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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE POSTGRADO
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de
Isquemia-Reperfusión Hepática en la Rata
Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biomédicas
PAMELA ROMANQUE ULLOA
Directores de tesis: Dr. Luis A. Videla C.
Dr. Mario O. Uribe M.
Santiago, Chile 2007
ÍNDICE GENERAL
_________________________________________________________________________________________________ Señalización en Preacondicionamiento Isquémico en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata
Doctorado en Ciencias Biomédicas - Facultad de Medicina - Universidad de Chile
i
ÍNDICE GENERAL
Nº Sección
PAG
ÌNDICE GENERAL i
ÍNDICE DE TABLAS vi
ÍNDICE DE FIGURAS vii
LISTA DE ABREVIATURAS xi
RESUMEN xv
ABSTRACT xvii
I INTRODUCCIÓN 1 1.1 Aspectos generales 1
1.1.1 Hepatotoxicidad y estrés oxidativo 1
1.1.2 Daño por isquemia-reperfusión y relevancia clínica 2
1.2 Mecanismos de daño por isquemia-reperfusión 3
1.2.1 Fases del daño por isquemia-reperfusión 4
1.3 Factores que participan en el daño secundario a isquemia-reperfusión 6
1.3.1 Pérdida de la homeostasis del calcio (Ca+2) 6
1.3.2 Generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) 6
1.3.3 Cambios en la microcirculación 7
1.3.4 Activación de las células de Kupffer 8
1.3.5 Activación de factores del complemento 8
ÍNDICE GENERAL
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ii
Nº Sección
PAG
1.3.6 El óxido nítrico en isquemia-reperfusión (.NO) 9
1.3.7 Antioxidantes en isquemia-reperfusión 11
1.4 Factores de transcripción (NF-κB) y reprogramación de la expresión
génica en situaciones de estrés oxidativo
12
1.5 Preacondicionamiento isquémico 13
1.6 Respuestas hepatoprotectoras gatilladas por el preacondicionamiento
isquémico
15
1.6.1 Señales de supervivencia antiapoptótica y antioxidantes mediadas por
TNF-α
15
1.6.2 Respuesta de fase aguda y proteínas de shock térmico 16
1.7 Importancia biomédica 18
II HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 20 2.1 HIPÓTESIS 20
2.2 OBJETIVOS GENERALES 20
2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 21
III METODOLOGÍA 23 3.1 Animales de experimentación 23
3.2 Protocolo quirúrgico 23
3.3 Grupos experimentales 25
3.3.1 Modelo de daño por isquemia-reperfusión 25
3.3.2 Modelo de maniobra de preacondicionamiento isquémico 26
3.3.3 Modelo de ventana tardía del preacondicionamiento isquémico 26
3.4 Parámetros de daño hepático 27
3.4.1 Evaluación de histopatología hepática 27
3.4.2 Determinación de la actividad de transaminasas plasmáticas 27
3.4.3 Determinación de la actividad deshidrogenasa láctica (LDH) plasmática 28
3.5 Parámetros de estrés oxidativo 28
3.5.1 Determinación de contenido de glutatión total 28
3.5.2 Determinación de oxidación de proteínas hepáticas 29
ÍNDICE GENERAL
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iii
Nº Sección
PAG
3.6 Determinación de niveles de citoquinas 30
3.7 Evaluación de la actividad de unión al ADN de factores de transcripción 30
3.7.1 Preparación de extractos nucleares 30
3.7.2 Electroforesis en geles de retardo EMSA (Electrophoresis mobility shift
assay) para NF-κB, AP-1 y HSF-1
31
3.7.2.1 Alineamiento de los oligonucleótidos de ADN 31
3.7.2.2 Marcación de oligonucleótidos 31
3.7.2.3 Ensayo EMSA 32
3.8 Evaluación de los niveles de proteínas relacionadas con la supervivencia
celular
32
3.8.1 Ténica de Western blot 32
3.8.1.1 Preparación de las muestras 32
3.8.1.2 Electroforésis en condiciones desnaturantes (PAGE-SDS) 33
3.8.1.3 Western blot 33
3.9 Técnica de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa para
expresión de iNOS
35
3.9.1 Extracción de ARN 35
3.9.2 Síntesis de ADN a partir del ARN obtenido 35
3.9.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 36
3.10 Análisis de imágenes 37
3.11 Expresión de resultados y análisis estadístico 37
IV RESULTADOS 38 4.1 CARACTERIZACIÓN DE UN MODELO DE DAÑO POR ISQUEMIA-
REPERFUSIÓN
38
4.1.1 Evaluación de parámetros de daño heopatico en animales sometidos a
isquemia-reperfusión y controles
38
4.1.2 Evaluación histopatológica del hígado 40
4.1.3 Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en
animales sometidos a isquemia-reperfusión y controles
44
ÍNDICE GENERAL
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iv
Nº Sección
PAG
4.1.4 Cinética de unión al ADN de NF-κB en animales sometidos a isquemia-
reperfusión y controles
47
4.2 CARACTERIZACIÓN DE LA MANIOBRA DE
PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO
48
4.2.1 Evaluación de parámetros de daño hepático en animales sometidos a la
maniobra preacondicionante y controles: actividad de transaminasas
plasmáticas
50
4.2.2 Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en
animales sometidos a la maniobra preacondicionante y controles
51
4.3 FASE TARDÍA DEL PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO 52
4.3.1 Evaluación de parámetros de daño hepático en animales sometidos a
preacondicionamiento isquémico y controles
52
4.3.1.1 Evaluación de la actividad de transaminasas plasmáticas 53
4.3.1.2 Evaluación de la actividad de LDH plasmática 55
4.4 Evaluación del efecto del pretratamiento con antioxidantes sobre el
preacondicionamiento isquémico
58
4.5 Evaluación de niveles de citoquinas séricas en animales sometidos a
preacondicionamiento isquémico y controles
61
4.6 Evaluación de la actividad de factores de transcripción en animales
sometidos a preacondicionamiento isquémico y controles
65
4.7 Evaluación de los niveles de proteínas relacionadas con citoprotección
en animales sometidos a preacondicionamiento isquémico y controles
72
V DISCUSIÓN 77 5.1 Modelo de daño por isquemia-reperfusión 78
5.1.1 Daño hepático en isquemia-reperfusión 78
5.1.2 Estrés oxidativo hepático en isquemia-reperfusión 79
5.1.3 Activación del factor de transcripción NF-κB en isquemia-reperfusión 80
5.2 Maniobra de preacondicionamiento isquémico y segunda ventana de
protección del preacondicionamiento isquémico
82
ÍNDICE GENERAL
_________________________________________________________________________________________________ Señalización en Preacondicionamiento Isquémico en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata
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v
Nº Sección
PAG
5.3 Daño y estrés oxidativo en el preacondicionamiento isquémico tardío 83
5.4 Maniobra preacondicionante y estrés oxidativo subletal 84
VI CONCLUSIONES 96 VII PROYECCIONES 98 VIII REFERENCIAS 101
ÍNDICE DE TABLAS
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vi
INDICE DE TABLAS Nº Título PAG
1 Efectos celulares de la isquemia 3
2 Acciones del óxido nítrico 9
3 Descripción de la composición de las soluciones de preservación más
utilizadas
11
4 Histopatología hepàtica en el modelo de daño por isquemia reperfusión 41
5 Estímulos y respuestas a NF-κB 80
ÍNDICE DE FIGURAS
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vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Nº Título
PAG
1 Fase temprana del daño por isquemia-reperfusión 4
2 Fase tardía del daño por isquemia-reperfusión 5
3 Ventanas de protección del preacondicionamiento isquémico 15
4 Respuesta de genes de fase aguda mediada por citoquinas 16
5 Efecto de los distintos niveles de especies reactivas del oxígeno
sobre la respuesta celular
18
6 Clip de Schwartz y visión esquemática del modelo de isquemia
hepática parcial en el hígado de rata
24
7 Diseño experimental 27
8 Actividad de transaminasas séricas en animales sometidos a 60
minutos de isquemia y reperfusión de 0 a 72 h
39
9 Actividad de Lactato Deshidrogenasa plasmática en animales
sometidos a 60 minutos de isquemia y tiempos de reperfusión
variables
40
10 Tinción con Hemotoxilina-eosina de cortes de hígado de ratas
sometidas a isquemia y reperfusión temprana
42
11 Tinción con Hemotoxilina-eosina de cortes de hígado de ratas
sometidas a isquemia y reperfusión tardía
43
ÍNDICE DE FIGURAS
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viii
Nº Título
PAG
12 Contenido de derivados carbonilos, producto de oxidación de
proteínas en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia
45
13 Contenido de Glutatión total en hígado de ratas sometidas a 60
minutos de isquemia
45
14 Velocidad de caída de 2 a 20 horas del contenido de Glutatión total
en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia
46
15 Índice de estrés oxidativo de 2 a 70 horas en hígado de ratas
sometidas a 60 minutos de isquemia:
47
16 Efecto de 60 minutos de isquemia sobre la actividad de unión al
ADN de NF-κB hepático durante la reperfusión
48
17 Niveles de transaminasas séricas en animales sometidos a PI 24 h
antes de la isquemia prolongada
49
18 Niveles de transaminasas séricas en animales sometidos a
maniobra de preacondicionamiento isquémico y controles
50
19 Parámetros de estrés oxidativo en animales sometidos a maniobra
de preacondicionamiento isquémico y controles
52
20 Actividad de ALT sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes
de la isquemia prolongada
54
21 Actividad de AST sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes
de la isquemia prolongada
55
22 Actividad de LDH sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes
de la isquemia prolongada
56
23 Oxidación de proteínas hepáticas en animales sometidos a PI 72
horas antes de la isquemia prolongada
57
24 Contenido de glutatión total en animales sometidos a PI 72 horas
antes de la isquemia prolongada
57
25 Indice de estrés oxidativo en animales sometidos a PI 72 horas
antes de la isquemia prolongada
58
ÍNDICE DE FIGURAS
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ix
Nº Título
PAG
26 Efecto del pretratamiento con NAC sobre las transaminasas séricas
de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia
prolongada durante la reperfusión temprana
60
27 Efecto del pretratamiento con NAC sobre las transaminasas séricas
de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia
prolongada durante la reperfusión tardía.
61
28 Niveles de TNF-α sérico en animales sometidos a PI 72 horas antes
de la isquemia prolongada
62
29 Niveles de IL-6 sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes
de la isquemia prolongada
63
30 Niveles de IL-1β sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes
de la isquemia prolongada
63
31 Niveles de IL-10 sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes
de la isquemia prolongada
64
32 Efecto del PI sobre la activación de NF-κB en animales sometidos a
isquemia y reperfusión temprana
66
33 Efecto del PI sobre la activación de NF-κB en animales sometidos a
isquemia y reperfusión tardía
67
34 Efecto del PI sobre la activación de AP-1 en animales sometidos a
isquemia y reperfusión temprana
68
35 Efecto del PI sobre la activación de AP-1 en animales sometidos a
isquemia y reperfusión tardía
69
36 Efecto del PI sobre la activación de HSF-1 en animales sometidos a
isquemia y reperfusión temprana
70
37 Efecto del PI sobre la activación de HSF-1 en animales sometidos a
isquemia y reperfusión tardía
71
38 Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de
NF-kB, AP-1 y HSF-1 en animales sometidos a isquemia durante la
reperfusión temprana y tardía
72
ÍNDICE DE FIGURAS
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x
Nº Título
PAG
39 Efecto del PI sobre los niveles de fibrinógeno hepático 73
40 Efecto del PI sobre los niveles de haptoglobina hepática 74
41 Efecto del PI sobre los niveles de HO-1 hepática 75
42 Efecto del PI sobre los niveles de HSP 70 hepática 75
43 Efecto del PI sobre los niveles de ARNm de iNOS hepática 76
44 Segunda ventana de protección del preacondicionamiento
isquémico
88
LISTA DE ABREVIATURAS
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xi
LISTA DE ABREVIATURAS ADA Desaminasa de adenosina
ALT o ALAT Alanina amino transferasa
AMPc AMP cíclico
ANP Atrial natriuretic peptide, péptido atrial natriurético
AP-1 Activator protein-1
APS Persulfato de amonio
AST o ASAT Aspartato amino transferasa
ATP Adenosina trifosfato
bcl-2 B-cell lymphoma 2
BPB Azul de bromofenol
CaM Calmodulina
CAT Catalasa
C/EBP CCAAT enhancer binding protein
CO Monóxido de carbono
CXC Quimioquinas
dATP, dGTP,
dCTP, dTTP
trifosfato de desoxiadenosina, trifosfato de desoxiguanidina,
trifosfato de desoxicitidina, trifosfato de desoxitimidina
DEPC Dietilpirocarbonato
DNPH 2,4-dinitrofenilhidrazina
DTT Ditiotreitol
LISTA DE ABREVIATURAS
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xii
DTNB Ácido 55'-dithiobis-(2-nitrobenzoico)
EDRF Endothelium Derived Relaxant Factor
EDTA ácido etilendiaminotetracético
ELISA Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay
EMSA Electroforetic mobility shift assay
ET Endotelina
FADD Fas-associated deathdomain
FAD dinucleótido de flavina y adenina oxidado
FMN mononucleótido de flavina
GC Guanilil ciclasa
GdCl3 Cloruro de gadolinio
GMPc GMP cíclico
GOT Transaminasa glutámico oxalacética
GPT Transaminasa glutámico pirúvica
Groα Corepresor transcripcional de la familia Groucho
GSH Glutatión reducido (gamaglutamil-cisteinil-glicina)
GSSG Glutatión oxidado
HIF-1 Hypoxia-inducible factor 1
H2O2 Peróxido de hidrógeno
HO-1 Heme-oxigenasa-1
HSE Heat shock element
HSF-1 Heat shock factor-1
Hsp Heat shock protein
ICAM Intercellular adhesión molecule
IκB Inhibidor de NF-κB
IKK Kinasa de IκB
IL Interleuquina
INF Interferón
i.p. intraperitoneal
IPF Initial poor function
LISTA DE ABREVIATURAS
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xiii
IR Isquemia-reperfusión
i.v. Intravenosa
JNK/SAPK Kinasa N-terminal de c-jun o proteína kinasa activada por estrés
LDH Lactato deshidrogenasa
LIF Leucemia inhibitory factor
L-NAME N (G)-nitro-L-arginina metil ester
LPS Lipopolisacárido
MAPK Proteínas quinasas activadas por mitógenos
MCP-1 Monocyte chemotactic protein-1
MIP-1α Macrophage inflammatory protein 1 alpha (MIP- 1 alpha)
mosm Miliosmoles
MPI Maniobra de preacondicionamiento isquémico
MPO Mieloperoxidasa
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido
NF-κB Nuclear factor -κB •NO Monóxido de nitrógeno u óxido nítrico
NAC N-acetil cisteína
NF-κB Nuclear factor κB
NOC-9 Donante de .NO 1-(N-metil-N-[6-(N-etilamoniohexil)amino])-
diazen-1-ium-1,2-diolato
NOS Óxido nítrico sintasa
eNOS o NOS3 NOS endotelial
iNOS o NOS2 NOS inducible
mtNOS NOS mitocondrial
nNOS o NOS1 NOS neuronal
NOX Familia de NADPH oxidasas
ONOO- Anión peroxinitrito •OH Radical hidróxilo
O2•- anión superóxido
p38 MAPK
LISTA DE ABREVIATURAS
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Doctorado en Ciencias Biomédicas - Facultad de Medicina - Universidad de Chile
xiv
p50 NF-κB1
p53 Proteína supresora de tumor
p65 RelA
PCNA Proliferating cell nuclear antigen
PKC Proteína kinasa C
PMN Polimorfonuclear (polimorfonucleares)
PMSF fenil-metil-sulfonil-fluoruro
PNF Primary non function
RORα Retinoic acid receptor-related orphan receptor alpha
ROS Especies reactivas del oxígeno
RXR Retinoic acid receptor
s.c. subcutánea
SOD Superóxido dismutasa
Sp1 Specificity protein 1 transcription factor
STAT Signal transducers and activators of transcription factors
SVP Segunda ventana de protección
TBE Tampón tris, ácido bórico y EDTA
TBS Tampón tris-salino
TCA Ácido tricloroacético
TCR T cell receptor
THO Trasplante hepático ortotópico
TK Tirosina kinasa
TEMED N,N,N´,N´-tetra-metiletilenediamina
TLR4 Toll like receptor 4
TNF-α Factor de necrosis tumoral-α
TNFR Receptor de TNF
TRAF Tumor necrosis factor receptor-associated factors
VDR Vitamin D receptor
XD Xantina deshidrogenasa
XO Xantina oxidasa
RESUMEN/ABSTRACT
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
xv
RESUMEN El daño por Isquemia-Reperfusión (IR) es un fenómeno de acentuación del
daño celular en un órgano isquémico después del reestablecimiento del flujo
sanguíneo. En el hígado va asociado a la cirugía que se realiza bajo exclusión
vascular, al trasplante del órgano y a estados de shock o trauma con compromiso
multisistémico. La isquemia induce un estado proinflamatorio que aumenta la
vulnerabilidad del tejido durante la reperfusión. Cursa en dos fases: temprana y
tardía, que se asocian a la activación de las células de Kupffer y a la llegada,
infiltración y activación de linfocitos polimorfonucleares, respectivamente. La
exposición a un período breve de isquemia previo a un período de isquemia más
prolongado, resulta en protección tisular; fenómeno que se conoce como
preacondicionamiento isquémico (PI). El PI otorga dos ventanas de protección:
temprana y retardada. La fase protectora retardada o segunda ventana de
protección (SVP) del PI no se ha descrito en el hígado. Los objetivos de este
estudio fueron: (i) desarrollar un modelo de IR hepática parcial en la rata, (ii)
determinar la existencia de la SVP del PI en el hígado, (iii) evaluar el efecto del
pretratamiento con antioxidantes sobre el PI y (iv) comprobar la aparición de
respuestas protectoras dependientes del factor de transcripción redox sensible
NF-κB inducidas por el PI. Se realizó PI a ratas Sprague Dawley machos, para lo
cual se las sometió a un período de 10 minutos de isquemia 72 horas antes de la
isquemia prolongada (60 minutos). El PI fue precedido una hora antes de una
dosis de NAC o su vehículo. Se obtuvieron muestras de sangre y tejido durante la
RESUMEN/ABSTRACT
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
xvi
reperfusión de 0 a 72 horas para los animales de los grupos que caracterizaron el
modelo de daño por IR y a las 3 y/o 20 horas de reperfusión post isquemia
prolongada, para los animales sometidos a PI+IR.
El modelo de daño por IR con 60 minutos de isquemia hepática parcial en la
rata, que se describe en este estudio, presenta dos fases: temprana y tardía, que
coinciden en los marcadores enzimáticos e histológicos de daño. El factor de
transcripción NF-κB tiene un comportamiento bifásico durante el período post-
reperfusión de 0 a 72 horas que sigue a 60 minutos de isquemia. Se comprobó la
existencia de la SVP en el hígado y ésta se caracteriza por: (i) una disminución de
la actividad sérica de AST, ALT y LDH, y (ii) una disminución en el estrés
oxidativo tisular hepático. Durante la SVP se encontró disminución de los niveles
séricos de citoquinas proinflamatorias y activación temprana de NF-κB, además de
modulación de la respuesta de fase aguda y disminución de la expresión del
mARN de iNOS. El pretratamiento con antioxidante no modifica la protección
mediada por el PI.
Se concluye la existencia de la SVP en el hígado, ventana que se
desarrollaría al menos después de 48 horas del estímulo preacondicionante. La
protección desencadenada por el PI tardío no dependería de la generación de
ROS durante la isquemia breve o preacondicionante y cursaría con disminución de
la respuesta inflamatoria y modulación de la respuesta de fase aguda, entre otros
efectores.
RESUMEN/ABSTRACT
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
xvii
ABSTRACT
Ischemia-reperfusion (IR) injury is the augmentation of the cellular damage
in ischemic tissue after reperfusion. Liver IR is related to surgery performed under
vascular exclusion, organ transplantation, multisistemic trauma and shock.
Ischemia induces a pro-inflammatory state which increases tissue susceptibility to
damage during reperfusion. IR injury has an early and a late phase, the first
depending mainly upon Kupffer cell activation and the later on PMN invasion,
permeation and activation.
Exposure to a brief period of ischemia induces tolerance to subsequent
longer ischemia, phenomenon known as ischemic preconditioning. (IP). IP
provides two windows of protection, early and delayed. The late phase of IP or
second window of protection (SWOP) has not been described in the liver. The aims
of this study were: (i) to develop a model of partial liver IR in the rat, (ii) to
determine the existence of the late phase of IP in the liver, (iii) to evaluate the
effect of antioxidant pretreatment over IP and (iv) to check if IP triggers redox
sensitive NF-κB mediated-responses. Male Sprague Dawley rats underwent 10
minutes of ischemia or sham surgery 72 hours prior 60 minutes of ischemia.
Treatment with NAC or its vehicle was administered 1 hour before PI. Serum and
tissue samples were taken 0 to 72 horas to IR liver injury groups and at 3 and/or 20
hours of reperfusion to IP+IR groups.
Partial liver injury with 60 minutes of ischemia has an early and a late phase,
determined by enzimatic and histologic injury markers. Transcription factor NF-κB
behaves biphasically during 0-72 reperfusion hours period after 60 minutes of
RESUMEN/ABSTRACT
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
xviii
ischemia. SWOP develops in liver and it is characterized by (i) decrease in serum
levels of AST, ALT, LDH, and (ii) reduction of liver tissue oxidative stress status.
Throughout SWOP it was found a decrease in pro-inflammatory cytokines levels
in serum and early activation of NF-κB, in addition to modulation of acute phase
response and lower levels of iNOS mRNA. PI was not abolished by NAC
pretreatment.
In conclussion, data presented confirm the existence of SWOP in the liver,
that is not dependent upon IP-generated ROS, being associated with a diminution
in the inflammatory response and modulation of acute phase response.
I.- INTRODUCCIÓN
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
1
I.- INTRODUCCIÓN
1.1- Aspectos generales
1.1.1- Hepatotoxicidad y estrés oxidativo
La hepatotoxicidad es un fenómeno multifactorial 1, 2 en el que pueden
concurrir mecanismos tales como una excesiva generación de radicales libres y
otros agentes oxidantes1-3, pérdida del potencial antioxidante celular 4 alteraciones
metabólicas y/o energéticas1, 2, y modificación de la actividad de células no
parenquimáticas del sinusoide hepático 5. Algunos de estos mecanismos
incrementan el estado de estrés oxidativo tisular, desbalance que puede gatillar
mecanismos asociados con el daño y muerte celular 6. En estas condiciones el
hígado puede (i) alcanzar un punto de no retorno en el que se induce la muerte
celular por la incapacidad de compensar adecuadamente las alteraciones
inducidas1, o (ii) reprogramar la expresión génica de las células sobrevivientes
con remodelación o regeneración celular 7.
Las células parenquimáticas o hepatocitos conforman el 90% de la masa
hepática y el 65% del número de células. Existen tres tipos principales de células
no parenquimáticas, las células: del endotelio sinusoidal, estrelladas y de Kupffer;
éstas últimas constituyen los macrófagos residentes en el hígado, representando
el 80% de los macrófagos del organismo 7, 8. Las células tienen la capacidad de
I.- INTRODUCCIÓN
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
2
regular varias etapas dentro de la secuencia ADN-proteína. La iniciación de la
transcripción constituye uno de los mecanismos de control más importantes 9. Si
bien el estrés oxidativo actúa como mecanismo citotóxico 6, algunas formas
radicalarias del oxígeno (O2), como el peróxido de hidrógeno (H2O2) pueden
activar factores de transcripción que regulan una amplia variedad de genes
involucrados en la promoción de señales de muerte o supervivencia celular 9.
1.1.2.- Daño por isquemia-reperfusión y relevancia clínica
Existen numerosas situaciones en las que puede ocurrir isquemia, falta o
disminución del flujo sanguíneo a un órgano, y con ello disminución del aporte de
O2 y nutrientes al tejido. El daño por IR es un fenómeno de acentuación del daño
celular en un órgano isquémico después del reestablecimiento del flujo de O2 10, 11.
Los mecanismos de daño asociados a IR participan en la patogenia de situaciones
clínicas como el infarto miocárdico, accidente cerebrovascular, traumatismos
mayores, algunas cirugías, y shock de diverso origen 11.
En el hígado, el daño por IR está asociado al trasplante, cirugía hepática
resectiva o de reconstrucción vascular y trauma 12. En aquellas cirugías que
precisan de exclusión vascular para controlar la hemorragia, ésta se realiza a
través del clampeo de la arteria hepática y la vena porta (Maniobra de Pringle).
Esta oclusión puede ser continua (ej. 30 minutos durante la transección hepática)
o intermitente (ej. oclusión durante 10 minutos y reperfusión durante 5 minutos
antes de la re-oclusión) El clampeo continuo expone al hígado a mayor tiempo de
isquemia, lo que se relaciona con la severidad del daño por IR, mientras que el
clampeo intermitente, si bien se asocia a mayor pérdida de sangre, tiene una
menor incidencia de falla hepática postquirúrgica 13.
En el caso del trasplante hepático, al momento de procurar el órgano se
perfunde con una solución de preservación fría, y se mantiene a 4º C hasta el
momento de la implantación en el receptor, período de tiempo que se denomina
de preservación o isquemia fría. La isquemia fría prolongada (mayor a 12 horas)
I.- INTRODUCCIÓN
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es un factor de riesgo significativo para la falla primaria del injerto (primary non-
function, PNF), disfunción primaria del injerto (initial poor function, IPF) y rechazo
agudo post trasplante. En algunos de estos casos se requiere con urgencia un
retrasplante 13.
