Upload
others
View
8
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
SEBASTIÁN ALEJO ROMANO
“MODIFICAÇÕES CONFORMACIONAIS
RECÍPROCAS DAS PROTEÍNAS LIGANTES PRÍON
E HOP/STI1: IMPLICAÇÕES PARA A SINALIZAÇÃO
CELULAR MEDIADA PELA PROTEÍNA PRÍON”
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 9
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
SEBASTIÁN ALEJO ROMANO
“MODIFICAÇÕES CONFORMACIONAIS
RECÍPROCAS DAS PROTEÍNAS LIGANTES PRÍON
E HOP/STI1: IMPLICAÇÕES PARA A SINALIZAÇÃO
CELULAR MEDIADA PELA PROTEÍNA PRÍON”
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).
Orientador: Rafael Linden Co-orientadora: Débora Foguel
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 9
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Romano, Sebastián Alejo Modificações conformacionais recíprocas das proteínas ligantes prion e
hop/STI1: implicações para sinalização celular mediada pela proteína príon / Sebastián Alejo Romano. – Rio de Janeiro: UFRJ / IBCCF, 2009.
xiv,159 f. : il ; 29,7 cm. Orientadores: Rafael Linden e Débora Foguel Tese (doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, IBCCF,
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2009. Referências bilbiográficas: f. : 110-128 1. Proteína príon 2. Proteína hop/STI1 3. Estrutura 4. Sinalização
celular 5. Neuritogênese 6. Neuroproteção 7. Alterações conformacionais – Tese. I. Linden, Rafael. II Foguel, Débora. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, IBCCF, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica). IV. Titulo.
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Neurogênese do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do Dr. Rafael Linden e co-orientação da Dra. Débora Foguel, na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pelo Programa de Apóio a Núcleos de Excelência (Pronex) e pela Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).
Aos meus pais, Cristina e Jorge, por me guiarem até aqui. A minha mulher, Ana Raquel, por me acompanhar daqui em diante.
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores, Rafael e Débora, por confiarem em mim e me darem a liberdade justa e o conselho sábio necessários para poder trabalhar criativamente; Aos meus orientadores informais, Yraima e Maurício, por me guiarem durante todo o trabalho, mesmo quando não receberam todo o crédito merecido: sem vocês nada neste trabalho teria sido possível; A Ana Raquel, minha amada mulher, o precioso presente que Rio de Janeiro me deu, por me apoiar pacientemente durante todo este caminho, escutar minhas angústias e festejar meus sucessos e, mais que nada, por me dar tanto amor; A Cristina, minha mãe, por me fazer quem eu sou, por todo o amor e cuidado brindado, pelo enorme sacrifício nem sempre reconhecido, e por me guiar no meu caminho, mesmo quando ele me afastase dela: você é um modelo de mãe; A Jorge, meu pai, pela amizade e o amor, pelos conselhos e a confiança, pela alegria e inspiração: é um prazer poder viver perto de você; A Julia, Glauce e Jeane, a nova família que Rio de Janeiro me deu, pelo carinho, o apóio, a companhia e as risadas, fico feliz de saber que estarão por perto sempre; A los amigos que traje hasta aqui, Santi, Alejo, Colo, Sole, Mati e Flor: son la mejor companía que puedo pedir, quiero tenerlos cerca de nuevo!; Aos amigos que encontrei aqui, Ana, Diego, Dani, Planet, Thiago, Ana Julia, Gabo e Osvaldo: obrigado pela companhia, diversão e inspiração!; Aos colegas do Fundão que se tornaram amigos, Yra, Mau, Brian, Rachel, Mari, Tati, Mona, Bruno, Vinícius e Maithê: foi um prazer descobrir vocês!; A todo o mundo no laboratório de Neurogênese e LAPA, estudantes e técnicos: obrigado por ensinar a um físico como se trabalha na biociência; A Dra. Vilma Martins, a Dra. Marilene Lopes e a Talita, pela ajuda na purificação de proteínas: obrigado por responder a meus apelos desesperados!; A todos os colaboradores que me ajudaram a concluir este trabalho; A Malú e She-Ra, as gatas mais lindas do universo!
LISTA DE ABREVIATURAS
aa aminoácidos bis-ANS 4,4'-dianilino-1,1'-binaphthyl-5,5'-sulfonate cAMP monofosfato de adenosina (AMP) cíclico CD dicroismo circular Dmax diâmetro máximo molecular DP domínio rico em aspartato e prolina da hop/STI1 ERK proteína cinase regulada por sinais extracelulares FITC isotiocianato de fluoresceína FYN proteína tirosina cinase não receptora GPI glicosil fosfatidilinositol hop/STI1 co-chaperona HSP70-HSP90 organizing protein stress-inducible protein 1 hop/STI1230-245 segmento da hop/STI1 que liga a PrPC HSP proteína de choque térmico Kd constante de dissociação LTP potenciação de longo prazo N-CAM molécula de adesão celular neuronal native-PAGE eletroforese de gel de poliacrilamida em condições não desnaturantes LR/LRP receptor de laminina / precursor do receptor de laminina PI3K fosfatidilinositol 3-cinase PKA proteína cinase A PrP proteína príon recombinante PrPC proteína príon PrPSc proteína príon scrapie PrP106-126 domínio hidrofóbico da proteína príon PrP113-128 segmento da PrPC que liga a hop/STI1 PrP113-132 segmento da PrPC que liga a hop/STI1 PrP121-231 segmento correspondente ao domínio globular da proteína príon PrP23-231 proteína príon madura PrP51-90 segmento de repetições de octapeptídeos da proteína príon PrP95-231
W98F mutante da PrP com a região 23-94 truncada e a mutação pontual W98F PrP-/- animal decificiente em PrPC ou célula obtida de animal deficiente em PrPC p(r) distribuição de distâncias intramoleculares Rg raio de giro molecular RMN ressonância magnética nuclear ROS espécies reativas de oxigênio SAXS espalhamento de raios-X a baixo ângulo SDS-PAGE eletroforese de gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio SE-HPLC cromatografia liquida de alta eficiência de exclusão por tamanho SNC sistema nervoso central SOD superóxido dismutase TPR domínio de tetratricopeptídeos repetidos TSE encefalopatias espongiformes transmissíveis
RESUMO
ROMANO, Sebastián Alejo. Modificações conformacionais recíprocas das proteínas ligantes príon e hop/STI1: implicações para sinalização celular mediada pela proteína príon. Rio de Janeiro, 2009. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas, Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio Janeiro, Rio de Janeiro, 2009. A proteína príon (PrPC) é uma glicoproteína abundantemente expressa no sistema nervoso, ligada à face extracelular da membrana plasmática por uma âncora de glicosil fosfatidilinositol (GPI). Apesar de ter sido associada à modulação de diversas respostas celulares e à participação em complexos sinalizadores residentes na superfície celular, suas funções fisiológicas ainda não foram totalmente compreendidas. Em particular, o engajamento da PrPC pela co-chaperona secretável hop/STI1 induz distintos sinais intracelulares neurotróficos. Porém, os mecanismos moleculares envolvidos nestes processos ainda estão longe de ser esclarecidos e ainda não foi elucidado como estas proteínas, que não possuem domínios transmembrana, são capazes de transmitir informação para o compartimento intracelular. Uma hipótese plausível sugere a ação de parceiros moleculares transmembrana que são recrutados de forma coordenada após a interação de PrPC com hop/STI1. Estes eventos de sinalização muito provavelmente dependem, e são modulados, por alterações estruturais alostéricas que podem ser propagadas nos distintos parceiros moleculares envolvidos. Portanto, este trabalho teve como objetivo analisar possíveis alterações conformacionais das estruturas da PrPC e da hop/STI1, disparadas pela interação destas proteínas, que, por seu turno, sejam potencialmente importantes para o recrutamento de outros ligantes que assistam no mecanismo sinalizador. Usando como modelos proteínas recombinantes murinas, tanto selvagens quanto mutantes, assim como peptídeos ligantes, analisamos biofísica e estruturalmente a interação da PrPC com a hop/STI1. Realizamos, dentre outras, medidas de dicroísmo circular (CD), espectroscopia de fluorescência e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Observamos que esta interação dispara uma perda de estruturas em α-hélice da proteína príon, que envolve, pelo menos, uma perturbação estrutural da α-hélice PrP143-153, mas não detectamos modificações da estrutura secundária da hop/STI1. Geramos novos modelos de baixa resolução por SAXS, que revelaram uma sensível compactação do C-terminal da hop/STI1, quando ligada à PrP. Em contraste com modelos recentes diméricos da hop/STI1 humana, tanto ensaios de cromatografia liquida de alta eficiência de exclusão por tamanho (SE-HPLC) quanto dados de SAXS, apóiam uma forma monomérica da hop/STI1 murina livre. Discutimos como alterações da α-hélice PrP143-
153 podem alterar a afinidade da PrPC pelas proteínas transmembrana sinalizadoras precursor do receptor de laminina (LRP) e molécula de adesão celular neuronal (N-CAM), ambas ligantes deste domínio da PrPC, e como ligantes adicionais podem ser engajados pelas alterações da estrutura terciária da hop/STI1. Estas modificações estruturais recíprocas indicam um mecanismo versátil para a sinalização mediada pela interação da PrPC com a hop/STI1, de forma consistente com a hipótese da ação de complexos sinalizadores multiprotéicos dependentes da PrPC.
ABSTRACT
ROMANO, Sebastián Alejo. Modificações conformacionais recíprocas das proteínas ligantes príon e hop/STI1: implicações para sinalização celular mediada pela proteína príon. Rio de Janeiro, 2009. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas, Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.
The prion protein (PrPC) is a glicoprotein abundantly expressed in the nervous system, anchored by a glycosylphosphatidylinositol (GPI) to the extracellular face of the plasma membrane. Although associated to the modulation of diverse cellular responses and to the scaffolding of multi-protein signaling complexes, its physiological functions are not completely understood. In particular, engagement of PrPC with the secretable co-chaperone hop/STI1 induces neurotrophic signals. However, the involved molecular mechanisms are far from understood, and it has not yet been shown how these proteins, which do not bear a transmembrane domain, are capable of transmitting information to the intracellular compartment. One plausible hypothesis suggests the action of transmembrane molecular partners that are recruited in a coordinated fashion after the interaction between PrPC and hop/STI1. These signaling events likely depend, and are modulated, by the propagation, through the molecular partners involved, of allosteric conformational modifications. Hence, the goal of this work was to analyze possible binding-triggered conformational alterations of both PrPC and hop/STI1 structures potentially relevant to the recruitment of further signaling ligands. Using recombinant wild type and mutant mouse proteins and binding peptides, we carried out a biophysical and structural analysis of the interaction between PrPC and hop/STI1, by performing circular dichroism (CD), fluorescence spectroscopy and small angle X-ray scattering (SAXS) measurements. We found that PrPC:hop/STI1 interaction triggers a loss of PrP helical structures, involving at least a perturbation of the PrP143-153 α-helix, but no secondary structural modification of hop/STI1 was detected. Novel low-resolution SAXS models showed a significant C-terminus compaction of hop/STI1 when bound to PrP. Differing from a recent dimeric model of human hop/STI1, both size-exclusion chromatography and SAXS data support a monomeric form of free murine hop/STI1. Changes in the PrP143-153 α-helix may engage the transmembrane signaling proteins Laminin Receptor Precursor and NCAM, both of which bind that domain of PrPC, and further ligands may be engaged by the tertiary structural changes of hop/STI1. These reciprocal structural modifications indicate a versatile mechanism for signaling mediated by PrPC:hop/STI1 interaction, consistent with the hypothesis of PrPC-dependent multi-protein signaling complexes.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 10
1.1 A PROTEÍNA PRÍON CELULAR .......................................................................... 10 1.1.1 A PrPC E AS DOENÇAS POR PRÍONS ............................................................... 10 1.1.2 SOBRE A ESTRUTURA DA PrPC ....................................................................... 16 1.1.3 SOBRE A FUNÇÃO DA PrPC NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL .............. 24 1.1.3.1 INTERAÇÃO COM COBRE E ESTRESSE OXIDATIVO .............................. 26 1.1.3.2 ATIVIDADE SINÁPTICA E EXCITABILIDADE NEURONAL ..................... 28 1.1.3.3 CONTROLE DA SOBREVIVÊNCIA NEURONAL .......................................... 30 1.1.3.4 DIFERENCIAÇÃO E ADESÃO CELULAR ...................................................... 32 1.1.3.5 COMPORTAMENTO .......................................................................................... 34 1.2 A PROTEÍNA HOP/STI1.......................................................................................... 34 1.2.1 SOBRE A ESTRUTURA DA HOP/STI1 ............................................................. 35 1.2.2 SOBRE A FUNÇÃO DA HOP/STI1 ..................................................................... 38 1.2.2.1 ATIVIDADES INTRACELULARES .................................................................. 39 1.2.2.2 ATIVIDADES EXTRACELULARES DA HOP/STI1 INDEPENDENTES DA PrPC ................................................................................................................ 41 1.3 A INTERAÇÃO PrPC:HOP/STI1 E SUA FUNCIONALIDADE ............................ 42 1.4 RACIONAL .............................................................................................................. 47
2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 48
2.1 GERAL ..................................................................................................................... 48 2.2 ESPECÍFICOS .......................................................................................................... 48
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 49
3.1 REAGENTES ........................................................................................................... 49 3.2 PURIFICAÇÃO DE PrP23-231 RECOMBINANTE .................................................. 49 3.3 PURIFICAÇÃO DE PrP95-231
W98F RECOMBINANTE ........................................... 52 3.4 PURIFICAÇÃO DE HOP/STI1 RECOMBINANTE .............................................. 52 3.5 PEPTÍDEOS SINTÉTICOS ..................................................................................... 54 3.6 MARCAÇÃO COM FITC DE PrP23-231 RECOMBINANTE .................................. 54 3.7 ELETROFORESE EM GÉIS EM CONDIÇÕES DESNATURANTES
E NATIVAS ............................................................................................................. 55 3.8 ANISOTROPIA DE FLUORESCÊNCIA ............................................................... 55 3.9 ESPECTROSCOPIA DE DICROISMO CIRCULAR ............................................. 58 3.10 ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA ........................................................ 59 3.11 ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXO ÂNGULO ....................................... 60
4 RESULTADOS ......................................................................................................... 66
4.1 AVALIAÇÃO DA INTERAÇÃO PrP:HOP/STI1 ................................................... 66 4.2 ANÁLISE DO EFEITO DA INTERAÇÃO PrP:HOP/STI1 SOBRE A
ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS .......................................................................... 70 4.2.1 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA SECUNDÁRIA ......................................... 70 4.2.2 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA LOCAL ..................................................... 80
4.2.3 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA TERCIÁRIA ............................................. 89
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 100
5.1 SOBRE AS EVIDÊNCIAS APRESENTADAS NESTE TRABALHO ................ 101 5.2 IMPLICAÇÕES PARA O MECANISMO SINALIZADOR ................................. 104 6 CONLUSÕES .......................................................................................................... 109 7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 110 APÉNDICE .............................................................................................................. 129
10
1 INTRODUÇÃO
1.1 A PROTEÍNA PRÍON CELULAR
A proteína príon celular (PrPC) é uma proteína altamente expressa no sistema nervoso central
(SNC), originalmente identificada no contexto do estudo das encefalopatias espongiformes
transmissíveis (TSEs, pelo seu nome em inglês, transmissible spongiform encephalopathies),
doenças que envolvem crucialmente esta proteína, assim como patógenos infecciosos
denominados príons, pelo que também são conhecidas como doenças por príons. Já que estas
doenças apresentam características incomuns que provocaram um grande interesse científico,
os estudos iniciais da PrPC foram quase exclusivamente direcionados para o estudo do seu
papel na patogênese, mais especificamente nos mecanismos de infecção. Respeitando este
processo histórico, vamos nos referir primeiramente a relação entre a PrPC e as doenças por
príon.
1.1.1 A PrPC E AS DOENÇAS POR PRÍONS
A família de doenças por príons, ou TSEs, incluem, entre outras, a TSE bovina (BSE,
popularmente conhecida como “mal da vaca louca”), caprina e ovina (scrapie), e variantes
humanas como a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), a síndrome de Gertsmann-Sträussler-
Scheinker (GSS), a insônia familiar fatal (FFI) e o Kuru (revisto por PRUSINER, 1999)
(Tabela 1). Estas doenças podem se apresentar como distúrbios genéticos, infecciosos ou
esporádicos, mas todas elas têm em comum alterações da fisiologia da PrPC expressa no
11
organismo do portador da doença (revisto por PRUSINER, 1998). Durante o
desenvolvimento destas doenças, todas incuráveis e fatais, podem ser observados diversos
sintomas de disfunções motoras e cognitivas, acompanhados de uma extensa morte neuronal,
gliose astrocitária, acúmulo de agregados protéicos (em alguns casos formando placas
amilóides), e vacuolização do tecido cerebral (responsável pelo termo “espongiforme” que
descreve a família de doenças) (revisto por COLLINS et al., 2004).
Tabela 1. Encefalopatias espongiformes transmissíveis animais e humanas (adaptado de MABBOTT & MACPHERSON, 2006).
12
O estudo das TSEs ganhou enorme atenção científica pelo fato delas envolverem um
agente patogênico sem precedentes: uma partícula proteinácea infecciosa, denominada príon
(PRUSINER, 1982). Diversos estudos demonstraram a resistência deste agente à radiação
ultravioleta (LATARJET et al., 1970; GIBBS et al., 1978), sugerindo que os príons são únicos
no fato de ser capazes de transmitir doenças prescindindo de ácidos nucléicos, e gerando a
hipótese “unicamente protéica” (protein only) (ALPER et al., 1967; PRUSINER et al., 1982).
Coerente com esta teoria, foi demonstrado que uma proteína altamente resistente à proteólise,
enriquecida em cérebros doentes, é necessária para que extratos desses cérebros resultem
infecciosos (PRUSINER et al., 1984). A purificação de material resistente à proteólise de
cérebros doentes isolou uma fração da então hipotética proteína patogênica, com uma massa
molecular entre 27 e 30 kDa (PrP27-30), que forma os agregados protéicos característicos da
doença. O sequenciamento desta proteína permitiu a identificação do gene Prnp, que codifica
a PrPC, demonstrando que a proteína patogênica e a PrPC compartilham a mesma seqüência de
aminoácidos (BOLTON et al., 1982; PRUSINER et al., 1982). Estudos estruturais desta
isoforma anômala da PrPC (conhecida, entre outras denominações, como príon scrapie, ou
PrPSc) demonstraram que o desenvolvimento da doença é acompanhado de uma modificação
conformacional da PrPC, que envolve a conversão de algumas de suas α-hélices nativas em
fitas-β, presentes abundantemente na PrPSc (CAUGHEY et al., 1991; PAN et al., 1993). Esta
transição estrutural desencadeia grandes mudanças nas características físico-químicas da
proteína, tais como a resistência à digestão por proteases e a tendência à formação de
agregados oligoméricos e, raramente, amilóides (PRUSINER et al., 1983; PRUSINER et al.,
1999). Desta forma, doenças por príons, junto com outras doenças como a doença de
Alzheimer, a doença de Parkinson, a doença de Huntington e a esclerose lateral amiotrófica,
são reconhecidas como doenças de conformação de proteínas, um grupo de enfermidades
neurodegenerativas que possuem em comum a alteração da conformação fisiológica de
13
proteínas específicas em prol da aquisição de estruturas ricas em fitas-β que facilitam a
fromação de agregados destas proteínas (ROSS & POIRIER, 2004).
O mecanismo molecular da conversão da PrPC em PrPSc ainda não foi esclarecido. O
modelo mais aceito na atualidade é conhecido como re-enovelamento assistido por molde ou
replicação por molde (Fig. 1). Neste modelo, o agente infeccioso consiste em monômeros da
PrPSc que apareceriam no organismo por infecção ou conversão espontânea. Este último caso
só seria possível na presença de mutações que desestabilizem a PrPC, já que uma alta barreira
energética dificultaria a conversão. A replicação da PrPSc progrediria quando ela se liga à
PrPC, instruindo-a a se converter na isoforma patogênica, em um processo auto-catalítico
alimentado pela presença de PrPC, e provavelmente facilitado por alguma outra molécula
ainda não identificada (WEISSMANN, 1999; AGUZZI & POLYMENDIOU, 2004). Entre os
candidatos para o papel de facilitador, foram sugeridos proteínas (HACHIYA et al., 2007) e
ácidos nucléicos (SILVA et al., 2008). O modelo é consistente com o caráter progressivo das
TSEs e com diversas outras evidências, destacando-se entre elas o fato de que a presença da
PrPC é necessária para a replicação de PrPSc e para a patogênese, já que estes fenômenos não
se desenvolvem após infectar camundongos transgênicos nulos para o gene Prnp com extratos
de cérebros doentes (BÜELER et al., 1993; BRANDNER et al., 1996).
Figura 1. Esquema representativo do modelo de replicação por molde (adaptado de AGUZZI & POLYMENDIOU, 2004).
Diversos estudos pressupõem ou sugerem que a degeneração neuronal e astrocitária é
14
o resultado do acúmulo de PrPSc em agregados depositados no tecido cerebral (revisto por
HARRIS, 1999), mas existe um considerável debate sobre a natureza dos agentes
neurotóxicos nas doenças de conformação de proteínas, sendo que tanto grandes agregados
fibrilares quanto pequenos oligômeros ordenados pré-fibrilares têm sido propostos como
principais responsáveis da degeneração (para uma revisão ver CAUGHEY et al., 2003; ROSS
& POIRIER, 2004). Porém, ambos modelos encaixam-se na hipótese de que a patogênese é
causada pelo ganho de uma função tóxica da PrPSc, cujo mecanismo ainda não foi elucidado.
Não obstante, alguns indícios sugerem que a degeneração neuronal não é uma simples
conseqüência da toxicidade de agregados da PrPSc. A análise minuciosa de animais infetados
revela a falta de correlação espacial significativa entre o acúmulo de depósitos da PrPSc e a
apoptose neuronal decorrente das TSEs (DORANDEU et al., 1998; GRAY et al., 1999;
CHRETIEN et al., 1999). De fato, um estudo recente sugere que a presença dos agregados
protéicos não é suficiente para provocar a neurodegeneração, e reveste de importância à PrPC
no seu estado fisiológico para o mecanismo patogênico. A PrPC é uma glicoproteína que se
encontra ligada à face extracelular da membrana plasmática através de uma âncora
glicosilfosfatidilinositol (GPI). Foi demonstrado que, apesar de que camundongos
transgênicos que expressam uma forma solúvel da PrPC não ancorada à membrana podem
sofrer a replicação infecciosa de amilóides de PrPSc, as manifestações clínicas da doença não
são evidentes, mas observáveis somente quando a PrPC está normalmente ancorada por GPI à
membrana celular (CHESEBRO et al., 2005).
Uma outra hipótese não excludente para explicar o mecanismo patológico é a de perda
de função da PrPC, já que a replicação por molde da PrPSc baseia-se em um mecanismo que
provoca a depleção gradual da PrPC, certamente comprometendo sua atividade (MARTINS et
al., 2002; HETZ et al., 2003; WESTERGARD et al., 2007; LINDEN et al., 2008; AGUZZI et
al., 2008) (Fig. 2). Dentro deste marco, resulta de vital importância analisar o papel
15
fisiológico da PrPC, um aspecto longamente relegado pelos amplos esforços direcionados à
compreensão do inédito mecanismo patogênico das doenças por príon. Para esta análise,
abordaremos brevemente diversos estudos da estrutura, biologia celular e função fisiológica
da PrPC.
Figura 2. As hipóteses de ganho e perda de função na patogênese das doenças por príon. Uma partícula patogênica formada por moléculas de PrPSc (verde claro) pode apresentar-se no sistema nervoso seja por infecção ou como resultado da conversão conformacional da PrPC (em vermelho e azul). A isoforma anormal coopta a PrPC endógena e induz a formação de agregados protéicos constituídos por moléculas de PrPSc (grandes aglomerados em verde claro). A hipótese de ganho de função sugere que a agregação de PrPSc sensibiliza neurônios para a morte celular programada, provocando as doenças por príon. Por outro lado, a hipótese de perda de função sugere que a perda gradual da PrPC endógena, que resulta do mecanismo de replicação de PrPSc, tem como consequência a neurodegeneração e o desenvolvimento das doenças por príon. Ambas hipóteses não são mutuamente exclusivas, e a dependencia entre agregação de PrPSc, morte celular e patogênese ainda não foi esclarecida. (Adaptado de LINDEN et al., 2008).
16
1.1.2 SOBRE A ESTRUTURA DA PrPC
Motivados principalmente pelo fato das TSEs estarem estreitamente vinculadas a uma
mudança conformacional da PrPC, abundante informação sobre a estrutura da PrPC foi obtida
no decorrer das ultimas décadas. Nesta seção, vamos rever algumas informações estruturais
relevantes para o estudo da funcionalidade da PrPC, focalizando estudos estruturais da PrPC
endógena e de seus modelos recombinantes, sem nos estender na literatura sobre a transição
estrutural patogênica que caracteriza as TSEs.
A PrPC é uma glicoproteína abundantemente expressa no SNC e, em menor
quantidade, em vários outros tecidos (revisto por LINDEN et al., 2008). O gene Prnp, que
possui dois éxons em hamsters, humanos e marsupiais, e três éxons em camundongos, ratos,
bovinos e carneiros, codifica para a PrPC em apenas um éxon (PUCKETT et al., 1991;
WESTAWAY et al., 1994a). Nos humanos, Prnp codifica uma seqüência de 253 aminoácidos
(aa) e no camundongo uma de 254 aa. Este polipeptídeo original é translocado para o retículo
endoplasmático (RE) devido à presença de um peptídeo sinalizador N-terminal. Durante o
tráfego pelo RE e complexo de Golgi, a seqüência sofre processamento pós-traducional. A
proteína humana sofre a clivagem de seus primeiros 22 aa e seus últimos 23 aa (24 aa no
camundongo), sendo que o primeiro segmento constitui o peptídeo sinalizador e os últimos
são hidrolisados para a adição da âncora de GPI na extremidade C-terminal. Desta forma, a
seqüência adota a forma madura PrP23-231.
Foi demonstrado que a PrPC pode ser sintetizada no RE em três topologias distintas:
uma forma majoritária que é translocada completamente para dentro do RE e posteriormente
é secretada ao meio extracelular, e duas formas transmembrana carboxi- e amino- terminais
(CtmPrP e NtmPrP, respectivamente), muito menos abundantes, que resultam da inserção
transmembrana de um trecho hidrofóbico da sua seqüência, o segmento PrP110-134. Sabe-se
17
pouco sobre estas duas últimas isoformas da PrPC, mas elas tem sido vinculadas a processos
neurodegenerativos (HEDGE et al., 1998). Também existe evidência de pequenas quantidades
de uma forma citosólica da proteína príon, detectada principalmente após a inibição de
proteassomos e a superexpressão de Prnp em animais transgênicos (MA & LINDQUIST,
2001). O impacto fisiológico desta variedade citosólica ainda não foi esclarecido, porém,
existem trabalhos que a associam tanto a processos neurodegenerativos quanto a
neuroprotetores, como veremos mais adiante. Durante o presente trabalho, vamos nos ater à
análise da forma mais abundante e mais estudada, que é a isoforma ancorada por GPI à face
extracelular da membrana plasmática, derivada da seqüência secretada.
A PrPC contém uma única ponte de dissulfeto entre as cisteínas 179 e 214 (178 e 213
no camundongo) e pode ser N-glicosilada nas asparaginas 181 e 197 (180 e 196 no
camundongo) (HARAGUCHI et al., 1989), pelo que pode ser encontrada na superfície celular
na forma não glicosilada, mono-glicosilada e di-glicosilada. Essa diversidade é ainda
ampliada quando consideramos que também existem pontos de clivagem na região N-
terminal. Consequentemente, a PrPC pode ser encontrada no SNC em formas truncadas que,
por sua vez, podem ser glicosiladas multiplamente por uma grande variedade de N-glicanos
(RUDD et al., 2001), refletindo uma importante heterogeneidade da natureza da PrPC. De
fato, há indícios de que estas diversas formas são distribuídas diferencialmente no SNC
(DEARMOND et al., 1999; BERINGUE et al., 2003).
Trabalhos realizados com a proteína príon recombinante (PrP) purificada ofereceram
grandes esclarecimentos sobre a estrutura da PrPC. Estudos de espectros de ressonância
magnética nuclear (RMN) da PrP mostraram que ela possui dois domínios bem diferenciados:
uma região N-terminal altamente flexível e intrinsecamente desestruturada, que abrange
aproximadamente os primeiros 100 aa, e um domínio globular C-terminal que cobre o
segmento PrP121-231 (DONNE et al., 1997). A região flexível N-terminal, PrP23-120, contém
18
cinco repetições de octapeptídeos no segmento PrP51-90, nos quais existe um domínio de
ligação para íons de cobre (HORNSHAW et al., 1995; BROWN et al., 1997a), assim como
um segmento de características hidrofóbicas, PrP106-126. Um importante avanço deste campo
de pesquisa foi a obtenção, através de RMN, da estrutura em alta resolução da estrutura
tridimensional dos domínios globulares da proteína príon recombinante de várias espécies,
entre as quais podemos destacar a humana e a do camundongo (RIEK et al., 1996; JAMES et
al., 1997; LOPEZ-GARCIA et al., 2000; ZAHN et al., 2000; CALZOLAI et al., 2005;
LYSEK et al., 2005). Para a proteína inteira só existe um modelo de baixa resolução obtido
através de medidas de espalhamento de raios-X de baixo ângulo (SAXS) da PrP recombinante
murina (LIMA et al., 2006). Resulta importante destacar o achado de que a cauda N-terminal
flexível PrP23-120 mantém interações transitórias com o domínio globular, mas não altera a
estrutura tridimensional deste, pelo que os modelos de RMN obtidos da proteína truncada
PrP121-231 devem representar fielmente a estrutura deste domínio na proteína inteira, PrP23-231
(RIEK et al., 1997). Esse conjunto de estudos demonstrou que as PrP de diversas espécies
apresentam um alto grau de similaridade estrutural, como era esperado devido à alta
conservação evolutiva da sequência da PrPC (WOPFNER et al., 1999). Todos os modelos
obtidos representam o domínio globular contendo 3 α-hélices, com pequenas variações no
comprimento delas, sendo que no humano elas cobrem os segmentos 144-153, 172-193 e 200-
222 (143-153, 171-192, 200-222 no camundogo), além de duas pequenas fitas-β em 128-131
e 161-164 que se alinham de forma anti-paralela, tanto no humano quanto no camundongo.
Estas informações são representadas nas Figuras 3, 4 e 5.
Devemos destacar que estes trabalhos usaram como modelo experimental a PrP23-231
expressa heterologamente em Escherichia coli transformada, pelo que não possuem
modificações pós-traducionais da PrPC, tais como glicolisações e a adição da âncora de GPI
(Fig. 5). Para validar a PrP como modelo de trabalho, devemos perguntar se estas
19
modificações têm algum efeito sobre a estrutura tridimensional da PrPC. O único estudo
experimental que abordou esta questão realizou medidas de estabilidade térmica, dicroísmo
circular (CD) e espectroscopia de prótons por RMN (1H–RMN) para a PrP23-231 recombinante
e a PrPC endógena, isolada e purificada do cérebro de bovinos. Concluiu-se que tanto a
estrutura secundária quanto a terciária não são afetadas pelo nível de glicosilação nem pela
adição da âncora de GPI (HORNEMANN et al., 2004), validando a PrP como modelo
experimental para estudos estruturais. Não obstante, as modificações pós-traducionais
poderiam afetar outras propriedades da PrPC relevantes para estudos funcionais, tais como a
interação com ligantes e o tráfego sub-celular. Por exemplo, foi reportado que a glicosilação
modula a capacidade de reconhecimento de várias espécies de PrPC por anticorpos
monoclonais, tanto em células cerebrais quanto em outro tipo de células (LI et al., 2001;
BERINGUE et al., 2003). Este efeito poderia ser o resultado de pequenas alterações
conformacionais ou bloqueios estéricos produzidos pelos N-glicanos ligados à PrPC. Deste
mesmo modo, a interação com ligantes fisiológicos da PrPC também poderia ser modulada
pela glicosilação.
20
Figura 3. Diagrama da estrutura da proteína príon. Abaixo à esquerda são apresentadas as regiões destacadas da seqüência traduzida da proteína príon (apresentada acima em forma de bastonete) e do modelo estrutural, obtido por RMN, do domínio globular da proteína prion recombinante (abaixo à direita). (Adaptado de GILL et al., 2000; AGUZZI & HEIKENWALDER, 2006).
Figura 4. Representação esquemática da estrutura e flexibilidade da cadeia polipeptídica de PrP29-
231. É representada a estrutura tridimensional do domínio PrP90-231 de hamster obtido por RMN (JAMES et al., 1997), conectada à seqüência PrP29-89 desenhada a mão para ilustrar a cauda N-terminal. A escala de cores mostra os valores do efeito nuclear Overhauser (NOE) heteronuclear [1H]-15N, obtidos na caracterização espectroscópica da proteína príon recombinante de hamster PrP29-231, onde vermelho marca as regiões de maior flexibilidade, e azul as regiões mais estruturadas e rígidas. Segmentos que não foram associados a valores de NOE são destacados em cinza. (Adaptado de DONNE et al., 1997).
21
Figura 5. Representação esquemática da PrPC após modificações pós-traducionais. A estrutura da PrP124-231 (o domínio globular) murina é apresentada em vermelho, junto com sua única ponte de dissulfeto em amarelo. A proteína é representada na versão di-glicosilada, sendo que os grupos carbohidratos são mostrados como estruturas azuis. A âncora de GPI é apresentada em amarelo, ligada ao C-terminal da proteína. (Adaptado de JACKSON & CLARKE, 2000).
Considerando que a PrPC está ligada à membrana celular pela âncora de GPI, alguns
grupos estudaram o efeito sobre a estrutura da proteína provocados pelo ambiente lipídico da
membrana plasmática. Estudos iniciais usaram diferentes tipos de modelos experimentais de
vesículas lipídicas que mimetizam os microdomínios de membrana do tipo balsas lipídicas
(lipid rafts), domínios onde a PrPC, assim como a maioria das proteínas ancoradas por GPI, se
localizam preferencialmente (NASLAVSKY et al., 1997; TAYLOR et al., 2006), e
encontraram que a PrP recombinante sofre uma pequena modificação da estrutura secundaria
como resultado de interações com estas vesículas modelo (MORILLAS et al., 1999; EBERL
et al., 2004). Simulações de dinâmica molecular sugeriram que não há alterações
significativas pela interação com os lipídeos, mas que o N-terminal da proteína é capaz de
22
interagir e inclusive atravessar a membrana (revisto por DEMARCO & DAGGET, 2005).
Outro estudo sintetizou uma seqüência semelhante a uma âncora de GPI e a adicionou
covalentemente ao C-terminal da PrP, demonstrando que esta proteína recombinante
modificada era capaz de se ligar a membranas modelo que mimetizam balsas lipídicas de
forma similar à PrPC, mas que não eram produzidas alterações estruturais significativas na PrP
(HICKS et al., 2006). Em conclusão, as evidências sugerem que a ligação da PrPC à
membrana através de GPI não repercutiria sensivelmente na conformação da proteína. No que
diz respeito à funcionalidade da proteína, a ancoragem seguramente modula a atividade da
PrPC, no mínimo pela compartimentalização que ela produz.
Finalmente, por diversos motivos, outro fator relevante para estudos da estrutura e
função da PrPC, consiste na análise do efeito do pH sobre a conformação da proteína. Entre
eles, cabe destacar que a maioria dos modelos da PrP obtidos por RMN foram realizados em
soluções com pH ácido (em vários casos 4.5). Um modelo do domínio globular PrP121-231
humano, obtido também por RMN mas usando pH 7.0, demonstrou que o envolamento global
é conservado com respeito aos modelos da proteína em pH ácido, apresentando alterações
pequenas e localizadas, dentre as quais destacamos um alongamento de um par de aa no
extremo C-terminal da α-hélice 1 (CALZOLAI & ZAHN, 2003). Este estudo também sugeriu
que esta hélice é mais estável em pH neutro, e evidenciou que ela apresenta uma tendência
maior ao desenovelamento em pH ácidos do que as outras estruturas secundárias da proteína.
