52/ PŮVODNÍ PRÁCEORIGINAL PAPER

ACTA CHIRURGIAE ORTHOPAEDICAEET TRAUMATOLOGIAE ČECHOSL., 79, 2012, p. 52–58

Schopnost kostní reparace u pacientů podstupujících implantaci TEP kyčelního kloubu

Bone Healing Capacity in Patients Undergoing Total Hip Arthroplasty

T. KUČERA1, T. SOUKUP2, O. KRS3, K. URBAN1, P. ŠPONER1

1 Ortopedická klinika FN a LF UK Hradec Králové2 Ústav histologie a embryologie LF UK Hradec Králové3 Ústav anatomie LF UK Hradec Králové

ABSTRACT

PURPOSE OF THE STUDYTo identify some characteristics of bone repair capacity in elderly patients who undergo total hip arthroplasty, which re -

quires good healing ability of bone for implant osteointegration and bone defect repair, particularly if revision arthroplastyis necessary.

MATERIAL AND METHODSIn a group of 27 patients (mean age, 70±7 years; range, 60 to 81 years) a coincidence of osteoarthritis and osteope-

nia/osteoporosis was assessed, and mesenchymal stem cells (MSC) were isolated and their numbers, viability and proli-ferative capacity were evaluated. The MSC populations were examined for their behaviour on bone tissue scaffolds usedin orthopaedic surgery for treatment of bone lesions. Each patient underwent bone densitometry examination before totalhip arthroplasty. Bone marrow was harvested intra-operatively from the trochanteric region of the femur. From a portion ofbone marrow, MSCs were isolated and cultured, and a mononuclear cell concentrate was obtained. Either whole bone mar-row or a mononuclear cell concentrate was applied to selected matrices (allograft, demineralised bone matrix, porous beta-tricalcium phosphate ( -TCP), pressed hydroxyapatite or calcium sulphate). The production of new collagen and extracel-lular mineralized matrix were first assessed in expansion medium and, when the production was low, differentiation me diumwas used.

RESULTSA coincidence of osteoarthritis and osteopenia/osteoporosis was found in 50% of the patients. All were women with a low

body mass index and had been post-menopausal for an average of 23 years. The isolated MSCs contained a high per-centage of viable cells (mean, 95%).

The mesenchymal cells of patients with osteopenia, as compared with those having normal bone density, showed mar-kedly lower numbers of fibroblastic colony forming units (CFU-F) per ml and had a lower proliferative capacity because thepopulation doubling time during the first four passages was much longer. Of the scaffolds tested, allografts showed themost marked collagen and extracellular mineralized matrix production in expansion medium with either whole bone mar-row or a monocyte concentrate; porous -TCP was the best of bone graft substitutes in collagen and extracellular minera-lized matrix production by both whole bone marrow and a monocyte concentrate, but this was only in differential medium.

DISCUSSIONThe coincidence of ostearthritis with osteopenia/osteoporosis was found in a higher number of our patients than is repor-

ted in the literature. Also, a lower MSC proliferative capacity and a low number of CFU-F/ml in the patients with low bonedensity were interesting findings. Better bone regeneration would generally be achieved with higher MSC numbers and theuse of growth factors for stimulation of osteoinduction and angiogenesis. Bone marrow harvesting for MSC isolation, cul-tivation and subsequent transplantation is currently feasible only in an experiment. A bone marrow aspirate can be appli-ed, but it may not provide a sufficient number of MSCs. In addition to autologous bone grafts, the best collagen produc tionwas on allografts. In bone graft substitutes, the porous structure played an important role because on a non-porous mate-rial (calcium sulphate) the formation of collagen was very low. There was no difference in collagen and extracellular mine-ralized matrix production between whole bone marrow and monocyte concentrates.

CONCLUSIONSElderly patients have reduced bone healing capacity also because of osteopenia/osteoporosis that occurs more often

than it is generally diagnosed, including its coincidence with osteoarthritis. The mesenchymal stem cells isolated from oste-openic bone give a lower number of CFU-F/ml and have a lower proliferative capacity. Of the matrices for new bone for-mation, allografts showed the best results because collagen was produced already in expansion medium. Of the graft sub-stitutes, porous -TCP was the best, but with collagen production in differential medium. The use of bone marrow aspirateis currently a method of choice in order to increase MSC numbers at the site of bone healing. The use of growth factors isan expensive treatment. To achieve the goal of reliable promotion of osteogenesis with cultured MSC transplantation anduse of composite materials with pro-osteogenic and pro-angiogenic factors will still require many experimental and clinicalstudies.

