Section 1-3

고정Fixation

정의• 고정은 단백질을 안정화시켜 그 후 발생할 수 있는

변화에 저항할 수 있도록 조직을 변화시킨다 . 이 변화는 화학적 ( 고정액 ) 또는 물리적 방법 ( 열 , 건조 , 동결 ) 으로 이루어지며 이 과정을 변성(denaturation) 이라 한다 .

• 절취된 조직을 물리 , 화학적인 방법을 이용하여 조직의 변화와 , 증명하려는 구성성분의 유실이나 존재 위치가 변형되는 것을 방지하여 표본 제작에 적합한 상태가 되도록 인위적으로 변형시키는 과정을 고정 (fixation)

고정 (Fixation)

고정의 5 대 목적ⅰ) 보존효과 (preservation : autolysis ( 자가융해 ) 의 방지 -

가수분해 효소를 불활성화 )ⅱ) 치사작용 (killing : 살해 , 세포의 기능을 정지 ), ⅲ) 침투작용 (penetration : 조직 내부로의 고정액 확산 ), ⅳ) 경화작용 (hardening : 유동성인 원형질의 반고체화 , sol

→ gel) ⅴ) 매염작용 (mordanting action : 염색단계에서 염색을 잘

되게 하는 작용 ) 이다 .

고정 (Fixation)

응고형 고정제• 세포내 단백질 분자의 기 (group) 가 서로 결합하고

엉겨 붙어 단백질 응고 (coagulation) 가 일어나는 고정액으로서 조직내 가는 섬유상의 단백질을 그물 형태로 변화시키고 , 박절하기에 적당한 경도를 주며 , paraffin 이 조직내로 쉽게 침투

고정제의 종류

응고형 고정제의 종류• Mercuric chloride ( 승홍 , 염화 제 2 수

은 ,HgCl2)• 유독성 및 금속 부식성의 백색 결정체• 장점 : 매우 강한 단백질의 고정과

매염작용으로 인한 염색성의 증가 • 단점 : 세포를 심하게 위축시키고 , 침투가

느리지만 오랜 시간 고정 시 조직이 상당히 경화되는 작용이 있어 비교적 작은 조직편의 고정에 사용• 승홍이 포함된 복합고정액은 Zenker’s,

Helly, Maximow, Heidenhain susa, Schaudinn solution 등

고정제의 종류

응고형 고정제의 종류• Mercuric chloride ( 승홍 , 염화 제 2 수

은 ,HgCl2)• 승홍으로 고정한 조직표본은 수은성의 침전물 즉

금속성 수은 또는 감홍 (HgCl) 으로 된 결정상 작은 흑색과립이 나타나는데 이는 염색 전에 Lugol's iodine 과 5% sodium thiosulfate 과정을 거쳐 제거

고정제의 종류

Mercuric pigment

응고형 고정제의 종류• Picric acid ( 피크린산 )

• 고정제와 염색에 모두 사용되는 유일한 물질• Nucleoprotein 을 매우 강하게 응고시키지만

DNA 는 가수분해시키는 강한 산성물질• DNA and RNA 를 염색할 때는 picric acid

가 첨가된 고정액은 피하라 .• 조직의 침투가 느리며 , 세포를 심하게

위축시키기 때문에 단독 고정액으로 사용하지 않고 보통 다른 고정제 (formalin, acetic acid, mercuric chloride 등 ) 와 혼합하여 사용

고정제의 종류

응고형 고정제의 종류• Picric acid ( 피크린산 )

• 피그린산이 포함된 고정액은 Boϋin, Rossmann, Gendre, Duboscque-Brazil solution 등• 고정된 조직은 황색을 띠어 염색을 방해 →

lithium carbonate 를 70% alcohol 에 포화시킨 용액으로 처리

고정제의 종류

응고형 고정제의 종류• Chromium trioxide ( 무수크롬산 , CrO3)

• 적갈색의 결정물로 강한 단백질 응고작용• 조직에 침투되는 성질이 느리고 , 고정 후

수세를 8~12 시간 충분히 해야 제거• 수세가 불충분하여 조직내에 CrO3 가 남게 되

면 , chromium tetroxide 가 alcohol 과 반응하여 녹색의 불용성인 chromium oxide 로 변화되어 조직과정에 영향

고정제의 종류

응고형 고정제의 종류• Ethanol (ethyl alcohol)

• water-soluble 조직의 구성요소 (glycogen, urate crystal) 의 보존에 이용• fat 을 용해시키며 , 조직을 overhardness

와 수축• 고정기전은 조직 내 유리수 또는 결합수의

분자가 ethanol 에 의해 치환되어 조직이 탈수• 단백질이 응고되고 조직의 침투가 빠르지만

alcohol 의 농도에 비례하여 조직의 경화 및 위축이 심하게 발생 • Alcohol 에 고정하면 고정과 동시에 탈수되기

때문에 탈수과정이 필요없다 .