Outros motivos que justificam a análise do efeito do pH, baseiam-se na fisiologia da PrPC, em
particular quando se considera tanto o contínuo tráfego sub-celular da PrPC (revisto por
PRADO et al., 2004), onde ela poderia encontrar um pH de 4.5-5.0 dentro de endossomos
(LEE et al., 1996), quanto a possível modulação do pH local produzida por microdomínios
ácidos da superfície celular onde a PrPC poderia se encontrar (CHERESH et al., 1986;
ANDERSON, 1998; FREIRE & COELHO-SAMPAIO, 2000). Vários estudos evidenciaram
23
que a estrutura do terminal flexível da PrPC é sensível ao pH, enquanto seu domínio globular
é mais estável. Usando a PrP recombinante como modelo, o uso de técnicas de CD junto com
espectroscopia de fluorescência extrínseca por um lado (SWIETNICKI et al., 1997;
HORNEMANN & GLOCKSHUBER, 1998), e o mapeamento estrutural mediado por
anticorpos pelo outro (MATSUNAGA et al., 2001), demonstrou que o pH ácido não afeta
sensivelmente a estrutura do domínio globular (corroborando os dados anteriores), mas induz
alterações na cauda flexível N-terminal, envolvendo, pelo menos, a região PrP94-112
(MATSUNAGA et al., 2001). Simulações de dinâmica molecular apóiam a evidência
experimental, mostrando que o pH baixo (menor a 4.0) reduz levemente o conteúdo de α-
hélices mas facilita a produção de estruturas estendidas do tipo fitas-β na cauda flexível, que
irão se nuclear nas fitas-β nativas (ALONSO et al., 2001; DEMARCO & DAGGETT, 2005).
Alguns dos estudos sugerem que para afetar a estrutura do domínio C-terminal, condições de
desnaturação suave por agentes químicos devem atuar em conjunto com o pH ácido,
resultando na conversão de estruturas nativas de α-hélice da PrP em estruturas secundárias do
tipo fitas-β, consistentes com as observadas na PrPSc (SWIETNICKI et al., 1997;
HORNEMANN & GLOCKSHUBER, 1998). De fato, um estudo que submeteu frações de
PrPC isolada de cérebros humanos sadios a condições de desnaturação química leve e pH 3.5,
mostrou uma conversão dos monômeros solúveis em agregados insolúveis, mas que não
foram resistentes a proteases (ZOU & CASHMAN, 2002). Cabe destacar, que a análise destes
estudos apresenta o pH 4.5, aproximadamente, como um ponto crítico a partir do qual maiores
acidificações do meio disparam as alterações citadas. De fato, tanto regiões caveolares da
membrana plasmática quanto organelas endocíticas, por onde a PrPC trafega normalmente e
onde o pH se aproxima a este valor (PRADO et al., 2004; LINDEN et al., 2008), foram
postulados como sítios para a conversão da PrPC em PrPSc (BORCHELT et al., 1992;
ANDERSON, 1998); porém, a necessidade de desnaturação por agentes químicos para
24
disparar a transição estrutural ainda deve ser correlacionada com um fator fisiológico.
1.1.3 SOBRE A FUNÇÃO DA PrPC NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Após a associação da PrPC às TSEs (BOLTON et al., 1982) e a proposta dos príons
como agentes patogênicos infecciosos (PRUSINER et al., 1982), grandes esforços foram
direcionados para a compreensão do inédito mecanismo de replicação dos príons e do
subseqüente desenvolvimento da enfermidade. Este processo acabou atuando em detrimento
da análise da função fisiológica da PrPC (MARTINS et al., 2002), sendo que até hoje a função
desta proteína ainda é intensamente discutida (revisto por LINDEN et al., 2008; AGUZZI et
al., 2008).
Passaram-se aproximadamente dez anos após a identificação da PrPC até que fossem
feitas as primeiras tentativas importantes de estudar sua funcionalidade, através da geração de
animais transgênicos nulos para o gene Prnp. A criação das primeiras cepas de camundongos
Prnp-/- sugeriu que a PrPC não seria necessária para o desenvolvimento embrionário e pós-
natal, já que a análise inicial dos animais evidenciou uma marcada falta de fenótipos
anatômicos ou comportamentais (BÜELER et al., 1992; MANSON et al., 1994)
acompanhada, no entanto, da impossibilidade destes de replicar PrPSc e desenvolver a
patologia após serem infetados com extratos de cérebros doentes (BÜELER et al., 1993;
BRANDNER et al., 1996). Mecanismos compensatórios ativados durante o desenvolvimento
poderiam estar mascarando a conseqüência funcional da ausência da PrPC nestes animais
transgênicos, porém, a deleção condicional da PrPC dos neurônios de camundongos adultos
não resultou em mudanças histopatológicas 13 meses depois (apesar de que, como veremos
mais adiante, estes animais exibirem alterações da excitabilidade neuronal) (MALLUCCI et
25
al., 2002). Este cenário potencialisou ainda mais o campo de estudo da patologia dos príons e
a hipótese de ganho de função tóxica da PrPSc para explicar a neurodegeneração característica
das TSEs, sem prover indícios conclusivos da ação fisiológica da PrPC e do envolvimento da
perda de função da PrPC na patogênese. Porém, como foi explicado acima, a hipótese de
ganho da função tóxica da PrPSc por si só não parece ser suficiente para a compreensão total
da fenomenologia das TSEs, e alguma função relevante para a PrPC é sugerida pelo fato de
que vários segmentos de sua seqüência são altamente conservados em diferentes espécies
(WOPFNER et al, 1999).
Durante os últimos anos, a análise minuciosa de processos fisiológicos pontuais, tanto
em animais transgênicos para a PrPC quanto em culturas de células in vitro, resultou
extremamente prolífica enquanto a produção de informação funcional desta proteína.
Diversos ligantes da PrPC foram identificados (revisto por LINDEN et al., 2008), dentre os
quais destacamos alguns na Figura 6.
Inclusive, hoje em dia a evidência acumulada apresenta um panorama complexo de
múltiplos achados que pareceriam estar pouco relacionados. Uma visão unificada destes
dados sugere que a PrPC forma parte de uma plataforma dinâmica da superfície celular que
integra módulos sinalizadores através de interações seletivas com vários ligantes e vias
sinalizadoras transmembrana que, por sua vez, são traduzidas em conseqüências de amplo
espectro tanto para a fisiologia quanto para o comportamento (LINDEN et al., 2008). A perda
ou perturbação destes mecanismos sinalizadores é, provavelmente, instrumental para a
patogênese das TSEs. A seguir, discutiremos algumas das funções atribuídas à PrPC.
26
Figura 6. Ligantes da PrPC. A seqüência traduzida da proteína príon é representada em forma de bastonete, onde seus domínios mais importantes são de acordo ao código apresentado acima à direita. As estrelas amarelas indicam a posição dos resíduos que podem ser glicosilados. Cada ligante é indicado junto com o correspondente segmento de aa que contém o domínio de ligação na PrPC murina. GAG, glicosaminoglicanos; HS, heparan sulfato; LRP1, proteína relacionada ao receptor de lipoproteínas de baixa densidade; LRP, proteína precursora do receptor de laminia; LR, receptor de laminina; Pint1, interator da proteína príon 1; CK2, caseína cinase 2; Grb, proteína ligante do receptor de fatores de crescimento; SynIb, sinapsina Ib; APLP1, proteína similar a precursor amilóide; Nrf2, fator 2 relacionado ao fator nuclear E2; GASP, proteína distribuidora associada ao receptor acoplado à proteína G; HnRNP, ribonucleoproteína nuclear heterogênea; AldC, aldolase C/zebrina. Dados obtidos com a PrPC humana, de hamster ou bovina foram transpostos às seqüências murinas homólogas. (Adaptado de LINDEN et al., 2008).
1.1.3.1 INTERAÇÃO COM COBRE E ESTRESSE OXIDATIVO
Uma função na qual a PrPC foi repetidamente implicada é a de transporte e
metabolismo de íons de cobre e proteção contra o estresse oxidativo (revisto por MILHAVET
& LEHMANN, 2002; ROUCOU & LEBLANC., 2003).
27
O cobre é um dos ligantes identificados da PrPC (BROWN et al., 1997a), mas o real
papel fisiológico desta interação ainda é controverso. Estudos in vitro do domínio de
octapeptídeos PrP51-90 demonstraram que esta seqüência liga estritamente Cu2+ dentre outros
íons metálicos em uma interação cooperativa que envolve quatro íons de Cu2+ (HORNSHAW
et al., 1995; STOCKEL et al., 1998; VILES et al., 1999), mas existe evidência de interações
de menor afinidade com outros íons metálicos na PrPC inteira (JACKSON et al., 2001; CHOI
et al., 2006). A afinidade destas interações, mediadas pela cauda N-terminal da PrPC, foram
estimadas dentro da faixa micromolar baixa (MILLHAUSER, 2007). Ao mesmo tempo,
também foram identificados sítios de coordenação de Cu2+ em regiões mais C-terminais,
especificamente nas histidinas 96 e 111 (JACKSON et al., 2001; JONES et al., 2004).
Recentemente foi descrito que, na presença de baixas concentrações de Cu2+, existe um modo
de coordenação distinta que envolve múltiplas histidinas e permite a proteína se ligar a dois
Cu2+ com afinidade na faixa nanomolar (WELLS et al., 2006a, 2006b). A interação com Cu2+
tem conseqüências estruturais para a proteína príon, já que a conformação da PrPC é alterada
pela interação (MIURA et al., 1996; STOCKEL et al., 1998; VILES et al., 1999; QIN et
al., 2000; JACKSON et al., 2001) e o enovelamento da PrP recombinante é afetado pela
presença destes íons (BROWN et al., 1999; WONG et al., 2000, JONES et al., 2004).
A ligação de Cu2+ pela proteína príon induz robusta internalização endocítica da
proteína residente na superfície celular (PAULY & HARRIS, 1999; PERERA & HOOPER,
2001). É interessante notar que a ligação é dependente do pH, sendo a afinidade maior em pH
neutro (WHITTAL et al., 2000; MIURA et al., 2005). Estes dados seriam consistentes com a
PrPC desenvolvendo uma ação quelante ou de transporte de cobre, já que a proteína poderia
ligar Cu2+ na superfície celular e posteriormente liberá-lo dentro de endossomos ácidos. Esta
possibilidade é revestida de importância pelo cobre ser um elemento celular essencial, mas
que pode se tornar extremamente tóxico quando em excesso devido à atividade pró-oxidante
28
de seus íons, que geram espécies reativas de oxigênio (ROS).
Consistente com esta hipótese, uma função atribuída por vários grupos à proteína
príon é a proteção contra estresse oxidativo. Foi mostrado que células resistentes a estresse
oxidativo apresentavam níveis elevados de PrPC (BROWN et al., 1997b). Culturas de
neurônios PrP-/- são mais suscetíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio do que
células selvagens, e este efeito pode ser bloqueado ao tratar as culturas com o peptídeo PrP59-
91 (WHITE et al., 1999). Existe controvérsia sobre o envolvimento neste processo da atividade
Cu/Zn superóxido dismutase (SOD). Por um lado, um grupo sugeriu uma diminuição da
atividade SOD em neurônios PrP-/- (BROWN et al., 1997c), enquanto outro falhou na
tentativa de observar tal fenômeno (WAGGONER et al., 2000). Por outro lado, a evidência de
que a PrP recombinante enovelada na presença de Cu2+ apresenta atividade SOD (BROWN
et al., 1999) foi contrariada por outros estudos (SAKUDO et al., 2003; JONES et al., 2005).
Em suma, a ligação PrPC:Cu2+ parece proteger células contra o estresse oxidativo, mas
os mecanismos envolvidos não foram esclarecidos.
1.1.3.2 ATIVIDADE SINÁPTICA E EXCITABILIDADE NEURONAL
A presença da PrPC em terminais pré e pós-sinápticos foi confirmada por estudos de
imunomarcação em microscopia eletrônica e fracionamento de sinaptossomos (FOURNIER et
al., 1995; SALÈS et al., 1998; HERMS et al., 1999; HAEBERLE et al., 2000). Além disso, a
deposição da PrPSc em terminais sinápticos também foi confirmada (TATESHI et al., 1996),
possivelmente causando a desorganização ou perda sináptica que caracterizam as doenças por
príon (revisto por AGUZZI et al., 2008).
As análises de localização da PrPC podem ser correlacionadas com estudos
29
eletrofisiológicos realizados em fatias hipocampais de camundongos PrP-/-, que mostraram
uma significativa diminuição da potenciação de longo prazo (LTP) das sinapses
glutamatérgicas da via CA3-CA1, concomitante com uma redução da inibição rápida mediada
pelo receptor GABAA (COLLINGE et al., 1994; MANSON et al., 1995; WHITTINGTON et
al., 1995). Ainda mais, o fenótipo destes animais nulos para PrPC foi resgatado pela expressão
de um transgene que codifica a PrPC (WHITTINGTON et al., 1995). Por outro lado, a
expressão de PrPC também suprime a redução de correntes de K+ ativadas por Ca2+
observada
em animais PrP-/- (HERMS et al., 2001). Além disso, quando comparados com animais
selvagens, camundongos PrP-/- apresentaram maior sensibilidade a convulsões (WALZ et al.,
1999). Em marcado contraste, um estudo realizado em fatias hipocampais de camundongos
nulos para PrP não encontrou diferenças na excitabilidade neuronal, inibição sináptica,
potencial de reversão dos potenciais pós-sinápticos inibitórios ou LTP (LLEDO et al., 1996),
ou ainda observaram aumento, e não redução, da transmissão sináptica glutamatérgica no giro
denteado de animais PrP-/- (MAGLIO et al., 2004, 2006). Porém, esta última observação não
refuta os estudos citados acima que observaram uma redução da LTP de sinapses
glutamatérgicas na área CA1, já que os mecanismos moleculares de LTP do giro denteado e
da área CA1 são distintos (MALENKA et al., 2004).
Também existem trabalhos que correlacionam o nível de expressão da PrPC com a
excitabilidade neuronal. Neurônios derivados de camundongos nulos para PrP apresentam
tanto uma menor resistência ao input elétrico quanto à ausência de correntes hiper-
polarizantes pós-despolarização (IAHP), dois efeitos opostos com relação à excitabilidade
neuronal (COLLING et al., 1996). Deleções condicionais do Prnp em camundongos com 12
semanas de vida pós-natal também resultam em correntes IAHP lentas nos neurônios
hipocampais da área CA1, favorecendo a excitabilidade neuronal (MALLUCCI et al., 2002).
Como a depleção de PrPC foi realizada durante a vida adulta destes animais, o efeito
30
observado deve-se a uma disfunção sináptica e não um déficit do desenvolvimento.
A análise destes diversos estudos permite chegar à conclusão de que a PrPC pode ter
efeitos tanto estimuladores quanto inibidores da função sináptica, dependendo da região do
sistema nervoso central e do tipo de neurotransmissor envolvido.
1.1.3.3 CONTROLE DA SOBREVIVÊNCIA NEURONAL
Um fato a ser destacado é que existe evidência de que a PrPC exerce uma função
reguladora da sobrevivência celular (revisto por ROUCOU & LEBLANC, 2005; LINDEN et
al., 2008). Esta atividade é altamente relevante, pois as TSEs são caracterizadas por uma
extensa morte neuronal.
Os primeiros indícios que sugerem que a PrPC regula eventos neuroprotetores, são
dados pela análise da sensibilidade à morte celular induzida por privação de soro em
linhagens de células neurais derivadas de camundongos PrP-/-. Estes neurônios se mostraram
mais sensíveis à apoptose do que neurônios de camundongos selvagens, sendo que a
transfecção do Prnp nas células nulas para PrPC impediu a apoptose (KUWAHARA et al.,
1999). A morte apoptótica de neurônios fetais humanos em cultura induzida pela
microinjeção de Bax é resgatada pela co-injeção de Prnp, e a inibição deste último gene não
induz morte celular, mas potencializa o efeito degenerativo de Bax (BOUNHAR et al., 2001).
Alguns estudos apresentam evidência de que a expressão da PrPC tem efeitos neuroprotetores
durante insultos hipóxicos isquêmicos em cérebros in vivo (WEISE et al., 2004; SHYU et al.,
2005). Como veremos em detalhe mais adiante (Seção 1.3), a interação da PrPC com a co-
chaperona hop/STI-1 induz a transdução de sinais neuroprotetores que resgatam da apoptose
tanto neurônios (ZANATA et al., 2002; CHIARINI et al., 2002; LOPES et al., 2005) quanto
31
astrócitos (ARANTES et al., 2009). Também foi sugerido que a PrPC residente na superfície
celular desenvolve um papel protetor em células granulares cerebelares através de interações
trans heterofílicas (CHEN et al., 2003). As isoformas transmembrana da PrPC foram
associadas a eventos neurodegenerativos (HEDGE et al., 1998), já sua isoforma citosólica foi
associada a eventos tanto protetores (ROUCOU et al., 2003) quanto degenerativos (MA et al.,
2002).
Porém, o efeito ambivalente da proteína príon sobre a sobrevida neuronal não é uma
característica exclusiva da versão citosólica. Foi descrito que a superexpressão transgênica da
PrPC em camundongos provoca um fenótipo que apresenta neurodegeneração do sistema
nervoso central e periférico (WESTAWAY et al., 1994b). Trabalhos realizados em distintas
linhagens celulares sugerem que o nível de expressão da PrPC potencia a morte celular
dependente da caspase-3 (PAITEL et al., 2002, 2003, 2004). Além disso, a ligação cruzada da
PrPC induzida por anticorpos monoclonais que reconhecem epítopos de dentro do segmento
PrP95-105 provoca morte celular no hipocampo e cerebelo de camundongos, enquanto
anticorpos que reconhecem a região PrP113-157 não produziram efeitos observáveis
(SOLFOROSI et al., 2004). Finalmente, o peptídeo PrP106-126 que corresponde ao domínio
hidrofóbico da PrPC, é utilizado como modelo de indução de neurotoxicidade, já que provoca
o aparecimento de sinais característicos de apoptose (BURKLE et al., 1999; SAEZ-VALERO
et al., 2000). O efeito neurotóxico desse peptídeo em culturas de neurônios é dependente da
expressão de PrPC e da presença de células da microglia que, uma vez ativadas pelo peptídeo,
liberam substâncias neurotóxicas, como ROS (BROWN et al., 1996).
Em conclusão, a PrPC parece ser um elemento crítico de uma rede de sinalização que
controla a sensibilidade à morte celular programada, com efeitos finais dependentes do tipo
celular envolvido. Provavelmente o resultado pró- ou anti-apoptótico do engajamento da PrPC
deve ser ditado pela disponibilidade de seus ligantes, determinando assim as vias
32
sinalizadoras que serão ativadas (LINDEN et al., 2008).
1.1.3.4 DIFERENCIAÇÃO E ADESÃO CELULAR
Estudos da regulação da expressão e localização da PrPC em neurônios em
desenvolvimento produziram resultados contraditórios, e não foram capazes de atribuir uma
função clara a esta proteína durante a diferenciação neuronal. Existem trabalhos sugerindo
que a PrPC é superexpressa durante o desenvolvimento de precursores neuronais (STEELE et
al., 2006) e que, durante o desenvolvimento do cérebro de hamsters, a proteína se desloca dos
axônios para regiões sinápticas (SALÈS et al., 2002), onde poderia ter um papel no
endereçamento axonal e na sinaptogênese. Entretanto, um estudo realizado com neurônios
hipocampais confirmou a regulação da expressão da PrPC durante o desenvolvimento, mas
não observou deslocamentos da proteína, nem confirmou sua localização sináptica (GALVAN
et al., 2005). Mesmo assim, a PrPC deve ter um papel na diferenciação neuronal, já que,
comparados com neurônios selvagens, culturas de neurônios hipocampais derivados de
camundongos nulos para PrP apresentam neuritos mais curtos, e este fenômeno pode ser
revertido pela transfecção do Prnp (KUWAHARA et al., 1999).
Esta função é apoiada pela evidência da ligação de alta afinidade da PrPC à laminina.
A interação dessas proteínas está envolvida na neuritogênese, induzida por NGF, de células
PC-12 que crescem sobre substratos de laminina (GRANER et al., 2000a, 2000b). O mesmo
grupo demonstrou recentemente outra interação entre a PrPC e componentes da matriz
extracelular, com conseqüências sobre a diferenciação neuronal: a PrPC liga a vitronectina
induzindo crescimento axonal em gânglios da raiz dorsal de camundongos, e esta sinalização
parece ser compensada em neurônios PrP-/- por mecanismos dependentes de integrinas (HAJJ
33
et al., 2007). Ao mesmo tempo, existem diversos indícios de que a PrPC mantém interações
heterofílicas cis e trans (GAUCZYNSKI et al., 2001; LEGNAME et al., 2002; CHEN et al.,
2003; SANTUCCIONE et al., 2005; KANAANI et al., 2005), podendo resultar em um
aumento da sinaptogênese e do crescimento dendrítico e axonal (CHEN et al., 2003;
SANTUCCIONE et al., 2005; KANAANI et al., 2005).
A PrPC também liga duas proteínas transmembrana envolvidas na diferenciação
celular. Uma destas interações é mantida com o receptor de laminina (LRP) e/ou a presumível
isoforma madura do receptor de laminina (LR) (RIEGER et al., 1997; GAUCZYNSKI et al.,
2001), e a interface de ligação foi mapeada nos segmento PrP143-178 (envolvendo a α-hélice 1
e a alça adjacente) e LRP161-179 (HUNDT et al., 2001). A funcionalidade desta interação ainda
não foi esclarecida, mas foi sugerido que o LRP atuasse como um receptor que regulasse a
internalização da PrPC (GAUCZYNSKI et al., 2001). A outra interação envolve a molécula de
adesão celular neuronal (N-CAM). Foi demonstrado que a N-CAM possui dois sítios de
ligação que abrangem as fitas-β C e C’ nos seus dois domínios FNIII consecutivos, e na PrP a
interface de interação reside em um segmento descontinuo que envolve parte da cauda N-
terminal e, novamente, a α-hélice 1 junto com a alça adjacente (PrP23-88 e PrP141-176,
respectivamente) (SCHMITT-ULMS et al., 2001). Esta interação se desenvolve na superfície
celular de neurônios hipocampais, e promove crescimento neurítico através do recrutamento,
dependente da PrPC, da N-CAM às balsas lipídicas e a ativação da tirosina cinase não
receptora FYN (SANTUCCIONE et al., 2005). A ativação da FYN pela ligação da PrPC com
anticorpos divalentes também foi demonstrada nas linhagens celulares 1C11 e PC12, em um
mecanismo dependente de caveolina (MOUILLET-RICHARD et al., 2000) que estimula a via
RAS-RAF, levando à fosforilação transiente da ERK (PANTERA et al., 2009). Porém ainda
resta esclarecer a relevância biológica deste último modelo de ativação.
Finalmente, como veremos mais adiante (Seção 1.3), a interação entre PrPC e a
34
hop/STI1 promove neuritogênese de neurônios hipocampais em cultura (LOPES et al., 2005)
e diferenciação de astócitos em cultura (ARANTES et al., 2009).
1.1.3.5 COMPORTAMENTO
Vários trabalhos abordaram o papel da PrPC no comportamento e em funções mais
sistêmicas do SNC que, provavelmente, estão relacionadas ao papel da PrPC na função
sináptica e na excitabilidade neuronal. Sem entrar em detalhes dos trabalhos, podemos
mencionar alguns importantes resultados. Animais PrP-/- apresentam alterações do padrão
locomotor, tanto durante a exploração de novos ambientes (ROESLER et al., 1999), quando
sob o efeito de drogas psicotrópicas que afetam sistema glutamatérgico (COITINHO et al.,
2002), ou após ser submetidos a estresse psíquico ou físico (NICO et al., 2005). Estes animais
também demonstram alterações no ciclo sono-vigília (TOBLER et al., 1996, 1997; HUBER et
al., 1999, 2002). Finalmente, animais PrP-/- apresentam deficiência de aprendizado espacial
dependente do hipocampo (CRIADO et al., 2005), e a retenção de memórias de curto e longo
prazo destes animais é afetada, mas somente quando os animais alcançam uma idade
avançada (COITINHO et al., 2003). Consistente com esta evidência, a interrupção da
interação da PrPC com a laminina (COITINHO et al., 2006) ou com a hop/STI1 (COITINHO
et al., 2007) no hipocampo também perturba o processamento mnemônico.
1.2 A PROTEÍNA HOP/STI1
A proteína hop/STI1 foi originalmente identificada em Saccharomyces cerevisiae
35
como uma proteína superexpressa em eventos estressantes relacionados a choques térmicos
(NICOLET & CRAIG, 1989), pelo que recebeu o nome de stress-inducible protein 1 (STI1).
Posteriormente foi reconhecido que ela tem homólogos em outras espécies, tais como
humanos, ratos, camundongos, insetos, plantas, parasitas e vírus (revisto por ODUNUGA et
al., 2004). Enquanto STI1 identifica o homólogo de levedura, o de mamíferos é referido
usualmente por HSP70-HSP90 organizing protein (hop), já que o papel mais conhecido desta
proteína é o de co-chaperona adaptadora para a formação do complexo de chaperonas HSP70-
HSP90 pertencentes à família das proteínas de choque térmico (heat shock proteins, HSPs)
(SMITH et al., 1993; CHEN et al., 1996; DITTMAR et al., 1996; CHEN & SMITH, 1998).
Em conseqüência, ambos os nomes (hop e STI1) tem sido usados na literatura, de forma não
consistente, para indicar a proteína, pelo que optamos por referir-nos a ela como hop/STI1.
A seguir, vamos rever aspectos estruturais e funcionais desta proteína.
1.2.1 SOBRE A ESTRUTURA DA HOP/STI1
A hop/STI1 tem um peso molecular de 66 kDa e uma seqüência de 543 aa que não
sofre alterações pós-traducionais. Ela possui nove motivos estruturais de tetratricopeptídeos
repetidos (TPRs), formados por uma sequência consenso de 34 aa. Estes nove motivos estão
agrupados em três domínios globulares TPR denominados TPR1, TPR2a e TPR2b, sendo que
cada um destes domínios contém três repetições consecutivas de motivos TPR. O domínio
TPR1 ocupa o N-terminal da proteína, e os domínios TPR2a e TPR2b são interconectados por
um pequena cadeia na região mais próxima ao C-terminal (Fig. 7). A análise de proteínas
mutantes indicou que o domínio TPR1 é responsável pela interação com a seqüência C-
terminal da HSP70, e que os domínio TPR2a e TPR2b podem ligar a HSP90, também através
36
da seqüência C-terminal desta última (CHEN et al., 1996; LASSLE et al., 1997; DEMAND et
al., 1998; YOUNG et al., 1998; CARRELLO et al., 1999). As caudas C-terminais dos
membros das famílias de HSP70 e HSP90 possuem a seqüência consenso EEVD, e foi
demonstrado que este motivo é reconhecido eletrostaticamente pelos domínios TPR,
explicando a conservação evolutiva desta seqüência. Porém, TPR1 e TPR2a reconhecem
especificamente HSP70 e HSP90, respectivamente, devido a efeitos hidrofóbicos que
envolvem resíduos upstream da cauda EEVD das HSPs (SCHEUFLER et al., 2000).
Figura 7. Diagrama esquemático da disposição dos domínios da proteína hop/STI1. Os domínios da hop/STI1 são destacados como caixas coloridas e as seqüências que ligam estes domínios são apresentados como segmentos verdes. Os resíduos iniciais e finais são indicados embaixo de cada domínio. O diagrama é esquemático e não respeita escalas.
Proteínas constituídas por repetições em série destes domínios TPR têm sido
associadas à formação de complexos multiprotéicos, pois apresentam estruturas altamente
ricas em α-hélices dispostas de forma tal de delinear um canal anfipático que pode acomodar
cadeias complementares de proteínas alvo (revisto por BLATCH & LASSLE, 1999). Análises
cristalográficas confirmam que este mecanismo é válido para a hop/STI1. O domínio TPR2a
foi cristalizado em complexo com um peptídeo de 5 aa que mimetiza a cauda C-terminal da
HSP90, e o domínio TPR1 com um peptídeo 12 aa que corresponde à cauda C-terminal da
HSC70, uma chaperona 85% homologa à Hsp70 e que, diferentemente desta última, não é
somente expressa em casos de estresse, mas constitutivamente (SCHEUFLER et al., 2000).
Nos modelos obtidos podemos observar os domínios TPR como estruturas globulares ricas
em α-hélices que criam um sulco onde os peptídeos se inserem de forma estendida (Fig. 8).
37
Figura 8. Estrutura dos domínios TPR1 e TPR2a. São apresentadas, em representações cartoon, duas orientações dos domínios TPR1, (A) e (B), e TPR2a, (C) e (D). Ambos os domínios foram cristalizados em complexo com peptídeos das caudas C-terminais de chaperonas que eles reconhecem especificamente. Cada motivo TPR forma duas α-hélices antiparalelas, e ambos domínios apresentam uma α-hélice C-terminal adicional formada por segmentos que não consituem os motivos (Adaptado de SCHEUFLER et al., 2000).
A hop/STI1 também possui dois domínios menores, ricos em repetições de aspartato e
prolina, conhecidos como domínios DP1 e DP2 (CARRIGAN et al., 2004) (Fig. 7). Para estes
domínios, assim como para os segmentos que conectam os domínios globulares da hop/STI1,
não existe informação estrutural.
Tampouco existe modelo de alta resolução da proteína inteira, mas, recentemente, um
estudo realizou medidas de SAXS para o homólogo humano da hop/STI1 (ONUOHA et al.,
2008). Pela interpretação de parâmetros estruturais (raio de giro, distância máxima
intramolecular) de proteínas mutantes truncadas, os autores sugerem que a hop/STI1 humana
se apresenta em solução como um dímero. Isto os levou a criar um modelo da hop/STI1,
impondo simetria P2, e modelando a interface de dimerização por homologia à proteína
GlcNac, uma proteína dimérica rica em domínios TPR (JINEK et al., 2004). O modelo obtido
apresenta um dímero de hop/STI1 com uma estrutura em forma de borboleta (Fig. 9). Porém,
38
existe controvérsia sobre o estado oligomérico de homólogos da hop/STI1. Estudos de
hop/STI1 de levedura (PRODROMOU et al., 1999; FLOM et al., 2007) e hop humana
(CARRIGAN et al., 2004) sugeriram que a proteína é dimérica. Não obstante, o único estudo
que analisou a hop/STI1 murina (a proteína que será usada no presente trabalho), purificada
de três formas distintas, encontrou moléculas monoméricas em duas dos três tipos de
purificações (VAN DER SPUY et al., 2001).
Figura 9. Modelos de baixa resolução da hop/STI1 humana, obtidos por análise de dados de SAXS. Linha superior: modelo do tipo rigid-body modeling, obtido com o programa BUNCH, da hop/STI1 humana. São apresentados os domínios TPR1 (amarelo), DP1 (rosa), TPR2a (vermelho), TPR2b (verde), DP2 (azul). Linha inferior: superposição deste modelo com modelos volumétricos obtidos com o programa GASBOR. Em cada linha são apresentadas três orientações dos modelos. (Adaptado de ONUOHA et al., 2008)
1.2.2 SOBRE A FUNÇÃO DA HOP/STI1
A hop/STI1 poder ser encontrada principalmente no núcleo celular e no citoplasma e,
em menor quantidade, adsorvida à face extracelular da membrana plasmática (ZANATA et al.,
2002; ODUNUGA et al., 2004). No entanto, também foi recentemente demonstrado que ela
pode ser secretada constitutivamente para o meio extracelular por culturas de células de
fibrosarcoma (EUSTACE et al., 2004), glioblastoma (ERLICH et al., 2007) e astrócitos
39
(LIMA et al., 2007). O mecanismo dessa secreção ainda não foi estabelecido, dado que sua
seqüência não contém um peptídeo sinalizador para secreção.
As características de suas funções intracelulares como co-chaperona são bem
descritas, tanto quanto outras funções independentes, como a de modulação de mecanismos
de sinalização intracelular (para uma revisão ver ODUNUGA et al., 2004). Também existe
evidência para funções extracelulares da hop/STI1, tanto dependentes quanto independentes
da interação com a PrPC. Vamos rever brevemente os estudos mais relevantes que abordam
esta questão.
1.2.2.1 ATIVIDADES INTRACELULARES
As chaperonas constituem uma família de proteínas altamente conservada que
desenvolvem funções cruciais da fisiologia celular, já que são facilitadoras do correto
enovelamento das proteínas sintetizadas, evitando o desencadeamento de mecanismos
patogênicos. Elas podem atuar constitutivamente na tradução de proteínas. Enquanto a
tradução protéica não está completa, as cadeias polipetídicas não enoveladas ficam expostas à
interações com outras cadeias em síntese e há superpopulação do citosol, podendo induzir à
agregação. As chaperonas reconhecem especificamente segmentos hidrofóbicos e/ou
esqueletos protéicos ainda na via de enovelamento nativa, impedindo interações impróprias
dentro e entre polipeptídeos e evitando o mal-enovelamento (revisto por HARTL & HAYER-
HARTL, 2002). Elas podem também atuar no re-enovelamento de proteínas que sofreram
desenovelamento como resultado de estresse celular, transporte intracelular, degradação de
proteínas e transdução de sinais (revisto em MUCHOWSKI & WACKER, 2005). Por
exemplo, o estresse induzido pelo aumento da temperatura ativa um programa genético,
40
conhecido como resposta de choque térmico, caracterizado pelo aumento da síntese de
chaperonas não constitutivas da família HSP, de forma a combater o dano protéico resultante
do estresse. As chaperonas exercem sua função facilitadora da conformação ótima dos seus
substratos através de ciclos de ligação e liberação do substrato, regulados pela sua atividade
ATPásica e pelo auxílio de co-chaperonas.
Devido à atividade de chaperonas, as proteínas de choque térmico desenvolvem
funções na proteção em distúrbios de enovelamento protéico, tais como as doenças
neurodegenerativas de Alzheimer, Parkinson e Huntington. Foi sugerido que o mecanismo de
proteção das chaperonas seja o direcionamento da agregação protéica à formação de fibras
inócuas, impedindo a formação de oligômeros intermediários tóxicos (MUCHOWSKI &
WACKER, 2005).
HSP70 estabiliza o enovelamento nativo de proteínas presentes na maior parte dos
compartimentos celulares (BUKAU & HORWICH, 1998) e HSP90 se encontra no citosol
onde, além de estabilizar proteínas mal-enoveladas, regula a atividade de enzimas
sinalizadoras como tirosina cinases e calcineurina (YOUNG & HARTL, 2002). Foi estimado
que 15 a 20% das proteínas atingem sua conformação nativa com a assistência da HSP70 e da
chaperona HSP40, sendo que uma fração destas também requer a participação da HSP90
(HARTL & HAYER-HARTL, 2002). Para a correta ação conjunta de HSP90 e HSP70, a
atividade coordenada de co-chaperonas catalisadoras e adaptadoras é crucial. Uma destas co-
chaperonas é a hop/STI1. Inicialmente, proteínas parcialmente enoveladas são direcionadas a
HSP70 pela HSP40, formando um complexo inicial que, para muitas proteínas, é suficiente
para atingir a conformação nativa. Quando a participação da HSP90 é requerida, a hop/STI1
(também denominada p60 em estudos iniciais) funciona como adaptadora para a aproximação
coordenada da HSP70 e a HSP90, através da ligação de seus domínios TPR às HSPs (SMITH
et al., 1993; CHEN et al., 1996; JOHNSON et al., 1998; YOUNG et al., 1998; SCHEUFLER
41
et al., 2000). A ligação da hop/STI1 com HSP70 é regulada pela atividade ATPásica desta
última (BUKAU & HORWICH, 1998). Além da função adaptadora da hop/STI1, ela modula
a atividade das chaperonas. A HSP90 se desliga das proteínas clientes após hidrólisar ATP
(OBERMANN et al., 1998; PRODROMOU et al., 1999). Esta atividade ATPásica da HSP90
é inibida por hop/STI1, através da interação desta última com o sítio de ligação de ATP da
HSP90 (PRODROMOU et al., 1999).
Finalmente, existe evidência de que as HSPs modulam diretamente vias de sinalização
intracelulares pela interação com componentes da via RAS/RAF (NOLLEN & MORIMOTO,
2002) e de vias reguladoras de mecanismos de morte celular programada (BEERE et al.,
2004), assim como com complexos transcricionais (YOUNG & HARTL, 2002). Também foi
demonstrado que a atividade do complexo HSP90-hop-HSP70 está envolvida na maturação
funcional de receptores de esteróides (revisto por PRATT & TOFT, 2003).
1.2.2.2 ATIVIDADES EXTRACELULARES DA HOP/STI1 INDEPENDENTES DA PrPC
Além das funções intracelulares da hop/STI1, existem vários trabalhos que
demonstram um papel desta proteína no meio extracelular (ZANATA et al., 2002; CHIARINI
et al., 2002; LOPES et al., 2005; COITINHO et al., 2006; ARRUDA-CARVALHO et al.,
2007; ERLICH et al., 2007; AMERICO et al., 2007; CAETANO et al., 2008; ARANTES et
al., 2009). Como veremos na seguinte seção, a maioria das funções demonstradas envolvem a
ação da PrPC, porém, dois estudos recentes, realizados em culturas de células ou explantes de
retina derivados de animais PrP-/-, demostraram que a hop/STI1 também exerce funções
fisiológicas independentes da PrPC. Na presente seção, vamos nos referir a estes estudos.