Key words: osteoporosis, mesenchymal stem cells, allogeneic bone graft, bone graft substitutes.

s_52_58_kucera_test_acta_sloupce 2/9/12 6:27 PM Stránka 52

53/ ACTA CHIRURGIAE ORTHOPAEDICAEET TRAUMATOLOGIAE ČECHOSL., 79, 2012 PŮVODNÍ PRÁCE

ORIGINAL PAPER

ÚVOD

Současná ortopedie, stejně jako ostatní lékařské obo-ry, je konfrontována se skutečností, že se prodlužujeprůměrný věk a stoupá počet seniorů. Z hlediska pohy-bového aparátu to znamená narůstající množství dege-nerativních kloubních onemocnění a zlomenin v osteo-porotické kosti, ale také zvyšující se nároky na tentosystém. Materiálově mechanický přístup vedl k náhra-dě poškozené kostní tkáně a rozvoji endoprotetiky.Vzhledem k nastoupenému trendu je v současné doběnutné minimalizovat rizika selhání implantátů a pro-dloužit jejich životnost, což vede k hledání biologickyzaložených přístupů nejen při konstrukci povrchů pro-téz (15), ale také k podpoře a urychlení tkáňové repara-ce.

S problematikou obnovení tkáně – kostního hojení –se setkáváme v každodenní ortopedické a traumatolo-gické praxi. Nejčastěji jsme nuceni léčit kostní defektyv rámci revizní endoprotetiky, dále při ošetření nádorůmpodobných afekcí, benigních, případně maligních kost-ních tumorů. V traumatologii je to pak hojení zlomenina léčba pakloubů. Cílem správného zhojení je tvorbaplnohodnotné kostní tkáně schopné remodelace a pře-nosu zátěže. K dosažení tohoto výsledku je nutný dosta-tečný počet mezenchymálních kmenových buněk(MKB) a jejich diferenciace v osteoprogenitorové buň-ky. Zároveň je nezbytná kvalitní angiogeneze k zajištnímetabolismu. K vývoji kostní novotvorby jsou třeba pro-osteogenní růstové faktory a vhodná trojrozměrná matri-ce, ve které mají MKB optimální prostředí k prolifera-ci a diferenciaci. Touto matricí mohou být autolognínebo allogenní kostní štěpy včetně demineralizovanékostní matrix a dále celá řada umělých náhrad kostníchštěpů (7, 28).

Cílem této studie bylo zjištění základních parametrůschopnosti kostní reparace u starších pacientů podstu-pujících implantaci totální endoprotézy kyčelního klou-bu, u nichž je nezbytné kvalitní kostní hojení pro osteo -integraci endoprotézy a pro hojení kostních defektů,zejména v případě revizních operací.

SOUBOR PACIENTŮ A METODIKA

Hodnotili jsme soubor 27 pacientů podstupujícíchimplantaci totální endoprotézy kyčelního kloubu prodiagnózu primární artrózy IV. stupně – 24 ženy a 3 mužes průměrným věkem 70±7 let (60 až 81 let). Z hlediskavlivu osteopenie/porózy byly hodnoceny pouze ženy,u kterých bylo provedeno předoperační denzitometric-ké vyšetření.

V tomto souboru jsme sledovali koincidenci artrózya osteopenie/porózy, izolovali jsme MKB a stanovovalijejich počet, viabilitu a proliferační schopnost. Dálejsme zkoumali, jakým způsobem se MKB chovají navybraných nosičích kostní tkáně užívaných v naší orto-pedické praxi při léčbě kostních defektů.

Odběr kostní dřeně byl schválen etickou komisí odpacientů, kterým byla implantována totální endoprotézakyčelního kloubu po podepsání informovaného souhla-

