18e Congrès de pneumologie de langue francaise — Marseille, 31 janvier au 2 février 2014 A199

J. Mouroux , M. Poudenx , J. Mazières , C. Hugo Marquette ,P. HofmanIRCAN team 3, unité Inserm 1081 CNRS UMR 7284« Carcinogenesis-related chronic active inflammation », France

Les résultats décevants de la chimiothérapie dans l’adénocarcinomebronchique incitent à affiner le diagnostic à l’échelle molécu-laire afin de développer de nouvelles thérapies ciblées. Seulesles mutations activatrices de l’EGFR et le réarrangement de ALKbénéficient actuellement de traitements validés sur des altéra-tions génomiques. Au sein des biomarqueurs, les mutations du gèneKRAS se caractérisent par leur fréquence (∼30 %) et la difficultéà élaborer des stratégies d’inhibition efficaces. Un défi actuel del’oncologie thoracique est aussi de pouvoir accéder aux données dela biologie moléculaire sur des prélèvements non invasifs et facilesà renouveler dans le temps.L’objectif de cette étude a été d’analyser sur une séried’adénocarcinome bronchique de stade I à IV le statut mutationnelde KRAS sur l’ADN libre circulant grâce à deux approches différentesde séquencage et de comparer les résultats à ceux obtenus sur latumeur primitive.Matériels et méthodes.— Sur une série de 65 patients atteintsd’adénocarcinome bronchique, l’ADN circulant a été extrait à partirde 2 mL de plasma grâce à la plateforme automatisée Qiasymphony(Qiagen, Hilden). Nous avons analysé le statut KRAS sur l’ADN plas-matique par deux techniques :— la méthode de therascreen KRAS RGQ PCR Kit qui associel’utilisation de ARMS-Scorpions et d’intercalants fluorescents satu-rants (Rotor-Gene®, Qiagen) ;— la technologie IPLEX Gold® associant une discrimination alléliqueet une spectrométrie de masse (Sequenom Mass Array).Les résultats ont été corrélés avec ceux obtenus sur la tumeur pri-mitive par une technique de pyroséquencage (Therascreen® KRASPyro® kit, Qiagen) sur un pyromark 24 (Qiagen, Hilden).Résultats.— Grâce à la technique automatisée, l’ADN plasma-tique a été extrait et détectédans 100 % des cas. L’analyse sur leRotor-Gene® a permis de détecter les mutations KRAS de manièreconcordante avec celles retrouvées par pyroséquencage sur latumeur primitive chez 24 % des patients.L’analyse par la technique IPLEX Gold® a permis de détecter lesmutations correspondantes aux résultats de pyroséquencage sur letissu dans 28 % des cas. Parmi les patients KRAS non mutés sur latumeur primitive, aucune mutation n’a été détectée sur l’ADN librecirculant.Conclusion.— La recherche des différentes mutations du gène KRASà partir de l’ADN libre circulant est possible même dans les stadesprécoces de la maladie. Elle se fait dans un délai rapide grâce auxnouvelles technologies d’extraction et de séquencage. Actuelle-ment, l’intérêt respectif du séquencage ciblée ou à haut débit àpartir du sang est discuté en pratique quotidienne.

http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2013.10.141

FRSR15Modifications du protéome nucléairedes fibroblastes pulmonaires danstrois modèles de différenciationprofibrosanteS. Habib , L. PlantierInserm U700, université Paris 7-Diderot, Paris, France

