UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULT

DEPARTMAN ZA HEMIJU

Sadržaj makro i mikroelemenata u mlečnoj i beloj čokoladi -MASTER RAD-

Mentor Kandidat dr Aleksandra Pavlović, vanr. prof. Slađana Cvetković, 16

U Nišu, 2013

2

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: Мастер рад Аутор, АУ: Слађана Цветковић Ментор, МН: Александра Павловић Наслов рада, НР:

Садржај макро и микроелемената у млечној и белој чоколади Језик публикације, ЈП: Српски Језик извода, ЈИ: Енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2013. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33 Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

55 стр., 8 табеле, 15 сликe, 24 референце Научна област, НО: Хемија Научна дисциплина, НД: Аналитичкa хемија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: макроелементи, микроелементи, ICP-OES, млечна чоколада,

бела чоколада УДК 577.118

663.918.5 Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: У раду је одређен садржај 26 елемената у 30 узорака млечне и беле чоколаде коришћењем ICP-

OES спектрометрије. Од макроелемената у испитиваним узорцима чоколаде су најзаступљенији K и P, а затим следе по заступљености Mg, Ca и Na. Од микроелемената најзаступљенији су Fe, Zn, Mn, Cu, B и Si. Са нутритивног аспекта у погледу садржаја микроелемената истичу се узорци млечне у односу на узорке беле чоколаде. У погледу садржаја тешких метала (As, Cd, Pb), може се закључити да су концентрације As и Pb у свим узорцима испод МДК прописаних домаћом законском регулативом, као и од стране Светске здравствене организације. Концентрација Cd је у неким узорцима млечне чоколаде на граници прописаних МДК вредности. Факторска анализа, као једна од метода мултиваријантне анализе, послужила је у диференцијацији испитиваних узорака на основу садржаја метала.

Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:

3

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: University Degree Thesis Author, AU: Slađana Cvetković Mentor, MN: Aleksandra Pavlović Title, TI: Qunantification of macro and microelements in milk and white

chocolate Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2013 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33 Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

55 p., 8 tables, 15 figures, 24 references

Scientific field, SF: Chemistry Scientific discipline, SD: Analytical Chemistry Subject/Key words, S/KW: macroelements, microelements, ICP-OES, milk and white chocolate UC 577.118

663.918.5 Holding data, HD: library Note, N: Abstract, AB: Тhe content of 26 elements in 30 samples of milk and white chocolate was determined using

ICP-OES spectrometry. Among the major elements, the most abundant are K and P, followed by the Mg, Ca and Na. Fe, Zn, Mn, Cu, B and Si are the most abundant among the microelements. From the nutritional point of view regarding the content of microelements, milk samples have a higher concentrations of microelements compared to the samples of white chocolate. In terms of heavy metals (As, Cd, Pb), it can be concluded that the concentrations of As and Pb are below permissible levels prescribed by national legislation, as well as by the World Health Organization, in all samples. Cd concentration in a several samples of milk chocolate is around of prescribed MAC values. Factor analysis, as a method of multivariate analysis, was used in the differentiation of the samples based on the metal content. Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:

4

Eksperimentalni deo ovog Master rada je rađen u naučno-istraživačkoj laboratoriji Katedre za analitičku i fizičku hemiju, Prirodno-matematičkog fakulteta, Univerziteta u Nišu. Zahvaljujem se mentoru dr Aleksandri Pavlović, na ukazanoj pomoći i sugestijama pri definisanju teme, izrade i formulisanju konačnog izgleda ovog Master rada. Veliko hvala i Jeleni Brcanović i Jovani Veljković, koje su pratile izradu rada i ukazivale na moguće greške. Najveću zahvalnost dugujem svojim roditeljima i sestrama, na neizmernoj pomoći, podršci, strpljenju i razumevanju svih ovih godina tokom studiranja – VELIKO HVALA!

5

Sadržaj: 1. UVOD ....................................................................................................................................... 6

2. TEORIJSKI DEO ................................................................................................................... 8

2.1. Mlečna i bela čokolada ....................................................................................................... 9

2.1.1. Istorijat čokolade.......................................................................................................... 9

2.1.2. Osnovne karakteristike i podela čokolade ................................................................. 10

2.2.Metali u ljudskoj ishrani .................................................................................................... 11

2.3. Makro i mikroelementi u čokoladi .................................................................................. 12

2.4. Načini pripreme uzoraka .................................................................................................. 12

2.4.1. Suva mineralizacija .................................................................................................... 13

2.4.1. Mokra mineralizacija ................................................................................................. 13

2.4.3 Mineralizacija u mikrotalasnoj pećnici ....................................................................... 13

2.5. Atomska emisiona spektrometrija – ICP spektrometrija .................................................. 13

2.5.1. Indukovano spregnuta plazma ................................................................................... 14

2.5.2. Tačnost i osetljivost metode ...................................................................................... 15

2.6. Faktorska analiza .............................................................................................................. 16

2.6.1. Kriterijumi za broj faktora za ekstrakciju .................................................................. 16

2.6.2. Rotacija u faktorskoj analizi ...................................................................................... 19

2.6.3. Selekcija rotacionih metoda ....................................................................................... 19

2.6.4. Kriterijumi za značajnost faktorskih opterećenja ...................................................... 20

3. EKSPERIMENTALNI DEO ............................................................................................... 21

3.1 Pribor i aparatura ............................................................................................................... 22

3.2 Reagensi ............................................................................................................................ 22

3.3. Uzorci ............................................................................................................................... 22

3.4. Priprema uzoraka .............................................................................................................. 22

3.5. Parametri meode ............................................................................................................... 22

3.6. Statistička obrada podataka .............................................................................................. 23

4.REZULTATI I DISKUSIJA ................................................................................................. 24

4.1 Određivanje makro i mikroelemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade....................... 25

5. ZAKLJUČAK ........................................................................................................................ 51

6. LITERATURA ...................................................................................................................... 53

6

1. UVOD

7

Čokolada je dugo vremena najomiljenija poslastica na planeti. Ona je mnogo više od izbalansirane smeše kakao praha, kakao maslaca i šećera, to je simbol gastronomskog užitka i katalizator emocionalnog zadovoljstva. Čokolada za organizam ne predstavlja samo dodatne kalorije, već ima i koristan antioksidativni kapacitet, a danas se koristi kao modulator raspoloženja u stanjima iscrpljenosti, apatije, depresije i stresa. Smatra se visokovrednom namirnicom i treba biti deo raznolike, uravnotežene i umerene ishrane, no bitno je koja, s obzirom da postoji crna, mlečna i bela čokolada. Način proizvodnje i hemijski sastav određuju kvalitet čokolade.

Čokolada je često komponenta za pripremu namernica (kolači, torte, keks, sladoled) čiji su najveći potrošači deca. Utvrđivanje hemijskog sastava ove komponente je od izuzetnog značaja za određivanje nutritivne vrednosti hrane. Makro i mikroelementi imaju veliki značaj za pravilan rast i razvoj organizma, jer učestvuju u metabolizmu. Ona je bogat izvor mikronutrijenata poput gvožđa, magnezijuma, fosfora, kalijuma i cinka. Zavisno od sastava i u kombinaciji s raznim vrstama voća i orašastih plodova, u njoj se nalazi i kalcijum, vitamini B grupe, tokoferol i beta karoten, a takođe su prisutne i masti i jednostavni ugljenihidrati. Govoreći o sastavu, antioksidativni profil je od velikog značaja i o tome svedoči veliki broj istraživanja o čokoladi. U poslednje vreme na „čokoladne“ polifenole sve više se gleda iz prespektive utvrđivanja svojstva flavonoida u koje se ubrajaju flavonoli, katehini, epikatehini i proantocijanidi, snažni borci protiv oksidativnog stresa čiji je sadržaj u čokoladnom proizvodu proporcionalan udelu kakao praha.

Ustanovljeno je da blagotvoran učinak čokolade nije samo rezerviran za povećanje brzine neurotransmitera serotonina, već uz hormon sreće, čokolada ima i niz drugih zdravstvenih, prvenstveno kardioprotektivnih svojstva. Čokolada se koristi šitorm sveta, u svim segmentima društva, nezavisno od uzrasta ljudi. S obzirom na to da je određivanje metala u hrani postalo važno u polju analize namernica, cilj ovog rada je bio određivanje sadržaja kako nutritivnih elemenata, tako i elemenata u tragovima koji u većim koncentracijama mogu štetno da deluju na živi organizam. U tu svrhu je korišćena optička emisiona spektrometrija sa indukovanom spregnutom plazmom kao izvorom pobuđivanja (ICP-OES).

8

2. TEORIJSKI DEO

9

2.1. Mlečna i bela čokolada

2.1.1. Istorijat čokolade

Seme kakao drveta, u ranom VI veku se nazivalo cacahuaquchtl - "drvo". Reč čokolada dolazi od reči Maja xocoatl sto znači “gorka voda”. Kod Maja, kakao plod simbolizuje život i plodnost. Zidovi njihovih palata oslikani su kakao plodovima. Veoma rano su ljudi u Centralnoj Americi upotrebljavali kakao zrno kao sredstvo plaćanja. Asteci su smatrali da im je kakao podario bog Quetzalcoatl koji je kakao drvo ukrao iz raja. Kao i Maje, Asteci su od kakaoa pravili hladno i gorko piće zvano cacahuat smatrali su da je to eliksir zdravlja. Šećer je bio nepoznat Astecima, dodavali su razne mirođije kao arome, čak i ljute papričice, čili i vanilu, pa i brašno. Asteci su verovali da mudrost i snaga dolaze jedući, pijući kakao. Asteski vladar Montezuma je toliko voleo kakao da je svaki dan pio po 50 pehara.

Kolumbo je posle povratka iz Amerike prezentovao španskom kralju Ferdinandu i kraljici Isabeli mnoge nepoznate i neobične stvari, kao i nekoliko tamno braon zrna koja su izgledala kao badem, ali ona nisu privukla njihovu pažnju. On je bio prvi evropljanin koji je probao čokoladni napitak. Opsednut Indijom, nije prepoznao komercijalne potencijale kakaoa.

Hernando Cortez, koji je osvojio deo Meksika 1519. godine probao je kakao, ali nije bio naročito oduševljen, mnogo više ga je interesovala vrednost kakaa kao sredstvo plaćanja. Odmah je kakao plantaže proglasio pod Španskom jurisdikcijom. Cortez je predstavio spanskom kralju Carlsu V kakao zrno iz Novog Sveta i neophodan pribor za pripremu. Predpostavljao je da bi ovaj gorak napitak pomešan sa šećerom mogao da ima jako lep ukus. Tako je kakao mešan sa sećerom, vanilom, mirisnim orahom, karanfilićem, biberom i cimetom. Rezultat je bio više, nego zadovoljavajući. Špansko plemstvo je prihvatilo ovaj napitak kao novu modu. Španci su tajnu čokolade čuvali oko 100 godina od ostatka sveta.

Dominikanski monasi kojima je bio poveren proces obrade kakao zrna, su odali tajnu. Nedugo posle, čokolada se proširila širom Evrope kao poseban napitak i hrana za bogate. Kakao zrno se u Španiji jos uvek upotrebljavalo kao novac. Za 200 zrna kakaa moglo se kupiti ćuran, 100 zrna je bila dnevnica stražara. Engleski gusari koji su zarobljavali španske brodove sa kakaom, spaljivali su ga, misleći da je reč o brodskom otpadu. A kada su Britanci pokorili Špance, lađa natovarena sa kakaom je uništena kao bezvredna.

Tek 1657. godine Velika Britanija je počela da ceni čokoladu. Jedan Francuz je otvorio prvu prodavnicu čokolade u Londonu. To mesto postaje sastajalište londonske elite i novi luksuz. Prva kuća čokolade oglašavala se sa sloganom: "Ovo je odlično zapadno-indijsko piće". Pet godina kasnije, Rimska crkva je proglasila čokoladu za magijski napitak. Presuda kardinala Brancaccio glasi: "Liquidum non frangit jejunum", sto znači “čokoladni napitak nije za upotrebu”. Međutim, vernici nisu pridavali značaj ovom mišljenju i čokolada postaje pomodna roba. Crkva je morala da promeni mišljenje i dozvolila je konzumiranje čokolade samo za vreme Uskrsa.

Amerika je čula za čokoladu 1775. godine. Deset godina kasnije napravljene su mnoge fabrike čokolade. Sto godina kasnije Švajcarci su počeli da investiraju u čokoladu i do danas je

10

Švajcarska poznata kao zemlja koja pravi najkvalitetnije i najukusnije čokolade na svetu, iako je tvrdu čokoladu, izumeo Britanac. Međutim, ta čokolada je bila pretvrda, pa je mogla da bude samo rendana. Rudolf Lindt iz Berna, (Švajcarska), izumeo je "conching", što otprilike znači zagrevanje i valjanje čokolade tokom prečiscavanja. Posle končiranja od 72 sata i dodavanja kakao putera, čokolada postaje "fondant" i topi se u ustima. Godine 1925. osnovana je berza kakaa u Njujorku, a kasnije je američka vlada primetila i važnu ulogu koju čokolada ima u vojsci (http://www.vasezdravlje.com/izdanje/clanak/943/; http://plavi.bigforumpro.com/t111-cokolada; http://zdravljeiprehrana.bloger.index.hr/post/povijest-i-sastav-cokolade/17209671.aspx).

2.1.2. Osnovne karakteristike i podela čokolade

Čokolada je namernica koja predstavlja vredan izvor energije, specifične arome, slatkog ukusa i jedinstvenog osećaja topljenja u ustima. Predstavlja polu kruta suspenzija čestica kakaa i šećera (i mleka, u zavisnosti od vrste). Mogućnost topljenja čokolade ustima omogućuju lipidne komponente (zasićene masne kiseline: stearinska, oleinska, palmitinska)

Čokolade su čvrste na sobnoj temperaturi (20-25°C). Bez obzira na visok sadržaj lipida i šećera, korišćenje ove poslastice pozitivno utiče na ljudsku ishranu zbog prisustva antioksidansa, uglavnom polifenola uključujući i flavonoide. Visoke količine antioksidansa doprinose smanjenju rizika od najrazličitih bolesti, pa i raka. Fluvanoidi smanjuju rizik od formiranja ugrušaka u krvnim sudovima, a samim tim i smanjuju rizik od srčanog napada.

Čokolada sadrži triptofan, esencijalnu aminokiselinu koja učestvuje u proizvodnji neuroprenosnika serotonina. Topljenje čokolade podstiče lučenje endorfina (prirodnih hormona sreće). Što se vitamina tiče u čokoladi se mogu naći B1, B2, B5, B6, B11 i E vitamin. B1 i B2 su važni koenzimi u metabolizmu ugljenihidrata i masnih kiselina. Čokolade u svom sastavu sadrže i minerale, naročito kalijum, magnezijum, bakar i gvožđe.