Considerando el déficit en el número de donantes de órganos para el
trasplante y el aumento de patologías que determinan injertos subóptimos, como
la esteatósis hepática, que son particularmente susceptibles al daño, la
importancia del estudio de los mecanismos y potenciales maniobras protectoras
contra el daño por IR en el hígado genera gran interés en la comunidad científica y
médica.
1.2.- Mecanismos de daño en isquemia-reperfusión
La isquemia prolongada se asocia a una variedad de cambios metabólicos y
ultraestructurales en la célula (Tabla 1) 14-17.
Efectos celulares de la isquemia Alteración del potencial de membrana Alteración de la distribución de iones intracelulares (↑Ca++ y Na+ intracelular) Aumento del volumen celular Desorganización del citoesqueleto Acumulación de hipoxantina Disminución de ATP, fosfocreatina y glutatión Acidosis celular
En condiciones de isquemia prolongada ocurren cambios funcionales que
incluyen (i) la disminución de la fosforilación oxidativa y de las bombas de
membrana dependientes de ATP, con la consiguiente entrada de calcio, sodio y
agua a la célula, (ii) el catabolismo del ATP que lleva a la acumulación de
hipoxantina con generación de especies reactivas del O2 (ROS) con la reentrada
del O2, (iii) la promoción de la expresión de productos génicos proinflamatorios
(moléculas de adhesión de leucocitos, citoquinas) y agentes bioactivos
Tabla 1: Efectos celulares de la isquemia
I.- INTRODUCCIÓN
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(endotelina, tromboxano A2) a nivel endotelial y (iv) la represión de los productos
de algunos genes protectores [óxido nítrico sintasa (NOS) constitutiva,
trombomodulina] y agentes bioactivos [prostaciclina, óxido nítrico (.NO)]. Así, la
isquemia induce un estado proinflamatorio que aumenta la vulnerabilidad del tejido
durante la reperfusión 15.
1.2.1.- Fases del daño por isquemia-reperfusión
El daño hepático secundario a la IR involucra dos fases bien caracterizadas.
La fase temprana, que comprende desde el inicio de la reperfusión hasta la 3a-4a
horas, está asociada a la activación de las células de Kupffer con producción de
ROS, activación de factores del complemento y el reclutamiento y activación de
linfocitos residentes (Figura 1) 14-16.
La fase tardía comprende alrededor de 6-24 horas posteriores y es
dependiente de la llegada, infiltración y activación de linfocitos polimorfonucleares
(PMN) 16. En esta fase, las citoquinas proinflamatorias, principalmente factor de
necrosis tumoral-α (TNF-α), la interleuquina (IL)-6 e IL-1, quimioquinas, y factores
del complemento liberados durante la reperfusión temprana son los responsables
Isquemia-reperfusión
Activación de la célula de Kupffer
TNF-α IL-1β
ROS IL-6, IL-10, IL-13, SLP,
Antioxidantes
Activación PMN sistémicos
Acumulación PMN en
sinusoides
Reclutamiento y activación de
leucocitos Activación C
C5a
Activación hepatocitos y
EC
Expresión de moléculas de
adhesión
Rolling y adherencia de
PMN
Daño hepatocitos
y EC
ROS intracelulares
PAF CXC C5a
Figura 1: Fase temprana del daño por isquemia-reperfusión.
I.- INTRODUCCIÓN
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del reclutamiento de PMN (Figura 2) 15-17. La infiltración de PMN en el hígado
perpetúa y amplifica el daño por la liberación adicional de mediadores como ROS,
TNF-α y proteasas 18. Si el daño endotelial es severo la migración transendotelial
de los neutrófilos ocurre fácilmente, sin embrago, ella requiere de la participación
de moléculas de adhesión como ICAM-1 si el daño es de menor magnitud, cuya
expresión aumenta en los hepatocitos en respuesta al TNF-α, IL-1 e interferón-γ
(INF-γ) 18.
La vía principal de generación de ROS en los neutrófilos involucra a la
NADPH oxidasa. Aunque la liberación de radical O.-2 y la subsiguiente dismutación
a H2O2 constituyen los principales oxidantes que se forman durante esta etapa, la
activación concomitante de mieloperoxidasa resulta en la formación de ácido
hipocloroso como un potente oxidante adicional 16.
Expresión en EC VCAM/ICAM
PMN activados en los sinusoides y vénulas
EXTRAVASACIÓN
Adherencia a hepatocitos
Expresión ICAM en hepatocitos
TNF IL-1
ROS proteasas
ROS
CXC Productos de la
lipoperoxidación
Figura 2: Fase tardía del daño por isquemia-reperfusión
I.- INTRODUCCIÓN
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1.3.- Factores que participan en el daño secundario a IR
Si bien los mecanismos precisos que conducen al daño por IR no han sido
elucidados, existe evidencia sustancial respecto de la participación de diversos
factores.
1.3.1.- Pérdida de la homeostasis del calcio (Ca+2)
Uno de los primeros factores implicados en la patogenia de la lesión por IR
fue el nivel de Ca+2, ya que se acumula en los tejidos postisquémicos y el uso de
bloqueadores de los canales de Ca+2 disminuye la lesión 19-22. El mecanismo a
través del cual se relaciona el aumento del Ca+2 intracelular con el daño involucra
tanto la activación de enzimas hidrolíticas dependientes de Ca+2 (fosfolipasas,
proteasas, nucleasas) como el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa
mitocondrial con la consecuente disminución del nivel de ATP 23, 24.
1.3.2.- Generación de especies reactivas del oxígeno (ROS)
Las ROS se generan durante el metabolismo aeróbico celular y son
neutralizados por diversos mecanismos antioxidantes. La inflamación, hiperoxia,
radiaciones, metales pesados y diversos xenobióticos aumentan la generación de
ROS, condiciones que al lograr el desbalance entre los procesos antioxidantes y
prooxidantes favoreciendo estos últimos, inducen el fenómeno de estrés oxidativo
citotóxico 25.
Fisiológicamente entre el 1-3% de la utilización del O2 produce ROS 19.
Estos pueden provocar daño a las membranas celulares por la peroxidación de los
ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos, fenómeno producido
preferentemente por O.-2 o por el radical hidroxilo (OH.), aunque también los
radicales peróxidos e hidroxilos derivados de ácidos grasos poseen actividad
oxidante y, por tanto, capacidad de ampliar el efecto lesivo. El daño de la
membrana puede afectar la integridad de la célula o sus organelos
comprometiendo seriamente la función celular 6. El estrés oxidativo puede,
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además, dañar otras moléculas eseciales, tales como proteínas y ADN,
produciendo alteraciones en algunos aminoácidos y degradación de proteínas
oxidadas, y desde daño a ruptura del material genético 6.
Durante la IR se ha detectado la formación de ROS en forma directa e
indirecta 26, 27. Ellas han sido relacionadas con el daño generado ambas fases del
daño por IR 28, 29, y el uso de antioxidantes como α-tocoferol 30, alopurinol 11 y las
enzimas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) 31 atenúan este daño.
Entre las fuentes generadoras de ROS potenciales en el hígado se cuentan
(i) la transformación, mediada por proteasas dependientes de Ca+2, de la xantina
deshidrogenasa en xantina oxidasa, que en presencia de O2 durante la reperfusión
oxida a la hipoxantina a ácido úrico con generación del anión superóxido (O.-2) y
peróxido de hidrógeno (H2O2) 23, 32, 33. (ii) La actividad NADPH oxidasa presente en
las células de Kupffer y fagocitos hepáticos, cuya inhibición bloquea la generación
de ROS y la patología hepática asociada a la ingesta de alcohol 34. (iii) La
producción de .NO por las NOS hepáticas y su posible conversión en peroxinitrito,
ambas especies reactivas del nitrógeno (RNS) 25.
1.3.3.- Cambios en la microcirculación
El flujo a un órgano isquémico no se reestablece completamente después
de liberar una oclusión vascular 14. Las modificaciones en la microcirculación
durante la isquemia o reperfusión inicial del tejido llevan a áreas que no se
prefunden después del reestablecimiento del flujo al órgano, fenómeno que se
conoce como no-reflujo (no-reflow) 35. Estos cambios incluyen aumento de
volumen celular con protrusión al lumen de los vasos, adherencia de leucocitos,
agregación plaquetaria, acumulación de fluido intracelular y vasoconstricción 14.
La falla microcirculatoria podría ser el fenómeno inicial que llevaría al no-
reflujo, con la liberación de citoquinas proinflamatorias, formación tapones
sinusoidales de neutrófilos y otras células, e inducción de un estado de estrés
oxidativo. Este fenómeno parece estar mediado por la lesión del endotelio
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sinusoidal y desbalance entre las moléculas vasodilatadoras y vasoconstrictoras,
como endotelina (ET) y .NO que se producen en el proceso de IR 16.
1.3.4.- Activación de las células de Kupffer
Durante la reperfusión temprana las células de Kupffer se activan
exhibiendo cambios morfológicos como aumento de volumen, protrusión a los
sinusoides y citoplasma vacuolado, lo que reduce el lumen sinusoidal, y contribuye
al fenómeno de no-reflujo 35, 36. La célula de Kupffer activada libera mediadores
proinflamatorios como TNF-α, IL-6, IL-1 y prostaglandinas, agentes
antiinflamatorios como la IL-10 e IL-13 y ROS, principalmente H2O2 y O.-2, por
acción de la NOX-2. La activación de la célula de Kupffer modula el daño inicial
tanto en isquemia fría 37 como en isquemia caliente 38.
A través de quimioluminiscencia, se ha determinado una respuesta
respiratoria temprana, alrededor de los 30 minutos de reperfusión, seguido de una
disminución y un nuevo aumento entre las 4 a 12 horas de reperfusión. Ambas
fases del daño por IR se modifican al agregar Cloruro de Gadolinio (GdCl3),
aunque menormente la fase tardía, lo que implica la generación de ROS por otros
tipos celulares, además de la célula de Kupffer 39.
1.3.5.- Activación de factores del complemento
El sistema del complemento también se activa en IR, lo que se estableció
en 1993 40, siendo particularmente importantes los factores C3a, C5a, iC3b y C5b-
9. C5a se une al receptor C5aR en PMN, monocitos y macrófagos y aumenta la
adhesividad de los neutrófilos, provocando su agregación y estimulando la
producción de ROS 8. Además de estimular los leucocitos y la quimiotaxis, C5a
amplifica la respuesta inflamatoria al inducir la producción de MCP-1 (methyl-
accepting chemotaxis proteins), TNF-α, IL-6 e IL-1 23. C5b e iC3b también pueden
alterar la homeostasis vascular e iC3b participa en la adhesión de los leucocitos al
endotelio vascular vía integrina β2, CD11b-CD18 (Mac-1) 23.
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El complemento es un mediador crítico en la amplificación de la respuesta
inflamatoria, y la intervención de su cascada de activación atenúa el daño por IR.
El tratamiento con un inhibidor de C1, que actúa a nivel de la vía clásica, aumenta
el número de sinusoides perfundidos y disminuye la agregación de leucocitos y
plaquetas 41, mientras que el uso de un antagonista del receptor de C5a disminuye
la mortalidad, el daño hepático y los niveles de TNF-α, MPO y la infiltración de
PMN en un modelo de IR parcial 42. En pacientes receptores de injerto en
trasplante hepático ortotópico (THO) los niveles séricos de C3a y C5b aumentan
durante la reperfusión temprana (120 minutos). El alza, sin embargo, fue similar
con tiempos de isquemia fría breves (<12 horas) versus prolongados (>12 horas) 43 por lo que la importancia biológica y su utilidad clínica no se han determinado
1.3.6.- El óxido nítrico (.NO)
El .NO se forma a partir de L-arginina por la acción de enzimas NOS, que
comprenden 3 isoformas, una inducible que se expresa principalmente bajo
condiciones patológicas (iNOS, NOS2), y dos constitutivas: eNOS (NOS3) y nNOS
(NOS1), que se expresan en endotelio y en sistema nervioso, respectivamente. El .NO cumple múltiples funciones fisiológicas y patológicas como mediador intra e
intercelular en procesos de inmunomodulación, neurotransmisión y regulación del
tono vascular (Tabla 2) 44-46.
Blanco Respuesta Guanilil ciclasa (GC) Elevación de cGMP GC en Plaquetas Inhibición de la agregación GC en Músculo liso Relajación Leucocitos Inhibición de NADPH oxidasa y activación de la sintasa de prostaglandinas Radicales peroxi-lipídicos
Posible efecto antioxidante y consecuentemente anti ateroesclerótico
Radicales superóxido Atrapamiento de radicales superóxido con formación de peroxinitrito Metaloproteínas A altas concentraciones (1-5 μM) inhibición de citrocromo c oxidasa y otras
enzimas que contienen hierro
Tabla 2: Acciones del óxido nítrico (NO o Monóxido de Nitrógeno)
I.- INTRODUCCIÓN
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La modificación del diámetro de los vasos sanguíneos está regulado por
agentes vasoconstrictores, como las aminas biogénicas, y vasodilatadores, como .NO, producidos en las células endoteliales 47. La acción de .NO sobre el tono
vascular se ejerce a través de cGMP que desencadena una cascada de eventos
que llevan a la reducción del tono muscular 47. Las acciones del .NO pueden
mediar el daño por ya sea por una acción relajadora a nivel de células estrelladas
o participación en la adhesión de los neutrófilos al endotelio y en la agregación
plaquetaria 48.
El .NO se asocia a la apoptosis de forma dual. A concentraciones
fisiológicas la apoptosis se inhibe por nitrosilación de caspasa 3, efecto asociado
a la inhibición de la liberación de citocromo c por bloqueo del clivaje de Bcl-2
(caspasa 3-dependiente). A niveles altos el .NO actúa induciendo apoptosis, lo que
podría estar mediado por peroxinitrito, el cual modificaría la permeabilidad
mitocondrial con la consecuente liberación de citocromo c, y provocaría daño al
DNA con la consiguiente activación de PARS [poly (ADP-ribose) synthase] 48.
En el hígado eNOS regula el flujo sanguíneo produciendo .NO en respuesta
a vasodilatadores dependientes del endotelio o estrés mecánico (shear stress o
estrés de cizallamiento), pero no participa en la regulación del flujo portal total, si
no más bien a nivel de sinusoide, regulando la distribución local de la perfusión y
la presión portal 48. iNOS se ha identificado en macrófagos, células epiteliales y
estrelladas, hepatocitos, y colangiocitos. Produce mayor cantidad de .NO en
comparación con eNOS y no es una enzima alostérica, por lo que manifiesta su
actividad hasta que es degradada. La falta de regulación fina y la gran cantidad de .NO que produce iNOS sugieren que este exceso de .NO puede llevar a daño
hepático 48, además de que la actividad de iNOS está prácticamente ausente en el
hígado normal y se gatilla en respuesta a inflamación y estrés oxidativo 49.
En IR, el .NO protegería a los hepatocitos y células endoteliales contra la
lesión, efecto que parece estar mediado por la vasodilatación inducida y represión
de la expresión de moléculas de adhesión y selectina–E a nivel endotelial 48-49. La
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expresión de iNOS y el aumento de .NO secundario en el injerto hepático se han
correlacionado con rechazo post THO 50, aunque los niveles séricos de .NO
monitorizados en humanos, intra y postoperatorio de THO, aumentaron y no se
asociaron con patología postoperatoria 28. Los niveles de .NO según se presenten
en el injerto del donante o en el receptor podrían explicar este resultado
aparentemente contradictorio.
1.3.7.- Antioxidantes en isquemia-reperfusión
Se ha observado que los niveles de antioxidantes endógenos caen durante
la reperfusión, lo cual probablemente se debe a su degradación, secundaria al
aumento de la actividad radicalaria. Antioxidantes enzimáticos (SOD) y no
enzimáticos (alopurinol, NAC y α-tocoferol) atenúan el daño por IR 12, 28.
Algunas de las soluciones de preservación que se utilizan en el trasplante
de órganos también contienen antioxidantes, que participan en la prevención o
minimización del daño por isquemia fría. (Tabla 3) 51, 52.
Wisconsin ViaSpan® EuroCollins
Celsior®HTK - Custodiol®
pH 7.4 7.02 - 7.2 Osmolaridad 320 mosm/l 370 mosm/kg 360 mosm/kg 310 mosm/kg Na - Na+ = 85 mmol/l Na+ = 100 mmol/l NaCl = 15,0 mmol/l K KOH = 5.61 g/l K+ = 40 mmol/l K+ = 15 mmol/l KCl = 9,0 mmol/l Cl - Cl- 15 41.5 - Anión Cl : 50 mEq Mg MgSO4 = 1.23 g/l - Mg+2 = 13 mmol/l MgCl = 4,0 mmol/l Ca - - Ca +2 = 0.26 mmol/l CaCl = 0,015 mmol/l Otros iones K2PO4 = 3.4 g/l PO4
-2 = 57.5 mmol/l - - HCO3
- = 10 mmol/l Glucosa - Glucosa 3.5 % - - Aminoácidos - - Histidina = 30 mmol/l Cetoglutarato = 1,0 mmol/l - Glutamato = 20 mmol/l Histidina = 180,0 mmol/l Triptófano = 2,0 mmol/l Glutatión Glutatión = 0.922 g/l - Glutatión = 3 mmol/l - Otros Adenosina = 1.34 g/l - Manitol = 60 mmol/l Manitol =30,0 mmol/l
Alopurinol = 0.136
g/l Lactobionato = 80
mmol/l Rafinosa = 17.83 g/l Lactona = 35.83 g/l
Tabla 3: Descripción de la composición de las soluciones de preservación más utilizadas
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1.4.- Factores de transcripción (NF-κB) y reprogramación de la expresión
génica en situaciones de estrés oxidativo
El factor de transcripción NF-κB es un factor dimérico que se encuentra en
el citoplasma retenido por la proteína inhibidora IκB 53. Diferentes vías de
transducción de señales activan a NF-κB, vía degradación de IκB, liberación del
dímero p50p65 activo y su traslocación al núcleo, con la activación de los genes
que contienen los sitios de unión a proteínas Rel (sitios κB) 53. La relación entre el
estrés oxidativo y la estimulación de la expresión génica está apoyada por la
activación del NF-κB, evidenciada por el aumento significativo en su capacidad de
unión al DNA en situaciones de estrés oxidativo 53, 54.
En IR fría se ha observado que NF-κB tiene un patrón de activación
bifásico, con un pico temprano entre los 30 minutos y 3 horas de reperfusión y un
segundo pico a las 9-12 horas de reperfusión. Durante la fase temprana, la
activación de NF-κB se asocia al aumento en la expresión de citoquinas
proinflamatorias IL-1β, IL-6 y TNF-α, lo que no ocurre durante la fase tardía
donde, por otra parte, la inhibición de la activación de NF-κB resulta en un mayor
daño en el tejido, lo que sugiere un rol dual para este factor de transcripción 55.
Otros factores de transcripción redox sensibles incluyen a AP-1 y entre los
genes de respuesta temprana que O.-2 y H2O2 pueden inducir se cuentan c-jun y
c-fos 9. Algunos mediadores capaces de generar ROS como factores de
crecimiento, TNFα y angiotensina activarían a AP-1 a través de éstos 53. La
activación de AP-1 por algunos mitógenos, ésteres de forbol, RUV, shock térmico,
IR, radiaciones y algunos fármacos también podría ser mediada por ROS, ya que
la activación ejercida por ellos es inhibida por antioxidantes como NAC 9.
Otros genes cuya activación o modulación por ROS ha sido descrita, y que
podrían participar en la respuesta a IR, incluyen los de la heme oxigenasa,
endotelina-1, eNOS y del factor de estrés térmico (Heat shock factor, HSF) 56, 57.
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1.5.- Preacondicionamiento isquémico
Varios órganos responden a la exposición a períodos breves de isquemia u
otros estímulos citotóxicos aumentando su resistencia a un estímulo citotóxico
posterior de mayor duración o severidad, fenómeno denominado
preacondicionamiento. El preacondicionamiento isquémico (PI) se ha descrito en
miocardio, cerebro, intestino, e hígado y consiste en breves períodos de isquemia,
seguidos de reperfusión, previo al insulto isquémico prolongado 58-63.
El clampeo intermitente y el PI otorgan una protección similar ante períodos
de isquemia de 75 minutos, siendo superior el primero cuando el período de
isquemia es más prolongado (120 minutos), aunque con mayor incidencia de
hemorragia entre los ciclos de IR 64. El PI hepático se evidencia con períodos de
isquemia de hasta 90 minutos y un período único de IR breve es suficiente para
inducir hepatoprotección 27. La duración de las fases del ciclo de PI es relevante
en el gatillamiento de los mecanismos que median la protección, ya que períodos
de isquemia de 2, 15, 20 y 30 minutos no son efectivos, mientras que períodos de
isquemia de 5 a 10 minutos sí lo son 27.
En donantes de órganos que han sufrido de paro cardiorrespiratorio (PCR),
que podría considerarse como PI no planificado, la sobrevivencia y función de los
injertos son comparables a aquéllos provenientes de donantes
hemodinámicamente estables, con niveles de transaminasa menores en los
pacientes con antecedentes de PCR 65.
Si bien la técnica del PI ha generado gran interés en el área clínica, no ha
logrado desplazar el uso estándar del clampeo intermitente y se ha utilizado con
reservas en ensayos clínicos. Al momento del planteamiento de esta tesis 66, la
información disponible de ensayos clínicos con PI era escasa 26, 67, 68.
Actualmente, la búsqueda en pubmed con la entrada human liver ischemic
preconditioning arroja 72 resultados: 16 corresponden a ensayos clínicos con PI
en resección o trasplante hepático, y el resto a revisiones que ponderan la utilidad
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práctica y aplicabilidad de la técnica. El año 2000 se publicó la primera
comunicación de PI utilizado en clínica 26, lo que se hizo con un número limitado
de pacientes en los cuales se obtuvo resultados favorables con disminución de
transaminasas séricas en los pacientes preacondicionados antes de la isquemia
durante la resección hepática. El año 2003 se publicó el primer ensayo clínico
aleatorio, que incluyó 100 pacientes, estudio realizado en Suiza 68. En el período
2004-2006, se han publicado 14 artículos, realizados por distintos grupos con
resultados contradictorios 69, 70. La mayoría de los trabajos, sin embargo,
comunican resultados favorables en términos de atenuación del daño generado
por IR 69, 71, 72, aunque la población que potencialmente se beneficiaría de ésta
técnica tendría características particulares. El acento de la investigación en los
distintos grupos ha estado en identificar mediadores y efectores relacionados con
la hepatoprotección, pero la naturaleza de los mecanismos que median la
protección del PI no ha sido esclarecida.
Así como el daño secundario a IR cursa en una etapa temprana y una
tardía, el PI otorga dos marcos temporales de protección, que difieren en sus
mecanismos. La ventana temprana de protección transcurre desde los primeros
minutos de reperfusión hasta 2 a 3 horas posteriores 16. La ventana tardía, descrita
claramente en el corazón, y de menor intensidad respecto de la ventana temprana,
se hace evidente a las 12-24 horas y dura por 2 a 3 días 73. Conceptualmente la
diferencia fundamental entre el preacondicionamiento temprano y la segunda
ventana de protección (SVP) o preacondicionamiento tardío es que, mientras que
en el primer caso el estímulo preacondicionante precede inmediatamente al
período de isquemia prolongado, en el segundo caso el estímulo
preacondicionante está separado por horas de la isquemia letal (Figura 3) 75. La
segunda ventana de protección o fase protectora tardía - retardada del PI se ha
descrito claramente en el corazón 73, pero en el hígado no se han publicado
experiencias en las cuales el período de preacondicionamiento isquémico no
preceda inmediatamente a la isquemia prolongada.
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En la hepatoprotección por el PI pueden concurrir varios mecanismos: (i) la
preservación del nivel de ATP por activación de la quinasa dependiente de AMP 76; (ii) la inducción de sistemas antioxidantes [efecto protector simulado por
glutatión reducido 76]; (iii) el aumento moderado en los niveles de TNF-α 77; (iv) la
liberación de .NO [efecto protector eliminado por la inhibición de NOS y simulado
por donantes de .NO o L-arginina 61]; y (v) mayores niveles de adenosina 61. Este
último mecanismo es dependiente de la síntesis de .NO y ocurriría por activación
del receptor A2 predominantemente, ya que la administración de un antagonista
competitivo revierte los efectos protectores 61, 69, 77, 78.
1.6.- Respuestas hepatoprotectoras gatilladas por el PI
1.6.1.- Señales de supervivencia antiapoptóticas y antioxidantes, mediadas
por TNF-α
Dentro de las respuestas potenciales responsables de la hepatoprotección
que otorga el PI, están las señales de supervivencia mediadas por TNF-α. Si bien
la activación del receptor del TNF-α 1 (TNFR1) se asocia a apoptosis mediada
por caspasas, TNF-α a través de TRAF-2 (TNFR associated factor 2) también
induce la activación de los factores de transcripción NF-κB y AP-1 34. Entre los
genes regulados por NF-κB algunos codifican proteínas necesarias para la
supervivencia celular, como las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, la iNOS que
Figura 3: Ventanas de protección del preacondicionamiento isquémico 75
I.- INTRODUCCIÓN
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contribuye a la nitrosilación e inhibición de caspasa 3 79-80 y la SOD mitocondrial
que bloquea la citotoxicidad inducida por TNF-α y la activación de caspasa 3 81.
