Ricombinazione Ricombinazione geneticagenetica

La ricombinazione genetica

• È un processo attraverso il quale due elementi genetici provenienti da fonti diverse si vengono a trovare nella stessa unità genetica.

• A livello molecolare la ricombinazione è definita come il passaggio di informazione genetica (sequenza di acidi nucleici) da una molecola di DNA ad un’altra.

• Questo processo è stato studiato soprattutto nei batteri e nei virus.

Evoluzione..

• La ricombinazione è un importante processo evolutivo e la cellula possiede meccanismi specifici che assicurano che si verifichi.

• Negli eucarioti la ricombinazione genetica è una conseguenza della riproduzione sessuale.

• Meccanismi di ricombinazione avvengono anche nei procarioti durante i processi di trasformazione, trasduzione e coniugazione.

Nei procarioti:

• Nei procarioti la ricombinazione genetica avviene grazie al trasferimento di un frammento di dna, geneticamente differente, da una cellula donatrice, in una cellula ricevente; successivamente, avviene l’inserimento di questo frammento nel genoma della cellula ricevente.

I tre meccanismi sono:

• Trasformazione la cellula recettiva è in grado di introdurre nel proprio interno i segmenti di DNA libero presenti nell'ambiente in cui si trova a vivere. Questi segmenti, estrusi da altre cellule o residui di cellule distrutte, possono essere inseriti nel cromosoma batterico in corrispondenza di porzioni omologhe,che vengono poi eliminate.

• Trasduzione, il DNA del batterio viene veicolato da particelle speciali, i virus batterici chiamati anche fagi. I fagi infettano una cellula e in condizioni opportune vi si moltiplicano; le particelle neoformate distruggono quindi la cellula e si liberano, portando eventualmente con sè frammenti del genoma batterico: quando penetrano in una nuova cellula possono cosi trasferire questo materiale alla cellula infettata.

• Coniugazione. Due cellule di segno diverso (+ e -) venute a contatto, formano un canale citoplasmatico attraverso il quale la cellula donatrice, indicata col segno +, cede all'altra, indicata col segno -, un filamento di DNA di nuova formazione; questa lo integra nel proprio cromosoma in corrispondenza del sito omologo che viene così sostituito. Va precisato che la cellula donatrice è caratterizzata dal possesso di un plasmidio F, cioè di un piccolo cromosoma anulare che si riproduce in modo autonomo e conferisce alla cellula la capacità di produrre alcuni sottili filamenti superficiali, le fimbrie. Grazie alle fimbrie la cellula donatrice stabilisce il contatto con la cellula di segno opposto con la quale si coniugherà.

Trasformazione• Il DNA dei procarioti è costituito da un’unica lunga

molecola, che viene rilasciata quando la cellula lisa.

• A causa della sua estrema lunghezza, la molecola di DNA si rompe molto facilmente e anche dopo una estrazione blanda si frammenta in 100 o più pezzi .

• Poiché la lunghezza media di un gene è di circa 1000 nucleotidi, ciascuno dei frammenti di DNA purificato conterrà più o meno 15 geni. Dal momento che ciascuna cellula incorpora uno o pochi frammenti di DNA, solo una piccola frazione di geni può esser trasferita da una cellula all’altra, durante un singolo evento di trasformazione

Competenza

• Si definisce competente una cellula in grado di assumere una molecola di DNA e di essere trasformata.

• La competenza nei batteri è regolata da speciali proteine di membrana che svolgono un ruolo essenziale nell’assorbimento e nel processamento del DNA.

Induzione artificiale della competenza

1970: Mandel and Higa osservarono che batteri, trattati con soluzioni di CaCl2 e riscaldati velocemente, potevano essere trasformati con DNA del batteriofago λ , quindi questo trattamento conferiva ai batteri un transiente stato di “competenza”.

COMPETENZA: capacità di assumere DNA

= numero di colonie positive/microgrammo di DNA trasformato

Nel corso degli anni sono stati fatti diversi tentativi per migliorare l’efficienza di trasformazione.

Le due tecniche maggiormente utilizzate oggi sono:

Trasformazione per CaCl2

Elettroporazione

Trasformazione Per Elettroporazione

Le cellule batteriche unite al DNA vengono sottoposte ad una veloce scarica elettrica che permette la formazione di “elettropori” che favoriscono l’entrata di DNA.

Competenza: 108-1010 cellule trasformate /μg di DNA

Trasformazione in CaCl2Crescita di un ceppo E.Coli interreno ricco di nutrienti. Le cellule si raccolgono quando sono in fase logaritmica

Trasduzione• I virus , come elementi genetici possono

trasferire non solo il loro patrimonio genetico ma anche porzioni del genoma della cellula. – Trasduzione generalizzata, particelle virali

difettive incorporano casualmente frammenti di DNA della cellula ospite; teoricamente, anche se a bassa efficienza,qualsiasi gene del donatore può essere trasferito.

– Trasduzione specializzata: il dna di un virus temperato che non si scinde correttamente porta con se frammenti adiacenti di DNA dell’ospite; in questo modo possono essere trasdotti soltanto i geni localizzati in prossimità del punto di integrazione del virus, ma con alta efficienza.

Coniugazione• Processo di trasferimento genetico

che implica un contatto tra le due cellule .

• Il materiale genetico che viene trasferito può essere un plasmide o una porzione di cromosoma mobilizzato da un plasmide.

• La cellula donatrice ,grazie al fatto di possedere un plasmide ”coniugativo”, è dotata di pili sessuali , strutture necessarie per il contatto tra donatore e ricevente.

• I pili sessuali dopo aver reso possibile il contatto tra le due cellule, si ritraggono, determinando la formazione del ponte citoplasmatico attraverso cui avviene il trasferimento del DNA.

Coniugazione

La cellula diventa «maschio»

Il plasmide completa il trasferimento e assume di nuovo la forma circolare

Il fattore F inizia la duplicazione e il trasferimento

Batterio «maschio» donatore

Cromosoma batterico

Fattore F (plasmide)

Può avvenire la ricombinazione

Solo una parte del cromosoma si trasferisce

Il fattore F inizia la duplicazione e il trasferimento del DNA

Origine della duplicazione

Cromosoma batterico

Batterio «maschio» donatoreFattore F (integrato)

Cellula ricevente