Foi sugerido que hop/STI1 está envolvida na modulação da proliferação e sobrevida
42
celular na retina de ratos em desenvolvimento, sem precisar da ação da PrPC (ARRUDA-
CARVALHO et al., 2007). Anticorpos policlonais contra a hop/STI1 (anti-hop/STI1)
bloquearam a morte induzida por axotomia de células da camada ganglionar e neuroblástica,
tanto em animais selvagens como nulos para PrPC, e sem envolver vias canônicas de
sinalização como a cAMP/PKA, ERK, PI3K ou PKC. Também foi observado que tratamento
com hop/STI1 ou anti-hop/STI1 produzem efeitos contrários sobre a proliferação celular das
retinas em desenvolvimento, sendo que o primeiro inibe a proliferação, e o segundo a
potencia. Novamente, estes fenômenos não envolvem a PrPC.
Em linha com esta última evidência, um outro estudo mostrou que culturas de
astrócitos tratadas com hop/STI1 também apresentam redução da proliferação celular
(ARANTES et al., 2009). O mecanismo subjacente depende da via de sinalização PKC, mas
independe da PrPC, já que foi observado tanto em culturas derivadas de animais selvagens
quanto nulos para PrPC.
1.3 A INTERAÇÃO PrPC:HOP/STI1 E SUA FUNCIONALIDADE
Para testar a hipótese de uma função neuroprotetora da PrPC, Chiarini e colaboradores
estudaram o efeito produzido pela interação entre a PrPC e um peptídeo de 16 aa,
denominado PrR, reconhecido previamente como um ligante da PrPC (MARTINS et al.,
1997). Naquele trabalho, foi observado que o tratamento de explantes de retinas de rato e
camundongo com o PrR reduz morte celular induzida por anisomicina, sendo que esse efeito
mostra-se ausente em animais nulos para PrP. A estimulação dos explantes com o peptídeo
ativa as vias de sinalização da PKA e da ERK, porém, a neuroproteção foi dependente
somente da primeira. Usando tanto os animais transgênicos mencionados acima, quanto
43
anticorpos anti-PrPC que bloqueariam o acesso à PrPC, bem como a liberação da PrPC da
superfície celular pela clivagem de sua âncora de GPI, foi demonstrado que o efeito protetor é
dependente da interação da PrPC com o peptídeo (CHIARINI et al., 2002). Assim, para que o
mecanismo protetor seja ativado, é necessária a presença da PrPC ancorada à membrana, onde,
por algum meio (possivelmente algum outro ligante), ela é capaz de ativar o sinal protetor.
Esses achados impulsionaram a procura de um ligante fisiológico da PrPC que fosse
mimetizado pelo PrR. Para isso, foi gerado um anticorpo contra o peptídeo PrR, que
identificou uma proteína de 66 kDa em western blots de géis bi-dimensionais. Após o
isolamento e seqüenciamento do spot, foi demonstrado que a proteína reconhecida pelo
anticorpo anti-PrR era a stress-inducible protein 1 (hop/STI1). Esta proteína foi observada co-
localizada com a PrPC na membrana celular e a ligação foi corroborada in vivo por
experimentos de co-imunoprecipitação. Através do uso de bibliotecas de peptídeos sintéticos
que reproduziam segmentos de ambas proteínas, foi demonstrado que a interface de interação
está contida nos segmentos PrP113-128 (na interface da cauda N-terminal com o domínio
globular) e hop/STI1230-245 (em uma alça do domínio TPR2a) (ZANATA et al., 2002) (Fig.
10). Cabe destacar que a interação PrPC:hop/STI1 gerou sinais neuroprotetores contra morte
celular induzida por anisomicina em explantes de retina de camundongos e ratos, similares
aos disparados pelo PrR (ZANATA et al., 2002). O tratamento dos explantes com o peptídeo
hop/STI1230-245 também foi capaz de produzir esse efeito (ZANATA et al., 2002), dependente
da ativação da via cAMP/PKA (Chiarini LB, dados não publicados). A partir destes estudos,
outros trabalhos confirmaram a neuroproteção produzida pela interação da hop/STI1 com a
PrPC.
44
Figura 10. Interface da ligação PrPC:hop/STI. São apresentadas, em representações cartoon, (A) o domínio globular da proteína recombinante murina, PrP121-231; (B) o domínio TPR2a da hop/STI1. Os respectivos sítios de ligação são destacados em vermelho (no caso da PrP, esta representação é parcial, já que o modelo do domínio globular é truncado no resíduo 121, enquanto a interface de ligação foi mapeada em PrP113-128).
Foi demonstrado que a hop/STI1 recombinante liga a PrPC na superfície celular de
neurônios hipocampais em cultura, ativando a via cAMP/PKA e protegendo contra morte
celular induzida por estaurosporina (LOPES et al., 2005). Trabalhando com culturas de
linhagens de células hipocampais, um estudo relatou que o peptídeo hop/STI1230-245 é capaz
de modular a atividade SOD da PrPC e, desta forma, aumentar a sobrevivência dos neurônios
(SAKUDO et al., 2005). Quando explantes PrP+/+ de retinas de ratos em desenvolvimento são
tratados com hop/STI1 recombinante, a morte celular induzida por axotomia de células da
camada neuroblástica é bloqueada, um efeito não observado em animais PrP-/- (ARRUDA-
CARVALHO et al., 2007). Finalmente, o tratamento com hop/STI1 recombinante também
bloqueia a morte celular de astrócitos selvagens, mas não dos nulos para PrP, novamente
através da via PKA (ARANTES et al., 2009).
Além desses efeitos protetores, a interação PrPC:hop/STI1 ativa outros mecanismos
relevantes para a fisiologia celular. No trabalho de Lopes e colaboradores, foi observado
também um efeito neuritogênico para esta interação quando se tratou culturas de neurônios
hipocampais com hop/STI1 recombinante. O efeito, que estava ausente em neurônios nulos
45
para PrPC, foi abolido pelo co-tratamento com anticorpos tanto para a PrPC como a hop/STI1
e mostrou-se dependente da presença do segmento hop/STI1230-245 na proteína recombinante.
Um dado interessante levantado por esse trabalho é que este efeito neuritogênico é
dependente da ativação da via das ERK. Consequentemente, este estudo demonstrou como a
interação da PrPC com a hop/STI1 ativa paralelamente as vias de cAMP/PKA e ERK, com
efeitos positivos sobre a neuroproteção e neuritogênese, respectivamente (LOPES et al.,
2005). O papel central da interação PrPC:hop/STI1 na diferenciação de astrócitos em cultura
também foi evidenciado (ARANTES et al., 2009).
Recentemente, um estudo avaliou a relevância da atividade endocítica para a
sinalização induzida pela interação PrPC:hop/STI1 e concluiu que ela é parcialmente
modulada pela endocitose (AMERICO et al., 2007; CAETANO et al., 2008). A interação das
duas proteínas na superfície celular induz a endocitose da PrPC, de maneira dependente de
dinamina. Ainda mais, a estimulação por parte da hop/STI1 de um mutante de PrPC
desprovido de atividade endocítica não ativou a via ERK, mas sim a PKA, indicando um
papel crucial da endocitose para a primeira via de sinalização (CAETANO et al., 2008).
Também foi sugerido que a interação da PrPC com a hop/STI1 tenha um papel na
regulação da proliferação celular. O estímulo com hop/STI1 recombinante aumentou
significativamente a proliferação de células de glioblastoma da linhagem A172 mas,
interessantemente, não teve efeito em células normais de glia. O efeito observado foi
modulado pelas vias da ERK e da PI3K, e foi anulado pelo co-tratamento com anticorpos para
PrPC (ERLICH et al., 2007).
Outra evidência sugere uma importante função para esta interação no processamento
de memórias em ratos. Coitinho e colaboradores usaram um paradigma de aprendizado
motivado por estímulos aversivos, e demonstraram que a perturbação da ligação da PrPC à
hop/STI1 no hipocampo prejudica a formação de memórias de curto prazo e a consolidação
46
de memórias de longo prazo. Por outro lado, a infusão intrahipocampal do peptídeo
hop/STI1230-245 favoreceu potentemente a performance mnemônica (COITINHO et al., 2007).
Finalmente, é interessante notar que camundongos transgênicos que expressam os
mutantes truncados PrP∆105-125 ou PrP∆94-134, ambas mutações que afetam a integridade da
interface de ligação da PrP para a interação com hop/STI1, apresentam neurodegeneração,
gliose, degeneração da mielina, atrofia e disfunções motoras, que culminam na morte dos
animais durante o primeiro mês de vida pós-natal (BAUMANN et al., 2007; LI et al., 2007).
É notável ainda que os animais não apresentaram agregados das PrP mutantes.
47
1.4 RACIONAL
As controvérsias acerca das funções fisiológicas da proteína príon persistem até hoje.
Entretanto, uma revisão compreensiva dos estudos funcionais da PrPC sugere que ela funciona
como uma plataforma dinâmica de montagem de complexos multiprotéicos de sinalização na
superfície celular (LINDEN et al., 2008). Uma das interações mantidas pela PrPC envolve a
hop/STI1. Como vimos, esta interação promove sinalização com efeitos positivos sobre a
proteção contra morte celular programada, a neuritogênese e a proliferação celular, através da
modulação das vias cAMP/PKA, ERK e PI3K, respectivamente. Desta forma, surge um
panorama no qual esta interação participa ativamente de importantes e múltiplos aspectos da
vida celular.
Porém, o(s) mecanismo(s) moleculares subjacentes a estes processos não estão
estabelecidos, sendo que diversas questões ainda devem ser esclarecidas. Entre elas, destaca-
se a incerteza de como este complexo, ligado à membrana celular e sem componentes
transmembrana, consegue promover transdução de sinais para o interior da célula. A
compreensão do papel sinalizador da PrPC exige novas estratégias de estudo, além da
identificação de respostas celulares.
O presente trabalho consiste de uma tentativa de ampliar esta compreensão, do ponto
de vista estrutural. A hipótese fundamental de trabalho é que a interação de hop/STI1 e PrPC
pode produzir alterações estruturais nestas proteínas que, por sua vez, sejam potencialmente
importantes para o recrutamento de outros parceiros moleculares capazes de transduzir sinais
para o ambiente intracelular.
48
2. OBJETIVOS
2.1 GERAL
• Usando proteínas recombinantes PrP e hop/STI1, analisar in vitro possíveis mudanças
conformacionais das proteínas, ativadas pela formação do complexo PrP:hop/STI1.
2.2 ESPECÍFICOS
• Confirmar a ligação das proteínas recombinantes pela técnica de anisotropia de
fluorescência.
• Realizar medidas de dicroísmo circular que nos permitam observar possíveis
alterações da estrutura secundária das proteínas.
• Analisar processos de enovelamento/desenovelamento modulados pela interação.
• Monitorar o ambiente químico dos resíduos aromáticos por técnicas de fluorescência
intrínseca, visando estudar o efeito da interação sobre a estrutura local das proteínas
• Obter informação sobre alterações das estruturas terciárias e quaternárias das
proteínas, através da realização de medidas de espalhamento de raios-X a baixo
ângulo.
49
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 REAGENTES
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. A água destilada foi filtrada e
deionizada por sistema de troca iônica para obtenção de elevado grau de pureza, satisfazendo
as exigências de água tipo I.
3.2 PURIFICAÇÃO DE PrP23-231 RECOMBINANTE
A purificação da proteína príon recombinante segue, em linhas gerias, o protocolo
sugerido por Zahn e colaboradores (ZAHN et al., 1997). Descreveremos brevemente o
procedimento.
O Dr. Ralph Zahn (Institut für Molekularbiologie und Biophysik, Eidgenossiche
Technische Hochschule, Suiza) nos cedeu, gentilmente, plasmídeos pRSET-A contendo a
sequência PrP23-231 murina, flanqueada no N-terminal por uma cauda de histidina adjacente a
um sítio de clivagem por trombina. Estes plasmídeos foram inseridos em E. coli (cepa BL21-
DE3) por eletroporação. Uma colônia isolada foi inoculada em 25 mL de meio Luria’s Broth
(LB) (Invitrogen) contendo 100 µg/ml de ampicilina. Este processo permite a seleção das
células corretamente transformadas, já que o plasmídeo confere resistência à ampicilina. O
inóculo cresceu a 37 ºC por aproximadamente 16 horas sob agitação orbital de 200 rpm.
Foram inoculados 4 ml da suspensão de bactérias em 800 ml de meio LB contendo 100 µg/ml
de ampicilina, sendo mantida a 37 ºC sob agitação orbital a 200 rpm, até que a cultura
50
atingisse a fase exponencial de crescimento (absorbância de 0.6 a 600 nm).
Neste ponto do crescimento, foi adicionado 1 mM de IPTG (β-D-tiogalactopiranosídeo
de isopropila) (Bioagency Biotecnologia), com o objetivo de induzir a expressão da proteína
PrP recombinante, uma vez que o promotor inserido no plasmídeo é controlado pela lactose.
Após deixar a cultura crescer a 37oC por 8 horas sob agitação orbital a 200 rpm, as bactérias
foram sedimentadas por meio de centrifugação a 6000 rpm a 4 ºC, por um período de 10
minutos (centrifuga HITACHI SCR 20B, rotor RPR-20.2). O sobrenadante foi descartado, e o
pellet resultante foi congelado em nitrogênio líquido e descongelado lentamente à temperatura
ambiente, começando assim o processo de lise.
O pellet foi ressuspendido em 70 ml de tampão G (cloreto de guanidina 6 M, fosfato
de sódio dibásico 100 mM, Tris-HCl 10 mM, glutationa reduzida 10 mM, pH 8.0), facilitando
a lise celular e permitindo desfazer corpos de inclusão, forma majoritária na qual a PrP
recombinante é encontrada quando superexpressa. Completamos a lise das bactérias
ressuspendidas com o auxílio de uma prensa de French (ThermoSpectronic): foram realizados
3 ciclos de lisado sob alta pressão (16.000 psi), mantendo a solução de bactérias em um
isopor com gelo para evitar o aquecimento excessivo.
A fim de separar as proteínas em solução dos fragmentos celulares, o lisado foi
centrifugado a 13000 rpm e 4 ºC, por um período de 30 minutos. O pellet foi descartado e o
sobrenadante foi incubado em um erlenmeyer com resina NTA agarose (Amersham
Bioscience) carregada com níquel e previamente equilibrada com tampão G, a temperatura
ambiente, por 30 minutos. Para eliminar as proteínas que não aderiram à resina, esta foi
centrifugada a 3000 rpm, por 3 minutos, e o sobrenadante foi descartado. Por duas vezes,
ressuspendemos a resina em tampão G e repetimos a centrifugação. Após descartar o
sobrenadante, a resina foi carregada em uma coluna C-10/40 (Pharmacia Biotech) e lavada
com 30 ml de tampão G. Como este tampão é altamente desnaturante, para permitir o re-
51
envolemento da PrP recombinante ligada à resina, lavamos esta última com um gradiente
linear lento (uma hora e meia de duração, aproximadamente) de 80 ml de tampão G e 80 ml
de tampão B (Tris-HCl 10 mM, fosfato de sódio dibásico 100 mM, pH 8.0). Após a
finalização do gradiente, a coluna foi lavada com 30 ml de tampão B e, em seguida, com 60
ml de tampão I (Tris-HCl 10 mM, fosfato de sódio dibásico 100 mM, imidazol 50 mM, pH
8.0), que permite eluir da coluna ligações inespecíficas. Para eluir a PrP aderida à resina, a
coluna foi lavada com 60 ml de tampão E (Tris-HCl 10 mM, fosfato de sódio dibásico 100
mM, imidazol 500 mM, pH 5.8) e o material eluído foi coletado em alíquotas de 1.5 ml cada.
Descartamos as alíquotas com valores de absorbância a 280 nm menores que 0.1. Para livrar-
nos do imidazol em excesso do tampão E, as alíquotas restantes foram dialisadas contra 5
litros de tampão fosfato de sódio 10 mM pH 6.4, durante um período de 16 h, a 4oC.
A PrP purificada e dialisada foi submetida a clivagem por α-trombina humana
(gentilmente cedida pelo Prof. Luis Mauricio Trambaioli da Rocha e Lima, Faculdade de
Farmácia, UFRJ) para a remoção da cauda N-terminal de histidina. Primeiramente, foi
realizado um teste de clivagem com uma pequena quantidade da PrP, em uma proporção
molar PrP:α-trombina de 1000:1 em tampão C (Tris-HCl 5 mM, pH 8.5), coletando-se
amostras do teste a cada hora, durante um intervalo de 4 horas. Estas amostras foram
submetidas à eletroforese em géis 15% de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-
PAGE), de forma de escolher o menor tempo no qual a proteína teve sua cauda clivada. A
clivagem da amostra total foi realizada em tampão C, durante o tempo sugerido pelo teste de
clivagem. Para separar a PrP da α-trombina, a amostra resultante da clivagem foi passada por
uma coluna de troca iônica de carboxi-metil celulose (SIGMA). A coluna foi eluida com um
gradiente linear de 80 ml de tampão C e tampão C contendo 500 mM de NaCl, durante uma
hora e meia, coletando o material eluído em alíquotas de 3 ml. As alíquotas foram dosadas por
absorbância a 280 nm e dialisadas contra 5 litros de água, por um período de 16 h.
52
Para confirmar a integridade e o correto enovelamento da proteína, foram realizados
ensaios de SDS-PAGE e dicroísmo circular. As amostras foram aliquotadas e guardadas a -20
oC.
3.3 PURIFICAÇÃO DE PrP95-231W98F RECOMBINANTE
O protocolo de purificação foi idêntico ao da PrP23-231, mas em vez da seqüência PrP23-
231 murina, o plasmídeo usado para a transformação continha a seqüência PrP95-231 murina,
com o triptofano 98 mutado por uma fenilalanina. Este plasmídeo foi construído pra este
trabalho pela Dra. Marilene H. Lopes, do Instituto Ludwig de São Paulo. Outra diferença foi
no momento de eluição da proteína ligada à resina de NTA agarose: dado que, em comparação
com PrP23-231, PrP95-231W98F apresenta uma menor afinidade pela resina, não foi usado tampão
I mas foi realizado um gradiente linear lento de tampão B e tampão E, e foram coletadas
amostras de 3 ml que foram posteriormente dosadas.
3.4 PURIFICAÇÃO DE HOP/STI1 RECOMBINANTE
Plasmídeos pTrcHis2 contendo a seqüência hop/STI11-543 murina, flanqueada no N-
terminal por uma cauda de histidina adjacente a um sítio de clivagem por trombina
(gentilmente cedidos pela da Dra. Vilma Martins do Instituto Ludwig de São Paulo) foram
inseridos em E. coli (cepa DH5α) por eletroporação.
Uma colônia isolada foi inoculada em 25 mL de meio LB contendo 50 µg/ml de
ampicilina. Este processo permite a seleção das células corretamente transformadas, já que o
53
plasmídeo confere resistência a ampicilina. O inóculo cresceu a 37 ºC por aproximadamente
16 horas sob agitação orbital de 200 rpm. Posteriormente, ele foi diluído 25 vezes em 1 litro
de LB contendo 50 µg/ml de ampicilina e a suspensão de bactérias foi mantida sob agitação
orbital a 37 ºC, até que a cultura atingisse a fase exponencial de crescimento (absorbância de
0.6 a 600 nm).
Neste ponto do crescimento, foi adicionado 1 mM de IPTG com o objetivo de induzir
a expressão da proteína hop/STI1 recombinante, uma vez que o promotor inserido no
plasmídeo é controlado pela lactose. Após 4 horas na presença de IPTG, as bactérias foram
sedimentadas por meio de centrifugação a 4000 x g, por 10 minutos, a 4 ºC. O sobrenadante
foi descartado, e o pellet foi ressuspendido em tampão de lise: 50 mM de tampão fosfato pH
8.0, 300 mM de cloreto de sódio, 10 mM de imidazol (SIGMA), 1mM de fluoreto de fenil
metil sulfonila - PMSF (SIGMA), 2 µg/ml de leupeptina, 2 µg/ml de aprotinina, 2 µg/ml de
pepstatina, 100 mM de ácido etilenodiaminotetracético – EDTA, e 1 mM de ditiotreitol –
DTT. As bactérias ressuspendidas foram lisadas sob alta pressão (16.000 psi), com o auxílio
da prensa de French.
A fim de separar as proteínas em solução dos fragmentos celulares, o lisado foi
centrifugado por 15 minutos a 14000 rpm, a 4 ºC. O pellet foi descartado e o sobrenadante foi
incubado com resina NTA agarose carregada com níquel e previamente equilibrada com
tampão de lise, sob agitação suave a 4 ºC, por aproximadamente 16 horas. Para que as
proteínas que não aderiram à resina fossem eliminadas, a resina foi centrifugada a 3500 rpm
por 3 minutos, a 4 ºC. O sobrenadante foi recolhido e a resina foi lavada duas vezes com
tampão de lise, e mais duas vezes com tampão de lavagem (50mM de tampão fosfato pH 8.0,
300 mM de cloreto de sódio e 50 mM de imidazol). A seguir, a resina foi transferida para uma
coluna e as proteínas ligadas à resina foram eluidas com tampão de eluição (50 mM de
tampão fosfato pH 8.0, 300 mM de cloreto de sódio, 500 mM de imidazol). O material foi
54
coletado em 20 frações de 1 ml cada. As frações contendo His6-hop/STI1 (identificadas
através da detecção da proteína pelo método de Bradford) foram dosadas e então dialisadas
contra TBS (20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5). Dada a instabilidade da hop/STI1, as
amostras não tiveram a cauda de histidina clivada.
A integridade e o correto enovelamento da hop/STI1 foram corroboradas por ensaios
de SDS-PAGE e dicroísmo circular. Foi possível observar no gel uma fração minoritária de
degradação, representada por múltiplas bandas de menor peso molecular. Todas as amostras
foram guardadas a -70 oC.
3.5 PEPTÍDEOS SINTÉTICOS
Os peptídeos PrP113-132 (113-GAAAAGAVVGGLGGYMLGSA-132) e hop/STI1230-245
(230-ELGNDAYKKKDFDKAL-245) foram sintetizados quimicamente por Neosystem
(NeoMPS, Estrasburgo, França). Eles foram diluídos em água e guardados a -20o C.
3.6 MARCAÇÃO COM FITC DE PrP23-231 RECOMBINANTE
PrP23-231 na concentração 0.2 mM foi marcada por incubação com 1 mM de
isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma) em tampão fosfato de sódio 10 mM, 150 mM
NaCl, pH 7.8, a temperatura ambiente, por 30 minutos. Após bloquear a reação com Tris 20
mM, FITC livre foi separado de PrP-FITC usando uma coluna Hitrap desalting (GE
Healthscience) equilibrada com o tampão usado durante a marcação. A marcação da PrP foi
confirmada por espectrofotometria de absorbância, de forma de observar as contribuições de
55
PrP e FITC para o espectro de absorbância. A eficiência de marcação foi calculada em ~0.26
mol de FITC-PrP por mol de PrP total. A baixa eficiência de marcação, provavelmente devida
ao pH usado durante a reação, é vantajosa porque diminui a chance de marcação múltipla de
moléculas de PrP, o que poderia resultar na transferência de energia entre fluoróforos ligados
a mesma proteína.
3.7 ELETROFORESE EM GÉIS EM CONDIÇÕES DESNATURANTES E NATIVAS
As amostras de proteína foram submetidas a eletroforese em géis de poliacrilamida
(PAGE), em densidades de 8% e 12.5%, dependendo da massa molecular das amostras
analisadas. Quando comparamos amostras em condições desnaturantes e nativas, não
inserimos dodecil sulfato de sódio (SDS) no gel de poliacrilamida nem no tampão de corrida,
e as amostras não foram fervidas. As amostras em condições nativas foram suspendidas em
tampões de amostra que não possuíam agentes desnaturantes. Já no caso de amostras em
condições desnaturantes, elas foram suspendidas em tampões de amostra contendo 1% β-
mercaptoetanol e 0.5% SDS.
3.8 ANISOTROPIA DE FLUORESCÊNCIA
As medidas foram realizadas em tampão Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7.4, a
temperatura ambiente. Foi utilizada uma concentração total fixa de PrP de 2 µM, sendo que
50 nM da proteína era FITC-PrP. Foram adicionadas quantidades crescentes de hop/STI1 e a
anisotropia de fluorescência foi medida em um fluorímetro Jasco FP-6300 (Jasco
56
Corporation), usando um comprimento de onda de excitação de 480 nm e observando a
emissão a 90o usando um filtro WG 3-69. Os polarizadores utilizados são do tipo Gland-
Thompson. Os valores de anisotropia de fluorescência foram calculados conforme a equação:
perpar
perpar
II
IIaAnisotropi
⋅+
−=
2 (1)
sendo Ipar e Iper as intensidades de emissão quando os polarizadores de detecção estão
orientados paralela e perpendicularmente à direção do polarizador de excitação,
respectivamente.
Para o cálculo da constante de dissociação Kd da ligação PrP:hop/STI1 recombinantes,
foi assumido um modelo para o equilíbrio de ligação entre monômeros de PrP e hop/STI1:
P + S ↔ PS (2)
onde P e S representam moléculas de PrP e hop/STI1 monoméricas, respectivamente,
e PS representa a uma molécula do complexo PrP:hop/STI1. Desta forma, a constante de
dissociação Kd deste modelo no equilíbrio seria:
Kd =P[ ]⋅ S[ ]
PS[ ] (3)
onde agora [P], [S] e [PS] são as concentrações molares das moléculas. Sabemos que a
totalidade das proteínas estão em estado monomérico ou formando complexo:
PTot[ ]= P[ ]+ PS[ ] (4)
57
STot[ ]= S[ ]+ PS[ ] (5)
onde [PTot] e [STot] representam as concentrações molares totais de PrP e hop/STI1 em
solução. Também sabemos que a concentração molar do complexo é igual a fração ligada de
PrP:
PS[ ]n
= PTot[ ]⋅ fn (6)
onde fn representa a fração ligada da totalidade de PrP, na condição n de concentração
de hop/STI1. Finalmente, podemos expressar a fração ligada da totalidade de PrP como:
fn =An − Ai
A f − Ai
(7)
onde Ai, Af e An representam a anisotropia de fluorescência da FITC-PrP na condição
inicial (na ausência de hop/STI1), final (no caso [hop/STI1] >> [PrP], ou seja na condição de
saturação da curva) e na condição n de concentração de hop/STI1.
Desta forma, usando as equações 4, 5, 6 e 7 na equação 3, obtemos:
An = Ai + A f − Ai( )⋅PTot + STot + Kd − PTot + STot + Kd( )
2− 4 ⋅ PTot ⋅ STot
2 ⋅ PTot
(8)
Por meio da equação 8 podemos ajustar uma curva teórica aos dados experimatis de
anisotropia de fluorescência, em função dos parâmetros Ai, Af e Kd, e obter a constante de
dissociação Kd.
58
Uma descrição detalhada desta metodologia pode ser encontrada em Principles of
fluorescence spectroscopy (LAKOWIKZ, 1999).
3.9 ESPECTROSCOPIA DE DICROISMO CIRCULAR
O espectro de dicroísmo circular (CD) foi obtido para luz ultravioleta longe do visível
(entre 190 e 260 nm), com um espectropolarímetro Jasco J-715 (Jasco Corporation). Todas as
medidas foram realizadas a 20 oC, em tampão Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7.4, utilizando
uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 0.2 mm. Os espectros são o resultado da média
de quatro medidas consecutivas, obtidas a uma velocidade de varredura de 50 nm/min.
Realizamos medidas espectroscópicas das amostras em concentrações de 35 µM para
proteínas livres e complexos, e de 500 mM para peptídeos livres. Entre medidas, a cubeta foi
lavada com abundante água e detergente Hellmanex, secada com jatos de nitrogênio, e sempre
foi obtido um espectro da cubeta vazia para corroborar a limpeza desta. Em todos os casos, o
espectro do tampão foi subtraídos do espectro das amostras.
Todos os dados são apresentados em função da elipticidade molar por resíduo [θ],
onde:
θ[ ]=θ
l ⋅ C ⋅ N (9)
sendo θ a elipticidade da amostra (dado bruto obtido no espectrômetro), ℓ o caminho ótico, C
a concentração molar da amostra e N o número de ligações peptídicas na cadeia polipeptídica
da molécula analisada. A unidade desta magnitude é deg x dmol-1 x cm2, onde deg representa
59
graus de elipticidade (ellipticity degrees), a unidade do dado bruto. Quando a amostra contém
múltiplas espécies moleculares, a elipticidade molar por resíduo fica:
θ[ ]=θ
l ⋅ Ci ⋅ N ii
∑ (10)
onde Ci representa a concentração molar da espécie molecular i, e Ni o número de ligações
peptídicas na cadeia polipeptídica de uma molécula da espécie molecular i.
Uma descrição detalhada desta metodologia pode ser encontrada em Circular Dichroism:
Principles and Applications (BEROVA et al., 2000).
3.10 ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
Os espectros de emissão de fluorescência foram medidos em um espectrofluorímetro
ISS-PC1 (ISS), com os braços de excitação e emissão em “L”, usando cubetas de quartzo de 1
cm de caminho ótico e um volume final de 400 µl. A velocidade de varredura utilizada foi
sempre de 1 nm por segundo e as medidas foram realizadas a 20 oC. As amostras foram
diluídas em tampão Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7.4. Em todos os casos, o espectro do
tampão foi subtraído dos espectros das amostras.
Durante as medidas de fluorescência do corante bis-ANS (Invitrogen), as amostras
foram excitadas a 360 nm e os espectros de emissão foram coletados de 400 nm a 600 nm.
Para analisar a alteração conformacional de uma determinada proteína, induzida pelo peptídeo
ligante, sempre partimos de uma amostra bis-ANS:proteína na concentração 4:2 µM e
titulamos o peptídeo ligante.
60
Para as medidas de fluorescência intrínseca de proteínas no estado estacionário,
usamos amostras com concentrações na faixa 2 - 3 µM. Quando possível, realizamos
titulações até observar saturação das alterações espectrais. As amostras de proteínas selvagens
foram excitadas em 280 nm, visando observar alterações globais (não seletivas) do espectro
das proteína; já no caso da PrP95-231W98F, ela foi excitada em 295 nm para obter uma excitação
seletiva do Trp144. A largura de banda da excitação foi sempre de 8 nm. As faixas de
comprimento de onda de emissão dos espectros foram ajustadas de forma de minimizar a
contribuição espectral do espalhamento de luz, usualmente presente em comprimentos de
onda próximos ao comprimento de onda de excitação.
Como controle, sempre monitoramos a possível agregação protéica através da medida
do espalhamento de luz elástico (espalhamento de Rayleigh), excitando e medindo a emissão
a 320 nm.
Uma descrição detalhada desta metodologia pode ser encontrada em Principles of
fluorescence spectroscopy (LAKOWIKZ, 1999).
3.11 ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXO ÂNGULO
As medidas de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foram realizadas no
Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) em Campinas, São Paulo. A linha utilizada
foi a D11A-SAXS1. As amostras, em solução, foram preparadas no dia anterior à medição,
guardadas e transportadas em gelo até o LNLS. O tampão usado foi Tris 50 mM, NaCl 100
mM, pH 7.4 As medidas foram realizadas a 20 oC. As amostras foram irradiadas com um
feixe monocromático com comprimento de onda de λ=1.488 Å, e os perfis de espalhamento
foram medidos com um detector bi-dimensional MARCCD sensível à posição. Para cobrir
61
uma larga faixa de ângulos de emissão, duas distâncias amostra-detector foram usadas: 603.8
mm e 1406.8 mm. Obtivemos a media circular do perfil através do programa FIT2D
(HAMMERSLEY et al., 1996) e as curvas de espalhamento resultantes foram
individualmente normalizadas pela intensidade do feixe incidente e a absorção da amostra.
Após unir as curvas obtidas com as duas distâncias amostra-detector usando o programa
PRIMUS (KONAREV et al., 2003), o vetor de espalhamento q = (4π/λ) sin(θ), onde 2θ é o
ângulo de espalhamento, cobriu a faixa 0.012 Å-1 to 0.3 Å-1. Devido à possível degradação
das amostras induzida pela exposição aos raios-X, escolhemos dividir o período de irradiação
em 3 intervalos consecutivos de 400 segundos. Após subtrair o espalhamento do tampão do
espalhamento das amostras, cada perfil de espalhamento foi inspecionando individualmente
visando controlar por degradações durante o período de irradiação. Também subtraímos
espalhamento de fundo (background) não específico, de forma de que os perfis de
espalhamento obedeçam à lei de Porod, estabelecendo I(q) α q-4, para q grandes (GLATTER
& KRATKY, 1982). Medimos os perfis de espalhamento em duas concentrações distintas
para checar se os perfis apresentavam dependência da concentração: a amostra de hop/STI1
livre foi medida a 4.5 mg/ml e 2.5 mg/ml, e a amostra PrP:hop/STI1 foi medida na proporção
molar 1:1 nas concentrações totais de 4 mg/ml e 2.3 mg/ml.
A aproximação de Guinier é uma expressão matemática para a intensidade de
espalhamento, válida somente para q pequenos (ângulos pequenos) :
ln(I(q )) ≅ −Rg
2
3⋅ q2 + ln(I(0)) (11)
onde Rg é o raio de giro molecular:
62
Rg =mi ⋅ (
r r i −
r r CM )2
i∑
mii
∑ (12)
sendo mi a massa do átomo i da molécula, posicionada em r r i , e
r r CM é a posição do
centro de massa. Formalmente, esta aproximação é válida quando q < Rg-1. Desta forma, a
análise de Guinier consiste em aplicar a equação 11 para a realização de um ajuste linear aos
dados experimentais expressados como ln(I(q)) vs. q2, para q < Rg
-1. Por meio deste ajuste
obtivemos o valor de Rg das moléculas analisadas. Ainda mais, se a amostra é polidispersa (se
contém diversas espécies oligoméricas), observaríamos um desvio da linearidade destes
gráficos, pelo que esta análise demonstrou que as amostras analisadas eram monodispersas.
Além de extrapolar o valor de espalhamento direto, I(0), das amostras, o ajuste teórico
aos dados experimentais de espalhamento realizado com o programa GNOM (SVERGUN et
al., 1992) indicou diversos parâmetros estruturais das moléculas analisadas: a distribuição de
distâncias intramoleculares p(r), o Rg (obtido através de cálculos independentes da análise de
Guinier, pelo que serve como validação), e o diâmetro máximo molecular Dmax das amostras.
Como controle, através dos valores I(0) obtidos, foram feitas estimativas do peso molecular
das amostras, usando amostras de lisozima de ovo de galinha (Sigma) como padrão.
Para abordar o cálculo de modelos de baixa resolução, discutiremos brevemente o
princípio básico pelo qual é possível obter modelos a partir da análise dados de espalhamento.
A intensidade espalhada pelas partículas em solução, I(q), é máxima para q=0, e diminui com
uma taxa que depende do tamanho e forma destas. Se consideramos a amostra como um
sistema bifásico de partícula e solvente, a densidade eletrônica da molécula analisada ρ(r) está
relacionada com I(q) de acordo com:
I(q ) = n ⋅ (ρ(r ) − ρs) ⋅ e− i⋅q ⋅r
d3r
V∫ (13)
63
onde n é o número de partículas por unidade de volume, ρs é a densidade eletrônica do
solvente e r é um vetor que denota a posição de uma porção da molécula, relativa ao centro de
massa desta. Consequentemente, medindo a intensidade de espalhamento, podemos obter
informação da ρ(r), ou seja, da densidade eletrônica de cada ponto r dentro da molécula. Se
fazemos uma aproximação desta expressão para q pequenos, vamos recobrar a expressão de
Guinier, apresentada na equação 11, e iremos obter informação sobre a forma global da
molécula, através do parâmetro Rg. Não obstante, por meio de cálculos computacionais,
implementados nos programas que criam modelos de baixa resolução da molécula analisada,
também podemos extrair informação da I(q) medida para toda a faixa de q. Os programas vão
estimar uma densidade ρ(r) que apresente um espalhamento teórico que se ajuste aos dados
experimentais. De fato, ρ(r) é a grandeza que representamos quando criamos um modelo de
baixa resolução da molécula. Porém, como não existe uma relação unívoca entre ρ(r) e I(q),
modelos com distinta densidade eletrônica podem apresentar o mesmo espalhamento. Então,
quando usamos programas para calcular modelos das moléculas devemos obter o volume
consenso ocupado pelos modelos obtidos (VOLKOV et al., 2003), gerando um modelo
volumétrico final que representa o espaço ocupado pela molécula analisada.
Os modelos ab initio foram calculados através do programa GASBOR (SVERGUN et
al., 2001), que aplica algoritmos otimização baseados em técninas de simulated annealing
para encontrar distribuições espaciais de cadeias de resíduos dummy (resíduos representados
de forma simplificada por átomos de carbonos alfa) que apresentem um espalhamento teórico
que se ajuste aos dados experimentais de espalhamento. Os modelos obtidos foram
consistentes entre si, e os modelos volumétricos finais apresentados no trabalho foram obtidos
pelo programa DAMAVER (VOLKOV et al., 2003) que calculou o volume consenso de 10
modelos de cada molécula analisada.