1.6.2.- Respuesta de fase aguda y proteínas de shock térmico
La respuesta de fase aguda es una reacción de defensa del organismo
frente a diversas agresiones con el fin restringir el área de daño, y eliminar o aislar
el agente tóxico 82. El hígado es uno de los principales órganos involucrados en la
respuesta de fase aguda y uno de los componentes precoces de esta respuesta
es la estimulación coordinada de la síntesis y secreción hepática de proteínas de
fase aguda 83. IL-1β, TNF-α e IL-6 son los más potentes inductores de la síntesis
de proteínas de fase aguda en los hepatocitos. Las células endoteliales y las
células de Kupffer pueden actuar como amplificadores intrahepáticos de la
respuesta al producir IL-6, TNF-α e IL-1 82.
El patrón de inducción de proteínas de fase aguda puede ser subdividido en
Tipo I (Proteína C reactiva en humanos, haptoglobina y hemopexina en ratas) y
Tipo II (varias cadenas de fibrinógeno y α2-macroglobulina en ratas y haptoglobina,
hemopexina en humanos). Los genes tipo I contienen regiones de respuesta a NF-
κB, AP-1 y factores de la familia C/EBP, mientras que los genes de proteínas de
fase aguda tipo II contienen elementos de respuesta para la familia de factores
STAT y C/EBP (Figura 4) 82.
Figura 4: Respuesta de genes de fase aguda mediada por citoquinas
Citoquinas tipo IL-1 (IL-1β, TNF-α)
Citoquinas tipo IL-6 (IL-6,
LIF, OSM)
Vía esfingomielinas
a/ceramida
Vía MAPK
Vía JAK/STAT
NF-κB AP-1 (fos/jun)
C/EBPβ STAT3/5
Genes de proteínas de fase aguda Tipo I Genes de proteínas de fase aguda Tipo II
I.- INTRODUCCIÓN
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La vía IL-6 - STAT3 regula la expresión de genes de fase aguda, en
particular participan en la activación de la transcripción de los genes de α2-
macroglobulina y haptoglobina. El efecto de TNF-α e IL-1 indica que estas
citoquinas actuarían en forma combinada para regular la expresión de hemopexina
y haptoglobina, probablemente a través de NF-κB 84.
Durante el período postisquémico la respuesta de fase aguda es similar a
aquwlla inducida por un foco inflamatorio extrahepático, aunque en el período
temprano de la reperfusión el hígado sintetiza preferentemente hsp 70 - hsp 89 85.
La familia hsp 70 es la más abundante y conocida dentro de las proteínas de
estrés. En las células normales su presencia es mínima, pero son rápidamente
inducidas en respuesta al calor, etanol, metales pesados, entre otros. Las ROS
que se producen durante la reperfusión también pueden activar los genes de
respuesta al calor (heat shock genes) 86. 4-Hidroxinonenal tiene el mismo efecto
que el shock de calor al promover la unión de HSF (heat shock factor) a HSE (heat
shock element) 85.
Se postula que el estado antioxidante modula la expresión de proteínas de
estrés. En linfocitos de individuos pretratados con antioxidantes y sometidos a
shock de calor en presencia de un generador de radicales libres [(2,2’-azo-bis (2-
amidinopropano)] se observó aumento de la síntesis de hsp 105, hsp 90, hsp 70 y
hsp 40, y una disminución en la síntesis de hsp 32 (HO-1) 87.La enzima heme
oxigenasa (HO) cataliza el corte del α-mesocarbono de la Fe-protoporfirina-IX
dando como productos biliverdina, hierro libre divalente y monóxido de carbono
(CO). HO-2 se expresa en el hígado normal y sería inducida por estrés oxidativo,
mientras que HO-1 se expresa en situaciones de estrés y tiene sitios de unión en
su DNA para AP-1, NF-κB y elementos de respuesta para hipoxia, estrés térmico,
metales pesados e IL-6. HO-1 podría ser hepatoprotectora en IR a través de varias
de sus acciones: (i) controla los niveles intracelulares de hem libre (prooxidante),
(ii) produce biliverdina (antioxidante), (iii) mejora la perfusión vía liberación de CO
y (iv) induce la síntesis de ferritina 88. En este contexto, se ha demostrado que el
daño mediado por linfocitos T depende de la sobreexpresión de HO-1 en el
I.- INTRODUCCIÓN
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modelo de trasplante hepático 89, y que la sobreexpresión lograda por la
transferencia del gen de HO-1 protege al riñón e hígado del daño por IR en el
trasplante 90.
1.7.- Importancia biomédica
A causa de su metabolismo único y relaciones con el tracto gastrointestinal,
el hígado es un blanco importante de la toxicidad de drogas, xenobióticos y estrés
oxidativo 91. La diversidad de mecanismos que median la hepatotoxicidad, que
varían de acuerdo al agente citotóxico, plantean un desafío permanente para
dilucidar estas vías y desarrollar nuevos fármacos o nuevas estrategias que
minimicen el daño 91.
En el caso del estrés oxidativo, al concepto clásico establecido de que las
especies reactivas participan en vías que desencadenan daño 6, se agrega un
nuevo concepto, en el cual el nivel de estrés oxidativo determina los eventos
ulteriores, sean sobrevivencia o muerte celular 92 (Figura 5)
Si durante la isquemia breve que constituye el estímulo preacondicionante
en el PI se genera una baja cantidad de especies reactivas del oxígeno 93, a través
de la modifiación de la activación de factores redox sensibles, éstas pueden
determinar reprogramación génica relacionada con señales de sobrevivencia
celular 94. En el caso del preacondicionamiento temprano, las señales que gatillan
la protección probablemente corresponden a mediadores preformados, ya que el
estímulo preacondicionante precede inmediatamente a la isquemia letal. En el
caso del PI tardío, donde el estímulo preacondicionante precede en horas a la
Baja dosis Dosis intermedia Dosis alta
Especies reactivas del oxígeno
Mitogénesis Proliferación
Arresto crecimiento
Envejecimiento
Muerte celular
Apoptosis Necrosis
Figura 5: Efecto de los niveles de especies reactivas del oxígeno 92
I.- INTRODUCCIÓN
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isquemia letal, de existir la SVP en el hígado, estas señales corresponderían
probablemente a mediadores neoformados que determinarían un fenotipo
tolerante del tejido a la isquemia posterior.
El descubrimiento de estas señales puede llevar a desarrollar
intervenciones que minimicen el daño asociado a IR cuando éste es inevitable
(cirugía o trasplante), o para mejorar las condiciones de injertos marginales que
actualmente son descartados (esteatósis, PCR prolongado) 93.
El determinar la existencia de la SVP en el hígado implicaría establecer un
marco temporal durante el cual se pueden realizar las intervenciones que resulten
en protección. Indudablemente, el hecho de someter a cualquier órgano al
estímulo isquémico mecánico, entendiendo éste como un período de clampeo
breve, lo que implica llevar al sujeto a cirugía en dos ocasiones, no plantea ningún
beneficio ni desde el punto de vista práctico ni desde el punto de vista del riesgo
quirúrgico. La finalidad del PI es, indudablemente, describir el mecanismo y
encontrar los mediadores, señales intermediarias o efectores que permitan su uso,
simulando el efecto protector que se encuentra con la maniobra mecánica.
II.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
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II.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2.1.- HIPÓTESIS:
EL PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO INDUCE UNA SEGUNDA
VENTANA DE PROTECCIÓN EN EL HÍGADO, QUE ES DEPENDIENTE DE LAS
ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO QUE SE GENERAN DURANTE LA
MANIOBRA PREACONDICIONANTE, DETERMINANDO LA ACTIVACIÓN DEL
FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN REDOX SENSIBLE NF-KB Y LA APARICIÓN DE
RESPUESTAS HEPATOPROTECTORAS
2.2.- OBJETIVOS GENERALES
1. Desarrollar el modelo de IR hepática en la rata y caracterizar la curva de
daño y estrés oxidativo que sigue a un período de 60 minutos de
isquemia.
2. Comprobar la existencia de la ventana tardía del PI en el modelo de daño
por IR hepático en la rata y determinar que en la segunda ventana de
protección se produzca (i) menor daño hepatocelular y (ii) menor estrés
oxidativo hepático.
II.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
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3. Comprobar la desaparición de la respuesta hepatoprotectora otorgada por
la ventana tardía del preacondicionamiento isquémico al suprimir la
generación de especies reactivas del oxígeno durante el
preacondicionamiento.
4. Determinar la activación del factor de transcripción nuclear kappa B
durante la ventana tardía de protección del PI, y correlacionar esta
activación con menor daño hepático y la aparición de respuestas
hepatoprotectoras.
2.3.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Evaluar el grado de injuria hepatocelular a través de histología,
determinación de niveles de transaminasas GPT y GOT plasmáticas y
determinación de liberación de LDH al plasma en animales sometidos a IR
hepática precedida o no de un período de preacondicionamiento
isquémico.
2. Evaluar el grado de estrés oxidativo tisular, a través de la medición del
nivel de oxidación de proteínas y contenido de glutatión total en tejido
hepático sometido a IR precedida o no de un período de
preacondicionamiento isquémico.
3. Caracterizar la maniobra de PI para encontrar la ventana temporal a la
cual es posible realizar preacondicionamiento isquémico que resulte en
hepatoprotección frente a un período de isquemia de 60 minutos realizado
con posterioridad.
4. Comprobar la existencia de la ventana tardía del preacondicionamiento
isquémico en el hígado, a través de la confirmación de la disminución de
parámetros de daño hepático (niveles de GOT, GPT, LDH e histología
hepática) en suero o tejido de animales sometidos a un período de
II.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
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preacondicionamiento isquémico, versus suero o tejido de animales no
preacondicionados.
5. Determinar la activación del factor de transcripción NF-κB, durante la
ventana tardía de protección del preacondicionamiento por IR, a través del
aumento de la actividad de unión al ADN (ensayo de EMSA). y comparar
el nivel de activación del factor de transcripción mencionado en animales
preacondicionados versus no preacondicionados.
6. Determinar la activación de otros factores de transcripción redox
sensibles, tales como AP-1 y HSF, durante la ventana tardía de protección
del preacondicionamiento por IR, a través del aumento de la actividad de
unión al ADN (ensayo de EMSA). y comparar el nivel de activación de
estos factores de transcripción en animales preacondicionados versus no
preacondicionados.
7. Determinar los niveles séricos de citoquinas que participan en la
respuesta inflamatoria y que se relacionan con la vía de transducción de
señales a través de NF-κB.
8. Determinar la expresión de proteínas que participan en la respuesta a
estrés y que pueden resultar en hepatoprotección (HO-1, HSP 70, iNOS),
al tiempo de máxima actividad de unión al ADN de NF-κB.
III.- METODOLOGÍA
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III.- METODOLOGÍA
3.1.- Animales de experimentación
Se utilizaron ratas Sprague Dawley, machos, 150 -180 gramos de peso
(Bioterio Central, ICBM, Facultad de Medicina). Los animales fueron mantenidos
con una dieta sólida estándar (Alimentos Champion S.A. Santiago) y agua ad
libitum, con temperatura ambiental controlada y ciclos de luz/oscuridad de 12
horas.
3.2.- Protocolo quirúrgico La cirugía fue realizada con técnica aséptica, de acuerdo a modelos
descritos de isquemia-reperfusión hepática en la rata 95, 96.
Durante los primeros meses de implementación de la técnica la mortalidad
fue de hasta 80% intra o postoperatoria. Para aumentar la sobrevivencia se
modificaron diversos aspectos: anestesia, homeostasis de la temperatura, técnica
quirúrgica, hidratación intra y post operatoria, manipulación del órgano durante el
intraoperatorio y prevención de infecciones, logrando finalmente sobrevivencia del
100% y valores de transaminasas consistentes dentro de los grupos. Este
protocolo, que es el que se describe a continuación, fue el que se utilizó en todos
los experimentos realizados.
Los animales fueron anestesiados con Zoletil® 50, (Clorhidrato de
tiletamina, 25 mg/ml, Clorhidrato de zolazepan 25 mg/ml, Laboratorios Virbac,
III.- METODOLOGÍA
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Carros, Francia), 1 ml/kg peso corporal. La cirugía se realizó sobre un calentador
tipo “slide warmer” (Barnstead Internacional, TermoFisher Scientific, USA) para
asegurar homeostasis de la temperatura, la que se controló durante el curso del
procedimiento. Se realizó incisión media supra e infraumbilical, hasta exponer las
vísceras, las que se desplazaron con gasa embebida en suero fisiológico, para
visualizar la tríada portal. Utilizando tórulas de algodón para tracción-
contratracción se expuso la bifurcación del pedículo hepático que irriga los lóbulos
superior medio y lateral izquierdo, lugar en el que se ubicó el clip tipo Schwartz
(Fine Science Tools, North Vancouver, Canada) (Figura 6).
Figura 6: Clip de Shwartz y esquema del modelo de isquemia hepática parcial en el hígado de rata
El período de preacondicionamiento isquémico se definió como 10 min de
isquemia seguida de reperfusión según protocolo.
Durante la isquemia o su simulación, la pared abdominal se afrontó con
puntos de seda 3-0. Una vez concluida la isquemia, se retiró el clip, se cerró la
cavidad abdominal con puntos totales, se pinceló con clorhexidina y se administró
suero fisiológico (1% del peso corporal en cc, sc). Se dejó a los animales en
recuperación en jaulas separadas con acceso libre al agua y comida hasta el
tiempo de reperfusión correspondiente según el protocolo.
Al final del protocolo se realizó la eutanasia del animal. Previa anestesia
con Pentotal sódico 50 mg/Kg ip, se procedió a:
III.- METODOLOGÍA
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- Obtener muestra de sangre (3 ml) por punción de cava infrahepática, la cual
fue centrifugada a 1085 g por 10 min. El suero obtenido fue guardado en
alícuotas de 300 μl a -20° C.
- Lavar hígado, vía porta, con amortiguador Tris (Tris KCl 0.67 M, pH 7.2) En
estas muestras de tejido isquemizado lavado se realizó determinación de
contenido de glutatión total y nivel de oxidación de proteínas.
- Obtener muestras de tejido hepático sin lavar. Se guardó una muestra de los
lóbulos isquemizados, previa congelación en nitrógeno líquido, a -80° C y un
corte del lóbulo medio en formalina amortiguada en PBS para su posterior
inclusión en parafina, corte y teñido para histología.
Todos los procedimientos realizados en esta tesis que incluyen
experimentación con animales cuentan con la aprobación del Comité de Bioética
de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. (CBA # 077 FMUCH)
3.3.- Grupos experimentales: De acuerdo a los diferentes modelos
analizados se conformaron los siguientes grupos experimentales:
3.3.1.- Modelo de daño por isquemia-reperfusión:
• Grupo A: ISQUEMIA-REPERFUSIÓN (IR). Se mantuvo el clampeo
hepático (isquemia) por 60 min y se realizó reperfusión de 0 a 72 horas,
obteniéndose muestras de sangre y tejido a las 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 y
72 horas post reperfusión. (Figura 7A)
• Grupo B: CONTROL DE OPERACIÓN SIMULADA (Sham). Simulación de
isquemia seguida de 0 a 72 horas (Figura 7B)
III.- METODOLOGÍA
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3.3.2.- Modelo de maniobra de preacondicionamiento isquémico
• Grupo C: MANIOBRA PI (MPI). Se mantuvo el clampeo (isquemia) por 10
min, y se realizó reperfusión de 0 a 72 horas, obteniéndose muestras de
sangre a las 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 horas y de tejido lavado a las 2, 4, 6,
8, 12, y 24 horas. (Figura 7C)
• Grupo D: SHAM MANIOBRA (Sham MPI). Simulación de isquemia seguida
de 0 a 72 horas con muestreos a tiempos similares (Figura 7D)
3.3.3.- Modelo de ventana tardía del preacondicionamiento isquémico
Se realizó la maniobra de PI (10 min de isquemia) seguida de 72 horas de
reperfusión previo al período de isquemia de 60 min Posteriormente se realizó
reperfusión por 3 y/o 20 horas. Algunos grupos fueron inyectados con NAC 0.5
g/kg peso corporal (Sigma, St. Louis, USA) o su vehículo 1 hora antes de
realizarse la maniobra PI.
• Grupo E: PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO (PI+IR): maniobra
preacondicionante 72 horas antes de la isquemia de 60 min seguida de 3 ó
20 horas post reperfusión (Figura 7E)
• Grupo F: SIN PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO O DAÑO POR IR
(Sham+IR): simulación de maniobra preacondicionante 72 horas antes de
la isquemia de 60 min seguida de 3 ó 20 horas post reperfusión (Figura 7F)
• Grupo G: PREACONDICIONAMIENTO SIN DAÑO POR IR (PI+Sham):
maniobra preacondicionante 72 horas antes de la simulación de isquemia
de 60 min y toma de muestras a las 3 ó 20 horas (Figura 7G)
• Grupo H: H.- CONTROL DE OPERACIÓN SIMULADA (Sham): simulación
de la maniobra preacondicionante 72 horas antes de la simulación de la
isquemia de 60 min y toma de muestras a las 3 ó 20 horas (Figura 7H)
III.- METODOLOGÍA
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Figura 7: Diseño experimental
3.4.- Parámetros de daño hepático: 3.4.1.- Evaluación de histopatología hepática: Se utilizó microscopía óptica
para analizar cortes de hígado previamente fijados en formalina amortiguada en
PBS (10%) incluidos en parafina y teñidos con hematoxilina-eosina 97. Los cortes
fueron analizados por un patólogo de forma ciega e informados de acuerdo a la
presencia de inflamación, hemorragia, fibrosis, necrosis, apoptosis y
citoarquitectura del tejido, factores que se evaluaron en forma cualitativa (+ a +++)
3.4.2.- Determinación de actividad de transaminasas plasmáticas: la
determinación de la actividad de transaminasas séricos se realizó con los kits
Enzyline® ALAT/GPT 20 Monoréactif IVD y Enzyline® ASAT/GOT 20 Monoréactif
IVD (Biomerieux® 69280 Marcy l´Etoile. France). La determinación se basa en
incubar la muestra con una mezcla de substratos (ácido α-cetoglutárico con
alanina o ácido aspártico) El ácido oxaloacético o pirúvico que se produce se
acopla a un segundo sistema enzimático en presencia de NADH. La segunda
reacción es catalizada por la enzima deshidrogenasa málica (para AST) o láctica
PI Reperfusión 3 o 20 h Isquemia 60 min72 horas
PI 3 o 20 h Simulación Isquemia 60min
72 horas
3 o 20 h
Reperfusión 3 o 20 h
NAC o
vehículo
NAC o vehículo
NAC o vehículo
Simulación PI
Simulación Isquemia 60min
72 horas
NAC o
vehículo Simulación PI
Isquemia 60 min72 horas
PI Reperfusión 0 a 72 horas
Simulación PI 0 a 72 horas
Isquemia 60 min Reperfusión 0 a 72 horas
Simulación Isquemia 60 min
0 a 72 horas
A B C D
E F G H
III.- METODOLOGÍA
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(para ALT) con la formación de ácido málico o láctico, respectivamente. La tasa de
consumo del NADH por esta segunda reacción se mide espectrofotométricamente
a 340 nm utilizando su coeficiente de extinción molar (ε = 6.22 mM-1 cm-1) 98 lo que
da una estimación indirecta de la actividad transaminasa presente en la muestra.
3.4.3.- Determinación de la actividad de deshidrogenasa láctica (LDH) plasmática: se determinó el nivel de LDH en plasma a través de la oxidación de
NADH en presencia del sustrato piruvato, cuya tasa de desaparición se midió
espectrofotométricamente a 340 nm utilizando el coeficiente de extinción molar del
NADH (ε = 6.22 mM-1 cm-1), estimando de esta manera la actividad de la enzima.
3.5.- Parámetros de estrés oxidativo 3.5.1.- Determinación del contenido de glutatión total: el contenido de glutatión
se determinó de acuerdo a la técnica descrita por Tietze 99 con las modificaciones
descritas por Anderson 100. Este ensayo cíclico tiene lugar en dos pasos. En el
primero de ellos el GSH en presencia de DTNB se oxida:
2 GSH + DTNB GSSG + TNB
Y en un segundo paso la enzima glutatión reductasa cataliza la reacción:
GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+
Siendo:
GSH: forma reducida del glutatión.
GSSG: forma oxidada del glutatión.
DTNB: 5.5-dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico).
TNB: 5-thio-2-ácido nitrobenzoico.
NADPH: forma reducida del fosfato del dinucleótido de nicotinamida y de adenina.
NADP+: forma oxidada del fosfato del dinucleótido de nicotinamida y de adenina.
III.- METODOLOGÍA
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El contenido total de glutatión puede estimarse a partir de la producción de
TNB que se determina a 412 nm. Para las mediciones se utilizaron 40 mg de
hígado homogenizados en hielo en HClO4 0,5M. El homogenizado se centrifugó a
2445 g por 10 min El sobrenadante ácido se neutralizó con K3PO4 1,75 M y se
centrifugó por 10 min a 3020 g. Se diluyó una alícuota de este sobrenadante y se
realizó la medición a 412 nm en presencia de DTNB, NADPH y Glutatión
reductasa.
3.5.2.- Determinación de oxidación de proteínas hepáticas: Se determinó la
formación de derivados carbonilos como índice de oxidación de proteínas,
utilizando el método descrito por Reznick y Packer 101, que corresponde a un
método espectrofotométrico que detecta la reacción de la 2,4-dinitrofenilhidrazina
(DNPH) (Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA) con derivados carbonilos de
las proteínas, para formar derivados proteína hidrazona. Para las mediciones se
utilizó 200 mg de hígado, homogenizados en 3 ml de un tampón fosfato de potasio
50 mM, pH 7,4, digitonina 0,1 %, EDTA 1 mM, PMSF 40 μg/ml, leupeptina 5 μg/ml,
pepstatina 7 μg/ml y aprotinina 5 μg/ml. Luego de incubar por 15 min a
temperatura ambiente, se centrifugó a 6000 g por 20 min Un ml del sobrenadante
obtenido se trató con 4 ml de DNPH 10 mM y otro volumen equivalente de
sobrenadante se trató con 4 ml de HCl 2,5 M. Ambos tubos se incubaron 1 hora a
temperatura ambiente, en oscuridad y con agitación cada 15 min, se adicionó 5 ml
de ácido tricloroacético (TCA) 20 %, incubando en hielo por 10 min y
posteriormente se centrifugó a 6000 g/10 min Las muestras fueron tratadas
nuevamente con TCA y los precipitados resultantes fueron lavados 3 veces con 4
ml de etanol-etilacetato (1/1 v/v) para remover DNPH libre y lípidos contaminantes,
centrifugando por 6000 g/10 min El precipitado se resuspendió en 2 ml de urea 6
M, pH 2,3. El contenido de derivados carbonilos se calculó utilizando la
absorbancia máxima obtenida del espectro de absorción (350-390 nm) de las
muestras tratadas con DNPH, utilizando el coeficiente de extinción molar del
DNPH (22.000 M-1 cm-1) Los resultados se expresaron en nm carbonilos/mg de
proteínas totales. El contenido de proteínas de las muestras se calculó a partir de
III.- METODOLOGÍA
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la absorbancia a 280 nm de muestras precipitadas con HCl 2,5 M y disueltas en
urea 6 M pH 2,3, utilizando como estándar una solución de albúmina de bovino (1
mg/ml).
3.6.- Determinación de niveles séricos de citoquinas: Se realizó mediante
ELISA utilizando los siguientes kits BIOSOURCE (Camarillo. CA. USA): Rat TNF-α
ELISA Kit Catalog KRC3012, Rat IL-10 ELISA Kit Catalog KRC0102, Rat IL-6
ELISA Kit Catalog KRC0062 y Rat IL-1β Kit Catalog KRC0012. Los ensayos se
realizaron de acuerdo a las indicaciones del fabricante. La densidad óptica se
midió a 450 nm en un lector Bio-Rad® 550 (Bio-Rad Laboratorios, Hercules, CA,
USA). Las muestras que contenían niveles altos de citoquinas fueron diluidas y se
repitió su lectura para asegurar que estaban dentro de la curva estándar. Las
mediciones se realizaron en duplicado y los resultados corresponden al promedio
expresado en pg/ml.
3.7.- Evaluación de la actividad de unión al ADN de factores de transcripción (activación) 3.7.1.- Preparación de extractos nucleares: Se prepararon con la técnica
descrita por Deryckere y Ganon 102. El pellet obtenido después de la última
centrifugación (3020 g/5 min) fue resuspendido en 100-500 μL de solución B
(glicerol 25 %, Hepes 20 mM pH 7,9, NaCl 420 mM, MgCl2 1,2 mM, EDTA 0,2 mM,
DTT 0,5 mM, PMSF 0,5 mM, benzamidina 2mM y 5 μg/ml de pepstatina,
leupeptina y aprotinina) e incubado en hielo por 20 min y el lisado nuclear obtenido
se centrifugó por 15 seg. El sobrenadante, que contiene las proteínas de unión a
ADN, fue congelado en nitrógeno líquido y almacenado a –80º C. La
concentración de proteínas del extracto nuclear se determinó utilizando el reactivo
de Bradford (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 103.