Razlike u senzorskim karakteristikama čokolade razlikuju se usled upotrebe različitih vrsta kakaa, varijacije sastojaka, upotrebe mlečnih mrvica umesto mleka u prahu, različitih metoda mešanja i metoda prerade. Jedna od bitnih karakteristika za dobijanje visoko kvalitetnih proizvoda sa dobro definisanom teksturom je reološka osobina čokolade. Čokolade sa velikim viskozitetom daju osećaj paste i dugo se zadržavaju u ustima. Viskozitet je povezan sa načinom obrade i granulometrijskim sastavom (http://www.tehnologijahrane.com/tehnologija-konditora/cokolada#toc-1osnovni-pojmovi-i-podela-okolade). Osnovna podela čokolade je na: tamnu, mlečnu i belu čokoladu. One se međusobno razlikuju po sadržaju čvrste materije kakaa, mlečne masti i kakao maslaca. Crna čokolada - mora da sadrži bar 34% kakao mase. Danas se proizvodi i čokolada sa 60, pa i 70-80% kakao mase. Sto grama ove čokolade sadrži: 48 grama kakaoa, 4 grama kakao putera i 48 grama šećera. Smatra se najzdravijom i najkvalitetnijom vrstom čokolade. Crna čokolada se može podeliti prema procentu kakaoa, kakao butera i šećera. Ukoliko sadržaj najmanje 15% tečnog kakaoa i isto toloko kakao butera, a minimum ukupne količine kakao delova 60%, onda spada u slatke čokolade. Ukoliko je procenat tečnog kakaoa najmanje 35% i isto toliko kakao buter i šećer, onda spade u gorke čokolade.

11

Mlečna čokolada - iako je najpopularnija, nije tako kvalitetna. Dobra čokolada ima 40% kakao mase, a uglavnom je taj procenat negde do 20. Ovakve čokolade se masovno proizvode, sadrže i do 50% šećera i vrlo često je skup kakao puter zamenjen biljnom mašću, a sadrže i veštačke arome. Švajcarske i Belgijske čokolade poseduju najbolji kvalitet od svih mlečnih čokolada. Sto grama ove čokolade sadrži oko 12 grama kakaa, 22 grama mleka u prahu, 48 grama šećera i 18 grama kakao putera.

Bela čokolada - to u stvari i nije čokolada. To je kakao puter kome je dodat šećer, veštačka aroma i mleko. Sto grama ove čokolade sadrži 28 grama kakao putera, 26 grama mleka u prahu i 46 grama šećera. Kvalitetna bela čokolada treba imati minimum 26% kakao delova. Bela čokolada razlikuje se od ostalih vrsta čokolade po tome što nema kakao masu koja sadrži antioksidanse, što utiče na smanjeni rok trajanja ovih proizvoda.

Čokolada za kuvanje i prelivanje - mora da sadrži bar 34% kakao putera, što je mast, a ne kakao masa i ne sadrži dodatke kao što su mleko i šećer.

2.2. Metali u ljudskoj ishrani

Pored energetskih materija (masti i šećera), belančevina i vitamina, u organizam se svakodnevno moraju unositi i mineralne materije koje ulaze u sastav tkivnih tečnosti i ćelija, u kojima pored gradivne uloge vrše i ulogu biokatalizatora, kojom su uslovljeni mnogi vitalni procesi. Minerali su neophodni za rast i razvoj organizma. To su neorganski hemijski elementi i od svih do sada poznatih elementa, 80 njih se nalazi u ljudskom organizmu, čineći 4,5% telesne mase. Klasična definicija minerala koji ulaze u sastav našeg organizma bila bi: to su materije koje se u organizmu nalaze u vrlo malim količinama, neki gotovo u tragovima, ali su neophodne za normalnu razmenu materija (metabolizam).

Nekad se smatralo da su za normalno funkcionisanje organizma potrebna četiri elementa: gvožđe, bakar, jod i cink. Danas je tom spisku dodato još desetak elemenata. Bakar, gvožđe, cink, kalcijum, kalijum, vanadijum, hrom, mangan, molibden, kobalt, jod, fluor, selen i neki drugi elementi nosioci su životnih funkcija organizma, jer učestvuju u enzimskom sistemu, bez kojeg nema preko potrebnih biohemijskih procesa. Dovoljno je reći da su oni za enzime isto što i kiseonik za disanje. Njihov se nedostatak u ishrani odražava nizom naizgled beznačajnih, ali na kraju ipak ozbiljnih, pa čak i smrtonosnih oštećenja. Neki naučnici smatraju da su minerali važniji od vitamina jer se u živom organizmu nikako ne mogu stvoriti.

Prema značaju i ulozi koju imaju u telu, minerali se dele na:

Esencijalne (glavne): kalcijum, magnezijum, fosfor, natrijum, kalijum, hlor; Esencijalne u trgovima: gvožđe, bakar, hrom, cink, jod, selen, fluor, kobalt, mangan,

molibden; Verovatno esencijalne u tragovima: silicijum, nikl, kalaj, vanadijum; Neesencijalne: arsen, živa, olovo, aluminijum,bor, zlato, srebro, titan, litijum, stroncijum,

germanijum, kadmijum, antimony, bizmut, rubidijum, brom;

Prema količini, minerali se dele na:

Mikroelemente: selen, mangan, kobalt, hrom, molobden;

12

Makroelemente: natrijum, magnezijum, kalcijum, fosfor, kalijum, hlor, gvožđe, sumpor, bakar, cink, jod.

Minerali se neprekidno obnavljaju u našem organizamu, unose se hranom, a izbacuju iz organizma kroz znoj, stolicu i druge izlučevine. Delovanje svakog minerala zavisi od unete količine u organizam (http://nutricionisti.org/index.php?view=article&id=64:minerali; http://www.organvlasti.com/20090721610/zdravlje/ishrana-i-dijete/minerali-u-ishrani.html). 2.3. Makro i mikroelementi u čokoladi

Čoklolada je namernica bogata kako organskim, tako i neorganskim komponentama. To je jedan od razloga što se čokolada danas posmatra sa aspekta "funkcionalne hrane". Odličan je izvor kalcijuma, koji ima bitnu ulogu u regulaciju količine vode u organizmu i regulaciji srčanog ritma. Magnezijum u čokoladi smiruje nervnu napetost, pozitivno deluje na mozak, mišiće, organe za disanje i jača kosti. Takođe, prisutno je gvožđe, koje pomaže kod blage anemije, dok bakar učestvuje u metabolizmu, formiranja melanina u koži i kosi. Čokolada je bogata i fosforom i cinkom. Fosfor učestvuje u izgradnji crvenih i belih krvnih zrnaca, a cink reguliše obnavljane kože.

Pored ovih elemenata u čokoladi se mogu naći i teški metali. Teški metali se zovu zbog toga što imaju gustinu veću od 5 g/cm3. U hrani su najčešće u sastavu kontaminanta. Teški metali kojima je hrana najčešće kontaminirana su: olovo (Pb), živa (Hg), kadmijum (Cd) i arsen (As). Maksimalno dopuštene vrednosti ovih elemenata u hrani regulisani su Pravilnikom o količinama pesticida, metala, metaloida i drugih otrovnih supstanci, hemioterapeutika, anabolika i drugih supstanci koje se mogu naći u namirnicama. Dozvoljene koncentracije date su u tabeli1. Tabela 1. Dozvoljene koncentracije metala u čokoladi izražene u mg/kg

Vrsta namirnice Olovo Kadmijum Arsen Bakar

Čokolada 1 0,02 0,5 15 a) čokolada bez šećera 2 0,05 1 30

b) punjena čokolada 1 - 1 20 2.4. Načini pripreme uzoraka

Određivanju sadržaja makro i mikroelemenata u namirnicama prethodi mineralizacija uzorka. Dve tehnike koje se najduže i još uvek najčešće primenjuju, baziraju se na suvom spaljivanju na definisanoj temeraturi, i na vlažnoj digestiji sa mineralnim kiselinama u otvorenim i zatvorenim sistemima (Lee, 1985; http://www.cecra.dh.pmf.uns.ac.rs/pdf/drugiseminar/priprema_Maletic.pdf).

13

2.4.1. Suva mineralizacija

Primenjuje se za uzorke koji sadrže veliku količinu organske materije i analiziraju se na nevolatilne elemente. Najčešće su to uzorci hrane (nutritivni elementi u hrani), biljni materijali, biološki materijali, itd. Metoda podrazumeva spaljivanje uzoraka na temperaturama od 450-500oC 16 sati, u porculanskim ili platinskim posudama (lončićima). Zatim, sledi rastvaranje dobijenog pepela koncentrovanom azotnom kiselinom, filtriranje kroz kvantitativam filter parir u normalnim sudovima i dopunjavanje istih do crte razblaženim rastvorom azotne kiseline. Prednosti suve mineralizacije jesu: mogućnost spaljivanja velike količine uzoraka, mala potreba za reagensima i pogodnost tehnike za pripremu velikog broja uzoraka. Nedostaci se ogledaju u: gubicima usled zaostajanja na zidovima suda, kontaminaciji od suda za spaljivanje i peći za žarenje, gubitku pepela male gustine usled strujanja vazduha (otvorena vrata peći za žarenje) i teškoćama pri rastavranju određenih metalnih oksida.

2.4.1. Mokra mineralizacija

Ovo je metod za prevođenje komponenata iz kompleksnog matriksa u jednostavne hemijske forme. Izvodi se dovođenjem energije kao što je toplota; primenom hemijskog reagensa, kao što su kiseline; ili kombinacijom ova dva načina. Uzorci se tretiraju azotnom kiselinom i vodonik peroksidom i zagrevaju 40 minuta na 150 . Potom, sledi filtracija kroz mikrofilter i dopunjavanje normalnog suda do određene zapremine. To je relativno brza i jeftina tehnika (primenjuje se oprema koja se koristi u rutinskoj analizi), a njeni nedostaci su: niska temperature mineralizacije (temperature ključanja kiseline ili primenjene smeše), rizik od kontaminacije iz laboratorijskog vazduha, potrebna veća količina reagenasa, veliki gubici elemenata u tragovima. 2.4.3 Mineralizacija u mikrotalasnoj pećnici

Savremeni postupak mineralizacije uzoraka je mnogo efikasniji i brži od konvencionalnog zagrevanja, jer zagrevanje se vrši unutar uzorka, primenom mikrotalasne energije. Moguća je automatizacija postupka. Dodatak sumporne kiseline je esencijalan u cilju postizanja visoke temperature mineralizacije pri atmosferskom pritisku. Potrebno je manja količina uzoraka i manje vreme pripreme u odnosu na ostale tehnike. 2.5. Atomska emisiona spektrometrija – ICP spektrometrija

Razvoj metode počinje sredinom šezdesetih godina, kada su Grinfild (S. Greenfield) u Engleskoj i Fasel (V. A. Fasel) u USA, sa sradnicima, demonstrirali mogućnost primene radiofrekventne plazme u analitičke svrhe. Najznačajnija preimućstva ICP-spektrometrije nad drugim metodama emisione spektrohemijske analize su (Antić-Jovanović, 2006): mogućnost izvođenja višelementarne analize: za manje od dva minuta može da se odredi

20-60 elemenata u probi, sa tačnošću koja je istog reda veličine ili veća nego u drugim instrumentalnim metodama;

14

široka dinamička oblast: kao posledica malog efekta samoapsorpcije u posmatranoj zoni plamena, analitička kriva je linearna u intervalu koncentracija od nekoliko redova veličine, tako da podjednako mogu da se određuju elementi, kako niskih koncentracija (ispod 1 μg), tako i na visokom, što je uslov za izvođenje višelelemntne analize;

analza uzoraka u obliku rastvora: prevođenje analita u rastvor znatno uprošćava analizu, posebno heterogenog materijala, pošto se pri rastvaranju, uz eventualno prethodno topljenje, razaranje i slično, svi elementi prevode u isti hemijski oblik, čime se redukuju efekti osnove i olokšava priprema standarda;

mala količina rastvora dovoljna za analizu, što podrazumeva i malu količinu uzorka;

relativno dugo vreme boravka čestica u plazmi: zadržavanje čestica u plazmi nekoliko milisekundi i njena inertna atmosfera doprinose efikasnosti atomizacije i pobuđivanja, a time i osetljivosti određivanja.

2.5.1. Indukovano spregnuta plazma

U poslednje vreme se kao izvor pobuđivanja sve češće se koristi induktivno spregnuta plazma - ICP (Inductively Coupled Plasma). To je bezelektrodna argonska (ređe azotna) plazma koja radi na atmosferskom pritisku, a održava se induktivnim sperezanjem sa radiofrekventnim elektromagnetskim poljem. Plazmenik se sastoji od tri koncentrične cevi (slika1). Kroz unutrašnju cev uvodi se uzorak, u obliku rastvora koji se prevodi u fini aerosol pomoću struje argona. Argon za formiranje plazme uvodi se kroz spoljasnju cev, dok se termička izolacija plazme postiže tangencijalnim uvođenjem struje argona kroz spoljašnju cev plazmenika - gorionika. Ova struja hladi zidove kvarcne cevi, a takođe stabilizuje i centrira plazmu. Oko spoljašnje kvarcne cevi obmotana su 3-4 navoja indukcionog kalema vezanog za radiofrekventni generator najčešće frekvencije od 27,12 MHz i snage 1-3 kW. Visokofrekventna struja koja potiče kroz indukcioni kalem stvara oscilatorno magnetno polje, koje indukuje elektrone u gasu unutar kvarcne cevi. Oni se ubrzavaju vremenski promenljivim električnim poljem, što dovodi do zagrevanja i dodatne jonizacije.

Slika 1. Plazmenik-gorionik. 1 – navoji indukcionog kalema, 2 – Ar koji nose areosol (uzorak), 3 – Ar za obrazovanje plazme, 4 – Ar za hlađenje.

15

Temperatura plazme varira od 6000 – 10000K i opada sa visinom iznad indukcionog kalema, tako da se za svako određivanje može izabrati pogodna visina na kojoj će se vršiti posmatranje. S obzirom na visoku temperaturu u ICP izvorima dobijeni spektri su dosta složeni.

Oblik plazme je toroidni (slika 2), a uslovljen je konstrukcijom plazmenika, brzinom protoka gasa, kao i frekvencom generatora. Ovakav oblik plazme je mnogo efikasniji za ulaženje čestica aerosola, nego uobičajni "plamen" oblik plazme. Može se razlikovati nekoliko zona. Prvo je zona prethodnog zagrevanja. Početna zona pražnjenja je oblik metka sa intenzivnom atomskom emisijom. Normalna analitička zona se nalazi na 15-20 mm iznad indukcionog kalema. Ekscitaciona temperatura u njoj je oko 6500K. U ovoj zoni je jako smanjen intenzitet kontinualnog zračenja tako da je plazma više optički transparentna. U njoj uglavnom nastaje jonska emisija. Iznad ove zone temperatura opada i javlja se atomska i molekulska emisija. (Todorović i sar. 1997).