Outra abordagem para à análise de I(q), consiste na produção de modelos do tipo rigid
64
body modeling, calculados com o programa BUNCH (PETOUKHOV et al., 2005). Este
programa implementa novamente simulated annealing, mas desta vez para encontrar a
posição e orientação ótima de modelos de alta resolução de domínios protéicos e cadeias
flexíveis que os unem, representadas por cadeias de resíduos dummy ligadas aos resíduos
terminais dos domínios. Este programa mostrou-se muito mais exigente para o ajuste aos
dados, sendo que para alcançar ajustes satisfatórios, tivemos que explorar o espaço de
parâmetros de penalidades do algoritmo de simulated annealing. Este algoritmo realiza uma
otimização do modelo calculado ao minimizar uma função de energia que considera tanto o
erro do ajuste aos dados experimentais quanto penalidades de características estruturais
indesejáveis do modelo obtido, tais como conflitos (clashes) entre domínios, extensão
excessiva das cadeias flexíveis, etc. Como foi sugerido pelos autores do programa
(PETOUKHOV et al., 2005), para realizar o ajuste aos dados e ao mesmo tempo obter
modelos satisfatórios, tivemos que calibrar os valores dos parâmetros que pesam estas
penalidades de forma tal que a contribuição das penalidades estruturais sejam 10-30% do
valor total da função energia. Os modelos que calculamos neste trabalho usam os modelos de
alta resolução dos domínios TPR1, TPR2A e PrP121-231 (códigos PDB 1elw, 1elr e 1ag2,
respectivamente), junto com modelos de homologia dos domínios TPR2B, DP1 e DP2,
calculados pelo servidor LOMETS (WU et al., 2007). Como BUNCH manipula unicamente
uma cadeia de polipeptídeos por corrida, o complexo PrP:hop/STI1 foi representado como
uma única cadeia, ao ligar o resíduo N-terminal da PrP ao resíduo C-terminal da hop/STI1
(para preservar a clareza de exposição, os primeiros 4 resíduos do N-terminal da PrP não
foram representados nas figuras). Este procedimento não pareceu introduzir uma imposição
sensível à modelagem, devido ao comprimento de 98 resíduos da cauda flexível N-terminal da
PrP. Ainda mais, durante a modelagem, foi imposto uma condição de contato (10 Å de
separação máxima) para as interfaces de ligação da PrP e da hop/STI1. Em nenhum caso
65
foram impostas condições de simetria para as partículas modeladas.
Para mais detalhes desta técnica, referir-se a Small angle X-ray Scattering (GLATTER
& KRATKY, 1982).
66
4 RESULTADOS
Ao longo deste trabalho as amostras foram analisadas em solução de tampão Tris-HCl
50 mM, contendo 100 mM de NaCl e o pH ajustado em 7.4.
4.1 AVALIAÇÃO DA INTERAÇÃO PrP:HOP/STI1
Após a purificação das proteínas recombinantes PrP23-231 (daqui em diante citada como
PrP) e hop/STI1, nosso primeiro passo foi confirmar a interação entre essas proteínas. Para
este fim a técnica escolhida foi a de anisotropia de fluorescência, que permite monitorar a
formação do complexo e, ao mesmo tempo, estimar a constante de dissociação (Kd) e a
estequiometria do complexo.
Esta técnica envolve a marcação de proteínas de interesse com um fluoróforo repórter
e o monitoramento da polarização da fluorescência das proteínas marcadas em solução. Os
fluoróforos possuem vetores de absorção e emissão alinhados em direções específicas
relativas a suas estruturas moleculares. Estes dois vetores determinam o eixo preferencial da
polarização da luz absorvida e emitida, respectivamente. Desta forma, quando um fluoróforo
é excitado com luz plano-polarizada, sua emissão resultante também é plano-polarizada,
porém não necessariamente na mesma direção da excitação. Se a molécula fluorescente se
encontra em solução e, em consequência, em rotação difusiva livre, a luz emitida pode adotar
todas as direções de polarização possíveis, já que as moléculas (e seus respectivos vetores de
emissão) estarão orientados aleatoria e dinamicamente. Consequentemente, apesar de se
67
excitar a amostra com polarização anisotrópica (com luz polarizada numa determinada
orientação), um observador medindo a polarização da luz fluorescente total iria obter a média
de um enorme número de orientações dinâmicas, ou seja, uma luz com um baixo grau de
anisotropia. Porém, variações da anisotropia de fluorescência podem indicar a interação da
molécula marcada com um ligante de interesse. Dois fenômenos vão afetar o nível de
anisotropia de fluorescência do fluoróforo. O primeiro está relacionado ao tamanho efetivo da
molécula marcada, já que a anisotropia desta é tanto menor quanto mais rápida é a velocidade
de rotação da molécula, porque esta velocidade é diretamente proporcional à quantidade de
orientações que o fluoróforo adota durante o tempo de medida. Como resultado, o grau de
anisotropia da luz emitida pelo fluoróforo é inversamente proporcional a sua velocidade de
rotação e diretamente proporcional ao seu tamanho molecular, já que moléculas maiores
possuem rotações mais lentas. Este princípio pode ser utilizado para monitorar a formação de
complexos moleculares entre moléculas marcadas com um fluoróforo e ligantes potenciais,
porque, ao formar-se a ligação, o complexo resultante terá um tamanho molecular maior, uma
rotação mais lenta e uma emissão mais anisotrópica. O segundo fenômeno envolve a
mobilidade local do fluoróforo, em uma escala temporal muito menor ao efeito anterior. A
interação da molécula marcada com o ligante de interesse pode alterar a mobilidade local do
fluoróforo com consequências para a anisotropia de emissão deste, de forma análoga ao efeito
descrito acima. Dado que a fluoresceína tem um tempo de vida de poucos ns, seus níveis de
anisotropia de fluorescência devem ser capazes de evidenciar alterações da mobilidade local
deste fluoróforo. Consequentemente, ambos os fenômenos irão contribuir para o nível de
anisotropia de fluorescência da molécula marcada. De qualquer forma, se a titulação de um
ligante hipotético em uma amostra contendo uma quantidade fixa da molécula marcada com
fluoresceína é acompanhada por uma alteração saturável da anisotropia da luz emitida,
podemos afirmar que está acontecendo a ligação entre estas duas moléculas. Para maximizar
68
este efeito, ao analisar a interação de duas proteínas, podemos marcar com o fluoróforo a
proteína de menor tamanho, pois assim, ao formar-se o complexo, a redução de sua
velocidade de rotação será maior que no caso inverso. Consequentemente, neste caso, a
proteína escolhida para a marcação foi a PrP, já que seu peso molecular é aproximadamente
1/3 do da hop/STI1. O fluoróforo selecionado foi um derivado da fluoresceína, o isotiocianato
de fluoresceína (FITC).
As medidas foram realizadas com uma amostra 2 µM de PrP, sendo que 50 nM da
proteína estava marcada com FITC, e foram adicionadas quantidades crescentes de hop/STI1
(utilizamos uma quantidade alta de PrP de forma de podermos medir vários pontos da
titulação de hop/STI1 até o platô, mas não foi marcada a totalidade da PrP com FITC para que
os valores de intensidade de fluorescência da FITC se encontrassem na faixa de detecção do
fluorímetro, evitando a saturação da medida). Na Figura 11 apresentamos os dados obtidos a
partir destes ensaios. Se consideramos que a PrP e a FITC-PrP tem a mesma afinidade pela
hop/STI1, a curva de anisotropia serve para o monitoramento do grau de ligação da totalidade
(marcada e não marcada) da PrP presente na amostra. Em conseqüência, podemos ajustar a
estes dados experimentais a curva dada pela Equação 8, presente na seção Materiais e
Método. O ajuste calculado também é apresentado na Figura 11.
O valor de Kd obtido pelo ajuste foi de 161 ± 98 nM, e o coeficiente de correlação
linear r foi de 0,99. O valor alto do erro do Kd deve-se a ausência de medidas para
concentrações mais elevadas de hop/STI1. Entretanto, o valor calculado para Kd concorda
com o valor obtido por Zanata e colaboradores que, mediante o uso de um ensaio
experimental distinto, estimaram um Kd de 140 nM para a interação PrP:hop/STI1 (ZANATA
et al., 2002). Outra informação que pode ser deduzida deste ensaio refere-se à estequiometria
da interação. A curva alcança seu platô quando a concentração da hop/STI1 chega a um valor
aproximado de 2 µM, a mesma concentração total de PrP. Este comportamento nos indica
69
que, neste ponto, não existem mais moléculas de FITC-PrP disponíveis para a ligação da
hop/STI1, uma vez que a anisotropia de fluorescência da amostra chega ao seu valor máximo
possível. Consequentemente, considerando que a marcação com FITC não altera a interação
entre as proteínas, estes dados sugerem fortemente que a estequiometria da ligação
PrP:hop/STI1 é 1:1 em razão molar, um dado que, até o momento, não havia sido confirmado.
Figura 11. Formação do complexo PrP:hop/STI1 e cálculo de Kd. Uma amostra de PrP 2 µM, contendo 50 nM FITC-PrP, foi titulada com hop/STI1. São apresentados os dados experimentais da anisotropia de fluorescência (pontos pretos) e curva de ajuste teórico de acordo à equação 8 (linha vermelha). O valor de Kd obtido foi de 161 ± 98 nM. A amostra foi excitada a 480 nm e a emissão coletada através do filtro WG3-69.
Em resumo, confirmamos a ligação das proteínas purificadas dentro de uma faixa de
afinidade que concorda com dados experimentais presentes na literatura, e ainda
demonstramos que a estequiometria molar do complexo é de 1:1.
70
4.2 ANÁLISE DO EFEITO DA INTERAÇÃO PrP:HOP/STI1 SOBRE A ESTRUTURA
DAS PROTEÍNAS
A ligação da PrP com a hop/STI1 desencadeia a ativação de múltiplas vias de
sinalização intracelular. O mecanismo molecular pelo qual esse processo é disparado não está
estabelecido e diferentes hipóteses podem ser levantadas. Dado que nenhuma destas proteínas
possui um domínio transmembrana, uma possibilidade que ganha força neste cenário envolve
a participação de outros parceiros moleculares no meio extracelular ou na membrana
plasmática. Estas moléculas seriam capazes de interagir (ou deixar de interagir) com as
proteínas hop/STI1 e/ou PrP após a formação do complexo e, de alguma forma, auxiliar no
mecanismo de ativação das vias sinalizadoras, provavelmente envolvendo a ação de um
domínio transmembrana em algum destes ligantes putativos, seja diretamente na superfície da
membrana plasmática ou durante a endocitose do complexo PrP:hop/STI1. Em qualquer caso,
mudanças conformacionais da PrP e/ou da hop/STI1 durante a formação do complexo seriam
eventos altamente significativos para estes processos, já que estas alterações poderiam
modular a capacidade de ligação a outros parceiros pela estabilização/desestabilização de
possíveis sítios de ligação. Assim, torna-se importante analisar como mudanças
conformacionais da PrP e da hop/STI1 é afetado pela formação do complexo.
4.2.1 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA SECUNDÁRIA
A técnica que escolhemos para monitorar o efeito da interação PrP:hop/STI1 sobre a
71
estrutura secundária destas proteínas foi a de espectroscopia de dicroísmo circular (CD, pelo
nome em inglês, circular dichroism). A partir de pequenas quantidades de amostra em
solução, esta técnica fornece informação sobre o tipo e a extensão da estrutura secundária das
proteínas, conseguindo diferenciar entre α-hélices, fitas-β e estruturas intrinsecamente
desenoveladas, pelo que constitui uma técnica extremamente útil para análises de
enovelamento/desenovelamento protéico, assim como para monitorar transições entre
diferentes tipos de estruturas secundárias.
A técnica baseia-se na absorção diferencial de uma amostra quando excitada com luz
circularmente polarizada no sentido esquerdo ou direito. Em um ensaio de CD, as amostras
são excitadas com luz linermente polarizada, que possui quantidades iguais de luz polarizada
circularmente no sentido esquerdo e direito. Como estes dois tipos de luz possuem sentidos
opostos, se a molécula analisada é quiral (ou seja, se ela tem assimetria molecular de forma
que não é possível sobrepor a estrutura da molécula sobre sua imagem especular), ela irá
absorver diferencialmente os dois componentes da luz incidente. Proteínas comportam-se
desta maneira porque são quirais, já que a ligação peptídica é assimétrica. Esta absorção
diferencial depende do comprimento de onda da excitação. Usualmente excita-se as amostras
numa faixa definida de comprimentos de onda, obtendo-se assim um espectro de CD.
Para a análise da estrutura secundária de proteínas é utilizada uma faixa de excitação
na região do ultravioleta distante da faixa visível (no presente estudo utilizamos de 200 a 250
nm). As características de um espectro de CD dependem do tipo de estrutura secundária em
questão. As α-hélices apresentam dois mínimos no espectro, situados em 208 e 222 nm. Já as
fitas-β apresentam um único mínimo entre 210 e 220 nm. Finalmente, os polipeptídeos
intrinsecamente desestruturados também apresentam um único mínimo de alta amplitude,
situado em 198 nm, aproximadamente. A amplitude dos mínimos é diretamente proporcional
ao conteúdo da estrutura secundária correspondente. Desta forma, monitorando a posição e a
72
magnitude dos mínimos de um espectro, podemos inferir qualitativamente o estado de
enovelamento de uma proteína.
Nestes ensaios realizamos medidas espectroscópicas das amostras em concentrações
de 35 µM para proteínas livres e complexos, e de 500 mM para peptídeos livres. Para facilitar
as comparações, exceto quando explicitado, todos os espectros foram normalizados de forma
a obter a elipticidade molar por resíduo, [θ] de cada amostra, já que esta magnitude independe
da quantidade e do tamanho das moléculas analisadas (ver Materiais e Métodos).
Para avaliar possíveis alterações na estrutura secundária das proteínas ao formar-se o
complexo PrP:hop/STI1, medimos os espectros de CD das proteínas PrP e hop/STI1 livres
(Fig. 12) e incubadas em uma mesma amostra, na proporção molar 1:1 (Fig. 13). Como era
esperado, as proteínas livres apresentam espectros que evidenciam um alto grau de conteúdo
de α-hélices, sendo que a hop/STI1 mostrou-se mais rica nesta estrutura. Se a formação do
complexo PrP:hop/STI1 não envolvesse alterações nas estruturas secundárias das proteínas, o
espectro da amostra contendo as proteínas co-incubadas deveria ser idêntico à predição
realizada pela Equação 10 (pág. 56), presente em Materiais e Métodos. Como pode ser
observado na Figura 13, os espectros medidos e preditos são similares qualitativamente,
porém, existe uma pequena diferença de aproximadamente 5% da intensidade do sinal no
mínimo correspondente aos 208 nm, sendo menor a amplitude do espectro medido que a do
predito. Esta diferença foi altamente reprodutível tanto no sentido como na magnitude.
Esta observação sugere que a formação do complexo PrP:hop/STI1 é acompanhada
por uma perturbação da estrutura protéica, na forma de um desenovelamento parcial da
estrutura das α-hélices. Devemos destacar que esta alteração do espectro de CD, que a
princípio pode parecer muito reduzida quantitativamente, é potencialmente relevante no
contexto biológico do mecanismo sinalizador regulado por este complexo. Este mecanismo
pode envolver a perturbação estrutural local de poucos resíduos, de forma de alterar a
73
afinidade por terceiros ligantes que possam participar na tarefa de comunicar os sinais para o
compartimento intracelular. Consequentemente, investigamos em maior profundidade este
evento.
Figura 12. Comparação dos espectros de CD da PrP e da hop/STI1. Espectro medido da PrP livre (linha preta) e da hop/STI1 livre (linha vermelha), ambas nas concentrações de 35 µM.
Figura 13. Comparação da medição e a predição do espectro de CD do complexo PrP:hop/STI1. Espectro medido da amostra equimolar PrP:hop/STI1 (linha preta), e soma, de acordo à equação 10
74
apresentada em Materiais e Métodos, dos espectros medidos da PrP e hop/STI1 livres (linha vermelha). As medidas foram realizadas na concentração 35 µM.
A princípio, os dados apresentados sugerem uma perda da estrutura secundária em
forma de α-hélices, disparada pela interação. Porém, eles não indicam se uma ou ambas
proteínas estão sofrendo a perturbação estrutural. Se quiséssemos obter esta informação,
poderíamos, por exemplo, tentar subtrair do espectro da amostra PrP:hop/STI1 o espectro da
hop/STI1 livre, e comparar o espectro resultante da subtração com o espectro da PrP livre.
Não obstante, ao realizar a subtração do espectro da hop/STI1 livre, estamos pressupondo que
a estrutura secundária da hop/STI1 não foi alterada pela interação. Consequentemente,
ensaios com as proteínas inteiras não podem nos oferecer a informação desejada.
Para superar esta limitação, fizemos uso de peptídeos sintéticos que contêm os sítios
de ligação entre estas proteínas e realizamos medidas de CD para complexos
proteína:peptídeo. O racional de substituir uma proteína inteira pelo peptídeo correspondente
consiste em que o peptídeo “x”, que possui a seqüência do sitio da proteína “X” que liga a
proteína “Y”, poderia mimetizar a ação perturbadora da proteína “X” sobre a estrutura da
proteína “Y”. Se de fato isto acontece, a vantagem desta abordagem é que poderemos realizar
ensaios de CD que permitam determinar inequivocamente quais das proteínas sofrem
alterações das estruturas secundárias ao interagir. Como veremos adiante, esta abordagem foi
possível porque os sinais brutos de CD dos peptídeos são muito baixos em comparação ao das
proteínas, já que os peptídeos são compostos por poucos resíduos.
De acordo com o estudo de Zanata e colaboradores, os sítios de ligação destas
proteínas estão contidos na PrP entre os resíduos 113 e 128, e na hop/STI1 entre os resíduos
230 e 245 (ZANATA et al., 2002), de agora em diante referidos como PrP113-128 e hop/STI1230-
245, respectivamente. Os peptídeos PrP113-128 e hop/STI1230-245 são intrinsecamente
desestruturados, como pode ser observado em seus espectros de CD normalizados,
75
apresentados na Figura 14. Ainda mais, na maior parte da faixa de emissão coletada, as
contribuições espectrais dos peptídeos são desprezíveis com respetio aos espectros das
proteínas inteiras, como pode ser observado ao comparar os espectros de PrP e hop/STI1230-
245, expressos em elipticidades brutas θ (Fig. 15).
Figura 14: Comparação dos espectros de CD dos peptídeos PrP113-132 e hop/STI1230-245. Espectro do hop/STI1230-245 (linha preta) e o PrP113-132 (linha vermelha), ambas na concentração 500 µM.
Figura 15. Comparação dos espectros de CD, expressos em elipticidade bruta, da PrP e o peptídeo hop/STI1230-245. São apresentados os espectros medidos da PrP (linha preta) e do peptídeo
76
hop/STI1230-245 (linha vermelha). Ambas as amostras foram medidas na concentração 35 µM. Os espectros são apresentados em unidades de elipticidade bruta, de forma de facilitar a comparação das contribuições espectrais relativas de cada uma destas moléculas.
Observamos que a ligação da hop/STI1 ao peptídeo PrP113-132 não produz um efeito
significativo sobre as estruturas secundárias (Fig. 16). Por outro lado, o espectro de uma
amostra equimolar de PrP e hop/STI1230-245 mostrou uma redução de aproximadamente 30%
do sinal a 208 nm em comparação à predição baseada nos espectros das moléculas livres
(Fig.17).
Este importante efeito observado indica que a interação da PrP com hop/STI1230-245
resulta em um desenovelamento parcial, mas muito robusto, das α-hélices da PrP. Podemos
afirmar que esta alteração estrutural acontece na PrP e não no peptídeo hop/STI1230-245, a
contribuição espectral do peptídeo é desprezível com respeito a contribuição da PrP (Fig. 15),
pelo que a perda da magnitude observada na Figura 17 não pode ser atribuída a uma alteração
estrutural do peptídeo hop/STI1230-235.
Figura 16. Comparação da medição e a predição do espectros de CD do complexo hop/STI1:PrP113-
132. Espectro medido da amostra equimolar hop/STI1:PrP113-132 (linha preta), e soma, de acordo à equação 10 apresentada em Materiais e Métodos, dos espectros medidos da hop/STI1 e do peptídeo
77
PrP113-132 livres (linha vermelha). As medições foram realizadas na concentração 35 µM.
Figura 17. Comparação da medição e a predição do espectros de CD do complexo PrP:hop/STI1230-
245. Espectro medido da amostra equimolar PrP:hop/STI1230-245 (linha preta), e soma, de acordo à equação 10 apresentada em Materiais e Métodos, dos espectros medidos da PrP e do peptídeo hop/STI1230-245 livres (linha vermelha). As medições foram realizadas na concentração 35 µM.
Finalmente, testamos se as alterações da estrutura secundária, que a PrP e a hop/STI1
sofrem ao interagirem entre si (Fig. 13), são mimetizadas pelas alterações que a PrP e a
hop/STI1 sofrem ao interagir com hop/STI1230-245 e PrP113-132, respectivamente (Figs. 16 e 17).
Trabalhando com elipticidades brutas, subtraímos dos espectros das amostras
PrP:hop/STI1230-245 e hop/STI1:PrP113-132 os espectros medidos dos peptídeos livres
correspondentes. Com este procedimento estamos desprezando alterações dos espectros dos
peptídeos, o que parece razoável, já que mesmo que eles ganhem ou percam estrutura, suas
contribuições espectrais serão muito baixas. Desta forma, obtemos a predição do espectro das
proteínas PrP e hop/STI1 nas conformações resultantes da interação com hop/STI1230-245 e
PrP113-132, respectivamente, conformações que denominaremos PrP* e hop/STI1*. As
predições destes espectros são apresentadas na Figura 18.
78
No nível de estruturas secundárias, se PrP* e hop/STI1* mimetizam as conformações
adotadas pela PrP e a hop/STI1 quando formam o complexo PrP:hop/STI1, a soma (de acordo
à Equação 10) dos espectros de PrP* e hop/STI1* deveria ser igual ao espectro medido de
PrP:hop/STI1. Esta comparação é apresentada na Figura 19, demonstrando uma sobreposição
quase perfeita dos espectros de “PrP*+hop/STI1*” e PrP:hop/STI1. Isto indica que os
peptídeos PrP113-132 e hop/STI1230-245 são capazes de induzir respectivamente a totalidade das
perturbações da estrutura secundária da hop/STI1 e da PrP que as proteínas inteiras induzem
quando formado o complexo PrP:hop/STI1. Desta forma, quando o uso de proteínas inteiras
era proibitivo pelas características da técnica utilizada, os peptídeos constituíram uma
ferramenta útil para o estudo das alterações estruturais induzidas pela interação PrP:hop/STI1,
e em diversas instancias deste estudo faremos uso deles.
Figura 18. Comparação dos espectros de CD da PrP, PrP*, hop/STI1 e hop/STI1*. São apresentados os espectros medidos da PrP (linha preta) e da hop/STI1 (linha vermelha) livres e o espectro predito da PrP* (linha verde) e da hop/STI1* (linha azul). A predição destes dois últimos espectros foi obtida ao subtrair respectivamente os espectros medidos de hop/STI1230-245 e PrP113-132, dos espectros medidos de PrP:hop/STI1230-245 e hop/STI1:PrP113-132, sempre trabalhando com elipticidades brutas, θ. Posteriormente, estes espectros calculados foram normalizados para elipticidade molar por resíduo, [θ]. Todas as amostras foram medidas na concentração 35 µM. Os espectros apresentados parecem-se muito aos apresentados nas Figuras 16 e 17, já que a contribuição espectral em elipticidade bruta dos peptídeos é muito baixa com respeito a contribuição espectral das proteínas inteiras, como é ilustrado
79
na Figura 15.
Estes dados também sugerem que a formação do complexo PrP:hop/STI1 está
acompanhada de uma forte perturbação da estrutura secundária da PrP, compatível com um
mecanismo molecular de desenovelamento parcial. Já no caso da hop/STI1, as técnicas
utilizadas não foram capazes de evidenciar uma alteração estrutural da estrutura secundária.
Também podemos sugerir que interações locais, dentro dos sítios de ligação, são responsáveis
por desencadear as modificações da estrutura secundária da PrP, sendo importante esclarecer
que as alterações citadas não são necessariamente restritas aos sítios de ligação ou às
vizinhanças imediatas destes sítios, mas podem se propagar pela cadeia polipeptídica até
regiões mais distantes da estrutura terciária (JAMES et al., 1997; CHRISTEN et al., 2009).
De fato, tanto o sítio de ligação da hop/STI1 na PrP, assim como suas proximidades,
apresentam uma estrutura flexível e não possuem uma estrutura secundária determinada, o
que sugere que o evento de desenovelamento parcial da estrutura secundária da PrP ocorre em
α-hélices mais distantes localizadas no domínio globular C-terminal.
Figura 19. Comparação da medição do espectro de CD do complexo PrP:hop/STI1 e as predições
80
do espectro de CD dos complexos PrP:hop/STI1 e PrP*:hop/STI1*. É apresentado o espectro medido da amostra equimolar PrP:hop/STI1 (linha preta), em conjunto com duas somas (sempre de acordo à equação 10 apresentada em Materiais e Métodos): a primeira envolvendo os espectros medidos da PrP e a hop/STI1 livres (linha vermelha), e a segunda os espectros preditos de PrP* e hop/STI1* (linha verde). Todas as medições foram realizadas na concentração 35 µM. 4.2.2 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA LOCAL
Para ampliar a investigação de se a formação do complexo PrP:hop/STI1 promove
mudanças no enovelamento local destas proteínas, realizamos medidas de espectroscopia de
fluorescência intrínseca e extrínseca no estado estacionário.
Para as experiências de fluorescência extrínseca utilizamos como sonda o corante
anfifílico bis-ANS (4,4'-dianilino-1,1'-binaphthyl-5,5'-sulfonate). O bis-ANS constitui uma
sonda útil para obter informação sobre o estado de enovelamento de proteínas em solução
aquosa, sendo que este corante é o suficientemente sensível para detectar estados instáveis
intermediários de enovelamento, tais como estados de molten globule (glóbulo fundido)
(GOLBIK et al., 1998). Quando livre em solução aquosa, o bis-ANS apresenta fluorescência
desprezível, porém, quando inserido em bolsos hidrofóbicos de proteínas que o protegem do
contato com o solvente, aumenta significativamente sua fluorescência em 500 nm, quando
excitado com comprimento de onda de 360 nm (ROSEN et al., 1969). Consequentemente,
através da monitoramento da intensidade de fluorescência em 500 nm de bis-ANS co-
incubado com uma proteína de interesse, é possível estudar processos de
enovelamento/desenovelamento desta última (sejam eles induzidos termicamente,
quimicamente ou pela interação com ligantes), já que a intensidade será diretamente
proporcional ao grau de enovelamento da amostra protéica analisada (GOLBIK et al., 1998;
GOMES et al., 2003). Isto se explica pelo fato de que o desenovelamento (enovelamento)
protéico é acompanhado pela exposição (ocultação) ao solvente de segmentos hidrofóbicos
das proteínas, devido a desestruturação (estruturação) das cavidades hidrofóbicas destas. A
observação de um decaimento no sinal de fluorescência do bis-ANS sugeriria a exposição ao
81
solvente destas cavidades hidrofóbicas e o desenovelamento da proteína analisada.
Foi exatamente este último tipo de comportamento que observamos quando uma
amostra de PrP foi titulada com hop/STI1230-245. A intensidade de fluorescência em 500 nm de
uma amostra bis-ANS:PrP na proporção molar 2:1 decaiu progressivamente a medida que o
peptídeo hop/STI1230-245 foi adicionado à solução (Fig. 20). Este comportamento parece
alcançar uma saturação aproximadamente na proporção molar 1:1 de PrP:hop/STI1230-245,
correspondendo a um decaimento total de 75% do sinal inicial. Neste ponto final da titulação
a fluorescência da amostra ainda foi maior que a de uma amostra contendo a mesma
concentração de bis-ANS livre ou co-incubada com hop/STI1230-245 (este último dado sugere
que o bis-ANS não interage com hop/STI1230-245).
Figura 20. Fluorescência de bis-ANS durante as titulações de hop/STI1230-245 e PrP113-132 em amostras de bis-ANS:PrP e bis-ANS:hop/STI1, respectivamente. (A) Espetros de emissão de bis-ANS da titulação de hop/STI1230-245 em uma amostra bis-ANS:PrP. Uma amostra de bis-ANS:PrP na concentração 4:2 µM (linha contínua preta) foi titulada com o peptídeo hop/STI1230-245 nas concentrações bis-ANS:PrP:hop/STI1230-245 de 4:2:0.5 (linha contínua vermelha), 4:2:1 (linha contínua verde), 4:2:1.5 (linha contínua azul) e 4:2:2 (linha contínua laranja), sempre em unidades de µM. Também são apresentados os espectros de emissão de bis-ANS livre 4 µM (linha tracejada vermelha) e de uma amostra bis-ANS:hop/STI1230-245 na concentração 4:2 µM (linha tracejada preta). A excitação foi ajustada em 360 nm. (B) A fluorescência relativa em 500 nm durante a titulação de hop/STI1230-245 em uma amostra de bis-ANS:PrP (linha contínua preta), e a titulação de PrP113-132 em uma amostra de bis-ANS:hop/STI1 (linha contínua vermelha). Como referência, são apresentados: a emissão fluorescente em 500 nm de bis-ANS livre (linha contínua cinza) e bis-ANS:hop/STI1230-245 (linha
82
tracejada preta), ambos relativos à emissão de bis-ANS:PrP; a emissão fluorescente em 500 nm de bis-ANS livre (linha contínua rosa) e bis-ANS:PrP113-132 (linha tracejada vermelha), ambos relativos à emissão de bis-ANS:hop/STI1. Os dados são apresentados em função das razões molares [hop/STI1230-
245]/[PrP] e [PrP113-132]/[hop/STI1], respectivamente.
O efeito observado poderia ser atribuído à possível competição do bis-ANS
fluorescente com hop/STI1230-245 pelo sítio de ligação PrP113-128, já que este segmento está
contido no domínio hidrofóbico da PrP. Porém, a forte queda da fluorescência do bis-ANS
não parece ser completamente explicada por esta hipótese por dois motivos. Primeiro, o
segmento PrP113-128 é parte da cauda flexível N-terminal exposta ao solvente, enquanto a
fluorescência de bis-ANS é somente aumentada quando inserido em cavidades estruturadas
hidrofóbicas; e segundo, a fluorescência de bis-ANS não é aumentada, com respeito à
emissão de bis-ANS livre, pela presença do peptídeo hidrofóbico PrP113-132 (Fig. 20B), cuja
estrutura deve se aproximar à conformação do segmento PrP113-132 da PrP. Os dados
apresentados sugerem que a interação da PrP com hop/STI1230-245 resulta em uma perturbação
estrutural dos bolsos hidrofóbicos da PrP, parcialmente expondo estas cavidades (e o corante
inserido) ao solvente, como em um evento de desenovelamento parcial. Consistente com esta
interpretação, uma amostra de bis-ANS:hop/STI1 titulada com PrP113-132 não apresentou
variações sensíveis da fluorescência de bis-ANS (Fig. 20B). Em suma, os dados de
fluorescência extrínseca se correlacionam satisfatoriamente com os resultados de CD (Figs.
16 e 17).
Também realizamos experiências de fluorescência intrínseca, que são capazes de
prover informação sobre o ambiente químico dos resíduos aromáticos de uma proteína,
permitindo a inferência da estrutura local na qual estão inseridos. A fluorescência intrínseca
das proteínas resulta da emissão fluorescente dos resíduos que contêm anéis aromáticos,
principalmente do triptofano, a tirosina e a fenilalanina. Destes três aminoácidos, o triptofano
é o que apresenta maior rendimento quântico, e dado que a emissão de tirosinas pode ser
absorvida (quenched) por triptofanos vizinhos, este último resíduo geralmente domina o
83
espectro de emissão de proteínas. Dependendo do caso, a tirosina também pode apresentar
uma contribuição espectral significativa perto de 300 nm, porém isso geralmente acontece
quando a proteína contém um grande número de tirosinas e quase nenhum triptofano.
O grupo indol do triptofano é bastante sensível às mudanças de polaridade do
ambiente químico em que se encontra inserido. Em conseqüência, o máximo de emissão
fluorescente do triptofano depende fortemente da polaridade do meio. Este máximo pode
variar de 320 nm, quando o resíduo se encontra em um meio hidrofóbico, até comprimentos
de onda de 355 nm, quando o resíduo está em contato com um ambiente mais polar. A
intensidade de emissão fluorescente dos resíduos aromáticos também pode fornecer
informações importantes sobre a estrutura protéica. Alterações da intensidade de fluorescência
de uma proteína sujeita a alguma perturbação indicam transições conformacionais locais, já
que resíduos fluorescentes que modificam sua posição na estrutura tridimensional da proteína
sofrem alterações das interações que eles mantêm, seja com outros resíduos ou moléculas de
solvente, com conseqüências para a intensidade de fluorescência destes resíduos. Dependendo
das suas características, tais mudanças nas interações podem resultar em uma diminuição ou
um aumento de intensidade de emissão fluorescente dos resíduos aromáticos. Este efeito é
um sinal inequívoco de alterações conformacionais, porém a natureza da modificação não é
de fácil interpretação, sendo usualmente necessária a complementação desta evidência com
outros tipos de medidas.
Inicialmente, quando uma amostra de PrP em solução foi excitada a 280 nm, o
espectro de fluorescência intrínseca obtido é fortemente dominado pela contribuição de
triptofanos expostos ao solvente, com uma emissão de máxima intensidade em 344 nm (Fig.
21). O espectro obtido é congruente com a seqüência e a estrutura da PrP, já que dos 8
triptofanos que ela possui, 7 estão na região N-terminal desestruturada exposta ao solvente e
só 1 no domínio C-terminal globular (Fig. 22). Já foi inclusive demonstrado que este último
84
triptofano, o Trp144, que se encontra na α-hélice 1 do domínio globular, possui um espectro
de emissão que indica que ele está substancialmente exposto ao solvente (HORNEMANN et
al., 1997).
Quando esta amostra de PrP foi titulada com hop/STI1, o espectro sofreu alterações
não monotônicas ao longo da titulação (Inset em Fig. 21), começando com um decaimento na
intensidade do espectro e continuando com uma gradual recuperação da intensidade de
fluorescência até alcançar níveis de intensidade similares aos da PrP livre quando a titulação
alcançou a proporção molar de 1:1. Entretanto, o espectro apresentou um máximo de
fluorescência fortemente deslocado para o azul (Fig. 21). A soma dos espectros da PrP e
hop/STI1 livres está longe de explicar o espectro da amostra PrP:hop/STI1 na proporção
molar 1:1, sugerindo que a interação PrP:hop/STI1 perturba o ambiente químico dos resíduos
fluorescentes de uma ou ambas proteínas. Porém, o alto conteúdo de resíduos fluorescentes
destas proteínas impede maiores esclarecimentos, já que além dos 8 triptofanos, a PrP possui
13 tirosinas e, por sua vez, hop/STI1 possui 1 triptofano nas proximidades do domínio TPR1,
e 28 tirosinas (Fig. 22).
Figura 21. Espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de PrP titulada com hop/STI1.
São apresentados os espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de PrP livre 2 µM (linha
85
contínua preta) e a titulação desta com hop/STI1 nas concentrações PrP:hop/STI1 de 2:0.5 (linha contínua azul) e de 2:2 (linha contínua vermelha), sempre em unidades de µM. O espectro de hop/STI1 2 µM também é apresentado (linha tracejada preta). Todos os espectros foram normalizados pela fluorescência máxima da PrP livre. A excitação foi ajustada em 280 nm. Inset: A fluorescência intrínseca relativa a 344 nm dos espectros da titulação é representada em função da razão molar [hop/STI1]/[PrP] ao longo da titulação (linha contínua preta). Os valores de fluorescência foram normalizados ao valor de fluorescência da amostra PrP livre.
Figura 22. Triptofanos e tirosinas do domínio globular da PrP e do domínio TPR2a da hop/STI. São apresentadas, em representações cartoon, (A) o domínio globular da proteína recombinante murina, PrP121-231; (B) o domínio TPR2a da hop/STI1. São destacados em amarelo as tirosinas, e em azul o único triptofano do domínio C-terminal da PrP. Os respectivos sítios de ligação da interação PrPC:hop/STI1 são destacados em vermelho (no caso da PrP, esta representação é parcial, já que o modelo do domínio globular é truncado no resíduo 121, enquanto a interface de ligação foi mapeada em PrP113-128).
Diante deste impedimento, voltamos a fazer uso dos peptídeos PrP113-132 e
hop/STI1230-245, que não possuem triptofanos nas suas seqüências, porém ambos possuem uma
tirosina.