su. Vyloučeni byli pacienti s anamnézou nádorovéhonebo infekčního onemocnění, nemocní podstupující dia-lyzační léčbu a nemocní po transplantaci, dále pacientis farmakologickou anamnézou kortikosteroidní, cyto-statické a imunosupresivní terapie. Před vlastní operacíbyla provedena denzitometrie a pacienti byli roztříděnina skupiny s normální a nízkou kostní denzitou dle T-skóre. Kritéria pro hodnocení osteoporózy dle T-skó-re: (+/- 1) zdravá populace, (-1/-2,5) osteopenie, (-2,5a méně) osteoporóza. Z předoperačního rtg byl stano-ven Singhův index (23). Před provedením osteotomiekrčku stehenní kosti jsme standardním způsobem pomo-cí troakáru aspirovali z trochanterické oblasti femuru zedvou vpichů 2x 10 ml kostní dřeně do předem hepari-nizované 10ml stříkačky. Všichni pacienti byli operová-ni ve spinální anestezii. Buněčná suspenze byla převe-dena do vychlazeného (4 °C) PBS pufru (Invitrogen,USA) ředěného s aqua pro inj. v poměru 1:10. Poměrkostní dřeně a PBS pufru byl 1:1. Za aseptických kau-tel byla dřeň transportována do laboratoře tkáňovýchkultur Ústavu histologie a embryologie. Zde byla částdřeně oddělena, z části byl získán mononukleární kon-centrát a izolovány MKB. Mononukleární buňky bylyzískány centrifugací 30 min při 2800 ot/min na základěFicoll-Paque (Amersham Biosciences, Švédsko) vztla-kového gradientu a byla využita jejich adherence k plas-tům v případě nasazení plné kostní dřeně a hodnoceníschopnosti tvořit kolonie (CFU). Buňky byly kultivová-ny na TPP Petriho miskách (Nunc, Dánsko) při 37 °Cza aerobních podmínek (5% CO2) v expanzním médiuobsahujícím 2 % fetálního telecího séra. Toto expanznímédium se skládalo z Eaglova minimálního esenciální-ho média v alfa modifikaci – alpha-MEM (Invitrogen,USA), fetálního telecího séra (PAA, Rakousko), 2-fos-fátu kyseliny askorbové (Sigma, USA), dexamethasonu(Sigma, USA), L-glutaminu (Invitrogen, USA), penici-linu a streptomycinu (Invitrogen, USA). Po dosažení70% splývavosti byly buňky uvolněny 0,25% trypsin-EDTA (Invitrogen, USA). Buňky jsme počítali pomocípřístroje Z2 Counter (Beckman Coulter, USA). Viabili-ta byla analyzována přístrojem Vi-Cell XR (BeckmanCoulter, USA). Primokultura byla pasážována mezi 7.až 14. dnem, podle vzhledu kolonií. Další pasáže bylyindikovány vždy po dosažení 70% splývavosti. V prů-běhu dlouhodobé kultivace v základních médiích bylypro každou pasáž stanovovány dvě základní biologickécharakteristiky – počet populačních zdvojení (No. ofpopulation doublings) a čas potřebný na zdvojnásobenípopulace (Doubling time). K výpočtu jsme použili třizákladní parametry – počet nasazených buněk, početbuněk v kultuře po pasáži a čas, který uplynul mezi pa -sážemi. Izolované MKB jsme vizualizovali mikroskopiís fázovým kontrastem. V další fázi jsme testovali cho-vání MKB od vybraných dárců s normální kostní den-zitou na trojrozměrných nosičích kostní tkáně. Vzhle-dem k tomu, že je v současné době nemožné použitínakultivovaných MKB v klinické praxi, nanášeli jsmena připravené nosiče buď 3 ml aspirované kostní dřeněnebo 3 ml monocytárního koncentrátu. Kultivace probí-hala v expanzním médiu 2 týdny, poté byly vzorky zpra-

s_52_58_kucera_test_acta_sloupce 2/9/12 6:27 PM Stránka 53

V případě aktivity MKB na nosičích byla nejvýraz-nější tvorba kolagenu v expanzním médiu na allogenímštěpu při nanesení kompletní kostní dřeně i monocytár-ního koncentrátu (obr. 2 a 3).

54/ ACTA CHIRURGIAE ORTHOPAEDICAEET TRAUMATOLOGIAE ČECHOSL., 79, 2012 PŮVODNÍ PRÁCE

ORIGINAL PAPER

U osteopenických pacientů byl nižší počet CFU-F/ml(fibroblast colony-forming units) (graf 1) a mezenchy-mální buňky se lišily od pacientů s normální denzitouv proliferační aktivitě, kdy během prvních 4 pasážípotřebovaly výrazně delší čas ke zdvojení populace(graf 2).

covány pro elektronovou mikroskopii – trojrozměrnéagregáty byly fixovány 24 hodin ve 4% roztoku for-maldehydu, po promytí destilovanou vodou byly vzor-ky odvodněny vzestupnou etanolovou řadou, převedenydo 100% hexamethyldisilazanu a vysušeny na vzduchuv digestoři při teplotě laboratoře (24). Potom následo-valo pokovení naprášením zlatem v tloušťce 15 nm v pří-stroji Polaron SC 7620 (Quorum Technologies, VelkáBritánie). Vzorky byly pozorovány a fotografoványv rastrovacím elektronovém mikroskopu Tesla BS 301(Tesla, Česká republika) při zobrazení v módu sekun-dárních elektronů při urychlovacím napětí 25 kV.

Hodnotili jsme přítomnost kolagenu. Tam, kde neby-la jeho tvorba dostatečná, jsme použili diferenciačnímédium s 10% FCS a přídavkem kyseliny L-askorbové(Sigma, USA) 0,5 mM/l, beta-glycerofosfátu (Sigma,USA) 10 mM/l a dexamethasonu (Sigma, USA) 0,1 M/l.

Z nosičů jsme testovali mražený allogení spongiózníkostní štěp a demineralizovanou kostní matrix z tkáňovéústředny. Čerstvý autologní kostní štěp jsme nepoužili,protože zvolenou metodou hodnocení přítomnosti kola-genu bychom neodlišili původní a nově vytvořený kola-gen. Dále jsme testovali porézní β-trikalciumfosfát a liso-vaný hydroxyapatit při 150 ºC (Lasak, Česká republika),kalciumsulfát bez porézní struktury (Wright, USA).

VÝSLEDKY

Dle výsledku denzitometrie byly ženy rozděleny napacientky s normální denzitou (12 žen) a nižší denzitou,resp. osteopenií (10 žen) nebo osteoporózou (2 ženy).U pacientek byla tedy koincidence artrózy a osteopenienebo osteoporózy 50 %. Interval menopauza – operacebyl ve skupině s normální kostní denzitou 15 let, ve sku-pině s nižší kostní denzitou 24 let. BMI u pacientek s nor-mální denzitou byl průměrně 29, u pacientek s nižší den-zitou 24. Zjištěný Singhův index se shodoval s výsledkydenzitometrie u 7 z 24 žen.