Slika 2. Temperatura i zone u ICP plazmi

2.5.2. Tačnost i osetljivost metode

ICP-spektrometrija se uspešno koristi za analizu različitih uzoraka (stena, minerala, vode, bioloških materijala itd.) u rastvoru. Tačnost metode je istog reda veličine kao i RSD i kreće se od 1-10% u zavisnosti od koncentracije određivanog elementa. U praksi, sa komercijalnim aparatima namenjenim analitičkim potrebama, LD mogu da budu veće za faktor 10 i više, pošto zavise u velikoj meri od kvaliteta (moći razlaganja i svetlosne jačine) spektrometra i tipa raspršivača. ICP spektrometrija je superiornija u detekciji elemenata sa većom energijom pobuđivanja, pa se alkalni metali i danas u analitičkim laboratorijama određuju plamenom spektrometrijom. Šema optički emisionog spektrometra prikazana je na slici 3. (http://glasswarechemical.com/category/scientific-instrument/).

16

Slika 3. Optički emisioni spektrometar

2.6. Faktorska analiza Metod multivarijacione analize koji se koristi za opis međusobne zavisnosti velikog broja promenljivih korišćenjem manjeg broja osnovnih, ali neopažljivih slučajnih promenljivih poznatih kao faktori, naziva se faktorska analiza (Kovačić, 1994). Kod faktorske analize, istraživač može prvo da identifikuje odvojene dimenzije strukture, i onda determiniše obim u kom je svaka varijabla objašnjena pomoću svake dimenzije. Kada se determinišu ove dimenzije i objašnjenje svake varijable, mogu se ostvariti dve primarne upotrebe faktorske analize – sumarizacija i redukcija podataka. U sumarizaciji podataka, faktorska analiza izvodi osnovne dimenzije, koje kada se interpretiraju i shvate, opisuju podatke u mnogo manjem broju koncepata nego originalne individualne varijable. Redukcija podataka se može ostvariti izračunavanjem skorova za svaku osnovnu dimenziju i njihovom zamenom umesto originalnih varijabli. Jedna varijanta ovog kriterijuma uključuje odabir dovoljno faktora da se ostvari unapred specifikovani komunalitet za svaku od varijabli. Ako teoretski ili praktični razlozi zahtevaju izvesni komunalitet za svaku varijablu, onda će istraživanje uključiti onoliko faktora koliko je potrebno za adekvatno reprezentovanje svake od originalnih varijabli. Ovo se razlikuje od fokusiranja na samo ukupan obim objašnjene varijanse, što zanemaruje stepen objašnjenja za individualne varijable. 2.6.1. Kriterijumi za broj faktora za ekstrakciju Kako odlučujemo o broju faktora za ekstrakciju? Kada se faktoriše veliki set varijabli, ovaj metod prvo ekstrahuje kombinacije varijabli koje objašnjavaju najveći obim varijanse, i onda produžava na kombinacije koje objašnjavaju sve manje i manje obime varijanse. U odlučivanju kada zaustaviti faktorisanje (tj. koliko faktora ekstrahovati), istraživač generalno počinje sa nekim unapred determinisanim kriterijumom, kao što je procenat varijanse ili kriterijum

17

latentnog korena, da bi se dobio specifičan broj faktora za ekstrakciju. Nakon što je inicijalno rešenje izvedeno, istraživač izračunava nekoliko dodatnih probnih rešenja – obično jedan manje faktor od inicijalnog broja, i dva ili tri faktora više nego što je inicijalno izvedeno. Onda, na bazi informacija dobijenih iz probnih analiza, ispituju se faktorske matrice, a najbolja reprezentacija podataka se koristi kao pomoć u determinisanju broja faktora za ekstrakciju. Po analogiji, odabir broja faktora koje treba interpretirati je nalik fokusiranju mikroskopa. Previsoko ili prenisko podešavanje, će učiniti nejasnom strukturu koja je očigledna kada je podešavanje ispravno. Stoga, putem ispitivanja broja različitih faktorskih struktura izvedenih iz nekoliko probnih rešenja, istraživač može da ih poredi i suprotstavlja, da bi došao do najbolje reprezentacije podataka. Tačna kvantitativna osnova za odlučivanje o broju faktora za ekstrakciju, nije razvijena. Međutim, trenutno se koriste sledeći kriterijumi zaustavljanja, za broj faktora za ekstrakciju. Kriterijum latentnog korena. Najčešće korišćena tehnika je kriterijum latentnog korena. Ova tehnika je jednostavna za primenu ili u komponentnoj analizi ili faktorskoj analizi u užem smislu. Obrazloženje za kriterijum latentnog korena je da bilo koji individualni faktor treba da objasni varijansu bar jedne varijable, ako ga treba zadržati za interpretaciju. Svaka varijabla doprinosi vrednost 1, ukupnoj karakterističnoj vrednosti. Stoga, samo se faktori koji imaju latentne korene ili karakteristične vrednosti veće od 1, smatraju značajnim; svi faktori sa latentnim korenima manjim od 1, se smatraju neznačajnim i oni se izostavljaju. Korišćenje karakteristične vrednosti za utvrđivanje prekida (granične vrednosti), je najpouzdanije kada je broj varijabli izmedju 20 i 50. Ako je broj varijabli manji od 20, postoji tendencija da ovaj metod ekstrahuje konzervativan broj faktora (premalo); dok, ako je uključeno više od 50 varijabli, nije neuobičajeno da se ekstrahuje previše faktora. A priori kriterijum. A priori kriterijum je jednostavan, a ipak razuman kriterijum pod izvesnim okolnostima. Kada ga primenjuje, istraživač već zna koliko faktora da ekstrahuje, pre preduzimanja faktorske analize. Istraživač jednostavno daje instrukcije kompjuteru da zaustavi analizu kada se ekstrahuje željeni broj faktora. Ovaj pristup je koristan kada se testira teorija ili hipoteza o broju faktora koje treba ekstrahovati. On takođe može biti opravdan u pokušaju repliciranja rada drugog istraživača, i ekstrahovanja istog broja faktora koji je prethodno pronađen. Kriterijum procenta varijanse. Kriterijum procenta varijanse je pristup baziran na ostvarenju specifikovanog kumulativnog procenta ukupne varijanse, ekstrahovane uzastopnim faktorima. Svrha je osigurati praktičnu značajnost za izvedene faktore, putem obezbeđenja da oni objašnjavaju bar specifikovani obim varijanse. Nije usvojen apsolutni prag za sve aplikacije. Međutim, u prirodnim naukama, proceduru faktorisanja obično ne treba zaustavljati dok ekstrahovani faktori ne objasne bar 95% varijanse, ili dok poslednji faktor ne objasni samo mali deo (manje od 5%). Suprotno tome, u društvenim naukama, gde su informacije često manje precizne, nije neuobičajeno da se rešenje koje objašnjava 60% ukupne varijanse (a u nekim slučajevima čak i manje), smatra zadovoljavajućim. Jedna varijanta ovog kriterijuma uključuje odabir dovoljno faktora da se ostvari unapred specifikovani komunalitet za svaku od varijabli. Ako teoretski ili praktični razlozi zahtevaju izvesni komunalitet za svaku varijablu, onda će istraživanje uključiti onoliko faktora koliko je

18

potrebno za adekvatno reprezentovanje svake od originalnih varijabli. Ovo se razlikuje od fokusiranja na samo ukupan obim objašnjene varijanse, što zanemaruje stepen objašnjenja za individualne varijable. Kriterijum skri (scree) testa. Kod faktorskog modela komponentne analize, kasniji ekstrahovani faktori sadrže i zajedničku i jedinstvenu varijansu. Iako svi faktori sadrže bar neku jedinstvenu varijansu, srazmera jedinstvene varijanse je znatno viša u kasnijim, nego u ranijim faktorima. Scree test se koristi da identifikuje optimalni broj faktora koji se mogu ekstrahovati pre no što obim jedinstvene varijanse počne da dominira strukturom zajedničke varijanse. Scree test se izvodi putem ucrtavanja latentnih korena, u odnosu na broj faktora po njihovom redosledu ekstrakcije, a oblik rezultirajuće krive se koristi za evaluaciju tačke prekida (granične vrednosti). Na slici 4 ucrtano je 18 faktora ekstrahovanih u jednoj studiji. Počevši sa prvim faktorom, dijagram u početku ima strmi silazni nagib, a onda polako postaje približno horizontalna linija. Za tačku u kojoj kriva prvo počinje da se ispravlja, se smatra da indicira maksimalan broj faktora za ekstrakciju. U sadašnjem slučaju, prvih 10 faktora bi se kvalifikovalo. Preko 10, bila bi uključena prevelika srazmera jedinstvene varijanse; stoga, ovi faktori ne bi bili prihvatljivi. Opaža se da u upotrebi kriterijuma latentnog korena, samo osam faktora bi bilo razmotreno. Nasuprot tome, upotreba scree testa obezbedjuje još dva faktora. Kao opšte pravilo, scree test rezultira u tome da se za uključenje razmatra bar jedan, a ponekad i dva ili tri više faktora, nego kod kriterijuma latentnog korena.

Slika 4. Dijagram karakteristične vrednosti za kriterijum scree testa x-osa – broj faktora y-osa – latentni koren (karakteristična vrednost) Heterogenost respondenata. Deljena varijansa među varijablama je osnova i za komponentne faktorske modele i one sa zajedničkim faktorom. Osnovna pretpostavka je da se deljena varijansa proteže preko čitavog uzorka. Ako je uzorak heterogen u pogledu bar jednog podskupa varijabli, onda će prvi faktori predstavljati one varijable koje su homogenije preko čitavog uzorka. Varijable koje su bolji diskriminatori između podgrupa uzorka, će opteretiti kasnije faktore, mnogo puta one koji nisu odabrani pomoću kriterijuma o kojima je gore diskutovano. Kada je cilj identifikovati faktore koji vrše diskriminaciju među podgrupama

19

uzorka, istraživač treba da ekstrahuje dodatne faktore preko onih indiciranih od strane metoda gore navedenih, i da ispita sposobnost tih dodatnih faktora. Ako se oni pokažu kao manje korisni u diskriminaciji, rešenje može ponovo da se pregleda, a ovi kasniji faktori eliminišu. 2.6.2. Rotacija u faktorskoj analizi Položaj referentnih osa, tj. faktora nakon ekstrakcije utvrđuje se rotacijom, postupkom koji za cilj ima da se faktor dovede u optimalni položaj u prostoru varijabli, kako bi se postigla jednostavna struktura (Kovačić, 1994; Hair i sar., 1998). Jednostavnu strukturu je definisao Terston i ona predstavlja jedan od kriterijuma koji se koriste u faktorskoj analizi u cilju lakše interpretacije rezultata. Jednostavna struktura ima za cilj da postigne mali broj visokih vrednosti faktorskih opterećenja i veliki broj niskih faktorskih opterećenja, tj. mali broj manifestnih varijabli treba da ima visoke i srednje visoke korelacije sa faktorom, a sve ostale niske ili nulte korelacija sa istim faktorom. Najbolje je da svaka varijabla ima samo jednu visoku korelaciju sa jednim faktorom, a da su sve ostale korelacije te varijable sa drugim faktorima niske ili nulte. U pravougle korelacije spadaju: Keiserov varimax, quartimax, equimax itd. Pravougle, tj. ortogonalne rotacije ne menjaju odnos faktorskih osa, one su i dalje ortogonalne. One se po tome razlikuju od kosougih rotacija kod kojih tog ograničenja nema (faktorske ose rotiraju nezavisno jedna od druge). U ortogonalnim rotacijama se zadržava nezavisnost sirovih faktora, tj. korelacije između faktora su nulte. To znači da skor na jednom faktoru, ništa ne govori o skoru na drugom. U ortogonalnim rotacijama međusobni odnosi faktora su unapred definisani, što može da predstavlja smetnju u postizanju jednostavne strukture. Kada je prvi faktor postavljen u optimalni položaj, položoji svih drugih faktora su takođe već određeni, jer oni moraju da budu u ortogonalnom odnosu sa prvim. Dobra stvar kod ortogonalnih faktora je ta što su oni jednostavniji za interpretaciju od kosougih, pošto se ortogonalna rotacija odvija na samo jednoj matrici-matrici strukture. Kosougle rotacije dopuštaju da rotirani faktori zaklapaju ugao različit od 90ºC, odnosno da faktori između sebe koreliraju. Zasnovane su na različitim kriterijumima. Njihovom se upotrebom dobijaju faktorska rešenja koja zadovoljavaju kriterijum jednostavne strukture, a da pri tome faktori nisu suviše korelirani između sebe. Kod kosouglih rotacija postoji više mogućih rešenja i one potpunije mogu da zadovolje kriterijum jednostavne strukture zbog fleksibilnosti u određivanju položaja pojedinih faktora. U kosougle rotacije spadaju: promax, oblimin i quarimin. 2.6.3. Selekcija rotacionih metoda Nisu razvijena nikakva specifična pravila koja bi pružala smernice istraživaču u odabiru određene ortogonalne ili kose rotacione tehnike. U većini slučajeva, istraživač jednostavno koristi rotacionu tehniku koju pruža kompjuterski program. Većina programa ima rotaciju varimax, ali su široko dostupni svi glavni rotacioni metodi. Međutim, ne postoji nijedan analitički razlog za favorizovanje jednog rotacionog metoda u odnosu na drugi. Izbor

20

ortogonalne ili kose rotacije treba izvršiti na osnovu konkretnih potreba datog problema istraživanja. Ako je cilj istraživanja redukovati broj originalnih varijabli, bez obzira na to koliko značajni rezultirajući faktori mogu biti, onda bi adekvatno rešenje bilo ortogonalno. Takođe, ako istraživač želi da redukuje veliki broj varijabli na manji set nekoreliranih varijabli za narednu u potrebu u regresiji ili drugim tehnikama predvidjanja, ortogonalno rešenje je najbolje. Međutim, ako je krajnji cilj faktorske analize, dobijanje nekoliko teoretski značajnih faktora, onda je pogodno koso rešenje. Do ovog zaključka se dolazi, jer realno, vrlo malo faktora je nekorelirano, kao u ortogonalnoj rotaciji. 2.6.4. Kriterijumi za značajnost faktorskih opterećenja U interpretiranju faktora, mora se doneti odluka u vezi toga koja faktorska opterećenja su vredna razmatranja. Sledeća diskusija detaljno opisuje pitanja u vezi praktične i statističke značajnosti, kao i broja varijabli, koja utiču na interpretaciju faktorskih opterećenja. Obezbeđivanje praktične značajnosti. Prva sugestija se ne bazira na nekoj matematičkoj propoziciji, već je više u vezi sa praktičnom značajnošću. To je opšte načelo koje se često koristi, kao način vršenja preliminarnog ispitivanja faktorske matrice. Ukratko, za faktorska opterećenja veća od ± 0,30 se smatra da zadovoljavaju minimalni nivo, opterećenja od ± 0,40 se smatraju važnijima, a ako su opterećenja ± 0,50 ili veća, smatraju se praktično značajnima. Što je veća apsolutna veličina faktorskog opterećenja, to je važnije to opterećenje u interpretaciji faktorske matrice. Pošto je faktorsko opterećenje korelacija varijable i faktora, kvadrirano opterećenje je obim ukupne varijanse varijable, koji taj faktor objašnjava. Stoga, opterećenje od 0,30 se prevodi približno u objašnjenje od 10%, a opterećenje od 0,50 označava da faktor objašnjava 25% varijanse. Opterećenje mora da pređe 0,70 da bi faktor objasnio 50% varijanse. Istraživač treba da shvati da ekstremno visoka opterećenja (0,80 i veća) nisu tipična, i da je praktična značajnost opterećenja, važan kriterijum. Ove smernice su primenljive kada je veličina uzorka 100 ili više. Naglasak u ovom pristupu je praktična, a ne statistička, značajnost. Procenjivanje statističke značajnosti. Kao što je ranije istaknuto, faktorsko opterećenje predstavlja korelaciju između originalne varijable i njenog faktora. U determinisanju nivoa značajnosti za interpretaciju opterećenja, mogao bi se koristiti pristup sličan determinisanju statističke značajnosti koeficijenata korelacije. Međutim, istraživanje je demonstriralo da faktorska opterećenja imaju znatno veće standardne greške nego tipične korelacije; stoga, faktorska opterećenja treba evaluirati na znatno strožijim nivoima. Istraživač može da koristi koncept statističke moći, da specifikuje faktorska opterećenja koja se smatraju značajnima za različite veličine uzorka. Npr. u uzorku od 100 respondenata, faktorska opterećenja od 0,55 i iznad, su značajna. Međutim, u uzorku od 50, za značajnost se zahteva faktorsko opterećenje od 0,75. U poređenju sa ranijim opštim načelom, koje je označilo da sva opterećenja od 0,30 imaju praktičnu značajnost, ovaj pristup bi smatrao opterećenja od 0,30 značajnim, samo za uzorke veličina 350 ili veće. Ovo su prilično konzervativne smernice kada se porede sa smernicama prethodnog odeljka ili čak statističkim nivoima povezanim sa konvencionalnim koeficijentima korelacije. Stoga ove smernice treba upotrebiti kao polazište u interpretaciji faktorskog opterećenja, gde se niža opterećenja smatraju značajnim i dodaju interpretaciji na bazi drugih razmatranja.