고정제의 종류

응고형 고정제의 종류• Aceton (CH3COCH3)

• enzyme 특히 효소 (acid and alkaline phosphatase) 를 조직학적으로 증명할 때 사용• 고정은 냉장온도 (cold aceton (0~4℃))

에서 빨리 고정하여야 하며 동시에 탈수도 이루어지므로 총 고정과 조직처리 시간은 많이 감소• 매우 빠른 고정 작용을 보이나 심하게

shrinkage, distortion, overhardening에 주의

고정제의 종류

비응고형 고정제 ( 가교형 고정제 )• 유리된 단백구조에 그 분자 내 결합을 나타낸 기가

표면에 표출하여 , 그것들의 기와 고정액 사이에 화학반응이 일어나 거대한 망상분자 덩어리가 되어 단백질을 변성시켜 고정시키는 것으로 , 단백질이 가수분해되어 peptide 결합이 분해되어 고정

• 가는 그물형태의 조직단백질 구조에 변화가 적어 세포의 미세구조 관찰에 적합

고정제의 종류

비응고형 고정제의 종류• Formalin (formaldehyde, HCHO)

• 100% formalin 은 무색의 formaldehyde gas 37~40% 가 물에 녹아있는 상태 (10% formalin or 3.7% to 4% formaldehyde)• 고정반응의 주요부위는

protein chains 에 연결되어 methylene bridges 를 형성한 amino acids 의 side chains 에 있는 amino group

고정제의 종류

비응고형 고정제의 종류• Formalin (formaldehyde, HCHO)

• Lipids 는 formaldehyde 에 의해 보존되며 , 탄수화물을 고정하지는 못하나 조직에 glycogen( 당원 ) 이 많이 존재할 때 proteins 을 안정화하고 (stabilizes) 고정• 빛에 의해서 formaldehyde 로부터 포름산

(formic acid) 이 발생할 수 있어서 미세구조의 보존 상태가 좋지 않기 때문에 전자현미경검사에는 부적당• 공기중의 산소 (O2) 에 의해 formic acid 로

산화되므로 이를 방지하기 위해서는 산화방지제를 첨가

고정제의 종류

비응고형 고정제의 종류• Formalin (formaldehyde, HCHO)

• 포름산 (HCOOH) 은 혈액이 풍부한 조직 내에 포함된 적혈구가 용혈되어 나온 혈색소(hemoglobin) 와 결합하여 갈색의 산헤마틴(acid hematin) 이란 과립 (artifact) 을 생성하는데 이를 포르말린 색소 (formalin pigment) 라 한다 .

고정제의 종류

비응고형 고정제의 종류• Formalin (formaldehyde, HCHO)

• 산성화된 포르말린의 산화방지제로 lithium carbonate( 탄산리튬 ), sodium carbonate ( 탄산나트륨 ), calcium carbonate, magnesium carbonate 등이 있으나 근원적으로 막기 위해서는 10% 인산완충액 (neutral buffered formalin:NBF) 을 제조하여 사용• 살균력이 있어 방부제로도 이용되며 값이 싸고

조직 내 침투력이 강하며 고정이 양호하여 조직병리 분야에서 가장 널리 사용하는 고정액• 조직침투력은 실온에서 1 시간에 약 1mm

정도이며 , 가온 및 진탕 시는 고정이 촉진

고정제의 종류

비응고형 고정제의 종류• Potassium dichromate ( 중크롬산칼륨 )

• 크롬친화성조직 , 골지체 , 유사분열상 , 적혈구 등의 보존에 우수• 단점 : 조직의 침투가 느리고 멜라닌 색소가

표백되고 , glycogen 이 잘 보존되지 않아 단독으로는 거의 사용되지 않고 복합고정액의 한 성분으로 첨가• 중크롬산칼륨이 포함된 고정액으로는 Müller,

Regaud, Orth solution

고정제의 종류

비응고형 고정제의 종류• Acetic acid(CH3COOH)

• 주요 작용은 nucleoprotein 의 precipitation 과 preservation 에 있다 – nuclei 을 고정하는 능력이 있으므로 많은 고정에서 첨가하여 사용• 세포구성 성분을 팽창시켜 단독으로는 사용되지

않고 , 조직을 위축시키는 성질이 있는 picric acid 나 mercuric chloride 와 혼합하여 사용• mitochondria 와 Golgi body 는 파괴