Na vztlakovém gradientu Ficoll-Paque bylo izolová-no v průměru při přímém měření 23 × 106 (11,6 × 106 –125 × 106) mononukleárních buněk. Z těchto buněkadherovalo na dno kultivačních nádob 123 (10 – 1100)buněk, což odpovídá 1230 CFU-F/ml. Viabilita kultivo-vaných buněk byla dlouhodobě průměrně 95 % (85 % –99 %) (obr. 1).

Obr. 1. Typický vřetenovitý tvar kultivovaných mezenchymál-ních kmenových buněk, mikroskopie s fázovým kontrastem,zvětšeno 200krát.

Obr. 2. Alloštěp – kompletní kostní dřeň, expanzní médium:Výrazná tvorba kolagenních vláken na alloštěpu, zvětšeno600krát.

Graf 1. Porovnání počtu CFU-F/ml u pacientů s normálnía patologickou kostní denzitou

Graf 2. Porovnání času potřebného ke zdvojení populace MKBu pacientů s normální a patologickou kostní denzitou

s_52_58_kucera_test_acta_sloupce 2/9/12 6:27 PM Stránka 54

55/ ACTA CHIRURGIAE ORTHOPAEDICAEET TRAUMATOLOGIAE ČECHOSL., 79, 2012 PŮVODNÍ PRÁCE

ORIGINAL PAPER

Na demineralizované matrix byla tvorba kolagenurovněž velmi dobrá, ale převážně při nanesení monocy-tárního koncentrátu (obr. 4, obr. 5).

U náhrad kostních štěpů (porézní β-trikalciumfosfát,lisovaný hydroxyapatit, kalciumsulfát) jsme nalezli jennevýraznou tvorbu kolagenu v expanzním médiu (obr. 6).

Při použití diferenciačního média u těchto náhradkostních štěpů byla pozorována výrazná tvorba kola-genu v celém rozsahu u porézního β-TCP (obr. 7),zatímco u lisovaného hydroxyapatitu převládala napovrchu (obr. 8).

Nejméně kolagenu jsme nalezli u neporézního kal -ciumsulfátu, kde byl tvořen pouze v oblasti dutin v mate-riálu (obr. 9).

Obr. 3. Alloštěp – monocytární koncentrát, expanzní médium:Stejně výrazná tvorba kolagenu na alloštěpu v širší perspekti-vě při menším zvětšení, zvětšeno 102krát.

Obr. 4. Demineralizovaná matrix – kompletní kostní dřeň,expanzní médium: Tvorba kolagenu nevýrazná. Při velkémzvětšení (1010krát) patrna kolagenní vlákna.

Obr. 5. Demineralizovaná matrix – monocytární koncentrát,expanzní médium: Zřejmá tvorba kolagenu již při menšímzvětšení (600krát).

Obr. 6. Porézní ß-TCP – monocytární koncentrát, expanznímédium: Patrna porézní struktura nosiče, ale tvorba kolage-nu minimální, zvětšeno 610krát.

Obr. 7. Porézní ß-TCP – monocytární koncentrát, diferenciač -ní médium: Výrazná tvorba kolagenu i uvnitř materiálu, zvět-šeno 580krát.

Obr. 8. Lisovaný ß-TCP – monocytární koncentrát, diferen -ciační médium: Tvorba kolagenu po povrchu materiálu, zvět-šeno 550krát.

Obr. 9. Kalciumsulfát – monocytární koncentrát, diferenciač-ní médium: nevýrazná tvorba kolagenu pouze v oblasti dutinneporézního materiálu, zvětšeno 630krát.

s_52_58_kucera_test_acta_sloupce 2/9/12 6:27 PM Stránka 55

56/ ACTA CHIRURGIAE ORTHOPAEDICAEET TRAUMATOLOGIAE ČECHOSL., 79, 2012 PŮVODNÍ PRÁCE

ORIGINAL PAPER

kloubů tibie, přičemž 18 z nich se zhojilo (3). Hernigouet al. užili koncentrát kostní dřeně do 60 pakloubů tibie,uvedli zhojení u 53 a stanovili minimální počet 30 000progenitorových buněk nutných v místě hojení, resp.koncentraci vyšší než 1500 CFU-F/ml (10, 11). Podlenašich výsledků by tuto koncentraci dosáhla pouze částnašich pacientů vyššího věku s normální kostní denzi-tou. Právě věk pacienta je důležitý pro schopnost expan-ze MKB (21). Další kostní reparaci lze ještě posílit při-dáním proosteogenních růstových faktorů, např.rekombinantními BMP-2 nebo BMP-7, ale širšímu kli-nickému použití brání dosud vysoká cena preparátů.Řešením nedostatku MKB by byl dvoudobý postup, nej-prve aspirace kostní dřeně, separace a kultivace MKBk získání jejich dostatečného množství a potom jejichtransplantace na místo kostního hojení. Tento postup mávšak svá úskalí, jako je používání zvířecího séra připěstování MKB s rizikem přenosu virových onemocně-ní a anafylaktické reakce na zvířecí bílkovinu, zejménapři nutnosti opakované transplantace (16), relativnědlouhá doba mezi odběrem a transplantací, otevřenýsystém s možností infekční kontaminace. Závažná jemožnost ztráty schopnosti diferenciace MKB v kostnítkáň (26), případně selekce geneticky modifikovanýchbuněk s rizikem kancerogeneze. V současné době se naodstranění jednotlivých překážek klinického použitínapěstovaných MKB intenzivně pracuje. Dokladem jenavržený postup kultivace eliminující použití zvířecíhoséra (22).