21

3. EKSPERIMENTALNI DEO

22

3.1 Pribor i aparatura

ICP-OES ICAP 6000 (Thermo Scientific, Cambridge, United Kingdom) Vaga – Metteler Toledo, AB204-S/A Aparat za dejonizovanu vodu - TKA MicroMed (TKA Wasseraufbereitungs systeme

GmbH) Automatske varijabilne pipette

3.2 Reagensi

HNO3 p.a., Merck® (KGaA, Darmstadt, Germany) Multi standard, Ultra scientific analytical solutions USA, (30 elemenata, 20,00±0,10 ppm,

osim P, K i Si koncentracije 100,0±0,5 ppm i Ag koncentracije 5,00±0,03 ppm, matriks je 2% HNO3 i tragovi vinske kiseline)

Argon 5,0 (čistoće 99,999%) Dejonizovana voda (χ = 0,05 μS/cm) Posuđe za pripremu uzoraka je prano česmenskom vodom, rastvorom HCl (1:1) i dejonizovanom vodom. 3.3. Uzorci

Prilikom izrade ovog rada korišćeno je 19 uzoraka mlečne (Najlepše želje, Milka, Premia, Bambi, Simka, Schogetten, Alpenmilch, Dorina, Seka, Galeb, Nestle, Baron, Zvečevo, Hibbi, Merkator, Daria, Simka 35%, Kidy, Ritter Sport) i 11 uzoraka bele čokolade (Weiss Blanc, Lindor, Lindt, Giandor, Prestige, Nestle Galak, Bambi, Milka, White Deluxe, Weisse Chocolate, Blanquita). 3.4. Priprema uzoraka

Uzorak, mase oko 1,5 g (izmeren sa tačnošću na cetiri decimale) homogenizovan je i stavljen u peć za žarenje 2 sata na temperaturi od 250oC. Temperatura je povećavana postepeno do 450oC i na toj temperature su uzorci žareni još 16 sati. Dobijeni pepeo je preliven sa 5 ml koncentrovane azotne kiseline, proceđen kroz kvantitativan filter papir u normalni sud od 25 ml i lončić par puta ispran 0,5% azotnom kiselinom. Rastvor je dopunjen 0,5% azotnom kiselinom do crte (Lee, 1985). 3.5. Parametri meode

Za analizu uzoraka bele i mlečne čokolade, izabrani parametri metode su sledeći: Snaga radiofrekventnog (RF) generatora – 1150 W Brzina peristaltičke pumpe – 50 rpm Protok gasa za hlađenje - 12 l/min Protok raspršivačkog gasa – 0,7 l/min Pravac posmatranja plazme – aksijalni/radijalni

23

Vreme ispiranja - 30s Tri probe za svako merenje

3.6. Statistička obrada podataka

Sva merenja su izvršena u tri ponavljanja, a rezultati predstavljeni kao srednja vrednost tri ponavljanja (csr ± SD). Interval poverenja je bio 95%.

Za statističku obradu podataka korišćen je kompjuterski statistički paket Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA).

24

4.REZULTATI I DISKUSIJA

25

4.1 Određivanje makro i mikroelemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade

Određivanju sardžaja makro i mikroelemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade prethodilo je kreiranje metode. Izabrane su po četiri talasne dužine sa najvećim relativnim intenzitetom emisije. Konstruisane su kalibracione prave primenom tri standarda. Dva standarda, koncentracije 2 ppm i 5 ppm, su dobijena razblaživanjem referentnog multi standarda (20,00 ± 0,10 ppm). Dejonizovana voda je korišćena kao treći standard. Radna talasna dužina je izabrana na osnovu relativnog inteziteta emisije, standardne devijacije nagiba, standardne devijacije odsečka, korelacionog koeficijenta, interferencije na talasnim dužinama levo i desno od odabrane. U tabeli 2 prikazane su odabrane talasne dužine za svaki element, korelacioni koeficijent (R2), limit detekcije (LOD) i limit kvantifikacije (LOQ). Tabela 2. Parametri kalibracionie prave za određivane elemente

Metal λ nm

R2 LD mg/L

LQ mg/L

Al 396,152 0,9998 0,0021 0,007 As 228,812 1 0,0008 0,0027 B 249,773 1 0,0005 0,0018 Ba 455,403 1 0,0001 0,0002 Ca 422,673 1 0,0006 0,0021 Cd 228,802 1 0,0002 0,0006 Co 228,616 1 0,0003 0,0011 Cr 283,563 1 0,0006 0,0019 Cu 324,754 1 0,0006 0,0019 Fe 259,94 1 0,0006 0,0019 K 769,896 0,9959 0,0044 0,0146 Li 670,784 0,9961 0,0001 0,003 Mg 279,553 0,9996 0,0001 0,0006 Mn 259,373 1 0,0001 0,0004 Mo 202,03 1 0,0007 0,0023 Na 589,592 0,9955 0,0009 0,0029 Ni 231,604 0,999 0,0005 0,0017 P 177,495 0,9999 0,0033 0,0108 Pb 220,353 1 0,0019 0,0064 Sb 252,852 0,9999 0,0008 0,0026 Se 196,09 1 0,0024 0,0079 Si 251,611 1 0,0014 0,0046 Sn 283,999 1 0,0067 0,0222 Sr 407,771 0,9998 0,0001 0,0007 V 309,311 0,9985 0,0006 0,0019 Zn 213,856 0,9992 0,0001 0,0004

26

Snimanje uzoraka bele i mlečne čokolade je vršeno na izabranim talsnim dužinam. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost tri ponavljanja csr±SD (μg/g ili mg/g). Od makro elemenata (tabela 3, slika 5-8), u uzorcima bele i mlečne čokolade najviše su zastupljeni K i P, zatim slede Ca, Mg i Na. Sadržaj kalijuma u uzorcima bele i mlečne čokolade se kreće u intervalu 1,14-5,92 mg/g i 4,27-7,9 mg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za K (Institute of Medicine, 2004) se kreće od 0,4 g za odojčad, 3,8 g za decu od 4-8 godina do 4,7 g za adolescente, žene i muškarce. Kalijum je najzastupljeniji unutarćelijski katjon. Reguliše metabolizam vode i soli unutar ćelije, osmotski pritisak, kiselo-baznu ravnotežu, normalizuje rad srca, učestvuje u predaji nervnih impulsa mišića, pojačava iznošenje natrijuma iz organizma i vode. Osim toga kalijum igra važnu ulogu u biosintezi proteina i za pretvaranje šećera iz krvi u glikogen. Aktivira veliki broj enzima, posebno onih koji učestvuju u stvaranju energije. Fosfor je prisutan u svim ćelijama i ima brojne fiziološke funkcije u organizmu. Metabolizam fosfora je u tesnoj vezi sa metabolizmom kalcijuma. U organizmu čoveka ima upola manje fosfora u odnosu na kalcijum (2:1), ali ga ipak ima više u odnosu na druge elemente. Važan je za nastanak energije, zajedno s kalcijumom je gradivni element kostiju i zuba, sastavni je deo DNK i RNK, bitan za strukturu ćelijske membrane (deo je fosfolipida) i pridonosi održanju acidobazne ravnoteže u telesnim tečnostima. Sadržaj fosfora u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu koncentracija 1,36-2,35 mg/g i 1,38-2,32 mg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za P (Institute of Medicine, 1997) za odojčad je 100 mg, za decu od 4-8 godina 500 mg, za adolescente 1 250 mg i za muškarce i žene 700 mg. Magnezijum se u organizmu nalazi u količini od oko dvadesetak grama i deo je strukture kostiju. Kofaktor je u više od 300 enzimskih sistema, koji regulišu sintezu proteina, mišićne i nervne funkcije i krvni pritisak. Važan je u obezbeđivanju energije organizmu. Učestvuje u aktivnom transportu kalcijumovih i kalijumovih jona kroz ćelijsku membranu, što čini važan proces za sprovođenje nervnih impulsa i normalni srčani ritam. U uzorcima bele i mlečne čokolade sadržaj magnezijuma se kreće u interval 71-492 µg/g i 299-608 µg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za Mg (Institute of Medicine, 1997) za odojčad je 30 mg, za decu od 4-8 godina 130 mg i za adolescente, muškarce i žene oko 400 mg. Kalcijum je najobimniji mineral u ljudskom organizmu. Njegove soli direktno utiču na čvrstinu kostiju i zuba. U organizmu se nalazi oko jednog kilograma kalcijuma, od čega je najveći deo u kostima. Pored delovanja na kosti, kalcijum učestvuje u prenošenju nervnih impulsa obezbeđujući srčani ritam, neophodan je za koagulaciju krvi, te reguliše odnos baza i kiselina u krvotoku. Za njegovo upijanje u krv neophodan je i vitamin D. Sadržaj kalcijuma u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu 522-2089 µg/g i 640-1864 µg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za Ca (Institute of Medicine, 1997) za odojčad je 210 mg, za decu od 4-8 godina 800 mg, za adolescente 1300 mg i za muškarce i žene u zavisnsti od razdoblja od 1000 do 1200 mg. Natrijum je jedan od glavnih katjona u organizmu. Učestvuje u metabolizmu vode, reguliše kiselo baznu ravnotežu kao pufer, učestvuje u kontakciji mišića, omogućava prenošenje ugljen – dioksida do pluća gde se oslobađa. Predstavlja najčešći pozitivno naelektrisani jon u

27

ekstracelularnoj tečnosti. Učestvuje u formiranju tzv. osmolarnosti ekstracelularne tečnosti. Odrastao čovek, koji obavlja umereno težak rad, u umerenim klimatskim uslovima, ima dnevne potrebe za kuhinjskom solju od 2 do 10 g. Sadržaj natrijuma u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu 504-1529 mg/g i 172-2104 mg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos Na (Institute of Medicine, 2004) za odojčad je 0,12 g, za decu od 4-8 godina 1,2 mg i za adolescente, muškarce i žene oko 1,5 g. Tabela 3. Sadržaj makro elemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade Uzorak Ca Mg Na csr(µg/g) ± SD RSD

(%) csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD RSD

(%) Bela čokolada Weiss Blanc 1709 ± 10 0,58 174 ± 2 1,15 651 ± 4 0,61 Lindor 1466 ± 17 1,16 151 ± 2 1,32 678 ± 4 0,59 Lindt 1889 ± 30 1,58 200 ± 1 0,50 899 ± 8 0,89 Giandor 1970 ± 7 0,35 492 ± 6 1,22 690 ± 2 0,28 Prestige 1771 ± 2 0,12 228 ± 3 1,31 803 ± 2 0,25 Nestle Galak 1275 ± 6 0,47 164 ± 2 1,22 1098 ± 18 1,64 Bambi 1852 ± 34 1,83 230 ± 1 0,43 1529 ± 13 0,85 Milka 522 ± 13 2,49 71 ± 2 2,81 504 ± 21 4,16 White Deluxe 2089 ± 44 2,10 206 ± 3 1,46 1527 ± 31 2,03 Weisse Schokolade 1570 ± 39 2,48 198 ± 6 3,03 1058 ± 29 2,74 Blanquita 1340 ± 25 1,86 154 ± 3 1,94 1037 ± 13 1,25 Mlečna čokolada

Najlepše želje 1864 ± 20 1,07 519 ± 9 1,73 1260 ± 5 0,39 Milka 1665 ± 15 0,90 523 ± 2 0,38 1793 ± 18 1,00 Premia 1303 ± 19 1,45 504 ± 8 1,58 1580 ± 32 2,02 Bambi 1468 ± 28 1,90 366 ± 1 0,27 1367 ± 27 1,97 Simka 1151 ± 12 1,04 353 ± 6 1,69 1282 ± 17 1,32 Schogetten 1105 ± 4 0,36 347 ± 4 1,15 664 ± 13 1,95 Alpenmilch 640 ± 4 0,62 608 ± 9 1,48 172 ± 1 0,58 Dorina 1287 ± 9 0,69 349 ± 6 1,72 776 ± 18 2,32 Seka 1340 ± 16 1,19 493 ± 4 0,81 804 ± 15 1,86 Galeb 1692 ± 14 0,82 510 ± 1 0,19 2104 ± 10 0,47 Nestle 1436 ± 15 1,04 299 ± 2 0,66 918 ± 16 1,74 Baron 928 ± 28 3,01 348 ± 4 1,15 1164 ± 25 2,14 Zvečevo 1320 ± 5 0,37 453 ± 2 0,44 841 ± 2 0,23 Hibbi 1068 ± 21 1,96 366 ± 3 0,82 748 ± 9 1,20 Merkator 1520 ± 12 0,79 534 ± 9 1,68 1075 ± 4 0,37 Daria 1348 ± 17 1,26 362 ± 3 0,82 790 ± 16 2,02 Simka (35%) 991 ± 16 1,61 503 ± 7 1,39 1184 ± 13 1,10 Kidy 1617 ± 10 0,61 383 ± 6 1,56 1227 ± 26 2,11 Ritter Sport 1226 ± 7 0,57 389 ± 2 0,51 631 ± 5 0,79

28

Uzorak K P

csr(mg/g) ± SD RSD (%) csr(mg/g) ± SD

RSD (%)