Introduction.— L’identification des mécanismes conduisant à unedifférenciation profibrosante héritable des fibroblastes au coursdes pneumopathies interstitielles fibrosantes telles que la fibrosepulmonaire idiopathique (FPI) et l’atteinte pulmonaire de la scléro-dermie systémique (SSc) est un enjeu majeur. Les objectifs de cetteétude sont d’identifier les modifications d’expression des protéinesstructurelles du noyau dans les fibroblastes de FPI et SSc par rapport

aux fibroblastes de poumon normal, et de déterminer si la cytokinepro-fibrosante TGF-�1 induit des modifications similaires.Méthodes.— Des fibroblastes cultivés à partir de poumon humainobtenu chez n = 5 patients témoins, n = 5 patients atteints de FPI etn = 3 patients atteints de SSc ont été cultivés avec 0 ou sans 5 ng/mLde TGF-�1 pendant 48 h et les protéines nucléaires ont été purifiées.Les échantillons ont été séparés sur gel et analysés par chromato-graphie en phase liquide et spectrométrie de masse, afin d’identifieret quantifier les protéines nucléaires dont l’expression est altéréedans les fibroblastes de FPI ou SSc et dans les fibroblastes traitéspar le TGF-�1, en comparaison aux fibroblastes de poumon normal.Une analyse d’enrichissement fonctionnel a été effectuée.Résultats.— L’analyse par LC/MS des protéines nucléaires a per-mis de mettre en évidence une surexpression de plusieurs protéinesimpliquées dans la biosynthèse du collagène, dans les fibroblastesde FPI et dans les fibroblastes traités par le TGF-�1. Plusieurs pro-téines impliquées dans l’épissage des ARNm étaient sous expriméesdans le noyau des fibroblastes de FPI par rapport aux fibroblastesde témoins.Conclusion.— Les altérations des protéines nucléaires observéesdans les fibroblastes de FPI se rapprochent de celles induites parle TGF-�1. Les similitudes observées entre fibroblastes de FPI etde SSc semblent indépendantes de la voie du TGF-�1. Il existe unefaible expression de la machinerie d’épissage dans les fibroblastesde FPI, compatible avec les anomalies de la traduction décrites dansces cellules. L’exploration des autres compartiments du protéomepermettra de mieux caractériser la différenciation pro-fibrosantedes fibroblastes pulmonaires et d’élaborer des hypothèses quant àses mécanismes.

http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2013.10.142

FRSR16Rôle de SPOCK2 dans la susceptibilitédu nouveau-né prématuré à ladysplasie bronchopulmonaire (DBP)A. HadchouelInserm U781, Institut Imagine, hôpital universitaireNecker—Enfants-Malades

Séquelle de la prématurité, la DBP résulte d’interactions gènes-environnement. Nous avons identifié SPOCK2 comme gène desusceptibilité.Objectifs.— Étudier le rôle de SPOCK2 dans l’alvéolisation par desmodèles transgéniques. Rechercher des mutations de SPOCK2 chezdes enfants avec un phénotype extrême de DBP par séquencage del’exome.L’invalidation (KO) de SPOCK2 est obtenue par délétion des exons2 à 4 entraînant l’apparition de codons stop prématurés, et lasurexpression (KI) par insertion d’un transgène tetO7-SPOCK2 aulocus ROSA26. L’invalidation ou la surexpression dans le pou-mon sont obtenues par croisement des souris transgéniques avecdes souris contenant le transgène SPC-reverse tetracycline tran-sactivator. L’étude phénotypique inclue des études histologiqueset d’expression de gènes de l’alvéolisation. Pour les phénotypesextrêmes, la capture de l’exome est faite avec le kit Agilent All Exon50 Mb et le séquencage sur le séquenceur HiSeq2000 d’Illumina. Lesdonnées sont analysées grâce à l’interface Polyweb créée par lesbioinformaticiens de l’IHU Imagine.Les animaux transgéniques ont été concus en collaboration avec laplateforme génomique de Cochin. Nous disposons d’animaux hété-rozygotes pour le transgène SPOCK2 KO et KI exprimant encore letransgène de la flippase utilisée pour éliminer la cassette de sélec-tion des souris transgéniques par l’hygromycine. Deux croisementssont nécessaires pour éliminer la flippase et obtenir des sourishétérozygotes uniquement pour le transgène SPOCK2 KO ou KI. Cesanimaux seront croisés entre eux pour obtenir des homozygotes puisavec les souris SPC pour obtenir le modèle final.

