ANÁLISIS DE LA CALIDAD DEL AGUA II

DETERMINACIÓN MICROBIOLÓGICA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICASDEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

LABORATORIO DE ECOLOGÍA MICROBIANA

EQUIPO 3 SEC 1• AGUIRRE CARBAJAL ITZEL

ALEJANDRA• GARCÍA FLORES MIGUEL ANGEL

EQUIPO 3 SEC 2• ANGUIANO AVIÑA

FERNANDO• GARCÍA URIBE TANIA

NAYELI

OBJETIVO

En una muestra obtenida de un cuerpo de agua determinar en base a la norma oficial mexicana de análisis NMX-AA-042-1987el número más probable (NMP): Microorganismos coliformes totales Microorganismos coliformes fecales

termotolerantes Escherichia coli presuntiva .

ANÁLISIS MICROBIÓLOGICO DEL AGUAAGUA

Vehículo de microorganismos patógenos causantes de enfermedades.

ENTEROPATÓGENOS

BACTERIAS• Salmonella• Shigella• VibrioPROTOZOARIOS• Entamoeba

histolyticaVIRUS• Hepatitis• Polio

• Causantes de diversas enfermedades

• Dificultad en su aislamiento

COLIFORMES

• Escherichia coli

• Klebsiella spp

• Citrobacter sp

• Enterobacter sp

• Bacilos cortos• G(-)• Aerobios o anaerobios

facultativos• No esporulados• Fermentadores de

lactosa • Productores de gas

TABLA 1.-CRITERIOS ECOLÓGICOS DE LA CALIDAD DEL AGUA

FUENTE NMP*/100mL

Abastecimiento para potabilización de agua

1000

Riego agrícola 1000

Agua dulce <200

Agua Marina <200

Recreativo en contacto directo <200

Agua potable <2

*de organismos coliformes totales Gaceta Ecológica. Enero de 1990. CE-CCA-001/89

De acuerdo a estos criterios la muestra obtenida de las cascadas de Atlihuetzia que es clasificada como agua dulce debe presentar valores menores a 200 UFC/100 mL

DETERMINACIÓN DEL NÚMERO MAS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES (TERMOTOLERANTES) Y Escherichia coli PRESUNTIVA

Se basa en la Norma Mexicana de análisis. NMX-AA-042-1987

Método para la detección y enumeración en agua de los m.o. antes mencionados mediante el cultivo en un medio liquido en múltiples tubos y el cálculo de sus NMP

Es aplicable para todo tipo de agua Las pruebas usadas en la detección y confirmación

puede verse como parte de una secuencia continua. De acuerdo al uso que se dará a la muestra será el

número de pasos.

FUNDAMENTO

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares.

PRUEBA PRESUNTIVA

Inoculación de alícuotas de la muestra, diluida o sin diluir, en caldo lactosado

37° C / 24 y 48 hrs,

Turbidez y producción de gas son positivos para coliformes

CALDO LACTOSADO Es un caldo rico en nutrientes, que no contiene algún

tipo de inhibidor, contiene la siguiente formulación:

FÓRMULA (en gramos por litro)Extracto de carne.........3.0.

Peptona............5.0.

Lactosa...........5.0. 

Usado como prueba presuntiva de la presencia de bacterias del grupo coliforme en agua, se usa con concentración doble debido a que es una muestra muy contaminada, para asegurar el crecimiento de los microorganismos presentes en la muestra

Fuente de C y N2

C ---- fermentable

Como producto de la fermentación de la lactosa se produce finalmente acido y gas, evidenciado en la campana de Durham.

PRUEBA CONFIRMATIVA

La resiembra de los tubos positivos de la prueba presuntiva en tubos con caldo BLVB

Crecimiento con producción de gas es + para coliformes totales.

A 37⁰ por 48 hrs

Desarrollo con producción de gas es + para termotolerantes.

44⁰C por 48 hrs

En el mismo medio

Se emplea como medio de cultivo caldo lactosa verde brillante bilis

por ser selectivo ya que solo permite el desarrollo de aquellos

microorganismos que toleran tanto las sales biliares como el

verde brillante.

CALDO TRIPTONA Formula(g/L)

TRIPTONA .....10.0

CLORURO DE SODIO ....5.0

El triptófano es un a.a que puede ser oxidado por ciertas bacterias para

formar 3 metabolitos, el indol, escatiol, y el indolacetico

La triptona presenta alto contenido en triptófano, el cual

es el sustrato utilizado por los microorganismos para la producción

de indol, ácido pirúvico y amoníaco.

