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SECCIÓN I - INTRODUCCIÓN

Facultad de Medicina

Genética – 1er Curso

Tema 1. TÉCNICAS BÁSICAS DE GENÉTICA MOLECULAR

Facultad de Medicina

1TEMA 1

TÉCNICAS BÁSICAS DEGENÉTICA MOLECULAR

Genética – 1er Curso

1.1 Tecnología del ADN recombinante.1.2 Enzimas de restricción.1.3 Hibridación de ácidos nucleicos. PCR. Secuenciación del ADN.

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1.1 Tecnología del ADN recombinante

Apartados

Clonación de ADN

Fago lambda ()

Vectores de clonación

Vectores de expresión

Cósmidos

Aplicaciones de la clonación de ADN

Clonación de ADNTecnología del ADN recombinante

EcoRI EcoRI

Tetr Strepr/Sulfr

EcoRIEcoRI

EcoRI EcoRI

ADN Ligasa

Diagrama esquemático delprimer experimento de

clonación por Boyer y Cohen

Tetr/Strepr

Transformarbacterias

3

Vectores de clonación

Plásmido pBR322, donde se aprecian:

Tecnología del ADN recombinante

(a) Sitios de restricción(b) Genes de resistencia a antibióticos(c) origen de replicación

Vectores de clonación

Clonación de ADN foráneo

Tecnología del ADN recombinante

mediante los extremoscohesivos del sitioPstI de pBR322.

Notar que el ADN foráneorompe el gen de resistencia

a ampicilina

Tetr/Amps

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Vectores de clonaciónTecnología del ADN recombinante

pUC18

pUC19

Estructura del plásmido pUC18/19, mostrando detallesDe los sitios de clonación multiple (Polilinkers)

Los MCSs mantienen la pauta de lectura del gen de la -galactosidasa

Vectores de expresiónTecnología del ADN recombinante

MCS

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Vectores de expresiónTecnología del ADN recombinante

GFP “reporter” en ratones adultos

lacZ “reporter” en un embrión de ratón de 11.5 días

Fago lambda ()

Bacteriófagos: virus queinfectan bacterias. Constande un genoma de ác.nucleicos dentro de una

l d

Tecnología del ADN recombinante

envoltura proteica deprotección llamada cápside.

Ciclos de infección.

Ha sido adaptado parausarlo como vector declonación.

Ventaja: el tamaño de los Ventaja: el tamaño de losfragmentos que puedenclonarse es mayor que en losplásmidos (10-20kb)

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Cósmidos

Estos vectores combinancaracterísticas de plásmidos -sitio de clonación multiple yresitencia a antibióticos- así

d f

Tecnología del ADN recombinante

como de fagos –secuencias cos,responsables del empaqueta-miento del fago en la cápside-.

Pueden clonarse 40-50kb.

YACYAC

YAC:

Tecnología del ADN recombinante

“Yeast Artificial Chromosome”

Cromosoma artificial de levadura

Pueden clonarse 300kb-1Mb.

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Aplicaciones

Importantes contribuciones a muchas áreas de investigación:

identificación de genes implicados en enfermedades

Tecnología del ADN recombinante

construcción de mapas genómicos

producción de proteínas recombinantes

creación de organismos modificados genéticamentecreación de organismos modificados genéticamente.

1.1 Tecnología del ADN recombinante (I)Objetivos

Clonaciónde ADN

Esta técnica permite aislar y copiar secuencias de ADN individuales a partir demezclas complejas permitiendo el análisis detallado y la manipulación. El ADN aclonar se recombina con un vector y se introduce en las células huésped dondese copia. El vector recombinante se purifica de cultivos de células huésped y elADN clonado puede recuperarse para su análisis.

Son moléculas de ADN circular pequeñas encontradas en bacterias y que seusan como vectores de clonación. Los plásmidos se purifican fácilmente yconfieren resistencia a antibióticos al huésped permitiendo la fácilidentificación de recombinantes. Otro sistema de selección consiste en laruptura del gen lacZ por inserción de ADN extraño.

Vectores deexpresión

Se han desarrollado muchos vectores que permiten la expresión de genesdentro de insertos clonados mediante transcripción regulada por un fuertepromotor en el vector. En algunos casos, p. ej. utilizando vectores deexpresión T7, una gran proporción de la proteína total en las células E.colipuede consistir en el producto deseado

Vectores declonación

Fago lambda () El bacteriófago , que infecta E. coli, ha sido adaptado como unvector de clonación. La porción central se reemplaza con ADN ajeno.El ADN recombinante del fago se empaqueta in vitro en cápsides queinfectan E. coli produciendo áreas claras en las placas de agar. Seutilizan para construir librerías genómicas

puede consistir en el producto deseado.

