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TGTGAACACACGTGTGGATTGG. Sequenciamento de DNA em MegaBACE DNA Analysis Systems. Prof. Dr. Luciano da Silva Pinto. [email protected]. Sequenciamento do DNA. Definição Identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA. Importância - PowerPoint PPT Presentation
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Sequenciamento de DNA emMegaBACE DNA Analysis Systems
bull Prof Dr Luciano da Silva Pinto
TGTGAACACACGTGTGGATTGG
ls_pintohotmailcom
Sequenciamento do DNA
Definiccedilatildeo Identificaccedilatildeo da ordem exata dos pares de bases (A T G e C)
em um segmento de DNA
ImportacircnciaO conhecimento da sequumlecircncia de bases de um gene fornece importantes informaccedilotildees sobre sua estrutura funccedilatildeo e relaccedilatildeo evolutiva com outros
genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes)
Anaacutelise do fluxo da informaccedilatildeo celular pela pesquisa genocircmica
Watson amp Crick
Nobel 1962
Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo
Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo
Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975
Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977
Sequumlenciamento de DNA
Projeto Genoma Humano
Tecnologias de sequenciamento
- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Meacutetodo de Sanger
bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear
bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar
bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica
Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)bull 1 primer bull DNA polimerasebull dNTPsbull ddNTPs
OH
H
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Sequenciamento do DNA
Definiccedilatildeo Identificaccedilatildeo da ordem exata dos pares de bases (A T G e C)
em um segmento de DNA
ImportacircnciaO conhecimento da sequumlecircncia de bases de um gene fornece importantes informaccedilotildees sobre sua estrutura funccedilatildeo e relaccedilatildeo evolutiva com outros
genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes)
Anaacutelise do fluxo da informaccedilatildeo celular pela pesquisa genocircmica
Watson amp Crick
Nobel 1962
Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo
Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo
Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975
Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977
Sequumlenciamento de DNA
Projeto Genoma Humano
Tecnologias de sequenciamento
- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Meacutetodo de Sanger
bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear
bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar
bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica
Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)bull 1 primer bull DNA polimerasebull dNTPsbull ddNTPs
OH
H
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Anaacutelise do fluxo da informaccedilatildeo celular pela pesquisa genocircmica
Watson amp Crick
Nobel 1962
Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo
Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo
Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975
Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977
Sequumlenciamento de DNA
Projeto Genoma Humano
Tecnologias de sequenciamento
- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Meacutetodo de Sanger
bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear
bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar
bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica
Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)bull 1 primer bull DNA polimerasebull dNTPsbull ddNTPs
OH
H
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Watson amp Crick
Nobel 1962
Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo
Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo
Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975
Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977
Sequumlenciamento de DNA
Projeto Genoma Humano
Tecnologias de sequenciamento
- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Meacutetodo de Sanger
bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear
bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar
bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica
Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)bull 1 primer bull DNA polimerasebull dNTPsbull ddNTPs
OH
H
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Histoacuterico ndash O sequenciamento de DNA no tempo
Frederick SangerPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980J Mol Biol v94 p 441-448 1975
Walter GilbertPrecircmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980PNAS vol 74 No 2 p 560-564 1977
Sequumlenciamento de DNA
Projeto Genoma Humano
Tecnologias de sequenciamento
- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Meacutetodo de Sanger
bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear
bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar
bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica
Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)bull 1 primer bull DNA polimerasebull dNTPsbull ddNTPs
OH
H
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Sequumlenciamento de DNA
Projeto Genoma Humano
Tecnologias de sequenciamento
- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Meacutetodo de Sanger
bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear
bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar
bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica
Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)bull 1 primer bull DNA polimerasebull dNTPsbull ddNTPs
OH
H
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Tecnologias de sequenciamento
- Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972Maxam amp Gilbert meacutetodo quiacutemico- 1972
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Meacutetodo de Sanger
bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear
bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar
bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica
Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)bull 1 primer bull DNA polimerasebull dNTPsbull ddNTPs
OH
H
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
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(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Meacutetodo de Sanger
bull Reaccedilatildeo de sequumlenciamento ndash amplificaccedilatildeo linear
bull Eletroforese em gel de acrilamidandash em placandash capilar
bull Leitura da sequumlenciandash manualndash automaacutetica
Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)bull 1 primer bull DNA polimerasebull dNTPsbull ddNTPs
OH
H
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
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(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Reaccedilatildeo de sequumlenciamentobull fragmento de DNA (fita simples)bull 1 primer bull DNA polimerasebull dNTPsbull ddNTPs
OH
H
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Eletroforese
bull em placabull capilar
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Reaccedilatildeo de sequenciamento e marcaccedilatildeo do DNA
Radioisoacutetopos
Leitura das sequecircncias -Manual
Leitura das sequecircncias -Automaacutetica
Fluoresceiacutenas
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
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(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Leitura da sequumlecircncia de DNA
bull ManualManualG A T C
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
bull AutomaacuteticaAutomaacutetica
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Reaccedilatildeo de sequenciamento e leitura automatizada
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
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ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGTTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT5rsquo 3rsquo
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTATGCTTCATGCTTCTTATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
Organizando as Sequumlecircncias de DNA
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
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Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
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(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
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Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Exemplo de gel utilizado nos sequumlenciadores de gel (ex 377) A diferenccedila de tamanho permite a separaccedilatildeo dos grupos de fragmentos e esta ldquodistribuiccedilatildeo normalrdquo da passagem dos
fragmentos eacute representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada sequumlecircncia (read)
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Generic Sequencing Instrument
GCTATAGTTGATTCCT
Electrical Field
-
+
Laser
DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
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DYEnamic ET Terminators ndash Preacute Mix
Energy Transfer Dyes
bullFluorescein Donor Dye
bullStandard Rhodamine Acceptor DyesFluorescein-R110-ddGTPFluorescein-R6G-ddTTPFluorescein-TAMRA-ddATPFluorescein-ROX-ddCTP
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
alize
d Fl
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scen