III.- METODOLOGÍA
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31
3.7.2.- Electroforesis en geles de retardo EMSA (Electrophoretic Mobility
Shift Assay) para NF-κB, AP-1 y HSF-1
3.7.2.1.- Alineamiento de los oligonucleótidos de ADN: Se utilizaron los
siguientes oligonucleótidos:
Para NF-κB: (a) 5’-GAT CTC AGA GGG GAC TTT-3’ y (b) 5’- CTC GGA AAG TCC CCT
CTG-3’ Para AP-1: (a) 5’-CGC TTG ATG AGT CAG-3’ y (b) 5’-TAC TCA GTC GGC CTT-3’ Para
HSF-1: (a) 5’-GAT CCT TCT GGG AAT TCC-3’ y (b) 5’-GAT CTA GGA ATT CCC AGA-3’
(Invitrogen life technologies, Carlsbad, California, USA).
Para cada reacción a 5 nm del oligonucleótido correspondiente (a y b), pre-
incubados a 70°C por 10 min, se adicionó NaCl 2M estéril (concentración final 300
mM) y se incubó a 37°C por 10 min y luego a 0° por 10 min Luego de adicionar 2,5
volúmenes de etanol absoluto e incubar 1 hora a -20°C, se centrifugó por 15700
g/10 min, se eliminó el sobrenadante y el pellet (lavado una vez con etanol 70 %),
se dejó reposar 1 hora a -20°C antes de centrifugar 15700 g/10 min El pellet, que
corresponde al ADN, se dejó secar a temperatura ambiente, y se resuspendió en
NaCl 150 mM, lo que deja a los oligonucleótidos alineados en una concentración 1
μg/μL.
3.7.2.2.- Marcación de oligonucleótidos: Se preparó un medio de reacción que
contenía 0,5 μL de oligonucleótido alineado, 10 μL de tampón 10x para ADN
polimerasa I (Klenow), 0,5 μL de dNTP 5 mM (dATP, dGTP, dTTP), 2,5 μL de
[α32P] dCTP (Perkin Elmer Life Sciences Inc. Boston, MA, USA), H2O y 1 μL de
ADN polimerasa I (Promega, Madison WI, USA), al cual, luego de incubar 10 min
a temperatura ambiente, se agregó 1 μL de dCTP 4 mM, incubando 5 min a
temperatura ambiente. Posterior a la adición de 60 μL de STE (NaCl 0,1 M, Tris-
HCl 10 mM, pH 8,0 y EDTA 1 mM pH 8,0) se realizó una filtración en columna G-
50 Sephadex para purificar el ADN (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA). Se
III.- METODOLOGÍA
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registró el número de cuentas por minuto (cpm) de 1 μL del oligonucleótido
marcado, el cual debe ser mayor a 100.000.
3.7.2.3.- Ensayo EMSA: Se preparó un medio de reacción que contenía tampón
de diálisis nuclear (Hepes 25 mM pH 7,9, EDTA 0,1 mM pH 8,0, KCl 40 mM,
glicerol 10%, DTT 1 mM, NaF 0,1 mM), tampón 10x footprinting (Hepes 250 mM
pH 7,6, MgCl2 50 mM, KCl 340 mM), poli (dI:dC) 2 mg/ml, oligonucleótido
marcado, NP-40 0,1% y NaCl 150 mM. A 10 μL de este medio (mix) se adicionó
10 μL de extracto nuclear (0,8 μg/μL) incubando en hielo por 15 min. Luego se
agregó 4 μL de azul de bromofenol (BPB) 0,2%/Ficoll 20%, y se mezcló
inmediatamente antes de aplicarlo a un gel de poliacrilamida 6 % (50:1;
acrilamida:bisacrilamida). El gel fue pre-corrido por 1 hora, con recirculación del
tampón de corrida (Tris, ácido bórico y EDTA 0,5 M pH 8,0) 0,5x y la electroforesis
de las muestras se realizó a 100 V por 4 horas a 4°C. Los geles se fijaron en
etanol 20% y ácido acético glacial 10% por 15 min, se secaron al vacío por 1 hora
a 80ºC y posteriormente se expusieron a una película Fuji ( Fuji Photo Film Co.,
Ltd., Tokyo).
3.8.- Evaluación de los niveles de proteínas relacionadas con la supervivencia celular: Para conocer los niveles tisulares hepáticos de
fibrinógeno, haptoglobina, HO-1 y HSP 70 se utilizó el ensayo de Western Blot.
3.8.1- Técnica de Western Blot: 3.8.1.1.- Preparación de las muestras: Los extractos citosólicos hepáticos fueron
preparados por la técnica descrita por Deryckere y Ganon 102. Se utilizó 100 a 500
mg de tejido congelado a –80ºC, transferido a un mortero para ser pulverizado con
nitrógeno líquido, luego se homogeneizó manualmente con 5 ml de solución A
[IGEPAL CA-630 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) (NP-40) 0,6%, NaCl
150 mM, Hepes 10 mM pH 7,9, EDTA 1 mM, fenil-metil-sulfonil-fluoruro (PMSF)
0,5 mM], se transfirió a un tubo de 15 ml y se centrifugó por 15 segundos a 480 g.
III.- METODOLOGÍA
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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El sobrenadante obtenido se incubó en hielo por 5 min y posteriormente se
centrifugó a 3020 g/5 min. El sobrenadante de esta centrifugación (citosol), se
congeló en nitrógeno líquido y se guardó a –80ºC. La concentración de proteínas
del extracto citosólico se determinó utilizando reactivo de Bradford (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA, USA) 103.
3.8.1.2.- Electroforesis en condiciones desnaturantes (PAGE-SDS): Las
proteínas presentes en el extracto tisular obtenido fueron separadas en un gel
SDS-PAGE 14%, según el método descrito por Laemmli 104. Se cargó 20 μL de
una mezcla que contenía 80 μg de proteína previamente desnaturadas a 100ºC y
tampón de muestra (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, glicerol 20%, SDS 4%, β-
mercaptoetanol 0,5% y azul de bromofenol (BPB) 0,1%). Los geles estaban
formados por un gel separador que contenía tampón Tris-HCl/SDS 0,4% pH 8,8,
Acrilamida 30%/Bisacrilamida 0,8%, persulfato de amonio (APS) 10% y N,N,N´,N´-
tetra-metiletilenediamina (TEMED, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), y
un gel concentrador formado por tampón Tris-HCl/SDS 0,4% pH 6,8, Acrilamida
30%/Bisacrilamida 0,8%, APS 10% y TEMED. Cada experimento se realizó
cargando en uno de los pocillos 10 μL de estándar de peso molecular preteñido
(Gibco BRL BenchMark Protein Ladders, Life Technologies Inc., USA). La
electroforesis se realizó en una cámara Protean II mini gel (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA, USA) a 150 V por una hora en tampón de electroforesis (SDS 0,5%,
glicina 1 M, tris base 125 mM).
3.8.1.3.- Western blot: Se utilizó el protocolo descrito por Towbin y col. 105. Las
proteínas separadas por electroforesis en condiciones desnaturantes, se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema semi-seco
Fastblot (Whatman Biometra®, Göttingen, Alemania) a 4 mA por cm2 de
membrana por 20 min, utilizando un tampón de transferencia (tris base 25 mM,
glicina 150 mM, metanol 10%). Finalizada la transferencia, la membrana se
bloqueó con leche (Svelty®, Nestlé Chile S.A.) al 5%p/v en TBS 1% durante 1h a
III.- METODOLOGÍA
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
34
temperatura ambiente, y se lavó 3 veces por 10 con TBS-Tween 20 0,1%. Luego
del lavado la membrana se incubó con el anticuerpo primario correspondiente:
- Fibrinógeno (Anticuerpo policlonal de conejo, Número de catálogo A-0080 y
Haptoglobina (Anticuerpo policlonal de conejo, Número de catálogo A-0030
(DakoCytomation, Dinamarca)
- HSP-70 (Anticuerpo monoclonal de ratón, Número de catálogo sc-24 y HO-1
(Anticuerpo policlonal de conejo, Número de catálogo sc-10789, Santa Cruz
Biotechnology, CA, USA)
La incubación con el anticuerpo primario se realizó a una dilución de 1:1000 a 4ºC
durante toda la noche. Luego de la incubación la membrana se lavó 3 veces por
10 a 15 min con TBS-Tween 20 0.1% y posteriormente se incubó con un segundo
anticuerpo, Anti –ratón o anti -conejo, conjugado con la peroxidasa de rábano
picante (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, USA), durante 1 hora a temperatura
ambiente. La membrana se lavó con TBS-Tween 20 0.1% 2 veces por 10 a 15 min
y finalmente se lavó con TBS durante 15 min. Como sistema de detección se
utilizó el kit quimioluminiscente “SuperSignal®West Pico Chemiluminescent”
(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, USA), utilizando una solución de trabajo que
contenía solución luminol/enhancer y solución peróxido estable, en una relación
1:1. La membrana se dejó por 1 minuto con la solución de trabajo y
posteriormente se expuso a una película de rayos X (Fuji Photo Film Co., Ltd.,
Tokyo). El análisis de las bandas obtenidas se realizó densitométricamente
utilizando el programa ScionImage (Scion Corporation, Frederick MA, USA).
Como control de carga se utilizó la detección de β-actina con un
anticuerpo monoclonal en dilución 1:1000 (ICN Biomedicals, Inc., Ohio, USA),
incubando por una hora a temperatura ambiente.
III.- METODOLOGÍA
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3.9.- Técnica de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa para expresión de iNOS 3.9.1.- Extracción de ARN: El ARN hepático total se extrajo utilizando TRIzol®
(Invitrogen Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA). Se homogeneizó 100 mg
de tejido hepático con 1 ml de TRIzol®, el homogeneizado fue incubado en hielo
por 5 min, se centrifugó a 14.000pm durante 5 min y la fase superior del
centrifugado se transfirió a un tubo adicional al cual se agregó 200 μL de
cloroformo, para luego agitar enérgicamente. Posteriormente se incubó en hielo
por 3 min, se centrifugó a 15700 g por 15 min y la fase acuosa se transfirió a otro
tubo al cual se adicionó 0,5 ml de isopropanol, se mezcló por inversión y se incubó
a temperatura ambiente durante 10 min, centrifugando luego a 15700 g por 10
min. El precipitado obtenido se resuspendió con 200 μL de H2O tratada con
dietilpirocarbonato (DEPC) y se agregó 20 μL de LiCl 8 M, luego se incubó en
hielo seco por una hora, se centrifugó a 15700 g por 30 min a 4ºC. El
sobrenadante fue eliminado, y la pelleta obtenida se resuspendió en 100 μL de
H2O – DEPC. A continuación se adicionó 10 μL de acetato de sodio 3 M y 200 μL
de etanol absoluto (100%), se incubó en hielo seco por 30 min, centrifugando a
15700 g durante 15 min. Luego se agregó a la pelleta 100 μL de etanol 80%,
incubando a –20ºC por 30 min, se centrifugó durante 15 min, se eliminó el
sobrenadante y se dejó secar el precipitado para luego resuspenderlo con 50 μL
de H2O – DEPC y cuantificar espectrofotométricamente el ARN obtenido a 260
nm, y confirmar la estabilidad de su estructura mediante electroforesis en gel de
agarosa 1%.
3.9.2.- Síntesis de ADN a partir del ARN obtenido: Para ello se utilizó
hexanucleótidos al azar (random primers), preparando una mezcla (partidor-ARN)
que contenía 5 μg de ARN total, hexanucleótidos al azar (50 ng/μL) y dNTP 10
mM. Luego cada una de las muestras se incubó a 65 ºC durante 5 min, y se
transfirieron a hielo por al menos 1 minuto. A cada mezcla primer-ARN se le
adicionó 9 μL de la mezcla de reacción que contenía tampón de transcriptasa
III.- METODOLOGÍA
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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reversa 10x, MgCl2 50 mM, DTT 0,1 M y un inhibidor de ribonucleasa, luego se
incubó a 25ºC por 2 min, agregando posteriormente 50 unidades de transcriptasa
reversa (Superscript® II ARNse H- Reverse Transcriptase, Invitrogen Life
Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA) a cada tubo, se mezcló e incubó a 25ºC
durante 10 min. Los tubos se transfirieron a 42ºC y se incubaron a esta
temperatura por 50 min; la reacción se detuvo incubando a 70ºC por 15 min, luego
de lo cual los tubos se colocaron en hielo. El producto obtenido correspondía a
ADNc total, el cual se utilizó posteriormente como molde para los análisis por
PCR.
3.9.3.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): En un tubo estéril se
preparó una mezcla de reacción (amplificación) que contenía tampón 10x PCR,
MgCl2 50 mM, dNTP 10 mM, mezcla de partidores específicos para el gen de
iNOS (sentido 5´- CAA-CAA-CAC-AGG-ATG-ACC-CTA-A- 3´ y antisentido 5´-
GGT-AGG-TTC-CTG-TTG-TTT-CTA-T -3´) (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, USA), ADN polimerasa Taq (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad,
CA, USA) y ADN molde (sección 9.2.2). La mezcla fue incubada en un
termociclador a 94ºC por 3 min para desnaturalizar completamente el ADN molde,
se realizaron 30 ciclos de PCR que consistieron en 30 segundos de
desnaturalización a 94ºC, 45 segundos de alineamiento a 59ºC y la extensión por
30 segundos a 72ºC. Además se hizo elongación adicional incubando por 10 min
adicionales a 72ºC y luego la reacción se mantuvo a 4ºC. El producto del PCR se
mantuvo a –20ºC. Las muestras se analizaron por electroforesis en geles de
agarosa, visualizados mediante tinción con bromuro de etidio y posteriormente
fotografiados. En todas las reacciones se utilizó el estándar classic II 18S de 324
pb (QuantumARN® 18S InteARNl Standards, Ambion Inc., Austin TX, USA) como
estándar interno de normalización. Las bandas del amplificado fueron analizadas
utilizando el programa Scion Image.
.
III.- METODOLOGÍA
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
37
3.10.- Análisis de imágenes: Las bandas obtenidas en los ensayos de EMSA
(sección) Supershift (sección) y Western blot (sección) se analizaron
densitométricamente con el programa Scion Image. (http://www.scioncorp.com).
Los resultados obtenidos se expresaron como unidades densitométricas
arbitrarias.
3.11.- Expresión de resultados y análisis estadístico: Los resultados obtenidos
en los experimentos se expresaron como el promedio de 3 a 8 determinaciones,
más menos la desviación estándar o el error estándar de la media. Para
determinar si las diferencias entre los distintos grupos experimentales eran
estadísticamente significativas se aplicó el test t de Student o las pruebas de
ANOVA unifactorial, seguida del test de Newman-Keuls, ambas con un nivel de
significación de 5 % (GraphPad Prism™ versión 4.0, GraphPad Software, Inc,
SanDiego, CA, USA).
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
38
IV.- RESULTADOS
4.1.- CARACTERIZACIÓN DE UN MODELO DE DAÑO POR ISQUEMIA-REPERFUSIÓN
4.1.1.- Evaluación de parámetros de daño hepático en animales sometidos a isquemia-reperfusión y controles: transaminasas plasmáticas y LDH De las muestras de sangre obtenidas a distintos tiempos de reperfusión
después de 60 minutos de isquemia se obtuvo suero para la determinación
espectrofotométrica de la actividad de ALT, AST y LDH.
En el caso de ALT, (Figura 8A) se observó que la actividad aumenta desde
la primera hora de reperfusión, alcanzando un nivel máximo de aproximadamente
15 veces su valor basal a las 4 y 6 horas. Los valores caen a las 8 horas y
aumentan nuevamente a partir de las 12 horas alcanzando un valor máximo a las
20 horas (15 veces el valor normal), para volver a niveles basales a partir de las
24 horas de reperfusión. De acuerdo al análisis estadístico el aumento es
significativo a las 4, 6 y 20 horas con respecto a los valores control (p<0,001) y
con respecto a los valores registrados a las 0, 48 y 72 horas de reperfusión
(p<0,05). No existe una diferencia estadísticamente significativa al comparar los
valores máximos entre sí. (p>0,05). AST presenta un patrón de aumento similar a
ALT (Figura 8B), registrándose valores significativamente aumentados en
comparación con sus controles a las horas 1, 6, 8 y 20 (p<0,05). El promedio de
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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los valores hallados a las horas 1, 6 y 8 corresponde a aumentos de 10 veces el
valor normal, mientras que el promedio de los valores registrados a las 20 horas
corresponde a 20 veces el valor normal, siendo éste el punto máximo dentro de
estas curva vs 1, 2, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 horas (p<0,05).
Figura 8: Actividad de transaminasas séricas en animales sometidos a 60 minutos de isquemia y reperfusión de 0 a 72 h: La actividad de transaminasas se expresa en unidades internacionales por litro (U/l)
versus el tiempo en horas. Los resultados representan el promedio ± D.S para 4 a 8 animales por tiempo de
reperfusión experimental. En A se muestran los valores de Alanina Amino Transferasa Sérica (ALT o GPT) y
en B los valores de Aspartato Amino Transferasa (AST o GOT). La significancia de las diferencias entre los
valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de ANOVA
unifactorial seguida del test de Newman-Keuls. La significancias se muestran con las letras a y b: A, ap< 0,001
AST IR vs AST Sham (4, 6, 20), bp< 0,05 vs 0, 48, 72 h; B, ap< 0,05 AST IR vs AST Sham (1, 6, 8, y 20), b p<
0,05 vs 1, 2, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 h .
La actividad de LDH (Figura 9) aumenta rápidamente a partir de la primera
hora de reperfusión (alrededor de 25 veces su valor basal) alcanzando niveles
máximos en los puntos correspondientes a la 2da y 4ta horas de reperfusión
(p<0,05 respecto de los controles). Los valores disminuyen entre la 8va y 12ma
horas y aumentan entre las 18 y 20 horas post isquemia (p<0,05). A las 24 horas
los valores vuelven al basal y se mantienen en valores control hasta las 72 horas
de reperfusión.
U/l
Actividad de ALT post 60 min de isquemia
0 10 20 0
500
1000
1500
2000
48 72
IR Sham
Tiempo de reperfusión (h)
a,b a,b
a,b
U/l
Actividad de AST post 60 min de isquemia
0 10 200
500
1000
1500
2000
48 72
IR Sham
Tiempo reperfusion (h)
aa
a,b
a
A B
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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Figura 9: Actividad de Lactato Deshidrogenasa plasmática en animales sometidos a 60 minutos de isquemia y tiempos de reperfusión variables: La actividad de LDH se expresa en unidades internacionales
por litro de suero (U/l) versus el tiempo en horas. Los resultados representan el promedio ± D.S para 4 a 8
animales por tiempo de reperfusión experimental. La significancia de las diferencias entre los valores
promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial
seguida del test de Newman-Keuls La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas
sometidas a isquemia (IR) versus animales con control de operación simulada (sham) se muestra con la letra
a: p<0,05 a las 2, 6, 18 y 20 horas de reperfusión.
4.1.2.- Evaluación histopatológica del hígado La evaluación histológica se realizó en cortes de tejido que fueron obtenidos
de una sección del lóbulo hepático derecho isquemizado. En cada tiempo de
reperfusión se analizaron al menos dos placas histológicas. Los resultados se
presentan en la Tabla 4 y en las Figuras 10 y 11.
Al analizar la Tabla 4, se observa que los signos inflamatorios aparecen
tempranamente después de la isquemia (1 hora) y que, tanto la presencia de PMN
como el grado de necrosis van aumentando conforme aumenta el tiempo de
reperfusión, siendo más intenso a las 4, 6 y 20 horas de reperfusión. Después de
las 24 horas de reperfusión tanto los signos inflamatorios como la necrosis son
más leves o no se observan. Podría decirse que, al tener en cuenta que a las 8 y
12 horas el daño que se describe es comparativamente menor, el comportamiento
del daño histológico también podría seguir una curva bifásica, sin embargo, la
0 10 200
1000
2000
3000
48 72
LDH IR
LDH Sham
Tiempo de reperfusión
Actividad de LDH post 60 minutos de isquemia
a
a
a
a
a=p<0.05 vs
IV.- RESULTADOS
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descripción no permite un análisis cuantitativo del daño ni la comparación en
términos estadísticos.
Tiempo Arquitectura Fibrosis Inflamación Vena
Central Espacio Porta Necrosis
0 Normal (-) Linfo. periportales + + VP + (-)
1 Normal (-) Linfo. periportales +
PMN + sinusoidales
++ a +++ VP + (-)
2 Normal (-) (-) + (-) (-)
4 Normal (-) PMN ++, tumefacción,
puentes de necrosis
++ VP ++ ++ en zona 2,
periportal y
pericapsular
6 Distorsionada (-) PMN ++, tumefacción
y focos de inflamación
sinusoidal
+ Tumefacción
periportal
+ a ++ pericentral
y periportal
8 Normal (-) PMN leve + VP + (-)
12 Distorsionada (-) + inflamación y
tumefacción en zona
2
+/- VP y Disse + + zona 2,
periportal y
pericentral
18 Distorsionada (-) + + (-) ++
20 Distorsionada (-) +++ extensa en zona
2, PMN +++
+ Disse ++ ++ en zona 2,
pericentral y
periportal
24 Normal (-) + + (-) (-)
48 Normal (-) (-) leve (-) (-)
72 Normal (-) Linfo. leve espacio
porta
(-) Disse y
linfácticos +
(-)
Tabla 4: Histología del hígado sometido a isquemia. Se presenta una descripción promedio de al menos dos
cortes por tiempo de reperfusión, consignando la presencia o ausencia (-) de los parámetros y su intensidad de +
a +++. Se informa la apariencia de la citoarquitecura del tejido, presencia de fibrosis, inflamación y necrosis,
apariencia de la Vena (VP) y Espacio Porta y dilatación de la Vena Central
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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Figura 10: Tinción con Hemotoxilina-eosina de cortes de hígado de ratas sometidas a isquemia y
reperfusión temprana. Tiempos de reperfusión de A, 1 hora (200X); B, 2 horas (400X); C, 4 horas
(200X) y D, 6 horas (200X).
En las Figuras 10 y 11 se muestran ejemplos de cortes de tejido hepático
sometido a isquemia a distintos tiempos de reperfusión. En la Figura 10 A se
muestra un corte obtenido 1 hora post-isquemia, la citoarquitectura está
conservada, no hay necrosis ni inflamación, y sólo se observa hemorragia leve. En
B (2h reperfusión), el tejido también tiene un aspecto normal. C, que corresponde
a 4h de reperfusión, muestra un mayor grado de inflamación con presencia de
PMN periportales y en la zona 2, donde además se observan además focos de
necrosis mientras que en D (6h reperfusión) también se observa inflamación
intensa, tumefacción y algunos focos de necrosis.
En la Figura 11 se muestran tiempos de reperfusión más prolongados,
siendo A un corte obtenido a las 18 horas, en el que se aprecian focos de necrosis
e inflamación, que también se observa en B (20h reperfusión) que exhibe focos de
necrosis extensos, hemorragia y alteración de la arquitectura del tejido. En las
muestras obtenidas a las 48 y 72 horas de reperfusión (C y D, respectivamente) el
A
D C
B
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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tejido ha recuperado su arquitectura normal, se observa hemorragia leve, pero no
se aprecian focos de necrosis ni presencia de infiltrado inflamatorio.
La evaluación histológica del hígado muestra que 60 minutos de isquemia
provocan inflamación, disrupción de la arquitectura normal y necrosis del tejido,
signos que se pueden observar temprano en la reperfusión (a partir de la primera
hora) pero que son más intensos alrededor de las 4ta, 6ta, 18va y 20ma horas de
reperfusión.
Figura 11: Tinción con Hemotoxilina-eosina de cortes de hígado de ratas sometidas a isquemia y
reperfusión tardía. Tiempos de reperfusión de A, 18 horas (200X); B, 20 horas (200X); C, 48 horas
(200X) y D, 72 horas (200X).
En el modelo que se presenta los parámetros de daño analizados coinciden
en demostrar el curso bifásico del daño por isquemia-reperfusión. La fase
temprana, de acuerdo a la actividad de transaminasas, se extiende desde la
primera hasta la sexta horas de reperfusión, mientras que LDH muestra daño
entre las horas 2da y 4ta. En la histología hepática se observaron signos de
inflamación desde la primera hora de reperfusión, con focos más extensos de
A
D C
B
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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necrosis en la 4ta y 6ta horas de reperfusión. Se determina para este modelo una
fase temprana de daño por IR que va desde el inicio de la reperfusión (1 h) hasta
la 6ta hora, y se elige, como un punto intermedio dentro de esta fase, la tercera
hora de reperfusión como punto para evaluar la estrategia de protección del PI
dentro de la reperfusión temprana.
En este modelo, durante la reperfusión tardía (más de 6 horas) tanto la
elevación de las enzimas ALT y AST, LDH como los parámetros de inflamación,
distorsión de la arquitectura tisular y necrosis en la histología, coinciden en
mostrar mayor daño alrededor de la 18va-20ma horas de reperfusión, por lo que
dentro de la fase tardía del daño por IR se eligió las 20 horas como punto en el
cual se evaluará la estrategia hepatoprotectora del PI.
4.1.3.- Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en animales sometidos a isquemia-reperfusión y controles Los parámetros de estrés oxidativo tisular se determinaron en muestras de
hígado lavado a las 2, 20, 48 y 72 horas de reperfusión. A través de los métodos
descritos en la sección 3.5 se midió la presencia de modificaciones en las
proteínas debidas a la acción de los ROS y el contenido de GSH en el tejido.