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En attendant les souris transgéniques, le rôle de SPOCK2 dansl’alvéolisation a été confirmé : l’inhibition de SPOCK2 par injec-tion d’anticorps spécifiques chez des souriceaux exposés à 85 %de FiO2 réduit significativement l’hypoalvéolisation induite parl’hyperoxie. Nous démontrons aussi les interactions in vivo entreSPOCK2 et activation de la MMP2 (co-encadrement du M2 de SophieGuérin).L‘exome a été séquencé chez 10 enfants, sans mutation identi-fiée dans la séquence codante de SPOCK2. Une stratégie a étéélaborée pour rechercher d’autres variations : définition de sous-groupes phénotypiques à partir des 10 enfants isolant 6 cas trèshomogènes, sélection d’un groupe contrôle d’anciens prématurés àterme comparable aux cas mais avec une évolution respiratoire trèsrapidement favorable après la naissance, séquencage de l’exomechez ces 8 contrôles ; l’analyse comparera les variations présenteschez les cas à celles des contrôles pour isoler des variations poten-tiellement causales et de nouveaux gènes candidats. Cette analysevient de débuter, les données de l’exome des contrôles venantd’être obtenues. Si aucune variation commune aux 6 cas et absentechez les contrôles n’est identifiée, une analyse par combinatoirescroissantes des cas (2 à 2, puis 3 à 3, etc.) comparativement auxcontrôles, sera réalisée.

http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2013.10.143

FRSR17Évaluation d’une molécule à effetanti-inflammatoire pour le traitementde la mucoviscidoseL. Haddad , P. FanenUnité Inserm 955, Équipe 11, France

Introduction.— La cause de morbi-mortalité la plus importante dansla mucoviscidose est l’atteinte pulmonaire, caractérisée par uneinflammation chronique et exagérée au sein de l’arbre bronchique,associée à des surinfections à répétition et à une destruction pro-gressive du parenchyme pulmonaire. Concernant l’inflammation,nous savons que la protéine COMMD1 a un effet anti-inflammatoire,anti-NF-�B et anti-IL-8 prouvé, dans les cellules épithéliales bron-chiques, et que le déficit en autophagie (dont le marqueur estl’augmentation de p62) des cellules de phénotype mucoviscidosique(CF) aggrave l’inflammation.Objectif.— La découverte récente de l’effet anti NF-�B d’un inhi-biteur de la clusterine (CLU), l’OGX-011, dans les cellules decancer de la prostate, passant par une augmentation de COMMD1(voie CLU/COMMD1/NF-�B), nous a incité à évaluer l’effet anti-inflammatoire d’un siARN clusterine (siCLU) dans le contexte dela mucoviscidose.Matériel et méthode.— Des cellules HeLa exprimant de facon stableCFTR wild-type ou CFTR �F508 (mutation la plus fréquente de lamucoviscidose) ont été transfectées transitoirement pendant 48 hpar du siCLU. Nous avons mesuré l’effet du siCLU sur l’extinctionde CLU, l’augmentation de COMMD1, et la diminution de p62 (parWestern blot qualitatif et quantitatif).Puis nous avons évalué l’effet du siCLU sur l’activité transcrip-tionnelle de NF-�B (par système rapporteur Luciférase), et sur lasécrétion de l’IL-8 (par Elisa).Résultats.— Le siCLU a permis de diminuer significativementl’expression de CLU de 85 % (p = 0,0002), et l’expression de p62 de60 % (p = 0,0004), dans les HeLa �F508, alors que COMMD1 a para-doxalement diminué significativement (de 45 %, p = 0,005) dansces mêmes cellules. Il est possible que la voie de l’inflammationCLU/NF-�B ne passe pas essentiellement par COMMD1 dans les cel-lules CF, contrairement aux cellules de prostate.Le siCLU a induit la diminution significative de l’activité transcrip-tionnelle de NF-�B de 48 % (p = 0,00087) dans les HeLa �F508 dansles conditions basales, mais aussi dans les HeLa wt (p = 0,00002) et�F508 stimulées par le TNF� (p = 0,016).

