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Introducción

La experiencia de laboratorio fue realizada con los siguientes objetivos: * Adiestrarse con los procesos experimentales con animales (manipulación,

colección de órganos y procesamiento de muestras) para extracción de ARN.* Adiestrarse con diferentes técnicas de biología molecular (diseño de primer

y uso de PCR como herramienta base de biología molecular. Extracción de ácidos nucleicos, RT-PCR).

Los resultados que esperamos es la identificación del fragmento del gen de interés, mediante geles de agarosa. Medir la semicuantificación de la expresión de un gen.

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Marco teórico

ADN (ácido desoxirribonucleico)Es un tipo de ácido nucleico, una macromolécula que forma parte de todas las células.

Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria.

El ADN es un polinucleótido, constituido por muchos nucleótidos; y cada nucleótido, está formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un grupo fosfato. Lo que distingue a un nucleótido de otro es la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando sólo la secuencia de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la información genética. En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí por unas conexiones denominadas puentes de hidrógeno.

Los extremos de cada una de las hebras del ADN son denominados 5’-P (fosfato) y 3’–OH (hidroxilo) en la desoxirribosa. Las dos cadenas se alinean en forma paralela, pero en direcciones inversas (una en sentido 5’ → 3’ y la complementaria en el sentido inverso), pues la interacción entre las dos cadenas está determinada por los puentes de hidrógeno entre sus bases nitrogenadas. Se dice, entonces, que las cadenas son antiparalelas.

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Dentro de las células, el ADN está organizado en estructuras llamadas cromosomas que, durante el ciclo celular, se duplican antes de que la célula se divida.

Replicación de ADN: proceso por el cual se obtienen copias idénticas de una molécula de ADN. La replicación es fundamental para la transferencia de la información genética de una generación a la siguiente y es la base de la herencia. El mecanismo consiste en la separación de las dos hebras de la doble hélice, las cuales sirven de molde para la posterior síntesis de cadenas complementarias a cada una de ellas. El resultado final son dos moléculas idénticas a la original. Este tipo de replicación se denomina semiconservativa debido a que cada una de las dos moléculas resultantes de la duplicación presenta una cadena procedente de la molécula "madre" y otra recién sintetizada. El Proceso de replicación es complejo y en el intervienen una serie de enzimas. Existen sitios específicos donde comienza la replicación denominados orígenes de replicación. Cuando comienza se forma una burbuja de replicación que contiene dos horquillas. Un breve resumen de las enzimas que participan y como lo hacen: las enzimas DNA polimerasa encargadas de la adición de nucleótidos por complementariedad, la helicasa que abre la horquilla, la RNA polimerasa que es quien comienza la replicación ya que puede unir dos nucleótidos libres y forma un pequeño fragmento de ARN, que luego es removido por una exonucleasa y la DNA polimerasa lo reemplaza por ADN, sellando el eje azúcar fosfato mediante la ligasa.

Transcripción y traducción de ARN: en un gen, la secuencia de nucleótidos a lo largo de una hebra de ADN se transcribe a un ARN mensajero (ARNm). Para que la información que contiene el ADN pueda ser utilizada por la maquinaria celular, debe copiarse en primer lugar en una secuencia de nucleótidos, más cortos y con unas unidades diferentes, ARN. Las moléculas de ARN se copian exactamente del ADN mediante un proceso denominado

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transcripción. La transcripción es el proceso por el cual se sintetiza un ARN usando como molde una cadena de ADN. Además el ARNm sufre modificaciones luego de ser transcrito como la adición del Cap y la cola poly A. El proceso en el cual se eliminan los intrones y empalman los exones se denomina SPLICING.

Luego, esta secuencia se traduce a una proteína que un organismo es capaz de sintetizar o "expresar" en uno o varios momentos de su vida, usando la información de la secuencia. La relación entre la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de la proteína viene determinada por el código genético, que se utiliza durante el proceso de traducción o síntesis de proteínas.

Fases de la síntesis de proteínas:

Fase de activación de los aminoácidos: mediante la enzima aminoacil-ARNt-sintetasa y de ATP, los aminoácidos pueden unirse ARN específico de transferencia, dando lugar a un aminoacil-ARNt. En este proceso se libera AMP y fosfato y tras él, se libera la enzima, que vuelve a actuar.

Inicio de la síntesis proteica: el ARN se une a la subunidad menor de los ribosomas, a los que se asocia el aminoacil-ARNt. A este grupo, se une la subunidad ribosómica mayor, con lo que se forma el complejo activo o ribosomal.

Elongación de la cadena polipeptídica: el complejo ribosomal tiene dos centros o puntos de unión. El centro P o centro peptidil y el centro A. El radical amino del aminoácido iniciado y el radical carboxilo anterior se unen mediante un enlace peptídico y se cataliza esta unión mediante la enzima peptidil-transferasa. Así, el centro P se ocupa por un ARNt carente de aminoácido. Seguidamente se libera el ARNt del ribosoma produciéndose la translocación ribosomal y quedando el dipeptil-ARNt en el centro P. Al finalizar el tercer codón, el tercer aminoacil-ARNt se sitúa en el centro A. A continuación se forma el tripéptido A y después el ribosoma procede a su segunda translocación. Este proceso puede repetirse muchas veces y depende del número de aminoácidos que intervienen en la síntesis.

Finalización de la síntesis de proteínas: aparecen los tripletes sin sentido, también conocidos como codones stop. Estos tripletes son tres: UGA, UAG y UAA. No existe ARNt tal que su anticodón sea complementario. Por ello, la síntesis se interrumpe y esto indica que la cadena polipeptídica ha finalizado.

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El flujo de la información dentro de la célula. En 2957, Francis Crick dio una conferencia en la Sociedad Británica de Biología Experimental en la que estableció el Dogma Central de la Biología, el cual establece que la información puede fluir de un ácido nucleico a una proteína pero no de una proteína a otra proteína, ni de una proteína a un ácido nucleico.