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1.1 Tecnología del ADN recombinante (y II)

Objetivos

Cósmidos Son similares a los plásmidos, pero contienen secuencias cos de fago posibilitando empaquetarse en cápsides Los cósmidos infectan E coli y seCósmidos

Aplicaciones de laclonación de ADN

posibilitando empaquetarse en cápsides . Los cósmidos infectan E. coli y sereplican. Pueden acoger ADNs largos de 40-50kpb.

Esta técnica ha hecho importantes contribuciones a muchas áreasde investigación en biología.: identificación de genes implicados enenfermedades; construcción de mapas genómicos; producción deproteínas recombinantes, creación de organismos modificadosgenéticamente.

1.2 Enzimas de restricción

Apartados

Endonucleasas

Extremos cohesivos

Electroforesis en gel de agarosa

Secuencias de reconocimiento

Mapas de restricción

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Enzimas de restricción

Endonucleasas Las endonucleasas de restricción se identificaron en los años 60-

70. Fue el paso clave para poder clonar ADN.

Los sistemas de restricción-modificación se dan en muchasbacterias, constituyendo un mecanismo de defensa contra laintroducción de ADN extraño Consta de dos componentes:introducción de ADN extraño. Consta de dos componentes:- endonucleasa de restricción reconoce una secuencia cortasimétrica de ADN y corta el ADN en cada hebra en un sitioespecífico dentro de esa secuencia.- metilasa añade un grupo metil a una base C o A dentro de lamisma secuencia de reconocimiento en el ADN celular. Estamodificación convierte al ADN en resistente a la degradación porendonucleasas

Secuencias de reconocimiento Los enzimas reconocen una secuencia palindrómica entre 4-8 pb,

dando lugar a fragmentos de restricción de doble cadena conextremos salientes en 5’/3’ o romos Extremos cohesivos

Los extremos con salientes son cohesivos, de modo que puedenligarse diferentes ADNs si presentan los mismos extremos

caccgtgGAATTCacgaacaagtggcacCTTAAGtgcttgtt

acaacgaGAATTCctttatctgttgctCTTAAGgaaatag

EcoRIEcoRI

Secuencias de reconocimiento y Extremos cohesivosEnzimas de restricción

acaacgaG AATTCctttatctgttgctCTTAA GgaaatagP

OH

HO

P

EcoRI

caccgtgG AATTCacgaacaagtggcacCTTAA GtgcttgttP

OH

HO

P

EcoRI

l P

caccgtgGAATTCctttatcgtggcacCTTAAGgaaatag

ligasa + ATP

acaacgaGAATTCacgaacaatgttgctCTTAAGtgcttgtt

ligasa + ATP

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caccgtgG AATTCacgaacaagtggcacCTTAA Gtgcttgtt

DNA pol

Extremos romosEnzimas de restricción

DNA pol+ dNTPs

ligasa + ATP

caccgtgGAATT AATTCacgaacaagtggcacCTTAA TTAAGtgcttgtt

caccgtgGAATTAATTCacgaacaagtggcacCTTAATTAAGtgcttgtt

ligasa + ATP

Secuencias de reconocimientoEnzimas de restricción

De Sphaerotilus species

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Electroforesis en gel de agarosaEnzimas de restricción

Electroforesis en gel de agarosaEnzimas de restricción

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Electroforesis en gel de agarosa

La agarosa es un polisacáridoderivado de algas marinas, que formaun gel sólido cuando se disuelve ensoluciones acuosas a concentraciones

Enzimas de restricción

-

soluciones acuosas a concentracionesentre 0.5 y 2% (w/v).

Aplicando un campo eléctrico al gel enuna solución conductora deelectricidad, los fragmentos de ADNmigran a través del gel hacia elelectrodo positivo, dependiendo deltamaño y forma.y

El ADN se tiñe con bromuro de etidioy se visualiza por luz UV como unabanda naranja.+

-

108

Electroforesis en gel de agarosaEnzimas de restricción

1086

43

21.5

6

4

3

2

1.0

1.51.4

0.7

0.50.4

0.3

0.2

1.0

1.51.4

0.7

0.5

+

0.7

0.5

0.1

0.05

3% 0.6%

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Mapas de restricciónEnzimas de restricción

Mapas de restricciónEnzimas de restricción

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Mapas de restricciónEnzimas de restricción

6 kb 11 kb 5 kb 12 kbH

9 kb 8 kb

12 kb5 kb

PstI

PstI

4 kb 5 kb

7 kb1 kb

1 kb

7 kb5 kb

HindIII-B 6 kbHindIII-A 11 kb PstI-B 5 kbPstI-A 12 kb

PP

H

P

H

7 kb 4 kb 5 kb 1 kb 7 kb 5 kb 4 kb 1 kb

4 kbP H

MAPA FÍSICO DE UN ADN DESCONOCIDO

1.2 Enzimas de restricciónObjetivosEndonucleasas

S i

Son enzimas bacterianos que cortan (hidrolizan) ADN en determinadosfragmentos y de modo reproducible. En la bacteria forman parte delmecanismo de defensa restricción-modificación contra ADN extraño.Son los instrumentos básicos de la clonación génica.