Reactivo de Kovacs

p-dimetilamino benzaldehído               5gAlcohol amílico                                75 mlHCl concentrado                              25 ml

+ Complejo colorido rojizo

PRUEBA COMPLETA

De tubos positivos de BLVB sembrar por estría cruzada en EMB

MEDIO EMB

FORMÙLA Peptona ..........................................10.0. Lactosa.............................................5.0. Sacarosa............................................5.0. Fosfato Di potásico ............................2.0. Eosina.............................................0.4. Azul de metileno.............................0.065. Agar ................................ 13.5. pH final: 7.2 ± 0.2

FUNDAMENTO

Medio selectivo y diferencial. Azul de metileno y eosina inhiben Gram

positivos Lactosa y sacarosa permiten desarrollo

de Enterobacterias que los utilizan. Escherichia coli colonias verde metálico Lactosa positivo colonias rosas claro con

centro negro Lactosa negativo colonias incoloras

FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA

En base a la Norma mexicana de análisis NMX-AA-102-1987 se determina el número de coliformes totales presentes en el agua mediante la filtración de volúmenes específicos de la muestra a través de filtros de membrana. Están compuestos de ésteres de celulosa, con poros de 0,45 mm de diámetro que retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra.

TABLA 2.-VOLUMEN DE AGUA A ANALIZAR

Se utiliza el Medio Endo para el recuento de coliformes totales. El lauril sulfato y desoxicolato que forman parte de la fórmula del medio permite crecer a los coliformes lactosa positivo pero inhibe el crecimiento del resto de bacterias acompañantes.

Las colonias lactosa positivo se colorean de rojo por la liberación de fucsina del sulfato de fucsina. Las colonias de E. coli y de los coliformes muestran generalmente un brillo metálico.

GRÁFICA 1.- RESULTADOS NMP SEC 1

Equi

po 1

Equi

po 2

Equi

po 3

Equi

po 4

Equi

po 5

Equi

po 6

Equi

po 7

0

500

1000

1500

2000

2500

NMP organismos col-iformes totalesNMP organismos Col-iformes fecalesNMP Escherichia coli Presuntiva NMP Escherichia coli completa

GRÁFICA 2.- RESULTADOS NMP SEC 2

1 2 3 4 5 6 70

500

1000

1500

2000

2500

NMP Organismos Col-iformes Totales/100mLNMP Organismos Col-iformes Fecales/100mLNMP Escherichia coli Presuntiva/100mL

TABLA 3.-RESULTADOS SECCIONES 1 Y 2 Número más probable de Microorganismos

Coliformes Totales en Muestras de Agua

 EqupoNúmero

característicoSec 1

NMP organismos coliformes

totales /100mLSec 1

Número característico

Sec 2

NMP Organismos Coliformes

Totales/100mLSec 2

1 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

2 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

3 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

4 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

5 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

6 3/3/3 ≥2400 2, 2, 0 21

7 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

TABLA 4.-NÚMERO MÁS PROBABLE DE MICROORGANISMOS COLIFORMES FECALES

EN MUESTRAS DE AGUA

Equipo/EstaciónNúmero

característicoSec 1

NMP organismos Coliformes

fecales /100mLSec 1

Número característico

Sec 2

NMP Organismos Coliformes

Fecales/100mLSec 2

1 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

2 3/3/3 ≥2400 3, 3, 2 1100

3 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

4 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

5 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

6 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

7 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

TABLA 5.-NÚMERO MÁS PROBABLE EN PRUEBA PRESUNTIVA PARA ESCHERICHIA COLI EN MUESTRAS

DE AGUA

 Equipo/Estación

Número característico

Sec 1

NMP Escherichia coli Presuntiva

/100mLSec 1

Número característico

Sec 2

NMP Escherichia coli Presuntiva/100mL

Sec 2

1 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

2 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

3 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

4 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

5 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

6 3/3/3 ≥2400 3, 3, 3 ≥2400

7 3/3/3 ≥2400 2, 1, 0 15

TABLA 6.-PRUEBA COMPLETA PARA ESCHERICHIA COLI EN MUESTRAS DE AGUA EN AGAR EOSINA AZUL DE METILENO

Equipo/ Estación Prueba completa EMB Sec 2

1 10 -1 -0.1 +

2 10 -1 +0.1 +

3 10 +1 +0.1 +

4 10 -1 -0.1 +

5 10 -1 +0.1 +

6 10 +1 +0.1 -

7 10 -1 -0.1 +

TABLA 7.-PRUEBA COMPLETA PARA ESCHERICHIA COLI EN MUESTRAS DE AGUA.

Sec 1Equipo

Número característicoNMP Escherichia coli

completa /100mL

1 3/3/3 ≥2400

2 3/3/3 ≥2400

3 2/3/3 53

4 2/3/3 53

5 1/3/3 29

6 3/2/1 150

7 3/3/3 ≥2400

CONCLUSIONES

En base a las normas mexicanas de análisis NMX-AA-042-1987, NOM-127-SSA1-1994 y a los criterios ecológicos de la calidad del agua publicados en la Gaceta ecológica de Enero de 1990 CE-CCA-001/89 la calidad microbiológica del agua muestreada es mala superando por mucho los niveles máximos estipulados, por lo que, no es apta para consumo humano u animal, sin embargo, si es tratada puede ser utilizada como agua de riego.

BIBLIOGRAFÍA

Gaceta Ecológica Enero 1990 Críterios Ecológicos de la Calidad del Agua CE-CCA-001/89

Atlas, R.M. & Bartha, 2003. Ecología microbiana. Fundamentos y aplicaciones. Addison Wesley Massachusets.

http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/127ssa14.html

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/gacetas/191/criterios.html