První publikace popisující přítomnostsekundárních metabolitů v lišejnících seobjevily v druhé polovině 19. stol. Rozvojchemotaxonomie nastal o 100 let později,v 60. letech minulého stol., v souvislostis vývojem a širším využitím chromatogra -fických metod. V té době šlo v podstatěo převrat v taxonomii lišejníků srovnatel-ný s nástupem molekulárních metod v po -sledních 20 letech. S pomocí chromatogra-fie se mohly nově rozlišovat druhy, kterékvůli nedostatku anatomických a morfo-logických znaků nebylo do té doby mož-né blíže určovat. Typickým příkladem jeběžný a široce rozšířený rod prášenka (Le -praria), který netvoří plodnice a vyskytujese pouze v podobě sterilních šedavýchpovlaků. Možnost detekce sekundárníchmetabolitů však napomohla rozvoji taxono-mie i mnoha známých druhů makrolišej-

níků – zvláště z rodů provazovka (Usnea),vousatec (Bryoria) a dutohlávka (Cladonia).

Sekundární metabolity se v lišejnícíchvyskytují v různých podobách a v různýchčástech stélky. Většina z nich obaluje po -vrch houbových vláken. Můžeme je všaknalézt také jako granulky, krystaly, kapén-ky nebo pigmenty v generativních a vzác-něji ve vegetativních částech stélky. Jejichpřítomnost někdy bývá patrná na prvnípohled, protože mohou určovat barvu lišej -níku. Např. žlutozelené zabarvení prova -zovek způsobuje kyselina usnová (obr. 2),šedou barvu terčovníků (Physcia) atranorin,žlutooranžovou stélku terčníku zedního(Xanthoria parietina) parietin, nebo nápad-né červené zbarvení plodnic některýchdutohlávek kyselina rodokladonová (obr. 1).Lišejníkové látky také zapřičiňují výraz-ně hořkou chuť většiny druhů. U děratky

hořké (Pertusaria amara, obr. 3) můžemepodle svíravé chuti zjistit přítomnost kyse-liny pikrolichenové přímo v terénu, čímždruh celkem spolehlivě odlišíme od velmipodobné děratky bělavé (P. albescens).Kyselina alektorialová obsažená např. u ně -kterých vousatců zase způsobuje růžovézabarvení herbářových položek po několi-ka letech skladování. Také výskyt některýchterpenoidů (zvláště běžně rozšířenéhozeorinu) se projevuje vytvořením drobnýchjehlicovitých krystalů na povrchu stélek

2

Jiří Malíček

Sekundární metabolity lišejníkůa jejich význam pro taxonomii

Všeobecně známou schopností živých organismů je produkce primárních meta-bolitů, mezi něž patří např. aminokyseliny, sacharidy a fotosyntetické pigmenty.Produkují ale také řadu sekundárních metabolitů, čili látek, které zpravidlanejsou pro život jedince nezbytné (alespoň v krátkodobém měřítku). K těmtoorganickým sloučeninám patří mimo jiné alkaloidy, glykozidy a mykotoxiny.Jednou ze skupin organismů, kde se můžeme setkat s množstvím různých sekun-dárních metabolitů, jsou lišejníky. V současné době se počet těchto látek s po -psanou strukturou blíží číslu 800. Skutečný počet může však být výrazně vyš-ší. Naprostá většina z nich je navíc specifická pouze pro lišejníky. Výjimečnostlišejníkových látek tkví v jejich obrovském taxonomickém významu a tudížv rutinním využívání metod jejich detekce. To je velký rozdíl oproti cévnatýmrostlinám, mechorostům, nelichenizovaným houbám nebo řasám, kde se pří-tomnosti sekundárních metabolitů využívá pro určování taxonů jen ojediněleu vybraných skupin.