Los enzimas de restricción cortan el ADN simétricamente en

Extremoscohesivos

El t f i

Secuenciasde reconocimiento

ambas cadenas en secuencias de reconocimiento palindrómicas,dejando libres un 5’-P y un 3’-OH. Dejan extremos romos osobresalientes.

Los extremos de cadena simple producidos por las enzimas de restricción soncohesivos, ya que pueden volverse a unir por emparejamiento de bases acualquier otro fragmento con extremos complementarios.

Los geles de agarosa separan el ADN lineal en base a su tamaño porElectroforesis engel de agarosa

Los geles de agarosa separan el ADN lineal en base a su tamaño, pormigración del ADN a través de su matriz bajo la influencia de uncampo eléctrico.

Mapas derestricción

Mediante restricción con endonucleasas solas o en combinación, se puedeconstruir un diagrama, mapa de restricción, de la molécula indicando los sitiosde corte y los tamaños de los fragmentos

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1.3 Hibridación de ácidos nucleicos. PCR. Secuenciación del ADN

Hib id ió l d d d Hibridación: proceso por el que dos cadenas de ácidos nucleicos que son complementarias se unen para dar una molécula bicatenaria.

La hibridación puede ser ADN-ADN, ADN-ARN.

Desnaturalización térmica

Hibridación de ácidos nucleicos

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Renaturalización

• La renaturalización tiene lugar enfriando la solución deADN

Hibridación de ácidos nucleicos

• Enfriamiento rápido sólo permite la formación deregiones locales de doble cadena formadas por la unión deregiones cortas complementarias

• Enfriamiento lento permite la complementariedadcompleta de las cadenas de ADN, ya que da tiempo a quecada cadena encuentre a la otra

• La renaturalización de regiones complementarias entrecadenas de ácidos nucleicos diferentes se llama hibridación

Hibridación de ácidos nucleicos

Esta fue la primera técnica analíticabasada en la hibridación de ácidosnucleicos, desarrollada por Ed Southern(Oxford).

Se utiliza para analizar la estructura delos genes.

pocillos paraCargar la muestra

Fragmentos de ADNSeparados por tamaño

Gel de agarosa

electroforesis Southern

Pasos:1 – extracción de ADN2 – Digestión con enzimas de restricción3 – Electroforesis4 – Transferencia5 – Hibridación6 - Autorradiografía

papel

mecha

membranaGel

transferencia

hibridación autorradiografíamembrana

híbridos(emiten radiación)

Bandas correspondientesa los fragmentos hibridados

Película de rayos X

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SouthernHibridación de ácidos nucleicos

SouthernHibridación de ácidos nucleicos

ADN teñido con bromuro de etidio

Autorradiografía con una sonda hibridada

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PCR

Apartados

Principio

Cómo trabaja

Aplicaciones

Componentes

PrincipioPCR

Copiar y amplificar secuencias específicas de ADN

miles de millones de veces en una

simple reacción enzimática.

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ComponentesPCR

Cuatro componentes fundamentales:

1) ADN molde conteniendo la secuencia de ADN a seramplificada

2) cebadores oligonucleótidos: “forward” y “reverse”

3) ADN polimerasa: Taq polimerasa

4) dNTPs: dATP dCTP dGTP dTTP4) dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Cómo trabajaPCR

Ver animación “PCR”.

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AplicacionesPCR

Detección de alteraciones genéticas que causanenfermedades.

Procesos de clonación del ADN Procesos de clonación del ADN.

Secuenciación de ADN.

Cualquier procedimiento que requiera mayor cantidad de ADNespecífico que la que es posible obtener del material departida.

RT-PCR: ADN complementario.

Cuantificación de la expresión de un gen: RT-PCR + PCR-Q.

ADN complementario Existe un tipo de virus cuyo genoma está formado únicamentepor ARN. Para propagarse ha de transcribirse en sentidocontrario: ARN ADN. Son los retrovirus. Posteriormente elADN li tú ld ARN í i L

AplicacionesPCR

ADN se replica y actúa como molde para nuevo ARN vírico. Laenzima que cataliza la reacción de ARN a ADN se denominatranscriptasa inversa. Esta enzima es importante en biologíamolecular, porque permite aislar rápidamente las regionescodificantes de un gen.