Vzhledem k možnostem klinické praxe jsme tedy napřipravené nosiče aplikovali kompletní aspirovanoukostní dřeň nebo monocytární koncentrát. Nosiče, nakterých se vytváří kostní tkáň jsou trojrozměrné matri-ce, které musí umožnit přichycení MKB, jejich přežití,proliferaci a diferenciaci. Zároveň musí umožnit vas -kularizaci. Vaskularizace a na ní závislý metabolismusnutrientů a kyslíku je klíčový pro tvorbu plnohodnotnékosti (19). Dalšími atributy jsou i přítomné signálnímolekuly a kvalita okolní kosti. V případě allogenníhoštěpu jsme pozorovali velmi dobrou tvorbu kolagenu přinanesení celé kostní dřeně i monocytárního koncentrá-tu již v expanzním médiu. Empiricky je tato skutečnostúspěšně prokazována již dlouhodobě při léčbě defektůkostí po resekci tumorů, u primárních a revizních náhradkloubů spojených s kostními defekty, v léčbě pakloubů.Výhodou allogenních štěpů je jejich dostatečné množ-ství, k jejich odběru není nutná další operační ránas možnými komplikacemi. Nevýhodou je riziko přeno-su infekce a relativní nevýhodou jsou převážně pouzeosteokonduktivní vlastnosti (5). Osteointegraci alloště-pu lze zlepšit přidáním osteoprogenitorových buněkv aspirátu kostní dřeně nebo monocytárním koncentrá-tu a přidáním růstových faktorů, např. rhBMP-2 (29).Tato metoda je však z výše uvedených finančních důvo-dů v běžné praxi těžko realizovatelná. Zlepšení angio-geneze a remodelace štěpu je v experimentu zkoušenojeho potažením geneticky upraveným adeno-associatedvirem kódující růstový faktor VEGF (Vascular endothe-lial growth factor) a RANKL (Receptor activator of nuc-lear factor kappa-B ligand) (12). Na demineralizované

Monocytární koncentrát nevykázal lepší výsledky nežkompletní kostní dřeň.

DISKUSE

Jednou z podmínek úspěšné kostní reparace je dosta-tečný počet a kvalita MKB v místě předpokládanéhohojení. Splnění tohoto předpokladu je závislé na věkua pohlaví pacienta (6, 20), místních a celkových one-mocněních. Z místních vlivů je to zejména přítomnostinfektu, nekrózy, stavu po ozáření, z celkových pak imu-nosupresivní a maligní onemocnění, podvýživa. Ze -jména u postmenopauzálních žen se uplatňuje faktorosteopenie/porózy (13, 14). V předkládané práci jsmeodebírali kostní dřeň u starších pacientů s koxartrózou.U poloviny žen byla zjištěna nižší kostní denzita, při-čemž bylo nutné provést denzitometrické vyšetření,neboť stanovení Singhova indexu z rentgenového sním-ku nebylo spolehlivé. O koincidenci osteopenie/porózya osteoartrózy jsou vedeny spory (8, 9, 25). Glowackiet al. nalezli 25% výskyt osteopenie u koxartrózy v sou-boru 68 žen s průměrným věkem 69 let (8). V našemsouboru je tato koincidence (50 % žen) adekvátní přimenším počtu sledovaných pacientek, zejména u žens nižším BMI a delším odstupem od menopauzy (prů-měrně 23 let).