고정제의 종류

비응고형 고정제의 종류• Osmium tetroxide (OSO4)

• Lipids 의 보존에 잘 되므로 Osmium 은 paraffin processing 동안에 조직에서 지방을 유지할 수 있기 때문에 fat 의 small amounts 를 검출하는데 사용• 복합지질 , 지방 등을 잘 고정하며 이 물질에

산화되면 검은색으로 나타난다 . • 주로 세포의 미세구조 혹은 세포 포함물과 같은

매우 작은 미세구조를 관찰하는데 효과가 있어서 glutaldehyde 와 함께 전자현미경을 위한 후 고정액 (2차 고정액 , postfixative) 으로 주로 사용

고정제의 종류

비응고형 고정제의 종류• Glutaraldehyde

• molecule 의 각 끝부분에 하나의 aldehyde group 이 붙어있는 dialdehyde 인 점이 formaldehyde 와의 차이• penetrates slowly and pooly• 전자현미경을 위한 고정에 주로 이용되며 ,

그것은 다른 aldehydes 보다 미세구조의 보존에 좋기 때문• periodic acid- Schiff (PAS) stain 과 같은

Schiff reagent 를 이용하는 염색에는 glutaraldehyde-fixed 은 false-positive를 얻을 수 있기 때문에 이용하여서는 안된다 .

고정제의 종류

Formalin 계 고정액• 가장 보편적으로 사용되는 고정액이며 , 가장 중요한

작용은 단백질분자의 amino group 사이에 methylene bridge 를 형성하는 중합 작용으로 , 단백질이 gel 상태로 변한다 .

• 고정 후 6~12 시간 이내로 수세하면 이 결합은 다시 원래대로 전환

• 장점• 값이 싸며 제조하기가 쉽고 비교적 안정하며 ( 완충액의

상태 ), 대부분의 염색에 특별한 전처리 과정이 필요치 않아 가장 널리 사용된다 .

• formalin 에 고정된 조직은 동결절편의 제작이 쉬우며 , 지방이나 효소의 보존에 우수

복합 고정액

Formalin 계 고정액• 단점

• 취급 시 피부에 자주 접촉하면 피부염을 일으키고 증발된 기체는 강한 자극성 냄새가 난다 .

• 혈액이 많이 함유된 조직을 산성화된 formalin 용액에 고정하면 acid formaldehyde hematein 의 형성으로 갈색의 인공색소가 침착되며 이중굴절을 나타낸다 .

• 종류• 10% 인산염 완충 중성 formalin (NBF : Neutral

Buffered Formalin)• 10% Formol-saline 용액• Formol-alcohol 용액• Paraformaldehyde 용액

복합 고정액

Alcohol 계 고정액• Absolute ethanol 은 당원 (glycogen) 의

보존에 사용되며 , absolute methanol 은 세포도말 표본이나 날인표본에 사용

• 장점• 신속한 고정효과를 가지고 있으며 RNA 나 당원

(glycogen) 등을 30 분 ~2 시간 이내에 탈수 및 고정• 단점

• 적혈구가 용해되며 , 너무 오래 고정하면 조직이 심하게 위축된다 . 지질이 용해되므로 항산성 간균이나 수초(myelin) 의 증명에 사용할 수 없다 .

복합 고정액

Alcohol 계 고정액• 종류

• Carnoy’s solution : Absolute alcohol + Chloroform + Glacial acetic acid

⇒ 적혈구를 용해시킨다 . ⇒ 빠른 고정작용 , 당원의 보존과 핵의 보존에 좋다 . ⇒ not be prolonged beyond 4 hours

복합 고정액

Picric acid 계 고정액• 조직을 수축시키는 작용이 있기 때문에 세포를 팽창시키는 glacial acetic acid 의 첨가로 조직의 균형을 주어야 한다 .

• 장점• 당원의 증명에 좋으며 , 조직에 신속히 침투• 특히 Masson's trichrome, Mallory's

PTAH 등의 염색에 우수• 단점

• 적혈구를 용해• DNA 의 증명에 사용되는 Feulgen 반응에는 핵단백질이 가수분해되기 때문에 절대 금물

복합 고정액

Picric acid 계 고정액• 종류

• Boüin solution : Picric acid 포화 수용액 + 40% formalin + Glacial acetic acid

⇒ picric acid 는 조직을 수축시키기 때문에 조직을 팽창시키는 acetic acid 와 함께

사용 ⇒ acetic acid 로 인해 적혈구는 용해 ⇒ excellent for trichrome stain• Dubosque-Brazil (D.B) solution : 80%

ethanol + 40% Formalin + Picric acid ⇒ 신장의 침생검의 고정에 우수

복합 고정액

Mercuric chloride (HgCl2) 계 고정액• 중금속 고정제 중 가장 많이 사용• Mercuric ion 은 주로 단백질의 carboxyl group