PROPUESTA INICIAL DE CRICK (1970)

Replicación

DNA RNA proteínas

Transcripción Traducción

“Dogma” fue una denominación poco acertada, porque un dogma se refiere a una premisa que no se pone en duda y la ciencia justamente se caracteriza por ser un proceso de cuestionamiento permanente. Pero el término persistió.

Después de haber publicado su teoría, Crick fue criticado por usar la palabra “dogma”. Él mismo reconoció que hubiera sido más adecuado llamarla “hipótesis central”. De cualquier manera, desde su formulación, se ha visto que, con algunas excepciones, el “dogma” generalmente se cumple.

Pero, en el mundo biológico las excepciones suelen ser muy significativas y reveladoras de la complejidad y multiplicidad de los procesos vitales. Una de esas excepciones fue revelada en 1962 por el virólogo estadounidense Howard M. Temin, quien descubrió que en algunos virus que contienen ARN como material genético se produce DNA a partir de ARN. Temin y otros investigadores, aislaron la enzima capaz de revertir el sentido del flujo de información postulado por el dogma; y fue llamada transcriptasa inversa.

MODIFICACION POSTERIORES

Replicación Replicación

Transcripción Traducción

ADN ARN Proteína

Transcripción

Inversa

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Retrotranscripción.

Es un proceso de la biología molecular que implica la generación de una cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena a partir de un ácido ribonucleico (ARN) de cadena simple. La clave es la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa; descrita por vez primera en virus de la familia Retroviridae de forma independiente por los investigadores Howard Temin y David Baltimore en 1970,su descubrimiento supuso la primera evidencia de la falsedad del dogma central de la biología molecular .

La transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa, que sintetiza ADN de doble cadena utilizando como molde ARN monocatenario, ósea cataliza la retrotranscripción o transcripción inversa. Esta enzima se encuentra presente en los retrovirus. Su nombre obedece a que el proceso normal de la transcripción, la que se puede llamar "directa", codifica el ARN a partir de la secuencia inicial de ADN, y no al revés. Una forma sencilla de síntesis de ADN de doble cadena a partir de transcriptasa inversa, también llamada ADN/ARN-polimerasa dirigida, sería partir de un cebador cola de poli-T que establecería bases complementarias con la cola de poli-A del ARN transcrito de la hebra que se va a sintetizar, lo que forma un híbrido ARN/ADN. Dicho híbrido podría separarse mediante ribonucleasas, y después, con la acción de una ADN-polimerasa y un nuevo cebador, ser completada la hebra de ADN de doble cadena. En la biología molecular y la bioquímica, la transcriptasa inversa, también conocida como ADN polimerasa dependiente de ARN, es una enzima ADN polimerasa que transcribe una sola cadena de ARN en una sola cadena de ADN. También ayuda en la formación de una doble hélice de ADN una vez que el ARN ha experimentado una transcripción inversa en una sola cadena de cDNA. La transcripción inversa implica la síntesis de ADN a partir del ARN.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado.

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La PCR puede efectuarse como una técnica de punto final, como una herramienta de generación del ADN deseado, o como un método continuo, en el que se evalúe dicha polimerización a tiempo real.

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la década de 1980.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción (muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica). Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción.

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Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.

Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Para realizar la técnica se necesitan:

Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.

Dos cebadores o primers (reverse y forward) oligonucleótidos que son (cada uno) complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.

Iones monovalentes, como el potasio.

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Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).

ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Agua libre de nucleasas.

El proceso de PCR consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura, ciclos; cada ciclo consiste en 3 pasos a diferentes temperaturas. Los pasos de ciclos están precedidos por un choque térmico ("hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final.

Inicio: se lleva la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C, que se mantiene durante 1-9 minutos (esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor).

Desnaturalización: se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). El modo más habitual de realizar este paso es el calentamiento (94-95 °C) de la muestra.

Alineamiento o unión del cebador: luego se producirá la hibridación del cebador, el cual se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos, permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

Extensión o elongación de la cadena: actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima

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actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende de la ADN polimerasa usada y de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar.

Elongación final: etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

Conservación: se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, (longitud) y a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes. Los tamaños de los productos de la PCR están determinados por un marcador de peso molecular de ADN, que contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

Tipos de PCR

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:

1er paso: retrotranscripción a partir del ARN (el ARN es transcrito a cDNA utilizando la transcriptasa inversa)

2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.

3er paso: PCR estándar.

Procedimiento: RT-PCR utiliza un par de cebadores que son complementarios a una secuencia definida en cada una de las dos hebras del DNA.

El primer paso es la transcripción reversa (RT), en los que el ARN es transcrito a cDNA utilizando la transcriptasa inversa. Este paso es muy importante para llevar a cabo la polimerización en cadena de la polimerasa de ADN, que sólo puede actuar sobre el ADN molde. El paso de RT se puede realizar en el mismo tubo de PCR o en uno separado con una temperatura entre 40 ° C y 50 ° C, dependiendo de las propiedades de la transcriptasa inversa utilizada.

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El siguiente paso consiste en la desnaturalización del ADN de doble cadena a 95 ° C, por lo que las dos acciones distintas y los primers pueden unirse de nuevo a temperaturas más bajas y comenzar una reacción en cadena de nuevo. Entonces, la temperatura disminuye hasta llegar a la temperatura de hibridación que puede variar dependiendo de la configuración de los cebadores utilizados, su concentración y los cationes de concentración. La principal consideración al elegir la temperatura de hibridación óptima es la temperatura de fusión (Tm) de los cebadores.