Za normálních okolností se v kostní dřeni vyskytuje2 až 5 MKB na 1 milion mononukleárních buněk (17).U našich pacientů odpovídala hodnota 5 MKB na 1 mi -lion. Dle Cuomo et al. existuje široká variabilita v kon-centraci MKB v aspirátu kostní dřeně – 1010 ± 960CFU-F/ml, v koncentrátu 6150 ± 6660 CFU-F/ml.Počet monocytárních buněk v aspirátu kostní dřeně je21 000 ± 7 000/μl, v koncentrátu 91 000 ± 19 000/μl (4).V Connolyho studii obsahoval aspirát kostní dřeně 1,4až 2,6 miliónů monocytárních buněk v jednom mililitrua v koncentrátu 3,0 až 8,6 miliónů monocytárních buněkv jednom mililitru (2). Námi zjištěný průměrný početCFU-F/ml u pacientů s normální kostní denzitou (1235± 500 CFU-F/ml) odpovídá výše uvedeným literárnímúdajům. Na druhé straně průměrný počet CFU-F/mlu pacientů s nízkou denzitou byl výrazně nižší (239 ±150 CFU-F/ml). Zároveň se ukázalo, že u osteopenickékosti je aktivita MKB nižší a při kostním hojení v tom-to terénu bude třeba hledat způsoby, jak tento proces sti-mulovat. V klinické praxi by bylo s výhodou obohatitmísto hojení autologními MKB tam, kde jich je nedo-statek – paklouby, kostní defekty apod., nebo mají sní-ženou proliferační aktivitu – osteopenická kost. V sou-časné době to lze provést peroperační aspirací kostnídřeně, kterou například při léčbě kostních defektů mísí-me s β-trikalciumfosfátem. Další možností je centrifu-gace aspirátu k získání monocytárního koncentrátu ješ-tě v rámci uzavřeného systému při operačním zákroku.Nicméně obecně se jedná o ne zcela spolehlivou meto-du, neboť u jednotlivých pacientů je různá kvalita kost-ní dřeně (4), přičemž závisí též na technice jejího odbě-ru (18). Nelze tedy říci, zda konkrétní aspirát nebokoncentrát obsahuje dostatečný počet kvalitních MKB.Connolly et al. aplikovali aspirát kostní dřeně do 20 pa -

s_52_58_kucera_test_acta_sloupce 2/9/12 6:27 PM Stránka 56

57/ ACTA CHIRURGIAE ORTHOPAEDICAEET TRAUMATOLOGIAE ČECHOSL., 79, 2012 PŮVODNÍ PRÁCE

ORIGINAL PAPER

kostní matrix v našem experimentu byla vykazovánatvorba kolagenu také v expanzním médiu, ale převážněpři nanesení monocytárního koncentrátu a v menší mířenež u alloštěpu. Této matrix je přisuzován významnýobsah růstových faktorů, nicméně záleží na kostní kva-litě dárce a technickém zpracování. Osteoinduktivnívlastnosti byly pozorovány spíše v experimentu na zví-řatech než v klinických studiích (5). Použití deminera-lizované kostní matrix se tak nejeví jako výhodnější nežvyužití nedemineralizovaného allogenního štěpu. TakéCuomo et al. prokázali, že samotná kostní dřeň s de -mineralizovanou kostní matrix nezvyšuje osteogenezu(4). Společnou vlastností testovaných umělých náhradkostních štěpů byla jen nepatrná tvorba kolagenuv expanzním médiu. Naproti tomu v diferenciačnímmédiu jsme pozorovali tvorbu kolagenu různé intenzityzávislou na vlastnostech biomateriálu. Obecně je kvali-ta kostní náhrady odvislá od své architektury (zvláštěvýhodná je porozita), od povrchových chemickýchvlastností, osmolarity, typu degradačních produktůu vstřebatelných materiálů (19). U kalciumsulfátu můžehrát roli i kyselé pH během degradace. V současné doběse hledají cesty, jak zlepšit osteointegraci těchto mate-riálů. Vznikají tak kompozitní biomateriály, jejichžvlastnosti vedou k výsledkům podobným při použitíautologních kostních štěpů, např. použití bifazickéhokalciumfosfátu, bovinního kolagenu a autologní kostnídřeně (1). V rámci experimentů jsou zkoušeny biomate-riály předem osázené nakultivovanými MKB nebo endo-telem, impregnované růstovými faktory, včetně VEGFke zlepšení angiogeneze. Implantují se biomateriály dovysoce vaskularizované tkáně jako např. do mezenteria,zde se předpokládá vrůst cév a následně se transplantu-jí do kostního defektu. Jsou vyvíjeny trojrozměrné ma -trice na bázi nanomateriálů (27).

Pro velké množství různých faktorů ovlivňujícíchosteogenezi je složité vytvořit experimentální modelin vitro nebo na zvířeti, jehož výsledky by byly spoleh-livě transformovatelné do humánní medicíny. Širšímupoužití nových metod také brání nedostatek randomizo-vaných kontrolovaných klinických studií (5).

ZÁVĚR

Reparační schopnosti u seniorů jsou omezené nejenvlivem věku, případné polymorbidity a medikace, alei výskytem osteopenie/porózy, který je vyšší, než seobecně diagnostikuje, a je významná koincidences artrózou, zejména u žen s nižším BMI a delším od -stupem od menopauzy. Stanovení Singhova indexunení v diagnostice osteopenie/porózy spolehlivé a jenutné denzitometrické vyšetření. Snížená reparačníschopnost u osteopenie/porózy je také daná nižšímpočtem a snížením proliferační schopnosti MKB vyjá-dřené výrazně vyšším časem potřebným ke zdvojná-sobení populace.

Z hlediska biomateriálů nejlepší vlastnosti vykazovalallogenní kostní štěp, kde MKB tvořily velké množstvíkolagenu již v expanzním médiu a ve formě aspirátukostní dřeně.