Si extraemos ARNm de un tejido, podemos sintetizar una cadenade ADN complementario (ADNc) mediante la transcriptasainversa ADNc es de cadena simple y puede obtenerse dobleinversa. ADNc es de cadena simple y puede obtenerse doblecadena mediante la PCR.

Este ADNc corresponde a los genes que estaban activos cuandose extrajo el tejido. Como el ARNm maduro sólo contieneexones, el ADNc equivale a los genes sin intrones.

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ADN complementarioAplicaciones

PCR

- Utilidad en los “microarrays”

Secuenciación del ADN

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Secuenciación

Método de secuenciación de ADN mediante el protocolo de didesoxi nucleósido trifosfatos (ddNTP) (Sanger).

Secuenciación

base

HOHdNTP 2’3’

base

HHddNTP2’3’

base2’3’

5’ base2’3’

5’

dNTPHOH

23

HOH23dNTP dNTP

23

Basado en la reacción de la ADN polimerasa

Cuatro reacciones separadas

Secuenciación

Cuatro reacciones separadas

Cada mezcla de reacción contiene dATP, dGTP, dCTPy dTTP, uno de los cuales está marcado con P32

Cada reacción también contiene una pequeñacantidad de un didesoxinucleótido: ddATP, ddGTP,ddCTP o bien ddTTPddCTP o bien ddTTP

Método de terminación de cadena La mayoría de las veces, la polimerasa

utiliza nucleótidos normales y el ADN se

Secuenciación

utiliza nucleótidos normales y el ADN se sintetiza con normalidad

Ocasionalmente, la polimerasa utiliza un didesoxinucleótido, el cual se añade a la cadena inhibiendo la unión de más nucleótidos en esa cadenaL di ió l d dddd l ótidl ótid La adición al azar de dddd--nucleótidnucleótidoossdeja (idealmente) al menos unas pocas cadenas terminadas en cada posición de nucleótido

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Secuenciación de ADN por el método de Sanger

ADN molde (simple cadena) 3’-G A G T G G T C A T A C T G T A-5’

Secuencia ADN sintetizada (codificante) 5’-C T C A C C A G T A T G A C A T-3’

- - - AReacción 1 - - - - - - A

Secuenciación

+ddATP - - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - A

- TReacción 2 - - - - - - - - T+ddTTP - - - - - - - - - - T

- - - - - - - - - - - - - - - T

R ió 3

3’

Reacción 3 - - - - - - - G+ddGTP - - - - - - - - - - - G

C- - C

Reacción 4 - - - - C+ddCTP - - - - - C

- - - - - - - - - - - - - C

5’

manualautomática

Secuenciación

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Secuenciador automáticoSecuenciación

La PCR permite copiar y amplificar secuencias específicas de ADN millones deveces en una simple reacción enzimática.

Objetivos

1.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR (I)

Principio

Cómo trabaja

Componentes Cuatro componentes fundamentales: ADN molde conteniendo la secuenciade ADN a ser amplificada; 2) cebadores oligonucleótidos; 3) ADNpolimerasa; 4) dNTPs

El ADN es amplificado en 20-40 ciclos de síntesis de ADN. Cada ciclotiene tres pasos que se llevan a cabo a diferentes temperaturas: 1)desnaturalización: 90-95ºC; 2) hibridación: 40-60 ºC; 3) extensión: 72ºC.Cada molécula de ADN sintetizada actúa como molde para las siguientesreacciones, de modo que ésta aumenta exponencialmente en los sucesivos

Aplicaciones

q pciclos.

Extensivamente para el estudio de genes. Ha contribuido mucho al estudiode enfermedades hereditarias y en la investigación del cáncer. Tambiéntiene aplicaciones prácticas como diagnóstico de enfermedades hereditaras,medicina forense y biotecnología.

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Virus cuyo genoma está formado únicamente por ARN. Para propagarse su ARNdebe transcribirse en sentido contrario: ARN ADN. Posteriormente el ADNse replica y actúa como molde para nuevo ARN vírico.

Objetivos

Retrovirus

1.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR (y II)

Enzima que cataliza la reacción de ARN a ADN. Esta enzima es importante enbiología molecular, porque permite aislar rápidamente las regiones codificantesde un gen.

Transcriptasa inversa

ADNc: Se sintetiza mediante la transcriptasa inversa a partir de ARNmextraído de un tejido. Es de cadena simple y puede obtenerse doblecadena mediante la PCR El ADNc equivale a los genes sin intrones

ADN complementario

cadena mediante la PCR. El ADNc equivale a los genes sin intrones.