En la Figura 12 se observa la presencia de derivados carbonilos en algunos
aminoácidos de las proteínas hepáticas, los que aumentan significativamente a las
20 horas de reperfusión, lo que demuestra un mayor nivel de estrés oxidativo
tisular a ese tiempo. A otros tiempos de reperfusión (2, 48 y 72 horas) no existen
diferencias significativas en el contenido de carbonilos en el tejido hepático de los
animales sometidos a isquemia y los animales del grupo control.
El contenido GSH se determinó a través del método de Tietze en muestras
de hígado exento de sangre (Figura 13). Se observa que hay una disminución en
el contenido de GSH tanto en los animales sometidos a isquemia como en los
animales control a las 20 h post-reperfusión. Esta disminución es significativa al
compararla con los resultados obtenidos a las 2 h en el grupo IR y a las 72 h en
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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ambos grupos, lo que implica que el estrés quirúrgico per se disminuye los niveles
de GSH. La recta de descenso en el grupo sometido a IR tiene una pendiente
mayor vs el grupo control, por lo que se calculó la velocidad de depleción del
Glutatión en ambos grupos entre la 2da y la 20ma horas (Figura 14).
Figura 12: Contenido de derivados carbonilos, producto de oxidación de proteínas en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia: Los niveles de carbonilos se expresan como nanomoles de carbonilo
por miligramos de proteína, los resultados representan el promedio ± D.S. para 4 a 6 animales por grupo
experimental. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas sometidas o no a
isquemia fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls: a p<0,05
vs IR 20 h
Figura 13: Contenido de Glutatión total en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia: Los
resultados se expresan como μmoles de Glutatión por gramo de hígado y representan el promedio ± D.S para
4 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas
sometidas a isquemia y sometidas a operación simulada (sham) fue determinada por las pruebas de ANOVA
unifactorial y test de Newman-Keuls: a p<0,05 vs IR 20 h; b p<0,05 vs Sham 20 h.
Presencia de grupos carbonilos en proteínas hepáticas post 60 minutos de isquemia
0 20 40 60 800
1
2
3
4
5
6
7
8
9
a: p<0.05 vs IR 20h
a
a
a
a
aa
a
Tiempo de reperfusión (h)
nmol
es c
arbo
nilo
s/m
g pr
otei
na
Sham
IR
sham
IR
Contenido de glutatión total en tejido hepático
0 20 40 60 800.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
a: p<0.05 vs IR 20h
a,b
a,b
a,b
b: p<0.05 vs Sham 20hTiempo de reperfusión (h)
μmol
/g h
ígad
o
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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Figura 14: Velocidad de depleción de Glutatión entre las 2 y 20 horas de reperfusión del contenido de en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia: Los resultados se expresan como μmoles de
Glutatión por gramo de hígado y representan el promedio ± D.S para 4 a 6 animales por grupo experimental.
La significancia de la diferencia entre los animales IR vs Sham fue determinada por el test t de Student para
datos no pareados (p<0,05)
La diferencia en la velocidad de depleción resultó estadísticamente
significativa al comparar los grupos IR vs Sham, lo que indica que la disminución
de GSH es más rápida en los animales sometidos a isquemia. Es decir, el estrés
quirúrgico y la recuperación postoperatoria (que implica menor consumo de
alimento) determinan una caída en GSH en ambos grupos, pero la tasa de
consumo de GSH es mayor en los animales sometidos a isquemia, lo que se
traduce en mayor velocidad de consumo de Glutatión.
Como parámetro adicional para estimar el estrés oxidativo tisular se calculó
la razón entre los contenidos de proteínas oxidadas y de GSH, lo que constituye
un índice de estrés oxidativo parcial, ya que relaciona un parámetro indicativo de
actividad prooxidante, con otro de connotación antioxidante. El índice de estrés
oxidativo (Figura 15) fue significativamente mayor en animales sometidos a
isquemia a las 20 y 48 h de reperfusión.
60 minutos de isquemia provocan un estado de estrés oxidativo tisular que
es objetivado por los parámetros obtenidos a las 20 y 24 h de reperfusión, valores
que vuelven a rangos normales a las 48 h post-reperfusión.
Depleción de GSH (2-20h reperfusión)
-0.15
-0.05
0.05
0.15
Sham IR
μ m
oles
GSH
/h/g
r hí
gado
* p<0.05
IV.- RESULTADOS
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Figura 15: Índice de estrés oxidativo entre las 2 y 72 horas de reperfusión en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia: Los resultados se expresan como la relación entre los contenidos de
proteínas oxidadas y de GSH y representan el promedio ± D.S para 3-14 animales por grupo experimental. La
significancia de la diferencia entre el índice de estrés oxidativo en los animales IR vs Sham fue determinada
con el test de ANOVA unifactorial seguido del test de Newman-Keuls ap<0,05.
4.1.4.- Cinética de la actividad de unión a ADN de NF-κB en animales
sometidos a isquemia-reperfusión y controles Se evaluó la actividad de unión al ADN del factor de transcripción nuclear
NF-κB en extractos nucleares obtenidos de muestras de hígado sometido a
isquemia y distintos tiempos de reperfusión (Figura 16).
En la Figura 16 se observa que NF-κB se activa temprano dentro de la
reperfusión en el tejido hepático de animales sometidos a isquemia y que esta
activación es transitoria (2da a 6ta horas), volviendo al nivel basal a partir de la 8va
hora de reperfusión. Se muestra en azul como un parámetro de comparación el
nivel de activación de NF-κB que se logra con LPS, siendo la activación que se
logra con IR similar. La actividad de unión al ADN aumenta nuevamente a partir de
la 12ma hora, siendo significativa con respecto a los niveles basales a las 18, 20,
24, 48 y 72 horas.
Índice de estrés oxidativo
0 25 50 750
1
2 sham
IR
Tiempo de reperfusión (h)
a
a
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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Actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en tejido hepáticopost 60 minutos de isquemia
0 10 200
10
20
30
40
50
60
48 72Tiempo de reperfusión (h)
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
aaa
a
a
a: p<0.05 vs basal
a
1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C
Grupos experimentales (tiempo de reperfusión en horas post isquemia)
NF-κB
A
B
Basal
IRLPS
Actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en tejido hepáticopost 60 minutos de isquemia
0 10 200
10
20
30
40
50
60
48 72Tiempo de reperfusión (h)
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
aaa
a
a
a: p<0.05 vs basal
a
1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C
Grupos experimentales (tiempo de reperfusión en horas post isquemia)
NF-κB
A
B Actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en tejido hepáticopost 60 minutos de isquemia
0 10 200
10
20
30
40
50
60
48 72Tiempo de reperfusión (h)
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
aaa
a
a
a: p<0.05 vs basal
a
1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C
Grupos experimentales (tiempo de reperfusión en horas post isquemia)
NF-κB
A
B Actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en tejido hepáticopost 60 minutos de isquemia
0 10 200
10
20
30
40
50
60
48 72Tiempo de reperfusión (h)
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
aaa
a
a
a: p<0.05 vs basal
a
1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C
Grupos experimentales (tiempo de reperfusión en horas post isquemia)
NF-κB
1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C
Grupos experimentales (tiempo de reperfusión en horas post isquemia)
1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C
Grupos experimentales (tiempo de reperfusión en horas post isquemia)
NF-κB
A
B
Basal
IRLPS
Basal
IRLPS
Figura 16: Efecto de 60 minutos de isquemia sobre la cinética de unión al ADN de NF-κB hepático
durante la reperfusión. A. EMSA utilizando la secuencia consenso para NF-κB (sección 3.7.2). B. Los
resultados están expresados en unidades densitométricas arbitrarias que resultan del análisis de las bandas
de A y representan el promedio ± D.S. para 3 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las
diferencias entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las
pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,05 vs control.
4.2.- CARACTERIZACIÓN DE LA MANIOBRA DE PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO
Para identificar la Segunda Ventana de Protección del PI (SVP) se realizó
una isquemia breve, de acuerdo a lo descrito por la mayoría de los autores en el
PI hepático, de 10 minutos de isquemia y se esperó 24 horas de reperfusión (de
acuerdo a los trabajos de SVP en miocardio) antes de someter al tejido a la
isquemia prolongada. Los resultados que se obtuvieron, sin embargo, no fueron
positivos y los animales que fueron sometidos al PI tuvieron mayor elevación en
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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las transaminasas séricas que los animales a los que se les sometió a una
operación simulada (sham) en lugar de la maniobra preacondicionante, diferencia
que además resultó estadísticamente significativa en el caso de AST (Figura 17).
Figura 17: Actividad de transaminasas séricas en animales sometidos PI 24 h antes de la isquemia prolongada. La actividad de transaminasas se expresa en U/l. Los resultados representan el promedio ± D.S
n=3-6. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia
fue determinada por t de Student para datos no pareados. La significancia de las diferencias entre los valores
promedio de ratas sometidas a isquemia (IR) versus animales con control de operación simulada *p< 0,05
Este resultado se repitió con intervalos de 15 y 20 horas entre la maniobra
preacondicionante y la isquemia prolongada. Se infiere que en el caso del hígado
el intervalo de tiempo que separa la maniobra preacondicionante de la isquemia
letal debería ser más prolongado, ya que los intervalos de tiempo que resultan
exitosos en el corazón, probablemente no son suficientes para que el tejido se
recupere de la primera isquemia y ésta resulta en un daño mayor al sobrevenir el
segundo período de isquemia. Con el objetivo de definir este intervalo de tiempo
se caracterizó la maniobra de preacondicionamiento isquémico en el hígado de
rata.
*
Actividad de AST en animales sometidos a PI con una ventana de 24 horas previo 60 minutos de isquemia
0
250
500
750
1000
1250
IR 3 PI + IR 30
100
300
500
700
900
Actividad de ALT en animales sometidos a PI con una ventana de 24 horas previo 60 minutos de isquemia
IR 3 PI + IR 3
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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4.2.1.- Evaluación de parámetros de daño hepático en animales sometidos a la maniobra preacondicionante: actividad de transaminasas plasmáticas
Se sometió a los animales a 10 minutos de isquemia seguidos de reperfusión
de 0 a 72 horas y se obtuvo muestras de sangre para determinación de las
transaminasas ALT y AST.
Figura 18: Actividad de transaminasas séricas en animales sometidos a maniobra de preacondicionamiento isquémico y controles. La actividad de transaminasas se expresa en U/l (Niveles de
AST en A y actividad de ALT en B). Los resultados representan el promedio ± D.S para 3 a 6 animales por
tiempo de reperfusión experimental. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas
control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de
Newman-Keuls. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas sometidas a isquemia
(IR) versus animales con control de operación simulada (sham) se muestran con las letras a, b y c.
La Figura 18 muestra que la maniobra de preacondicionamiento isquémico
(MPI) produce una elevación en la actividad de transaminasas séricas AST y ALT,
alza que es significativa al compararla con los animales sometidos al control de
operación simulada, aunque el procedimiento per se también provoca alzas
enzimáticas leves. En el caso de AST (Figura 18 A) la elevación de la
concentración sérica en animales sometidos a MPI es de alrededor de 6 veces el
nivel basal (alrededor de 50 U/l), alcanzando la elevación máxima a las 2 y 6 horas
de reperfusión y volviendo a los basales después de las 48 horas. ALT (Figura 18
B) aumenta también a las 2 y 6 horas, pero menos de 3 veces su valor normal,
volviendo al nivel basal después de las 48 horas. Si bien la concentración sérica
de ambas enzimas aumenta significativamente después de 10 minutos de
a: p< 0.001 MPI vs Sham b: p< 0.001 MPI 48 vs MPI 2, 6, 8 c: p<0.05 Sham 48 vs Sham 4
Actividad de AST post maniobra de PI
0 10 20 30 40 50 60 70
50
150
250
MPI Sham MPI
Tiempo de reperfusión (h)
U/ a b a
c a: p< 0.05 MPI vs Sham b: p<0.05 MPI 48 vs MPI 2, 6
Actividad de ALT post maniobra de PI
0 10 20 30 40 50 60 700
20
40
60
80
100
120
MPI Sham MPI
Tiempo de reperfusión (h)
U/
a a
b
A B
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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isquemia, ésta elevación es mucho menor al compararla con la elevación
enzimática que se produce después de 60 minutos de isquemia. A las 24 horas de
reperfusión, que fue el tiempo de ventana que se ensayó inicialmente entre la MPI
y la isquemia prolongada, la actividad de transaminasas persiste levemente
elevada.
4.2.2.- Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en animales sometidos a la maniobra preacondicionante y controles Se tomaron muestras de tejido hepático lavado a distintos tiempos post 10
minutos de isquemia y se determinó el contenido de GSH y nivel de oxidación de
proteínas.
Las proteínas oxidadas aumentaron significativamente en los animales
sometidos a isquemia a las 6 horas de reperfusión (Figura 19 A). El contenido de
Glutatión en los animales sometidos a isquemia muestra una tendencia a la caída
a las 4 y 6 horas, que no resultó estadísticamente significativa (Figura 19 B). El
índice de estrés oxidativo, la razón entre proteínas oxidadas y GSH, tiene un
aumento significativo a las 6 horas de reperfusión (Figura 19 C).
Se concluye que 10 minutos de isquemia provocan daño hepático y
aumento en el estado de estrés oxidativo tisular, ambos leves, que tienen un punto
máximo a las 6 horas de reperfusión. Los parámetros de daño hepático vuelven al
nivel basal después de las 48 horas de reperfusión, mientras que los parámetros
de estrés oxidativo sufren un alza tan leve que no es evidenciable más allá de las
24 horas de reperfusión con los ensayos utilizados. Se elige un período de 72
horas como intervalo entre la maniobra de PI y la isquemia prolongada para
buscar la SVP del PI.
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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Figura 19: Parámetros de estrés oxidativo en animales sometidos a MPI y controles. A) Contenido de
derivados carbonilo, B) Contenido de Glutatión total e C) Índice de estrés oxidativo en hígado de ratas
sometidas a 10 minutos de isquemia. Los resultados representan el promedio ± D.S. para 4 animales por
grupo experimental. Los resultados correspondientes a los animales sometidos a control de operación
simulada (Sham) fueron normalizados. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas
sometidas (MPI) o no (Sham) a la maniobra fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida
del test de Newman-Keuls a p<0,05.
4.3.- FASE TARDÍA DEL PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO
4.3.1.- Evaluación de parámetros de daño hepático en animales
sometidos a PI y controles Se realizó una maniobra de PI (MPI) que consistió en 10 minutos de
isquemia. En los animales en que no se realizó MPI, se hizo una laparotomía de
las mismas características, sin la colocación de clamp (Sham). 72 horas después
del PI los animales fueron reintervenidos y se les sometió a un período de
isquemia, que se denominó isquemia prolongada o letal, de 60 minutos. Los
0 2 4 6 8 10 12 14
0.5
1.0
1.5Sham
MP
Reperfusión (h)
Contenido relativo de GSH
0 2 4 6 8 10 12 14
1
2
3
Sham MP
a
Contenido relativo de carbonilos en proteínas
Reperfusión (h)
A
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
ShamMPI
a
Reperfusión (h)
Índice relativo POX/GSH
B
C
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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parámetros correspondientes a daño hepático fueron evaluados a las 3 y 20 horas
de reperfusión, que corresponden a puntos representativos de las fases temprana
y tardía del daño por IR de acuerdo a lo descrito en la sección 4.1 del modelo de
daño por IR.
4.3.1.1.- Evaluación de actividad de transaminasas plasmáticas Se determinó la actividad de las transaminasas ALT y AST en suero
obtenido a partir de muestras de sangre a las 3 y 20 horas post isquemia
prolongada.
Los controles utilizados corresponden a animales que fueron sometidos a
dos cirugías simuladas (Sham) o a PI sin isquemia (PI + Sham) con 3 o 20 horas
post quirúrgicas. Ambos controles presentaron resultados similares en los dos
tiempos de reperfusión (3 y 20 h), por lo que se agruparon en un grupo Sham y un
grupo PI + Sham, independientemente del tiempo de reperfusión. Asimismo, los
grupos Sham y PI + Sham no mostraron diferencias estadísticas entre sí en
ninguno de los marcadores de daño, lo que indica que los resultados obtenidos no
se deben a la maniobra preacondicionante per se, por lo que los resultados
obtenidos en los grupos sometidos a isquemia y preacondicionamiento isquémico,
fueron comparados con los resultados obtenidos en el grupo Sham. En la Figura
20 A se presentan los resultados de ALT. Se observa que ésta tuvo un alza
significativa con 60 minutos de isquemia en los animales que no fueron sometidos
a PI de 728±408 U/l a las 3 horas post-isquemia (Sham+IR 3) y de 913±871 a las
20 horas post-isquemia (Sham+IR 20). Al aplicar el PI 72 horas antes de la
isquemia prolongada, éste resulta en hepatoprotección, disminuyendo los valores
de ALT a 487±299 y 294±104, a las 3 y 20 horas respectivamente (grupos PI+IR 3
y PI+IR 20). La protección obtenida es estadísticamente significativa en la fase
tardía del daño, aunque en la fase temprana aparece una tendencia. Se graficó la
diferencia de los promedios de transaminasas obtenidos en los distintos grupos
(control vs daño y daño vs protección) y el cambio porcentual de ALT obtenido con
el PI en la fase temprana y tardía, lo que se muestra en el panel B de la Figura 20.
IV.- RESULTADOS
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El porcentaje de disminución de ALT obtenido a las 3 horas post isquemia es de
27%, mientras que a las 20 horas la disminución que se obtiene con el PI sobre el
daño es de 56%.
Figura 20: Actividad de ALT sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. La actividad de ALT se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados
representan el promedio ± SEM para 7 a 15 animales por grupo experimental. En el panel A se muestran los
valores de ALT de animales controles, preacondicionados y no preacondicionados evaluados a las 3 o 20
horas de reperfusión. Los resultados se muestran en conjunto, pero los grupos comparados fueron: (Sham vs
Sham+IR 3 vs PI+IR 3) y (Sham vs Sham+IR 20 vs PI+IR 20). La significancia de las diferencias entre los
valores promedio de los grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de
Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a, b y c: a p< 0,01 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham, c p<0,05 vs
Sham+IR 20. En el panel B se muestra la el porcentaje de modificación del daño que se obtiene a las 3 o 20
horas con el PI.
En la Figura 21 A se presentan los resultados de AST. Se observa que ésta
tuvo un alza significativa con 60 minutos de isquemia de 1013±208 U/l a las 3 y de
984±929 a las 20 horas post-isquemia. Al realizar PI éste resulta en
hepatoprotección, disminuyendo los valores de ALT a 729±282 y 294±104, a las 3
y 20 horas respectivamente (PI+IR 3 y PI+IR 20). La protección obtenida es
estadísticamente significativa en la fase tardía del daño. Nuevamente la protección
que se obtiene es cuantitativamente mayor a las 20 horas. En el panel B se
muestra el cambio porcentual de ALT obtenido con el PI a las 3 o 20 horas. Se
observa que el porcentaje de disminución de AST a las 3 horas post-isquemia es
de 28%, mientras que a las 20 horas la disminución que se obtiene con el PI es de
70%.
-500
-250
250
500
Modificación de ALT 3 vs 20
Daño
Protección
0
3 h
20 h
56% 27%
B
0
250
500
750
1000
1250
U/l
Niveles de ALT durante la reperfusión temprana y tardía en animales sometidos a PI
3 h 20 h
PI +IR 20
Sham+IR 20
Sham
PI+shamSham+ IR 3
PI +IR 3
a
a
b
c
A
U/l
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Figura 21: Actividad de AST sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. La actividad de AST se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados
representan el promedio ± SEM para 7 a 15 animales por grupo experimental. En el panel A se muestran los
valores de AST de animales controles, preacondicionados y no preacondicionados evaluados a las 3 o 20
horas de reperfusión. Los resultados se muestran en conjunto, pero los grupos comparados fueron: (Sham vs
Sham+IR 3 vs PI+IR 3) y (Sham vs Sham+IR 20 vs PI+IR 20). La significancia de las diferencias entre los
valores promedio de los grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de
Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a, b y c: a p< 0,01 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham, c p<0,05 vs
PI+IR 20. En el panel B se muestra el porcentaje de modificación del daño que se obtiene a las 3 o 20 horas
con el PI.
4.3.1.2.- Evaluación de la actividad de LDH plasmática Como un parámetro adicional de daño se evaluó la actividad de LDH sérica
en los animales sometidos a PI en muestras de sangre obtenidas a las 3 ó 20
horas de reperfusión post isquemia prolongada.
En la Figura 22 A se observa que LDH aumenta significativamente con 60
minutos de isquemia (p<0,001) a 1810±395 en la reperfusión temprana y a
1376±860 en la reperfusión tardía y que se logra una disminución significativa de
LDH sérico con el PI en el grupo evaluado durante la reperfusión tardía 555± 139
(p<0,05), disminución que no es observable durante la reperfusión temprana. En
efecto, el porcentaje de disminución de LDH a las 3 horas post-isquemia es de
21%, mientras que a las 20 horas la disminución con el PI es de 40% (Figura 22
B).
PI +IR 20
Sham+IR 20
Sham
PI+shamSham+ IR 3
PI +IR 3
Niveles de AST durante la reperfusión temprana y tardía en animales sometidos a PI
0
250
500
750
1000
1250 U
/l
20 h 3 h
a a
c
b
Modificación de AST 3 vs 20
Daño
Protección
-1000
0
1000
3 h
20 h
70% 28%
A B
U/
IV.- RESULTADOS
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Figura 22: Niveles de LDH sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. La actividad de LDH se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados
representan el promedio ± SEM para 7 a 15 animales por grupo experimental. En el panel A se muestran los
valores de ALT de animales controles, preacondicionados y no preacondicionados evaluados a las 3 o 20
horas de reperfusión. Los resultados se muestran en conjunto, pero los grupos comparados fueron: (Sham vs
Sham+IR 3 vs PI+IR 3) y (Sham vs Sham+IR 20 vs PI+IR 20). La significancia de las diferencias entre los
valores promedio de los grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de
Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a y b: a p< 0,001, bp<0,05 vs Sham+IR 20 vs Sham. En el
panel B se muestra el porcentaje de modificación del daño que se obtiene a las 3 o 20 horas con el PI.
4.3.2.- Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en animales sometidos a PI y controles
En el análisis del modelo de daño se observó que un período de isquemia
de 60 minutos aumentaba los niveles de proteínas oxidadas en el tejido hepático a
las 20 horas de reperfusión, el contenido de Glutatión no se modificaba versus
animales Sham, pero sí la velocidad de consumo de éste, que era mayor en los
animales sometidos a isquemia (sección 4.1.2). Para determinar si el PI modifica
el estado de estrés oxidativo tisular que provocan 60 minutos de isquemia, de
acuerdo a lo descrito para el modelo de daño por IR (sección 4.1.2) se evaluó el
contenido de Glutatión total y de proteínas oxidadas en animales sometidos a PI e
isquemia durante la reperfusión tardía.
Las proteínas oxidadas aumentaron significativamente en los animales
sometidos a isquemia a las 20 horas de reperfusión (Figura 23, p<0,05 vs Sham).
Al realizar PI 72 horas antes de la isquemia la oxidación de proteínas disminuye
PI +IR 20
Sham+IR 20
Sham
PI+shamSham+ IR3
PI +IR 3
20 h
Niveles de LDH durante la reperfusión temprana y tardía en animales sometidos a PI
0
500
1000
1500
2000 U
/l
3 h
Modificación de LDH 3 vs 20
Daño
Protección
0
3 h
20 h
B
-
100
200
21% 40%
A
U/
a a
a
b
IV.- RESULTADOS
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en comparación con el nivel encontrado en los animales isquemizados y no
preacondicionados (p<0,01)
Figura 23: Oxidación de proteínas hepáticas en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada: Los niveles de carbonilos se expresan como nanomoles de carbonilo por miligramos de proteína,
los resultados representan el promedio ± SEM. para 5 a 10 animales por grupo experimental. La significancia
de las diferencias entre los valores promedio de los grupos experimentales fue determinada por las pruebas
de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls. ap<0,05 vs Sham, bp<0,01 vs Sham+ IR 20.
Figura 24: Contenido de Glutatión total en hígado de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada: Los resultados se expresan como μmoles de Glutatión por gramo de hígado y
representan el promedio ± D.S para 4 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias
entre los valores promedio de ratas sometidas a isquemia y sometidas a operación simulada (sham) fue
determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls y el test t de Student
para valores no pareados. Se indica sobre cada punto con la letras a: a p<0,05 vs Sham
Presencia de grupos carbonilos en proteínas de tejido hepático de animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía
Sha Sham+IR PI+IR 0
1
2
nmol
es c
arbo
nilo
/mg a
b
Contenido de glutatión total en tejido de animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía
Sha Sham+IR PI+IR 0
1
2
3
4
5
6
μ m
oles
GSH
/g
a
IV.- RESULTADOS
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En la Figura 24 se presentan los resultados de contenido de GSH, el cual
disminuye significativamente en los animales sometidos a isquemia sin PI y se
observa una clara tendencia a la recuperación como efecto del PI previo al período
de isquemia de 60 minutos. Al aplicar el test de ANOVA sin embargo, esta
diferencia no resultó significativa.