MKB na umělých kostních náhradách vyžadovaly protvorbu kolagenu přítomnost diferenciačního média. Klí-čovou roli hrála porézní struktura, kdy v našem experi-mentu byl patrný rozdíl v tvorbě kolagenu – výrazná pro-dukce u porézního β-TCP, dobrá produkce u lisovanéhohydroxyapatitu, ale pouze na povrchu, kde byla porozi-ta patrná, a minimální produkce u neporézního kalcium -sulfátu.

Výhledy do budoucnaPři léčbě defektů po uvolněných endoprotézách,

v osteopenické/porotické kosti nebo obecně v místě nedostatku MKB a růstových faktorů by se nabízelakombinace allogenních kostních štěpů, aspirátu kostnídřeně a případně proosteogenních a proangiogenníchrůstových faktorů, které však výrazně zvyšují cenu léč-by. Jako velmi výhodné by se jevilo obohacení počtuMKB jejich nakultivováním a zpětnou transplantací, tatometoda je však zatím možná pouze experimentálně.

Posílení osteoinduktivních vlastností β-TCP v kom-pozitních materiálech ho předurčuje jako spolehlivoukostní náhradu, ale před zavedením do rutinní praxe jsouještě třeba další experimentální práce a klinické studie.

Nové metody a biomateriály jsou příslibem vyřešenířady obtížných klinických problémů, nicméně při volběsprávné léčebné metody je nutné kritické hodnoceníexperimentálních prací a dostatečné množství dobřevedených klinických studií. Další výzkum je tedynezbytný, protože cesta od izolace MKB ke spolehlivépodpoře osteogeneze v klinické praxi je ještě dlouhá.

Literatura

1. CHAPMAN, M. W., BUCHOLZ, R., CORNELL, C.: Treatment ofacute fractures with a collagen-calcium phosphate graft material.A randomized clinical trial. J. Bone Jt Surg., 79-A: 495–502, 2007.

2. CONNOLY, J. F., GUSE, R., LIPPIELLO, L., DEHNE, R.: Deve-lopment of an osteogenic bone-marrow preparation. J. Bone Jt Surg.,71-A: 684–691, 1989.

3. CONNOLY, J. F., GUSE, R., TIEDMAN, J., DEHNE, R.: Autolo-gous marrow injection as a substitute for operative grafting of tibial nonunions. Clin. Orthop., 266: 259–70, 1991.

4. CUOMO, A.V., VIRK, M., PETRIGLIANO, F., MORGAN, E.F.,LIEBERMAN, J.R.: Mesenchymal stem cell concentration andbone repair: potential pitfalls from bench to bedside. J. Bone JtSurg., 91-A: 1073–1083, 2009.

5. DE LONG JR, W.G., EINHORN, T. A., KOVAL, K., McKEE, M.,SMITH, W., SANDERS, R., WATSON, T.: Bone grafts and bonegraft substitutes in orthopaedic trauma surgery. J. Bone Jt Surg., 89-A: 649–658, 2009.

6. D’IPPOLITO, G., SCHILLER, P.C., RICORDI, C., ROOS, B.A.,HOWARD, G.A.: Age-related osteogenic potential of mesenchymalstromal stem cells from human vertebral bone marrow. J. BoneMiner. Res., 14: 1115–22, 1999.

7. GÁL, P., ONDRUŠ, Š., ŠKVAŘIL, J., STRAKA, M., JOCHYMEK,J., PLÁNKA, L.: Syntetický biokompatibilní degradabilní mate riálv léčbě juvenilních kostních cyst. Acta Chir. orthop. Traum. čech.,76: 495–500, 2009.

8. GLOWACKI, J., HURWITZ, S., THORNHILL, T. S., KELLY, M.,LE BOFF, M. S.: Osteoporosis and vitamin-D deficiency amongpostmenopausal women with osteoarthritis undergoing total hiparthroplasty. J. Bone Jt Surg., 85-A: 2371–2377, 2003.

9. HEALEY, J. H., VIGORITA, V. J., LANE, J. M.: The coexistenceand characteristics of osteoarthritis and osteoporosis. J. Bone JtSurg., 67-A: 586–592, 1985.

s_52_58_kucera_test_acta_sloupce 2/9/12 6:27 PM Stránka 57

58/ ACTA CHIRURGIAE ORTHOPAEDICAEET TRAUMATOLOGIAE ČECHOSL., 79, 2012 PŮVODNÍ PRÁCE

ORIGINAL PAPER

10. HERNIGOU, P., POIGNARD, A., BEAUJEAN, F., ROUARD, H.:Percutaneous autologous bone marrow grafting for nonunions.Influence of the number and concentration of progenitor cells. J.Bone Jt Surg., 87-A: 1430–7, 2005.

11. HERNIGOU, P., POIGNARD, A., MANICOM, O., MATHIEU, G.,ROUARD, H.: The use of percutaneous autologous bone marrowtransplantation in nonunion and avascular necrosis of bone. J.Bone Jt Surg., 87-B: 896–902, 2005.