živa 6/2012276ziva.avcr.cz

1 Nápadně červenou barvu plodnicněkterých dutohlávek (Cladonia) způsobuje kyselina rodokladonová. Asinejběžnějším červenoplodým druhem jedutohlávka vyzáblá (C. macilenta).2 Žlutozelenou barvu provazovek(Usnea) způsobuje přítomnost kyselinyusnové. U této látky bylo zjištěno její protirakovinné působení (např. Bačkorováa kol. 2011 a 2012).3 Některé lišejníky můžeme poznatdokonce podle chuti. Díky přítomnostikyseliny pikrolichenové mají sorály(místa, kde vznikají vegetativní rozmno-žovací částice zvané sorédie) děratkyhořké (Pertusaria amara) palčivě hořkou chuť. Foto J. P. Halda4 Ke zjištění přítomnosti kyselinyfumarprotocetrarové se využívá parafenylendiamin. V případě kladnéreakce se vzorek zbarvuje oranžově, až červeně jako u zde použité misničkykorové (Lecanora pulicaris).5 Kyselina norstiktová vytváří v hydro-xidu draselném nezaměnitelné červenékrystalky o délce ca 5–10 µm. Společněs atranorinem se využívá jako standardv tenkovrstevné chromatografii (TLC).6 Krystaly kyseliny vulpinové vzniklépři mikrokrystalizačních testech. Tato látka způsobuje výrazně žluté zabarvení některých lišejníků a je jedovatá. Foto W. Obermayer7 Ve stélce větvičníku žlutého (Lethariavulpina) se kyselina vulpinová vyskytujeve velkém množství. Proto se tento lišej-ník dříve používal k trávení vlků. Rostehojněji např. v Alpách, v České republicebyl před časem nalezen na Šumavě (vizŽiva 2000, 6: 249–250). Foto F. Bouda

1

u několik let starých herbářových položek.K detekci lišejníkových látek slouží víceči méně sofistikované metody, které bymohly být popsány v nejedné knize. V ná -sledujících kapitolách stručně představímjen několik z nich, které lichenologovérutinně využívají.

� Stélkové reakce a UV světloStélkové (bodové) reakce lišejníků s che-mikáliemi jsou jednoduchým způsobemzjištění vybraných látek, a proto se velmičasto využívají při určování druhů. V pra-covně lichenologa nesmí chybět roztokhydroxidu draselného, chlorové vápno(resp. jiný dezinfekční přípravek obsahu-jící chlór, např. Savo) a parafenylendiamin(obr. 4 a 5). Nepatrné množství těchto rea-gencií se nanese na stélku lišejníku, kdev případě přítomnosti hledané látky do -chází k barevným změnám – nejčastěji načervenou, žlutou, oranžovou a růžovou(viz také obr. na 2. str. obálky). Nevýhodoutěchto reakcí je, že bývají nespecifické(specificky reaguje jen určitý typ slouče-nin), a tudíž často nelze jednoznačně určitkonkrétní látku obsaženou ve stélce. Tatometoda má ještě další slabinu, a sice že

v případě nízkých koncentrací sekundár-ních metabolitů v lišejníku není bodováreakce zpravidla čitelná. Pro účinnější vy -užití metody můžeme provádět stanovenína mikroskopických řezech. Ke stélkovýmreakcím patří také aplikace Lugolova roz-toku obsahujícího jód k de tekci vybranýchskupin polysacharidů. Většinou se nanášína dřeň (střední vrstva lišejníkové stélkytvořená houbovými vlákny), která se v pří-padě kladné reakce zbarvuje modře. Vy -užití Lugolova roztoku však nachází zásad-ní uplatnění u zkoumání struktury vřecek(kde vznikají výtrusy). Některé sekundár-ní metabolity světélkují v ultrafialovémsvětle, proto je nezbytným vybavením kva-litní UV lampa. Pokud je látka obsažena,svítí lišejník pod UV lampou bíle až mod-ře (tím je prokázána přítomnost depsidůa depsidonů), popř. v odstínech žluté,oranžové až červené (tyto barvy značí pří-tomnost xantonů). Ultrafialové záření jevelmi užitečným nástrojem např. při určo-vání dutohlávek.

� Mikrokrystalizační testyTato metoda se v současné době používáspíše ojediněle, protože byla zastíněna

chromatografií (viz dále). Ta je v porovná -ní s mikro krystalizačními testy citlivějšía spolehlivější, avšak také časově i finanč-ně náročnější. Výhodou mikrokrystalizač-ních testů je naopak možnost rozlišeníněkolika látek, které se tenkovrstevnouchromatografií neoddělí. Postup je takový,že nejprve naneseme kapku rozpouštědla(nejčastěji acetonu) na část stélky umístě-nou na podložním sklíčku. Rozpouštědloz lišejníku vyextrahuje sekundární meta-bolity. V dalším kroku přidáme k získané -mu extraktu vybrané mikrokrystalizačníčinidlo, jehož základ tvoří nejčastěji glyce -rol, etanol, voda a kyselina octová. Sklíčkozahřejeme a necháme zchladnout. Postup-ně se vytvoří krystaly specifických tvarůa velikostí, které jsou charakteristické projednotlivé látky. Jejich vzhled a vlastnostipak sledujeme pod mikroskopem (obr. 6).