O espectro de fluorescência da hop/STI1, rica em tirosinas, apresenta um máximo de
fluorescência em 303 nm, como era de esperar, e um máximo secundário que deve
corresponder a emissão do seu único triptofano (Fig. 23). A adição de PrP113-132 à amostra de
hop/STI1 aumenta a intensidade do espectro numa proporção substancialmente maior à
contribuição espectral de PrP113-132 livre (Fig. 23). Como o sítio de ligação na hop/STI1 (ou
seja, a seqüência hop/STI1230-245) e o peptídeo PrP113-132 ambos possuem uma tirosina,
86
interpretamos este dado como uma confirmação da interação destas moléculas, já que
provavelmente o aumento na fluorescência deve-se à alteração das interações que estas
tirosinas mantém, provocada pela interação proteína:peptídeo. Porém, não podemos obter
informação adicional sobre efeitos estruturais.
Figura 23. Comparação dos espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de hop/STI1 livre e uma amostra de hop/STI1:PrP113-132. São apresentados os espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de hop/STI1 livre 4 µM (linha contínua preta), uma amostra hop/STI1:PrP113-132 na concentração 4:4 µM (linha contínua vermelha) e uma amostra PrP113-132 livre 4 µM. Os espectros foram normalizados pela fluorescência máxima da hop/STI1 livre. A excitação foi ajustada em 280 nm.
Por outro lado, a situação foi distinta no caso da interação PrP:hop/STI1230-245. A
emissão fluorescente dos triptofanos da PrP decaiu drasticamente durante a titulação do
peptídeo hop/STI1230-245, observando-se uma diminuição gradual da área dos espectros, que
saturou aproximadamente na proporção molar 1:1 de PrP:hop/STI1230-245, alcançando uma
perda total aproximada de 80% da área inicial (Figs. 24A e 24B ).
87
Figura 24. Espectros de fluorescência intrínseca da PrP e a PrP95-231W98F tituladas com hop/STI1230-
245. (A) São apresentados os espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de PrP livre 2 µM (linha contínua preta) e a titulação desta com hop/STI1230-245 nas concentrações PrP:hop/STI1230-245 de 2:0.5 (linha contínua laranja), 2:1 (linha contínua verde), 2:2 (linha contínua vermelha, sempre em unidades de µM. O espectro de hop/STI1230-245 2 µM também é apresentado (linha tracejada preta). Para demonstrar a saturação do efeito, é apresentado o espectro obtido ao subtrair a emissão espectral de 2 µM hop/STI1230-245 livre da emissão de 2:4 µM PrP:hop/STI1230-245, de forma de subtrair a contribuição do peptídeo em excesso (linha contínua azul). Todos os espectros foram normalizados pela fluorescência máxima da PrP livre. A excitação foi ajustada em 280 nm. (B) A área relativa dos espectros obtidos durante a titulação é representada em função da razão molar [hop/STI1230-245]/[PrP] (linha contínua preta). Os valores das áreas foram normalizados ao valor da área do espectro da PrP livre. (C) e (D) mesmos gráficos que em (A) e (B), respectivamente, respeitado as mesmas proporções molares, mas substituindo PrP por PrP95-231
W98F 5 µM e excitando em 295 nm.
Como controle de possíveis eventos de agregação durante a titulação, monitoramos o
88
espalhamento elástico de Rayleigh em 320 nm, que é diretamente proporcional ao tamanho
das partículas em solução, mas não observamos variações significativas do espalhamento que
possam sugerir agregação (dados não mostrados). Consequentemente, este fenômeno só pode
ser atribuído a uma perturbação estrutural das regiões vizinhas aos triptofanos da PrP, já que a
contribuição espectral do peptídeo hop/STI1230-245 é muito pequena em comparação à da PrP
(Fig. 23A). Cabe destacar que, durante a titulação, observamos que os espectros apresentam
um pequeno mas claro deslocamento de aproximadamente 4 nm para o azul, sugerindo que,
na média, os triptofanos da PrP engajam-se em interações mais apolares como conseqüência
da ligação ao peptídeo hop/STI1230-245.
Como foi mencionado antes, a PrP possui 7 dos seus 8 triptofanos na cauda N-
terminal desestruturada. Os dados sugerem que provavelmente esta região da proteína sofre
uma reestruturação induzida pela interação. O triptofano restante, Trp144, encontra-se na
primeira α-hélice do domínio globular C-terminal (Fig. 22A). Com base nos dados de CD
apresentados anteriormente, que sugerem um evento de perturbação deste tipo de estruturas
secundárias da PrP ao interagir tanto com a hop/STI1 como com o peptídeo hop/STI1230-245,
pensamos que o Trp144 poderia servir como sonda para monitorar perturbações estruturais
locais pela técnica de fluorescência intrínseca. Para tal, construímos um mutante da PrP com
uma deleção parcial (até o resíduo 94) do N-terminal adicionando ainda a mutação pontual
W98F. Esse mutante, que denominamos PrP95-231W98F, preserva o sítio de ligação da hop/STI1
e contém um único triptofano, Trp144. Assim, ensaios de espectroscopia de fluorescência
intrínseca deste mutante nos permitem detectar possíveis perturbações estruturais da α-hélice
1 da PrP.
O espectro de fluorescência deste mutante (Fig. 24C) é sensivelmente menos intenso
que o da PrP, como esperado devido ao menor conteúdo de triptofanos. O espectro se
apresenta sobreposto a um background espectral resultante do espalhamento de luz, porém
89
apresenta um claro máximo de emissão em 340 nm, em concordância com estudos anteriores
(HORNEMANN et al., 1997) e confirmando que a hélice 1 se encontra exposta ao solvente.
Ao titular a amostra de PrP95-231W98F com o peptídeo hop/STI1230-245, observamos outra vez
um decaimento gradual do pico do espectro, que novamente saturou na proporção molar de
1:1 (Figs. 24C e 24D). Devido ao alargamento espectral, a determinação dos comprimentos de
onda correspondentes aos máximos de emissão foi ambígua, pelo que não fomos capazes de
monitorar deslocamentos espectrais. O efeito observado não é capaz de explicar
quantitativamente as alterações espectrais da PrP inteira, porém é qualitativamente similar.
Novamente, o monitoramento do espalhamento de Rayleigh descartou eventos de agregação
(dados não mostrados). Os dados apresentados sugerem, portanto, que a vizinhança da α-
hélice 1 da PrP sofre alterações estruturais disparadas pela interação com o peptídeo
hop/STI1230-245.
Em resumo, a evidência coletada de espectroscopia de fluorescência extrínseca e
intrínseca sugere que a interação da PrP com o peptídeo hop/STI1230-245 dispara uma série de
alterações da estrutura local da PrP, levando à exposição parcial de seus segmentos
hidrofóbicos, e envolvendo provavelmente tanto uma reestruturação da cauda flexível N-
terminal quanto uma perturbação estrutural do domínio globular que afeta, pelo menos, a α-
hélice PrP143-53, compatível com os dados de CD apresentados acima.
4.2.3 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA TERCIÁRIA
Com a finalidade de analisar o efeito da interação PrP:hop/STI1 sobre as estruturas
terciárias da PrP e da hop/STI1, realizamos medidas de espalhamento de Raios-X a baixos
ângulos (SAXS, pelo nome em inglês, small-angle X-ray scattering). Esta técnica é capaz de
90
prover informação sobre o tamanho e a forma de macromoléculas em soluções
monodispersas, ou seja, com uma única espécie oligomérica marcadamente dominante
(PETOUKHOV et al., 2007). Originalmente, o uso da técnica limitava-se à obtenção de
parâmetros estruturais que caracterizam a conformação global de macromoléculas, tais como
o raio de giro molecular, Rg, e a distribuição de distâncias intramoleculares, p(r) (GLATTER
et al., 1982). Porém, recentemente, foram desenvolvidos algoritmos computacionais,
implementados em softwares de livre acesso, que permitem o cálculo de modelos estruturais
de baixa resolução das moléculas analisadas (na ordem de 10 Å), através de diversos ajustes
teóricos aos perfis de espalhamento experimentais (SVERGUN et al., 2001; PETOUKHOV et
al., 2005).
Realizamos ensaios de SAXS com amostras de hop/STI1 livre e amostras de PrP e
hop/STI1 co-incubadas na proporção molar 1:1 (não fomos capazes de analisar amostras de
PrP livre pela presença de oligômeros que comprometem a monodispersidade das amostras).
A faixa de concentrações das amostras analisadas foi de 2.3 - 4.5 mg/ml (ver Materiais e
Métodos). Os perfis de espalhamento medidos são apresentados na Figura 25A, junto com os
ajustes teóricos aos dados experimentais realizados através de métodos de transformação de
Fourier indiretos implementados no programa GNOM (SVERGUN et al., 1992). Este ajuste
permitiu a obtenção de uma estimativa do diâmetro máximo molecular, Dmax, das moléculas
analisadas, que foram de 198 Å e 162 Å para a hop/STI1 e a PrP:hop/STI1, respectivamente.
O ajuste também calcula as distribuições p(r) (Fig. 26) e sugere um Rg de 60.24±0.2 Å para a
hop/STI1, e 52.26±0.15 Å para o complexo PrP:hop/STI1. A análise dos gráficos de Guinier
(Fig. 25B) confirma a monodispersidade das amostras (um desvio da linearidade nestes
gráficos indicaria a presença de múltiplas espécies oligoméricas), e provê valores similares de
Rg: 58.34±1.71 Å para a hop/STI1 e 53.26±1.72 Å para o complexo PrP:hop/STI1. Se a
hop/STI1 é um monômero e o complexo PrP:hop/STI1 é formado por uma molécula de cada
91
espécie, estes dados evidenciariam uma significativa compactação da estrutura terciária da
hop/STI1 quando ela interage com a PrP.
Figura 25. Espalhamento por SAXS de hop/STI1 livre e PrP:hop/STI1, ajuste teórico realizado com o programa GNOM e análise dos gráficos de Guinier das amostras. (A) As intensidades de espalhamento medidas de uma amostra de hop/STI1 livre 4.5 mg/ml (pontos vermelhos) e uma amostra PrP:hop/STI1 equimolar 4 mg/ml (pontos azuis) são apresentadas em função do vetor de espalhamento, q. Os ajustes realizados com o programa GNOM (linhas verdes) foram obtidos com os valores de Dmax de 198 Å e 162 Å para a hop/STI1 e a PrP:hop/STI1, respectivamente. Os dados (e as correspondentes curvas teóricas) foram normalizados arbitrariamente, de forma de facilitar a visualização. (B) São apresentados os gráficos de Guinier, na região q x Rg< 1, da hop/STI1 (pontos vermelhos) e da PrP:hop/STI1 (pontos azuis). A regressão linhar por mínimos quadrados destes dados (linhas verdes) sugere um Rg de 58.34±1.71 Å para a hop/STI1 e 53.26±1.72 Å para o complexo PrP:hop/STI1 (ver Materiais e Métodos). Os dados foram normalizados de forma arbitraria, novamente.
92
Figura 26. Distribuição de pares distâncias intramoleculares da hop/STI1 e o complexo PrP:hop/STI1. São apresentadas as distribuições de distâncias intramoleculares da hop/STI1 (linha vermelha) e do complexo PrP:hop/STI1 (linha azul), calculadas pelo programa GNOM, a partir do ajuste aos dados de espalhamento, apresentados na Figura 25. As curvas apresentadas foram normalizadas de forma de facilitar a comparação. As distribuições indicam um Rg de 60.24±0.2 Å para a hop/STI1 e 52.26±0.15 Å para o complexo PrP:hop/STI1.
De fato, a comparação entre os valores obtidos de espalhamento direto, I(0), das
amostras analisadas e as de amostras controle (lisozima) sugere que a hop/STI1 é um
monômero, e que o complexo PrP:hop/STI1 é formado por uma molécula de PrP e uma
molécula da hop/STI1 (Tabela 2). Considerando que existe controvérsia sobre o estado
oligomérico da hop/STI1 (PRODROMOU et al., 1999; VAN DER SPUY et al., 2001;
CARRIGAN et al., 2004; FLOM et al., 2007; ONUOHA et al., 2008), tentamos corroborar
este dado. Abordamos esta questão realizando ensaios de eletroforese em géis de
poliacrilamida não desnaturantes (native-PAGE, pelo nome em inglês, native polyacrylamide
gel electrophoresis), e ensaios de cromatografia liquida de alta eficiência de exclusão por
tamanho (SE-HPLC, pelo nome em inglês, size exclusion high-performance liquid
cromatography) usando as colunas TSK-gel 3000SW e Superdex 200 (Fig. 27 e Tabela 2).
Ambos os ensaios indicam que a hop/STI1 se apresenta em solução primordialmente como
um monômero. Native-PAGE mostrou que espécies oligoméricas são muito raras (Fig. 27A).
93
SE-HPLC sugeriu uma forma monomérica alongada e não globular, já que a hop/STI1 elui
com um raio hidrodinâmico equivalente ao de uma proteína globular de 108 kDa (Fig. 27B e
Tabela 2), enquanto ela possui 66 kDa. Este perfil de eluição não deve corresponder a um
dímero da hop/STI1, já que a eluição do dímero de albumina de soro bovina (BSA), cujo
monômero é globular e também possui 66 kDa, elui em volumes sensivelmente menores (Fig.
27B). Em linha com a observação do formato pouco globular da hop/STI1, a p(r) (Fig. 26) da
hop/STI1 (assim como a do complexo PrP:hop/STI1) é uma curva em forma de sino
assimétrica, com uma cauda de queda lenta, o que indica uma molécula alongada e pouco
globular, e o gráfico de Kratky apresenta as características de uma molécula com múltiplos
domínios conectados flexivelmente (Fig. 28).
Figura 27. Avaliação do estado oligomêrico da hop/STI1 e do complexo PrP:hop/STI1. (A) Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% de hop/STI1 em um tampão de amostra nativo (esquerda) e em tampão de amostra desnaturante (direita). Não houve presença de agentes desnaturantes no gel, tampão de corrida ou tampão de amostra nativo; o tampão de amostra desnaturante continha 1% β-mercaptoetanol e 0.5% de dodecil sulfato de sódio (SDS). As amostras não foram fervidas. (B) SE-HPLC em coluna TSK-gel 3000SW das amostras hop/STI1 4.5 mg/ml (linha sólida preta) e PrP:hop/STI1 4 mg/ml (linha sólida cinza). As amostras eluiram com raios hidrodinâmicos equivalentes a proteínas globulares de 108 kDa e 97 kDa, respectivamente. A linha vertical tracejada indica o volume de eluição do dímero de 132 kDa formado pelas proteínas globulares de albumina de soro bovina (BSA). Resultados similares foram obtidos com uma coluna Superdex-200. Inset: Calibração da coluna TSK-gel 3000SW, destacando, com um ponto cinza, a eluição da hop/STI1.
94
Notamos que, quando comparado com hop/STI1 livre, as medidas de SE-HPLC
parecem indicar que amostras de PrP:hop/STI1 eluem como se tivessem um raio de Stokes
menor, pelo que difundem pela coluna como uma partícula com um peso molecular (P. M.)
menor (Fig. 27B e Tabela 2), fato que apóia o evento de compactação sugerido pelos
experimentos de SAXS. Porém, esta evidência não é conclusiva, já que, em pH
aproximadamente neutro, PrP livre tende a eluir em múltiplos picos de baixa
reprodutibilidade, o que poderia explicar a raridade de estudos que mostrem dados de SE-
HPLC para a PrP, usualmente realizados na presença de uréia ou em pH ácidos (MORILLAS
et al., 2001; LU et al., 2001).
Tabela 2. Resumo dos parâmetros estruturais obtidos.
Molécula P. M. equivalente por
SE-HPLC (kDa)
P. M. por
I(0) (kDa)
P. M. da
seqüência (kDa)
Rg (Å)
(Guinier)
Rg (Å)
(GNOM)
Dmax
(Å)
STI1 108 72 66 58.34±1.71 60.24±0.2 198
STI1:PrP 97* 87 89 53.26±1.72 52.26±0.1 162
*: resultado não conclusivo dado o comportamento pouco reprodutível de PrP em ensaios de SE-HPLC.
Em suma, os dados apresentados até o momento indicam que as amostras de hop/STI1
murina com as quais trabalhamos são monodispersas, compostas por moléculas monoméricas,
e ainda sugerem que a hop/STI1 tem um formato alongado com seus domínios globulares
(DP1, TPR1, TPR2a, TPR2b, DP2) conectados por enlaces flexíveis. A interação da hop/STI1
com a PrP parece manter o formato global da hop/STI1, porém dotado de uma robusta
compactação da estrutura terciária, sendo que a estrutura do complexo PrP:hop/STI1
encontra-se menos dispersa espacialmente do que a da hop/STI1 livre apesar da cauda flexível
N-terminal da PrP.
A fim de esclarecer melhor a conformação estrutural da hop/STI1 e do complexo
95
PrP:hop/STI1, reconstruímos modelos de baixa resolução destas moléculas a partir da análise
dos dados experimentais de espalhamento de SAXS, com o uso de software especializado
produzido por Svergun e colaboradores.
Figura 28. Gráfico de Kratky da hop/STI1 e o complexo PrP:hop/STI1. (A) São apresentados os gráficos de Kratky calculados a partir dos espalhamentos da hop/STI1 (pontos vermelhos) e do complexo PrP:hop/STI1 (pontos azuis). Para facilitar a comparação entre os gráficos A e B, a escala do eixo das ordenadas foi ajustado de forma similar a escala do eixo das ordenadas de B. O comportamento das curvas sugere que o complexo PrP:hop/STI1 é mais compacto que a hop/STI1 livre, e que tanto a hop/STI1 como PrP:hop/STI1 são moléculas alongadas e não globulares. (B) É apresentada uma figura esquemática que representa gráficos de Kratky típicos de proteínas globulares (linha azul), proteínas com múltiplos domínios conectados flexivelmente (linha vermelha) e proteínas intrinsecamente desestruturadas (linha rosa). Figura adaptada do site do fórum da Small Angle X-ray
Scattering Initiative for Europe (SAXIER) (www.saxier.org/forum/viewtopic.php?t=337).
Usamos dois tipos de programas que implementam diferentes algoritmos. O primeiro
programa, denominado GASBOR (SVERGUN et al., 2001), implementa métodos de
simulated annealing para encontrar distribuições de resíduos dummy conectados em cadeia
que apresentem um espalhamento teórico, calculado a partir de primeiros princípios (ab
initio), que se ajuste ao espalhamento medido por SAXS. Como podem ser obtidos diferentes
modelos deste tipo, que ajustam o espalhamento experimental com a mesma confiança
estatística, o protocolo envolve o cálculo de uma média espacial de alguns modelos
96
(usualmente dez são suficientes), obtendo-se um modelo final que representa uma espécie de
volume comum (ou consenso) aos modelos calculados, e que reproduz fielmente a forma e o
tamanho de proteínas em solução com uma resolução de aproximadamente 10 Å (SVERGUN
et al., 2001; PETOUKHOV et al., 2007). Denominaremos este tipo de modelos de “modelos
volumétricos”. O segundo programa, denominado BUNCH (PETOUKHOV et al., 2005), cria
modelos aproximadamente da mesma resolução, mas depende da existência de modelos de
alta resolução de alguns dos domínios da proteína de interesse, usualmente calculados por
técnicas como cristalografia por difração de raios-X ou RMN. BUNCH também usa simulated
annealing, mas para implementar um tipo de modelagem de corpos rígidos (rigid body
modeling), já que encontra a posição e orientação ótimas dos modelos de domínios que, por
sua vez, são conectados por segmentos flexíveis, formados por cadeias de resíduos dummy
ligados apropriadamente aos resíduos terminais dos domínios. Como aproximação neste
estudo, os modelos de alta resolução de domínios protéicos usados como input para o
programa BUNCH foram TPR1, TPR2a (SCHEUFLER et al., 2000) da hop/STI1 e PrP121-231
da PrP (RIEK et al., 1996), em conjunto com modelos de homologia do TPR2b, DP1 e DP2
da hop/STI1, calculados pelo servidor LOMETS (WU et al., 2007). Este servidor prevê
aproximadamente a estrutura de proteínas através da análise da homologia a modelos
experimentais de alta resolução já existentes, criando modelos consenso entre 9 programas
independentes. Para o modelo BUNCH do complexo PrP:hop/STI1 foi imposta uma condição
de contato entre os sítios de ligação da PrP e da hop/STI1, ao restringir a distância máxima de
10 Å entre PrP113-128 e hop/STI1230-245.
O resultado do ajuste aos dados experimentais de SAXS, realizado com ambos os
programas, é apresentado na Figura 29. Os modelos volumétricos, calculados por GASBOR,
e os modelos de corpo rígido, calculados por BUNCH, são apresentados na Figura 30, após
ambos serem alinhados pelo programa SUPCOMB (KOZIN et al., 2001). Como pode ser
97
observado, os modelos obtidos por estas duas diferentes metodologias são congruentes e se
superpõem satisfatoriamente.
Figura 29. Ajustes teóricos ao espalhamento por SAXS da hop/STI1 livre e do complexo PrP:hop/STI1, realizados com os programas GASBOR e BUNCH. (A) Ajustes realizados com o programa GASBOR (linhas verdes) e BUNCH (linhas pretas) das intensidades de espalhamento medidas da hop/STI1 livre (pontos vermelhos) e do complexo PrP:hop/STI1 (pontos azuis). No caso do programa GASBOR, são apresentados os espalhamentos de modelos representativos dentre os dez modelos calculados para cada amostra. Os dados (e as correspondentes curvas teóricas) foram normalizados arbitrariamente, de forma de facilitar a visualização.
Os resultados confirmam a forma alongada da hop/STI1 monomérica, bem como a
compactação que aquela proteína sofre quando se liga à PrP em uma estequiometria de 1:1. O
alinhamento do modelo da hop/STI1 livre ao da hop/STI1 na conformação resultante da
interação com a PrP indica que a parte C-terminal da hop/STI1 é a região que experimenta a
compactação, como resultado da aproximação mútua dos domínios TPR2a, TPR2b e DP2
(Fig. 31).
98
Figura 30. Modelos da hop/STI1 livre e do complexo PrP:hop/STI1. (A) Representação esquemática das seqüências da hop/STI1 (esquerda acima) e da PrP (esquerda abaixo). Os domínios globulares são destacados como caixas e aos segmentos flexíveis que conectam os domínios, como linhas. Os números dos resíduos inicias e finais de cada domínio são apresentados embaixo de cada domínio. Também são representadas as três orientações dos modelos apresentados em B e C, que consistem em uma primeira orientação e duas rotações sucessivas desta, de 90o ao redor do eixo z (direita). (B) e (C) Modelos por BUNCH (fileira superior) e superposição destes modelos com os modelos volumétricos obtidos por GASBOR representados com esferas cinzas (fileira inferior). As cores dos domínios e dos segmentos flexíveis que os conectam são os mesmos que os apresentados em (A). Os sítios de ligação PrP113-128 e hop/STI1230-245 são destacados em vermelho. (B) Modelos da hop/STI1. (C) Modelos do complexo PrP:hop/STI1.
99
Figura 31. Alinhamento dos modelos da hop/STI1 livre e da hop/STI1 na conformação resultante da interação com PrP. É apresentado o alinhamento dos modelos por BUNCH da hop/STI1 livre (azul) e da hop/STI1 na conformação resultante da interação com PrP (vermelho), onde a estrutura da PrP foi omitida para facilitar a comparação. As orientações dos modelos são as mesmas que as apresentadas na Figura 30.
100
5. DISCUSSÃO
A interação da PrPC com a hop/STI1 na superfície celular induz a modulação de
múltiplas vias de sinalização molecular, com diferentes impactos sobre a fisiologia celular
(ZANATA et al., 2002; CHIARINI et al., 2002; LOPES et al., 2005; ERLICH et al., 2007;
ARANTES et al., 2009). Não obstante, como estas proteínas não possuem domínios
transmembrana, o mecanismo molecular através do qual sua interação induz a transmissão de
informação para o compartimento intracelular ainda está longe de ser compreendido. A
profusão de estudos que abordaram a análise de respostas celulares ativadas por esta interação
precisa, portanto, ser complementada por uma contrapartida de trabalhos que pesquisem os
mecanismos estruturais que medeiam estes processos.
Com base na diversidade de ligantes (Fig. 6) e processos biológicos regulados pela
PrPC, foi sugerido que ela forme parte de uma plataforma dinâmica da superfície celular que
integra módulos sinalizadores através das interações seletivas com seus ligantes (LINDEN et
al., 2008). Os eventos de sinalização muito provavelmente dependem e são modulados por
alterações estruturais alostéricas, que podem ser propagadas nos distintos parceiros
moleculares envolvidos, especialmente no caso de moléculas restritas espacialmente, como
proteínas de membrana (BRAY & DUKE, 2004; WHITTY, 2008). Desta forma, alterações
estruturais ativadas pela interação entre PrPC e hop/STI1 são de relevância biológica, já que
modificações das estruturas de uma ou ambas proteínas poderiam expor ou ocultar sítios
putativos de ligação envolvidos na formação de complexos protéicos de ordem superior que,
por seu turno, podem regular eventos sinalizadores.
101
5.1 SOBRE AS EVIDÊNCIAS APRESENTADAS NESTE TRABALHO
Usando uma variedade de técnicas, avaliamos o impacto da ligação in vitro da PrP e
hop/STI1 murinas recombinantes sobre distintos níveis de suas estruturas protéicas. A análise
dos dados coletados sugere que esta interação dispara um sensível rearranjo estrutural da
cauda flexível N-terminal da PrP, acompanhada de um desenovelamento parcial do seu
domínio globular C-terminal, na forma de um afrouxamento de estruturas em α-hélice,
envolvendo pelo menos a α-hélice 1 que abrange o segmento PrP143-153. Cabe destacar, que o
efeito observado pela ligação do peptídeo hop/STI1230-245 à PrP demonstrou que estas
modificações estruturais podem ser disparadas por interações locais na interface de ligação da
PrP, localizada na junção entre a cauda flexível e a α-hélice 1 (Fig. 6). Isto sugere que tais
interações desencadeiam uma série de perturbações estruturais que se propagam ao longo do
domínio globular, sem o envolvimento de domínios adicionais da hop/STI1. Este tipo de
alterações estruturais de longo alcance, disparadas pelo acoplamento de um ligante, foram
observadas em várias moléculas sinalizadoras e constitui uma base estrutural para a regulação
alostérica (REMÉNYI et al., 2006). Consistente com esta evidência, foi recentemente
demonstrado que interações de longo alcance entre sítios distantes na sequência primária
afetam propriedades da estrutura local da PrP (CHRISTEN et al., 2009). Adicionalmente, um
estudo de RMN avaliou o impacto de um segmento da cauda N-terminal flexível da PrP sobre
a estrutura de seu domínio globular. As estruturas obtidas por RMN mostraram que uma
cauda N-terminal parcial altera a estrutura do domínio enovelado, e indicaram que a
sequência hidrofóbica rica em glicinas PrP113-125 (cobrindo quase a totalidade do sitio de
ligação da hop/STI1), apesar de flexível, parece apresentar uma estrutura polimórfica
marginalmente estável que se envolve em interações de longo alcance, as quais estabilizam
102
conformações estendidas de α-hélices do domínios globular da PrP (JAMES et al., 1997). O
truncamento deste segmento resulta em um domínio globular da PrP com α-hélices mais
curtas. Estes dados são consistentes com nossa observação de que o engajamento de PrP113-
128, tanto com hop/STI1230-245 ou hop/STI1 inteira, resulta em uma diminuição do conteúdo de
estruturas em α-hélice da PrP, já que este engajamento perturbaria interações críticas de longo
alcance necessárias para estabilizar aquelas estruturas.
Por outro lado, os dados que apresentamos indicam que a hop/STI1 murina é uma
proteína monomérica alongada. Em contraste com esta evidência, alguns estudos anteriores
indicaram que a hop/STI1 de levedura é dimérica (PRODROMOU et al., 1999; FLOM et al.,
2007), assim como o homólogo humano (CARRIGAN et al., 2004; ONUOHA et al., 2008)
para o qual foi sugerido que o domínio de dimerização é o TPR2a (ONUOHA et al., 2008).
Porém, a comparação com a hop/STI1 de levedura não é conclusiva, já que ela apresenta
somente ~40% de homologia à hop/STI1 murina. Não obstante, a homolgia de ~97% entre a
hop/STI1 murina e a humana mostra que a sequência desta última difere da primeira nos
resíduos T243K, K250R e Y269H do domínio de dimerização TPR2a, e o resíduo 269 reside
na interface de dimerização sugerida (ONUOHA et al., 2008). No outro estudo em que foi
analisado o estado oligomérico da hop/STI1 humana (CARRIGAN et al., 2004), a evidência
que apóia a dimerização desta proteína consistiu unicamente de ensaios de SE-HPLC, nos
quais hop/STI1 eluiu em um volume que corresponde a uma proteína globular de 120 kDa.
Este volume de eluição é menor do que o do dímero da proteína globular alumina de soro
bovina (BSA) (132 kDa), cujo monômero tem aproximadamente o mesmo peso molecular
que a hop/STI1 (66 kDa). De fato, 14 mutações pontuais, cobrindo todos os domínios da
hop/STI1, falharam em afetar o volume de eluição. Então, estes dados também são
consistentes com uma proteína monomérica alongada. Importantemente, o único estudo que
analisou o estado oligomérico da hop/STI1 murina, usando SE-HPLC e ligação química
103
cruzada (chemical cross-linking) de três versões da proteína (sem tag, com His-tag e GST-
tag), encontrou estados diméricos e monoméricos para uma versão (His-tag) e estados
monoméricos para as outras duas versões (VAN DER SPUY et al., 2001). Consistente com
este estudo, nossos ensaios de SE-HPLC (usando colunas Superdex-200 e TSK-del 3000SW)
e PAGE nativo, assim como a calibração dos dados de espalhamento de SAXS com padrões
de peso molecular, todos apoiam a interpretação de que a hop/STI1 murina com His-tag
apresenta-se em solução em forma monomérica, com estados oligoméricos superiores muito
menos abundantes.
Esta mesma calibração dos dados de SAXS sugere uma estequiometria de ligação
molar 1:1 para o complexo. Através da obtenção de parâmetros estruturais que caracterizam
de forma global as moléculas analisadas, os dados de SAXS, consistentes com perfis de
eluição de SE-HPLC, indicam que o complexo PrP:hop/STI1 é mais compacto que hop/STI1
livre. Este fato deve ser destacado, já que, em princípio, poderíamos esperar que a cauda
flexível da PrP, que deve explorar distintas conformações transitórias expostas ao solvente,
aumentasse substancialmente o volume ocupado pelo complexo.
A análise dos dados de espalhamento por meio de distintos programas de modelagem
molecular apoiam estas evidências e ainda forneceu maiores esclarecimentos sobre a
organização estrutural destas moléculas. Apesar dos programas utilizados serem baseados em
metodologias diferentes para a análise dos dados experimentais, os modelos de baixa
resolução obtidos foram altamente congruentes. Este modelos representam a hop/STI1 como
uma proteína estendida do tipo beads-on-a-string, e o complexo PrP:hop/STI1 como uma
molécula de conformação similar, porém mais compacta, onde a cauda N-terminal da PrP se
mostra ocupando um volume restrito. A ligação da PrP parece resultar em uma sensível
modificação da estrutura terciária da hop/STI1, na forma de um aproximação mútua entre os
104
domínios TPR2a, TPR2b e DP2 da região mais C-terminal da hop/STI1, mantendo a
organização global da parte N-terminal da molécula, incluindo os domínios TPR1 e DP1.
5.2 IMPLICAÇÕES PARA O MECANISMO SINALIZADOR
É tentador especular que as alterações conformacionais demonstradas, induzidas pela
interação PrP:hop/STI1, modifiquem as afinidades destas proteínas por outros ligantes. A
evidência de que a ligação de hop/STI1 induz um rearranjo estrutural da PrP na forma de uma
redução do conteúdo de α-hélices desta última, envolvendo, pelo menos, uma perturbação
estrutural da α-hélice do segmento PrP143-153, é de particular relevância. Como foi
mencionado, a interação da PrPC com a hop/STI1 precisa de um parceiro transmembrana que
seja capaz de acoplar os eventos moleculares que envolvem estas proteínas no meio
extracelular à sinalização intracelular demonstrada. A α-hélice do segmento PrP143-153 é uma
parte fundamental do sítio de ligação de dois dos ligantes da PrPC melhor caracterizados, o
precursor do receptor de laminina (LRP) (HUNDT et al., 2001) e a molécula de adesão
celular neural (N-CAM) (SCHMITT-ULMS et al., 2001), ambas proteínas transmembrana
envolvidas tanto no tráfego e na sinalização mediada por PrPC (GAUCZYNSKI et al., 2001;
SANTUCCIONE et al., 2005; NIKLES et al., 2008), quanto na citopatologia mediada por
PrPSc (RIEGER et al., 1997; LEUCHT et al., 2003). Desta forma, como veremos a seguir,
perturbações da estrutura desta α-hélice poderiam resultar em alterações da afinidade por
estes ligantes transmembrana, com prováveis consequências para a sinalização que eles
carreiam para o meio intracelular.
Diversos estudos realizados em culturas de neurônios PC12 demonstraram que N-
105
CAM regula eventos neuritogênicos através de dois processos diferentes: mediante a ligação
direta com o receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) e mediante interações
indiretas com a tirosina cinase não receptora FYN (revisado por CHEKHONIN et al., 2007).
Várias vias de sinalização intracelulares são ativadas por estas duas interações, porém, elas se
integram na via das ERK, associada à regulação do citoesqueleto, da transcrição gênica, e de
eventos de neuritogênese. Interessantemente, a PrPC liga a N-CAM nos aa N-CAM645-679
(SCHMITT-ULMS et al., 2001) e o FGFR interage com o segmento adjacente N-CAM681-695
(KISELYOV et al., 2003; CHEKHONIN et al., 2007), pelo que PrPC e FGFR poderiam
competir pela N-CAM, com consequências sobre a sinalização intracelular. Consistente com
esta hipótese, experimentos realizados por nosso grupo demonstraram que tanto a estrutura da
α-hélice 1 da PrPC (este trabalho), que faz parte da interface de ligação com o N-CAM,
quanto a via da ERK (CHIARINI et al., 2002; LOPES et al., 2005; ERLICH et al., 2007) são
perturbadas e ativadas, respectivamente, pela interação PrPC:hop/STI1. Desta forma, as
alterações conformacionais que observamos na PrPC após formação do complexo
PrPC:hop/STI1 poderiam representar um substrato estrutural para uma perturbação da via N-
CAM/FGFR por meio da alteração da afinidade da PrPC pela N-CAM, o que poderia
explicaria a ativação da via da ERK e a subsequente neuritogênese.
Ao mesmo tempo, a via de sinalização da N-CAM através da cinase FYN também
poderia ser modulada pela alteração da afinidade da PrPC pela N-CAM, como conseqüência
da interação PrPC:hop/STI1. Esta via neuritogênica depende da formação de aglomerados
homofílicos de N-CAMs dentro de balsas lipídicas, resultando indiretamente em um aumento
dos níveis de fosforilação da FYN e, subsequentemente, os da ERK (CHEKHONIN et al.,
2007). A interação PrPC:N-CAM poderia afetar a formação destes aglomerados de N-CAM e,
compatível com esta hipótese, a ligação cruzada da PrPC na superfície celular por meio de
anticorpos monoclonais dispara uma série de eventos intracelulares neuritogênicos que são
106
idênticos, em vários dos processos moleculares envolvidos, aos ativados pela ligação cruzada
da N-CAM que resulta no engajamento da FYN (SANTUCCIONE et al., 2005; PANTERA et
al., 2009).
Por outro lado, foi demonstrado que a PrPC liga-se, na superfície celular, ao LRP e/ou
a putativa isoforma madura do receptor de laminina (LR) (RIEGER et al., 1997;
GAUCZYNSKI et al., 2001), e que a interface de ligação inclui a α-hélice 1 da PrPC e o
segmento de aa LRP/LR161-179 (HUNDT et al., 2001). A funcionalidade desta interação ainda
não foi esclarecida, mas foi sugerido que o LRP atue como um receptor que regula a
internalização da PrPC (GAUCZYNSKI et al., 2001). Interessantemente, o segmento PrP173-
182, que se sobrepõe parcialmente ao sítio de ligação do LRP/LR, interage com a laminina
através do C-terminal da cadeia γ desta, com consequências neuritogênicas (GRANER et al.,
2000a, 2000b), e atuando no hipocampo de ratos favorecendo a consolidação de memórias
aversivas (COITINHO et al., 2006). Ainda mais, o LRP/LR interage com a PrPC e a laminina
através do mesmo sitio (LRP/LR161-179), pelo que a dinâmica das interações entre o trio
formado pela PrPC, o LRP/LR e a lamina exibe uma rica complexidade, com interações
mutuamente exclusivas que podem ser significativas para os mecanismos moleculares de
sinalização envolvidos (LINDEN et al., 2008). Desta forma, as alterações estruturais
observadas na α-hélice 1 da PrPC, disparadas pela interação com a hop/STI1, podem ter um
importante efeito sobre esta intrincada rede de interações sinalizadoras.
De fato, a interação do LRP/LR com a laminina vai além de conferir estabilidade
estrutural durante a adesão celular e deve ser capaz de ativar transdução de sinais celulares, já
que induz outros processos dinâmicos envolvidos na diferenciação celular, como aumento de
filopódios, indução de mobilidade direcionada e modulação da expressão gênica (revisado por
NELSON et al., 2008). De fato, estudos inicias em células tumorais evidenciaram que esta
107
interação estimula a desfosforilação de MAP cinases da família ERK, JNK e p38 (GIVANT-
HORWITZ et al., 2004).