12. ITO, H., KOEFOED, M., TIYAPATANAPUTI, P., GROMOV, K.,GOATER, J. J., CARMOUCHE, J., ZHANG, X., RUBERY, P. T.,RABINOWITZ, J., SAMULSKI, R.J., NAKAMURA, T.,SOBALLE, K., O' KEEFE, R. J., BOYCE, B. F., SCHWARZ, E.M.: Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherentAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat. Med., 11: 291–297,2005.

13. JUPITER, J. B., WYSS, H.: Stable fixation of osteoporotic frac-tures and nonunions in the upper limb – life before the „Lockingplate“. Acta Chir. orthop. Traum. čech., 77: 361–364, 2010.

14. KOUDELA, K., KASAL, E., MATĚJKA, J., VYSKOČIL, V.: Ge -riatrická traumatologie – vize nebo skutečnost? Acta Chir. orthop.Traum. čech., 76: 338–343, 2009.

15. LANDOR, I., VAVŘÍK, P., JAHODA, D., POKORNÝ, D., BAL-LAY, R., SOSNA, A.: Dlouhodobé zkušenosti s kombinovanýmhydroxyapatitovým povrchem ARBOND v osteointegraci implan-tátu. Acta Chir. orthop. Traum. čech., 76: 172–178, 2009.

16. MACKENSEN, A., DRÄGER, R., SCHLESIER, M., MERTELS -MANN, R., LINDENMAN, A.: Presence of IgE antibodies to bo -vine serum albumin in a patient developing anaphylaxis after vac -cination with human peptide-pulsed dendritic cells. CancerImmunol. Immunother., 49: 152–156, 2000.

17. MINGUEL, J. J., ERICES, A., CONGET, P.: Mesenchymal stemcells. Exp. Biol. Med., 226: 507–520, 2001.

18. MUSCHLER, G. F., BOEHM, C., EASLEY, K.: Aspiration toobtain osteoblast progenitor cells from human bone marrow: theinfluence of aspiration volume. J. Bone Jt Surg., 79-A: 1699–709,1997.

19. MUSCHLER, G. F., NAKAMOTO, C., GRIFFITH, L. G.: En -gineering principles of clinical cell-based tissue engineering. J.Bone Jt Surg., 86-A: 1541–1558, 2004.

20. MUSCHLER, G. F., NIITTO, H., BOEHM, C. A., EASLEY, K.A.: Age- and gender related changes in the cellularity of humanbone marrow and the prevalence of osteoblastic progenitors. J. Ort-hop. Res., 19: 117–25, 2001.

21. PITTENGER, M. F., MARIN, B. J.: Mesenchymal stem cellsand their potential as cardiac therapeutics. Circ. Res., 95: 9–20,2004.

22. PYTLÍK, R., STEHLÍK, D., SOUKUP, T., KALBÁČOVÁ, M.,RYPÁČEK, F., TRČ, T., MULINKOVÁ, K., MICHNOVÁ, P.,KIDERYOVÁ, L., ŽIVNÝ, J., KLENER JR, P., VESELÁ, R.,TRNĚNÝ, M., KLENER, P.: The cultivation of human multipo-tent mesenchymal stromal cells in clinical grade medium for bonetissue engineering. Biomaterials, 30: 3415–3427, 2009.

23. SINGH, M., NAGRATH, A. R., MAINI, P. S.: Changes in trabe-cular pattern of the upper end of the femur as an index of osteo-porosis. J. Bone Jt Surg., 52-A: 457–467, 1970.

24. SLÍŽOVÁ, D., KRS, O., POSPÍŠILOVÁ, B.: Alternative methodof rapid drying vascular specimens for scanning electron micros-copy. J. Endovasc. Ther., 10: 285–287, 2003.

25. STEWART, A., BLACK, A., ROBINS, S. P., REID, D. M.: Bonedensity and bone turnover in patients with osteoarthritis and osteo -porosis. J. Rheumatol., 26: 622–626, 1999.

26. SUGUIRA, F., KITOH, H., ISHIGURO, N.: Osteogenic poten -tional of rat mesenchymal stem cells after several passages. Bio-chem. Biophys. Res. Commun., 316: 233–239, 2004.

27. SZPALSKI, C., BARR, J., WETTERAU, M., SAADEH, P. B.,WARREN, S. M.: Cranial bone defects: current and future strate-gies: in vivo animal models of cranial defects. Neurosurg. Focus,29: E8, 2010.

28. URBAN, K., ŠPONER, P.: Rekonstrukce rozsáhlých acetabulár-ních defektů bioaktivní sklokeramikou u revizních operací totál-ních endoprotéz. Acta Chir. orthop. Traum. čech., 65: 17–23, 1998.

29. WIENTROUB, S., GOODWIN, D., KHERMOSH, O., SALAMA,R.: The clinical use of autologous marrow to improve osteogenicpotential of bone grafts in pediatric orthopedics. J. Pediatr. Ort-hop., 9: 186–190, 1989.

Korespondující autor:MUDr. Tomáš KučeraPernštýnské nám. 64530 02 PardubiceE-mail: kucertom@fnhk.cz

s_52_58_kucera_test_acta_sloupce 2/9/12 6:27 PM Stránka 58