El paso final de amplificación por PCR del ADN es la extensión de los cebadores. Esto se hace con termoestable Taq polimerasa de ADN, por lo general a 72 ° C, la temperatura a la que la enzima funciona óptimamente. La duración de la incubación en cada temperatura, las alteraciones de temperatura, y el número de ciclos son controlados por un termociclador programable. El análisis de los productos de PCR depende del tipo de la PCR aplicada. Si una PCR convencional se utiliza, el producto de PCR se detecta mediante electroforesis en gel de agarosa y bromuro de etidio (o de ácido nucleico otras manchas).

RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa)

Es un método sensible para la detección de los niveles de expresión del ARNm. Tradicionalmente la RT-PCR de dos pasos: la reacción de RT y la amplificación por PCR. ARN es la primera transcripción inversa en cDNA utilizando una transcriptasa inversa, el ADNc resultante se utiliza como plantilla para la amplificación de PCR posterior con iniciadores específicos para uno o más genes. RT-PCR también se puede realizar como RT de un solo paso PCR en el que todos los componentes de la reacción se mezclan en un tubo antes de comenzar la reacción.

RT-PCR es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica de laboratorio de uso general en biología molecular para generar muchas copias de un ADN de secuencia, un proceso llamado "amplificación". En RT-PCR, sin embargo, una cadena de ARN es la primera transcripción inversa en su ADN complementario (ADNc) utilizando la enzima transcriptasa inversa , y el ADNc resultante es amplificada por PCR tradicional o la PCR en tiempo real .

PCR de transcripción inversa no se debe confundir con la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (Q-PCR/qRT-PCR), que también es a veces abreviado como RT-PCR.

Existe un mayor riesgo de contaminación cruzada de las muestras ya que la detección del producto de PCR requiere el tratamiento posterior a la amplificación de las muestras.

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Por otra parte, la especificidad de la prueba está determinada principalmente por los iniciadores, lo que puede dar resultados falsos positivos. Sin embargo, la cuestión más importante sobre RT-PCR convencional es el hecho de que se trata de un semi o incluso una técnica de bajo cuantitativos, mientras que la amplificación se puede visualizar sólo después de la amplificación de los extremos.

Espectrofotometría de ácidos nucleicos

Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos nucleicos (AN) absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de AN presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un AN en particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración a partir del valor de A260. Así, una unidad de absorbancia a 260nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 μg/ml de ADN doble hebra, 40 μg/ml de ARN o 33 μg/ml de fragmentos cortos de ADN monohebra (oligodesoxinucleótidos).

En las preparaciones de AN, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de AN. Dado que el máximo de absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8, y para ARN, A260/A280 ≥ 2.0.

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Experiencia de Laboratorio

Día 1 (sábado 28 de mayo): “ Obtención y procesamiento de la muestra”.

Anestesiamos un rata macho de 70 gr. de un mes y un día de vida, mediante una inyección intramuscular en el musculo abdominal. La anestesia era una mezcla de aproximadamente 170 ml (1oo ml de ketamina por 30 ml de xilacina). Dicha mezcla está aprobada. (Realizado por los profesores a cargo).

Para asegurarnos que el animal estaba completamente anestesiado, con una pinza le apretábamos la patita y no tenía que tener ningún tipo de reflejo la rata.

Ya anestesiado, abrimos el animal por la cavidad abdominal, y retiramos cuidadosamente tres órganos: corazón, hígado e intestino. El corazón es el último órgano en retirar. Con muchísimo cuidado de no romper el páncreas, ya que contiene RNasas que destruirían el ARN que necesitamos. (Realizado por los profesores a cargo)

Para extraer las muestras no es necesario que la rata esté en ayuno, y no se debe matar el animal antes de retirar los órganos porque sino se degradaría el ARN (es muy inestable) y nosotros lo necesitamos intacto.

Al retirar los órganos, los lavamos con solución Ringer para mantener el equilibrio osmótico y así no se dañen nuestras muestras. En el caso del intestino, tuvimos que lavarlo por dentro con ésta solución, para así eliminar todo desecho que contenga dentro (sobre hielo). (Realizado por los profesores a cargo)

Luego, colocamos las muestras en 4oo µl de solución RNAlater (Ambion) durante 24 hs. Durante el aislamiento y almacenamiento del mismo, debe tenerse mucho cuidado para impedir que lo degraden las RNasas. Por eso se las incuba en sustancias que contengan inhibidores de las RNasas como el RNAlater.

RECOMENDACIONES.

* Trabajar con guantes lavados previamente con alcohol 70.

* Las pipetas a utilizar también las lavamos con alcohol 70.

* Todo el material a utilizar debe estar esterilizado.

* Todos los materiales que usamos para extraer y contener las muestras, se limpian con solución Ringer.

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* Para contener las muestras se utilizan tubos eppendorf, los cuales son libres de DNasas, RNasas.

* Las muestras se conservan a 4° C, en hielo granizado.

* Se recomienda trabajar a aproximadamente 15 cm de fuego, para que el aire sea estéril.

* Los tips utilizados en las pipetas deben estar totalmente esterilizados, y sólo se utilizan una sola vez y luego son desechados.

Día 2 (lunes 30 de mayo): “ Obtención del ARN y medición de la absorbancia”.

Homogeneización: durante la homogeneización el Trizol mantiene la integridad del ARN. El trizol (guanidin tiocianato-fenol-cloroformo) desnaturaliza proteínas haciéndolas insolubles en la preparación.

Procedimos a retirar con una pipeta el RNAlater colocado anteriormente. Luego, le agregamos a las muestras 800 µl de Trizol por 50-100mg de tejido; y realizamos la homogeneización de las mismas mediante un homogeneizador. Una vez que las homogeneizamos, las dejamos incubar a las muestras por 5 minutos a temperatura ambiente, y así permitimos que actúe el Trizol. Se rompieron todas las grasas que contengan las muestras y los complejos nucleoproteicos.