Com respetio à hop/STI1, ela é reconhecida como um proteína adaptadora que
coordena a montagem dinâmica do complexo de chaperonas HSP90:hop/STI1:HSP70. A
formação deste complexo é acompanhada por modificações conformacionais. A ligação de
HSP90 pela hop/STI1 altera o número de sítios de ligação hop/STI1:HSP70, resultando em
um aumento de 5 vezes da afinidade de hop/STI1 pela HSP70 (HERNÁDEZ et al., 2002).
Podemos especular que, em analogia ao mecanismo do complexo HSP90:hop/STI1:HSP70,
as modificações observadas da estrutura terciária da hop/STI1, disparada pela interação com
PrP, poderiam alterar a afinidade da hop/STI1 pelos seus ligantes. Ainda mais, proteínas com
múltiplos domínios TPR, tais como a hop/STI1, foram associadas com o recrutamento de
complexos multiprotéicos, servindo como plataformas estruturais capazes de múltiplas
interações e da catálise de diversos processos biológicos (BLATCH & LASSLE, 1999).
Assim a aproximação, ativada pela ligação de PrP, dos domínios TPR2a, TPR2b e DP2 da
hop/STI1 poderia aproximar seus ligantes, facilitando interações adicionais com
consequências biológicas.
Trabalhos prévios realizados em explantes de retinas murinas e em culturas de
neurônios hipocampais, demonstraram que o peptídeo hop/STI1230-245 é capaz de mimetizar o
efeito da hop/STI1 inteira, engajando a PrP na superfície celular e disparando eventos
sinalizadores tróficos (ZANATA et al., 2002; LOPES et al., 2005). Então, nossa observação
de que tanto o peptídeo hop/STI1230-245 quanto a hop/STI1 inteira perturbam de forma similar
a estrutura secundária da PrP nos leva a sugerir que esta modificação conformacional da PrP
seja o mecanismo molecular chave responsável pela ativação de sinais neurotróficos nessas
preparações. Por outro lado, enquanto a hop/STI1 inteira induz proliferação de culturas
108
celulares de glioblastomas, de forma dependente da PrPC (ERLICH et al., 2007), o peptídeo
hop/STI1230-245 não teve efeito (S. Kahn, R.B. Erlich, L.B.Chiarini, R. Linden, V.R. Martins
and V. Moura-Neto, dados não publicados), sugerindo que para a ativação destes sinais, outros
domínios da hop/STI1, aparte o segmento que liga a PrPC, são necessários. A aproximação
dos domínios TPR2a, TPR2b e DP2 da hop/STI1, disparado pela interação com PrP, levanta a
hipótese de que os domínios C-terminais da hop/STI1 poderiam estar envolvidos nestes sinais
proliferativos.
Em conclusão, as alterações estruturais recíprocas da hop/STI1 e da PrPC aqui
demonstradas constituem um mecanismo versátil que pode ajudar a explicar a variedade de
sinais intracelulares disparados por esta interação. Os dados apresentados neste trabalho são
consistentes tanto com a ideia de que PrPC serve de plataforma dinâmica para complexos
funcionais multiprotéicos compostos de várias combinações de ligantes dependentes do tipo
celular, quanto com a hipótese de que estes complexos multiprotéicos estejam envolvidos na
patogênese das doenças por príons, talvez ao conferir caraterísticas patológicas distintas,
dependendo das combinações específicas de ligantes da PrPC (LINDEN et al., 2008).
109
6. CONCLUSÕES
•••• A formação do complexo PrP:hop/STI1, constituído por uma molécula de cada proteína,
é acompanhada por uma remodelação recíproca das estruturas protéicas.
•••• A estrutura secundária da PrP sofre uma redução no conteúdo de α-hélices após a
ligação tanto da hop/STI1 inteira quanto do peptídeo hop/STI1230-245, enquanto a
estrutura secundária da hop/STI1 parece permanecer inalterada pela interação com PrP.
•••• Tanto o N-terminal da PrP, quanto a α-hélice que cobre o segmento de aa PrP143-153
sofrem perturbações estruturais disparadas pela ligação do peptídeo hop/STI1230-245.
•••• A ligação do peptídeo hop/STI1230-245 pela PrP induz a perturbação e exposição ao
solvente de cavidades hidrofóbicas desta última, enquanto a interação do peptídeo
PrP113-132 com hop/STI1 não parece afetar este tipo de cavidades na hop/STI1.
•••• A hop/STI1 murina é monomérica em solução pH 7.4, e possui uma forma pouco
globular típica de proteínas multidomínio, cujos domínios são ligados flexivelmente.
•••• O complexo PrP:hop/STI1 é mais compacto do que a hop/STI1 livre.
•••• Quando a hop/STI1 liga PrP, a primeira sofre um rearranjo da sua estrutura terciária,
que envolve a compactação do C-terminal desta última, enquanto o N-terminal
permanece globalmente inalterado.
•••• Estas alterações conformacionais provavelmente repercutem sobre a capacidade de
interação com terceiros ligantes, com possíveis efeitos sobre a sinalização celular.
110
7. REFERÊNCIAS AGUZZI, A., POLYMENIDOU, M. Mammalian prion biology: one century of evolving concepts. Cell, v. 116, p. 313-327, 2004. AGUZZI, A., HEIKENWALDER, M. Pathogenesis of prion diseases: current status and future outlook. Nature Reviews Microbiology, v. 4, n. 10, p. 765-775, 2006. AGUZZI, A., BAUMANN, F., BREMER, J. The prion’s elusive reason of being. Annual Review of Neurosciences, v. 31, p. 439-477, 2008. ALPER, T, CRAMP, W.A., HAIG, D.A., CLARKE, M.C. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? Nature, v. 214, p. 764-766. ALONSO, D.O., DEARMOND, S.J., COHEN, F.E., DAGGET, V. Mapping the early steps in the pH-induced conformational conversion of the prion protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, p. 2985-2989, 2001. AMERICO, T.A., CHIARINI, L.B., LINDEN, R. Signaling induced by hop/STI-1 depends on endocytosis. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 358, n. 2, p. 620-625, 2007. ANDERSON, R.G.W. The caveolae membrane system. Annual Review of Biochemistry, v. 67, p. 199-225, 1998.
ARANTES, C., NOMIZO, R., LOPES, M.H., HAJJ, G.N.M., LIMA, F.R.S., MARTINS, V.R. Prion protein and its ligand stress inducible protein 1 regulate astrocyte development. Glia, no prelo, 2009.
ARRUDA-CARVALHO, M., NJAINE, B., SILVEIRA, M.S., LINDEN, R., CHIARINI, L.B. Hop/STI1 modulates retinal proliferation and cell death independent of PrPC. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 361, p. 474-480, 2007.
BAUMANN, F., TOLNAY, M., BRABECK, C., PAHNKE, J., KLOZ, U., NIEMANN, H.H., HEIKENWALDER, M., RULICKE, T., BURKLE, A., AGUZZI, A. Lethal recessive myelin toxicity of prion protein lacking its central domain. EMBO Journal, v. 26, p. 538-547, 2007.
BEERE, H.M. "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. Journal of Cell Science, v. 117. n. 13, p. 2641-51, 2004. BERINGUE, V., MALLINSON, G., KAISAR, M., TAYEBI, M., SATTAR, Z., JACKSON, G., ANSTEE, D., COLLINGE, J., HAWKE, S. Regional heterogeneity of cellular prion protein isoforms in the mouse brain. Brain, v. 126, p. 2065-2073, 2003. BEROVA N, NAKANISHI J, WOODY RW. Circular Dichroism: Principles and Applications, 2nd ed. Wiley-VCH, New York, 2000. BLATCH, G.L., LASSLE, M. The tetratricopeptide repeat: a structural motif mediating protein-protein interactions. Bioessays, v. 21, p. 932-9, 1999.
111
BOLTON, D.C., McKINLEY, M.P., PRUSINER, S.B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science, v. 218, p. 1309–1311, 1982. BORCHELT, D.R., TARABOULOUS, A., PRUSINER, S.B. Evidence for synthesis of scrapie prion proteins in the endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry, v. 267, p. 16188-16199. BOUNHAR, Y., ZHANG, Y., GOODYER, C.G., LEBLANC, A. Prion protein protects human neurons against Bax-mediated apoptosis. The Journal of Biological Chemistry, v. 276, n. 42, p. 39145-39149, 2001. BRANDNER, S., ISENMANN, S., RAEBER, A., FISCHER, M., SAILER, A., KOBAYASHI, Y., MARINO, S., WEISSMANN, C., AGUZZI, A. Normal host prion protein necessary for scrapie-induced neurotoxicity. Nature, v. 379, p. 339-343, 1996. BRAY, D., DUKE, T. Conformational spread: the propagation of allosteric states in large multiprotein complexes. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structure, v. 33, p. 53-73, 2004. BROWN, D.R., SCHMIDT, B., KRETZSCHMAR, H.A. Role of microglia and host prion protein in neurotoxicity of a prion protein fragment. Nature, v. 380, n. 6572, p. 345-347, 1996. BROWN, D.R., QIN, K., HERMS, J.W., MADLUNG, A., MANSON, J., STROME, R., FRASER, P.E., KRUCK, T., VON BOHLEN, A., SCHULZ-SCHAEFFER, W., GIESE, A., WESTAWAY, D., KRETZSCHMAR, H. The cellular prion protein binds copper in vivo. Nature, v. 390, n. 6661, p. 684-687, 1997a. BROWN, D.R., SCHMIDT, B., KRETZSCHMAR, H.A. Effects of oxidative stress on prion protein expression in PC12 cells. International Journal of Developmental Neuroscience, v. 15, n. 8, p. 961-972, 1997b. BROWN, D.R., SCHULZ-SCHAEFFER, W.J., SCHMIDT, B., KRETZSCHMAR, H.A. Prion protein-deficient cells show altered response to oxidative stress due to decreased SOD-1 activity. Experimental Neurology, v. 146, n. 1, p. 104-112, 1997c. BROWN, D.R., WONG, B.S., HAFIZ, F., CLIVE, C., HASWELL, S.J., JONES, I.M. Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase. Biochemical Journal, v. 344, p. 1–5, 1999. BÜELER, H., FISCHER, M., LANG, Y., BLUERHMANN, H., LIPP, H.P., DEARMOND, S.J., PRUSINER, S.B., AGUET, M., WEISSMAN, C. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature, v. 356, p. 577-582, 1992. BÜELER, H., AGUZZI, A., SAILER, A., GREINER, R.A., AUTENRIED, P., AGUET, M., WEISSMANN, C. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell, v. 73, n. 7, p. 1339-1347, 1993. BUKAU, B., HORWICH, A.L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell, v. 92. n. 3,
112
p. 351-66, 1998.
BURKLE, A., KRETZSCHMAR, H.A., BROWN, D.R. Poly(ADP-ribose) immunostaining to detect apoptosis induced by a neurotoxic fragment of prion protein. The Histochemical Journal, v. 31, n. 11, p. 711-716, 1999. CAETANO, F.A., LOPES, M.H., HAJJ, G.N., MACHADO, C.F., PINTO ARANTES, C., MAGALHÃES, A.C., VIEIRA M.P., AMÉRICO, T.A., MASSENSINI, A.R., PRIOLA, S.A., VORBERG, I., GÓMEZ, M.V., LINDEN, R., PRADO, V.F., MARTINS, V.R., PRADO, M.A. Endocytosis of prion protein is required for ERK1/2 signaling induced by stressinducible protein 1. The Journal of Neuroscience, v. 28, n. 26, p. 6691-6702, 2008. CALZOLAI, I., ZAHN, R. Influence of pH on NMR structure and stability of the human prion protein globular domain. Journal of Biological Chemistry, v. 278, p. 35592-35596. CALZOLAI, L., LYSEK, D.A., PEREZ, D.R., GUNTERT, P., WUTHRICH, K. Prion protein NMR structures of chickens, turtles, and frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 102, p. 651-655, 2005. CARRELLO, A., INGLEY, E., MINCHIN, R.F., TSAI, S., RATAJCZAK, T. The common tetratricopeptide repeat acceptor site for steroid receptor-associated immunophilins and hop is located in the dimerization domain of Hsp90. Journal of Biological Chemistry, v. 274, p. 2682-2689, 1999.
CARRIGAN, P.E., NELSON, G.M., ROBERTS, P.J., SOFFER, J., RIGGS, D.L., SMITH, D.F. Multiple domains of the co-chaperone hop are important for Hsp70 binding. Journal of Biological Chemistry, v. 279, p.16185-16193, 2004. CAUGHEY, B., RAYMOND, G.J. The Scrapie-associated form of PrP is made from a cell-surface precursor that is both protease-sensitive and phospholipase-sensitive. Journal of Biological Chemistry, v. 266, p. 18217-18233, 1991. CAUGHEY, B., LANSBURY, P.T. Jr. Protofibrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders. Annual Review of Neuroscience, v. 26, p. 267-298, 2003.
CHEKHONIN, V.P., SHEPELEVA, I.I., GURINA, O.I. Signal functions of NCAM. Neurochemical Journal, v. 1: 113-126, 2007.
CHEN, S., PRAPAPANICH, V., RIMERMAN, R.A., HONORE, B., SMITH, D.F. Interactions of p60, a mediator of progesterone receptor assembly, with heat shock proteins hsp90 and hsp70. Molecular Endocrinology, v. 10, p. 682-93, 1996.
CHEN S, SMITH DF. Hop as an adaptor in the heat shock protein 70 (Hsp70) and hsp90 chaperone machinery. Journal of Biological Chemistry, v. 273, p. 35194-200, 1998.
CHEN, S., MANGE, A., DONG, L., LEHMANN, S., SCHACHNER M. Prion protein as trans-interacting partner for neurons is involved in neurite outgrowth and neuronal
113
survival. Molecular and Cellular Neurosciensce, v. 22, p. 227–233, 2003. CHERESH, D.A., PIERSCHBACHER, M.D., HERZIG, M.A., MUJOO, K. Disialogangliosides GD2 and GD3 are involved in the attachment of human melanoma and neuroblastoma cells to extracellular matrix proteins. Journal of Cell Biology, v. 102, p. 688–696, 1986. CHESEBRO, B., TRIFILO, M., RACE, R., MEADE-WHITE, K., TENG, C., LaCASSE, L.R., FAVARA, C., BARON, G., PRIOLA, S., CAUGHEY, B., MASLIAH, E., OLDSTONE, M. Anchorless prion protein results in infectious amyloid disease without clinical scrapie. Science, v. 308, p. 1435-1439, 2005. CHIARINI, L.B., FREITAS, A.R., ZANATA, S.M., BRENTANI, R.R., MARTINS, V.R., LINDEN, R. Cellular prion protein transduces neuroprotective signals. The EMBO Journal, v. 21, n. 13, p. 3317-3326, 2002. CHOI, C.J., KANTHASAMY, A., ANANTHARAM, V., KANTHASAMY, A.G. Interaction of metals with prion protein: possible role of divalent cations in the pathogenesis of prion diseases. Neurotoxicology, v. 27, p. 777–787, 2006. CHRETIEN, F., DORANDEU, A., ADLE-BIASSETTE, H., ERAU, T., WINGERTSMANN, L., BRION, F., GRAY, F. A process of programmed cell death as a mechanisms of neuronal death in prion diseases. Clininical and Experimental Pathology, v. 47, p. 181-191, 1999. CHRISTEN, B., HORNEMANN, S., DAMBERGER, F.F., WUTHRICH, K. Prion protein NMR structure form Tammar Wallaby (Macropus eugenii) shows that the b2-a2 loop is modulates by long-range sequence effects. Journal of Molecular Biology, no prelo, doi: 10.1016/j.jmb.2009.04.040, 2009. COITINHO, A.S., DIETRICH, M.O., HOFFMANN, A., DALL’IGNA, O.P., SOUZA, D.O., MARTINS, V.R., BRENTANI, R.R., IZQUIERDO, I., LARA, D.R. Decreased hyperlocomotion induced by MK-801, but not amphetamine and caffeine In mice lacking cellular prion protein (PrP(C)). Brain Research Molecular Brain Research, v. 107, p. 190-194, 2002. COITINHO, A.S., ROESLER, R., MARTINS, V.R., BRENTANI, R.R., IZQUIERDO, I. Cellular prion protein ablation impairs behavior as a function of age. Neuroreport, v. 14, p. 1375-1379, 2003. COITINHO, A.S., FREITAS, A.R., LOPES, M.H., HAJJ, G.N., ROESLER, R,. WALZ, R., ROSSATO, J.I., CAMMAROTA, M., IZQUIERDO, I., MARTINS, V.R., BRENTANI, R.R. The interaction between prion protein and laminin modulates memory consolidation. European Journal of Neuroscience, v. 24, p. 3255-3264, 2006. COITINHO, A.S., LOPES, M.H., HAJJ, G.M., ROSSATO, J.I., FREITAS, A.R., CASTRO, C.C., CAMMAROTA, M., BRENTANI, R.R., IZQUIERDO, I., MARTINS, V.R. Short-term memory formatio and long-term memory consolidation are enhanced by cellular prion association to stress-inducible protein 1. Neurobiology of Disease, v. 26, p. 282-290, 2007.
114
COLLING, S.B., COLLINGE, J., JEFFERYS, J.G. Hippocampal slices from prion protein null mice: disrupted Ca2 -activated K currents. Neuroscience Letters, v. 209, p. 49–52, 1996. COLLINGE, J., WHITTINGTON, M.A., SIDLE, K.C., SMITH, C.J., PALMER, M.S., CLARKE, A.R., JEFFERYS, J.G. Prion protein is necessary for normal synaptic function. Nature, v. 370, n. 6487, p. 295-297, 1994. COLLINS, S.B., LAWSON, V.A., MASTERS, C.L. Transmissible spongiform encephalophaties. Lancet, v. 363, n. 9402, p. 51-61, 2004. CRIADO, J.R., SANCHEZ-ALVAREZ, M., CONTI, B., GIACCHINO, J.L., WILLS, D.N., HENRIKSEN, S.J., RACE, R., MANSON, J.C., CHESEBRO, B., OLDSTONE, M.B. Mice devoid of prion protein have cognitive deficits that are rescued by reconstitution of PrP in neurons. Neurobiology of Disease, v. 19, p. 255-265, 2005. DEARMOND, S.J., QIU, Y., SANCHEZ, H., SPILMAN, P.R., NINCHAK-CASEY, A., ALONSO, D., DAGGET, V. PrPc glycoform heterogeneity as a function of brain region: implications for selective targeting of neurons by prion strains. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, v. 58, p. 1000-1009, 1999. DEMAND, J., LUDERS, J., HOHFELD, J. The carboxy-terminal domain of Hsc70 provides binding sites for a distinct set of chaperone cofactors. Molecular and Cellular Biology, v. 18, p. 2023-2028, 1998. DEMARCO, M.L., DAGGET, V. Local environmental effects on the structure of the prion protein. Comptes Rendus Biologies, v. 328, p. 847-862, 2005.
DITTMAR, K.D., HUTCHISON, K.A., OWENS-GRILLO, J.K., PRATT, W.B. Reconstitution of the steroid receptor.hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. Journal of Biological Chemistry, v. 271, p. 12833-9, 1996. DONNE, D.G., VILES, J.H., GROTH, D., MEHLHORN, I., JAMES, T.L., COHEN, F.E., PRUSINER, S.B., WRIGHT, P.E., DYSON, H.J. Structure of the recombinant full-length hamster prion protein PrP(29-231): The N terminus is highly flexible. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 94, p. 13452-13457, 1997. DORANDEU, A., WINGERTSMANN, L., CHRETIEN, F., DELISLE, M.B., VITAL, C., PARCHI, P., MONTAGNA, P., LUGARESI, E., IRONSIDE, J.W., BUDKA, H., GAMBETTI, P., GRAY, F.. Neuronal apoptosis in fatal familial insomnia. Brain Pathology, v. 8, p. 531-537, 1998. EBERL, H., TITTMANN, P., GLOCKSHUBER, R. Characterization of recombinant, membrane-attached full-length prion protein. Journal of Biological Chemistry, v. 279, p. 25058-25065, 2004. ERLICH, R.B., KAHN, S.A., LIMA, F.R., MURAS, A.G., MARTINS, R.A., LINDEN, R., CHIARINI, L.B., MARTINS, V.R., MOURA NETO, V. STI1 promotes glioma proliferation
115
through MAPK and PI3K pathways. Glia, v. 55, p. 1690-1698, 2007. FOURNIER, J.G., ESCAIG-HAYE, F., BILLETTE DE VILLEMEUR, T., ROBAIN, O. Ultrastructural localization of cellular prion protein (PrPc) in synaptic boutons of normal hamster hippocampus. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences III, v. 318, n. 3, p. 339-344, 1995. FLOM, G., BEHAL, R.H., ROSEN, L., COLE, D.G., JOHNSON, J.L. Definition of the minimal fragments of STI1 required for dimerization, interaction with Hsp70 and Hsp90 and in vivo functions. Biochemical Journal, v. 404, 159-167, 2007. FREIRE, E., COELHO-SAMPAIO, T. Self-assembly of laminin induced by acidic pH. Journal of Biological Chemistry, v. 275, p. 817-822, 2000. GALVAN, C., CAMOLETTO, P.G., DOTTI, C.G., AGUZZI, A., LEDESMA, M.D. Proper axonal distribution of PrP(C) depends on cholesterol-sphingomyelin-enriched membrane domains and is developmentally regulated in hippocampal neurons. Moleular and Cellular Neuroscience, v. 30, p. 304–315, 2005. GAUCZYNSKI, S., PEYRIN, J.M., HAIK, S., LEUCHT, C., HUNDT, C., RIEGER, R., KRASEMANN, S., DESLYS, J.P., DORMONT, D., LASMEZAS, C.I., WEISS, S. The 37-kDa/67-kDa laminin receptor acts as the cell-surface receptor for the cellular prion protein. EMBO Journal, v. 20, p. 5863–5875, 2001. GIBBS, C.J Jr., GAJDUSEK, D.C., LATARJET, R. Unusual resistance to ionizing radiation of the virus of kuru, Creutzfeldt-Jakob disease, and scrapie. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 75, p. 6268-6270, 1978. GILL, A.C., RITCHIE, M.A., HUNT, L.G., STEANE, S.E., DAVIES, K.G., BOCKING, S.P., RHIE, A.G., BENNETT, A.D., HOPE, J. Post-translational hydroxylation at the N-terminus of the prion protein reveals presence of PPII structure in vivo. The EMBO Journal, v. 19, n. 20, p. 5324-5331, 2000. GIVANT-HORWITZ, V., DAVIDSON, B., REICH, R. Laminin-induced signaling in tumor cells: the role of the Mr 67,000 laminin receptor. Cancer Research, v. 64, p. 3572-3579, 2004. GLATTER, O., KRATKY, O. Small angle X-ray Scattering. Academic Press, New York. 1982. GRANER, E., MERCADANTE, A.F., ZANATA, S.M., FORLENZA, O.V., CABRAL, A.L., VEIGA, S.S., JULIANO, M.A., ROESLER, R., WALZ, R., MINETTI, A., IZQUIERDO, I., MARTINS, V.R., BRENTANI, R.R. Cellular prion protein binds laminin and mediates neuritogenesis. Brain Research Molecular Brain Research, v. 76, n. 1, p. 85-92, 2000a. GRANER, E., MERCADANTE, A.F., ZANATA, S.M., MARTINS, V.R., JAY, D.G., BRENTANI, R.R. Laminin-induced PC-12 cell differentiation is inhibited following laser inactivation of cellular prion protein. FEBS Letters, v. 482, p. 257–260, 2000b.
116
GRAY, F., CHRETIEN, F., ADLE-BIASSETTE, H., DORANDEU, A., ERAU, T., DELISLE, M.B., KOPP, N., IRONSIDE, J.W., VITAL, C. Neuronal apoptosis in Creutzfeldt-Jakob disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, v. 58, p. 321-328, 1999. HAEBERLE, A.M., RIBAUT-BARASSIN, C., BOMBARDE, G., MARIANI, J., HUNSMANN, G., GRASSI, J., BAILLY, Y. Synaptic prion protein immunoreactivity in the rodent cerebellum. Microscscopy Research and Techique, v. 50, p. 66–75, 2000. HACHIYA, N.S., IMAAWA, M., KANEKO, K. The possible role of protein X, a putative auxiliary factor in pathological prion replication, in regulating a physiological endoproteolytic cleavage of cellular prion protein. Medical Hypotheses, v. 68, n. 3, p. 670-673, 2007. HAJJ, G.N., LOPES, M.H., MERCADANTE, A.F., VEIGA, S.S., DA SILVEIRA, R.B., SANTOS, T.G., RIBEIRO, K.C., JULIANO, M.A., JACCHIERI, S.G., ZANATA, S.M., MARTINS, V.R. Cellular prion protein interaction with vitronectin supports axonal growth and is compensated by integrins. Journal of Cell Science, v. 120, n. Pt 11, p. 1915-1926, 2007. HAMMERSLEY, A.P., SVENSSON, S.O., HANFLAND, M., FITCH, A.N., HAÜSSERMANN, D. Two-Dimensional Detector Software: From Real Detector to Idealised Image or Two-Theta Scan. High Pressure Research, v. 14, p. 235-248, 1996. HARAGUCHI, T., FISHER, S., OLOFSSON, S., ENDO, T., GROTH, D., TARENTINO, A., BORCHELT, D.R., TEPLOW, D., HOOD, L., BURLINGNAME, A. Asparagine-linked glycosylation of the scrapie and cellular prion proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 274, p. 1-13, 1989. HARRIS, D.A. Cellular biology of prion diseases. Clinical Microbiology Reviews, v. 12, n. 3, p. 429-444, 1999. HARTL, F.U., HAYER-HARTL, M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science, v. 295, p. 1852-8, 2002.
HEDGE, R.S., MASTRIANNI, J.A., SCOTT, M.R., DEFEA, K.A., TREMBLAY, P., TORCHIA, M., DEARMOND, S.J., PRUSINER, S.B., LINGAPPA, V.R. A Transmembrane Form of the Prion Protein in Neurodegenerative Disease. Science, v. 279, p. 827-834, 1998. HERMS, J., TINGS, T., GALL, S., MADLUNG, A., GIESE, A., SIEBERT, H., SCHURMANN, P., WINDL, O., BROSE, N., KRETZSCHMAR, H. Evidence of presynaptic location and function of the prion protein. Journal of Neuroscience, v. 19, p. 8866–8875, 1999. HERMS, J.W., TINGS, T., DUNKER, S., KRETZSCHMAR, H.A. Prion protein affects Ca2+-activated K+ currents in cerebellar purkinje cells. Neurobiology of Disease, v. 8, n. 2, p. 324-330, 2001. HERNÁNDEZ, M.P., SULLIVAN, W.P., TOFT, D.O. The assembly and intermolecular properties of the hsp70-Hop-hsp90 molecular chaperone complex. Journal of Biological Chemistry, v. 277, p. 38294-38304, 2002.
117
HETZ, C., MAUNDRELL, K., SOTO, C. Is loss of function of prion protein the cause of prion disorders? Trends in Molecular Medicine, v. 9, n. 6, p. 237-243, 2003. HICKS, M.R., GILL, A.C., BATH, I.K., RULLAY, A.K., SYLVESTER, I.D., CROUT, D.H., PINHEIRO, T.J. Synthesis and structural characterization of a mimetic membrane-anchored prion protein. FEBS Journal, v. 273, p. 1285-1299, 2006. HORNEMANN, S., GLOCKSHUBER, R. A scrapie-like unfolding intermediate of the prion protein domain PrP(121-231) induced by acidic pH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 95, p. 6010-6014, 1998. HORNEMANN, S., SCHORN, C., WUTHRICH, K. NMR structure of the bovine prion protein isolated from healthy calf brains. EMBO Reports, v. 5, p. 1159-1164, 2004. HORNSHAW, M.P., MCDERMOTT, J.R., CANDY, J.M. Copper binding to the N-terminal tandem repeat regions of mammalian and avian prion protein. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 207, n. 2, p. 621-629, 1995. HUBER, R., DEBOER, T., TOBLER, I. Prion protein: a role in sleep regulation? Journal of Sleep Research, v. 8, p. 30-36, 1999. HUBER, R., DEBOER, T., TOBLER, I. Sleep deprivation in prion protein deficient mice sleep deprivation in prion protein deficient mice and control mice: genotype dependent regional rebound. Neuroreport, v. 13, p. 1-4, 2002. HUNDT, C., PEYRIN, J.M., HAIK, S., GAUCZYNSKI, S., LEUCHT, C., RIEGER, R., RILEY, M.L., DESLYS, J.P., DORMONT, D., LASMEZAS, C.I., WEISS, S. Identification of interaction domains of the prion protein with its 37-kDa/67-kDa laminin receptor. EMBO Journal, v. 20, p. 5876–5786, 2001. JACKSON, G.S., MURRAY, I., HOSSZU, L.L., GIBBS, N., WALTHO, J.P., CLARKE, A.R., COLLINGE, J. Location and properties of metal-binding sites on the human prion protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, p 8531–8535, 2001. JAMES, T.L., LIU, H., ULYANOV, N.B., FARR-JONES, S., ZHANG, H., DONNE, D.G., KANEKO, K., GROTH, D., MEHLHORN, I., PRUSINER, S.B., COHEN, F.E. Solution structure of a 142-residue recombinant prion protein corresponding to the infectious fragment of the scrapie isoform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 94, p. 10086-10091, 1997. JINEK, M., REHWINKEL, J., LAZARUS, B.D., IZAURRALDE, E., HANOVER, J.A., CONTI, E. The superhelical TPR-repeat domain of O-linked GlcNac transferase exhibits structural similarities to importin alpha. Nature Structural and Molecular Biology, v. 11, p. 1001-1007, 2004. JOHNSON, B.D., SCHUMACHER, R.J., ROSS, E.D., TOFT, D.O. Hop modulates hsp70/hsp90 interactions in protein folding. Journal of Biological Chemistry, v. 273, p. 3679-3686, 1998.
118
JONES, C.E., ABDELRAHEIM, S.R., BROWN, D.R., VILES, J.H. Preferential Cu2+ coordination by His96 and His111 induces beta-sheet formation in the unstructured amyloidogenic region of the prion protein. Journal of Biological Chemistry, v. 279, p. 32018–32027, 2004. JONES, S., BATCHELOR, M., BHELT, D., CLARKE, A.R., COLLINGE, J., JACKSON, G.S. Recombinant prion protein does not possess SOD-1 activity. Biochemical Journal, v. 392, p. 309–212, 2005. KANAANI, J., PRUSINER, S.B., DIACOVO, J., BAEKKESKOV, S., LEGNAME, G. Recombinant prion protein induces rapid polarization and development of synapses in embryonic rat hippocampal neurons in vitro. Journal of Neurochemistry, v. 95, n. 5, p. 1373-1386, 2005. KISELYOV, V.V., SKLADCHIKOVA, G., HINSBY, A.M., JENSEN, P.H., KULAHIN, N., SOROKA, V., PEDERSEN, N., TSETLIN, V., POULSEN, F.M., BEREZIN, V., BOCK, E. Structural basis for a direct interaction between FGFR1 and NCAM and evidence for a regulatory role of ATP. Structure, v. 11: p. 691-701, 2003. KONAREV, P.V., VOLKOV, V.V., SKOLOVA, A.V., KOCH, M.H.J., SVERGUN, D.I. A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystalography, v. 36, p. 1277-1282, 2003. KUWAHARA, C., TAKEUCHI, A.M., NISHIMURA, T., HARAGUCHI, K., KUBOSAKI, A., MATSUMOTO, Y., SAEKI, K., MATSUMOTO, Y., YOKOYAMA, T., ITOHARA, S., ONODERA, T. Prions prevent neuronal cell-line death. Nature, v. 400, n. 6741, p. 225-226, 1999. LAKOWICZ, J.R. Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd ed. Ed. Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, 1999. LASSLE, M., BLATCH, G.L., KUNDRA, V., TAKATORI, T., ZETTER, B.R. Stress-inducible, murine protein mSTI1. Characterization of binding domains for heat shock proteins and in vitro phosphorylation by different kinases. Journal of Biological Chemistry, v. 272, p. 1876-1884. LATARJET, R., MUEL, B., HAIG, D.A., CLARCKE, M.C., ALPER, T. Inactivation of the scrapie agent by near monochromatic ultraviolet light. Nature, v. 227, p. 1341-1343, 1970. LEE, R.J., WANG, S., LOW, P.S. Measurement of endosome pH following folate receptor-mediated endocytosis. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1312, p. 237-42, 1996. LEGNAME, G., NELKEN, P., GUAN, Z., KANYO, Z.F., DEARMOND, S.J., PRUSINER, S.B. Prion and doppel proteins bind to granule cells of the cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 99, p. 16285–16290, 2002. LEUCHT, C., SIMONEAU, S., REY, C., VANA, K., RIEGER, R., LASMÉZAS, C.I., WEISS, S. The 37 kDa/67 kDa laminin receptor is required for PrP(Sc) propagation in
119
scrapie-infected neuronal cells. EMBO Reports, v. 4, p. 290-295. LI, R., LIU, D., ZANUSSO, G., LIU, T., FAYEN, J.D., HUANG, J.H., PETERSEN, R.B., GAMBETTI, P., SY, M.S. The expression and potential function of cellular prion protein in human lymphocytes. Cellular Immunology, v. 207, p. 49-58, 2001. LI, A., CHRISTENSEN, H.M., STEWART, L.R., ROTH, K.A, CHIESA, R., HARRIS, D.A. Neonatal lethality in transgenic mice expressing prion protein with a deletion of residues 105-125. EMBO Journal, v. 26, p. 548-558, 2007. LIMA, L.M.T.R., CORDEIRO, Y., TINOCO, L.W., MARQUES, A.F., OLIVEIRA, C.L., SAMPATH, S., KODALI, R., CHOI, G., FOGUEL, D., TORRIANI, I., CAUGHEY, B., SILVA, J.L. Structural insights into the interaction between prion protein and nucleic acid. Biochemistry, v. 45, p. 9180-9187, 2006. LIMA, F.R., ARANTES, C.P., MURAS, A.G., NOMIZO, R., BRENTANI, R.R., MARTINS, V.R. Cellular prion protein expression in astrocytes modulates neuronal survival and differentiation. Journal of Neurochemistry, v. 103, p. 2164-76, 2007. LINDEN, R., MARTINS, V.R., PRADO, M.A.M., CAMMAROTA, M., IZQUIERDO, I., BRENTANI, R.R. Physiology of the prion protein. Physiological Reviews, v. 88, p. 673-728, 2008. LLEDO, P.M., TREMBLAY, P., DEARMOND, S.J., PRUSINER, S.B., NICOLL, R.A. Mice deficient for prion protein exhibit normal neuronal excitability and synaptic transmission in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 93, n. 6, p. 2403-2407, 1996. LOPES, M.H., HAJJ, G.N., MURAS, A.G., MANCINI, G.L., CASTRO, R.M., RIBEIRO, K.C., BRENTANI, R.R., LINDEN, R., MARTINS, V.R. Interaction of cellular prion and stress-inducible protein 1 promotes neuritogenesis and neuroprotection by distinct signaling pathways. The Journal of Neuroscience, v. 25, n. 49, p. 11330-11339, 2005. LOPEZ-GARCIA, F., ZAHN, R., RIEK, R., WUTHRICH, K. NMR structure of the bovine prion protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 97, p. 8334-8339, 2000. LYSEK, D.A., SCHORN, C., NIVON, L.G., ESTEVE-MOYA, V., CHRISTEN, B., CALZOLAI, L., VON SCHROETTER, C., FIORITO, F., HERRMANN, T., GUNTERT, P., WUTHRICH, K. Prion protein NMR structures of cats, dogs, pigs, and sheep. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 102, p. 640-645, 2005. MA, J., LINDQUIST, S. Wild-type PrP and a mutant associated with prion disease are subject to retrograde transport and proteasome degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, p. 14955-14960, 2001. MA, J., WOLLMANN, R., LINDQUIST, S. Neurotoxicity and neurodegeneration when PrP accumulates in the cytosol. Science, v. 298, p. 1781–1785, 2002.