과 결합• 장점

• 경색 또는 울혈이 발생한 조직 및 비장과 같이 혈액이 풍부한 조직의 고정에 우수

• 단점• 금속을 부식하는 성질이 있으므로 금속제 기구의 사용을

금한다 .• 조직이 심하게 위축되므로 대부분의 빙초산을 첨가• 동결절편의 제작이 어려우며 , 고정후의 조직에 흑색

침전물이 침착

복합 고정액

Mercuric chloride (HgCl2) 계 고정액• 종류

• Zenker solution• Potassium dichromate + Sodiun

sulfate + Mercuric chloride + D.W.• 사용 직전 Zenker 원액 95ml 에 빙초산

5ml 를 첨가하여 사용• 고정 후에는 반드시 mercury pigment 를

처리• acetic acid 로 인해 erythrocytes 를

lysis

복합 고정액

Mercuric chloride (HgCl2) 계 고정액• 종류

• Helly solution• Zenker 원액 + Formalin 37~40%• erythrocytes 를 잘 보존하지만 Zenker

solution 은 acetic acid 가 있어 nuclear fixative 는 더 좋다 .• 고정 후에는 반드시 mercury pigment 를

처리• Heidenhain 'Susa" solution• B-5 용액• Maximow sol, Schaudinn sol

복합 고정액

중크롬산 (dichromate) 계 고정액• 수용액내에서 Cr-O-Cr 복합체로 전환• 부신수질 (adrena medulla) 의 chromatin

granule 을 증명할 때 필히 사용• 장점

• 크롬친화성 조직 , 사립체 , 골지체 , 적혈구의 보존에 우수

• 단점• 당원의 보존이 나쁘며 , 산화작용 때문에 PAS

반응의 강도가 저하• 오래 고정하면 멜라닌 색소가 산화에 의해 표백

복합 고정액

중크롬산 (dichromate) 계 고정액• 종류

• Müller solution• Regaud solution• Orth’s solution

• potassium dichromate 를 함유하고 있는 고정액은 고정 후에 반드시 수세하여야 하고 , 고정 시간은 조절되어야 하며 , 수세 후에 wet tissue 는 70% to 80% alcohol 에 보관

복합 고정액

Osmiun 계 고정액• Osmic acid 는 주로 전자현미경 검사의 후 고정액

(post-fixative) 으로 사용• 불포화지질과 결합하여 지질이 지용제에 녹지 않게

된다 .• 장점

• 전자 현미경 검사를 위한 조직의 고정 및 지질의 고정에 우수

• 단점• 값이 비싸며 침투가 느리고 조직을 검게 착색하므로 대조염색을 하기가 어렵다 . 독성이 강하기 때문에 환기장치가 잘된 장소에서 취급

복합 고정액

Osmiun 계 고정액• 종류

• Flemming solution• 2% Osmium tetroxide + 1%

Chromium trioxide + Glacial acetic acid • 12~24 시간 고정하고 물에 수세한 다음

80% alcohol 에 보관• Champy solution• Altman solution

복합 고정액

Electron-microscopy fixative• 전고정제로서 2% glutaldehyde (pH

7.2~7.4), 후고정제로 서 1~2% Osmium tetroxide 용액

박물표본을 위한 고정액 • Kaiserling solution

• 방법은 Kaiserling Ⅰ 고정에 1~5 일간 고정하고 Ⅱ액에 1~6 시간 두어 원래의 조직의 색을 재현시킨 후 Ⅲ액으로 옮기면 영구히 마르지도 않고 변하지도 않는다 ( 본래의 색 유지 ).• 전시용 박물표본 (museum preparation) 을

제작하여 영구보존 해야 할 경우

특수 고정액

화학적 고정 • 침수고정 (immersion fixation, 담금고정 )

• 고정액에 조직을 침수시켜 단백질을 변성• 대부분의 조직은 이 방법에 의해 고정

• 관류고정 (perfusion fixation)• 고정액의 침투속도가 느린 경우 고안• 조직괴 내부도 균일하게 고정을 유도• 특수한 장기 , 뇌 , 폐 , 췌장 등은 관류고정• 자주 사용되는 관류고정액으로는 4%

glutaraldehyde 인산염 완충액• 관류 시간은 생체나 그 국소부위의 크기에 따라

다르지만 보통 5~20 분이 적당

고정의 형태