El índice de estrés oxidativo se presenta en la Figura 25. Éste aumentó
significativamente en los animales sometidos a isquemia sin PI (p<0,001 vs Sham)
y se recupera retornando a los niveles obtenidos en los animales control con el PI
(p<0,05 vs PI+IR 20)
Figura 25: Índice de estrés oxidativo en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. Los resultados se expresan como la relación entre los contenidos de proteínas oxidadas y de
GSH y representan el promedio ± D.S para 3-14 animales por grupo experimental. La significancia de la
diferencia entre el índice de estrés oxidativo en los animales IR vs Sham fue determinada con el test de
ANOVA unifactorial seguido del test de Newman-Keuls ap<0,05
4.4.- Evaluación del efecto del pretratamiento con antioxidante sobre el preacondicionamiento isquémico. En la hipótesis se planteó que la hepatoprotección lograda con el PI
dependería de las ROS generadas durante la MPI las que gatillarían vías de
protección redox sensibles que modificarían el patrón celular de expresión de
proteínas a nivel transcripcional favoreciendo aquellas relacionadas con vías de
sobrevivencia celular. Una vez lograda la protección mediante el PI se pretrató a
los animales, una hora antes de la MPI con un antioxidante (NAC 0,5 mg/g peso
corporal). Se esperaba que el NAC aboliera la síntesis de ROS durante MPI, en
Indice de estrés oxidativo en animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía
Sham Sham+IR 20 PI+IR 200.
0.
1.
1.
2.
2. a
b
PO
X/G
SH
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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consecuencia, el efecto protector y que por lo tanto, los animales pretratados con
NAC mostrarían niveles de transaminasas similares a los animales no sometidos a
PI. Los resultados de este ensayo se muestran en las Figuras 40 y 41.
En la Figura 26 se presenta la actividad de ALT y AST obtenida durante la
reperfusión temprana. Al administrar NAC o su vehículo PBS y hacer los controles
de cirugía simulada (NAC Sham o PBS Sham) la actividad de las transaminasas
no se modifica al compararla con los valores controles Sham realizados
previamente. Al pretratar los animales con NAC o su vehículo y someter a los
animales a 60 minutos de isquemia, sin la realización de preacondiconamiento
isquémico previo, la actividad de transaminasas, tanto ALT (panel superior) como
AST (panel inferior) se mantienen elevados (alrededor de 1000 U/l). Esta alza es
significativa al compararla con los dos grupos controles (p<0,001), es decir, NAC
no interviene en el daño provocado por 60 minutos de isquemia. El tratamiento con
NAC se realizó 1 hora antes de la MPI o su simulación, esto es, 73 horas antes de
la isquemia prolongada. Asimismo, el pretratamiento con NAC no modificó el
efecto del preacondiconamiento isquémico, y tanto el grupo tratado con NAC como
el grupo tratado con PBS que fueron sometidos a PI y luego a isquemia de 60
minutos mostraron niveles mas bajos de transaminasas en relación a su control de
daño (no sometido a PI, p>0,01) y no mostraron diferencias significativas entre sí
(p>0,05). Es decir, el pretratamiento con antioxidantes no evita la hepatoprotección
mediada por el PI.
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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Figura 26: Efecto del pretratamiento con NAC sobre las transaminasas séricas de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada durante la reperfusión temprana. La actividad de
transaminasas se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados representan el promedio
± SEM para 4 a 7 animales por grupo experimental. En el panel superior se muestran los valores de ALT y en
el panel inferior los de AST. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de los grupos fue
determinada por las pruebas de ANOVA bifactorial seguida del test de Bomferroni.
Al evaluar el efecto del pretratamiento con antioxidantes sobre la
hepatoprotección lograda con el PI durante la reperfusión tardía (Figura 27) los
resultados obtenidos son muy similares a aquellos que se obtuvieron durante la
reperfusión temprana: NAC o PBS no modifican la actividad de transaminasas que
se obtiene en los controles, no alteran el daño generado por 60 minutos de
isquemia ni evitan el efecto hepatoprotector de 10 minutos de isquemia 72 horas
antes de la isquemia prolongada.
Efecto de NAC sobre los niveles de ALT durante la reperfusión temprana
0
250
500
750
1000
1250 NAC Sham
PBS Sham
NAC Sham+IR 3
PBS Sham+IR 3
NAC PI+IR 3
PBS PI +IR 3 U
/l
Efecto de NAC sobre los niveles de AST durante la reperfusión temprana
0
250
500
750
1000
1250
U/l
p>0,05
p>0,05
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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Figura 27: Efecto del pretratamiento con NAC sobre las transaminasas séricas de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada durante la reperfusión tardía. La actividad de
transaminasas se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados representan el promedio
± SEM para 4 a 7 animales por grupo experimental. En el panel superior se muestran los valores de ALT y en
el panel inferior los de AST. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de los grupos fue
determinada por las pruebas de ANOVA bifactorial seguida del test de Bomferroni.
4.5.- Evaluación de los niveles de citoquinas séricas en animales sometidos a PI y controles:
Se estimó los niveles séricos de citoquinas TNF-α, IL-6, IL-10 e IL1β a
través del ensayo de ELISA en animales sometidos a PI previo a un período de
isquemia de 60 minutos.
En la Figura 28 se muestra que los niveles de TNF-α aumentan en forma
significativa con un período de isquemia de 60 minutos, elevándose tres veces su
valor basal durante la reperfusión temprana y al doble de su valor basal durante la
p>0,05
p>0,05
Efecto de NAC sobre los niveles de ALT durante la reperfusión tardía
0
250
500
750
1000
1250
U/l
Efecto de NAC sobre los niveles de ALT durante la reperfusión tardía
0
250
500
750
1000
1250
U/l
NAC Sham
PBS Sham
NAC Sham+IR 20
PBS Sham+IR 20
NAC PI+IR 20
PBS PI +IR 20
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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reperfusión tardía (p<0,01 vs Sham). Con el PI los valores de TNF-α vuelven a su
nivel basal, cambio que es significativo en ambas fases de la reperfusión (p<0,05).
Figura 28: Niveles de TNF-α sérico en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia
prolongada. Los niveles de TNF-α se expresan en picogramos de TNF-α por ml de suero. Los resultados
representan el promedio ± SEM para 8-12 animales por grupo experimental. Se muestran los valores de TNF-
α durante la reperfusión temprana (panel A) y tardía (panel B). La significancia de las diferencias entre los
valores promedio de los grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de
Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a y b: a p< 0,01 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham+IR 3 ó 20.
La modificación de los niveles séricos de IL-6 se muestra en la Figura 29,
en la que se observa que durante la reperfusión temprana (panel A) aumenta
alrededor de 2.5 veces su valor basal y que el PI provoca un aumento aún mayor
a este tiempo de reperfusión de alrededor de 4 veces su valor basal. Durante la
reperfusión tardía (panel B), al observar la escala en el eje de las Y y compararla
con el panel A se aprecia que todos los grupos presentan niveles mucho menores
de IL-6 que van desde 60±37 en el grupo control a 121±82 en el grupo de daño
versus los valores que se encuentran durante la reperfusión temprana que van
desde 265±135 que es el valor que presenta el grupo control a: 1121±3430, valor
del grupo protegido. En el panel B se observa que en ambos grupos, de daño y
protección, los niveles de IL-6 aumentan significativamente sobre el basal (p<0,05
vs Sham), pero que no hay diferencias significativas entre ambos (p>0,05).
Sham Sham + IR 20 PI + IR 20 0
50
100
150
200
250
pg T
NF-α
/ml s
uero
Niveles séricos de TNF-α durante la reperfusión temprana
Sham Sham + IR 3 PI + IR 30
100
200
300
400
500
pg T
NF-α
/ml s
uero
a
b
a
b
Niveles séricos de TNF-α durante la reperfusión tardía
B A
IV.- RESULTADOS
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Figura 29: Niveles de IL-6 sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. Los niveles de IL-6 se expresan en picogramos de IL-6 por ml de suero. Los resultados representan el
promedio ± SEM para 8-12 animales por grupo experimental. Se muestran los valores de IL-6 durante la
reperfusión temprana (panel A) y tardía (panel B). La significancia de las diferencias entre los valores
promedio de los grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-
Keuls, lo que se muestra con las letras a y b. A: a p< 0,01 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham+IR; B: a<0,05 vs
Sham.
Figura 30: Niveles de IL-1β sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. Los niveles de IL-1β se expresan en picogramos de IL-1β por ml de suero. Los resultados
representan el promedio ± SEM para 8-12 animales por grupo experimental. Se muestran los valores de IL-1β
durante la reperfusión temprana (panel A) y tardía (panel B). La significancia de las diferencias entre los
valores promedio de los grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de
Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a y b. B: a p< 0,05 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham+IR 20.
IL-1β es otra de las citoquinas que se han involucrado en la respuesta
inflamatoria al daño por IR. En la Figura 30 se observa que durante la reperfusión
temprana ni la IR ni el PI provocan cambios significativos en los niveles séricos de
IL-1β respecto de los niveles séricos de la citoquina encontrados en animales
sometidos a la cirugía simulada, mientras que durante la reperfusión tardía el
Sham Sham + IR 3 PI + IR 3
0
25
50
75
100
125
150Niveles séricos de IL-6 durante la reperfusión temprana
pg IL
-6/m
l de
suer
o Niveles séricos de IL-6 durante la reperfusión tardía
Sham Sham + IR 20 PI + IR 20 0
5
10
15
pg IL
-6/m
l de
suer
o
a
b
a a
A B
Sham Sham + IR 3 PI + IR 30
2
5
7
10
Niveles séricos de IL-1β durante la reperfusión temprana
pg IL
-1β
/ml s
uero
Niveles séricos de IL-1β durante la reperfusión tardía
Sham Sham + IR 20 PI + IR 20 0
1
2
pg IL
-1β/
ml
A B
a
b
IV.- RESULTADOS
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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grupo IR exhibe niveles significativamente más elevados comparados con los
controles (p<0,05 vs Sham) y el PI resulta en una recuperación de estos niveles a
valores cercanos a los encontrados en los controles (p<0,05 vs Sham+IR 20).
IL-10 por su parte participaría controlando la extensión del daño por IR
gracias a sus propiedades antiinflamatorias. En el modelo expuesto, sin embargo,
los niveles de IL-10 durante la reperfusión temprana fueron significativamente más
bajos en los animales sometidos a PI vs los animales sometidos a IR sin PI
(p<0,01, Figura 31 A), mientras que en el grupo Sham durante la reperfusión
temprana los niveles de esta citoquina fueron indetectables a través del ensayo
aplicado. Durante la reperfusión tardía se observa una tendencia en el grupo PI a
presentar niveles séricos de IL-10 similares a los encontrados en los animales
Sham, pero las diferencias no fueron significativas entre los grupos (Figura 31 B).
Figura 31: Niveles de IL-10 sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. Los niveles de IL-10 se expresan en picogramos de IL-10 por ml de suero. Los resultados
representan el promedio ± SEM para 8-12 animales por grupo experimental. Se muestran los valores de IL-6
durante la reperfusión temprana (panel A) y tardía (panel B). La significancia de las diferencias entre los
valores promedio de los grupos fue determinada en A por el test t de Student y en B por las pruebas de
ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls, lo que se muestra con las letra a: a p< 0,01 vs
Sham+IR 3.
Niveles séricos de IL-10 1h durante la reperfusión tardía
Sham Sham + IR 20 PI + IR 20 0
25
50
75
100
125
pg IL
-10/
ml s
uero
Sham + IR 3 PI + IR 3 0
50
100
150 Niveles séricos de IL-10 1h durante la reperfusión temprana
pg IL
-10/
ml d
e su
ero
a
A B
IV.- RESULTADOS
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4.6.- Evaluación de la activación de factores de transcripción en animales sometidos a PI y controles
Se evaluó la actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en
hígado de animales sometidos a preacondicionamiento isquémico e isquemia con
3 o 20 horas de reperfusión.
En la Figura 32 se muestran los resultados correspondientes al análisis
densitométrico de las bandas obtenidas en geles de EMSA. En el panel A se
muestra una fotografía de uno de los cuatro geles analizados, se aprecian bandas
de mayor densidad en los carriles correspondientes al tejido de animales
sometidos a PI, lo que significa mayor unión de la proteína al oligonucleótido, que
en este caso, correspondía a la secuencia de consenso de NF-κB. En el panel B
se presenta el gráfico que representa densidad relativa en unidades
densitométricas versus grupos experimentales. En animales sometidos a IR sin la
maniobra preacondicionante (Sham+IR 3) la activación del factor de transcripción
estadísticamente diferente al compararla con la actividad de unión al ADN
obtenida para animales con simulación de cirugía (Sham). En los animales
sometidos a PI la actividad de unión al ADN de NF-κB fue mayor al compararla
con los animales Sham (p<0,05 y con los animales Sham+IR 3 (p<0,01).
IV.- RESULTADOS
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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Figura 32: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de NF-κB en animales
sometidos a isquemia y reperfusión temprana. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso
para NF-κB (sección 3.7.2) S=Sham. B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los
resultados están expresados en unidades densitométricas arbitrarias que resultan del análisis de las bandas
de A y representan el promedio ± D.S. para 3 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las
diferencias entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las
pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,01 vs Sham, bp<0,05 vs Sham+IR
3.
Durante la reperfusión tardía la activación de NF-κB se presenta en la
Figura 33. En el panel A se observa una fotografía de ejemplo de lo obtenido en
los geles de EMSA, si bien hay una leve tendencia a mayor activación en el
hígado de animales sometidos a PI previo a la isquemia prolongada, la mayoría de
las bandas aparecen tenues, lo que implica baja actividad de NF-κB, que es
similar en todos los grupos. En B se presenta el gráfico de la densidad relativa de
las bandas analizadas en unidades densitométricas por grupos experimentales. En
el tejido de los animales sometidos a IR con la maniobra preacondicionante (PI+IR
20) hay una tendencia a mayor activación de NF-κB. Sin embargo, en el análisis
estadístico estas diferencias no fueron significativas (p>0,05). Por lo tanto el
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB animales sometidos a PI durante la reperfusión temprana
Sham Sham + IR 3 PI + IR 30
1
2
3
4
5
6
7
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
NF-κB
S S S IR 3 IR 3 IR 3 IR 3 PI-IR3 PI-IR 3 PI-IR 3 Grupos experimentales A
B
a, b
IV.- RESULTADOS
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preacondicionamiento isquémico durante la SVP sobre 60 minutos de isquemia
aumenta la activación de NF-κB sólo durante la reperfusión temprana.
NF-κB
S S S IR 20 IR 20 IR 20 IR 20 PI-IR20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentales
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
25
50
75
100
125
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
arbi
trar
ias
B
A
NF-κB
S S S IR 20 IR 20 IR 20 IR 20 PI-IR20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentales
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
25
50
75
100
125
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
arbi
trar
ias
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
25
50
75
100
125
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
arbi
trar
ias
B
A
Figura 33: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de NF-κB en animales
sometidos a isquemia y reperfusión tardía. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso para
NF-κB (sección 3.7.2) S=Sham B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los resultados
están expresados en unidades densitométricas arbitrarias que resultan del análisis de las bandas de A y
representan el promedio ± D.S. para 3 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias
entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de
ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls p>0,05.
En la introducción se comentó que tanto el daño mediado por IR como la
protección desencadenada por el PI son procesos complejos que dependen de
múltiples mecanismos, utilizan para la señalización varias vías de transducción de
señales en forma simultánea y potencialmente ejercen su efecto a través de más
de un efector final. Bajo esta premisa se evaluó la activación de otros factores de
transcripción que se han relacionado con el daño mediado por IR y con las vías de
señalización en el tejido hepático: AP-1 y HSF-1
En la Figura 34 se muestra una de las fotografías de los geles obtenidos en
el EMSA de AP-1 (panel A) y el gráfico del análisis densitométrico de las bandas
IV.- RESULTADOS
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
68
(panel B). En la fotografía se aprecia que las bandas aparecen más densas en los
carriles correspondientes al tejido hepático de animales sometidos a isquemia sin
preacondicionamiento como en aquellos a los que se les sometió a PI 72 horas
antes de la isquemia letal, mientras que en el tejido de los animales no sometidos
a isquemia prácticamente no hay activación de AP-1. Al hacer el análisis
densitométrico gráfico (panel B) se observó que la activación de AP-1 aumenta
significativamente con la isquemia a las 3 horas de reperfusión (p<0,01) y con el PI
más isquemia (p<0,05) sin embargo la diferencia entre estos dos grupos no fue
estadísticamente significativa.
Figura 34: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de AP-1 en animales sometidos a isquemia y reperfusión temprana. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso
para AP-1 (sección 3.7.2). S=Sham B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los
resultados están expresados en unidades densitométricas arbitrarias que resultan del análisis de las bandas
de A y representan el promedio ± D.S. para 3 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las
diferencias entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las
pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,01 vs Sham, bp<0,05 vs Sham.
Durante la reperfusión tardía la activación de AP-1 sigue siendo mayor en
los animales sometidos a isquemia, con o sin PI previo (Figura 35, panel A); sin
embargo, en el grupo de PI no todas las bandas mostraron densidades altas a
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción AP-1 durante la reperfusión temprana en animales sometidos a PI
Sham Sham + IR 3 PI + IR 30
2
5
7
10
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
b
a
B
S S S IR 3 IR 3 IR 3 PI-IR3 PI-IR 3 PI-Grupos experimentales
AP-1
A
IV.- RESULTADOS
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
69
diferencia de los animales del grupo IR. Al realizar el análisis densitométrico (panel
B) el promedio de los valores demuestra que la activación de AP-1 es mayor en el
tejido de los animales sometidos a IR sin PI (Sham+IR 20) versus los animales
control (p<0.01), mientras que en el tejido de los animales sometidos a PI esta
activación disminuye a niveles aún menores que los encontrados en los animales
control (p<0,05) siendo también esta diferencia significativa al comparar este
grupo (PI+IR 20) con el grupo no protegido (p<0.001).
AP-1
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción AP-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
25
50
75
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
a
b, c
S S S IR 20 IR 20 IR 20 IR 20 PI-IR20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
B
AP-1
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción AP-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
25
50
75
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
a
b, c
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción AP-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
25
50
75
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción AP-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
25
50
75
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
a
b, c
S S S IR 20 IR 20 IR 20 IR 20 PI-IR20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
B
Figura 35: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de AP-1 en animales sometidos a isquemia y reperfusión tardía. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso para
AP-1 (sección 3.7.2) S=Sham B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los resultados
están expresados en unidades densitométricas arbitrarias que resultan del análisis de las bandas de A y
representan el promedio ± D.S. para 3 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias
entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de
ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,01 vs Sham, bp<0,05 vs Sham, cp<0,0001 vs
Sham+IR 20
AP-1, por lo tanto, a diferencia de NF-κB tiende a disminuir el nivel de
activación gracias al PI lo que se hace significativo durante la reperfusión tardía.
En la Figura 36 se presentan los resultados para HSF-1 durante la
reperfusión temprana. Si bien hay una tendencia a una menor activación del factor
IV.- RESULTADOS
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
70
en el tejido de los animales sometidos a isquemia, estas diferencias no fueron
significativas respecto del grupo control (p>0,05).
Figura 36: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de HSF-1 en animales sometidos a isquemia y reperfusión temprana. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso
para HSF-1 (sección 3.7.2) S=Sham B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los
resultados están expresados en unidades densitométricas arbitrarias que resultan del análisis de las bandas
de A y representan el promedio ± D.S. para 3 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las
diferencias entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las
pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls p>0,05.
Durante la reperfusión tardía en el grupo correspondiente al daño (Figura
37, Sham+IR 20) la activación de HSF-1 disminuye, es decir, la unión de la
proteína al ADN es menor que los niveles que se encontraron en el grupo control.
El efecto del preacondicionamiento isquémico es retornar estos niveles de
activación a los niveles que se encontraron en el grupo control.
HSF-1
S S S S IR 20 IR 20 IR 20 IR 20 PI-IR20 PI-IR 20 PI-IR
Grupos experimentalesA
B Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción HSF-1
en animales sometidos a PI durante la reperfusión temprana
Sham PI + IR 0
1
2
3
4
5
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
Sham + IR 3
IV.- RESULTADOS
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
71
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción HSF-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
10
20
30
40
50U
nida
des
dens
itom
étric
as
a
b
HSF-1
S S S IR 20 IR 20 IR 20 IR 20 PI-IR20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
B Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción HSF-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
10
20
30
40
50U
nida
des
dens
itom
étric
as
a
b
Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción HSF-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200
10
20
30
40
50U
nida
des
dens
itom
étric
as
a
b
HSF-1
S S S IR 20 IR 20 IR 20 IR 20 PI-IR20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
B
Figura 37: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de HSF-1 en animales sometidos a isquemia y reperfusión temprana. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso
para HSF-1 (sección 3.7.2). B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los resultados
están expresados en unidades densitométricas arbitrarias que resultan del análisis de las bandas de A y
representan el promedio ± D.S. para 3 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias
entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de
ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,05 vs Sham, bp<0,05 vs Sham+IR 20.
Para visualizar los cambios ocurridos a nivel de activación de factores de
transcripción se graficó la razón obtenida entre el promedio del grupo sometido a
isquemia o a isquemia previo preacondiconamiento y su control Sham respectivo.
Se expresan los resultados en número de veces versus grupo experimental y
factor de transcripción (Figura 38), se indica con una línea punteada que atraviesa
1 en el eje de las Y el nivel de activación basal, que en este caso corresponde a lo
encontrado en Sham. Se indica con ∗ los cambios que resultaron significativos en
el test estadístico originalmente aplicado (Figuras 32 al 37), siendo esta
agrupación un ejercicio para visualizar los cambios en conjunto. El nivel de
activación de NF-κB aumenta durante la reperfusión temprana con el PI previo a
un período de isquemia de 60 minutos y no se modifica significativamente en el
IV.- RESULTADOS
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
72
resto de los grupos. AP-1, que presenta los mayores cambios respecto de su
basal, aumenta con isquemia a las 3 y a las 20 horas y con el PI a las 3 horas.
Durante la fase tardía de la reperfusión la activación de AP-1 disminuye con el PI.
HSF-1 no presenta cambios significativos durante la fase temprana de la
reperfusión (3 horas) y disminuye su nivel de activación con la isquemia de 60
minutos y con el PI retorna a niveles más cercanos al basal.
Figura 38: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de NF-κB, AP-1 y HSF-1 en
animales sometidos a isquemia durante la reperfusión temprana y tardía Gráfico de las modificaciones
sufridas en la actividad de los factores de transcripción. Los resultados representan la razón entre el promedio
en unidades densitométricas arbitrarias que presentaron los grupos IR o PI para los distintos factores y tiempo
y el promedio de su control Sham y están expresadas como número de veces sobre la activación control
(Nivel activación control=1) versus factor de transcripción.
4.7.- Evaluación de los niveles de proteínas relacionadas con la citoprotección en animales sometidos a PI y controles Se evaluó los niveles proteicos (Western blot) o la expresión de mARN (RT-
PCR) de algunas de las proteínas que podrían participar como efectoras en la
respuesta desencadenada por el PI durante la reperfusión tardía.
Modificación de la activación de factores de transcripción NF-κB, AP-1 y HSF-1 durante la reperfusión temprana y tardía
NF-κB
Nivel de activación
control
HSF-1 AP-1
PI +IR 20
PI +IR 3
Sham+ IR 3
Sham+IR 20
Núm
ero
de v
eces
0
1
2
3
4
5
∗
∗
∗
∗
∗ ∗∗
IV.- RESULTADOS
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
73
En la Figura 39 se muestra en el panel A una fotografía de uno de los geles
de Western blot utilizados para la determinación de los niveles de fibrinógeno.
Como control se utilizó la expresión de actina. Se observa que hay una tendencia
al aumento de la expresión de fibrinógeno con IR, cambio que no resultó
significativo, y una disminución de la expresión de la proteína en el tejido de
animales sometidos a PI (p<0,05 vs Sham+IR 20).
Niveles de fibrinógeno en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico y reperfusión tardía
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
a
Fibrinógeno
Actina
S S PI-IR20 PI-IR 20 IR 20 IR 20
Grupos experimentalesA
B Niveles de fibrinógeno en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico y reperfusión tardía
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
a
Fibrinógeno
Actina
S S PI-IR20 PI-IR 20 IR 20 IR 20
Grupos experimentalesA
B
Figura 39. Efecto del PI sobre los niveles de fibrinógeno hepático. A, Western blot para la detección de
fibrinógeno en muestras de hígado de ratas. B, análisis densitométrico de A. Los resultados representan el
promedio ± S.E.M. para 3 -6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias entre los
valores promedio de los distintos grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del
test de Newman-Keuls (p<0.05): ap<0,05 vs Sham+IR 20.
La expresión de haptoglobina se presenta en la Figura 40. Los niveles de
expresión de esta proteína variaron significativamente entre los distintos grupos
experimentales durante la reperfusión tardía, lo que se observa como un aumento
en la expresión de haptoglobina en el grupo preacondicionado (1.19±0.22),
IV.- RESULTADOS
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
74
significativa versus el grupo sometido a isquemia y no preacondicionado
(0.77±0.46), que no tuvo diferencias significativas con el grupo Sham (0.98±0.19).
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200.0
0.5
1.0
1.5
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
Niveles de haotoglobina en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico
Haptoglobina
Actina
S S IR20 IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
B
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200.0
0.5
1.0
1.5
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200.0
0.5
1.0
1.5
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
Niveles de haotoglobina en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico
Haptoglobina
Actina
S S IR20 IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
Haptoglobina
Actina
S S IR20 IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
B
Figura 40. Efecto del PI sobre los niveles de haptoglobina hepática. A, Western blot para la detección de
haptoglobina en muestras de hígado de ratas. B, análisis densitométrico de A. Los resultados representan el
promedio ± S.E.M. para 5-10 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias entre los
valores promedio de los distintos grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del
test de Newman-Keuls (p<0,05) ap<0,05 vs Sham+IR 20.
