A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Senzori electrochimici pentru evaluarea toxicitatii nanomaterialelor in vitro

Szilveszter Gáspár (sgaspar@biodyn.ro)

Centrul International de Biodinamica, Bucuresti

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

I. De ce metode alternative la testele pe animale?

II. Alternativa la care lucram noi (pe scurt)

III. Sistem experimental

IV. Biosenzor pentru detectia superoxidului in spatiul extracelular

V. Impedanta electrochimica pentru monitorizarea aderentei celulare

VI. Monitorizarea simultana a eliberarii de superoxid si a aderentei celulare

VII. Concluzii

Continut

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

a.) din considerente etice (54 milioane vertebrate doar pt. REACH)

b.) din cauza costurilor ridicate (250 milioane – 1.2 bilioane $ doar pt. testarea celor ~ 1000 nanoparticule deja comercializate) 1

c.) din cauza unui “throughput” limitat (34-53 ani doar pt. testarea celor ~ 1000 nanoparticule deja comercializate) 1

d.) din cauza predictivitatii limitate (20-30% din efectele adverse ale medicamentelor nu sunt detectate in testele preclinice) 2,3

I. De ce metode alternative la testele pe animale?

1. Choi, J.-Y et al. The impact of toxicity testing costs on nanomaterial regulation. Environ. Sci. Technol. (2009), 43, 3030-3034.2. Seok, J. et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. PNAS (2013). doi:10.1073/pnas.12228781103. Stevens, J. L., Future of toxicology – mechanisms of toxicity and drug safety: where do we go from here? Chem. Res. Toxicol. (2006)19, 1393-1401.

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

II. Alternativa la care lucram noi (pe scurt)

Modele celulare (culturi 2D sau 3D, co-culturi, “organ-on-a-chip”, etc.)

Metode analitice care permit monitorizarea continua si in situ a

unor procese celulare

Inlocuite cu

Inlocuite cu

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiGold

Cell

Membrane capacitance

Barrierfunction

O2•

Supe

roxi

dese

nsor

Cell

Glass

O2•

O2•

III. Sistem experimental

16 mai 2013A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

IV.1. Biosenzor pentru detectia superoxidului in spatiul extracelular

•O2-

RED

O2

OX

Hipoxantina / Xantina, O2

Acid uric, H2O2, •O2-

SH

O

NH

SH

O

NH

Electrod de Au la 150 m

V

OX

Gáspár, S., et al., Electroanalysis 25, 448–452 (2013).

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

IV.2. Calibrarea biosenzorului pentru superoxid

0 2 4 6 8

0

10

20

30

curr

ent s

igna

l /

nA

(XOD activity)1/2 / (mU/ml)1/2

y = 3.03 ± 0.10 * xR2 = 0.995

0.0 5.0x10-7 1.0x10-6

0

10

20

30y = 2.41 ± 0.08 x 107 * x

R = 0.995

curr

ent s

igna

l /

nA

superoxide conc. / M

Gáspár, S., Niculite, C., Cucu, D. & Marcu, I., Biosensors and Bioelectronics 25, 1729–1734 (2010).

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

0 2500 5000 7500 10000-101234567

159 U ml-1 SOD

curr

ent s

igna

l /

nA

time / sec

0.98 mg ml-1

0.52 mg cm-2 calcium oxalate

159 U ml-1 SOD

IV.3. Evolutia superoxidului in spatiul extracelular al celulelorrenale incubate cu cristale de oxalat de calciu

Obs.: Eliberarea de superoxid este un proces nemonoton si temporar. Astfel, el

poate trece neobservat in cazul unor masuratori clasice (de tip “end point”).

Gáspár, S., Niculite, C., Cucu, D. & Marcu, I., Biosensors and Bioelectronics 25, 1729–1734 (2010).

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Obs.: Se pot ”observa” celule care cresc si adera pe electrod in jur de

1800 Hz!

V.1. Impedanta electrochimica pentru monitorizarea aderentei celulare

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

V.2. Impedanta electrochimica pentru monitorizarea aderentei celulare

Gáspár, S. et al. , Analytica Chimica Acta 713, 115– 120 (2011).

Zelectrod cu celule la 1800 Hz

Rp ~ rezistenta transepitelialaCp ~ capacitanta transepiteliala

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

VI.1. Monitorizarea simultana a eliberarii de superoxid si a aderentei celulare

EIS Amperometrie

1. 2. 3. 1. 2. 3.

Gáspár, S. et al. , Analytica Chimica Acta 713, 115– 120 (2011).

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

Obs.: Celulele “tinere” (fara jonctiuni stranse) sunt mai sensibile!

VI.2. Efectul varstei celulelor asupra vulnerabilitatii acestora

Gáspár, S. et al. , Analytica Chimica Acta 713, 115– 120 (2011).

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

VI.3. Q:Stres mecanic sau chimic?

A: Stres mecanic + stres chimicGáspár, S. et al. , Analytica Chimica Acta 713, 115– 120 (2011).

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

VII. CONCLUZII

+ Senzorii sunt reversibili (pot monitoriza atat productia cat si consumul de superoxid)

+ Marcarea celulelor nu este necesara

+ Sistem experimental simplu si usor de folosit

+ Rezolutie temporala excelenta (care permite observarea dinamicii proceselor)

+ Procesele studiate sunt ne-monotone si temporare si pot trece neobservate cand se folosesc metode clasice

- Sistemul poate fi utilizat doar la evaluarea toxicitatii acute (nu si a toxicitatii cronice)

A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti

16 mai 2013

MULTUMIRI

Suport financiar: UEFISCDI

Irene Marcu

Cristina Niculite

Mihaela Gheorghiu

Eugen Gheorghiu

Sorin David

DanaCucu

Cristina Polonschii

DumitruBratu