Bela čokolada

Weiss Blanc 2,60 ± 0,01 0,38 1,82 ± 0,01 0,55 Lindor 2,30 ± 0,02 0,87 1,36 ± 0,04 2,94 Lindt 3,05 ± 0,05 1,64 1,91 ± 0,04 2,09 Giandor 3,48 ± 0,01 0,29 2,35 ± 0,01 0,42 Prestige 3,18 ± 0,01 0,31 1,94 ± 0,02 1,03 Nestle Galak 3,86 ± 0,06 1,55 2,24 ± 0,01 0,44 Bambi 5,92 ± 0,09 1,52 1,69 ± 0,02 1,18 Milka 1,14 ± 0,02 1,75 1,79 ± 0,03 1,67 White Deluxe 3,23 ± 0,07 2,17 1,71 ± 0,04 2,33 Weisse Schokolade 3,19 ± 0,08 2,51 1,70 ± 0,03 1,76 Blanquita 3,33 ± 0,05 1,50 1,56 ± 0,01 0,64

Mlečna čokolada

Najlepše želje 6,38 ± 0,09 1,41 1,80 ± 0,03 1,67 Milka 7,9 ± 0,1 1,26 1,79 ± 0,01 0,56 Premia 6,06 ± 0,03 0,49 1,49 ± 0,01 0,67 Bambi 6,0 ± 0,1 1,66 1,61 ± 0,01 0,62 Simka 5,20 ± 0,07 1,35 1,40 ± 0,01 0,71 Schogetten 4,27 ± 0,08 1,87 1,39 ± 0,01 0,72 Alpenmilch 7,4 ± 0,1 1,35 2,25 ± 0,01 0,44 Dorina 4,43 ± 0,09 2,03 1,74 ± 0,02 1,15 Seka 4,96 ± 0,06 1,21 2,12 ± 0,01 0,47 Galeb 6,82 ± 0,03 0,44 2,27 ± 0,01 0,44 Nestle 4,64 ± 0,08 1,72 1,89 ± 0,01 0,53 Baron 6,2 ± 0,1 1,61 1,39 ± 0,01 0,72 Zvečevo 5,19 ± 0,05 0,96 2,17 ± 0,03 1,38 Hibbi 5,04 ± 0,06 1,19 1,62 ± 0,01 0,62 Merkator 7,02 ± 0,04 0,57 2,18 ± 0,01 0,46 Daria 4,57 ± 0,03 0,66 1,97 ± 0,02 1,01 Simka (35%) 5,61 ± 0,09 1,60 1,74 ± 0,02 1,15 Kidy 5,64 ± 0,05 0,88 2,32 ± 0,03 1,29 Ritter Sport 4,32 ± 0,04 0,93 1,93 ± 0,01 0,52

29

Slika 5. Sadržaj Na, Ca i Mg u uzorcima bele čokolade

Slika 6. Sadržaj Na, Ca i Mg u uzorcima mlečne čokola

Slika 7. Sadržaj K i P u uzorcima bele čokolade

30

Slika 8. Sadržaj K i P u uzorcima mlečne čokolade

Važnost mikroelemena u organizmu čoveka se ogleda u pravilnom funkcionisanju enzima. Enzimi su izgrađeni tako da sadrže organske i neorganske komponenete. Od mikroelemenata posebno su značajni gvožđe, mangang, cink, bakar. Koncentracije ispitivanjh mikroelemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade predstavljeni su tabelarno i grafički (tabela 4, slika 9 i 10). Gvožđe je sastavni deo hema u hemoglobinu i ima ulogu u vezivanju i prenošenju kiseonika iz pluća u perifernu krv. U tkivima i organima gvožđe je vezano za razne belančevine. To su hromoproteini, (hemoglobin, mioglobin, citohrom-oksidaze, peroksidaze, katalaze), flavoproteini (citohrom c-oksidaza, dehidrogenaze, oksidaze ksantina) i treća grupa belančevina koje vezuju gvožđe a koju čine transferin i feritin. U organizmu zdravih odraslih osoba nalazi se 3-5g gvožđa. Najveći deo gvožđa se nalazi u hemoglobinu, zatim u mioglobinu. Višak gvožđa se u organizmu nalazi kao rezervno gvožđe u vidu feritina i hemosiderina u makrofazima jetre, slezine i kostne srži. Sadržaj gvožđa u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu 1,19-6,39 µg/g i 5,9-37,9 µg/g. Preporučeni dnevni unos Fe (Institute of Medicine, 2001) se kreće od 0,27 mg za odojčad, 10 mg za decu od 4-8 godina, 11 mg za adolescente do 8 mg za muškarce i 18 mg za žene. Cink je sastavni deo brojnih enzima. Nužan je za deobu ćelija što znači i za rast i obnovu tkiva. Takođe, bitan je za metabolizam nukleinskih kiselina, produkciju nekih hormona, procese transporta, pravilno funkcioniranje imunološkog sistema i pravilan razvoj reproduktivnog sistema. Sadržaj cinka u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu ND-10,17 µg/g i 4,76-21,4 µg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za Zn (Institute of Medicine, 2001) se kreće od 2 mg za odojčad, 5 mg za decu od 4-8 godina, 11 mg za adolescente, 11 mg za muškarce i 8 mg za žene. Mangan je sastavni deo antioksidativnog enzima koji štiti ćelije od mogućih oštećenja uzrokovanih slobodnim radikalima. Takođe, učestvuje i u aktivaciji nekih drugih enzima. Mangan je bitan je i za detoksikaciju amonijaka i razvoj kostiju. Slučajevi deficita mangana su retki. Preporučeni dnevni unos za Mn (Institute of Medicine, 2001) se kreće od 0,003 mg za odojčad, 1,5 mg za decu od 4-8 godina, 2,2 mg za adolescente do 2,3 mg za muškarce i 1,8 mg

31

za žene. Uzorci bele i mlečne čokolade sadrže manga u koncentraciji od 0,070 do 2,979 µg/g i od 1,44 do 15,26 µg/g, respektivno. Bakar je sastavni deo enzima u organizmu koji učestvuju u stvaranju energije u ćeliji. Aktivnost ovih enzima je najveća u srcu, mozgu, jetri i bubregu. Pored toga, enzimi koji su odgovorini za stvaranje vezivnih proteina tkiva (kolagen i elastin) zahtevaju bakar. Stoga se može reći da je bakar neophodan za razvoj i održavanje krvnih sudova, kože, kostiju i zglobova. Bitan je i za metabolizam gvožđa. Sadržaj bakra u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu ND-1,37 µg/g i 1,64-14,23 µg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za Cu (Institute of Medicine, 2001) se kreće od 0,2 mg za odojčad, 0,44 mg za decu od 4-8 godina, 0,89 mg za adolescente do 0,90 mg za muškarce i žene. Bor doprinosi delovanju i resorpciji kalcijuma, magnezijuma i fosfora. Utiče na metabolizam steroidnih hormona i ima ulogu u pretvaranju vitamina D u njegov aktivni oblik. Ima važnu ulogu u očuvanju skeleta čokoveka, jer njegov nedostatak može izazvati demineralizaciju kostiju. Sadržaj bora u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu 0,45-3,84 µg/g i 0,77-12,20 µg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za B nije tačno definisan, ali maksimalno dozvoljeni dnevni unos (Institute of Medicine, 2004) se kreće od 6 mg za decu od 4-8 godina, 17 mg za adolescente do 20 mg za muškarce i žene. Kobalt je esencijalni mikroelement koji je integralni deo vitamina B12, a koji je neophodan u metabolizmu folne kiseline i masnih kiselina. Osim toga, kobalt učestvuje u proizvodnji crvenih krvnih zrnaca i ima značaj za dobro funkcionisanje nervnog sistema, jer potpomaže stvaranje mijelinskog omotača. Deficit kobalta može da izazove megaloblastičnu anemiju. Sadržaj kobalta u uzorcima mlečne čokolade se kreće od ND do 0,224 µg/g. Preporučene dnevne potrebe za kobaltom iznose 0,2 grama (Jaredić i Vučetić, 1997). Selen je neophodan oligoelement, jer je moćan antioksidans. Njegova uloga u organizmu je da štiti ćelije od oksidacije, sprečava prerano starenje kože, mišića i mozga. Učestvuje u prevenciji kardiovaskularnih bolesti i stimuliše imunitet. U jetri, on potstiče izbacivanje nekih otrova. Uključen je i u proizvodnji hormona štitne žlezde. A prema najnovijim istraživanjima selen (u kombinaciji sa vitaminom E) bi mogao da smanji opasnost od gastro-intestinalnog raka i raka prostate. Količina selena u hrani zavisi od njegovog prisustva u zemljištu. Sadržaj selena u uzorcima bele i mlečne čokolade se kreće u intervalu ND-0,17 µg/g i ND-0,23 µg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za Se (Institute of Medicine, 2000) se kreće od 15 μg za odojčad, 30 μg za decu od 4-8 godina, 55 μg za adolescente, muškarce i žene. Biloški aktivan oblik molibdena poznat je i kao molibdenov kofaktor ili Moko. Moko je kofaktor tri humana enzima: sulfit-oksidaza, ksantin-oksidaza i aldehid-oksidaza. Sulfit-oksidaza je uključena u metabolizam aminokiselina sa sumporom, ksantin-oksidaza je neophodna za oksidaciju purina i pirimidina i stvaranje mokraćne kiseline, dok je aldehid-oksidaza uključena u oksidaciju aldehida. Sadržaj molibdena u uzorcima bele i mlečne čokolade je u interval 0,058-0,170 µg/g i 0,112-0,215 µg/g. Preporučeni dnevni unos za Mo (Institute of Medicine, 2001) se kreće od 2 μg za odojčad, 22 μg za decu od 4-8 godina, 43 μg za adolescente i 45 μg za muškarce i žene. U trudnoći, preporučeni dnevni unos za Mo iznosi 50 μg.

32

Silicijum je redak elemenat i uglavnom se nalazi u vezivnom tkivu i hrskavici. Sadržaj silicijuma u uzorcima bele i mlečne čokolade se kreće u intervalu 8,3-92,2 µg/g i 6,75-55,7 µg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za Si nije određen (Institute of Medicine, 2001). Vanadijum je mikroelement koji pomaže da se stabilizuje nivo šećera u krvi. U obliku vanadijum-sulfata, lako se apsorbuje. On omogućava da šećer iz krvi ode u mišiće gde lakše može da sagori. Sadržaj vanadijuma u uzorcima bele i mlečne čokolade se kreće u intervalu 0,082-1,41 µg/g i ND-12,31 µg/g, respektivno. Preporučena dnevna doza za V nije utvrđena (Institute of Medicine, 2001). Značaj nikla za živi svet je prvi put otkrivem šezdesetih godina prošlog veka, a do tada se nikl posmatrao u smislu toksičnosti za organizam. Veće količine ovog elementa ulaze u sastav nukleinskih kiselina (naročito RNK). Smatra se da utiče na strukturu i funkciju proteina koji su povezani sa nukleinskim kiselinama. Sadržaj nikla u uzorcima bele i mlečne čokolade se kreće u intervalu ND-1,237 µg/g i 0,61-6,244 µg/g, respektivno. Hrom je bitan elemenat u tragovima, dobro poznat po svojoj funkciji u održavanju normalne količine glukoze u krvi, odnosno svoje dobre funkcije na insulinsku osetljivost. Utiče na metabolizam ugljenih hidrata, masti i proteina. Prisustvo ovog elementa u hrani uslovljena je temperatutom obrade namernica i geografskom poreklu iste. Sadržaj hroma u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu 0,12-0,38 µg/g i ND-0,376 µg/g, respektivno. Preporučeni dnevni unos za Cr (Institute of Medicine, 2001) se kreće od 0,2 μg za odojčad, 15 μg za decu od 4-8 godina, 35 μg za adolescente i 25 μg za žene i 35 μg za muškarce. Kalaj zajedno sa vandijumom učestvuje u metabolizmu masti. Neophodan je za rad svih organa. Glavni izvor kalaja je povrće. Prosečni dnevni unos Sn iznosi 4 mg (Šarkanj i sar., 2010). Sadržaj kalaja u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu od ND-1,83 µg/g i ND-0,79 µg/g, respektivno. Tabela 4. Sadržaj mikroelemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade

Uzorak Fe Zn Mn

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Bela čokolada Weiss Blanc 1,83 ± 0,03 1,64 7,17 ± 0,03 0,42 0,117 ± 0,002 1,71 Lindor 1,29 ± 0,03 2,32 5,68 ± 0,03 0,53 0,070 ± 0,002 2,86 Lindt 1,48 ± 0,01 0,67 7,15 ± 0,05 0,70 0,089 ± 0,003 3,37 Giandor 6,39 ± 0,01 0,16 10,17 ± 0,02 0,20 2,979 ± 0,002 0,07 Prestige 2,30 ± 0,01 0,43 6,43 ± 0,03 0,47 0,177 ± 0,002 1,13 Nestle Galak 4,63 ± 0,04 0,86 6,26 ± 0,03 0,48 0,272 ± 0,001 0,37 Bambi 5,26 ± 0,05 0,95 ND - 0,433 ± 0,001 0,23 Milka 1,19 ± 0,02 1,68 2,41 ± 0,03 1,24 0,076 ± 0,002 2,63 White Deluxe 6,10 ± 0,05 0,82 8,11 ± 0,06 0,74 0,263 ± 0,005 1,90 Weisse Schokolade 3,3 ± 0,1 3,03 6,99 ± 0,06 0,86 0,184 ± 0,005 2,72 Blanquita 2,80 ± 0,01 0,36 7,29 ± 0,06 0,82 0,219 ± 0,002 0,91

33

Uzorak Fe Zn Mn

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Mlečna čokolada Najlepše želje 37,9 ± 0,4 1,05 12,1 ± 0,1 0,83 3,24 ± 0,03 0,93 Milka 16,6 ± 0,1 0,60 9,9 ± 0,1 1,01 3,11 ± 0,02 0,64 Premia 20,5 ± 0,2 0,97 10,2 ± 0,1 0,98 3,99 ± 0,04 1,00 Bambi 23,9 ± 0,2 0,84 9,9 ± 0,1 1,01 2,51 ± 0,03 1,19 Simka 21,5 ± 0,2 0,93 8,9 ± 0,2 2,25 3,35 ± 0,02 0,60 Schogetten 27,0 ± 0,4 1,48 8,3 ± 0,1 1,20 2,97 ± 0,04 1,35 Alpenmilch 21,1 ± 0,1 0,47 21,4 ± 0,1 0,47 11,35 ± 0,07 0,62 Dorina 19,5 ± 0,2 1,15 10,3 ± 0,1 0,97 2,50 ± 0,01 0,40 Seka 8,7 ± 0,1 0,67 9,3 ± 0,1 1,08 15,26 ± 0,04 0,26 Galeb 22,5 ± 0,1 0,44 10,5 ± 0,1 0,95 3,93 ± 0,03 0,76 Nestle 5,9 ± 0,1 1,69 8,3 ± 0,1 1,20 1,44 ± 0,02 1,39 Baron 36,0 ± 0,3 0,83 4,8 ± 0,1 2,08 3,55 ± 0,02 0,56 Zvečevo 10,7 ± 0,1 0,93 9,7 ± 0,2 2,06 3,35 ± 0,04 1,19 Hibbi 25,9 ± 0,1 0,39 6,5 ± 0,1 1,54 2,87 ± 0,02 0,70 Merkator 31,4 ± 0,1 0,32 11,5 ± 0,2 1,74 3,64 ± 0,01 0,27 Daria 19,4 ± 0,2 1,03 9,9 ± 0,1 1,01 2,44 ± 0,03 1,23 Simka (35%) 21,2 ± 0,3 1,41 6,5 ± 0,1 1,54 3,11 ± 0,03 0,96 Kidy 16,4 ± 0,2 1,22 13,1 ± 0,1 0,76 2,79 ± 0,03 1,07 Ritter Sport 20,3 ± 0,1 0,49 10,2 ± 0,1 0,98 2,59 ± 0,01 0,39