� ChromatografiePři zkoumání sekundárních metabolitůvyužíváme v zásadě dva základní typychromatografie – tenkovrstevnou (TLC)a vysokoúčinnou kapalinovou (HPLC).Tenkovrstevná chromatografie je na liche-nologických pracovištích široce rozšířenáa v taxonomii představuje nezbytnou me -todu pro zjišťování lišejníkových látek.Sloučeniny vyextrahované v acetonu se na -nášejí na chromatografickou desku, kte-rou po ponoření vzlíná roztok organickýchrozpouštědel a s ním i nanesené metabo-lity. Ty se podle velikosti molekul rozmís-ťují na různých pozicích v rámci desky.Umístění je charakteristické a zásadní prourčování jednotlivých látek. Krátkým po -nořením desky do vody je dále možné zji-stit přítomnost mastných kyselin, kteréjsou jinak bezbarvé. Po aplikaci kyselinysírové a zahřátí po dobu několika minut seorganické látky zbarvují. Změna barvy tak-též slouží k identifikaci látek, stejně jakozkoumání vlastností skvrn (vzniklých popředchozím zahřívání) pod UV světlem.TLC je velmi efektivní metoda a její po -užívání není složité ani příliš finančněnáročné.

Sofistikovanější metodou je vysokoúčin -ná kapalinová chromatografie (HPLC). K je -jím přednostem patří možnost stanoveníkoncentrace metabolitů, detekce látek za -stoupených pouze ve stopových množ-stvích a rozlišení příbuzných látek, kterév TLC splývají v jediné skvrně. Kapalino-vé chromatografy také zároveň měří ab -sorpční maxima detekovaných sloučenin,což výrazně napomáhá k následné identi-fikaci (obr. 9). HPLC je zvláště užitečnáu skupin lišejníků, které obsahují barevnépigmenty rozpustné v organických rozpou -štědlech, jako jsou antrachinony a xanto-ny. Vysokoúčinná kapalinová chromato-grafie má ve výzkumu lišejníkových látekdo budoucna značný potenciál. Dokážetotiž zjistit mnoho sloučenin zastoupenýchpouze v nepatrných koncentracích, z nichžvelké procento není prozatím známo. Cenazařízení však přesahuje rozpočet průměr-ného pracoviště, tudíž nebývá standard-ním vybavením lichenologické laboratoře.

Všeobecnou komplikací chromatogra-fických metod jsou potíže s identifikacíjednotlivých metabolitů, která vyžaduječasto mnohaletou zkušenost badatele a hoj -né využívání srovnávacího materiálu.

živa 6/2012 277 ziva.avcr.cz

76

5

3 4

� Pigmenty a krystalyČást lišejníkových pigmentů není rozpust-ná v organických rozpouštědlech (např. vezmíněném acetonu), a tudíž je nelze iden-tifikovat pomocí chromatografie nebo mi -krokrystalizačních testů. Z tohoto důvoduneznáme ani jejich strukturní vzorce. Ob -vykle se vyskytují v generativních částechstélky – v apoteciích a periteciích. Majírůzné barvy, nejčastěji zelenou, hnědou,červenou a modrou. Pro identifikaci se sle-duje chování (barevná reakce) v zásaditéma kyselém prostředí po přidání hydro xidudraselného, resp. kyseliny chlorovodíko-vé. Důležitá je také reakce s kyselinoudusičnou, která např. mění barvu některýchpigmentů na červenou. V běžné licheno-logické praxi jsou pigmenty velmi důleži-tým vodítkem při mikroskopickém určo-vání řady taxonů.

Mezi sekundární metabolity lišejníků seřadí i šťavelan vápenatý. O produkci tétolátky houbovými organismy se dočtemevíce v Živě – v článku O. Koukola (2012,1: 14–16). Šťavelan se u lišejníků vysky-tuje v apoteciích, ale také na povrchu stél-ky v podobě ojínění. U několika rodů hra-je velikost a rozmístění krystalů této látkypodstatnou roli pro určování. Ke zkoumá-ní krystalů šťavelanu se využívá polarizo-vané světlo, které zviditelní za normálníchpodmínek těžko patrné krystalické kom-ponenty a umožní jejich odlišení od jinýchpodobných struktur.

