UAM Dpto Física Aplicada

SEPARACIÓN, CROMATOGRAFÍA, ELECTROFORESIS

1. Introducción:

- La materia biomolecular se caracteriza por la heterogeneidad (numerosos elementos en estructuras muy variables y de tamaño muy disperso).

- Biofísica histórica: contribución a desenmascarar como son los distintos componentes de las estructuras biológicas.

- Métodos que permitan una SEPARACIÓN, lo mas selectiva posible.

- Métodos basados en distintos mecanismos físicos de naturaleza mecánica, eléctrica, magnética…

- … que tengan un efecto sobre la… solubilidad, masa, carga, etc.

- Generalmente se aplican en cascada, separación primaria…

- Dan pie a métodos mas sofisticados para la determinación de la estructura y composición de una biomolécula.

- Esta escala de técnicas de separación y análisis es imprescindible para conocer los cuatro niveles de estructura de las proteínas.

Homogeinización de una muestra biológica.

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CROMATOGRAFÍA

CROMATOGRAFÍA: Introducción

- origen, separación de sustancias coloreadas. [khrōm(at)- gr. 'color' + graph- gr. 'grabar', 'escribir’ ] Acuñada en al. Chromatographie M. Tswett, 1906.

- Por extensión, método para separar mezclas de gases, líquidos o sólidos en disolución mediante diferentes procesos físicos.

- Explota la separación de una mezcla biomolecular en una fase móvil (líquido o gas) en sus componentes como resultado de la distribución diferencial sobre una fase sólida estacionaria de las biomoléculas solubles.

Figura : Representación esquemática de una columna cromatográfica con secciones identificables (placas teóricas)

- configuración mas generalizada: columna con una elección de fases optimizada para los componentes del muestreo.

- La muestra circula a través de la columna mediante unaadición continua de la fase movil (elución).

- La velocidad con la que se desplaza un tipo de biomoléculaen la columna viene determinada por el tipo de interaccióncon la fase estacionaria (ADSORCIÓN). A mayor interacción, menor velocidad.

En función de la configuración, la cromatografía no es solo una técnica de separación sino también de análisis resolutivo.

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CROMATOGRAFÍA

Aspectos de Físico Química:

La distribución de una biomolécula entre las dos fases puederepresentarse mediante una ecuación de equilibrio químico;

Amov Aestac

La constante de equilibrio, K, se conoce como el coeficiente de partición.

K= Aestac/Amov

A refleja una concentración molecular en cada una de las fases.

Proceso dinámico: al tiempo transcurrido entre la inyección de la muestray la detección de una molécula a la salida de la columna se le conocecomo tiempo de retención (tR ).

Cada molécula tiene su tiempo de retención característico. El tiempo de tránsito de la fase móvil se conoce como tM.

Figura : tiempos de detección de la fase móvil y de una biomolécula en una columna cromatográfica.

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CROMATOGRAFÍA

Aspectos de Físico Química:

Medida de los tiempos de retención -> existencia de un tipo de traza de la biomolécula. ¿color?

En sistemas modernos generalizados a cualquier biomolécula esnecesario acoplar sistemas espectroscópicos.

El factor de retención (o capacidad) k', se utiliza frecuentemente para describir la tasa de migración de cada tipo de biomolécula :

k'A = (tR - tM)/ tM

Cuando el factor de retención es menor que 1, la elución es demasiadorápida (TM y TR son similares). De forma ideal se buscan factores de retención entre 1 y 5.

El factor de selectividad, , que describe la separación entre dos biomoléculas (A y B) de la columna se define como.

= k 'B / k 'A

(si >1, la elución de A es mas rápida que la de B)

Figura : Instrumentación básica en cromatografía de líquidos. f columna, g analizador

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CROMATOGRAFÍA

Aspectos de Físico Química :

Eficiencia: mínimo ensanchamiento de los picos cromatográficos. Separaciones óptimas presentan picos estrechos y simétricos.

Modelo determinación eficiencia máxima (Theoretical Plate Model): la columna consta de seccioes diferenciales de fase estacionaria que son atravesadas secuencialmente por la fase movil.

La altura (Height Equivalent to a Theoretical Plate, HETP) de una de estas capas se puede calcular mediante:

HETP = L / N

L, longitud de la columna y el N nro de capas de la columna. Éste últimoviene restringido por el ancho de los picos de detección:

donde w1/2 es la anchura a media altura del pico.

Las columnas se comportan como si tuvieran un N diferente para distintas biomoléculas.

LIMITACIÓN: No tiene en cuenta tiempo necesario para que las faseslleguen a su equilibrio.

Resolver: 1. Diagrama de Flujo, 2. Programación, 3. Presentar casos relevantes.

Problema: En un medio sometido a cromatografía se encuentran dos tipos de biomoléculas (A y B) con un nro total de moléculas NA y NB y coeficientes de partición KA y KB. Suponiendo un avance en pulsos de tiempo que coinciden con las placas teóricas (tiempo de equilibrio aceptable) resolver numéricamente el avance de la columna durante al menos 6 ciclos.

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CROMATOGRAFÍA

Modelo mas desarrollado (Rate Theory of Chromatography)

Tiene en cuenta la influencia del tiempo necesario para alcanzar el equilibrio en la forma de los picos y por la disparidad en los caminos queuna biomolécula podría seguir.

Van Deemter estableció una relación entre la altura de las capas (H) y la velocidad de cada uno de los tipos de biomolécula en la columna:

H = A + B / u + C u

donde u es la velocidad media de la fase movil y A, B, y C son factoresque dan lugar a ensanchamiento del pico.

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CROMATOGRAFÍA

Aspectos de Físico Química :

A – Factor de “Eddy diffusion”: Un mismo tipo de biomolécula puededescribir una trayectoria directa y otra realizar serpenteos.

B – Factor de Difusión Longitudinal: La propia existencia de las paredesde la columna hace que la concentración de una misma biomolécula sea mayor en el centro de la columna. Si la velocidad de la fase movil es altalas biomoléculas permanecen menor tiempo en la columna y se minimizaeste efecto.

C – Factor de resistencia a la transferencia de masa. Si un tipo de biomolécula tiene una alta afinidad por la fase estacionaria y no se ha alcanzado su equilibrio, las biomoléculas de ese tipo que permanezcanen la fase movil avanzarán en la columna.

Las gráficas de Van Deemter representan H en función de u y permitenestablecer los factores limitantes de resolución A, B, C, que se puedenmodificar seleccionando una u optimizada.

Figura 3: Gráfica de Van Deemter para la optimización de la velocidad óptima de la fase móvil.

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Resolución Problema : Resolución numérica por mínimos cuadrados utilizando una hoja de cálculo.

1. Representar 2. Definir Función 3. Definir Parámetros de Partida.

4. Iterar.

0 2 4 6 8 10 126,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

10,5

Data: Data1_BModel: user1 Chi^2 = 0R^2 = 1 P1 4 ±--P2 6 ±--P3 0.25 ±--

H (m

)

Vel Fase Movil (cm/h)

5. Resultados

Proponer una solución mediante un sistema o herramienta alternativa. Para la función definida por estos parámetros:a) Determinar el mínimo.b) Presentar con unidades los parámetros Pi

Problema : Dada la siguiente tabla de datos H vs U realizar un ajuste numérico que permita:1) Determinar la velocidad óptima de la fase móvil.2) Estimar los valores de los distintos factores de ensanchamiento. H (m): 10.25; 6,75; 6,45; 6,60; 6,92 u (cm/h): 1; 3; 5; 7; 9