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(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Ar+ Laser
O
CO2-
N+N
ddNTP
O
CO2-
N+NO
CO2-
OH O
ddNTP
Radiationless
Energy Transfer
Transferecircncia de energia aumenta a fluorescecircncia
Norm
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d Fl
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scen
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(Exc
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n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
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Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Norm
alize
d Fl
uore
scen
ce E
miss
ion
(Exc
itatio
n at
488
nm
)Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
0102030405060708090
100
500 550 600 650 700Wavelength (nm)
DYEnamic ET terminator - espectro de emissatildeo
Leitura da sequumlecircncia de DNA
Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
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DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
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Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
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Leitura da sequumlecircncia de DNA
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Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
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DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
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DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
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Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
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Anaacutelise dos resultadospor Bioinformaacutetica
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
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bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Montagem
Limpeza das sequumlecircncias1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias ribossocircmicas1048708remoccedilatildeo de sequumlecircncias de vetor 1048708remoccedilatildeo da regiatildeo de poliA1048708corte por qualidade1048708eliminaccedilatildeo das derrapagens
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
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Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
clonar em vetor
sequenciamento
reads
Shotgun do genoma inteiro
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Reconstruccedilatildeo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizaccedilatildeo)
reads
Sequecircncia consenso(DNA original)
A reconstruccedilatildeo eacute feita a partir de sobreposiccedilatildeo dos fragmentos
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
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bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Quebrar em pedaccedilos aleatoriamente desde
50Kpb ateacute 300Kpb
DNA genocircmico
~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaccedilos de 2000pb
Clonar em BACrsquos e sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
clonar em vetor e sequenciar os fragmentos
Shotgun de pedaccedilos do genoma
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
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Science 281 (1998) n 5375 363-365
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Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
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Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
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0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40
O programa PHRED lecirc o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequecircncia
Genome Research 8 (3) (1998) 175-185
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
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bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
- A identificaccedilatildeo dos picos eacute feita atraveacutes de uma transformada de fourier do sinal
- A nota eacute ligada com a resoluccedilatildeo entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
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Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
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Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
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Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
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Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
Analisando o cromatograma
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcessangerseqhtml
bull httpwwwdnalcorgddnalcresourcescycseqhtml
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
- Sequenciamento produz sequumlecircncias da ordem de 500 pb
Pirosequenciamento
Science 281 (1998) n 5375 363-365
Quebrar em pedaccedilos aleatoacuterios ~2000pb
(shotgun)
DNA genocircmico
Ligaccedilatildeo do adaptador e
separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
Nature 437 (2005) 326-327
Pirosequenciamento
O sequenciador 454
Cacircmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluiacutedos
Cacircmara de fluxo contendo as amostras e as fibras oacutepticas(16 milhotildeesslide)
Nature 437 (2005) 376-380
Linearidade eacute mantida ateacute homopoliacutemeros de 8 nt
Pirograma
Satildeo obtidas sequumlecircncias de ateacute 100-120 b
SANGER Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
Sanger vs Pirosequenciamento
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila PNAS 103 (2006) 11240
Os organismos possuem padrotildees
As moleacuteculas tambeacutem
Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
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Onde q eacute a nota phred e P eacute a probabilidade encontrar uma base errada
- Nota phred = 20 =gt 1 base errada a cada 100 (99)
- Nota phred = 30 =gt 1 base errada a cada 1000 (999)
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- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
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EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
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separaccedilatildeo em fita simples
Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
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Os organismos possuem padrotildees
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EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
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Shotgun do genoma inteiro
- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
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EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
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- O adaptador permite que o DNA se ligue em gracircnulos minuacutesculos (diacircmetro de 28 m) Apenas um DNA eacute ligado em cada gracircnulo
- Os gracircnulos satildeo envolvidos em gotas de oacuteleo que contecircm todos os reagentes necessaacuterios para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o gracircnulo eacute mantida isolada para evitar contaminaccedilatildeo e consegue produzir 10 milhotildees de coacutepias numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reaccedilatildeo de pirosequenciamento produz 1011 moleacuteculas de ATP gerando mais de 109 foacutetons num comprimento de onda de 560 nm e num periacuteodo de 3-4 segundos Facilmente detectado por uma cacircmera de CCD
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EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
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EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
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EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
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bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
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Os organismos possuem padrotildees
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Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
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bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
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bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
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Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
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Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
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Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
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Daehhhh
EvoluccedilatildeoEvoluccedilatildeoCaracteres morfoloacutegicosMacadores molecularesSequecircncias
Similaridade X HomologiaSimilaridade X HomologiaA homologia deve ser uma conclusatildeo feita pela observaccedilatildeo da similaridade
Transferecircncia horizontalTransferecircncia horizontalUm alto iacutendice de similaridade entre as sequecircncias justifica a conclusatildeo de que elas
satildeo homoacutelogas
1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
2004-2006 Viagem do Sorcerer II
Animaccedilotildees
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1859 Charles Darwin A Origem das Espeacutecies
1831-1836 Viagem do Beagle
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