Význam sekundárních metabolitůSekundární metabolity lišejníků a jejichfunkce v organismu jsou doposud velicemálo probádanou oblastí. Lišejníkové lát-ky skýtají potenciál nových objevů v bu -doucnu, např. v medicíně. Jejich využitíčlověkem bylo v Živě již popsáno (2003, 6:253–255; 2004, 1: 17–19). Pro připomenu-tí uveďme alespoň několik nejvýznamněj-ších způsobů uplatnění nebo působení

lišejníkových metabolitů: barvení látek,výroba lakmusu, léčivé účinky, antibiotic-ké a protirakovinné působení, výroba par-fémů atd. V samotném lišejníku zastávajítyto látky různé úlohy, avšak u většinyz nich funkci neznáme. Uplatňují se v kom-petici s jinými organismy nebo pomáhajípřežít v extrémních podmínkách – mohoupůsobit jako inhibitory růstu rostlin a enzy-mové aktivity, chrání lišejník před býlo -žravci, symbiotickou řasu chrání přednadměrným UV zářením, mají vliv na pro-pustnost membrán fotobiontů nebo vzni-kají jako tzv. stresové metabolity.

Ne všechny druhy lišejníků obsahujísekundární metabolity – chybějí např.u většiny cyanolišejníků (obsahují jako fo -tobionta sinici; obr. 11) a také u pyreno-karpních lišejníků (typem plodnice je pe -ritecium). Zde se při determinaci musímespoléhat na anatomické, morfologickéa popřípadě molekulární znaky.

S lišejníkovými látkami také souvisí je -jich fytogeografická variabilita a přítom-nost tzv. chemotypů. Označení chemotypse používá pro případy, kdy se jeden druhvyskytuje s různými sekundárními meta-bolity. U některých taxonů je popsánazměna v přítomnosti určitých látek v rám-ci jejich areálu, např. evropské populacehouboplodky krvavějící (Mycoblastus san-guinarius, obr. 10) obsahují kyselinu kapera -tovou, zatímco americké a asijské kyseli-nu rangiformovou. Často je tudíž zajímavéstudovat, zda chemotypy mají nějaký taxo-nomický význam a neodlišují jinak mor-fologicky totožné druhy. V mnoha přípa-dech ale jde pouze o přítomnost chemickyblízce příbuzných látek, kde o výslednémmetabolitu mohou rozhodovat např. pod-mínky prostředí či stabilita molekul dané-ho produktu (ačkoli někteří lichenologovése spíše přiklánějí ke genetickým příčinám).

ziva.avcr.cz 278 živa 6/2012

1110 12

98

8 Příklad výsledné chromatografickédesky, kde byla analyzována skupina příbuzných zástupců rodu misnička. Právě v tomto případě se setkávámes doposud neznámými látkami (v obr. označeny jménem druhu), jež jsou charakteristické pro jednotlivédruhy. K nejrozšířenějším sekundárním metabolitům u lišejníků patří atranorin,který se v tenkovrstevné chromatografiipoužívá jako standard.9 Výsledný chromatogram z vysoko -účinné kapalinové chromatografie(HPLC). Na ose X je zobrazen tzv. retenční čas, který pomáhá k identifikaci sloučeniny, na ose Y jekoncentrace látek. Jednotlivé vrcholypředstavují různé antrachinony obsaženév krásnici zubaté (Caloplaca crenularia). Orig. U. Søchting10 Řez plodnicí houboplodky krvavějící (Mycoblastus sanguinarius).Pro horní část výtrusorodé vrstvy (epihymenium) je charakteristický tmavězelený pigment (Cinereorufa-green), ve spodní části plodnice (hypotecium) se koncentruje rodokladonová kyselina.Tuto látku nalezneme i ve stélce, protojsou narušená místa stélky sytě červená.11 Většina cyanolišejníků (jako foto -bionta obsahují sinici) netvoří žádnésekundární metabolity. Na obrázku typický zástupce této skupiny huspeníktuhý (Collema tenax). Foto F. Bouda12 Vysokohorský lišejník šídloveckůstkovitý (Thamnolia vermicularis) se ve střední Evropě vyskytuje ve dvouchemotypech. Jeden obsahuje kyselinybaeomycesovou a squamatovou (vlevo)a svítí pod UV lampou bělavě, zatímcodruhý chemotyp s kyselinou thamnolo-vou (vpravo) na UV záření nereaguje.Někdy bývají oba chemotypy považoványza samostatné druhy. Snímky J. Malíčka,pokud není uvedeno jinak

Chromatogram antrachinonů krásnice zubaté (Caloplaca crenularia)

[minuty]

abso

rpčn

í jed

notk

y [m

AU

]

Lecanora allophana, 1

L. allophana, 2

L. allophana, 3

atranorin

kyselinanorstiktová

další neznámé terpenoidy

L. glabrata, 1

L. grantii, 1

L. grantii, 2

L. glabrata, 2

terpenoidy z kůry dřevin

gangaleoidin+ norgangaleoidin

L. grantii, 1

4-0-dechlorgangaleoidin

kyselina konnorstiktová