Uzorak Cu B Co

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Bela čokolada Weiss Blanc 0,23 ± 0,02 8,69 1,5 ± 0,1 6,67 ND - Lindor 0,16 ± 0,01 6,25 1,07 ± 0,08 7,48 ND - Lindt 0,12 ± 0,01 8,33 0,91 ± 0,04 4,39 ND - Giandor 1,37 ± 0,01 0,73 3,84 ± 0,01 0,26 ND - Prestige 0,082 ± 0,007 8,54 0,97 ± 0,01 1,03 ND - Nestle Galak 0,77 ± 0,02 2,60 1,41 ± 0,02 1,42 ND - Bambi 0,60 ± 0,02 3,33 0,84 ± 0,02 2,38 ND - Milka 0,012 ± 0,001 8,33 0,45 ± 0,03 6,67 ND - White Deluxe 0,23 ± 0,02 8,70 2,09 ± 0,04 1,91 ND - Weisse Schokolade 0,17 ± 0,01 5,88 0,95 ± 0,03 3,16 ND - Blanquita ND - 1,5 ± 0,1 6,67 ND -

34

Uzorak Cu B Co

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Mlečna čokolada Najlepše želje 3,2 ± 0,03 0,94 0,77 ± 0,01 1,30 0,062 ± 0,003 4,84 Milka 3,29 ± 0,03 0,91 2,3 ± 0,1 4,35 0,045 ± 0,004 8,89 Premia 4,09 ± 0,04 0,98 2,07 ± 0,04 1,93 0,027 ± 0,001 3,70 Bambi 3,58 ± 0,03 0,84 2,49 ± 0,04 1,61 0,052 ± 0,005 0,96 Simka 3,09 ± 0,03 0,97 2,05 ± 0,02 0,97 ND - Schogetten 3,06 ± 0,06 1,96 1,97 ± 0,02 1,01 ND - Alpenmilch 14,23 ± 0,06 0,42 1,60 ± 0,04 2,5 0,224 ± 0,005 2,23 Dorina 2,95 ± 0,01 0,34 6,13 ± 0,02 0,33 0,025 ± 0,001 4,0 Seka 3,51 ± 0,02 0,57 1,64 ± 0,02 1,22 0,033 ± 0,002 6,06 Galeb 3,44 ± 0,01 0,29 1,58 ± 0,02 1,26 0,045 ± 0,003 6,67 Nestle 1,64 ± 0,03 1,83 2,08 ± 0,02 0,96 ND - Baron 2,32 ± 0,03 1,29 12,20 ± 0,01 0,08 0,042 ± 0,003 7,14 Zvečevo 3,50 ± 0,02 0,57 1,62 ± 0,01 0,62 0,028 ± 0,002 7,14 Hibbi 2,60 ± 0,02 0,77 1,77 ± 0,04 2,26 0,045 ± 0,001 2,22 Merkator 3,95 ± 0,02 0,51 1,74 ± 0,03 1,72 0,037 ± 0,003 8,12 Daria 2,69 ± 0,03 1,11 2,28 ± 0,01 0,44 0,032 ± 0,001 3,12 Simka (35%) 3,14 ± 0,03 0,95 1,50 ± 0,01 0,67 0,035 ± 0,001 2,86 Kidy 2,59 ± 0,05 1,93 1,90 ± 0,02 1,05 0,018 ± 0,001 5,56 Ritter Sport 3,03 ± 0,04 0,94 1,91 ± 0,03 1,57 0,035 ± 0,003 8,57

Uzorak Se Mo Si

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Bela čokolada Weiss Blanc ND - ND - 18,3 ± 0,4 2,19 Lindor 0,121 ± 0,008 6,61 0,100 ± 0,002 2,00 16,3 ± 0,1 0,61 Lindt ND - 0,144 ± 0,008 5,55 16,1 ± 0,1 0,62 Giandor ND - 0,166 ± 0,007 4,22 22,4 ± 0,1 0,45 Prestige ND - 0,132 ± 0,005 3,79 17,8 ± 0,1 0,56 Nestle Galak 0,17 ± 0,01 5,88 0,146 ± 0,003 2,05 10,5 ± 0,1 0,95 Bambi 0,14 ± 0,01 7,14 0,170 ± 0,003 1,76 11,3 ± 0,1 0,88 Milka ND - 0,058 ± 0,005 8,62 8,3 ± 0,2 2,41 White Deluxe ND - 0,123 ± 0,005 4,06 92,2 ± 1,1 1,19 Weisse Schokolade 0,089 ± 0,002 2,25 0,115 ± 0,008 6,96 20,4 ± 0,5 2,45 Blanquita ND - 0,118 ± 0,003 2,54 15,9 ± 0,1 0,63

35

Uzorak Se Mo Si

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Mlečna čokolada Najlepše želje 0,21 ± 0,02 9,52 0,171 ± 0,008 4,68 18,6 ± 0,1 0,54 Milka 0,19 ± 0,01 5,26 0,158 ± 0,003 1,90 16,6 ± 0,1 0,60 Premia 0,19 ± 0,01 5,26 0,144 ± 0,003 2,08 15,6 ± 0,2 1,28 Bambi ND - 0,215 ± 0,005 2,33 17,0 ± 0,1 0,59 Simka 0,19 ± 0,01 5,26 0,117 ± 0,007 5,98 11,6 ± 0,1 0,86 Schogetten ND - 0,16 ± 0,01 6,25 18,9 ± 0,3 1,59 Alpenmilch 0,21 ± 0,01 4,76 0,179 ± 0,007 3,91 13,3 ± 0,1 0,75 Dorina 0,18 ± 0,01 5,56 0,12 ± 0,01 8,33 7,4 ± 0,1 1,35 Seka 0,17 ± 0,01 5,88 0,117 ± 0,002 1,71 39,9 ± 0,3 0,75 Galeb 0,18 ± 0,01 5,56 0,112 ± 0,002 1,79 12,3 ± 0,1 0,81 Nestle 0,20 ± 0,02 9,99 0,132 ± 0,002 1,52 6,8 ± 0,1 1,47 Baron 0,16 ± 0,01 6,25 0,159 ± 0,003 1,89 55,7 ± 0,4 0,72 Zvečevo 0,17 ± 0,01 5,88 0,129 ± 0,001 0,78 41,6 ± 0,5 1,20 Hibbi 0,22 ± 0,01 4,55 0,128 ± 0,005 3,91 16,8 ± 0,1 0,60 Merkator 0,15 ± 0,01 6,67 0,164 ± 0,007 4,27 21,1 ± 0,1 0,47 Daria 0,18 ± 0,01 5,55 0,130 ± 0,005 3,85 8,6 ± 0,1 1,16 Simka (35%) 0,18 ± 0,01 5,55 0,148 ± 0,005 3,38 30,9 ± 0,4 1,29 Kidy 0,23 ± 0,02 8,69 0,13 ± 0,01 7,69 11,9 ± 0,1 0,84 Ritter Sport 0,20 ± 0,01 5,00 0,124 ± 0,003 2,42 9,1 ± 0,1 1,10

Uzorak Ni V

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Bela čokolada Weiss Blanc ND - 0,360 ± 0,005 1,39 Lindor ND - 0,312 ± 0,007 2,24 Lindt ND - 0,42 ± 0,01 2,38 Giandor ND - 1,143 ± 0,003 0,26 Prestige ND - 0,448 ± 0,005 1,12 Nestle Galak 1,237 ± 0,007 0,56 0,085 ± 0,003 3,53 Bambi 0,642 ± 0,008 1,25 0,082 ± 0,007 8,54 Milka ND - 1,41 ± 0,01 0,71 White Deluxe ND - 0,47 ± 0,01 2,13 Weisse Schokolade ND - 0,43 ± 0,02 4,65 Blanquita ND - 0,43 ± 0,01 2,32

36

Uzorak Ni

V

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Mlečna čokolada Najlepše želje 0,839 ± 0,007 0,83 ND - Milka 1,19 ± 0,01 0,84 1,04 ± 0,04 3,85 Premia 0,89 ± 0,01 1,12 0,99 ± 0,03 3,03 Bambi 2,385 ± 0,003 0,13 0,88 ± 0,03 3,41 Simka 1,369 ± 0,008 0,58 0,96 ± 0,03 3,12 Schogetten 1,089 ± 0,005 0,46 0,88 ± 0,03 3,10 Alpenmilch 3,80 ± 0,05 1,32 7,54 ± 0,02 2,65 Dorina 1,442 ± 0,008 0,55 0,97 ± 0,03 3,09 Seka 0,80 ± 0,02 2,50 1,39 ± 0,03 2,16 Galeb 0,837 ± 0,007 0,84 1,46 ± 0,05 3,42 Nestle 6,244 ± 0,002 0,03 0,91 ± 0,01 1,11 Baron 0,895 ± 0,007 0,78 0,98 ± 0,01 1,02 Zvečevo 0,827 ± 0,007 0,85 1,37 ± 0,06 4,38 Hibbi 0,797 ± 0,003 0,38 1,06 ± 0,07 6,60 Merkator 0,826 ± 0,01 1,21 1,26 ± 0,07 5,55 Daria 0,626 ± 0,005 0,80 1,26 ± 0,02 1,59 Simka (35%) 0,91 ± 0,01 1,10 1,20 ± 0,01 0,83 Kidy 0,61 ± 0,01 1,64 11,93 ± 0,04 0,33 Ritter Sport 0,686 ± 0,007 1,02 12,31 ± 0,02 0,16

Uzorak Cr Sn

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Bela čokolada Weiss Blanc 0,13 ± 0,01 7,69 0,25 ± 0,01 4,00 Lindor 0,14 ± 0,01 7,14 ND - Lindt 0,12 ± 0,01 8,33 0,26 ± 0,01 3,85 Giandor 0,20 ± 0,01 5,01 ND - Prestige 0,19 ± 0,01 5,26 ND - Nestle Galak 0,15 ± 0,01 6,67 1,83 ± 0,01 0,55 Bambi 0,13 ± 0,01 7,69 ND - Milka 0,24 ± 0,01 4,17 ND - White Deluxe 0,37 ± 0,03 8,11 0,035 ± 0,001 2,86 Weisse Schokolade 0,38 ± 0,03 7,89 ND - Blanquita 0,37 ± 0,03 8,11 ND -

37

Uzorak Cr Sn

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Mlečna čokolada Najlepše želje 0,31 ± 0,01 3,23 0,79 ± 0,02 2,53 Milka ND - 0,33 ± 0,02 6,06 Premia 0,23 ± 0,01 4,35 0,27 ± 0,01 3,70 Bambi 0,30 ± 0,01 3,33 0,19 ± 0,01 5,26 Simka 0,15 ± 0,01 6,67 ND - Schogetten 0,38 ± 0,02 5,26 0,5 ± 0,03 6,00 Alpenmilch 0,16 ± 0,01 6,25 0,61 ± 0,01 1,64 Dorina 0,27 ± 0,01 3,70 0,13 ± 0,01 7,69 Seka 0,18 ± 0,01 5,56 0,15 ± 0,01 6,67 Galeb 0,27 ± 0,01 3,70 0,084 ± 0,002 2,38 Nestle 0,14 ± 0,01 7,14 0,11 ± 0,01 9,09 Baron 0,34 ± 0,01 2,94 0,109 ± 0,003 2,75 Zvečevo 0,15 ± 0,01 6,67 0,090 ± 0,005 5,55 Hibbi 0,26 ± 0,01 3,85 0,19 ± 0,01 5,26 Merkator 0,36 ± 0,01 2,78 0,12 ± 0,01 8,33 Daria 0,34 ± 0,01 2,94 0,14 ± 0,01 7,14 Simka (35%) 0,38 ± 0,02 5,26 0,18 ± 0,01 5,55 Kidy 0,19 ±0,01 5,26 0,17 ± 0,01 5,88 Ritter Sport 0,28 ± 0,01 3,57 0,104 ± 0,008 7,69

38

Slika 9. Sadržaj mikroelemenata u uzorcima bele čokolade

39

Slika 10. Sadržaj mikroelemenata u uzorcima mlečne čokolade

40

Teški metali kojima je hrana najčešće kontaminirana su olovo, kadmijum i arsen. Propis koji reguliše sadržaj toksičnih metala u većini namirnica je Pravilnik o kličinama pesticida, metala i metaloida i drugih otrovnih supstancija, hemioterapeutika, anabolika i drugih supstancija koje se mogu nalaziti u namirnicama, objavljen u Službenom glasniku Republike Srbije br. 25/2010 i 28/2011. Maksimalne dozvoljene koncentracije olova, kadmijuma i arsena u čokoladi su: 1 mg/kg, 0,02 mg/kg i 0,5 mg/kg, respektivno. Svetska zdravstvena organizacija (2001) (World Health Organization, WHO) je propisala MDK za Pb, Cd i As u čokoladi 1 mg/kg, 0,05 mg/kg i 0,5 mg/kg, respektivno. Olovo je u beloj čokoladi detektovan u jednom uzorku u koncentraciji od 0,408 µg/g, a u mlečnoj čokoladi je u intervalu ND-0,783 µg/g. Sadržaj kadmijuma u uzorcima bele i mlečne čokolade je u intervalu 0,013-0,022 µg/g, i ND-0,028 µg/g, respektivno. Sadržaj arsena je u intervalu od 0,23-0,41 µg/g i 0,13-0,20 µg/g. Koncentracije neesencijalnih elemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade prikazane su u tabeli 5 i na slikama 11 i 12. Olovo se može naći u hrani prilikom njene proizvodnje, distribucije ili skladištenja. Ono se taloži u kostima i manjim delom u jetri, bubrezima i mekim tkivima. Kadmijum u hranu dolazi iz prirodnih izvora. Riža i pšenica mogu akumulirati kadmijum iz zemlje. U organizmu on može da zameni cink, kalijum i kalcijum, pa ga je teško ukloniti. Arsen je manje toksičan od ostalih teških metala. Arsen koji je vezan u organska jedinjenja (As5+) i elementarni arsen nisu toksični za razliku od neorganskog trovalentnog arsena (As3+) (Šarkanj i sar., 2010). Pregledom literaturnih podataka, koncentracije kadmijuma, olova i arsena u mlečnoj čokoladi su veće od vrednosti čokolade koja se nalazi na tržištu Srbije. Koncentracija kadmijuma, olova i arsena se kreće u intervalu 0,01-0,42 µg/g, 0,23-1,94 µg/g I 0,83-1,28 µg/g, respektivno (Lee i Low, 1985; Dahiya i sar., 2005).

41

Tabela 5. Sadržaj neesencijalnih metala u uzorcima bele i mlečne čokolade

Uzorak Al As Ba

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Bela čokolada Weiss Blanc 3,25 ± 0,03 0,92 0,26 ± 0,01 3,85 0,323 ± 0,003 0,93 Lindor 2,97 ± 0,04 1,35 0,24 ± 0,01 4,17 0,281 ± 0,005 1,78 Lindt 2,86 ± 0,05 1,75 0,27 ± 0,01 3,70 0,247 ± 0,002 0,81 Giandor 3,21 ± 0,03 0,93 0,27 ± 0,02 7,41 0,753 ± 0,003 0,40 Prestige 2,63 ± 0,04 1,52 0,27 ± 0,02 7,41 0,301 ± 0,002 0,66 Nestle Galak 2,99 ± 0,04 1,34 0,23 ± 0,01 4,35 1,559 ± 0,007 0,45 Bambi 2,88 ± 0,02 0,69 0,23 ± 0,02 8,69 0,607 ± 0,007 1,15 Milka 1,51 ± 0,04 2,65 0,25 ± 0,01 4,00 0,261 ± 0,002 0,77 White Deluxe 22,3 ± 0,3 1,34 0,29 ± 0,02 6,90 0,518 ± 0,007 1,35 Weisse Schokolade 5,0 ± 0,1 2,00 0,31 ± 0,02 6,45 0,482 ± 0,003 0,62 Blanquita 2,69 ± 0,01 0,37 0,41 ± 0,04 9,76 0,399 ± 0,003 0,75

Mlečna čokolada Najlepše želje 13,5 ± 0,1 0,74 0,13 ± 0,01 7,69 1,12 ± 0,01 0,89 Milka 8,6 ± 0,1 1,16 0,15 ± 0,01 6,67 0,92 ± 0,01 1,09 Premia 10,8 ± 0,1 0,93 0,14 ± 0,01 7,14 1,06 ± 0,01 0,94 Bambi 10,1 ± 0,1 0,99 0,13 ± 0,01 7,69 1,07 ± 0,01 0,93 Simka 7,5 ± 0,1 1,33 0,14 ± 0,01 7,14 0,82 ± 0,01 1,22 Schogetten 11,4 ± 0,2 1,75 0,13 ± 0,01 7,69 1,35 ± 0,01 0,74 Alpenmilch 9,3 ± 0,1 1,07 0,20 ± 0,01 5,00 3,87 ± 0,01 0,26 Dorina 5,1 ± 0,1 1,96 0,15 ± 0,01 6,67 0,83 ± 0,01 1,20 Seka 3,7 ± 0,1 2,70 0,14 ± 0,01 7,14 1,23 ± 0,02 1,63 Galeb 9,8 ± 0,1 1,02 0,13 ± 0,01 7,69 1,20 ± 0,02 1,67 Nestle 3,3 ± 0,1 2,94 0,14 ± 0,01 7,14 5,16 ± 0,03 0,58 Baron 20,1 ± 0,2 0,99 0,15 ± 0,01 6,67 1,18 ± 0,01 0,85 Zvečevo 4,3 ± 0,1 2,33 0,16 ± 0,01 1,40 1,21 ± 0,02 1,65 Hibbi 12,9 ± 0,1 0,78 0,13 ± 0,01 7,69 4,00 ± 0,05 1,25 Merkator 18,7 ± 0,2 1,07 0,16 ± 0,01 6,25 1,74 ± 0,02 1,15 Daria 4,8 ± 0,1 2,08 0,14 ± 0,01 7,14 0,96 ± 0,01 1,04 Simka (35%) 10,7 ± 0,1 0,93 0,14 ± 0,01 7,14 1,43 ± 0,01 0,70 Kidy 7,4 ± 0,1 1,37 0,15 ± 0,01 6,54 1,00 ± 0,08 8,00 Ritter Sport 8,2 ± 0,1 1,22 0,16 ± 0,01 6,25 1,26 ± 0,01 0,79

42

Uzorak Cd Li Pb

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Bela čokolada Weiss Blanc 0,017 ± 0,001 5,88 2,53 ± 0,03 1,19 ND - Lindor 0,017 ± 0,001 5,88 2,36 ± 0,03 1,27 ND - Lindt 0,020 ± 0,002 9,05 3,29 ± 0,05 1,52 ND - Giandor 0,013 ± 0,001 7,69 0,665 ± 0,003 0,45 ND - Prestige 0,018 ± 0,001 5,56 2,98 ± 0,01 0,33 ND - Nestle Galak 0,019 ± 0,001 5,26 1,256 ± 0,003 0,24 0.408 ± 0.008 1,96 Bambi 0,022 ± 0,002 9,09 1,23 ± 0,02 1,63 ND - Milka 0,020 ± 0,002 9,37 0,43 ± 0,02 4,65 ND - White Deluxe 0,018 ± 0,001 5,56 0,325 ± 0,005 1,54 ND - Weisse Schokolade 0,019 ± 0,001 5,25 1,14 ± 0,03 2,63 ND - Blanquita 0,017 ± 0,001 5,88 1,860 ± 0,008 0,43 ND -

Mlečna čokolada Najlepše želje 0,017 ± 0,001 5,88 1,23 ± 0,01 0,81 ND - Milka ND - 2,75 ± 0,03 1,09 ND - Premia 0,019 ± 0,001 5,26 1,42 ± 0,03 2,11 0,12 ± 0,01 8,33 Bambi 0,018 ± 0,001 5,56 1,54 ± 0,03 1,95 ND - Simka 0,020 ± 0,002 9.17 1,31 ± 0,01 0,76 ND - Schogetten 0,021 ± 0,002 9,52 1,04 ± 0,01 0,96 ND - Alpenmilch 0,020 ± 0,002 8,74 1,28 ± 0,01 0,78 0,26 ± 0,02 7,69 Dorina 0,020 ± 0,001 5,00 1,82 ± 0,02 1,10 ND - Seka 0,021 ± 0,001 4,76 1,48 ± 0,04 2,70 0,783 ± 0,002 0,25 Galeb 0,018 ± 0,001 5,55 1,56 ± 0,02 1,28 0,087 ± 0,005 5,75 Nestle 0,020 ± 0,002 10,00 1,50 ± 0,02 1,33 0,085 ± 0,002 2,35 Baron 0,018 ± 0,001 5,56 2,79 ± 0,03 1,07 0,15 ± 0,01 6,67 Zvečevo 0,023 ± 0,001 4,35 1,91 ± 0,03 1,57 0,068 ± 0,005 7,35 Hibbi 0,021 ± 0,002 9,52 1,27 ± 0,01 0,79 0,19 ± 0,01 5,26 Merkator 0,015 ± 0,002 6,67 1,87 ± 0,02 1,07 0,21 ± 0,01 4,76 Daria 0,009 ± 0,001 11,1 3,67 ± 0,04 1,09 0,077 ± 0,005 6,49 Simka (35%) 0,028 ± 0,002 7,14 2,61 ± 0,03 1,15 0,064 ± 0,005 7,81 Kidy 0,027 ± 0,002 7,41 1,24 ± 0,01 0,81 0,12 ± 0,01 8,33 Ritter Sport 0,022 ± 0,001 4,55 1,23 ± 0,01 0,81 0,21 ± 0,01 4,76

43

Uzorak Sb Sr

csr(µg/g) ± SD RSD (%) csr(µg/g) ± SD

RSD (%)

Bela čokolada Weiss Blanc 3,27 ± 0,05 1,53 0,943 ± 0,007 0,74 Lindor 2,91 ± 0,02 0,69 0,680 ± 0,007 1,03 Lindt 2,89 ± 0,02 0,69 0,705 ± 0,005 0,71 Giandor 4,00 ± 0,03 0,75 2,571 ± 0,005 0,19 Prestige 3,23 ± 0,01 0,31 0,854 ± 0,007 0,82 Nestle Galak 1,76 ± 0,01 0,57 0,664 ± 0,007 1,05 Bambi 1,92 ± 0,02 1,04 0,82 ± 0,01 1,22 Milka 1,53 ± 0,02 1,31 0,60 ± 0,02 3,33 White Deluxe 17,1 ± 0,1 0,58 1,16 ± 0,02 1,72 Weisse Schokolade 3,8 ± 0,1 2,63 0,81 ± 0,02 2,47 Blanquita 2,89 ± 0,03 1,04 0,79 ± 0,01 1,26

Mlečna čokolada Najlepše želje 3,34 ± 0,02 0,60 2,23 ± 0,01 0,45 Milka 2,88 ± 0,03 1,04 1,66 ± 0,02 1,20 Premia 2,78 ± 0,03 1,08 1,91 ± 0,02 1,05 Bambi 3,08 ± 0,03 0,97 1,77 ± 0,01 0,56 Simka 2,12 ± 0,02 0,94 1,47 ± 0,01 0,68 Schogetten 3,53 ± 0,02 0,57 1,73 ± 0,03 1,73 Alpenmilch 2,37 ± 0,01 0,42 5,39 ± 0,02 0,37 Dorina 1,38 ± 0,02 1,45 1,62 ± 0,01 0,62 Seka 7,4 ± 0,2 2,70 2,00 ± 0,02 1,00 Galeb 2,24 ± 0,04 1,78 2,07 ± 0,01 0,48 Nestle 1,23 ± 0,01 0,81 1,48 ± 0,02 1,35 Baron 10,01 ± 0,03 0,30 1,65 ± 0,01 0,61 Zvečevo 7,5 ± 0,1 1,33 2,04 ± 0,02 0,98 Hibbi 2,99 ± 0,05 1,67 1,97 ± 0,01 0,51 Merkator 3,69 ± 0,05 1,35 2,50 ± 0,01 0,40 Daria 1,5 ± 0,03 2,00 1,61 ± 0,02 1,24 Simka (35%) 5,42 ± 0,01 0,18 1,64 ± 0,02 1,22 Kidy 2,07 ± 0,02 0,97 1,85 ± 0,02 1,08 Ritter Sport 1,39 ± 0,03 2,16 1,66 ± 0,01 0,60

44

Slika 11. Sadržaj neesencijalnih elemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade

45

Slika 12. Sadržaj neesencijalnih elemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade

Faktorska analiza je metod multivarijantne analize i upotrebljava se kada se želi da opiše međusobna zavisnost većeg broja varijabli, korišćenjem manjeg broja osnovnih, latentnih varijabli koje su poznate kao faktori. U slučaju određivanja makro i mikroelemenata u uzorcima bele i mlečne čokolade faktorkska analiza je korišćenja u diferencijaciji ispitivanih uzoraka na osnovu sadržaja metala. Primenom metoda glavnih komponenti, ekstrahovani su faktori, tj, glavne komponente. Broj optimalnih faktora koji je korišćen u analizi izabran je na osnovu kriterijuma tačke preloma na Cattelovom scree testu. Na osnovu ovog testa, kriterijum za određivanje broja faktora predstavlja tačka u kojoj karakteristične vrednosti formiraju silazni trend, tzv. tačku preloma (slika 13). Karakterisitčne vrednosti su varijanse glavnih komponenata. Broj karakterističnih vrednosti u ovom slučaju je 8. Broj ekstrahovanih faktora, kao i nivo njihovog varijabiliteta dat je u tabeli 6. Na osnovu podataka iz tabele može se videti da svi ekstrahovani faktori zajedno objašnjavaju 84,05% varijanse. S druge strane, prva dva faktora objašnjavaju zajedno 45,64% disprezije merenja. Prvim faktorom je objašnjeno 32,28%, a drugim 13,36% disperzije posmatranih merenja.

46

32.28%

13.36%

9.23%

7.25%

7.03%

6.11%

4.61%

4.18%

-5 0 5 10 15 20 25 30

Redni broj karakteristične vrednosti

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Kar

akte

ristič

na v

redn

ost

32.28%

13.36%

9.23%

7.25%

7.03%

6.11%

4.61%

4.18%

Slika 13. Dijagram karakteristične vrednosti za kriterijum scree testa

Tabela 6. Ekstrahovani faktori na osnovu scree testa Redni broj

karakterisitčne vrednosti

Karakterisitčna vrednost

Ukupna varijansa

(%)

Kumulativna karakteristična

vrednost

Kumulativna varijansa

(%) 1 8,39 32,28 8,39 32,28 2 3,47 13,36 11,87 45,64 3 2,40 9,23 14,27 54,87 4 1,88 7,25 16,15 62,12 5 1,83 7,03 17,98 69,15 6 1,59 6,11 19,57 75,26 7 1,20 4,61 20,77 79,87 8 1,09 4,18 21,85 84,05

Nakon utvrđivanja broja faktora, određena je matrica faktorske strukture izldvojenih faktora, korišćenjem Varimax kriterijuma. Matrica faktorske strukture koja je data u tabeli 7 i tabeli 8 sadrži faktorska opterećenja koja predočavaju koeficijente korelacije između izldvojenih faktora i varijabli (makro i mikroelementi) i između izdvojenih faktora i slučajeva (uzorci bele i mlečne čokolade). Faktorska opterećenja ukazuju na važnost svake varijable za pojedini faktor.

47

Tabela 7. Matrica faktorske strukture (makro i mikroelementi)

Factor Loadings (Varim ax normalized)Extraction: Principal components(Marked loadings are >.500000)

VariableFactor

1Factor

2Factor

3Factor

4Factor

5Factor

6Factor

7Factor

8CaKNaMgPZnFeSeCuMoCrMnNiVSiLiSrAlSnAsCdBaPbSbCoB

-0.152049 -0.183408 -0.159160 -0.129708 -0.336478 0.793616 -0.110887 -0.0218280.643822 0.032064 0.531282 0.132214 0.208889 0.350482 0.128947 -0.066811

-0.133084 -0.119169 0.347284 -0.120674 0.169249 0.751195 0.060506 0.0054540.790721 -0.057337 0.561018 0.068081 0.054296 0.179708 -0.001911 0.0349780.532486 0.040188 -0.015592 -0.011744 -0.608660 0.154018 0.184229 0.3715450.875305 0.066159 -0.005695 0.164917 -0.061761 0.038888 -0.017570 0.1873690.573156 -0.003333 0.525755 -0.002405 0.638854 0.079435 0.054914 -0.0043210.321429 0.212178 0.706653 0.167183 0.007706 -0.042924 0.132168 0.2213520.887484 0.057491 0.175091 0.242158 0.085331 -0.204547 0.087920 0.0144510.563189 -0.008766 0.076613 0.203517 0.323963 0.419585 0.319998 -0.1410060.037767 -0.238644 -0.207670 -0.171892 0.651888 -0.054502 -0.048973 0.2072940.688844 -0.251175 0.312979 0.030692 -0.184699 -0.339403 0.174391 0.0699440.251430 0.145805 0.191309 0.891892 -0.005301 -0.056908 0.087623 -0.0172540.426355 0.238252 0.119287 -0.065536 -0.090092 -0.155290 -0.218881 0.638802

-0.014518 -0.963216 -0.046248 -0.085578 0.105834 0.076995 -0.052164 0.0046170.053202 0.166261 0.136222 -0.229703 -0.142973 -0.018591 -0.163854 -0.7250210.919451 -0.055163 0.103587 0.263791 0.034715 -0.095245 0.014198 0.0993630.267690 -0.552400 0.259969 0.025833 0.619702 0.209777 -0.007629 0.0919640.082471 0.145856 0.045261 0.074852 -0.033623 0.026153 0.881467 0.016096

-0.264483 -0.070912 -0.882795 -0.172981 -0.175312 0.017656 -0.011417 0.0387480.001581 0.131918 -0.730464 -0.148304 0.250910 -0.091630 -0.019405 0.2011900.288719 0.046463 0.224643 0.808431 0.051442 -0.200648 0.144470 0.1306310.264113 -0.255006 0.301579 -0.042055 -0.309256 -0.402625 0.533142 0.245805

-0.019182 -0.966031 -0.054380 -0.080282 0.103286 0.075167 -0.054112 0.0053120.874676 0.030913 0.061081 0.188128 0.091981 -0.200514 0.109120 -0.0419480.203583 0.015765 0.052149 0.926256 -0.155999 0.040223 -0.080125 0.091890

Analizirajući varijable i faktorska opterećenja uočava se da pojedine varijable koreliraju sa nekoliko faktora, a analiza faktora pokazuje da je prvi faktor definisan visokim faktorskim opterećenjima većeg broja varijabli. Prvi faktor opisuju Sr, Zn, Co, Cu i Mg sa visokim faktorskim zasićenjem (> 0,7) i K, P, Fe i Mn sa nižim zasićenjem (> 0,5). Drugi faktor opisuju Sb i Si sa visokim faktorskim zasićenjima (> 0,7) i Al sa nešto nižim faktorskim zasićenjem (> 0,5). Treći faktor opisuju As, Cd i Se (> 0,7) i K i Fe (> 0,5). Četvrti faktor opisuju Ni, Ba i B (> 0,7), peti P, Fe, Cr i Al (> 0,5), šesti Ca i Na (> 0,7), sedmi Sn (> 0,7) i Pb (> 0,5) i osmi Li (> 0,7) i V (> 0,5).

48

Tabela 8. Matrica faktorske strukture (uzorci bele i mlečne čokolade)

Factor Scores Rotation: Varimax normalizedExtraction: Principal components

CaseFactor

1Factor

2Factor

3Factor

4Factor

5Factor

6Factor

7Factor

8Weiss Blanc (b)Lindor (b)Lindt (b)Giandor (b)Prestige (b)Nestle Galak (b)Bambi (b)Milka (b)White Deluxe (b)Weisse Scho (b)Blanquita (b)Najlepše želje (m)Milka (m)Premia (m)Bambi (m)Simka (m)Schogetten (m)Alpenmilch (m)Dorina (m)Seka (m)Galeb (m)Nestle (m)Baron (m)Zvečevo (m)Hibbi (m)Merkator (m)Daria (m)Simka (m-35%)Kidy (m)Ritter Sport (m)

-0.80023 0.009489 -0.55455 -0.484765 -1.41357 -0.76463 -0.935076 -0.67238-1.05098 -0.291339 -0.11180 -0.307287 -0.52114 -0.80291 -0.753491 -1.01102-0.25538 -0.325300 -1.02382 -0.583076 -1.18087 0.59106 0.024092 -1.600820.62076 0.357344 -1.36408 0.172378 -1.30531 1.15022 -0.488771 0.55917

-0.27350 -0.170107 -0.95226 -0.562474 -0.96043 0.27225 -0.514983 -1.24428-1.21785 -0.580255 -0.10735 0.034869 -0.80431 0.07486 4.484937 0.57780-1.05390 -0.580209 0.32869 -0.058646 -0.34977 1.31222 0.214893 -0.24007-1.62822 -0.542062 -0.49848 -0.337681 0.08427 -2.13757 -0.410963 0.82953-0.72360 3.932675 -1.00313 0.326865 0.37448 1.23510 -0.501776 1.09315-0.57685 -0.244288 -1.63052 -0.410058 0.74117 0.14433 -0.131725 0.83572-0.19451 -0.666724 -2.98816 -0.549669 1.09720 -0.11351 0.078293 0.125980.71454 -0.264391 0.34001 -0.162211 1.12245 1.38744 1.075471 0.052200.53215 -0.427711 1.23217 -0.188066 -0.80969 1.57063 -0.069097 -1.434310.16896 -0.232608 0.84298 -0.093155 0.67284 0.39468 0.136095 -0.033600.44809 -0.257106 -0.33251 0.511549 1.20476 0.96687 0.282148 -0.856840.44434 -0.572003 0.99348 0.090046 0.49887 -0.21914 -0.691882 -0.087420.27619 -0.014988 -0.16138 0.228601 1.73257 -0.62901 0.513755 -0.275043.91827 -0.269771 -1.27223 1.525069 -0.33899 -1.58457 0.486101 -0.116230.04586 -0.792679 0.47088 -0.088352 0.29646 -0.45676 -0.522733 -0.269830.59566 1.993599 1.14297 -0.868560 -2.07845 -1.80120 1.187899 0.362280.50957 -0.319144 1.03388 -0.476552 -0.22833 1.52946 -0.328242 0.74327

-1.18591 -0.360967 0.38911 4.633696 -0.81140 0.15967 -0.594298 0.273160.09143 1.707849 1.04245 -0.202405 1.80187 -0.79218 -0.076822 -1.157010.43413 0.851877 0.39232 -0.132218 -1.05504 -0.18259 -0.504039 -0.30070

-0.41743 0.032586 1.00846 0.627315 0.98481 -1.11154 0.250051 0.331801.05192 0.288628 0.20533 -0.274638 0.84226 0.66739 0.149052 0.330650.35244 -0.741129 0.58497 -0.695356 -0.06227 -0.48515 -0.501590 -1.230050.13923 0.330207 0.74628 -0.231002 0.99100 -0.40704 -0.158475 -0.644270.46242 -0.862432 0.83725 -0.759911 -0.79800 0.78073 -0.853526 2.618870.28805 -0.989041 0.40907 -0.684305 0.27252 -0.74910 -0.845299 2.44029

49

Weiss Blanc (b)

Lindor (b)

Lindt (b)

Giandor (b)

Prestige (b)

Nestle Galak (b)

Bambi (b)

Milka (b)

White Deluxe (b)

Weisse schokolade (b)

Blanquita (b)

Najlepše želje (m)

Milka (m)

Premia (m)Bambi (m)

Simka (m)

Schogoten (m)

Alpenmilch (m)

Dorina (m)

Seka (m)

Galeb (m)

Nestle (m)

Baron (m)

Zvečevo (m)

Hibbi (m)

Merkator (m)

Daria (m)

Simka (m-35%)

Kidy (m)

Ritter Sport (m)

-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

F1: 32.28%

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

F2: 1

3.36

%

Weiss Blanc (b)

Lindor (b)

Lindt (b)

Giandor (b)

Prestige (b)

Nestle Galak (b)

Bambi (b)

Milka (b)

White Deluxe (b)

Weisse schokolade (b)

Blanquita (b)

Najlepše želje (m)

Milka (m)

Premia (m)Bambi (m)

Simka (m)

Schogoten (m)

Alpenmilch (m)

Dorina (m)

Seka (m)

Galeb (m)

Nestle (m)

Baron (m)

Zvečevo (m)

Hibbi (m)

Merkator (m)

Daria (m)

Simka (m-35%)

Kidy (m)

Ritter Sport (m)

Slika 14. Dijagram rasipanja Dobijeni rezultati za multielementu analizu uzorka mlečne i bele čokolade mogu da se posmatraju i u koordinatnoj ravani čije su koordinatne ose ekstrahovani faktori. Dijagram rasipanja prikazan na slici 14 uzima u obzir prva dva faktora koji objašnjavaju zajedno 45,64% disprezije merenja (F1-F2 45,64%; F1-F3 41,51%; F1-F4 39,53%; F1-F5 39,31%; F1-F6 38,39%; F1-F7 36,89%; F1-F8 36,56%). Iz vizuelnog pregleda slike 14, dobijene na osnovu podataka iz tabele 8, očigledno je da postoje dva klastera varijabli. Uzorci mlečne čokolade (osim Hibbi) su grupisani u pozitivnom delu faktorskih skorova prvog faktora, a uzorci bele čokolade (osim White Deluxe i Weiss Blanc) su grupisani u negativnom delu faktorskih skorova prvog faktora i drugog faktora. Slična diferencijacija ispitivanih uzoraka čokolade, na osnovu elementne analize, dobija se i kada se posmatra 3D dijagram rasipanja (slika 15) čije su koordinatne ose prva tri faktora koji zajedno objašnjavaju 54,87% ukupne varijanse (F1-F2-F3 54,87%; F1-F2-F4 52,89%; F1-F2-F5 52,67%; F1-F2-F6 51,75%; F1-F2-F7 50,25%; F1-F2-F8 49,82%).

50

-3-2

-10

12

34

5

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

-4-3

-2-1

01

2

F3

F2F1

Ritter Sport (m)

Bambi (m)

Najlepše želje (m)

Schogetten (m)

White Deluxe (b)

Blanquita (b)

Giandor (b)Alpenmilch (m)

Merkator (m)

Kidy (m)Baron (m)Hibbi (m) Milka (m)

Lindor (b)Milka (b)

Weisse scho (b)

Premia (m)Simka (m)

Lindt (b)Prestige (b)

Nestle Galak (b)

Bambi (b)

Galeb (m)Simka (m)Bambi (b) Dorina (m)

Seka (m)

Nestle (m)Zveèevo (m)

Daria (m)

Slika 15. 3D dijagram rasipanja

51

5. ZAKLJUČAK

52

U ovom radu je određen sadržaj 26 elemenata u 30 uzoraka bele i mlečne čokolade, metodom optičke emisione spektrometrije, koja kao izvor pobuđivanje koristi indukovano spegnutu plazmu. Od makroelemenat u uzorcima bele i mlečne čokolade najzastupljenij su K, P, potom slede, Ca, Mg, Na. Od mikroelemenata najzastupljeniji su: Fe, Zn, Mn, Cu, B, Si. U pogledu sadržaja teških metala (As, Cd, Pb), može se zaključiti da su koncentracije arsena i olova u svim uzorcima ispod MDK propisanih domaćom zakonskom regulativom, kao i od strane Svetske zdravstvene organizacije. Koncentracija Cd je u nekoliko uzoraka mlečne čokolade na granici i nešto iznad propisanih MDK vrednosti od strane domaće regulative, ali ispod preporučene vrednosti od strane Svtske zdravstvene organizacije. Faktorska analiza, kao jedna od metoda multivarijantne analize, poslužila je u diferencijaciji ispitivanih uzoraka na osnovu sadržaja metala, na vrlo jednostavan i razumljiv način. Sa dijagrama rasipanja može se zaključiti da postoje dva klastera varijabli. Uzorci mlečne čokolade su grupisani u pozitivnom delu faktorskih skorova prvog faktora, a uzorci bele čokolade su grupisani u negativnom delu faktorskih skorova prvog i drugog faktora.

53

6. LITERATURA

54

Antić-Jovanović, A., Atomska spektroskopija, spektrohemijski aspekti, Fakultet za fizičku hemiju, Beograd, 2006.

Dahyia, S., Karpe, R., Hegde, A. G., Sharma, R. M., Lead, cadmium and nickel in chocolates and candies from suburban areas of Mumbai, India, Journal of Food Composition and Analysis, 18, 517–522, 2005.

Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization (FAO/WHO), Draft Standards for Chocolates and Chocolate products. Joint FAO/WHO Standards Programme. CODEX Committee on Cocoa Products and Cocoa Chocolates, 19th Session, 3–5 October 2001, Fribourg, Switzerland, CX/CPC 01/3, 2001. Hair, F. J., Anderson, E. R., Tatham, L. R., Black, C. W., Multivariate Data Analysis, 5th Ed., Prentice-Hall International, Inc., 1998. Institute of Medicine, Dietry reference intakes for calcium, phosphorus, magnesium, vitamin D, and fluoride, National Academy of Science, 1997. www.nap.edu Institute of Medicine, Dietry reference intakes for vitamin C, vitamin E, selenium and carotenoids, National Academy of Science, 2000. www.nap.edu Institute of Medicine, Dietry reference intakes for vitamin A, vitamin K, arsenic, boron, chromium, copper, iodine, iron manganese, molybdenum, nickel, silicon, vanadium, and zinc, National Academy of Science, 2001. www.nap.edu Institute of Medicine, Dietry reference intakes for water, potassium, sodium, chloride and sulfate, National Academy of Science, 2004. www.nap.edu Jaredić, M., Vučetić, J.I., Mikroelementi u biološkom materijalu, Studentski trg, Beograd, 1997. Kovačić, J. Z., Multivarijaciona analiza, Ekonomski fakultet, Beograd, 1994. Leggli, C.V.S., Bohrer, D., do Nascimento, P.C., de Carvalho, L.M., Determination of sodium, potassium, calcium, magnesium, zinc and iron in emulsified chocolate samples by flame atomic absorption spectrometry, Food Chemistry, 124, 1189-1193, 2011. Leggli, C.V.S., Bohrer, D., Nascimento, P.C., Carvalho, L.M., Gobo, L.A., Determination of aluminum, copper and manganese content in chocolate samples by grapgite furnace atomic absorption spectrometry using a microemulsion technique, Journal of Food Composition and Analysis, 24, 465-468, 2011.

55

Lee, C.K., Low, K.S., Determination of cadmium, lead, copper and arsenic in raw cocoa, semi-finished and finished chocolate products, Pertanika, 8, 243-248, 1985. Pravilnik o kličinama pesticida, metala i metaloida i drugih otrovnih supstancija, hemioterapeutika, anabolika i drugih supstancija koje se mogu nalaziti u namirnicama, Službeni glasnik Republike Srbije br. 25/2010 i 28/2011. Šarkanj, B., Kipčić, D., Vasić-Rački, Đ., Delaš, F., Galić, K., Katalenić, M., Dimitrov, N., Klapec, T., Kemijske i fizikalne opasnosti u hrani, Hrvatska agencija za hranu (HAH), Osijek, 2010. Todorović, M., Đorđević, P., Antonijević, V., Optičke metode instrumentalne analize, Hemijski fakultet, Beograd, 1997. http://www.vasezdravlje.com/izdanje/clanak/943/

http://plavi.bigforumpro.com/t111-cokolada

http://zdravljeiprehrana.bloger.index.hr/post/povijest-i-sastav-cokolade/17209671.aspx

http://www.tehnologijahrane.com/tehnologija-konditora/cokolada#toc-1osnovni-pojmovi-i-podela-okolade

http://nutricionisti.org/index.php?view=article&id=64:minerali http://www.organvlasti.com/20090721610/zdravlje/ishrana-i-dijete/minerali-u-ishrani.html

http://www.cecra.dh.pmf.uns.ac.rs/pdf/drugiseminar/priprema_Maletic.pdf

http://glasswarechemical.com/category/scientific-instrument/