Le siCLU a fait diminuer de manière significative la sécrétion d’IL-8 de 45 % (p = 0,00017) dans les HeLa �F508 stimulées par TNF�.Conclusion.— Le siCLU a un effet anti-inflammatoire significatifdans les cellules exprimant le CFTR �F508, anomalie présente chez90 % des patients atteints de la mucoviscidose. L’inhalation d’unmédicament siCLU permettrait sans doute de contrôler l’atteintebroncho-pulmonaire de la maladie. Il reste à confirmer cet effetà l’échelle des cellules des voies aériennes de patients CF et àl’échelle animale, avant de pouvoir le tester chez l’homme.

http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2013.10.144

FRSR18Étude de la modulation del’expression du récepteur àl’interleukine-22 (IL-22 R) en réponseà des stimuli infectieux et à la fuméede cigaretteY. Jouann , M. SIi-TaharUnité d’accueil : INSERM U1100/EA6305 » Centre d’etude despathologies respiratoires »

Introduction.— L’épithélium respiratoire est en contact permanentavec des pathogènes présents dans les voies aériennes et joue unrôle important dans la défense immunitaire innée. Cette réponseest médiée par l’interleukine 22 (IL-22) dont le récepteur (IL-22 R)est présent uniquement sur les cellules épithéliales. La voie designalisation IL-22/IL-22 R induit la production de peptides anti-microbiens, acteurs clé de la réponse anti-microbienne innée.Les facteurs modulant l’expression de l’IL-22 R sont peu connus,en particulier dans le contexte la bronchopneumopathie obstruc-tive, où l’on sait qu’il existe pourtant une susceptibilité accrue auxinfections respiratoires.Matériels et méthodes.—— in vitro : des cellules épithéliales bronchiques humaines (Beas2B)en cultures ont été soumises à différents stimuli : virus Influenzasouche Scotchland/74/H3N2, Pseudomonas aeruginosa délété dugène de virulence pscF, Lipopolysaccharides (LPS), enfin Poly I/C.Les cellules épithéliales ont également été mises en contact 6 h avecun extrait de fumée de cigarette en phase liquide, à 5 %. L’analysedu niveau d’expression de l’IL-22 R a été effectuée par RT—qPCR etcytométrie en flux ;— in vivo : des souris balb/c ont été exposées pendant 8 ou16 semaines à la fumée de 36 cigarettes/jour dans une enceintedédiée, puis infectées ou non par une dose subléthale de virusInfluenza H3N2. Le niveau d’expression du gène à l’IL-22 R a étéanalysé en RT—qPCR et Western Blot sur le broyat de poumons 2 et6 jours après infection.Résultats.— Après infection des cellules Beas2B par Influenza,l’expression en surface de l’IL-22 R était significativement augmen-tée. En revanche, les autres stimuli infectieux n’induisaient pas demodulation de l’expression de l’IL-22 R. Les extraits de fumée decigarette n’induisaient aucune modulation de la transcription dugène de récepteur à l’IL-22.De facon concordante, in vivo, l’exposition chronique à la fumée decigarette n’induisait pas de modulation du niveau de transcriptiondu gène de l’IL-22 R, alors que l’infection subléthale à Influenzaaugmentait l’expression de l’IL-22 R au niveau transcriptionnel etprotéique.Conclusion.— L’infection par le virus de la grippe, dans nos modèlesin vitro et in vivo, augmentait l’expression du récepteur à l’IL-22.L’exposition à la fumée de cigarette, in vitro et in vivo, n’induisaitpas de modulation d’expression de l’IL-22 R.

http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2013.10.145