max arcsinna

Secondo ordine

Monocromatore a prisma

•La dispersione (e la banda passante) non è costante con l•Maggior risoluzione nell’UV•Non ci sono effetti di secondo ordine

1

2

2

1

sin

sin

n

n

Filtri

Passa banda

Passa alto

Normalmente si usa un filtro passa-alto in emissione per eliminare ulteriormente la luce di eccitazione diffusa.Analogamente si può usare un filtro passa-banda in eccitazione per eliminare la “stray light”

• Normalmente in quarzo (trasparente nell’UV)

• Per la fluorescenza tutte e quattro le facce trasparenti

CUVETTE

Fine intermezzo “strumentale”

Torniamo alle misure di fluorescenza

Osservabili: intensitàDipende da:

•Concentrazione di fluoroforo•Efficienza dell’assorbimento di radiazione (e)•Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica)

assorbiti fotoni

emessi fotoni

F fotoni emessi = (fotoni assorbiti)

(I0 ' I ') (I0 ' I0 '10 A ' ) (1 10 A ' )

per A '1

(1 10 A ' )A ' ln10

lCAF

Ecc.

Em.

10 A 10 A A0

ddA

(10 A )

A0

A1 A ddA

e ln(10 A )

A0

1 Ad

dAe A ln10

A0

1 A ln10e A ln10 A0

1 Aln10

1 10 A A ln10

Filtro interno

0

5

10

15

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Flu

ore

scen

ce (

a.u

.)

A

Filtro interno

Campione diluito Campione concentrato

F I(centro cella )I010 A (ecc . )

2

A(ecc. )0.03 10 0.03

2 0.97

0

10

20

30

40

50

0 0.5 1 1.5 2 2.5

MeasuredInner-filter corrected

Flu

ores

cenc

e (a

.u.)

A

Ecc. Ecc.

Filtro interno in emissione

Attenzione!

Assorbanza contro fluorescenza

Inoltre: l’assorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no•sensibilità molto maggiore all’ambiente del cromoforo (processi non radiativi)•Sensibilità alla dinamica.

Intensità: applicazioni• Misure di concentrazione

(fino a nM, ma anche singola molecola)• Ambiente ed interazioni molecolari del

fluoroforo, tramite F

lCF

300 320 340 360

Flu

ores

cenc

e in

tens

ity (

a.u.

)

Wavelength (nm)

Lipidconcentration

Partizione acqua membranaKP

Stella et al., Biophys . J. 2004 86: 936–945.

0

0.5

1

F10 1.1 M

F10 11 M

F10 30 M

0 0.001

Lipid (mM)

App

aren

t me

mb

rane

-bou

nd p

ept

ide

frac

tion

400 450 500 550 600

BSA boundFree

Flu

ore

sce

nce

(a

rbitr

ary

units

)

(nm)

Processi di associazione

pH

Altri esempi quando parleremo del quenching

Osservabili: intensità e resa quanticaL’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché dipende anche da:

•Intensità della lampada•Efficienza dei monocromatori•Banda passante utilizzata•Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore

Ossia dipende dallo strumento con cui è stata determinata

Al contrario,•l’assorbanza è una misura assoluta [A=log(I0/I)]•la resa quantica è una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]

Osservabili: resa quanticamisura diretta

• Bisogna raccogliere i fotoni emessi in tutte le direzioni

• Sfera integratrice• Materiale altamente riflettente

(es. teflon)

• Alternativa: misura calorimetrica

Osservabili: resa quanticamisure per confronto

A

FS

A

F

AF

st

st

st

stst

st

stst

F

A

A

F

A

FS

AF

S

A

FS

A

A

F

F st

stst

S dipende da lexc e lem: standard e campione devono avere spettri simili.

Osservabili: resa quanticamisure per confronto

Osservabili: resa quanticamisure per confronto

Se standard e campione sono in solventi differenti:2

st

st

stst n

n

A

A

F

F

La frazione di luce raccolta dal rivelatore dipende dagli n

qi

qo

Angolo solido in coordinate sferiche

2r

A

0

2

0

22

sin

sin

sin1

dd

ddd

drrdrr

dAd

L’intero angolo solido è 4p

2

2

2

0

0

0

0

0

2

0

0

2

0

2

2

sin2

sin2

sin

sin

o

i

o

i

o

io

i

o

i

o

i

d

d

d

d

dd

dd

qi

qo

A causa del diverso indice di rifrazione tra cuvetta ed esterno viene rivelata una frazione della luce pari a

Legge di Snell

o

i

o

i

i

o

n

n

sin

sin

2

221

ii

o

o

i

o

i

nn

n

A

FnS

A

FS 2'

2

st

st

stst n

n

A

A

F

F

Indice di rifrazione a 500 nmAria: 1Acqua: 1.337Metanolo: 1.345Etanolo: 1.365Cicloesano: 1.431

N.B.: dipendono da l!

refractiveindex.info

Per acqua-cicloesano, il fattore di correzione è(1.431/1.337)2=1.14