120
MABBOTT, N.A., MACPHERSON, G.G. Prions and their lethal journey to the brain. Nature Reviews Microbiology, v. 4, n. 3, p. 201-211, 2006. MAGLIO, L.E., PEREZ, M.F., MARTINS, V.R., BRENTANI, R.R., RAMIREZ, O.A. Hippocampal synaptic plasticity in mice devoid of cellular prion protein. Brain Research Molecular Brain Research, v. 131, n. 1-2, p. 58-64, 2004. MAGLIO, L.E., MARTINS, V.R., IZQUIERDO, I., RAMIREZ, O.A. Role of cellular prion protein on LTP expression in aged mice. Brain Research, v. 1097, n. 1, p. 11-18, 2006. MALENKA, R.C., BEAR, M.F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron, v. 44, p. 5–21, 2004. MALLUCCI, G.R., RATTE, S., ASANTE, E.A., LINEHAN, J., GOWLAND, I., JEFFERYS, J.G., COLLINGE, J. Post-natal knockout of prion protein alters hippocampal CA1 properties, but does not result in neurodegeneration. EMBO Journal, v. 21, p. 202–210, 2002. MANSON, J.C., CLARKE, A.R., HOOPER, M.L., AITCHISON, L., MCCONNELL, I., HOPE, J. 129/Ola mice carrying a null mutation in PrP that abolishes mRNA production are developmentally normal. Molecular Neurobiology, v. 8, n. 2-3, p. 121-127, 1994. MANSON, J.C., HOPE, J., CLARKE, A.R., JOHNSTON, A., BLACK, C., MACLEOD, N. PrP gene dosage and long term potentiation. Neurodegeneration, 4: 113–114, 1995. MARTINS, V.R., GRANER, E., GARCIA-ABREU, J., DE SOUZA, S.J., MERCADANTE, A.F., VEIGA, S.S., ZANATA, S.M., NETO, V.M., BRENTANI, R.R. Complementary hydropathy identifies a cellular prion protein receptor. Nature Medicine, v. 3, p. 1376-1382, 1997. MARTINS, V., LINDEN, R., PRADO, M.A.M., WALZ, R., SAKAMOTO, A.C., IZQUIERDO, I., BRENTANTI, R.R. Cellular prion protein: on the road for functions. FEBS letters, v. 512, p. 25-28, 2002. MATSUNAGA, Y., PERETZ, D., WILLIAMSON, A., BURTON, D., MEHLHORN, I., GROTH, D., COHEN, F.E., PRUSINER, S.B., BALDWIN, M.A. Cryptic epitopes in N-terminally truncated prion protein are exposed in the full-length molecule: dependence of conformation on pH. Proteins, v. 44, p. 110-118, 2001. MILLHAUSER, G.L. Copper and the prion protein: methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry, v. 58, p. 299–320, 2007. MILHAVET, O., LEHMANN, S. Oxidative stress and the prion protein in transmissible spongiform encephalopathies. Brain Research Brain Research Reviews, v. 38, n. 3, p. 328-339, 2002. MIURA, T., HORI-I, A., TAKEUCHI, H. Metal-dependent alpha-helix formation promoted by the glycine-rich octapeptide region of prion protein. FEBS Letters, v. 396, p. 248–252, 1996. MIURA, T., SASAKI, S., TOYAMA, A., TAKEUCHI, H. Copper reduction by
121
the octapeptide repeat region of prion protein: pH dependence and implications in cellular copper uptake. Biochemistry, v. 44, p. 8712–8720, 2005. MORILLAS, M., SWIETNICKI, W., GAMBETTI, P., SUREWICZ, W.K. Membrane environment alters the conformational structure of the recombinant human prion protein. Journal of Biological Chemistry, v. 274, p. 36859-36865, 1999. MOUILLET-RICHARD, S., ERMONVAL, M., CHEBASSIER, C., LAPLANCHE, J.L., LEHMANN, S., LAUNAY, J.M., KELLERMANN, O. Signal transduction through prion protein. Science, v. 289, p. 1925–1928, 2000. MUCHOWSKI, P.J., WACKER, J.L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews in Neuroscience, v. 6. n. 1, p. 11-22, 2005. NASLAVSKY, N., STEIN, R., YANAI, A., FRIEDLANDER, G., TARABOLOUS, A. Characterization of detergent-insoluble complexes containing the cellular prion protein and its scrapie isoform. Journal of Biological Chemistry, v. 272, p. 6324-631, 1997. NELSON, J., MCFERRAN, N.V., PIVATO, G., CHAMBERS, E., DOHERTY, C., STEELE, D., TIMSON, D.J. The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Bioscience Report, v. 28, p. 33-48, 2008. NICO, P.B., DE-PARIS, F., VINADE, E.R., AMARAL, O.B., ROCKENBACH, I., SOARES, B.L., GUARNIERI, R., WICHERT-ANA, L., CALVO, F., WALZ, R., IZQUIERDO, I., SAKAMOTO, A.C., BRENTANI, R., MARTINS, V.R., BIANCHIN, M.M. Altered behavioural response to acute stress in mice lacking cellular prion protein. Behav. Brain Res., v. 162, p. 173-181, 2005.
NICOLET, C.M., CRAIG, E.A. Isolation and characterization of STI1, a stress-inducible gene from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology, v. 9, p. 3638-46, 1989. NIKLES, D., VANA, K., GAUCZYNSKI, S., KNETSCH, H., LUDEWIGS, H., WEISS, S. Subcellular localization of prion protein and the 37 kDa/67 kDa laminin receptor fused to fluorescent proteins. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1782, p. 335-340, 2008. NOLLEN, E.A., MORIMOTO, R.I. Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins. Journal of Cell Science. v. 115. n. 14, p. 2809-16, 2002. OBERMANN, W.M.J., SONDERMANN, H., RUSSO, A.A., PAVLETICH, N.P., HARTL, F.U. In vivo function of hsp90 is dependent on ATP binding and ATP hydrolysis. Journal of Cellular Biology, v. 143, p. 901-910, 1998.
ODUNUGA, O.O., LONGSHAW, V.M., BLATCH, G.L. Hop: more than an Hsp70/Hsp90 adaptor protein. Bioessays, v. 26, p. 1058-68, 2004.
ONUOHA, S.C., COULSTOCK, E.T., GROSSMANN, J.G., JACKSON, S.E. Structural
122
studies on the co-chaperone hop and its complexes with Hsp90. Journal of Molecular Biology, v. 379, p. 732-744, 2008. PAITEL, E., ALVES DA COSTA, C., VILETTE, D., GRASSI, J., CHECLER, F. Overexpression of PrPc triggers caspase 3 activation: potentiation by proteasome inhibitors and blockade by anti-PrP antibodies. Journal of Neurochemistry, v. 83, p. 1208–1214, 2002. PAITEL, E., FAHRAEUS, R., CHECLER, F. Cellular prion protein sensitizes neurons to apoptotic stimuli through Mdm2-regulated and p53-dependent caspase 3-like activation. Journal of Biological Chemistry, v. 278, p. 10061–10066, 2003. PAITEL, E., SUNYACH, C., ALVES DA COSTA, C., BOURDON, J.C., VINCENT, B., CHECLER, F. Primary cultured neurons devoid of cellular prion display lower responsiveness to staurosporine through the control of p53 at both transcriptional and post-transcriptional levels. Journal of Biological Chemistry, v. 279, p. 612–618, 2004. PAN, K.-M., BALDWIN, M., NGUYEN, J., GASSET, M., SERBAN, A., GROTH, D., MEHLHORN, I., HUANG, Z., FLETTERICK, R.J., COHEN, F.R., PRUSINER, S.B. Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 90, p. 10962–10966, 1993. PANTERA, B., BINI, C., CIRRI, P., PAOLI, P., CAMICI, G., MANAO, G., CASELLI, A. PrPc activation induces neurite outgrowth and differentiation in PC12 cells: role for caveolin-1 in the signal transduction pathway. Journal of Neurochemistry, v. 110, p. 194-207, 2009. PAULY, P.C., HARRIS, D.A. Copper stimulates endocytosis of the prion protein. The Journal of Biological Chemistry, v. 273, n. 50, p. 33107-33110, 1998. PERERA, W.S., HOOPER, N.M. Ablation of the metal ion-induced endocytosis of the prion protein by disease-associated mutation of the octarepeat region. Current Biology, v. 11, n. 7, p. 519-523, 2001. PETOUKHOV, M.V., SVERGUN, D.I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophysical Journal, v. 89, p. 1237-12350, 2005. PETOUKHOV, M.V., SVERGUN, D.I. Analysis of X-ray and neutron scattering from biomacromolecular solutions. Current Opinion in Structural Biology, v. 17, p. 562-571, 2007. PRADO, M.A., ALVES-SILVA, J., MAGALHAES, A.C., PRADO, V.F., LINDEN, R., MARTINS, V.R., BRENTANI, R.R. PrPc on the Road: Trafficking of the Cellular Prion Protein. Journal of Neurochemistry, v. 88, p. 769-781, 2004. PRATT, W.B., TOFT, D.O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Experimental Biology and Medicine, v. 228, p. 111-133, 2003.
123
PRODROMOU, C., SILIGARDI, G., O'BRIEN, R., WOOLFSON, D.N., REGAN, L., PANARETOU, B., LADBURY, J.E., PIPER, P.W., PEARL, L.H. Regulation of Hsp90 ATPase activity by tetratricopeptide repeat (TPR)-domain co-chaperones. EMBO Journal, v. 18, 754-762, 1999. PRUSINER, S.B. Novel proteinasceous infectious particles cause scrapie. Science, v. 216, n. 4542, p. 136-144, 1982. PRUSINER, S.B., McKINLEY, M.P., BOWMAN, K.A., BOLTON, D.C., BENDHEIM, P.E., GROTH, D.F., GLENNER, G.G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell, v. 35, p. 349–358, 1983. PRUSINER, S.B. Prions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 95, n. 23, p. 13363-13383, 1998. PRUSINER, S.B. An introduction to prion biology and diseases. In: ____. Prion biology and diseases. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. p. 1-66. PRUSINER, S.B., GROTH, D.F., BOLTON, D.C., KENT, S.B., HOOD, L.E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell, v. 38, p. 127-134, 1984. PUCKETT, C., CONCANNON, P., CASEY, C., HOOD, L. Genomic structure of the human prion protein gene. American Journal of Human Genetics, v. 49, n. 2, p. 320-329, 1991. QIN, K., YANG, D.S., YANG, Y., CHISHTI, M.A., MENG, L.J., KRETZSCHMAR, H.A., YIP, C.M., FRASER, P.E., WESTAWAY, D. Copper(II)-induced conformational changes and protease resistance in recombinant and cellular PrP. Effect of protein age and deamidation. Journal of Biological Chemistry, v. 275, p. 19121–19131, 2000. REMÉNYI, A., GOOD, M.C., LIM, W.A. Docking interactions in protein kinase and phosphatase networks. Current Opinion in Structural Biology, v. 16, p. 676-685. RIEGER, R., EDENHOFER, F., LASMEZAS, C.I., WEISS, S. The human 37-kDa laminin receptor precursor interacts with the prion protein in eukaryotic cells. Nature Medicine, v. 3, p. 1383–1388, 1997. RIEK, R., HORNEMANN, S., WIDER, G., BILLETER, M., GLOCKSHUBER, R., WUTHRICH, K. NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-231). Nature, v. 382, p. 180-182, 1996. RIEK, R., HORNEMANN, S., WIDER, G., GLOCKSHUBER, R., WUTHRICH, K. NMR characterization of the full-length recombinant murine prion protein, mPrP(23-231). FEBS Letters, v. 413, p. 282-288, 1997. ROESLER, R., WALZ, R., QUEVEDO, J., DE-PARIS, F., ZANATA, S.M., GRANER, E., IZQUIERDO, I., MARTINS, V.R., BRENTANI, R.R. Normal inhibitory avoidance learning and anxiety, but increased locomotor activity in mice devoid of PrP(C). Brain Res. Mol. Brain Res., v. 71, p. 349-353, 1999.
124
ROSS, C.A., POIRIER, M.A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine, v. 10 Suppl., p. S10-S17, 2004. ROUCOU, X., GUO, Q., ZHANG, Y., GOODYER, C.G., LEBLANC, A.C. Cytosolic prion protein is not toxic and protects against Bax-mediated cell death in human primary neurons. Journal of Biological Chemistry, v. 278, p. 40877–40881, 2003. ROUCOU, X., LEBLANC, A.C. Cellular prion protein neuroprotective function: implications in prion diseases. Journal of Molecular Medicine, v. 83, n. 1, p. 3-11, 2005. RUDD, P.M., WORMALD, M.R., WING, D.R., PRUSINER, S.B., DWEK, R.A. Prion Glycoprotein: Structure, Dynamics, and Roles for the Sugars. Biochemistry, v. 40, p. 3759 -3766, 2001. SAEZ-VALERO, J., ANGERETTI, N., FORLONI, G. Caspase-3 activation by beta-amyloid and prion protein peptides is independent from their neurotoxic effect. Neuroscience Letters, v. 293, n. 3, p. 207-210, 2000. SALÈS, N., RODOLFO, K., HÄSSIG, R., FAUCHEUX, B., DI GIAMBERARDINO, L., MOYA, K.L. Cellular prion protein localization in rodent and primate brain. The European Journal of Neuroscience, v. 10, n. 7, p. 2464-2471, 1998. SALÈS, N., HASSIG, R., RODOLFO, K., DI GIAMBERARDINO, L., TRAIFFORT, E., RUAT, M., FRETIER, P., MOYA, K.L. Developmental expression of the cellular prion protein in elongating axons. European Journal of Neuroscience, v. 15, p. 1163–1177, 2002. SANTUCCIONE, A., SYTNYK, V., LESHCHYNS'KA, I., SCHACHNER, M. Prion protein recruits its neuronal receptor NCAM to lipid rafts to activate p59fyn and to enhance neurite outgrowth. The Journal of Cell Biology, v. 169, n. 2, p. 341-354, 2005. SAKUDO, A., HAMAISHI, M., HOSOKAWA-KANAI, T., TUCHIYA, K, NISHIMURA, T., SAEKI, K., MATSUMOTO, Y., UEDA, S., OONODERA, T. Absence of superoxide dismutase activity in a soluble cellular isoform of prion protein produced by baculovirus expression system. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 307, p. 678–683, 2003. SCHEUFLER, C., BRINKER, A., BOURENKOV, G., PEGORARO, S., MORODER, L., BARTUNIK, H., ULRICH HARTL, F., MOAREFI, I. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell, v. 101, p. 199-210, 2000. SCHMITT-ULMS, G., LEGNAME, G., BALDWIN, M.A., BALL, H.L., BRADON, N., BOSQUE, P.J., CROSSIN, K.L., EDELMAN, G.M., DEARMOND, S.J., COHEN, F.E., PRUSINER, S.B. Binding of neural cell adhesion molecules (N-CAMs) to the cellular prion protein. Journal of Molecular Biology, v. 314, p. 1209–1225, 2001. SHYU, W.C., LIN, S.Z., CHIANG, M.F., DING, D.C., LI, K.W., CHEN, S.F., YANG, H.I., LI, H. Overexpression of PrPC by adenovirus-mediated gene targeting reduces ischemic injury in a stroke rat model. Journal of Neuroscience, v. 25, p. 8967–8977, 2005.
125
SILVA, J.L., LIMA, L.M., FOGUEL, D., CORDEIRO, Y. Intriguing nucleic-acid-binding features of mammalian prion protein. Trends in Biochemical Science, v. 33, n. 3, p. 132-140, 2008. SMITH, D.F., SULLIVAN, W.P., MARION, T.N., ZAITSU, K., MADDEN, B., MCCORMICK, D.J., TOFT, D.O. Identification of a 60-kilodalton stress-related protein, p60, which interacts with hsp90 and hsp70. Molecular and Cellular Biology, v. 13, p. 869-876, 1993. SOLFOROSI, L., CRIADO, J.R., MCGAVERN, D.B., WIRZ, S., SANCHEZ-ALAVEZ, M., SUGAMA, S. Cross-linking cellular prion protein triggers neuronal apoptosis in vivo. Science, v. 303, p. 1514–1516, 2004. STEELE, A.D., EMSLEY, J.G., OZDINLER, P.H., LINDQUIST, S., MACKLIS, J.D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 103, n. 9, p. 3416-3421, 2006. STOCKEL, J., SAFAR, J., WALLACE, A.C., COHEN, F.E., PRUSINER, S.B. Prion protein selectively binds copper(II) ions. Biochemistry, v. 37, p. 7185–7193, 1998. SVERGUN, D.I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystalography, v. 25, p. 495-503, 1992.
SVERGUN, D.I., PETOUKHOV, M.V., KOCH, M.H.J. Determination of domain structure of proteins from x-ray solution scattering. Biophysical Journal, v. 80, p. 2946-2953, 2001. SWIETNICKI, W., PETERSEN, R., GAMBETTI, P., SUREWICZ, W.K. pH dependent stability and conformation of the recombinant human prion protein PrP(90-231). Journal of Biological Chemistry, v. 272, p. 27517-2520, 1997. TATEISHI, J., KITAMOTO, T., KRETZSCHMAR, H., MEHRAEIN, P. Immunhistological evaluation of Creutzfeldt-Jakob disease with reference to the type PrPres deposition. Clinical Neuropathology, v. 15, n. 6, p. 358-360, 1996. TAYLOR, D.R., HOOPER, N.M. The prion protein and lipid rafts. Molecular Membrane Biology, v. 23, p. 89-99, 2006. TOBLER, I., GAUS, S.E., DEBOER, T., ACHERMANN, P., FISCHER, M., RULICKE, T., MOSER, M., OESCH, B., MCBRIDE, P.A., MANSON, J.C. Altered circadian activity rhythms and sleep in mice devoid of prion protein. Nature, v. 380, p. 639-642, 1996. TOBLER, I., DEBOER, T., FISCHER, M. Sleep and sleep regulation in normal and prion protein-deficient mice. Journal Neuroscience, v. 17, p. 1869-1879, 1997. VAN DER SPUY, J., CHEETHAM, M.E., DIRR, H.W., BLATCH, G.L. The cochaperone murine stress-inducible protein 1: overexpression, purification and characterization. Protein Expression and Purification, v. 21, p. 462-469.
126
VILES, J.H., COHEN, F.E., PRUSINER, S.B., GOODIN, D.B., WRIGHT, P.E., DYSON, H.J. Copper binding to the prion protein: structural implications of four identical cooperative binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 96, n. 5, p. 2042-2047, 1999. VOLKOV, V.V., SVERGUN, D.I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystalography, v. 36, p. 860-864, 2003. WALZ, R., AMARAL, O.B., ROCKENBACH, I.C., ROESLER, R., IZQUIERDO, I., CAVALHEIRO, E.A., MARTINS, V.R., BRENTANI, R.R. Increased sensitivity to seizures in mice lacking cellular prion protein. Epilepsia, v. 40, n. 12, p. 1679-1682, 1999. WAGGONER, D.J., DRISALDI, B., BARTNIKAS, T.B., CASARENO, R.L., PROHASKA, J.R., GITLIN, J.D., HARRIS, D.A. Brain copper content and cuproenzyme activity do not vary with prion protein expression level. Journal of Biological Chemistry, v. 275, p. 7455–7458, 2000. WEISE, J., CROME, O., SANDAU, R., SCHULZ-SCHAEFFER, W., BAHR, M., ZERR, I. Upregulation of cellular prion protein (PrPc) after focal cerebral ischemia and influence of lesion severity. Neuroscience Letters, v. 372, p. 146–150, 2004. WEISSMANN, C. Molecular genetics of transmissible spongiform encephalopathies. Journal of Biological Chemistry, v. 274, n. 1., p. 3-6, 1999. WELLS, M.A., JACKSON, G.S., JONES, S., HOSSZU, L.L., CRAVEN, C.J., CLARKE, A.R., COLLINGE, J., WALTHO, J.P. A reassessment of copper(II) binding in the full-length prion protein. Biochemical Journal, v. 399, p. 435–444, 2006a. WELLS, M.A., JELINSKA, C., HOSSZU, L.L., CRAVEN, C.J., CLARKE, A.R., COLLINGE, J., WALTHO, J.P., JACKSON, G.S. Multiple forms of copper (II) co-ordination occur throughout the disordered N-terminal region of the prion protein at pH 7.4. Biochemical Journal, v. 400, p. 501–510, 2006b. WESTAWAY, D., COOPER, C., TURNER, S., DA COSTA, M., CARLSON, G.A., PRUSINER, S.B. Structure and polymorphism of the mouse prion protein gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 91, n. 14, p. 6418-6422, 1994a. WESTAWAY, D., DEARMOND, S.J., CAYETANO-CALNAS, J., GROTH, D., FOSTER, D., YANG, S.L., TORCHIA, M., CARLSON, G.A., PRUSINER, S.B. Degeneration of skeletal muscle, peripheral nerves, and the central nervous system in transgenic mice overexpressing wild-type prion proteins. Cell, v. 76, p. 117–129, 1994b. WESTERGARD, L., CHRISTENSEN, H.M., HARRIS, D.A. The cellular prion protein (PrP(C)): its physiological function and role in disease. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1772, n. 6, 629-644. WHITE, A.R., COLLINS, S.J., MAHER, F., JOBLING, M.F., STEWART, L.R., THYER, J.M., BEYREUTHER, K., MASTERS, C.L., CAPPAI, R. Prion protein-deficient neurons
127
reveal lower glutathione reductase activity and increased susceptibility to hydrogen peroxide toxicity. The American Journal of Pathology, v. 155, n. 5, p. 1723-1730, 1999. WHITTINGTON, M.A., SIDLE, K.C., GOWLAND, I., MEADS, J., HILL, A.F., PALMER, M.S., JEFFERYS, J.G., COLLINGE, J. Rescue of neurophysiological phenotype seen in PrP null mice by transgene encoding human prion protein. Nature Genetics, v. 9, p. 197–201, 1995. WHITTAL, R.M., BALL, H.L., COHEN, F.E., BURLINGAME, A.L., PRUSINER, S.B., BALDWIN, M.A. Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein Science, v. 9, p. 332–343, 2000. WHITTY, A. Cooperativity and biological complexity. Nature Chemical Biology, v. 4, p. 435-439, 2008. WONG, B.S., VENIEN-BRYAN, C., WILLIAMSON, R.A., BURTON, D.R., GAMBETTI, P., SY, M.S., BROWN, D.R., JONES, I.M. Copper refolding of prion protein. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 276, p. 1217–1224, 2000. WOPFNER, F., WEIDENHOFER, G., SCHNEIDER, R., VON BRUNN, A., GILCH, S., SCHWARZ, T.F., WERNER, T., SCHATZL, H.M. Analysis of 27 mammalian and 9 avian PrPs reveals high conservation of flexible regions of the prion protein. Journal of Molecular Biology, v. 289, p. 1163–1178, 1999. WU, S., ZHANG, Y. LOMETS: a local meta-threading-server for protein structure prediction. Nucleic Acids Research, v. 35, p. 3357-3382, 2007. VAN DER SPUY, J., CHEETHAM, M.E., DIRR, H.W., BLATCH, G.L. The cochaperone murise stress-inducible protein 1: overexpression, purification and characterization. Protein Expression and Purification, v. 21, p. 462-469, 2001. YOUNG, J.C., OBERMANN, W.M.J., HARTL, F.U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry, v. 273, p. 18007-18010, 1998. YOUNG, J.C., HARTL, F.U. Chaperones and transcriptional regulation by nuclear receptors. Nature Structural Biology, v. 9. n. 9, p. 640-2, 2002. ZANATA, S.M., LOPES, M.H., MERCADANTE, A.F., HAJJ, G.N., CHIARINI, L.B., NOMIZO, R., FREITAS, A.R., CABRAL, A.L., LEE, K.S., JULIANO, M.A., DE OLIVEIRA, E., JACHIERI, S.G., BURLINGAME, A., HUANG, L., LINDEN, R., BRENTANI, R.R., MARTINS, V.R. Stress-inducible protein 1 is a cell surface ligand for cellular prion protein that triggers neuroprotection. The EMBO Journal, v. 21, n. 13, p. 3307-3316, 2002. ZAHN, R., VON SCHROETTER, C., WUTHRICH, K. Human prion proteins expressed in Escherichia coli and purified by high-affinity column refolding. FEBS Letters, v. 417, p. 400-404, 1997.
128
ZAHN, R., LIU, A., LUHRS, T., RIEK, R., VON SCHROETTER, C., LOPEZ-GARCIA, F., BILLETER, M., CALZOLAI, L., WIDER, G., WUTHRICH, K. NMR solution structure of the human prion protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 97, p. 145-150, 2000. ZOU, W.Q., CASHMAN, N.R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. Journal of Biological Chemistry, v. 277, p. 43942-43947, 2002.
129
APÉNDICE
Artigo aceito para publicação na revista FASEB Journal
130
Reciprocal remodeling upon binding of the Prion Protein to its signaling partner hop/STI1
Sebastián A. Romano*, Yraima Cordeiro†, Luis Maurício T. R. Lima†, Marilene H. Lopes#, Jerson L. Silva‡, Débora Foguel‡, and Rafael Linden*.
*Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, †Faculdade de Farmácia, ‡Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-902, Rio de Janeiro, RJ, Brazil; # Ludwig Institute for Cancer Research, São Paulo, SP, Brazil.
Corresponding author: Rafael Linden, Instituto de Biofísica da UFRJ, CCS, Bloco G, Cidade Universitária, RJ 21941-902, Brazil; E-mail: [email protected].
Short title: Reciprocal remodeling of PrP and STI1 upon binding
131
Abstract
The GPI-anchored prion protein (PrPC), usually associated with neurodegenerative diseases, modulates various cellular responses, and may scaffold multi-protein cell surface signaling complexes. Engagement of PrPC with the secretable co-chaperone hop/STI1 induces neurotrophic transmembrane signals through unknown molecular mechanisms. We addressed whether interaction of PrPC and hop/STI1 entails structural rearrangements relevant for signaling. Using recombinant wild type and mutant mouse proteins and binding peptides, we measured circular dichroism (CD), fluorescence spectroscopy and small angle X-ray scattering (SAXS). PrPC:hop/STI1 interaction triggers loss of PrP helical structures, involving at least a perturbation of the PrP143-153 α-helix, but no secondary structural modification of hop/STI1 was detected. Novel SAXS models revealed a significant C-terminus compaction of hop/STI1 when bound to PrP. Differing from a recent dimeric model of human hop/STI1, both size-exclusion chromatography and SAXS data support a monomeric form of free murine hop/STI1. Changes in the PrP143-153 α-helix may engage the transmembrane signaling proteins Laminin Receptor Precursor and NCAM, both of which bind that domain of PrPC, and further ligands may be engaged by the tertiary structural changes of hop/STI1. These reciprocal structural modifications indicate a versatile mechanism for signaling mediated by PrPC:hop/STI1 interaction, consistent with the hypothesis of PrPC-dependent multi-protein signaling complexes.
Key words: GPI-anchored proteins; multi-protein complexes; structural modifications; trophic signals; SAXS.
132
Introduction
The prion protein (PrPC) is a cell surface glycoprotein constitutively expressed in various mammalian tissues, although most abundantly in the central nervous system (1). Conversion of PrPC to an abnormal isoform (PrPSc for prion scrapie), is associated with incurable and invariably fatal neurodegenerative diseases called transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) (1,2). However, the physiological role of PrPC remains controversial. Although mice survive both knock out (3,4) and postnatal depletion of PrPC (5), extensive data implicate PrPC in diverse functions, such as the binding of metal ions and protection against oxidative stress, modulation of synaptic transmission and neuronal excitability, cell adhesion and differentiation, signal transduction and control of cell survival. PrPC has, therefore, been attributed a general function as a cell surface platform for the assembly of multi-protein signaling complexes, involved in widespread physiological mechanisms both within and beyond the nervous system (6).
The predominant mature form of PrPC consists of PrP23-231, i.e. residues 23-231, glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored to the extracellular face of the plasma membrane through its carboxyl end. It contains a single disulfide bridge and two sites for N-glycosylation. A flexible, intrinsically unstructured, N-terminus comprises approximately the first 100 amino acids, followed by a globular C-terminal domain rich in α-helices (PrP121-231). The structure of the latter at acidic pH was resolved by nuclear magnetic resonance for various species, including both mouse and human (7,8). A low-resolution SAXS model was also reported for the mouse full-length protein (9).
The search for functional properties of PrPC resulted in the identification of various putative ligands (6,10). Among these, the secretable 66 kDa co-chaperone hop/STI1 (hsp70-hsp90 organizing protein/stress-inducible protein 1) binds PrPC in vivo, through binding sites mapped to within PrP113-128 and hop/STI1230-245 in the mouse (11). Interestingly, mice carrying deletion mutants PrP∆105-125 and PrP∆94-134, which compromise the hop/STI1-binding site in PrPC, present severe and lethal neurodegenerative phenotypes (12,13), suggesting that critical physiological functions of the prion protein depend on this domain.
Hop/STI1 is a 543-residue co-chaperone that modulates the activities of Hsp70 and Hsp90, and may have additional functions (14-16). Despite its mainly cytoplasmic localization, it can be constitutively secreted (14,17), to bind membrane-attached PrPC. Hop/STI1 has nine tetratricopeptide repeats (TPRs), grouped in three globular domains TPR1, TPR2a (the PrPC-binding domain) and TPR2b. The first two of these domains, bound to Hsp90 and Hsc70 peptides, respectively, were crystallized and had their structure resolved (18). Models of these domains represent highly α-helical globular structures that line a canal where binding sequences can lie in an extended form. The protein also has two small domains rich in aspartate-proline repeats, known as DP domains (19) (see Fig. 4A). Recently, SAXS measurements were performed for the full-length human hop/STI1 protein (20).
Binding of PrPC to hop/STI1 produces neuroprotective, neuritogenic and proliferative effects through PKA, Erk and PI3K pathways, respectively (11,14,21,22), among which the activation of MAP kinase pathways was shown to depend on endocytosis (23,24). The molecular mechanisms by which engagement of the GPI-anchored prion protein with an extracellular ligand activates such diverse intracellular pathways remain unknown, but is expected to involve additional transmembrane partners (6). The assembly of such higher
133
complexes and the signaling events triggered likely entails and depends on orchestrated cooperative allosteric structural changes that may propagate in the various partner proteins, especially in the case of spatially constrained molecules such as membrane proteins (25,26). Here, using heterologously expressed mouse recombinant proteins, we report a biophysical and structural study of the interaction between the prion protein (PrP) and hop/STI1, aiming at gaining insight into molecular processes involved in its physiological functions. The data suggest a versatile structural basis for the diverse signals activated by interaction of PrPC with its ligand STI1.
134
Materials and methods
Materials
Mouse recombinant STI1 (His6-STI1), PrP (His6-PrP) and PrP95-231W98F (His6- PrP95-
231W98F) were purified as previously described (11,27). PrP95-231
W98F was constructed using PCR primers flanking the 95-231 domain. Forward primer was designed for W98F site-directed mutagenesis. cDNA fragments were amplified employing pRSET-A PrP(23-231) (27) with primers (F- 5´CATAATCAGTTTAACAAGCCCAGC3´and R-5’GAGAATTCTCAGCTGGATCTTCTCCCGTC 3’, IDT). The PCR fragments were cloned into BamHI and EcoRI restriction sites in pRSET-A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Sequencing analysis was performed as a control. Peptides corresponding to mouse STI1 amino acid sequences STI1230-245 (230-ELGNDAYKKKDFDKAL-245) and mouse PrP amino acid sequences PrP113-132 (113-GAAAAGAVVGGLGGYMLGSA-132) were chemically synthesized by Neosystem (NeoMPS, Strasbourg, France) and further purified by reverse-phase HPLC. All reagents used were of analytical grade. All experiments were performed in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4 buffers, at 22 oC.
Far-UV Circular Dichroism
All spectra were recorded in a Jasco J-715 spectropolarimeter (Jasco Corporation, Tokyo, Japan) with 0.2 mm path-length cells. All spectra were subtracted from the respective buffer spectra and were collected with 4 accumulations in concentrations of 30 µM for each molecular species present in the sample. Data are presented in the experiment-independent quantity molar ellipticity per residue, [θ] according to
θ[ ]=θ
l ⋅ Ci ⋅ N ii
∑ (1)
where θ is the raw measured ellipticity, ℓ is the optical path-length and Ci and Ni are the
molar concentration and number of peptide bonds in a single molecule of the ith-species present in the sample, respectively. Assuming no change in secondary structure upon complexation (or no binding), the prediction for the [θ] of the complex, [θ]pred, consists of the simple weighted sum
θ[ ]pred
=N i
NT
⋅ θ[ ]ii
∑ (2)
where [θ]i are the [θ] measured for the individual polypeptides that form the complex and NT
is the total number of peptide bonds present in a single molecule of the presumed complex,
i.e. equal to the sum of the individual Ni.
135
Fluorescence spectroscopy
All measurements were performed in an ISS-PC1 spectrofluorimeter (ISS, Champaign IL, USA) in “L” geometry. For fluorescence anisotropy measurements PrP was labeled with FITC as previously described (28). Excitation was set at 480 nm, and emission was recorded through a WG3-69 filter (50% cut-off at 520 nm). Dissociation constants (Kd) were calculated according to (29), considering a simple two-state reversible equilibrium PrP + STI1 [PrP:STI1]. For the steady state fluorescence spectroscopy experiments, tryptophan fluorescence of 3-5.5 µM samples was measured by exciting samples at 280, 290 or 295 nm with an 8 nm bandwidth, and emission collected from 300 to 420 nm. As a control, protein aggregation was monitored as a function of light scattering (excitation 320 nm, emission 320 nm). Bis-ANS fluorescence was monitored to obtain information about the folding state of proteins in solution, since this dye is sensitive enough to even detect unstable folding intermediates, such as molten globule states (30). Bis-ANS-containing samples were excited at 360 nm and emission was collected from 400 to 600 nm.
Small-angle X-ray scattering measurements, data analysis and structural reconstructions
SAXS data were collected at the D11A-SAXS1 beamline of the National Synchrotron Light Laboratory, Campinas, Brazil. Scattering intensity curves were recorded using a two-dimensional, position-sensitive MARCCD detector, and samples in a 1-mm thick sample cell with mica windows were irradiated with a monochromatic beam of λ = 1.488 Å, at room temperature. Two sample-to-detector distances were used: 603.8 mm and 1406.8 mm. Following circular averaging, the scattering curves were individually normalized by incident beam intensity and sample absorption and, after merging the resulting curves, the magnitude of the momentum transfer vector q = (4π/λ) sin(θ), where 2θ is the scattering angle, covered a range from 0.012 Å-1 to 0.3 Å-1. Three successive frames of 400 s were recorded. Buffer scattering was subtracted and the obtained curves were carefully inspected to check for possible radiation-induced damage. Concentration dependence was checked by recording the sample scattering patterns at two different concentrations each: the STI1 sample was measured at 4.5 mg/ml and 2.5 mg/ml, and the PrP:STI1 complex was measured in a 1:1 molarity, adding to total concentrations of 4 mg/ml and 2.3 mg/ml. Samples were monodisperse, as evidenced by Guinier analysis (31). The scattering intensities, I(q), were well above background noise and followed Porod's law (31). As a control, molecular-weight calculations were carried out using hen egg lysozyme as standard (not shown). The scattering profiles were fitted using the program GNOM (32), yielding the p(r), Rg and Dmax of the samples. Ab initio particle models were restored using GASBOR (33), which employs simulated annealing to find chain-compatible spatial distributions of dummy residues that fit the experimental scattering patterns. Several runs of ab initio shape determination led to consistent results and the final particle shapes are an average of 10 independent models, performed by DAMAVER (34). The rigid body models were obtained using BUNCH (35), which implements simulated annealing to find the optimal position and orientation of high resolution domain models and flexible linkers, represented by dummy residue chains attached to the appropriate terminal residues. These models use the domains TPR1, TPR2a and PrP121-
231 (PDB codes 1elw, 1elr and 1ag2), along with homology models of TPR2b, DP1 and DP2 calculated by Lomets (36). Since BUNCH handles only one polypeptide chain per calculation, the PrP:STI1 complex was represented as a single chain, by attaching the PrP N-terminus to the C-terminal residue of STI1 (for clarity, the initial 4 residues of PrP N-terminus are not shown in the figures). This procedure did not seem to introduce a serious constraint to
136
modeling, due to the 98-residue length of the flexible PrP tail. Furthermore, a contact constraint (maximum 10 Å separation) was imposed for the binding interface of PrP and STI1. For both GASBOR and BUNCH models no particle symmetry was imposed.
137
Results
Loss of PrP secondary structure upon binding to STI1
With the use of fluorescence anisotropy, we confirmed that the purified mouse PrP and STI1 recombinant proteins interact with Kd= 161 ± 98 nM (see SI Fig. 1), in agreement with previous results obtained with a different technique, that reported Kd= 140 nM (11), and we also found that the reaction follows a 1:1 binding stoichiometry.
The far-UV circular dichroism (CD) spectrum for an equimolar PrP:STI1 sample did not match the expected residue number-weighted sum of the spectra of the individual proteins predicted by Eq. 2 in Materials and Methods (Fig. 1B). An approximate 5% reduction in CD peak deflection suggested a reduction in the α-helix content of the interacting proteins.