Los niveles de HO-1 (Figura 41) no presentaron diferencias significativas
entre los grupos experimentales, la dispersión de los resultados fue pequeña y los
promedios de 7 a 17 animales por grupo experimental, expresados en unidades
densitométricas, fueron de 0,77±0,19 para el grupo control, 0,78±0,17 Sham + IR
20 y 0,8±0,15 para el grupo sometido a la MPI antes de la isquemia prolongada.
Los niveles de HSP-70 encontrados en el tejido de animales sometidos a
isquemia sin PI aumentaron significativamente versus el control de cirugía
simulada (Figura 42, panel B). El nivel de expresión de HSP 70 volvió al nivel
basal al someter el tejido al PI 72 horas antes de la isquemia prolongada.
a
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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Figura 41. Efecto del PI sobre los niveles de HO-1 hepática. A, Western blot para la detección de HO-1 en
muestras de hígado de ratas. B, análisis densitométrico de A. Los resultados representan el promedio ±
S.E.M. n= 7-17. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de los distintos grupos fue
determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls (p<0,05).
Niveles de HSP 70 en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
a
b
HSP 70
Actina
S S IR20 IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
B Niveles de HSP 70 en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico
Sham Sham + IR 20 PI + IR 200.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
a
b
HSP 70
Actina
S S IR20 IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
B
Figura 42: Efecto del PI sobre los niveles de HSP 70 hepática. A, Western blot para la detección de HSP
70 en muestras de hígado de ratas. B, análisis densitométrico de A. Los resultados representan el promedio ±
S.E.M n=4-9. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de los distintos grupos fue
determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls lo que se muestra con
las letras a y b: ap<0,05 vs Sham, bp<0,05 vs Sham+IR 20.
Niveles de HO-1 en tejido hepático de animales sometidos a preacondicionamiento isquémico y reperfusión tardía
Sham Sham+IR 20 PI+IR 200.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
HO-1
Actina
S S IR20 IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20
Grupos experimentalesA
B
IV.- RESULTADOS
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
76
La expresión de iNOS se estimó a través de la medición de los niveles de
ARN con la técnica de RT-PCR. En ensayos previos en nuestro laboratorio se
había intentado estimar la expresión de la proteína iNOS a través de Western blot
sin resultados positivos.
En la Figura 43 se observa que la banda correspondiente al ARN de iNOS
solamente es observable en los carriles correspondientes al tejido hepático de los
animales sometidos a IR sin PI previo. En el resto de los grupos prácticamente no
se observó la presencia de la banda. Este ensayo se realizó en dos animales por
grupo experimental, por lo que no fue posible obtener significancia estadística, sin
embargo, este resultado se repitió en todas las repeticiones realizadas (4) por lo
que es esperable que al repetir el ensayo para un n mayor en cada grupo esta
tendencia se mantenga.
18S
C CN CC IR 20 IR 20 PI-IR 20 PI+IR 20 S S
Grupos experimentalesA
iNOS
Niveles de mARN de iNOS en tejido hepático de animalessometidos a preacondicionamiento isquémico
Sham Sham+IR 20 PI+IR 200.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
B
18S
C CN CC IR 20 IR 20 PI-IR 20 PI+IR 20 S S
Grupos experimentalesA
iNOS
Niveles de mARN de iNOS en tejido hepático de animalessometidos a preacondicionamiento isquémico
Sham Sham+IR 20 PI+IR 200.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
Niveles de mARN de iNOS en tejido hepático de animalessometidos a preacondicionamiento isquémico
Sham Sham+IR 20 PI+IR 200.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Uni
dade
s de
nsito
mét
ricas
B
Figura 43. Efecto del PI sobre los niveles de ARNm de iNOS hepática. A, RT-PCR utilizando partidores
específicos para iNOS. Control ARN 18 S B, Los resultados representan el promedio ± S.E.M. para 2 animales
por grupo experimental.
V.- DISCUSIÓN
_____________________________________________________________________________________________
Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
77
V.- DISCUSIÓN
En el hígado el daño por IR constituye un problema clínico importante que
afecta el resultado de las cirugías que se realizan bajo exclusión vascular y el
pronóstico del trasplante del órgano 13. El objetivo de este estudio fue determinar
la existencia y efectividad de la maniobra protectora del preacondicionamiento
isquémico en un marco temporal no descrito previamente para este órgano: la fase
tardía o segunda ventana de protección del preacondicionamiento isquémico. Se
implementó un modelo de isquemia reperfusión hepática parcial en la rata, se
determinó el marco temporal adecuado para obtener la hepatoprotección tardía a
través de la caracterización de la maniobra preacondicionante de 10 minutos de
isquemia y se analizó esta segunda ventana de protección en el hígado a través
de parámetros de daño hepático,parámetros de estrés oxidativo tisular, niveles de
citoquinas séricas relacionadas con la respuesta a IR, activación de los factores de
transcripción NF-κB, AP-1 y HSF-1 y la respuesta de algunas de las proteínas que
tienen elementos de respuesta para dichos factores de transcripción.
Se evaluó la respuesta de esta segunda ventana de protección al
pretratamiento con antioxidantes y se estableció que la hepatoprotección en este
marco temporal no se modifica con el pretratamiento con NAC una hora antes de
la MPI, es decir, la SVP sería independiente de las especies reactivas del oxígeno
que se generan durante la maniobra preacondicionante.
V.- DISCUSIÓN
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
78
5.1.- Modelo de daño por isquemia-reperfusión
5.1.1.- Daño hepático en isquemia-reperfusión
El modelo de daño por IR con 60 minutos de isquemia que se describe en
este trabajo se comporta de acuerdo a lo publicado por otros grupos 15, 16,
presentando una curva bifásica de daño. Clásicamente estas fases se han
identificado como las fases de daño temprana y tardía, la fase temprana
comprende desde el inicio de la reperfusión hasta la tercera-cuarta hora y la fase
tardía desde la sexta hora de reperfusión hasta las 24 horas posteriores 17. En el
modelo presentado la fase temprana de daño se extiende desde la 1ra hasta la 6ta
hora de reperfusión. Se caracteriza por un alza de las enzimas ALT, AST y LDH y
va asociada a cambios morfológicos tales como dilatación de la vena central,
infiltrado inflamatorio de PMN y aparición de focos de necrosis después de la 4ta
hora (Figuras 8, 9 y 10). La fase tardía se concentra alrededor de la 18va-20ma
horas de reperfusión, presenta alza de transaminasas, LDH, focos de necrosis e
inflamación más extensos y distorsión de la citoarquitectura del tejido hepático
(Figuras 8, 9 y 11). Después de las 24 horas de reperfusión comienzan a disminuir
la actividad sérica de transaminasas y LDH llegando a niveles basales a las 48
horas de reperfusión. Las diferencias sutiles en el inicio y duración de ambas fases
de daño pueden ser a causa de las diferentes cepas de animales utilizadas (cepas
más sensibles) 105, al tiempo de isquemia (45, 60 o 90 minutos) y a otros
parámetros tales como el ayuno previo 107,108 y la hidratación intra y postoperatoria,
lo que se comprobó durante el desarrollo del modelo, tiempo durante el cual la
modificación de estos factores llevó a mejorar la tasa de sobrevivencia y a la
estandarización de los parámetros de daño. Inicialmente, por ejemplo, con 90
minutos de isquemia y sin hidratación intra ni postoperatoria la mortalidad de los
animales fue cercana al 50% (datos no publicados); mientras que la cirugía de 60
minutos practicada en animales alimentados disminuye el daño en alrededor de un
70% en términos de actividad de transaminasas. No obstante los detalles técnicos,
el modelo logrado exhibe claramente dos fases en términos de marcadores de
daño hepático. Este modelo, previamente no disponible estandarizadamente o
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comunicado de tal manera por otros grupos en el país, permite evaluar otras
técnicas de hepatoprotección diferentes del preacondicionamiento isquémico.
En la placas histológicas analizadas a los distintos tiempos de reperfusión
no se encontró signos morfológicos sugerentes de apoptosis y durante los últimos
años la mayoría de los grupos que trabajan en el tema coinciden en que la muerte
celular que ocurre secundariamente al daño por IR sería mayoritariamente a
través de necrosis celular y que la vía apoptótica no daría cuenta más que de un
pequeño porcentaje de este daño 109. Una falencia en este punto es la ausencia de
un parámetro cuantitativo para estimar el daño tisular. La reevaluación de las
placas con asignación de puntajes, como el índice HAI (Histology Activity Index) 110, puede ser de utilidad; aunque es un índice creado para estimar la actividad de
hepatitis crónica asintomática. En el caso del miocardio, por ejemplo, la
estimación del tamaño del infarto es un parámetro confiable, reproducible y que se
correlaciona con los niveles de enzimas y el pronóstico funcional del tejido post-
infarto 111 y constituye el estándar para estimar el daño tisular post isquémico.
Actualmente no existe un parámetro de esta naturaleza en el hígado y uno de los
argumentos en contra del PI estima que aún con la disminución de transaminasas,
esto no se correlaciona necesariamente con un mejor funcionamiento o pronóstico
del órgano en el paciente 112.
5.1.2.- Estrés oxidativo hepático en isquemia-reperfusión
Se ha definido el estrés oxidativo como una condición de desbalance entre
la de generación de especies prooxidantes y su consumo por los mecanismo de
defensa antioxidante, a favor de los primeros 6. Esta condición lleva al deterioro
oxidativo de moléculas esenciales tales como lípidos, proteínas, carbohidratos y
ácidos nucleicos, que conducen a alteraciones estructurales y funcionales en la
célula y los tejidos.
En este estudio 60 minutos de isquemia producen un incremento en la
oxidación de proteínas, indicador de la condición prooxidante, a la 20va hora de
reperfusión posterior a la isquemia (Figura 12). Este aumento en el daño oxidativo
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podría estar mediado por ROS generadas durante la fase temprana, cuya fuente
principal serían las células de Kupffer activadas, como se ha descrito en otros
modelos 113.
El aumento en el nivel de proteínas oxidadas no es significativo en otros
puntos de la curva de reperfusión, lo que puede significar que: (i) la cantidad de
ROS generadas no es suficiente para generar daño oxidativo en las proteínas, (ii)
que la muerte celular, que se objetiva en los cortes histológicos, está eliminando
aquellas células que resultaron muy dañadas, o (iii) que las mismas proteínas
carboniladas están siendo eliminadas por proteólisis 114. Durante las horas
posteriores a las 20 horas, además de la necrosis celular, es probable que se
gatillen mecanismos de defensa que protejan al tejido de una oxidación masiva.,
entre ellos la recuperación de los niveles de Glutatión que contribuye a reducir las
ROS (Figura 13). El contenido de Glutatión total, sin embargo, disminuye de igual
manera en animales sometidos a isquemia como en los animales sometidos a la
cirugía de simulación, aunque con mayor velocidad entre la 2da y la 20ma hora en
los primeros (Figuras 13 y 14) lo que indica una tasa de consumo mas alta. Un
indicador más sensible del estado de estrés oxidativo a través de éste parámetro
podría ser la relación Glutatión oxidado/Glutatión reducido. Inicialmente se intentó
esta medición con un método fluorimétrico que utiliza OPT y NEM 115, pero sin
resultados satisfactorios, por lo que actualmente se explora un ensayo más
sensible que pueda ser utilizado en el futuro.
Aunque el contenido de Glutatión total no haya mostrado diferencias entre
ambos grupos, al calcular un índice asociado al EO, que corresponde a la razón
entre los contenidos de derivados carbonilos de proteínas y de GSH en el hígado,
se encuentra un aumento en dicho índice en el grupo de animales sometidos a
isquemia a las 20 horas de reperfusión, con respecto a los controles (Figura 15).
Este efecto es esperable, ya que si aumenta el indicador de la condición
prooxidante (oxidación de proteínas) y disminuye el indicador de los mecanismos
de defensa antioxidante (Glutatión total) se produce una condición de EO
hepático, y además es un índice de estrés oxidativo tisular ampliamente utilizado
en investigación.
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5.1.3.- Activación del factor de transcripción NF-κB en isquemia-reperfusión
Al evaluar el efecto de una hora de isquemia sobre la actividad de unión a
ADN del factor transcripcional NF-κB, como mecanismo involucrado en la
generación del daño por IR, se observó un aumento moderado en relación a un
control positivo (LPS) en la actividad de unión de NF-κB a la secuencia de
consenso desde la 2da a la 6ta horas de reperfusión y un segundo aumento más
prolongado y mayor que el que se alcanza con LPS desde la 18va hora hasta las
72 horas de reperfusión (Figura 16).
Como se mencionó previamente NF-κB es un factor de transcripción clave
en la modulación de la respuesta inflamatoria. En la Tabla 5 se exponen algunos
estímulos que son capaces de activar NF-κB, así como algunas de las proteínas
cuyos genes son controlados por este factor de transcripción 116.
Estímulos que activan NF-κB Proteínas reguladas por NF-κB
Citoquinas: TNF-α, IL-1β, IL-17 Activadores de PKC: ésteres de forbol,
PAF ROS: H2O2, ozono Virus: rinovirus, EBV, CMV, adenovirus,
virus influenza Estimulos inmunes: fitohemaglutinina, Ac
anti CD3, antígenos Otros : LPS, RUV
Citoquinas: TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, GM-CSF, M-CSF, G-CSF
Quimioquinas: IL-8, MIP-1α, MCP-1, Gro α, β y γ, eotaxina.
Enzimas: iNOS, COX-2, LP-5, PLA2 Moléculas de adhesión: ICAM-1, VCAM-1,
E-selectina Receptores: IL-2 (cadena α), TCR
(cadena β) IκBα, bcl-2, bcl-X
Tabla 5: estímulos y respuestas a NF-κB
En IR, como se dijo, se ha encontrado que NF-κB exhibe un perfil de
activación bifásico, lo que concuerda con los resultados expuestos. Las maniobras
tendientes a disminuir el nivel de activación de NF-κB con el uso de IL-10 117,
Sulfasalazina 118, pirrolidin-ditiocarbamato 118 o sobre-expresión de IκBα 119 han
resultado exitosas en disminuir la activación de NF-κB inducida por IR, el daño
hepático, la infiltración de neutrófilos y los niveles de TNF-α , CXC e ICAM-1.
Los estímulos capaces de activar NF-κB que se generan durante la IR
incluyen ROS y TNF-α, mientras que la curva bifásica puede deberse a control de
la síntesis de su propio inhibidor (IκBα) y síntesis de proteínas antioxidantes que
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contribuirían a disminuir los ROS haciendo que la primera fase de la activación
sea relativamente breve y autolimitada. El proceso de daño por IR, sin embargo,
se amplifica con la llegada de PMN y nueva producción de ROS y citoquinas
proinflamatorias lo que causaría el segundo aumento de la activación de NF-κB.
5.2.- Maniobra de preacondicionamiento isquémico y segunda ventana de protección del PI.
En el PI clásico, la maniobra preacondicionante precede inmediatamente a
la isquemia prolongada y resulta en protección. El uso de diversos agonistas como
adenosina, bradiquinina, opioides y catecolaminas gatillan el mismo efecto a
través de la unión a receptores de membrana acoplados a proteína G 75. En 1993
se describió la existencia de una ventana de protección que se desarrollaba 12 a
24 horas después del estímulo preacondicionante inicial: la segunda ventana de
protección (SVP) 120.
A diferencia del preacondicionamiento temprano que es de corta duración,
extendiéndose solamente por alrededor de 2-3 horas, la SVP se desarrolla en
forma más tardía pero protege alrededor de 48-96 horas, aunque la magnitud de la
protección sería menor y los mecanismos involucrados diferentes 121 (Figura 3)
Esta segunda fase del PI no se había descrito hasta ahora en el hígado y en los
primeros intentos se buscó esta ventana en un marco temporal similar al que se
había descrito para el corazón, sin embargo a las 15, 20 o 24 horas después del
estímulo preacondicionante no se encontró protección (Figura 17), y
probablemente la isquemia prolongada en este caso se estaba realizando en el
período en el cual el efecto protector temprano se agotó y el fenotipo descrito
como tolerante a la isquemia que caracteriza a la fase tardía del PI aún no se
desarrolla (caída antes de la meseta correspondiente a la SVP en Figura 3). Al
analizar la actividad de transaminasas séricas de los animales sometidos a 10
minutos de isquemia, lo que se definió como la maniobra preacondicionante, se
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encontró que había un alza leve y temprana, lo que se recuperaba después de las
48 horas y que la MPI provocaba estrés oxidativo tisular leve alrededor de la 6ta
hora después de la maniobra. La isquemia prolongada, entonces, debió realizarse
al menos 48 horas después de la maniobra preacondicionante. Se eligió 72 horas
inicialmente, para que la realización de la isquemia prolongada coincidiera con el
desarrollo pleno de la protección durante la SVP y esto arrojó resultados
satisfactorios, es términos de disminución de parámetros de daño hepático.
Es posible inducir la SVP en el hígado, la se desarrolla en forma más tardía
al compararlo con el corazón, no alrededor de 12-24 horas, sino que al menos 48
horas después del estímulo preacondicionante. Este fenómeno no ocurre
solamente con el PI, en el caso del preacondicionamiento farmacológico
recientemente se reportó que una dosis de T3 administrada 48 horas antes de un
período de isquemia de 60 minutos en la rata resulta en hepatoprotección
confirmado la existencia de la SVP en el hígado, que sería inducible a través de
isquemia o fármacos 122.
Entre los factores que pueden influenciar el marco temporal en el que se
encuentra la SVP en los distintos órganos está la cantidad de ROS que es capaz
de generar un estímulo dado, lo que va en relación a la tasa metabólica y
defensas antioxidantes presentes en un tejido, (cantidad de mitocondrias vs
contenido de Glutatión total, por ejemplo, en este caso) y la irrigación colateral que
hace que la reperfusión ocurra de forma más o menos completa 16, 123.
5.3.- Daño y estrés oxidativo en el preacondicionamiento isquémico tardío
Al realizar la isquemia prolongada alrededor de 72 horas después de la
maniobra preacondicionante, entonces, se obtiene una disminución en los
parámetros de daño hepático AST, ALT y LDH. Como un parámetro de daño
adicional, se obtuvieron muestras y placas para el análisis histológico cuyo
resultado está pendiente al momento de escribir esta tesis. El resultado de la
maniobra se evaluó durante la reperfusión temprana (a las 3 horas de reperfusión)
y tardía (a las 20 horas de reperfusión) lo que da cuenta de la influencia de la
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maniobra protectora en ambas fases del daño por IR. La disminución de
transaminasas que se logra es mayor en este último punto, en relación al alza
obtenida en el mismo punto (Figuras 20 y 21).
El nivel de estrés oxidativo tisular se evaluó a las 20 horas de reperfusión,
ya que de acuerdo a los resultados obtenidos con el modelo de daño este fue el
único punto en el que se pudo objetivar un aumento de los parámetros de estrés
oxidativo tisular. Al realizar PI el nivel de oxidación de las proteínas disminuye,
retornando a los niveles basales y también se recupera el contenido de Glutatión
total, disminuyendo con ambos el índice de estrés oxidativo (Figuras 23, 24 y 25).
Ambos hallazgos coinciden con lo reportado con la MPI aplicada dentro del
contexto de la primera ventana de protección, o preacondicionamiento temprano 10, 13, 16.
5.4.- Maniobra preacondicionante y estrés oxidativo subletal
Las especies reactivas del oxígeno participan en ambas fases del daño por
IR, y por lo tanto, una de las primeras estrategias terapéuticas fue el uso de
antioxidantes. α-tocoferol 30 y alopurinol 11 y atrapadores de ROS como las SOD 31y CAT 31, atenúan el daño secundario a IR. Algunas de las soluciones de
preservación que se utilizan en el trasplante de órganos, como la solución de
Wisconsin (Tabla 3) también contienen agentes antioxidantes que previenen el
daño por preservación o isquemia fría.
El Glutatión es el tiol de bajo peso molecular más abundante de las células
animales y participa de manera central en las defensas antioxidantes del
organismo contra ROS. La biodisponibilidad de cisteína es el factor limitante en la
síntesis de Glutatión y n-acetilcisteína (NAC) es un precursor efectivo, es decir, la
mayoría de los efectos antioxidantes de NAC estarían mediados por la síntesis de
GSH 124 NAC también es capaz de atrapar ROS directamente y se ha postulado
que también podría inhibir la activación de los neutrófilos, y participar como
agente vasodilatador, disminuyendo el número de sinusoides 124.
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En clínica, NAC se utiliza en las intoxicaciones agudas por paracetamol y
otras drogas, ya que la mayoría de las drogas se detoxifican a través de su
conjugación con Glutatión. Experimentalmente se ha utilizado para atenuar el
daño por IR en distintos modelos. En un modelo de IR hepática y shock por
hipovolemia la administración de NAC 150 mg/kg en dos dosis antes del inicio de
la isquemia y de la reperfusión respectivamente, disminuyó significativamente la
actividad sérica de ALT, AST y LDH después de 1 hora de reperfusión 125.
Similares resultados se obtuvieron con una infusión continua de NAC de 10
mg/Kg/h después de 7 horas de reperfusión. En este trabajo se comunica que
NAC mantiene la frecuencia cardiaca cercana al basal, disminuye la actividad de
ALT, aumenta la microcirculación y la oxigenación tisular (medidas por
espectroscopia infrarroja) y mejora el aclarado de indocianina verde 126. Otros
grupos han reportado que NAC disminuye efectivamente el daño por IR
disminuyendo la actividad y expresión de metaloproteinasas 127, disminuyendo la
agregación de plaquetas y aumentando los niveles de cAMP en tejido isquémico 128 o inhibiendo el aumento de VCAM e ICAM circulantes después de la
reperfusión en receptores de OLT 129; sin embargo, algunos grupos también han
reportado la ausencia de efectos positivos al pretratar con NAC, aunque se ha
discutido que el uso de la vía im afectaría la disponibilidad de NAC para el uso
tisular.
En el mecanismo de daño por IR las especies reactivas del oxígeno
participarían iniciando y amplificando el daño, por lo cual una de las primeras
estrategias utilizadas fue el tratamiento con antioxidantes. Las ROS, sin embargo,
al estar presentes en baja cantidad podrían gatillar señales de sobrevivencia
celular y este concepto se planteó y se probo para la ventana temprana del PI
aplicado previo a preservación fría e isquemia caliente: en el primer modelo de PI
temprano se aplicó un período de 10 minutos de isquemia seguidos de 15 minutos
de reperfusión, previo a la preservación fría del hígado en la solución de
Wisconsin por 30 horas. El pretratamiento con NAC revirtió los efectos benéficos
del PI que se habían objetivado en términos de atenuación del daño hepático y
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disminución de signos sugerentes de apoptosis 129. En el modelo de IR caliente
se utilizó un período de 75 minutos de isquemia en ratón, precedido de PI de
10/15 minutos y se pretrató a los animales con una dosis única de NAC de 100
mg/kg ip 3 horas antes del PI, evaluándose el daño a la 3ra hora de reperfusión. Se
encontró que el PI disminuía el daño generado por IR y que nuevamente NAC
abolía este efecto, adicionalmente en este mismo trabajo el uso de hidroperóxido
de tert-butilo 15 minutos antes de la isquemia letal simula el efecto del PI, mientras
que el tratamiento con NAC antes del hidroperóxido impide la hepatoprotección 93.
En los modelos descritos en el párrafo anterior, no se informa de los niveles
de NAC previo al inicio de la IR y el pretratamiento se realiza 3 horas antes del
inicio de la isquemia correspondiente a la maniobra o a la isquemia prolongada,
considerando que la vida media de NAC es de alrededor de 2,5 horas 130, se
descarta que el efecto protector sobre la IR se deba a NAC y no a la maniobra de
PI a través de los controles quienes recibieron el vehículo de NAC y resultaron
igualmente beneficiados de la maniobra de PI, sin embargo no se sugiere una
explicación para este fenómeno, aunque el uso del hidroperóxido de tert-butilo
simula el PI y su efecto es abolido por NAC. Es posible que la protección de NAC
sea dosis dependiente y que con dosis pequeñas el efecto antioxidante sea
consumido por las ROS generadas durante los 10 minutos de isquemia.
En nuestro estudio el pretratamiento con NAC se realizó con una dosis de
500 mg/kg peso corporal 1 hora antes de la maniobra preacondicionante, es decir,
73 horas antes de la isquemia prolongada. El pretratamiento con NAC no impide
el efecto hepatoprotector del PI durante la segunda ventana de protección.
Rüdiger y cols 75 establecieron en su trabajo que el PI temprano
dependería de las ROS generadas durante la MPI, pero no se evaluó la SVP de
esa maniobra. En nuestro trabajo sólo se evaluó la SVP, por lo tanto no se
establece si se reproduciría un resultado como el comunicado por estos autores al
evaluar el PI temprano. No obstante, con estos antecedentes y los resultados
expuestos en esta tesis, NAC bloquea el efecto protector del
preacondicionamiento isquémico temprano, pero no modifica el
preacondicionamiento isquémico tardío, lo que sugiere que la etapa temprana del
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PI estaría mediada por las ROS generadas durante la isquemia breve mientras
que el desarrollo de la SVP dependería de la generación de otro u otros
mediadores.
En el hígado no hay a la fecha disponibles en la literatura otros trabajos
relacionados con la SVP ni con el estrés oxidativo subletal como mecanismo que
medie el efecto protector del PI, pero en el miocardio el uso de un antioxidante
como melatonina 131 o atrapadores de especies reactivas del oxígeno como SOD o
CAT 132 no limitan el efecto protector del PI (cuando la isquemia prolongada
sucede inmediatamente a la MPI). El pretratamiento con vitamina E 150 mg/kg
limita el tamaño del infarto en conejos sometidos a isquemia a través de los
canales KATP y cGMP, pero conserva el beneficio del PI 133. Estos hallazgos
establecen que además de las ROS, existen otros gatilladores capaces de
desencadenar el efecto protector del PI.
El miocardio es uno de los órganos donde se ha estudiado más
extensamente la SVP y para organizar los hallazgos de los diversos artículos
dentro de la respuesta fisiológica del órgano al estímulo preacondicionante se ha
dividido a los factores involucrados en: (i) gatilladores, que serían las moléculas de
aparición temprana, que serían las responsables de desencadenar el efecto
protector del estímulo preacondicionante (ROS, .NO, adenosina), (ii) mediadores
de la respuesta, que incluyen las vías de transducción de señales involucradas
(MAPK, JAK, PTKs) y los factores de transcripción que se activan o modifican su
respuesta en presencia del estímulo preacondicionante (NF-κB, STAT), y (iii) los
genes que en respuesta a estos factores de transcripción son responsables de la
aparición de productos (proteínas) que participan como efectores finales (HSPs,
iNOS, SOD) 134.
En este trabajo se determinaron algunos de éstos elementos, los que junto
a la información disponible adaptada de 134 constituyen la Figura 45. En el corazón
se ha planteado que los gatillantes iniciales del PI serían ROS, .NO y adenosina 134. En nuestro trabajo se sugiere que ROS podría descartarse como gatillador
inicial de la respuesta protectora durante la SVP en el hígado. Tanto .NO como
adenosina pueden ser potenciales promotores de esta respuesta.
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Figura 45: Segunda ventana de protección del preacondicionamiento isquémico. Adaptación 134
En nuestros resultados, además, se sugiere que la expresión de iNOS
estaría disminuída en los animales preacondiconados, lo que determinaría un nivel
de .NO más cercano a los niveles basales, donde .NO podría participar como una
molécula señal y no, en exceso, ir a la formación de RNS. Respecto de otros
mediadores iniciales como catecolaminas u opiodes, se sabe que el hígado
expresa receptores para ambos, y que en el caso de los opioides, estos podrían
participar en el desarrollo de fibrosis 162, sin embargo, el parénquima hepático, que
Día 1
Días 2-4
ESTRÉS SUBLETAL Isquemia breve, hipoxia, ejercicio, shock térmico
PC FARMACOLÓGICO Endotoxina, citoquinas, ROS, adenosina,
agonistas de adenosina, agonistas de receptores opioides, alcohol, hormona
tiroídea, agonistas adrenérgicos, donantes de NO Gatilladores de SVP
(NO, ROS, adenosina, opioides,
catecolaminas)
Activación de kinasas (MAPK, Src, PKCε, p38, PTKs,
JAK1/2)
Modificación de la activación de factores de transcripción
(NF-κB, AP-1, STAT, HSF-1)
TRANSCRIPCIÓN GÉNICA
Mediadores de SVP iNOS, COX2, aldosa
reductasa, HO-1, HSPs, MnSOD, canales KATP
PROTECCIÓN
Transducción de señales
Modificaciones post-traduccionales Src, PTKs, MAPKs
Estímulo preacondicionante
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es el tejido predominante, deriva de una capa embriológica diferente de la que
origina el sistema nervioso y las uniones neuromusculares, por lo que es posible
que no participen en forma determinante en la respuesta del tejido hepático al
estrés.
En este trabajo no se realizó estudios de vías de activación que conducen a
la respuesta protectora (Activación de kinasas), lo que ocurriría durante el primer
día post estímulo preacondicionante. La modificación de la activación de factores de transcripción, en este caso, se realizó 75 y 92 horas, es decir alrededor de 3-
4 días post estímulo preacondicionante, estableciéndose que NF-κB aumenta
significativamente su actividad de unión al ADN a las 75 horas post MPI en
animales preacondicionados, y se mantiene en niveles similares a lo encontrado
en IR a las 92 horas post MPI.
NF-κB se ha asociado al daño en IR, especialmente durante la fase
temprana, pero NF-κB también controla genes antiapoptóticos y asociados a la
regeneración celular, lo que podría asociarse al cambio de la cinética de activación
que se vislumbra con el PI 135-137. Se ha comunicado en otros trabajos que el PI se
asocia a activación de NF-κB inmediatamente después de la maniobra
preacondicionante y a las 24 horas de reperfusión, lo que se acompañó de
menores niveles de transaminasas, menor actividad MPO, menor daño histológico
y menor expresión de ICAM-1 y TNF-α 136. Previamente Teoh y colaboradores
también encontraron mayor activación de NF-κB en animales preacondicionados a
los 30 minutos de reperfusión.
AP-1, como otro factor de transcripción que modifica su actividad post MPI,
aumenta en forma importante como respuesta a IR en ambas fases y recupera el
nivel de activación de los controles con el PI durante la reperfusión tardía, aunque
se observa una tendencia a ese comportamiento durante la reperfusión temprana
(Figuras 34 y 35). La activación de AP-1 en respuesta a la IR y su relación con
mayor daño y muerte celular en el hígado se habían comunicado previamente. En
estos trabajos la isquemia intermitente o el uso de citoquinas antiinflamatorias
disminuían la activación de AP-1 y con ello el daño 137, 138. En un modelo de IR en
ratas Wistar se observó que la inhibición de JNK se relaciona con una mejoría en
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los parámetros de daño hepático, disminución de la activación de caspasa-3,
disminución de la liberación de citocromo C y de la lipoperoxidación 139.
La activación del factor de transcripción HSF-1 muestra una tendencia a
disminuir durante la reperfusión temprana en IR y PI, pero en este último grupo se
recupera durante la reperfusión tardía. En el preacondicionamiento farmacológico
del hígado se ha encontrado que HSF-1 se activa en forma temprana, pero su
activación no va acompañada de mayor expresión de HSPs 140. Otros grupos han
reportado que la activación de HSF-1 estaría más bien relacionada con la
isquemia, prolongándose muy brevemente durante la reperfusión 141 y que la
respuesta al shock de calor comparte algunas, pero no todas las características de
la respuesta a IR 142.
Un punto importante que plantea proyección para los resultados
presentados es hacer la determinación de la activación de los factores de
transcripción en forma más temprana post MPI, de manera de estimar las
modificaciones que sufren en el primer día post estímulo preacondicionante.
Dentro de los mediadores o efectores finales potenciales de la SVP en el
hígado que se encontraron dentro de los resultados presentados, y que se
modificarían en respuesta al cambio en la cinética de activación de los factores de
transcripción involucrados en la respuesta protectora incluyen:
Modificación de los niveles de citoquinas séricas: el daño por IR cursa con un
aumento en los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias, tales como TNF-α
e IL-1β 16. Durante la fase temprana la fuente de producción más importante de
estas citoquinas serían las células de Kupffer. La producción temprana de TNF-α
es un evento cardinal, aunque no es el único evento responsable de la
amplificación inflamatoria en el desarrollo del daño por IR. En ratones TNF-α -/-
ambas fases del daño por IR se atenúan y la lesión se reestablece al inyectar
TNF-α 77. Durante el daño por IR también se producen citoquinas
antiinflamatorias, tales como IL-10 e IL-13. Del balance que exista entre los niveles
de estas citoquinas depende, en parte, la extensión del daño tisular. En el PI lo
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lógico sería encontrar una disminución en los mediadores proinflamatorios y un
aumento en los mediadores antiinflamatorios, lo que daría cuenta de menor
cantidad de quimioquinas, menor exposición de moléculas de adhesión, menor
infiltración de PMN y consecuentemente menor daño tisular.
En los resultados expuestos TNF-α aumenta en forma significativa en el
daño por IR al evaluarlo durante la reperfusión temprana (triplica el valor
encontrado en los animales Sham) y tardía (duplica el valor de Sham) y disminuye
recuperando los niveles basales en los animales preacondicionados en ambos
tiempos de reperfusión evaluados (Figura 30). TNF-α es una citoquina pleiotrópica
que produce varias respuestas relacionadas con inflamación y respuesta
inmunológica.
TNF-α media el reclutamiento de neutrófilos a través de quimiotaxis, induce
fagocitosis, adherencia al endotelio, generación de ROS, mayor expresión de
moléculas de adhesión en el endotelio, síntesis de otras citoquinas y quimioquinas
proinflamatorias y tiene en su gen sitios de unión para NF-κB, CRE, ATF-2 y AP-1
entre otros factores de transcripción que controlan su síntesis 143. El PI temprano,
sin embargo, es dependiente de la presencia de TNF-α y en ratones TNF-α -/- no
es posible realizarlo 77.
El rol dual de TNF-α puede ser ejercido a través de la acción predominante
sobre TNFR1 o TNFR2 de acuerdo la cantidad de citoquina presente en el medio y
la presencia de otras moléculas mediadoras o efectoras de la respuesta IR.
TNFR1 sería el receptor que mediaría la mayoría de las acciones relacionadas con
inflamación y muerte celular en IR 146. TNF-α se une rápidamente y de forma más
estable a TNFR1 que a TNFR2, que además es activado en forma más eficiente
por la forma de TNF-α unida a membrana que por la forma soluble. La afinidad se
ha estudiado in vitro con resultados disímiles que además pueden estar sesgados
por el hecho de que la gran mayoría de los investigadores han utilizado la forma
soluble de TNF-α 145. La función de TNFR2 en la respuesta fisiológica aún no está
clara, pero se ha reportado que en algunas líneas celulares tiene un rol
V.- DISCUSIÓN
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predominantemente proliferativo y de modulación de la apoptosis inducida por
TNF-α 145.
Los niveles de IL-6 (Figura 31) aumentan tanto en IR como en PI,
alcanzando niveles más altos en la reperfusión temprana en este último grupo y
exhibiendo niveles similares en ambos grupos durante la reperfusión tardía. El gen
de IL-6 tiene elementos de respuesta para AP-1, glucocorticoides, SER y NF-κB,
además responde a factores peptídicos como TNF-α e IL-2 y a agentes que
aumentan los niveles de AMPc. Su principal fuente son los macrófagos y sus
acciones incluyen, además de su rol en la producción de inmunoglobulinas y
proliferación de linfocitos y timocitos, la capacidad de inducir una amplia variedad
de proteínas tales como fibrinógeno, haptoglobina, α1-antitripsina, proteína C
reactiva y proteína amiloide sérica A que participan en la respuesta de fase aguda 146.
TNF-α e IL-6 son componentes importantes de las vías de señalización que
llevan a la regeneración hepática. Tempranamente TNF-α induce la producción de
IL-6 y la activación los factores de transcripción NF-κB, STAT3 AP-1 y C/EBP 5.
En el caso del PI tardío el TNF-α generado durante la maniobra preacondicionante
podría cumplir con este rol. El potencial terapéutico de IL-6 ya ha sido utilizado en
algunos modelos 147 y además de participar en la respuesta de fase aguda, se ha
comunicado que solamente las dosis más altas de IL-6 (500 μg/kg) previenen
efectivamente la necrosis por IR y que este efecto estaría mediado, al menos en
parte, por la activación de STAT3, la inducción de la síntesis de HSP70 y la
disminución del stress del retículo. Este nuevo elemento se ha relacionado
recientemente con el daño mediado por IR 148 y tiene relación con la cantidad de
proteínas no plegadas que aparecen como respuesta al stress en células
secretoras, como el hepatocito 149.
IL-1β no se modifica durante la reperfusión temprana con IR ni PI vs los
controles, lo que sugiere que su contribución como citoquina proinflamatoria es
más importante durante la reperfusión tardía (Figura 32). A las 20 horas de
reperfusión esta citoquina se encuentra elevada en los animales sometidos a IR y
V.- DISCUSIÓN
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disminuye con el PI, lo que sumado al efecto del PI sobre los niveles de TNF-α
sugiere que uno de los mecanismos de hepatoprotección mediados por el PI tardío
es la disminución de citoquinas proinflamatorias.
Así como disminuyen los niveles de citoquinas proinflamatorias, se
esperaba que durante la SVP el PI provocara un aumento de citoquinas
antiinflamatorias. Otros autores han comunicado que la disminución de IL-1β que
se observa en el PI temprano estaría mediado por un aumento de IL-10 150.
En nuestros resultados los niveles de IL-10 se encuentran más elevados en
los animales sometidos a IR sin PI durante la reperfusión temprana (Figura 33).
Los niveles encontrados en los animales sometidos a PI son menores, mientras
que los niveles de los animales controles son indetectables con el ensayo.
No es posible descartar el rol antiinflamatorio de IL-10 como un factor
contribuyente al efecto hepatoprotector durante la SVP, y puede ser que los
cambios de observen más temprano post MPI.
Modificación de la respuesta de fase aguda: fibrinógeno es una de las
proteínas de fase aguda, participa en la coagulación, trombosis y probablemente
esta involucrado en el desarrollo de estenosis posquirúrgicas, siendo un factor
clave en los procesos en los cuales ocurre la formación de trombos o coágulos
asociados al endotelio 151. La falla microvascular y el fenómeno de no-reflow han
sido señalados como uno de los mecanismos centrales en el daño por IR 15. El PI
provoca una caída en el nivel de fibrinógeno hepático durante la reperfusión tardía
(Figura 39). El uso de estrategias que modifican la fibrinolisis, como heparina de
bajo peso molecular 152 o antitrombina 153 atenúan el daño por IR.
El fibrinógeno se secreta como un dímero cuyas subunidades estas
compuestas por tres polipéptidos codificados en distintos grupos de genes que
contienen elementos de respuesta para IL-6, pero que además contienen
elementos de respuesta para otros factores como el Retinoic Acid Receptor
(RXR), el Retinoid Acid Receptor-Related Orphan Receptor α (RORα) y el
receptor farnesoide 154, 155. La etapa limitante en la síntesis de fibrinógeno sería la
V.- DISCUSIÓN
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formación del complejo, para lo cual los tres péptidos que forman cada subunidad
deben ser sintetizados en cantidades equivalentes. Aunque en nuestro modelo se
haya encontrado una elevación en los niveles de IL-6 esto por sí solo no es
suficiente para controlar la síntesis coordinada del complejo fibrinógeno, lo que
puede explicar que los niveles de fibrinógeno se encuentren disminuidos.
Dentro de las proteínas de respuesta a shock térmico (heat shock proteins,
HSPs) se evaluó HSP32 que corresponde a la enzima HO-1 y HSP70. HO-1 es
una enzima de estrés que tiene en su ADN sitios unión para AP-1, NF-κB y
elementos de respuesta para hipoxia e IL-6, entre otros 156. En el PI temprano HO-
1 participa como efector en la hepatoprotección que se logra, lo que se ha
observado en hígados normales y esteatósicos durante la reperfusión temprana (6
horas) pero predominantemente en la reperfusión tardía (20 horas). El tratamiento
con geranilgeranilacetona (GGA) actúa como inductor de HO-1 y produce un
efecto comparable al del PI. Tanto GGA como PI lograrían este efecto a través de
la activación de PKC. La inducción de HO-1 en este modelo, especialmente en los
hígados esteatósicos en los que la inducción es mayor, es esencial para lograr la
protección ya que el uso de inhibidores de HO-1 previo al PI revierte el efecto
protector de éste 157.
En nuestro modelo los niveles de HO-1 no mostraron cambios entre los
diversos grupos en el tiempo de reperfusión evaluado, lo que no descarta la
participación de esta enzima, lo cual podría ser observable en otros tiempos de
reperfusión. La activación de HO-1 con cobalto protoporfirina (Co-PP) también
resulta en hepatoprotección, una de las vías que podría estar involucrada en la
activación de HO-1 en el PI es la vía de Toll like receptor 4 (TLR4), el que
recientemente se ha relacionado como uno de los receptores que se activarían
tempranamente en el daño por IR. La administración de Co-PP suprime la vía de
TLR4 mediada por INF-γ, lo que se acompaña de menor daño hepatocelular,
menores niveles séricos de citoquinas proinflamatorias y activación de HO-1 158.
V.- DISCUSIÓN
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HSP70 por su parte aumenta en IR y recupera su nivel basal con el PI. Esta
proteína también tendría un rol dual, ya que se ha comunicado que aumenta en
respuesta a IR 159, pero su inducción disminuye el daño hepático 160 o facilita la
recuperación posquirúrgica 161. La función de HSP70 sería participar como
chaperona en el plegamiento de proteínas, sin embargo el mecanismo involucrado
en la respuesta a IR no está claro. Es posible que la respuesta mediada por
HSP70 sea más importante bajo ciertas condiciones, distintas de las que se
presentan en este modelo. En el modelo de Kuboki 160, por ejemplo, se utilizan 90
minutos de isquemia en ratón y animales HSP70-/- para elucidar su rol, mientras
que Massip-Salcedo y cols 157 comunican que el aumento de HSP70 relacionado
con la protección sería muy temprano y mas importante en animales con hígado
graso.
La expresión de iNOS muestra una tendencia al aumento en IR y a la
disminución en PI (Figura 39). Si bien .NO es un vasodilatador y podría mejorar la
perfusión postisquemia, un exceso de .NO, como el que produce iNOS que no
tiene regulación alostérica puede llevar al daño hepático y a la producción de
peroxinitrito 48. La generación de .NO que actuaría como citoprotector en el PI
temprano estaría determinada por un aumento en la expresión de eNOS 162 por lo
que los resultados presentados podrían complementarse con la determinación de
la actividad NOS y los niveles de eNOS, adicionalmente la utilización de
antagonistas de eNOS podría orientar el trabajo en términos de determinar si el .NO originado por esta enzima podría participar como un gatillador en la SVP
hepática.
Siguiendo con esta línea, la determinación directa de ROS generados en la
MPI y su eliminación por NAC confirmarían lo que aquí se sugiere: que las ROS
no participan como un gatillador importante para la inducción de la SVP. El uso de
otro tipo de antioxidantes o atrapadores, que eliminen ROS en otro
compartimento celular o a través de otro mecanismo, apoyaría los resultados
obtenidos en este trabajo.
VI.- CONCLUSIONES
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VI.- CONCLUSIONES
1. El modelo de daño por IR con 60 minutos de isquemia presenta dos fases,
una fase temprana entre la 1 y 6ta y una fase tardía alrededor de las 18va-
20ma horas de reperfusión. La elevación de los distintos parámetros de daño
hepático coinciden temporalmente en estas fases (AST, ALT y LDH) y
concuerdan con el daño histopatológico.
2. El factor de transcripción NF-κB tiene un comportamiento bifásico durante
el período post-reperfusión de 0 a 72 horas que sigue a 60 minutos de
isquemia.
3. Diez minutos de isquemia constituyen una maniobra preacondicionante
efectiva al mediar una ventana de 72 horas entre dicha maniobra y la
isquemia prolongada. El marco temporal en el que es posible encontrar la
SVP en el hígado difiere del marco temporal descrito para el corazón.
4. Es posible inducir la SVP a través de PI en el hígado y en los animales
sometidos a PI previo a la isquemia prolongada se encontró: (i) una
disminución en el daño hepático estimado a través de la actividad de AST,
ALT y LDH, y (ii) una disminución en el estrés oxidativo tisular estimado a
través del contenido de Glutatión total, nivel de oxidación de proteínas e
índice de estrés oxidativo.
VI.- CONCLUSIONES
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5. El PI tardío no esta mediado por las especies reactivas del oxígeno que se
generan durante la maniobra preacondicionante y la SVP dependería de un
gatillador diferente de ROS.
6. El PI tardío ejerce su efecto hepatoprotector a través de: (i) la disminución
de los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias (TNF-α e IL-1β), (ii) el
aumento de los niveles séricos de IL-6 durante la reperfusión temprana, (iii)
la activación temprana de NF-κB, (iv) la disminución de la activación de
AP-1 y (v) la recuperación de la activación de HSF-1 durante la reperfusión
tardía.
7. Algunas respuestas hepatoprotectoras que gatilla el PI dependientes de
estos factores de transcripción incluyen: (i) el aumento de los niveles de
haptoglobina, (ii) la disminución en los niveles de fibrinógeno, (iii) la
disminución en los niveles HSP70 y (iv) la disminución de los niveles de
mRNA de iNOS.
8. Los niveles de HO-1 no se modifican con el PI durante la reperfusión tardía.
VII.- PROYECCIONES
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VII.- PROYECCIONES
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Este trabajo comprueba la existencia de la segunda ventana de protección
del preacondicionamiento isquémico en el hígado, lo que conceptualmente
significa la posibilidad de trabajar con intervenciones realizadas varias horas antes
de llevarse a cabo la isquemia prolongada. La existencia de este marco
temporal posibilita el ensayo de otras maniobras preacondicionantes distintas de la
isquemia tales como la hipoxia, el shock térmico, la hipotermia y drogas
hepatotóxicas en dosis pequeñas. El modelo desarrollado para este estudio se
presenta como reproducible y confiable; y se comporta de acuerdo a lo descrito
por varios grupos en la literatura, lo que permitirá experimentar con las
intervenciones previamente mencionadas .
El uso del PI, pese a los resultados promisorios que ha arrojado en diversos
estudios experimentales, no ha logrado posicionarse como una técnica atractiva
para el uso clínico. Algunas de las razones que se sugieren para explicar la
escasa proyección clínica del PI en el hígado, considerando el alto impacto que
ha tenido la técnica en el estudio del infarto miocárdico, pueden ser que: (i) la
prevalencia de la patología asociada a IR hepática es menor vs la patología
cardiaca que cursa con IR, (ii) no existe un parámetro único de laboratorio para
estimar el pronóstico del órgano o el injerto en respuesta a la maniobra (como lo
es el tamaño del infarto en el corazón) y (iii) la realización del PI mecánico en el
hígado no está exento de riesgo pues el clampeo repetido de la tríada portal se
VII.- PROYECCIONES
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Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile
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asocia a mayor incidencia de hemorragia y necesidad de transfusiones 75, el
estudio del PI, por lo tanto, debe estar enfocado no a su utilización clínica en
forma directa, sino a la identificación de los mecanismos subyacentes
responsables de la protección que puedan ser simulados a través de tratamiento
con fármacos, anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, transferencia de genes
hepatoprotectores u hormonas.
A futuro, es necesaria la incorporación de un parámetro funcional, como la
excreción de bilirrubina, la síntesis de albúmina o la depuración de colorantes
pueden contribuir a establecer una relación morfológica-funcional en los modelos
de IR que permita establecer con un examen de sangre periférica, el pronóstico
del paciente o del injerto en clínica.
La ausencia de resultados satisfactorios que han comunicado algunos
grupos con el uso del PI 82 puede relacionarse con la complejidad de la maniobra
en términos técnicos y mecanísticos, y la aparentemente limitada ventana de
tiempo que provee para realizar la intervención temprana. La SVP, en ese sentido,
aparece como una alternativa más flexible en la que la simulación de la maniobra
de PI se puede gatillar a nivel de promotor, estimulación de vías de transducción
de señales o efector final.
A nivel de efectores finales, las citoquinas pro y anti-inflamatorias (o sus
antagonistas y agonistas) tienen potencial clínico ya que la disponibilidad de
citoquinas recombinantes humanas, pese a su elevado costo, posibilita su uso en
pacientes. Para la utilización clínica de las citoquinas en este contexto, sería
importante contar con curvas cinéticas completas que permitan estimar el
comportamiento global en la respuesta fisiológica, más allá de estimaciones
puntuales, lo que permitiría elegir el momento y dosis adecuadas para el
tratamiento.
Así como se determinó la cinética de activación de NF-κB post-reperfusión,
la realización de curvas similares para los otros factores de transcripción incluidos
VII.- PROYECCIONES
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(AP-1, HSF-1) o no en este estudio (HIF-1, STAT3) permitirá estimar con mayor
certeza los cambios que se produzcan con las maniobras protectoras y de esa
manera acercarse a una interpretación de los resultados mas cercana al fenómeno
biológico.
En este estudio se han descrito algunos de los eventos asociados a la
respuesta mediada por PI en la SVP, como disminución de citoquinas
proinflamatorias, disminución de algunas proteínas relacionadas con la respuesta
de fase aguda y activación de NF-κB. Si las vías de transducción de señales que
median estos eventos son similares a las descritas para el PI temprano: p38
MAPK, Akt, ERK; y si hay vías y efectores adicionales que participen en la
respuesta mediada por SVP es un asunto que queda por explicar.
Tanto la IR como el PI son fenómenos complejos regulados a múltiples
niveles y que dependen no sólo de la cantidad y variedad de factores y vías
involucrados, sino que también de la temporalidad de los eventos. La regulación
cruzada y la participación de otros elementos no abordados en el presente
estudio, como el Ca++ , la mitocondria y los canales dependientes de ATP podrán
contribuir a completar el cuadro de manera de permitir intervenciones innovadoras,
pero a la vez efectivas, reproducibles y seguras. Es nuestra opinión que el futuro
del preacondicionamiento hepático está en el preacondiconamiento farmacológico,
ya sea incorporado como elemento adicional en la dieta, pretratamiento hormonal 139, farmacológico o génico (en el caso de pacientes) o como componente de
soluciones de preservación, en el caso de los injertos.
VIII.- REFERENCIAS
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