Después, centrifugamos los tejidos en una centrifuga refrigerada a 4° C durante 10 minutos a 12000 g, y así removimos detritos. Mediante este proceso los residuos orgánicos hacia el fondo de los eppendorf, y así pudimos extraer y transferir una cantidad aproximada de 800µl del sobrenadante obtenido a un eppendorf limpio.

Separación de fases:

En el nuevo eppendorf que contiene el sobrenadante obtenido en el paso anterior, le agregamos 200 µl de cloroformo a cada tubo, bajo campana (para cargar la pipeta levantamos y soltamos varias veces, para que cargue. Luego lo colocamos en el eppendorf). Y agitamos vigorosamente por 15 segundos; y así conseguimos que nuestras muestras se separen en 3 fases: acuosa, interfase y orgánica. A esto, lo dejamos incubar por 2-3 minutos a temperatura ambiente y luego lo centrifugamos por 15 minutos a 12,000 g a 4ºC.

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Precipitación del ARN: la mayor parte de ARN se extrae de la fase acuosa, pues permanece soluble en la fase superior de ácidos acuosos debido a la presencia del grupo oxidrilo en su carbono 3, que lo hace mas soluble que el DNA, que se encuentra en la interfase o en la fase orgánica (inferior) junto con las proteínas.

Entonces, transferimos 400 µl de la fase acuosa (fase superior) con la pipeta, sin levantar nada de la interfase ni fase orgánica; si creemos que tomamos algo que no sea fase acuosa, lo volvemos. Y lo transferidos a un nuevo eppendorf. A esto le agregamos 0,5ml de isopropanol a cada tubo para que precipite el ARN (deshidrata el RNA). Mezclamos por inversión, y observamos una turbulencia (la hebra de ARN). Seguidamente, dejamos incubar por 10 minutos a temperatura ambiente, luego centrifugamos a 12,000 x g por 10 minutos a 4ºC.

El ARN formó un pellet.

Lavado de ARN:

Se desecha el sobrenadante que contiene las proteínas. Lavamos el pellet de ARN formado con alcohol 75% en agua tratada con DEPC. Luego, separamos el pellet con pequeños golpes y por último centrifugamos las muestras a 7500 g por 5 minutos a 4ºC.

Este proceso se repite 3 veces para conseguir un pellet bien limpio. El ARN puede ser almacenado en alcohol a -70°C por meses.

Redisolver el ARN:

Procedimos a remover el sobrenadante y lo dejamos secar al aire. SIN PERDER EL PELLET. Y luego, lo redisolvimos en 50μl de agua libre de nucleasas (el corazón, como obtuvimos menor cantidad de ARN, lo disolvimos en 40 µl).

Determinación de la concentración del ARN y su pureza: es esencial que las todas las muestras del análisis tengan grados de pureza (A260/280) e integridad (28S/18S) comparables.

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Realizamos una dilución 1/10 de ARN de la muestra del corazón y una dilución 1/100 del intestino y del hígado. Luego, diluimos en agua libre de nucleasas.

Medimos el blanco y después pipeteamos con una micro pipeta el RNA diluido en un ampliquant (que mide la absorbancia), y así medimos la absorbancia a 260nm (presencia de nucleótidos) y 280nm (presencia de proteínas). Y de la relación de abs 260/abs 280, calculamos la pureza de cada muestra. Una buena pureza debe dar 1,7-2

Si la pureza nos da un resultado mayor a 2 es porque las muestras están contaminadas con proteínas. En caso que nos de menor a 2, es porque están contaminadas con ADN.

Estos son nuestros resultados sobre las absorbancias y la pureza de las muestras.

Muestra Abs 260 Abs 280 Dilución Pureza

Corazón 0,694 0,377 1/10 1,840

Hígado 1,606 0,937 1/100 1,713

Intestino 2,287 1,343 1/100 1,102

Luego, calculamos la concentración de ARN en la muestra:

[ARN ug/mL]= fd x 40 x 10/3 x Abs 260

1000

Corazón= 10 x 40 x 10/3 x o,694 = 0,935 µg / mL

1000

Hígado= 100 x 40 x 10/3 x 1,606 = 21,41 µg / mL

1000

Intestino= 100 x 40 x 10/3 x 2,287 = 30,49 µg / mL

1000

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Día 3 (sábado 4 de junio): “Retrotranscripción y PCR”.

Ya que las concentraciones de las muestras que se obtuvieron no eran las esperadas, trabajamos sin desoxirribonucleasa 1.

Se realizó una RT mix:

Buffer 10X 2 µL

RT (MMLV) 1 µL

Agua libre de nucleasas 6 µL

dNTPS 1 µL

Estas cantidades se multiplicaron por la cantidad de muestras N= 4 (tres muestras y se le suma 1 por un margen de error) por lo que nuestro volumen final sería:

* Buffer 10X : 8 µL

* RT (MMLV) :4 µL

* Agua libre de nucleasas: 24 µL

* dNTPS: 4 µL

Se procedió a realizar un control negativo, en el cual se utilizaron las mismas cantidades, pero se retiró la RT y se agregó 1 µL de agua. La cantidad de las muestras eran dos, un control perteneciente a cada comisión. Las muestras más el margen nos da un total de N= 3 por lo que la RT mix del control negativo tiene los siguientes componentes:

* Buffer 10X: 6 µL

* Agua libre de nucleasas: 21 µL

* dNTPS: 3 µL

Se llevó 10 minutos a baño maría a 70°C, se suben y se bajan las temperaturas con el fin de que los oligos se apareen mejor y evitar los pliegues.

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Se utilizó un tubo con tapa circular con el fin de que no condensara en las paredes.

Control negativo: es un control que no tiene que dar nada. Se saca la RT (mmlv) y se le agrega 1 µL de agua. Si se ve en el gel de agarosa significa que las muestras están contaminadas con ADN.

Se tenían 3 muestras más el control negativo, N=4. Se hacen diluciones 1 /5 de esas muestras. Se dividen en dos, sacas 10 µL para los genes de interés (18laudina 2 y 18laudina 12) y 10 µL para los genes de referencia EEF1A1. De esos 4 ahora te quedan 8.

Luego se realizamos la PCR mix:

Buffer 10X 3,5 µL

dNTPS 0,28 µL

Agua libre de nucleasas 15,01 µL

Taq 0,11 µL

MgCl2 2,1 µL

Al tener 8 tubos más el margen de error N=9, las proporciones quedarían:

o Buffer 10 X: 31,5 µLo dNTPS: 2,52 µLo agua libre de nucleasas: 135,09 µLo TAQ: 0,99 µLo Cloruro de magnesio: 18,8 µL

Luego de agregar esto a cada tubo, se hizo la disolución del primer:

1,25 µL del primer más 18,78 µL de agua libre de nucleasas, quedándote un total 20,03 µL.

En cada tubo donde se puso la PCR mix, se le agregaba un primer forward en un lado del tubo, y el reverse del otro con el fin de que no polimericen entre sí. Eso se llevó al termociclador minutos a las temperaturas necesarias para la PCR; el mismo termociclador

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regula las temperaturas y cuando termina las mantiene al final a una temperatura constante de 4°C.

Día 4 (lunes 6 de junio): “Corrida en gel de agarosa y discusión de los datos. Premisas para armar el informe”.

Colocamos el gel de agarosa al 2,5 %, buffer TBE 0.5X y se le agregamos 1 µL de gel red, (termo resistente). Se recomienda agregarlo durante la preparación del gel ya que de esta forma permite ver las bandas con mayor intensidad que si se agregara al final.

Esta preparación la calentamos hasta que el gel de agarosa tiende a derretirse (tiene un bajo punto de fusión). Cuando su temperatura baja, lo colocamos sobre la cama de la cuba.

Previamente a cada tubo que contiene las muestras, le colocamos dos µL de loading buffer 6X, el cual le da un “peso” a la muestra permitiendo que luego por electroforesis se dirija a un polo. El loading buffer está compuesto por sacarosa, agua destilada y azul de bromo fenol (en una cantidad de punta del tip) el cual es inocuo.

Una vez preparado el gel, lo colocamos sobre la cama y dejamos pasar unos 10 minutos para que polimerice y le agregamos un peine para que nos marcara los surcos en donde sembramos las muestras. El peine utilizado contenía 15 surcos.

Una vez que polimerizó, retiramos el peine y le agregamos el buffer TBE que permite que la corriente pase. Se recomienda colocarlo antes de sembrar las muestras ya que no se corre el riesgo de que si se agrega después levante las muestras ya sembradas.

Por lo general, el buffer TBE utilizado para la preparación del gen es un buffer nuevo y el que se utiliza sobre la cama esta reciclado.

A las muestras las agregamos de a una en los diferentes surcos que dejó el peine; cargando la muestra en la pipeta, lo resuspendíamos y luego lo colocábamos en los surcos. Con las muestras en su lugar, realizamos la electroforesis por 90 minutos a un voltaje constante de 50mV/cm.

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Resultado obtenido en gel de agarosa.

Well 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

MW 4 4control 5 5control 6 6control B- B-control

MW: marcador de peso molecular.

Muestra 4: corazón.

Muestra 5: hígado.

Muestra 6: intestino.

(El well 7 se dejó vacío porque no se armó bien)

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Conclusión.

Al observar el resultado del gel de agarosa, podemos identificar que nuestras muestras están contaminadas con ADN genómico. De esto nos damos cuenta, ya que el control negativo no debería verse en el gel, porque no se le realizó la RT.

Los well 3 y 4 (correspondientes a la muestra del tejido del corazón) dieron bastante bien. Los well 5 y 6, dieron totalmente contaminados. Y los well 8 y 9 (del intestino) también nos dieron relativamente bien.

Lo que observamos en la imagen, es que esos puntitos por todos lados es contaminación de ADN; y debajo son los desechos de primer utilizados durante el procedimiento.

No podemos cuantificar la expresión de ADNc, porque está contaminado con ADN.

ADN amplificado de ADN genómico.

de ARN de las muestras.

Igual, este laboratorio fue realizado para poder observar estas bandas. Su intensificación, y eso lo pudimos observar; solamente que no podemos cuantificarlo porque está contaminado con ADN.

Los resultados no fueron los esperados porque no seguimos con las normas recomendadas para trabajar con ARN, ya que a modo de aprendizaje pipeteábamos los alumnos, hablábamos mientras realizábamos la experiencia, nos movíamos de un laboratorio a otro, y eso produce contaminación.

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Glosario

Absorbancia 260: el estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia. Por tanto, la absorbancia a 2.600 Å se puede utilizar como una medida del estado físico de la molécula de ADN. Las curvas de fusión tienen forma de S observándose un aumento brusco de la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusión.

Absorbancia 280: La mayoría de proteínas presenta un máximo de absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano y fenilalanina). La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir proteínas en concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura. Algunas preparaciones de proteínas parcialmente purificadas pueden tener ácidos nucleicos, los cuales tienen un máximo de absorción a 260 nm. Una ecuación para calcular la concentración de proteína en la presencia de ácidos nucleicos en cubetas de 1 cm de paso es: (proteína)mg/ml = 1.55 A280nm - 0.76 A260nm. La ecuación fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1.75) en la presencia de ácido nucleico de levadura (A280/A260 = 0.49) y por tanto puede no ser precisa para otras proteínas y otros ácidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solución de proteína 0.1% (p/v) varía entre 0.5 y 2.5, dependiendo de la proporción de aminoácidos aromáticos que contengan.

ADNc: sinónimo de ADN complementario o copia de ADN. Puede ser monocatenario o bicatenario. ADNc es ADN sintetizado a partir de un ARNm maduro en una reacción catalizada por la enzima es transcriptasa inversa y la enzima ADN polimerasa. Este proceso se denomina transcripción inversa (RT) o la primera línea de la síntesis de ADNc. El propósito de la conversión de RNAm a ADNc es para el análisis de la plantilla de ARNm porque el ADN es mucho más estable que el ARN. Una vez que ARNm se convierte en DNA, la DNA se puede utilizar para la RT-PCR, como punta de prueba para el análisis de expresión y para la clonación de la secuencia del ARNm. Cuando los científicos quieren expresar una determinada proteína en una célula que normalmente no expresan esta proteína (heteróloga expresión), que trasladará el cDNA que codifica para la proteína de la célula receptora. DNAc también es producida por retrovirus (como el VIH-1 , VIH-2 , Simian Virus de la Inmunodeficiencia , etc), que está integrado en su sede de crear un provirus.

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Agua DEPC: es útil en biología molecular, particularmente cuando se va a trabajar con RNA. El término DEPC significa Dietilpirocarbonato, y es una sustancia química que elimina Ribonucleasas, enzimas capaces de degradar el RNA. Se prepara adicionando el compuesto DEPC, 0.01 ml por cada 100 ml de agua. Con el agua DEPC puedes disolver RNA aislado de cualquier tejido, pues esta agua ya no tendra ribonucleasas que degraden el RNA.

Agua libre de nucleasas: (H2O + C6H10O5) también llamada “agua estabilizada, oxido de dihidrógeno estabilizada, dihidrógeno oxido estabilizada”. Liquido, incoloro, transparente e indoloro. Con pH 7, su densidad 1.0 kg/L aproximadamente a 20°C, completamente soluble en agua.

Cebadores “primers”: secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar.

Centrífuga: máquina que pone en rotación una muestra para separar por fuerza centrífuga sus componentes o fases (generalmente una sólida y una líquida), en función de su densidad. Una aplicación típica consiste en acelerar el proceso de sedimentación, dividiendo el plasma y el suero en un proceso de análisis de laboratorio.

DNasa I: Enzima que es capaz de hidrolizar el ADN altamente polimerizado quebrando los enlaces fosfodiéster, preferencialmente adyacentes a un nucleótido de pirimidina. Cataliza la segmentación endonucleolítica del ADN dando lugar a los productos finales 5'-fosfodi- y oligonucleótido. La enzima tiene preferencia por el ADN de cadena doble.

dNTPs: nucleótidos fosfatados. Éstos son la materia prima del DNA. Literalmente son los "ladrillos" para construir una hebra de acido nucleico.La polimerasa toma estos dNTPs y los va organizando sobre una cadena de hexosas (desoxiribosa en el DNA), en una secuencia determinada. La amplificación mediante PCR se hace de manera exponencial. Es decir, siempre doblo la cantidad anterior de fragmentos x que desnaturo las dos hebras.

Eppendorf: tubo de microcentrífuga, pequeño contenedor cilíndrico de plástico, con un fondo cónico y una tapa unida al cuerpo del tubo para evitar su desprendimiento. Son empleados profusamente en biología molecular y bioquímica para la centrifugación, y se emplean a menudo como simples viales contenedores de sustancias químicas. Los tubos están fabricados de polipropileno, y pueden emplearse a temperaturas muy bajas (-20 °C) o con disolventes orgánicos como el cloroformo. Su tamaño oscila entre los 200 μL y los 2 mL. La capacidad más comúnmente usada es de 1,5 mL, siendo por otra parte los de 200 μl los más empleados para PCR. La desinfección de los tubos es posible (1 atm, 120 °C, 20

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minutos), pero dado su bajo costo y la dificultad de limpieza de la superficie de plástico, los tubos de microcentrífuga son usualmente desechados después de su uso.

Ketamina: es un anestésico general veterinario, fuerte, con propiedades analgésicas. Bloquea el sistema nervioso sin deprimir el sistema respiratorio ni el circulatorio. Es una arilciclohexidina, relacionada químicamente con la fenciclidina y ciclohexamina. La ketamina trabaja adhiriéndose a estos receptores principalmente el receptor PCP (PHENCYCLIDINE) y bloqueándolos.Se elimina por orina sin metabolizar un 4% y un 17% en forma hidroxilada. En los tejidos permanece parte del fármaco, lo cual puede contribuir a su acumulación cuando se da en dosis repetidas o infusión continua. La ketamina provoca una sensación de que la mente ha sido separada del cuerpo. El tacto es excepcional y supersensorial. Esto crea alucinaciones y experiencias "fuera del cuerpo" de 2 a 3 horas. El estado anestésico que produce se caracteriza por un estado de analgesia profunda, perdida de la conciencia y reflejo normal de la faringe y laringe. Durante este tiempo, podes ser incapaz de moverte. Varias dosis puede crear problemas respiratorios y fallo en el corazón. La ketamina es MUY PELIGROSA si es mezclada con alcohol u otras drogas. Una sobredosis de Ketamina te anestesiará por completo, 10 mg. por libra de peso es una dosis prácticamente suicida porque incluso puede paralizar el sistema respiratorio si se combina con alcohol o barbitúricos de cualquier tipo.

Oligo-dT: DNA sintetico compuesto por 15 nucleotidos de base timina. Es complementario a la terminación poliadelinada presente en el RNAm de organismos eucariotas. Se utiliza como primer universal para la transcripción reversa.

Pellet: en los procesos de centrifugado, se denomina "pellet" al material sedimentado.

Pureza del ARN: las lecturas A260 y 260/280 de las relaciones de transformación no son bastantes para asegurar el ARN de la pureza elevada. Usted debe tomar un espectro ULTRAVIOLETA completo. Usted puede también utilizar la relación de transformación de 260/230 para ayudar a determinar la cantidad de contaminación orgánica en su ARN. Es un número mucho más variable que la relación de transformación de 260/280, pero generalmente, las relaciones de transformación sobre 1 indican buena pureza.

RNAlater: reactivo de tejido de almacenamiento acuoso que estabiliza y protege el ARN celular, sin congelar muestras de tejido intacto. RNAlater elimina la necesidad de procesar de inmediato las muestras de tejido o para congelar las muestras en nitrógeno líquido para su posterior procesamiento. Piezas de tejido se pueden cosechar y sumergir en el RNAlater para el almacenamiento sin comprometer la calidad o la cantidad de ARN

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obtenido después del aislamiento de ARN. Las muestras se pueden almacenar congelados o sin congelar.

Simplifica la recolección de la muestra de un reactivo, inmediatamente inactiva RNasas y estabiliza el ARN en los tejidos o células

Mayor flexibilidad, sin necesidad de congelar las muestras en nitrógeno líquido.

Elimina la necesidad de congelar y moler muestras mayoría de los tejidos

Flexible tejido de almacenamiento - ARN es estable durante 1 día a 37 ° C, 1 semana a 25 ° C, 1 mes a 4 ° C o largo plazo a -20 ° C

Compatible con muchos procedimientos de aislamiento de ARN incluyendo la mayoría de kits de Ambion de aislamiento de ARN.

Solución Ringer: solución salina que contiene cloruro de sodio, potasio, calcio y magnesio. Dicha solución mantiene las muestras en las mismas condiciones que dentro del organismo, controlando el equilibrio osmótico. Este producto permite el almacenamiento de muestras a 4ºC por una semana o un mes a -20ºC.

Taq polimerasa: es un termoestable polimerasa de ADN ,lleva el nombre del termófilo bacteria Thermus aquaticus de la que fue aislado originalmente por Thomas D. Brock en 1965. Es abreviado a "Taq Pol" (o "Taq"), y se utiliza en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método de amplificación de segmentos cortos de ADN. Taq polimerasa es una enzima capaz de soportar las condiciones de desnaturalización de proteínas (alta temperatura) necesarios durante la polimerización en cadena. Sustituyó a la DNA polimerasa de E. coli originalmente utilizado en la PCR. La temperatura óptima de Taq de la actividad es 75-80 º C, con una vida media de 9 minutos a 97,5 ° C, y se puede replicar de 1000 pares de bases cadena de ADN en menos de 10 segundos a 72 ° C. Carece de actividad correctora , y tiene una tasa de error medido en aproximadamente 1 de cada 9.000 nucleótidos. Algunos ADN polimerasas termoestables han sido aislados de otras bacterias y arqueas termófilas, tales como Pfu ADN polimerasa , que posee una actividad de lectura de pruebas, y se están utilizando en lugar de (o en combinación con) Taq de amplificación de alta fidelidad.

Termociclador: también conocido como máquina de PCR o reciclador térmico de PCR es un aparato usado en Biología Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reacción en cadena de la polimerasa de amplificación de ADN o para reacciones de secuencia con el método de Sanger. El modelo más común consiste en un bloque de resistencia eléctrica que distribuye a través de una placa una temperatura

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homogénea durante tiempos que pueden ser programables. Dado que las reacciones incubadas en el aparato son en soluciones acuosas, suelen incluir una placa de tapa calentada constantemente a 103 °C para evitar la condensación de agua en las tapas de los tubos donde ocurre la reacción, y así evitar que los solutos se concentren, lo que modificaría las condiciones óptimas para la enzima polimerizante y la termodinámica del apareamiento de los iniciadores.

Xilacina: forma parte del grupo de los agentes agonistas- 2, y es utilizado para lograr inmovilización farmacológica de diferentes animales. Es frecuente observar tras su aplicación, disminución de la frecuencia cardíaca, bloqueos atrios ventriculares de primero y segundo grado, hipertensión inicial seguida de hipotensión más duradera. Es un derivado de las tiacinas que al ser formulado como clorhidrato toma forma de cristales incoloros, de sabor picante. Se disuelve ráptidamente en agua y metanol. Existen diferentes grados de depresión que puede alcanzar el sistema nervioso central, los cuales pueden describirse como:

Analgesia: Es una disminución de la capacidad de captación del dolor. Sedación: Comprende una depresión central moderada, donde el paciente se halla

despierto, se disminuye la hiperexitabilidad y hay tendencia al sueño y embotamiento de la conciencia.

Hipnosis: Es similar al sueño normal profundo. Hay una moderada depresión del SNC.

Anestesia: Es una depresión central más profunda, con ausencia de la motilidad, de la actividad refleja y de la sensación dolorosa.

Coma: Pérdida de todos los reflejos, con persistencia sólo de la actividad autonómica.

Muerte: Cese de todas las funciones vitales.

La droga se puede administrar por vías diversas. Su absorción es relativamente rápida, de acuerdo a los resultados clínicos, aunque, como se ha dicho, es algo irregular. La eliminación se lleva a cabo básicamente por orina. Luego de su administración por vía intra muscular, el comienzo de su efecto puede visualizarse entre los primeros 1 a 15 minutos, pero su absorción es muy variable.

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Anexo

Recomendaciones para la extracción del RNA

Se recomienda el uso de muestras frescas para la obtención del RNA. Para la extracción de RNA a partir de tejidos, congelar el tejido en nitrógeno líquido inmediatamente después de su obtención (en nuestro caso lo conservamos en RNAlater). El tejido así congelado puede mantenerse a -80°C hasta la extracción del RNA. Para la extracción, trocear y pesar el tejido sin descongelar, mantenerlo en hielo seco hasta su homogenización en la solución de lisis. Otra solución para acumular tejido hasta el momento de la extracción, es utilizar una solución estabilizadora de RNA como el RNAlater de AMBION (Cat #AM7020, AM7024) o QIAGEN (Cat # 76104, 76106). Seguir las instrucciones del fabricante.

Para el análisis de expresión génica es imprescindible el procesamiento de las muestras control o referencia y experimental en paralelo y siguiendo exactamente el mismo procedimiento.

Recomendaciones básicas para el manejo de RNA

El RNA es un material extremadamente sensible y deben tomarse las máximas precauciones para evitar la contaminación con ribonucleasas (RNasas) y su degradación. Las RNasas son unas enzimas muy estables y activas que hidrolizan el RNA y no requieren de cofactores para su función. Las RNasas son muy difíciles de inactivar, soportan el autoclavado y son insensibles a los métodos estándar para la inactivación de proteínas. Es importante trabajar en un ambiente libre de RNasas, y debe tratarse el material para su eliminación. Las siguientes recomendaciones ayudan a prevenir la contaminación de RNasas:

Utilizar guantes durante todo el proceso de manejo de muestras, material fungible y de vidrio, y extracción de RNA. Las RNasas están presentes en grandes cantidades en la piel y es la mayor vía de contaminación de RNasas. Durante la extracción intentar trabajar lo más rápido posible para minimizar la exposición con RNasas y evitar la degradación del RNA.

Opcional: Tratar superficies, extremos de las pipetas y gradillas con soluciónes descontaminantes de RNasas. Utilizar pipetas específicas para el manejo de RNA.

Mantener la muestra de RNA siempre en hielo o bloque frío, al menos que esté disuelta en un disolvente orgánico.

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Utilizar material plástico desechable (tubos, puntas de pipetas) estéril y certificado libre de RNasas.

El material de vidrio debe incubarse en un horno a 240°C toda la noche. Los tapones de plástico, y otro tipo de material de plástico no desechable como cubetas de electroforesis, probetas, vasos de precipitados, debe lavarse con 0.1M NaOH, 1mM EDTA durante 5 minutos, y enjuagarse con agua MilliQ libre de RNasa. Alternativamente, material de plástico resistente al cloroformo, puede enjuagarse con cloroformo.

El agua y las soluciones deben tratarse con DEPC (dietil pirocarbonato) 0,1 % (v/v en agua destilada).

Precaución: El DEPC es tóxico y posible carcinógeno. Utilizar guantes y realizar todo el proceso en una campana de extracción hasta su inactivación por autoclavado.

Se recomienda resuspender el RNA en agua ultrapura tratada con DEPC o libre de RNasas.

No hablar cuando se estén pipeteando soluciones con RNA o manipulando material o reactivos que se vayan a emplear en su preparación. En la saliva hay RNasas.

Emplear tubos eppendorf y puntas de micropipeta que no se hayan tocado con las manos desnudas y que hayan sido convenientemente tratadas para eliminar restos de RNAsas.

Usar material de vidrio tratado con soluciones inactivadoras de RNAsas y manipularlo a partir de ese momento siempre con guantes y cuidando de no contaminarlo con RNAsas.

Requisitos de Calidad de las muestras

La calidad del RNA se mide en base a tres parámetros básicos:

Pureza: La contaminación de la muestras con impurezas orgánicas e inorgánicas (p.ej. fenol, cloroformo), y proteínas afecta de forma significativa la sensibilidad y especificad del resultado. Para determinar el grado de pureza del RNA se determina la relación de absorbancia A260/280 y A260/230, que debe ser = 1,8.

Integridad: La absorbancia a 260 nm y la relación A260/280 sólo nos da una indicación de la cantidad de RNA y del grado de contaminación de impurezas orgánicas e inorgánicas, pero no nos dice nada sobre el nivel de degradación de RNA. Existen dos métodos para determinar el grado de degradación del RNA:

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o Relación entre las bandas ribosomales 28S y 18S que se observan en un gel de agarosa como bandas discretas y cuya relación 28S/18S en un RNA íntegro es cercano a dos. Se recomienda una relación 28S/18S = 1,2.

o RIN: RNA Integrity Number, es un número que aplica el algoritmo del software del Bioanalizador 2100 Bioanalyzer de Agilent Technologies y que es un indicador del grado de degradación de la muestra de RNA. Un RNA intacto tiene un RIN 9-10, mientras que un RNA degradado tendría un RIN <6. Para las aplicaciones de PCR a tiempo Real y microarrays se recomienda un RIN mínimo de 7, aunque depende del tipo de muestra.

Contaminación de DNA genómico: la contaminación de DNA puede afectar de forma significativa a la sensibilidad y especificidad del resultado de expresión génica. El mejor método para evitar la contaminación de DNA genómico es el utilizar un método de extracción que combine al extracción orgánica en fenol (Trizol) y la posterior purificación. Existen kits de purificación en columna que incluyen un pretratamiento en columna con DNasa y posterior elución del RNA. En aquellos casos en los que la muestra contenta un grado de contaminación inaceptable debe tratarse la muestra con DNasa (QIAGEN o AMBION) y repurificar en columna tras el tratamiento. Es muy importante eliminar totalmente la DNasa ya que inactiva la reacción de retrotranscripción requerida en la síntesis de cDNA o cRNA.

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Bibliografía

CURTIS, Helena. (2008) Biología 7° edición en español. Editorial Médica Panamericana.

Wikipedia “la enciclopedia libre”,

http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa#PCR_con_transcriptasa_inversa_.28RT-PCR.29

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Ambion “Applied Biosystems”, http://www.ambion.com/techlib/resources/RNAlater/

Invitrogen, http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Product-Brand/Trizol.html