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Selecção de transconjugantes
Objectivos
Identificação das bactérias a utilizar
Selecção dos transconjugantes
Identificação das bactérias receptora e dadora a utilizar
avaliação da capacidade que um microrganismo tem de proliferar/crescer in vitro e na presença de vários fármacos.
Método de Difusão (de Kirby-Bauer [1] )
Epsilon Test
A partir dos testes de susceptibilidade foi possível concluir que as bactérias a utilizar na conjugação seriam a 999 e a K802N, respectivamente espécie dadora e espécie receptora.
Estirpe 999 – fermentadora da lactose
resistente à amoxicilina (não formou halo de inibição)
A estirpe K802 N – não fermentadora da lactose
resistente ao ácido nalidixico (não formou halo de
inibição).
Uma bactéria receptora é a que possui o DNA cromossómico que recebe o plasmídeo da dadora.
O conhecimento das características das estirpes é fundamental para que
estas possam ser correctamente escolhidas no laboratório para ensaios de
conjugação.
Encontro entre a espécie dadora e a receptora
Estirpe 999 (fermentadora da lactose e resistente à amoxicilina) (100µL)
K802N (não fermentadora da lactose e resistente ao ácido nalidíxico) (100µL)
Selecção de transconjugantes
Transconjugantes - transconjugação entre bactérias receptora
e dadora. Têm as características cromossómicas conferidas pela
bactéria receptora, mas com DNA plasmídico da dadora, que
confere resistência à amoxicilina. Os transconjugantes são,
assim:
Não fermentadores da lactose (Lac -)
Resistentes aos dois antibióticos (amoxicilina e ácido nalídixico)
A conjugação conduz ao aparecimento de uma mistura das 3 populações bacterianas: bactérias dadoras, receptoras e transconjugantes;
•Verifica-se a presença das bactérias transconjugantes, inoculando-as em meio sólido com os 2 antibióticos;
•Realiza-se o plaqueamento num meio selectivo, contendo os 2 antibióticos aos quais queremos testar a resistência;
O meio de MacConkey é um meio de selecção que promove o crescimento dos transconjugantes, pois neste caso apresenta amoxicilina e ácido nalidíxico.
Placa de controlo
O meio de seleção tem de ser controlado quanto à sua eficácia, por isso é utilizado um lote de placas em que uma delas é de controlo/testemunho, placa esta sem antibiótico.
O objectivo é verificar se o lote utilizado pode realmente ser usado para a selecção em causa.