To further investigate this apparent structural modification, we used synthetic peptides containing the binding sites of each protein, namely PrP113-132 and STI1230-245 (11). Since STI1230-245 is capable of activating biological effects through PrPC (11,22), those peptides might be sufficient to mimic the structural effects triggered by the interaction of the native proteins. CD spectra of each molecule showed that the isolated oligopeptides are intrinsically disordered (data not shown). Interestingly, the interaction of PrP and STI1230-245 resulted in an approximate 30% decrease in CD intensity at 208 nm, indicating a significant loss of PrP secondary structure, whereas a negligible, albeit reproducible effect was found of PrP113-132 on STI1 (Fig. 1A). Furthermore, when the measured spectra of the full-length proteins in the peptide-bound conformations (Fig. 1A) were summed (Eq. 2), the result matched exactly the measured spectrum of the PrP:STI1 sample (Fig. 1B), thus confirming the structural change observed for the interaction between PrP and STI1. These data are consistent with the interpretation that the peptides containing the active sites for the PrP:STI1 interaction reproduce, on their cognate proteins, the structural effects observed for the interaction between the full-length proteins, i.e. a partial loss of helical structure, and that this structural modification is particularly strong for PrP. Importantly, these effects are not a byproduct of protein aggregation, since neither Rayleigh scattering measurements (data not shown) nor Guinier analysis of SAXS data (Inset in Fig. 3A) detected any aggregation or higher oligomeric forms in the complex samples. In addition, the lack of a significant effect of the PrP113-132 peptide upon the CD spectrum of STI1 (Fig. 1A) serves as a negative control.
Fluorescence spectroscopy confirms structural rearrangement of PrP upon binding STI1.
To further investigate this conformational change, we applied extrinsic fluorescence spectroscopy using the amphiphilic dye bis-ANS (4,4'-dianilino-1,1'-binaphthyl-5,5'-sulfonate) (37). This dye presents negligible fluorescence when free in aqueous solution; however, the dye significantly increases its fluorescence emission when inserted into structured hydrophobic pockets of proteins that shield it from contact with the solvent. Consequently, bis-ANS fluorescence intensity is a useful tool to monitor the folding state of proteins (30, 38). A bis-ANS:PrP sample presented strong bis-ANS fluorescent emission, which progressively decreased when the sample was titrated with STI1230-245 (Fig 2A). Since the STI1 binding site in PrP, i.e. PrP113-128, is contained within a hydrophobic segment of PrPC, these data could be taken as evidence that STI1230-245 displaces PrP113-128-bound dye (39). However, this is unlikely to explain our observation of an approximate 80% decrease in total fluorescence (Inset in Fig 2A) for two reasons: First, the native PrP113-128 segment is part
138
of the solvent-exposed, flexible N-terminus whereas bis-ANS fluorescence is only augmented when inserted into structured hydrophobic patches; And second, because the fluorescence of bis-ANS was not enhanced with respect to the emission of free bis-ANS, by the presence of the hydrophobic peptide PrP113-132 (Inset in Fig 2A) that approaches the conformation of the 113-132 flexible segment of full-length PrP. The data strongly suggest that the interaction of PrP with STI1230-245 results in a disruption of PrP hydrophobic pockets, partially exposing these cavities (and the inserted dye) to the solvent, such as in a partial unfolding event. Consistent with this interpretation, a bis-ANS:STI1 sample titrated with PrP113-132 did not present significant variations in bis-ANS fluorescence (Inset in Fig 2A). Overall, the extrinsic fluorescence data correlate well with the results of the CD experiments above.
When a PrP sample was titrated with STI1, its intrinsic fluorescence emission spectrum excited at 280 nm initially suffered a decay in peak intensity at 344 nm, followed by a subsequent increase in fluorescence signal, and finally stabilized at a 1:1 PrP:STI1 molar ratio at an intensity similar to free PrP, albeit with a robust blue-shift (see SI Fig 2A). These data suggest that the interaction perturbs the environment of fluorescent residues on either protein. However, since both proteins contain abundant aromatic residues, i.e. 8 tryptophans (Trp) and 13 tyrosines (Tyr) in PrP and 1 Trp and 28 Tyr in STI1, it is not possible to assign these effects to any specific residue.
We therefore used the binding-site peptides, which contain only one Tyr each in their sequences. The fluorescence emission spectrum of STI1 is dominated by its numerous Tyr. Setting excitation at 280 nm and titrating the Tyr harboring peptide PrP113-132 on a STI1 sample, an increase in fluorescence emission at 303 nm was observed (see SI Fig 2B). The fact that this increase is larger than the spectrum of the added peptide confirms binding, but since both PrP113-132 and the binding site in STI1 contain one Tyr each, structural conclusions are unwarranted. On the other hand, excitation of PrP at 280 nm resulted in a Trp-dominated spectrum with peak intensity of fluorescence emission at 344 nm (Fig. 2B), indicating a strong contribution of Trp substantially exposed to the solvent, as expected. The fluorescence spectrum intensity decayed drastically as a function of the concentration of peptide STI1230-
245, reaching saturation approximately at an 80% decrease at a 1:1 molar ratio, (Fig 2B). This effect can only be attributed to a structural perturbation of PrP, since the spectral contribution of the STI1 peptide is negligible compared to PrP. An approximate 4 nm blue-shift of the peak intensity was also observed, which indicates that, overall, Trp engage in more apolar interactions as a consequence of peptide binding.
The multiplicity of Trp in PrP precludes site-specific information regarding the effect of the interaction of full-length PrP and STI1230-245. However, all but one Trp are contained within the N-terminal unstructured domain of PrP. We, therefore, constructed a PrP mutant with a partial N-terminal deletion plus a site mutation W98F. This PrP95-231
W98F mutant preserves the binding site for STI1 and contains a single Trp at position 144, within the first α-helix of PrP. In order to excite this Trp selectively, we set excitation at 295 nm, at the cost of loosing total fluorescence intenstity. The resulting spectrum had a maximum intensity at 343 nm, as expected for Trp in a solvent-exposed α-helix. Interestingly, STI1230-245 induced a significant perturbation in the first α-helix of PrP95-231
W98F, as shown by the gradual decay in the fluorescence emission of Trp144 upon peptide titration, once again reaching saturation at 1:1 molar ratio (Fig 2C). Due to spectral broadening, wavelengths of maximum emission were difficult to determine, thus we were not able to detect shifts in maximal emission. The observed effect did not seem to fully account for the changes in wild-type PrP. Still, the data show that the interaction of PrP with the peptide containing the binding site from STI1
139
produces an important structural modification in PrP, which involves both the unstructured N-terminal tail and a loosening of its globular domain, affecting at least the α-helix PrP143-153. Data gathered with excitation at 290 nm produced similar results (not shown). The data are again consistent with the results of the CD experiments, which suggested a partial unwinding of PrP α-helical structures (Fig 1A). As a control, monitoring of elastic Rayleigh scattering of all the samples at 320 nm showed no evidence of aggregation (data not shown).
SAXS models uncover tertiary structural rearrangements on STI1 upon binding PrP
SAXS measurements were made to obtain information on the size and shape of both STI1 and the PrP:STI1 complex in solution (40). The scattering profiles are shown in Fig. 3A. Linear least squares fitting of Guinier plots (31) (Inset in Fig. 3A) were done in the region of small scattering vector, q, i.e. q<Rg
-1, where Rg is the molecular radius of gyration. These plots confirmed the monodispersity of the samples, and indicated a Rg of 58.34 ± 1.71 Å for STI1 and 53.26 ± 1.72 Å for PrP:STI1. Fitting the experimental data through indirect Fourier transformation methods using the program GNOM (32) (Fig. 3A) allowed an estimate of the maximum molecular diameter of the samples, Dmax, which were 198 Å and 162 Å for STI1 and the PrP:STI1 complex, respectively. This analysis also leads to the pair distance distribution functions, p(r) (Fig. 3B), which provided an Rg of 60.24±0.2 Å for STI1 and 52.26±0.15 Å for the PrP:STI1 complex, in agreement with the results obtained by Guinier plots (see Table 1 for a summary of structural parameters). Size exclusion high-performance liquid chromatography (SE-HPLC) using both TSK-gel 3000SW and Superdex 200 columns and native polyacrylamide gel electrophoresis of our STI1 samples suggest an elongated, non-globular, monomeric protein, with rare higher oligomeric forms (SI Figs 3-4). Interestingly, when compared with free STI1, SE-HPLC measurements seem to indicate that PrP:STI1 samples elute as having a smaller Stokes radius, and thus diffuse through the column as a particle with a lower molecular weight (SI Fig 2 and Table 1), which would support the compaction event suggested by SAXS experiments. However, this evidence is not conclusive, because, at near neutral pH, free PrP tends to elute in multiple peaks with poor reproducibility, which likely explains the rarity of studies showing SE-HPLC data of either wild-type or truncated PrP in native form, usually replaced by proteins either treated with urea or at an acid pH (41, 42). Notwithstanding, comparing the forward scattering values, I(0), of the obtained sample with that of lysozyme samples further supports the monomeric form of STI1 and suggests that the PrP:STI1 complex is formed by one molecule of PrP and one of STI1 (Table 1). Moreover, the calculated p(r) of both STI1 and PrP:STI1 are characteristic of elongated structures (Fig. 3B), and Kratky plots (31) suggest multi-domain extended conformations (Inset in Fig. 3B). These initial analyses indicate that both STI1 and the PrP:STI1 complex are non-globular, elongated proteins, the former monomeric and the latter formed by one molecule of each species. Interestingly, the data indicate that binding of PrP to STI1 entails significant structural compaction, despite the presence of the N-terminal flexible domain of PrP.
To gain further insight into the structural assembly of STI1 and the PrP:STI1 complex, we reconstructed low-resolution ab initio models using the GASBOR software, consisting of chain-compatible spatial distributions of dummy residues that fit the experimental scattering patterns (32). A set of these models was produced and averaged (33), resulting in volumetric models that represent the shape of the molecules. In addition, we carried out rigid body modeling of the full-length molecules using the BUNCH software (35). As an approximation, we used for the latter models the high-resolution structures of TPR1, TPR2a (18) and the C-terminal globular domain of PrP (7), along with the homology models for TPR2b, DP1 and DP2 obtained using the structure prediction server Lomets (36). The domains were linked
140
with dummy residue flexible chains, and the experimental data was fitted. For the complex model, a proximity constraint was imposed between the binding sites of the proteins. Fitting results for the ab initio volumetric and full-length rigid body models are presented in Fig 3A, and the models of STI1 and PrP:STI1 in Figs 4B and 4C, respectively. Importantly, for both molecules both types of models agreed well.
The results depict mouse STI1 as a monomeric elongated protein, which undergoes compaction when binding PrP in 1:1 stoichiometry. Aligning the model of STI1 in the PrP-binding conformation to the free STI1 model (Fig 5) clearly indicates that the C-terminal part of STI1 encompassing the TPR2a, TPR2b and DP2 domains clusters together. This is the result of the approximation of DP2 and TPR2a (the PrP-binding domain) to TPR2b, which are otherwise outward oriented in the free STI1 model.
141
Discussion
Structural changes in either PrPC or STI1 upon binding are likely of biological relevance, since these modifications may either expose or hide putative binding sites for the assembly of higher-order protein complexes at the cell surface (6). Using a variety of techniques, we assessed the impact of PrP:STI1 binding at both local and secondary-structure levels. Our data suggest that this interaction triggers a structural rearrangement of the N-terminal tail of PrP, plus partial unfolding of the C-terminal globular domain in the form of a loosening of PrP α-helical structures, involving at least the first α-helix PrP143-153. Importantly, the effect of the peptide containing the binding site of STI1 showed that these modifications can be triggered by local interactions at the STI1-binding domain located at the junction of the flexible tail with the first α-helix of PrP. This suggests that such interactions unleash a series of structural perturbations that propagate into the PrP globular domain, without involvement of further STI1 domains. This type of docking-triggered, long-range structural change has been observed in various signaling molecules, and constitutes a structural basis for allosteric regulation (43). Indeed, it was recently shown that long-range, sequentially distant interactions affect local structure features in PrP (44). Moreover, a previous nuclear magnetic resonance (NMR) study assessed the impact of a PrP flexible N-terminus segment in the structure of its globular domain. The NMR models obtained showed that this partial tail alters the structure of the folded domain, and concluded that the PrP113-125 glycine-enriched hydrophobic sequence (covering almost entirely the STI1 binding site), although flexible, seems to present a marginally stable polymorphic structure that is involved in long-range interactions that stabilize extended conformations of PrP α-helices at the globular domain (45). Truncation of this segment renders a PrP globular domain with shorter α-helices. These data are consistent with our observation that engagement of PrP113-128 with either STI1230-245 or full-length STI1, results in a diminished content of α-helical structures in PrP, since this engagement would disrupt critical long-range interactions needed to stabilize such structures.
Our SAXS data indicate that mouse STI1 is a monomeric, elongated protein. In contrast, STI1 dimers have been reported in previous studies using yeast STI1 (46,47) and the human homologue hop (19,20). However, the yeast protein has only ~40% homology to mouse STI1 used in the present study. Further, the human protein, despite its ~97% homology to mouse STI1, differs from the latter in residues T243K, K250R, and Y269H within the TPR2a dimerization domain, and residue 269 lies exactly at the dimerization interface suggested in (20). In one study (19) data supporting hop dimerization consisted only of an elution volume that corresponded to a globular protein of 120 kDa in SE-HPLC, that is lower than the elution volume of the dimeric globular bovine serum albumin. In fact, 14 point mutations covering all hop domains failed to affect elution volume. Those data are, thus, also consistent with a monomeric, elongated protein. Importantly, the only study addressing the oligomeric state of mouse STI1 using SE-HPLC and chemical cross-linking of various purified versions of the protein found monomeric forms for 2 out of 3 versions (48). Our results of SE-HPLC (using Superdex-200 and TSK-gel 3000SW columns), native PAGE and SAXS, all support that His-tagged mouse STI1 is present in a monomeric form, with much less abundant higher oligomeric sates, in agreement with (48).
SAXS data further showed that the PrP:STI1 complex is more compact than STI1 alone. Calibration with molecular weight standards supports a 1:1 molar binding stoichiometry for the complex. Novel, congruent SAXS volumetric and rigid-body models
142
picture STI1 as an extended, beads-on-a-string-like protein, and the complex presents a similar, more compact, shape. The model of the complex is also consistent with a 1:1 binding stoichiometry, and suggests that PrP binding triggers a significant structural modification of STI1 as a result of the approximation of TPR2a, TPR2b and DP2 domains, leaving the overall organization of the N-terminal part of the molecule (including TPR1 and DP1 domains) largely unmodified.
The binding between PrPC and STI1 activates multiple and parallel signaling pathways (11,14,21,22), but the mechanisms involved are not established. Since none of these proteins possess any transmembrane domain, it is tempting to postulate that binding modifies their affinities for transmembrane ligands that can mediate the signaling events (6). Evidence that the binding of STI1 produces structural rearrangement, notably a loss of α-helical content in the first α-helix of the globular domain of PrPC, is of particular relevance. This helix contains the binding sites of two of the best-characterized PrP ligands, namely the laminin receptor precursor (49) and N-CAM (50), both of which are transmembrane proteins involved in either PrPC-mediated signaling or PrPSc-mediated cytopathology. On the other hand, hop/STI1 is known to be an adaptor protein that coordinates the dynamic assembly of the chaperone hsp90:hop:hsp70 complex. The formation of this complex is accompanied by conformational modifications, and the initial binding of hsp90 to hop results in alteration of the number of hop:hsp70 binding sites and a 5-fold enhancement of hop affinity for hsp70 (51). We speculate that, in analogy to the hsp90:hop:hsp70 mechanism, the observed changes in the tertiary structure of STI1 triggered by the interaction with PrPC may alter the affinity of STI1 for its own ligands. Moreover, proteins with multiple TPR domains, such as hop/STI1, have been associated with the assembly of multiprotein complexes, serving as structural platform capable of multiple interactions and catalyzing diverse biological processes (52). Hence, the PrPC-binding triggered approximation of TPR2a, TPR2b and DP2 domains of STI1 may bring together its ligands, therefore facilitating further interactions with biological consequences.
Previous work on murine retinal explants and cultures of hippocampal neurons showed that STI1230-45 is capable of mimicking the effect of full-length STI1, engaging PrPC at the cellular surface and triggering signaling events with trophic consequences (11,22). Then, our observation that either STI1230-245 or full-length STI1 perturb the secondary structure of PrP to the same degree leads us to suggest that this structural modification of PrP is the key molecular mechanism responsible for triggering the neurotrophic signaling events in those preparations. On the other hand, whereas full-length STI1 induces PrPC-dependent proliferation of glioblastoma cell cultures (14), STI1230-245 had no effect (S. Kahn, R.B. Erlich, L.B.Chiarini, R. Linden, V.R. Martins and V. Moura-Neto, unpublished observations), which suggests that domains of STI1 apart from the PrP-binding segment are necessary for activating the underlying signals. The clustering of TPR2a, TPR2b and DP2 domains of STI1, triggered by PrP-binding, raises the hypothesis that the STI1 C-terminal domains may be involved in the latter proliferation signals.
In summary, reciprocal structural modifications of STI1 and PrPC constitute a versatile mechanism that may help explain the variety of intracellular signals triggered upon their binding. The data shown here are consistent with both the idea that PrPC dynamically scaffolds multi-protein functional complexes composed of various, cell type-specific combinations of ligands (6), as well as with the hypothesis that such multi-protein complexes may be involved in the pathogenesis of prion diseases, perhaps by imparting distinct pathological characteristics depending on specific combinations of PrP ligands.
143
Acknowledgements
We thank Dr. Tomas S. Plivelic, Dr. Fernando Q. Reis and Dr. Lucas Sanfelici for excellent technical assistance with he LNLS beamline, and Talita M. Oliveira for assistance on purification of STI1. This research was supported by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq #472741/2007-1, #486489/2006-0, #420036/2005-9, #410554/2006-5, #151567/2004-2, #480986/2004-5, #420015/2005-1, #472174/2007-0; IMBEBB # 42.0120/2005-0); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (FAPERJ APQ1-E-26/170.406/2006, PRONEX and CNE Programs) and Brazillian Synchrotron Light Laboratory (LNLS; D11A-SAS1 7690/08).
144
References
1. Prusiner, S.B. (1998) Prions. Proc Natl Acad Sci USA 95, 13363-13383. 2. Collins, S.J., Lawson, V.A., and Masters, C.L. (2004) Transmissible spongiform
encephalopathies. Lancet 363, 51-61. 3. Bueler, H., Fischer, M., Lang, Y., Bluethmann, H., Lipp, H.-P., DeArmond, S.J.,
Prusiner, S.B., Aguet, M., and Weissmann, C. (1992) Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature 356, 577–582.
4. Manson, J.C., Clarke, A.R., Hooper, M.L., Aitchison, L., McConnell, I., and Hope, J. (1994) 129/Ola mice carrying a null mutation in PrP that abolishes mRNA production are developmentally normal. Mol Neurobiol 8, 121–127.
5. Mallucci, G.R., Ratté, S., Asante, E.A., Linehan, J., Gowland, I., Jefferys, J.G.R., and Collinge, J. (2002) Post-natal knockout of prion protein alters hippocampal CA1 properties, but does not result in neurodegeneration. EMBO J 21, 202-210.
6. Linden, R., Martins, V.R., Prado, M.A.M., Cammarota, M., Izquierdo, I., and Brentani, R.R. (2008) Physiology of the prion protein. Physiol Rev 88, 673-728.
7. Riek, R., Hornemann, S., Wider, G., Billeter, M., Glockshuber, R., and Wuthrich, K. (1996) NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-231). Nature 382, 180-182.
8. Zahn, R., Liu, A., Luhrs, T., Riek, R., Von Schroetter, C., Lopez-Garcia, F., Billeter, M., Calzolai, L., Wider, G., and Wüthrich, K. (2000) NMR solution strucure of the human prion protein. Proc Natl Acad Sci USA 97, 145-150.
9. Lima, L.M.T.R., Cordeiro, Y., Tinoco, L.W., Marques, A.F., Oliveria, C.L., Sampath, S., Kodali, R., Choi, G., Foguel, D., Torriani, I., Caughey, B., and Silva, J.L. (2006) Structural insights into the interaction between prion protein and nucleic acid. Biochemistry 45, 9180-9187.
10. Lee, K.S., Linden, R., Prado, M.A., Brentani, R.R., and Martins, V.R. (2003) Towards cellular receptors for prions. Rev Med Virol 13, 399-408.
11. Zanata, S.M., Lopes, M.H., Mercadante, A.F., Hajj, G.N., Chiarini, L.B., Nomizo, R., Freitas, A.R., Cabral, A.L., Lee, K.S., Juliano, M.A., De Oliveira, E., Jachieri, S.G., Burlingame, A., Huang, L., Linden, R., Brentani, R.R., and Martins, V.R. (2002) Stress-inducible protein 1 is a cell surface ligand for cellular prion protein that triggers neuroprotection. EMBO J 21, 3307-3316.
12. Baumann, F., Tolnay, M., Brabeck, C., Pahnke, J., Kloz, U., Niemann, H.H., Heikenwalder, M., Rulicke, T., Burkle, A., and Aguzzi, A. (2007) Lethal recessive myelin toxicity of prion protein lacking its central domain. EMBO J 26, 538-547.
13. Li, A., Christensen, H.M., Stewart, L.R., Roth, K.A., Chesa, R., and Harris, D.A. (2007) Neonatal lethality in transgenic mice expressing prion protein with a deletion of residues 105-125. EMBO J 26, 548-558.
14. Erlich, R.B., Kahn, S.A., Lima, F.R., Muras, A.G., Martins, R.A., Linden, R., Chiarini, L.B., Martins, V.R., and Moura Neto, V. (2007) STI1 promotes glioma proliferation through MAPK and PI3K pathways. Glia 55, 1690-1698.
15. Odunuga, O.O., Longshaw, V.M., and Blatch, G.L. (2004) Hop: more than an Hsp70/Hsp90 adaptor protein. Bioessays 26, 1058-1068.
16. Arruda-Carvalho, M., Njaine, B., Silveira, M.S., Linden, R., and Chiarini, L.B. (2007) STI1 modulates retinal proliferation and cell death independent of PrPC. Biochem
Biophys Res Commun 358, 620-625. 17. Eustace, B.K., and Jay, D.G. (2004) Extracellular roles for the molecular chaperone,
hsp90. Cell Cycle 3, 1098-1100.
145
18. Scheufler, C., Brinker, A., Bourenkov, G., Pegoraro, S., Moroder, L., Bartunik, H., Hartl, F.U., and Moarefi, I. (2000) Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell 101, 199-210.
19. Carrigan, P.E., Nelson, G.M., Roberts, P.J., Soffer, J., Riggs, D.L., and Smith, D.F. (2004) Multiple domains of the co-chaperone hop are important for Hsp70 binding. J
Biol Chem 279, 16185-16193. 20. Onuoha, S.C., Coulstock, E.T., Grossmann, J.G., and Jackson, S.E. (2008) Structural
studies on the co-chaperone hop and its complexes with Hsp90. J Mol Biol 379, 732-744.
21. Chiarini, L.B., Freitas, A.R., Zanata, S.M., Martins, V.R., Brentani, R.R., and Linden, R. (2002) Cellular prion protein transduces neuroprotective signals. EMBO J 21, 3317-3326.
22. Lopes, M.H., Hajj, G.N., Muras, A.G., Mancini, G.L., Castro, R.M., Ribeiro, K.C., Brentani, R.R., Linden, R., and Martins, V.R. (2005) Interaction of cellular prion protein and stress-inducible protein 1 promotes neuritogenesis and neuroprotection by distinct signaling pathways. J Neurosci 25, 11330-11339.
23. Americo, T.A., Chiarini, L.B., and Linden, R. (2007) Signaling induced by hop/STI-1 depends on endocytosis. Biochem Biophys Res Commun 35, 620-625.
24. Caetano, F.A., Lopes, M.H., Hajj, G.N.M., Machado, C.F., Arantes, C.P., Magalhães, A.C., Vieira, M.D.P., Américo, T.A., Massensini, A.R., Priola, S.A., Vorberg, I., Gomez, M.V., Linden, R., Prado, V.F., Martins, V.R., and Prado, M.A.M. (2008) Endocytosis of prion protein is required for ERK1/2 signaling induced by stress-inducible protein 1. J
Neurosci 28, 6691-702. 25. Bray, D., and Duke, T. (2004) Conformational spread: the propagation of allosteric
states in large multiprotein complexes. Ann Rev Biophys Biomol Struct 33, 53-73. 26. Whitty, A. (2008) Cooperativity and biological complexity. Nat Chem Biol 4, 435-
439. 27. Zahn, R., von Schroetter, C., and Wuthrich, K. (1997) Human prion proteins expressed
in Escherichia coli and purified by high-affinity column refolding. FEBS Lett 417, 400-404.
28. Matozo, H.C., Santos, M.A.M., de Oliveria Neto, M., Bleicher, L., Lima, L.M.T.R., Iuliano, R., Fusco, A., and Polikarpov, I. (2007). Low resolution structure and fluorescence anisotropy analysis of protein Tyrosine Phosphatase η catalytic domain. Biophys J 92, 4424-4432.
29. Lima, L.M.T.R., and Silva, J.L. (2004). Positive contribution of hydration on DNA binding by E2c protein from papillomavirus. J Biol Chem 279, 47968-47974.
30. Golbik, R., Zahn, R., Hardig, S.E., and Fersht, A.R. (1998) Thermodynamic stability and folding of GroEL minichaperones. J Mol Biol 276, 505-515.
31. Glatter, O., and Kratky, O. (1982) in Small angle X-ray scattering (Glatter, O., and Kratky, O., eds) pp.119-196, Academic Press, New York, USA.
32. Svergun, D.I. (1992) Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. J Appl Cryst 25, 495-503.
33. Svergun, D.I., Petoukhov, M.V., and Koch, M.H.J. (2001) Determination of domain structure of proteins from X-ray solution scattering. Biophys J 80, 2946-2953.
34. Volkov, V.V., and Svergun, D.I. (2003) Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. J Appl Cryst 36, 860-864.
35. Petoukhov, M.V., and Svergun, D.I. (2005) Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J 89, 1237-12350.
146
36. Wu, S., and Zhang, Y. (2007) LOMETS: a local meta-threading-server for protein structure prediction. Nucleic Acids Res 35, 3357-3382.
37. Rosen, C.G., and Weber, G. (1969) Dimer formation from 1-anilino-8-naphthalene sulfonate catalyzed by bovine serum albumin - A new fluorescent molecule with exceptional binding properties. Biochemistry 8, 3915-3920.
38. Gomes, M.O., Pinheiro, A.S., Bonafe, C.F.S., Silva, J.L. (2003) Pressure-induced fusogenic conformation of vesicular stomatitis virus glycoprotein. Biochemistry 42, 5540-5546.
39. Cordeiro, Y., Lima, L.M., Gomes, M.P., Foguel, D., and Silva, J.L. (2004) Modulation of prion protein oligomerization, aggregation, and beta-sheet conversion by 4,4'-dianilino-1,1'-binaphthyl-5,5'-sulfonate (bis-ANS). J Biol Chem 13, 5346-5252.
40. Petoukhov, M.V., and Svergun, D.I. (2007) Analysis of X-ray and neutron scattering from biomolecular solutions. Curr Opin Struct Biol 17, 562-571.
41. Morillas, M., Vanik, D.L., Surewicz, W.K. (2001) On the mechanism of α-helix to β-sheet transtion in the recombinant prion protein. Biochemistry 40, 6982-6987.
42. Lu, B.-Y., Beck, P.J., Chang, J.-Y. (2001) Oxidative folding of murine prion mPrP(23-231). Eur J Biochem 268, 3767-3773.
43. Reményi, A., Good, M.C., and Lim, W.A. (2006) Docking interactions in protein kinase and phosphatase networks. Curr Opin Struct Biol 16, 676-685.
44. Christen, B., Hornemann, S., Damberger, F.F., and Wüthrich, K. (2009) Prion protein NMR structure from Tammar Wallaby (Macropus eugenii) shows that the β2-α2 loop is modulated by long-range sequence effects. J Mol Biol doi:10.1016/j.jmb.2009.04.040.
45. James, T.L., Liu, H., Ulyanov, N.B., Farr-Jones, S., Zhang, H., Donne, D.G., Kaneko, K., Groth, D., Mehlhorn, I., Prusiner, S.B., and Cohen, F.E. (1997). Solution structure of a 142-residue recombinant prion protein corresponding to the infectious fragment of the scrapie protein. Proc Natl Acad Sci 94, 10086-10091.
46. Prodromou, C., Siligardi, G., O'Brien, R., Woolfson, D.N., Regan, L., Panaretou, B., Ladbury, J.E., Piper, P.W., and Pearl, L.H. (1999). Regulation of Hsp90 ATPase activity by tetratricopeptide repeat (TPR)-domain co-chaperones. EMBO J 18, 754-762.
47. Flom, G., Behal, R.H., Rosen, L., Cole, D.G., and Johnson, J.L. (2007). Definition of the minimal fragments of STI1 required for dimerization, interaction with Hsp70 and Hsp90 and in vivo functions. Biochem J 404, 159-167.
48. Van der Spuy, J., Cheetham, M.E., Dirr, H.W., and Blatch, G.L. (2001). The cochaperone murine stress-inducible protein 1: overexpression, purification and characterization. Protein Expr Purif 21, 462-469.
49. Hundt, C., Peyrin, J.M., Haïk, S., Gauczynski, S., Leucht, C., Rieger, R., Riley, M.L., Deslys, J.P., Dormont, D., Lasmézas, C.I., and Weiss, S. (2001). Identification of interaction domains of the prion protein with its 37-kDa/67-kDa laminin receptor. EMBO J 20, 5876-5886.
50. Santuccione, A., Sytnyk, V., Leshchyns'ka, I., and Schachner, M. (2005) Prion protein recruits its neuronal receptor NCAM to lipid rafts to activate p59fyn and to enhance neurite outgrowth. J Cell Biol 169, 341-354.
51. Hernández, M.P., Sullivan, W.P., and Toft, D.O. (2002). The assembly and intermolecular properties of the hsp70-Hop-hsp90 molecular chaperone complex. J Biol
Chem 277, 38294-38304. 52. Blatch, G.L., and Lässle, M. (1999). The tetratricopeptide repeat: a structural motif
mediating protein-protein interactions. Bioessays 21, 932-939.
147
Figure Legends
Fig. 1. Unfolding of PrP triggered when binding either STI1 or STI1230-245. (A) CD spectra of measured (blue line) and predicted (red line) equimolar sample of STI1:PrP113-132, shown along with the measured (green line) and predicted (black line) spectra of an equimolar sample of PrP:STI1230-245. (B) CD spectra of measured (blue line) and predicted (green line) equimolar sample of PrP:STI1, along with the spectrum predicted for an equimolar mixture of PrP and STI1 in the peptide-bound conformations (red line). The spectra for these conformations were obtained by subtracting the respective peptide contributions from the spectra measured in (A).
Fig. 2. Fluorescence spectroscopy supports structural rearrangement of PrP when binding STI1230-245. (A) Bis-ANS emission spectra of a bis-ANS:PrP:STI1230-245 at the 2:1:0 (black solid line), 2:1:0.25 (green solid line), 2:1:0.5 (blue solid line), 2:1:1 (red solid line) molar ratios. Free bis-ANS (gray solid line) and bis-ANS:STI1230-245 (dashed gray line) showed similar fluorescence emission. All spectra were normalized by the maximum emission of the bis-ANS:PrP 2:1 sample, i.e., 41863. Excitation was set as 360 nm. Inset: bis-ANS relative 500 nm fluorescence emission during titration of STI1230-245 on a bis-ANS:PrP sample (dotted black solid line), and titration of PrP113-132 on a bis-ANS:STI1 sample (dotted red solid line). As a reference, we show: the 500 nm fluorescence emission of free bis-ANS (gray solid line) and bis-ANS:STI1230-245 (dashed black line), both relative to the bis-ANS:PrP emission; the 500 nm emission of free bis-ANS (pink solid line) and bis-ANS:PrP113-132 (dashed red line), both relative to the bis-ANS:STI1 emission. Data are presented as a function of the molar ratios of STI1230-245:PrP and PrP113-132:STI1, respectively. (B) Emission spectra of 2 µM free PrP (black solid line), and PrP:STI1230-245 samples at 2:0.5 (orange solid line), 2:1 (green solid line) and 2:2 (red solid line) µM concentrations. The spectrum of 2 µM free STI1230-245 (cyan solid line) is also presented. To demonstrate the saturation of the effect, we also present the spectra obtained by subtracting the spectral emission of 2 µM free STI1230-245 from the emission of a 2:4 µM PrP:STI1230-245 sample, in order to subtract the contribution from the excess peptide (blue solid line). All spectra were normalized by the maximum intensity of the free PrP spectrum, i.e. 71230. Excitation was set at 280 nm. Inset: Relative area of the spectra obtained during this STI1230-245 titration, as a function of the STI1230-245:PrP molar ratio (dotted black solid line). (C) Same as in (B) but replacing PrP with PrP95-231
W98F at a 5.5 µM concentration, exciting at 295 nm and normalizing by the maximum intensity of the free PrP95-231
W98F spectrum, i.e. 32940.
Fig. 3. SAXS data suggests structural compaction as a consequence of STI1:PrP complex formation. (A) Measured scattered intensity for STI1 (red dots) and an equimolar sample of PrP:STI1 (blue dots), along with the corresponding GNOM fits (green lines) and BUNCH fits (black lines). Inset: linear fits to Guinier plots. STI1 and PrP:STI1 in red an blue dots, respectively. (B) Pair distance distribution, p(r), calculated by GNOM, for STI1 (red line) and the PrP:STI1 complex (blue line). Inset: Kratky plots for STI1 (red dots) and PrP:STI1 (blue dots). The scattering intensities at 0 angle of both samples were matched before calculation of the Kratky plot to allow comparisons.
Fig. 4. SAXS models of STI1 and PrP:STI1. (A) Schematic representation of the sequences of STI1 (top row) and PrP (bottom row). Globular domains are highlighted as boxes and flexible segments as lines. (B) and (C) BUNCH rigid body models (top row) and superposition of these models with GASBOR volumetric models represented as gray spheres (bottom row).
148
Three model visualizations are presented in each row, where the second and third ones (from left to right) are 90o successive rotations of the first representation. Domain and flexible linker colors are as in (A). The binding sites PrP113-132 and STI1230-245 are highlighted in red. (B) Models for STI1. (C) Models for PrP:STI1.
Fig. 5. Alignment of free STI1 (blue) and STI1 in the PrP-bound conformation (red) BUNCH models (PrP omitted for clarity).
149
150
151
152
153
154
155
Table 1. Summary of obtained structural parameters.
Molecule Molecular
weight by SE-
HPLC (kDa)
Molecular weight
by I(0) (kDa)
Molecular
weight by
sequence (kDa)
Rg (Å)
(Guinier)
Rg (Å)
(GNOM)
Dmax
(Å)
STI1 108 72 66 58.34±1.71 60.24±0.2 198
STI1:PrP 97? 87 89 53.26±1.72 52.26±0.1 162
156
Fig. SI 1. Fluorescence anisotropy of 50 nM FITC-labeled PrP in a total pool of 2 µM PrP titrated with STI1 (black dots). Curve was fitted considering a simple two-state reversible equilibrium between PrP and STI1, PrP + STI1 [PrP:STI1], as explained in (45). The obtained dissociation constant, Kd, was 161 ± 98 nM, in agreement with previous results obtained with a distinct technique (11). The curve saturates approximately at 2 µM of STI1, indicating a 1:1 binding stoichiometry. Excitation was set at 480 nm and emission was recorded through an orange short wave cut-off filter WG3-69 (50% cut-off at 520 nm). The graph shows the results of one representative experiment. Fig. SI 2. Fluorescence spectroscopy of STI1:PrP and STI1:PrP113-132. (A) Emission fluorescence spectra of 2 µM free PrP (solid black line), STI1:PrP at 0.5:2 (dashed line) and 2:2 (dotted line) µM concentrations, and spectrum of 2 µM free STI1 (gray solid line). All spectra were normalized to peak intensity of free PrP sample. Excitation set at 280 nm. (B) Emission fluorescence spectra of 4 µM free STI1 (solid black line) and STI1:PrP113-132 at a 4:4 µM concentration (dashed line). Spectrum of free PrP113-132 at 4 µM (gray solid line). Excitation set at 280 nm. Fig. SI 3. Evaluation of the oligomerization state of STI1 and PrP:STI1. SE-HPLC with TSK-gel 3000SW column of STI1 4.5 mg/ml (black solid line) and PrP:STI1 4 mg/ml (gray solid line) samples. The molecules eluted with a hydrodynamic radius equivalent to a globular protein of 108 kDa and 97 kDa, respectively. The vertical dashed line indicates the elution volume of a globular bovine serum albumin (BSA) dimer of 132 kDa. We obtained similar results using a Superdex-200 column. Inset: Calibration of the TSK-gel 3000SW column, highlighting the elution of STI1 as a gray dot. Fig. SI 4. STI1 is populated mainly as a monomeric species. 8% polyacrylamide gel electrophoresis of STI1 in native sample buffer (left lane) and in denaturing sample buffer (right lane). The gel, running buffer and native sample buffer did not contain any denaturing agents; the denaturing sample buffer contained 1% β-mercaptoethanol and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Samples were not boiled.
157
158
159
160
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo