UNIVERSITATEA DE M EDICINĂ ŞI FARMACIE CRAIOVA

REZUMAT

TEZĂ DE DOCTORAT

CERCETĂRI CLINICE ÎN DOMENIUL

FARMACOCINETIC II ANESTEZICELOR LOCALE CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. univ. dr. FLORICA POPESCU DOCTORAND MANDA COSTEL-VALENTIN CRAIOVA 2011

2

CUPRINS I. Introducere ………………………………………………………………………… ..4 II. Parte teoretică. Stadiul cunoaşterii.............................................................................6 II.1. Definiţia anesteziei locale şi tipuri de anestezie locală...........................................6 II.2. Mecanisme de acţiune ale anestezicelor locale.......................................................7 II.2.1. Locul de acţiune.............................................................................................7 II.2.2. Blocurile tonic şi fazic produse de anestezicele locale..................................8 II.2.3. Modelul speculativ al mecanismului molecular al anestezicelor locale........8 II.3. Gradul de ionizare al anestezicelor locale..............................................................9 II.4. Asociaţia anestezic local - substanţă vasoconstrictoare........................................10 II.5. Farmacocinetica anestezicelor locale....................................................................10 II.6. Efecte adverse.......................................................................................................12 II.6.1. Efecte adverse la nivelul SNC.....................................................................12 II.6.2. Efecte adverse cardiovasculare....................................................................12 III. Cercetări personale……………………………………………………………… .13 III.1. Motivarea alegerii subiectului cercetat…………………………………………13 III.2. Design experimental……………………………………………………………15 III.3. Studiul I - Contribuții personale la dezvoltarea unei metode cromatografice în

fază gazoasă de analiză a articainei și modalitatea de aplicare într-un studiu farmacocinetic……………………………………………………………………………16

III.3.1. Motivația și obiectivele studiului…………………………………………16

III.3.2. Material și metodă……………………………………………………… ..16

III.3.2.1. Designul studiului clinic în vederea recoltării probelor biologice…...16 III.3.2.2. Stabilirea metodei cromatografice în fază gazoasă de determinare a

concentrației plasmatice a articainei……………………………………………… ..……17

III.3.2.2.1.Reactivi…………………………………………………………… ..17 III.3.2.2.2. Prepararea soluțiilor stoc și de

lucru………………….……………17 III.3.2.2.3. Prepararea standardelor de sânge și a

probelor……………………17 III.3.2.2.4. Extracția lichid-

lichid…………….………………………………..18 III.3.2.2.5. Echipamente și condiții

cromatografice…………………………...18 III.3.2.2.6. Curba de calibrare…………………………………………………18 III.3.3. Rezultate………………………………………………………………… .18

3

III.3.3.1. Curba de calibrare……………………………………………………18 III.3.3.2. Extracția lichid-

lichid……………………………………………… ..19 III.3.3.3. Separarea prin cromatografie în fază gazoasă……………………….20 III.3.3.4. Validarea metodei……………….…………………………………...20 III.3.3.5. Studiul farmacocinetic….....................................................................21 III.3.4.

Discuții………………………………………………………………… ...23 III.3.4.1. Curba de calibrare……………………………………………………23 III.3.4.2. Extracția lichid-

lichid………………………………………………..23 III.3.4.3. Separarea prin cromatografie în fază gazoasă ………………………24 III.3.4.4. Validarea metodei……………………………………………………25 III.3.4.5. Prelucrarea statistică a datelor……………………………………….25 III.3.4.6. Studiul farmacocinetic….....................................................................26 III.3.5. Concluzii…………………………………………………………… ..…...27 III.4. Studiul II - Contribuții personale la dezvoltarea unei metode cromatografice de

lichide de înaltă performanță pentru analiza articainei și modalitatea de aplicare într-un studiu farmacocinetic…………………………………………………………… ...……..28

III.4.1. Motivație și obiective…………………………………………………… ..28

III.4.2. Material și metodă……………………………………………………… ..29

III.4.2.1. Designul studiului clinic în vederea recoltării probelor biologice…..29 III.4.2.2. Stabilirea metodei HPLC de determinare a concentrației plasmatice a

articanei………………………………………………………………………………… .30 III.4.2.2.1. Reactivi…………………………………………………………....30 III.4.2.2.2. Prepararea soluțiilor stoc și de

lucru………………………………30 III.4.2.2.3. Prepararea standardelor de sânge și a

probelor……………………30 III.4.2.2.4. Extracția lichid-

lichid……………………………………………...30 III.4.2.2.5. Echipamente și condiții

cromatografice………………………..…30 III.4.2.2.6. Curba de calibrare…………………………………………………31 III.4.3. Rezultate………….………………………………………………………31 III.4.3.1. Curba de calibrare……………………………………………………31 III.4.3.2. Extracția lichid-

lichid……………………………………………… ..32 III.4.3.3. Separarea prin cromatografie în fază lichidă………………….……..32

4

III.4.3.4. Validarea metodei……………………………………………………34 III.4.3.5. Studiul farmacocinetic……………………………………..………...35 III.4.4.

Discuții……………………………………………………………………37 III.4.4.1. Curba de calibrare……………………………………………………37 III.4.4.2. Extracția lichid-

lichid……………………………………………… ..38 III.4.4.3. Separarea prin cromatografie în fază lichidă……………….………..38 III.4.4.4. Validarea metodei……………………………………………………40 III.4.4.5. Prelucrarea statistică a datelor…………………………………….....40 III.4.4.6. Studiul farmacocinetic……………………………………..………...40 III.4.5. Concluzii…………………………………………………………………44 IV. Concluzii finale………………………………………………………………… ..46 V. Bibliografie selectivă………….………………………………………………… .48

I. INTRODUCERE

Suprimarea durerii în afecţiunile dureroase și efectuarea unor intervenţii chirurgicale în

deplină linişte pentru bolnav şi medic au reprezentat din cele mai vechi timpuri deziderate ale practicii medicale.

Medicina dentară şi îndeosebi chirurgia stomatologică au beneficiat din plin de introducerea în practică a anesteziei locale şi regionale. Progresele considerabile realizate în ultimele decenii în anesteziologie au fost posibile datorită cercetărilor farmacologice, fiziopatologice şi clinice, care au permis pe de o parte sintetizarea de noi substanţe cu acţiune individualizată, cu mare eficienţă şi toxicitate redusă, iar pe de altă parte o mai corectă indicaţie, care să prevină şi să trateze în mod eficient accidentele locale şi generale.

Deoarece în multe situaţii în care este folosită anestezia locală bolnavul poate să fie în tratament cu diferite medicamente cu acţiune pe sistemul cardio-vascular, există posibilitatea interacţiunii între anestezicul local care ajunge în circulaţia sistemică într-o concentraţie mai mare sau mai mică şi substanţe cu acţiune specifică la nivel cardio-vascular.

Anestezia locală reprezintă o parte importantă a activității medicului de medicină dentară. Un număr semnificativ de carpule de anestezic local sunt injectate în fiecare an. Istoricul folosirii anestezicelor locale în medicina dentară începe în 1884 când a fost utilizată pentru prima dată cocaina. În anul 1903, Braun a propus pentru prima dată folosirea adrenalinei în scopul prelungirii duratei de acţiune a anestezicului local. În 1904 a fost sintetizată procaina de către Einhorn. Începând cu anul 1940 a fost introdus un nou

5

grup de anestezice locale, anestezicele de tip amidă. Lidocaina a fost sintetizată pentru prima dată de chimistul suedez Nils Lőfgren în 1943. Când a fost introdusă, lidocaina a revoluţionat anestezia locală în medicina dentară datorită faptului că are o potenţă mai mare şi este mai puţin alergenică decât procaina. În anii care au urmat, au fost introduse şi alte anestezice locale de tip amidă: prilocaina în 1953 de către Lőfgren şi Tegner, bupivacaina şi mepivacaina în 1957 de către A.F. Ekenstam şi etidocaina în 1971 de către Takman.

În 1969, Rusching şi colab. au sintetizat un nou medicament, articaina. Diferenţa faţă de celelalte anestezice locale constă în inelul tiofen pe care îl conţine în moleculă, în loc de obişnuitul benzen. Iniţial a fost denumită carticaină, dar numele a fost schimbat în 1984 la articaină. La momentul actual, articaina (în combinaţie cu adrenalina 1:100000 şi 1:200000) ajunge să aibă un raport de piaţă de până la 50% în unele ţări europene, în vreme ce lidocaina, prilocaina şi mepivacaina constituie restul. În Germania, articaina are o cotă de piaţă de peste 90%.

Articaina este anestezicul local care formează obiectul prezentei teze de doctorat. Fiind cel mai nou anestezic local introdus pe piaţă el a fost mai puţin studiat de către cercetători din punct de vedere al farmacocineticii, doar câteva articole care vor fi prezentate în următoarele capitole abordând acest subiect. Având la dispoziţie suportul material reprezentat de laboratorul de cercetare al Facultăţii de Farmacie (UMF Craiova) care cuprinde un cromatograf de gaze şi un cromatograf de lichide de înaltă performanţă de ultimă generaţie, dar şi suportul uman al d-nei Prof. univ. dr. Popescu Florica şi al d-nei Prof. univ. dr. Băniceru Mihaela, am realizat un studiu farmacocinetic în care am inclus opt pacienţi, studiu prezentat în capitolul III.

În încheiere doresc să adresez calde mulţumiri d-nei Prof. univ. dr. Popescu Florica sub coordonarea căreia am efectuat prezenta teză de doctorat şi d-nei Prof. univ. dr. Băniceru Mihaela care m-au îndrumat la fiecare pas în elaborarea acestei lucrări.

6

II. PARTE TEO RETICĂ – STADIUL CUNOAŞTERII II.1. Definiţia anesteziei locale şi tipuri de anestezie locală Anestezia locală reprezintă pierderea reversibilă a sensibilităţii îndeosebi dureroase într-

o zonă delimitată prin impiedicarea procesului de excitaţie-conducere, fără lezarea fibrelor nervoase [1].

Anestezia locală este un procedeu util pentru efectuarea unor intervenţii chirurgicale şi a unor manevre endoscopice, pentru calmarea durerii în anumite afecţiuni medicale, pentru privarea temporară a unor structuri periferice de control nervos. Ea provoacă insensibilităţi, fără pierderea cunoştinţei şi fără deprimarea centrală a circulaţiei şi respiraţiei, fiind de regulă mai puţin agresivă pentru organism decât anestezia generală [2].

În general, în medicina dentară se obţine analgezia prin anestezia locală pentru prevenirea durerilor provocate de diverse manevre stomatologice.

Substanţele medicamentoase folosite pentru realizarea anesteziei locale sunt denumite anestezice locale şi ele determină blocarea conducerii nervoase prin aplicarea locală lângă ţesutul nervos, în concentraţii adecvate.

Tipurile de anestezie locală: ◊ Anestezia de suprafaţă sau anestezia de contact se realizeazǎ prin aplicarea

anestezicului local pe pielea lezată sau pe mucoase (mucoasa conjunctivală şi corneea, mucoasa nazală, mucoasa bucală, faringiană şi esofagiană, mucoasa traheobronşică, mucoasa aparatului genito-urinar). Anestezia de suprafaţă pe mucoase este superficială şi nu interesează stratul submucos.

7

◊ Anestezia de infiltraţie constă în injectarea soluţiei în ţesuturi, strat cu strat. Ea poate interesa pielea sau ţesuturile profunde.

◊ Anestezia de conducere sau anestezia regională se realizează prin injectarea soluţiei anestezice in preajma unei formaţiuni nervoase mari. În această categorie sunt cuprinse: anestezia prin bloc nervos, rahianestezia şi anestezia epidurală.

○ Anestezia prin bloc nervos (tronculară sau plexală) se realizează prin injectarea la nivelul nervilor periferici - nervi intercostali, nervi cranieni senzitivi, nerv sciatic, nerv femural, plex brahial, plex cervical, etc.

○ Rahianestezia sau anestezia spinală este produsă prin introducerea soluţiei anestezice în spaţiul subarahnoidian, în lichidul cefalorahidian. Injectarea se face, de obicei, între vertebrele a III-a si a IV-a lombare, realizând rahianestezia joasă utilă în intervenţiile chirurgicale pe abdomenul inferior, perineu şi extremităţi. Anestezicul acţionează asupra rădăcinilor spinale şi asupra straturilor superficiale ale măduvei, interesând fibrele senzitive şi motorii somatice şi fibrele simpatice.

○ Anestezia epidurală se realizează prin injectarea soluţiei anestezice în spaţiul epidural, de regulă regiunea lombară (mai rar toracică). Anestezia caudală este o variantă prin injectarea în canalul caudal. Anestezicul difuzează prin dura mater în spaţiul subarahnoidian, de asemenea, pătrunde în spaţiul paravertebral, producând bloc nervos paravertebral. Cu cât volumul injectat este mai mare, cu atât nivelul anesteziei este mai înalt. Concentraţii mici blochează fibrele simpatice, cele medii adaugă blocul senzitiv, iar cele mari provoacă şi paralizie motorie.

II.2. Mecanisme de acţiune ale anestezicelor locale Anestezicele locale blochează senzaţia de durere interferând cu propagarea impulsului

în nervii periferici. Sunt inhibate atât generarea cât şi conducerea potenţialelor de acţiune. Datele de electrofiziologie arată că anestezicele locale nu modifică semnificativ potenţialul de repaus normal al fibrei nervoase, în schimb deprimă răspunsurile dinamice la stimularea nervului.

II.2.1. Locul de acţiune al anestezicelor locale În membrana nervului există câteva locuri prin care anestezicele locale pot interfera cu

permeabilitatea sodiului. Substanţele capabile de a bloca conducerea pot fi caracterizate prin locul respectiv de acţiune pe care îl blochează.

Următoarea clasificare a anestezicelor locale propusă de Tackman (1975) şi modificată de Strichartz G.R. şi Ritchie J.M. (1987). Ea reflectă cercetările concentrate prin interrelaţia medicament-receptor [3].

Clasa A – agenţi ce acţionează pe un loc receptor situat la deschiderea spre exterior a canalului de sodiu.

Tetrodotoxina şi saxitoxina sunt două neurotoxine marine care sunt extrem de puternice ca anestezice locale. Ele se leagă specific de un constituent proteic exterior al canalului de sodiu, cu închiderea respectivă a porului canalului. Deşi aceste substanţe sunt extreme de

8

selective în acţiune, slaba penetrabilitate prin barierele tisulare lipidice nu a permis utilizarea clinică. Interesant este că unele canale de sodiu găsite în musculatura scheletică a vertebratelor imature şi în creierul unor nevertebrate mature, ca şi în miocardul de mamifer adult, au o afinitate absolută mult mai scăzută pentru tetrodotoxină şi saxitoxină. Pe aceste locuri externe de legare ale canalele de sodiu în prezent s-a demonstrat că mai acţionează două toxine cu structură peptidică izolate din veninul de scorpion [4].

Clasa B – Agenţi care acţionează pe un loc al canalului de sodiu accesibil dinspre axoplasmă.

Transformarea grupării amino- terminale a unor anestezice locale în forma cuaternară produce o formă cationică permanent ionizată ce este incapabilă să treacă prin membrane. Deşi sunt ineficace când sunt aplicate extern pe suprafaţa axolemei, aceşti compuşi demonstrează experimental o acţiune blocantă rapidă când sunt aplicate pe faţa internă a membranei. Studii cu stereoizomeri sau alte anestezice locale arată existenţa unui receptor specific, care este implicat în acţiunea acestor medicamente.

Clasa C – Agenţi care influenţează canalele de sodiu printr-o cale hidrofobică. Numeroase medicamente neînrudite cu anestezicele locale sunt capabile să blocheze

conducerea în nerv. Examinarea acestor medicamente (de exemplu alcool, barbiturice) relevă că singurul aspect comun este lipsa unei sarcini pozitive la pH fiziologic. Lipsa de asemănare între structurile moleculare şi corelaţia directă între potenţa anestezică locală şi coeficienţii de partiţie membrană/soluţie tampon sugerează că medicamentele din clasa C pot acţiona într-o manieră analoagă anestezicelor generale.

Clasa D – agenţi care acţionează prin combinarea mecanismelor B și C. Multe din anestezicele locale folosite clinic fac parte din această clasă. Deoarece aceste

medicamente există într-o mixtură de forme cationică şi neutră la pH-ul tisular, ele sunt capabile să interfere cu conductanţa sodiului prin combinare cu receptori de pe faţa internă a membranei şi, probabil, şi prin alterarea membranei printr-o legare hidrofobică, nespecifică. Pentru clasa D sunt valabile atât calea canalului de sodiu, cât şi calea hidrofobică pentru a avea acces la locul de acţiune. Deşi dovezile cele mai multe sunt în favoarea legării formelor cationice de anestezice locale de receptori specifici, formele neutre sunt, de asemenea, active (şi desigur larg eficiente pentru difuzarea prin învelişurile nervului şi prin membrane).

II.2.2. Blocurile tonic şi fazic produse de anestezicele locale Blocarea impulsului de către anestezicele locale se produce prin inhibiţia canalelor de

sodiu voltaj-dependente. Atât anestezicele locale ionizate cât şi cele neutre inhibă canalele de sodiu prin interferenţa cu schimbările conformaţionale care stau la baza procesului de activare (secvenţele care se produc prin trecerea canalului din stare de repaus – închis până la starea de conducere – deschis). Ocluzia canalelor deschise contribuie puţin la inhibiţia totală [5].

Inhibiţia curenţilor de sodiu produsă de anestezicele locale creşte prin depolarizări repetitive într-un proces denumit bloc fazic. Blocul fazic reprezintă legarea crescută a

9

anestezicelor locale de canal. După cum am menţionat, derivaţii cuaternari (clasa B) au acţiune de blocare a membranei când sunt injectați intraaxonal, dar sunt ineficienţi dacă se aplică extern. Deoarece aceste medicamente îşi găsesc locul de acţiune în canal numai când acesta este deschis este normal ca o stimulare repetitivă a nervului să crească expunerea locului receptor la anestezicul local şi să conducă la o creştere a acţiunii medicamentului până când se stabileşte o stare de echilibru între forma de medicament din canal şi forma liberă din axoplasmă.

Aceste rezultate susţin ipoteza “receptorului modulat” al anesteziei locale, sugerând că stimularea membranei nervului nu numai că expune locul de acţiune la anestezicele locale de formă cationică, dar chiar creşte temporar afinitatea receptorului canalului pentru acestea.

Teoria “receptorului modulat” susţine că anestezicele locale, atât în forma cationică cât şi neutră, se leagă preferenţial de canalele deschise şi inactivate.

II.2.3. Modelul speculativ al mecanismului molecular al anestezicelor locale Stereospecificitatea acţiunii anestezicelor locale este de asemenea relativ neselectivă,

sugerând o detaşare rapidă între ligand şi locul de legare [6]. Se presupune că o moleculă de anestezic local acţionează prin pătrunderea într-un buzunar amfipatic localizat în canal sau într-o regiune care se roteşte ca un tirbuşon în membrană la nivelul canalului de sodiu .

Secvenţa primară a subunităţii mari a canalului ionilor de sodiu are patru domenii repetitive (I-IV), fiecare conţinând 6-8 secvenţe de aminoacizi care probabil formează structuri delta helicale, care perforează ca un tirbuşon membrana nervului, notate prin litere de la A la H.

Vedantham şi Cannon [7] descoperă rezultate surprinzătoare care intră în contradicţie cu „teoria receptorului modulat” care spune că anestezicul local stabilizează stările inactivate. Totuşi, cei doi cercetători arată ca multe din conceptele teoriei se respectă, dar există o componentă a blocului cu anestezic local care nu interesează închiderea acestei porţi. Pe măsură ce concentraţia anestezicului local creşte, rata modificării nu este la fel de mare. Ipoteza receptorului modulat arată că şi canalele în repaus pot lega molecule de anestezic local, dar cu o afinitate mai mică decât cele depolarizate.

Legat de teoria receptorului modulat, modelul de bază rămâne intact. Se schimbă rolul porţii de inactivare. În timp ce poarta de inactivare era considerată anterior ca având rol central în blocul produs de anestezicul local, Vedantham şi Cannon sugerează că ar putea juca un rol secundar.

Cercetările pe mecanismele de acţiune ale anestezicelor locale se vor extinde pe viitor în două direcţii. Într-una din ele, cercetările biochimice vor defini locul sau locurile de legare pentru anestezicele locale pe canalele de ioni de sodiu, în timp ce studiile biofizice vor compara farmacologia anestezicelor locale acţionând asupra unor diferite canale de ioni de sodiu şi vor rezolva detaliile moleculare ale mecanismului de inhibiţie. În altă direcţie va fi explorată întreaga gamă de activităţi referitoare la anestezicele locale şi vor fi

10

definite mecanismele moleculare şi celulare posibile pentru anestezia finală şi epidurală şi pentru efectele toxice ale anestezicelor locale pe SNC, inima şi alte localizări.

Ambele abordări vor îmbunătăţi înţelegerea anesteziei locale, practica şi siguranţa ei.

II.3. Gradul de ionizare al anestezicelor locale Constanta pKa a moleculei de anestezic local este un parametru care influenţează viteza

de inducţie şi intensitatea anesteziei. Când pKa este egală cu pH, atunci formele ionizată şi neionizată sunt în echilibru. Anestezicele locale se folosesc sub formă de săruri solubile în apă, de obicei clorhidraţi. Soluţiile care le conţin au o reacţie acidă şi sunt stabile. Ele cuprind cantităţi mici de molecule liposolubile, neionizate, capabile să difuzeze tisular pentru a ajunge la locul de acţiune. Majoritatea anestezicelor locale au un pKa cuprins între 8 şi 9, prezentând în soluţie, la pH-ul mediului intern, molecule neionizate în proporţie relativ mică, dar suficiente pentru a asigura anestezia locală. Lidocaina cu un pKa 7,9 prezintă o proporţie relativ mare de molecule neionizate la pH fiziologic (35%) de aceea difuzează cu uşurinţă şi provoacă repede anestezie locală. În cazul procainei, cu un pKa mai mare (8,9) proporţia moleculelor neionizate este mai mică, difuziunea este mai slabă şi anestezia se instalează relativ lent.

II.4. Asocierea anestezic local-substanţă vasoconstrictoare Asocierea anestezicului local cu un vasoconstrictor poate diminua absorbţia sistemică a

anestezicului local [8]. În acest mod, efectele indezirabile date de o absorbţie rapidă şi în concentraţie mare a anestezicului local sunt diminuate, durata anesteziei locale este crescută, intensitatea de asemenea, iar hemoragia este diminuată.

Aceste substanţe acţionează cu deosebire asupra dinamicii vasculare. Contracarează prin efectul lor acţiunea vasodilatatoare a unor substanţe anestezice locale.

Ele au următoarele proprietăţi: 1. Scad irigarea în teritoriul anesteziat. 2. Scad sângerarea locală în timpul intervenţiei chirurgicale. 3. Scad absorbţia anestezicului local în sânge. 4. Scad timpul de inducţie al anestezicului local. 5. Scad efectele toxice ale anestezicelor locale. 6. Scad riscul de supradozare al anestezicului local. 7. Scad sau neutralizează efectele alergice ale anestezicelor locale; combat şocul

anafilactic. 8. Cresc puterea anestezică a anestezicului local. 9. Favorizează metabolizarea mai rapidă a anestezicului local. 10. Prelungesc durata acţiunii substanţelor anestezice locale. Produsele utilizate sunt: adrenalina, noradrenalina şi corbadrina (levonordefrina).

Aceste trei substanţe aparţin familiei de catecolamine.

11

La concentraţiile sistemice mici realizate prin utilizarea unor cantităţi mici de substanţă adrenomimetică asociată anestezicelor locale, efectele beta sunt rareori decelabile, cu excepţia unor accidente ca injectarea i.v. involuntară.

Adrenalina este mai ales tahicardizantă prin efectele sale beta-adrenergice [9]. În plus, este şi hiperglicemiantă. Diabetul insulino-dependent este o contraindicaţie relativă de utilizare.

Preparatele anestezice locale cu adrenalină sunt contraindicate la bolnavii sub tratament cu inhibitori de MAO, antidepresive triciclice, la hipertiroidieni.

Eficiența clinică a anestezicului local este dependentă de acțiunea agentului vasoconstrictor. În cazul în care anestezicul local nu conține suficient agent vasoconstrictor, controlul durerii este mai puțin adecvat, fapt care duce la creșterea nivelului de catecolamine endogene, în special noradrenalină. Aceasta produce o creștere a tensiunii arteriale și determină efecte cardiotoxice. Numai concentrațiile potrivite ale celor doi componenți pot oferi o garanție a profunzimii și a duratei anesteziei, pentru a putea evita stress-ul datorat durerii cu toate efectele nedorite date de excesul de noradrenalină.

II.5. Farmacocinetica anestezicelor locale Consideraţiile farmacocinetice ale anestezicelor locale sunt foarte importante pentru că

ele determină în mare măsură potenţialul toxic, datorită balanţei între captarea anestezicelor locale în circulaţia sistemică şi eliminarea lor prin urină după redistribuire şi metabolizare [10].

Viteza de absorbţie este dependentă de doza şi profilul farmacologic al medicamentului administrat, volumul soluţiei, de prezenţa agentului vasoconstrictor și de natura locului de administrare. Deci, cu cât se va injecta o cantitate mai mare de anestezic local, cu atât concentraţia sangvină va fi mai ridicată. La cantităţi egale de anestezic local, soluţiile mai concentrate realizează niveluri plasmatice superioare, deci, prezintă risc toxic crescut.

Cu cât ţesuturile sunt mai bine vascularizate, cu atât absorbţia este mai bună. Injectarea pentru blocarea nervilor intercostali realizează concentraţii plasmatice comparativ mari, infiltraţiile subcutanate realizează concentraţii relativ mici. După anestezia epidurală absorbţia este importantă; după rahianestezie ea este slabă.

Odată intrat în circulaţie, un anestezic local se leagă parţial (5 până la 95%) de proteinele plasmatice, în particular de o alfa 1-acid glicoproteină (şi mai puţin de albumină) cât şi de hematii. Deoarece concentraţia alfa 1-acid glicoproteinei este influenţată de mai mulţi factori, fracţiunea legată de anestezic local diferă de la un individ la altul şi chiar la acelaşi individ în momente diferite. Factorii care deprimă legarea includ acidoza respiratorie şi posibil co-administrarea altor medicamente. Aşa numitele bariere biologice în difuziune sunt relativ ineficiente pentru anestezicele locale. Pe lângă faptul că traversează bariera hemato-encefalică, aceste medicamente traversează placenta şi pot produce ocazional deprimarea severă a cordului la făt.

12

Metabolizarea se face în funcţie de structura chimică a compusului de anestezic local. Ea este rapidă pentru compuşii cu structură esterică, care sunt hidrolizaţi îndeosebi de colinesteraza plasmatică, dar şi de esterazele hepatice. Aceasta determină durata scurtă a efectelor sistemice şi toxicitatea relativ mică a unor asemenea compuşi, îndeosebi a procainei și articainei.

Compuşii cu structură amidică sunt metabolizaţi lent la nivelul ficatului (de exemplu lidocaina); mepivacaina, prilocaina sunt N-dezalchilate, apoi hidrolizate şi eventual, în parte, conjugate sub acţiunea enzimelor microzomale. Fluxul plasmatic hepatic influenţează viteza de metabolizare. Importanţa ficatului pentru bio-inactivare explică riscul toxic crescut al anestezicelor locale, mai ales al celor amidice, la bolnavii hepatici.

Diferenţele în biotransformarea anestezicelor locale sunt uneori relevante clinic. Indivizi cu defecte genetice în activitatea pseudo-colinesterazei sunt neobişnuit de sensibili la procaina şi alţi esteri. Dozele obişnuite în aceste cazuri produc reacţii toxice.

Eliminarea anestezicelor locale se face pe cale renală, în mare parte ca metaboliţi. Principalul metabolit al articainei este acidul articainic care este inactiv şi a fost detectat

în plasmă după administrarea anestezicului local epidural sau i.v. Are o structură deosebită de celelalte anestezice locale. Prezintă un ciclu tiofen în loc de benzen, fapt care îi conferă o lipofilicitate crescută. Principalul metabolit se formează în plasmă prin hidroliza grupei ester, ducând la un timp de înjumătățire scurt (15-20 min). Nivelurile plasmatice ale articainei prin rezultatele contradictorii din literatură sunt investigate în prezenta teză de doctorat.

II.6. Efecte adverse Efectele sistemice ale anestezicelor locale sunt obişnuit slabe, deoarece concentraţiile

realizate în plasma sunt de cele mai multe ori mici. Aceste efecte devin evidente la doze toxice, fie în condiţii de supradozare absolută, fie atunci când anestezicele sunt aplicate în concentraţii mari pe anumite mucoase inflamate sau atunci când se injectează accidental i.v.

II.6.1. Efecte adverse la nivelul SNC Sistemul nervos central este iniţial stimulat, probabil secundar îndepărtării unor

influenţe inhibitoare. Se produc fenomene de excitaţie psihomotorie, cu nelinişte, hiper-reflectivitate, tremor, uneori confuzii şi delir care pot fi urmate de convulsii clonice [11]. Convulsiile survin în supradozări sau la subiecţi cu metabolism hepatic afectat (ciroza) sau cu debit hepatic modificat (insuficienţă cardiacă, beta-blocante, cimetidină).

II.6.2. Efecte adverse cardio-vasculare Anestezicele locale pot exercita o serie de efecte pe sistemul cardio-vascular [12].

Unele dintre efecte sunt benefice şi pot servi ca bază de înţelegere a unor agenţi selectaţi în tratamentul aritmiilor cardiace; altele servesc la accentuarea toxicităţii sistemice.

13

Miocard- la concentraţii subtoxice, anestezicele locale au influenţă pe electrofiziologia inimii. Pe când lidocaina scurtează perioada refractară şi durata PA în fibrele Purkinje, procaina acţionează în mod opus. În doze toxice anestezicele locale au acţiune calitativ asemănătoare. Excitabilitatea membranară şi viteza de conducere sunt deprimate în miocard. Bradicardia sinusală şi scăderea forţei de contracţie a miocardului contribuie la reducerea debitului cardiac. Aceste efecte sunt amplificate prin hipoxie, dar, chiar atunci când respiraţia este susţinută artificial, la doze mari colapsul circulator se menţine.

Vasele periferice- acţiunea anestezicelor locale pe vasele de sânge este complexă şi dependentă de doză. Soluţii diluate cresc contracţiile spontane miogene şi rezistenţa periferică în unele paturi vasculare - probabil prin creşterea concentraţiei calciului ionic în fibrele musculare netede. Concentraţia folosită clinic inhibă atât activitatea miogenă cât şi a tonusului autonomic şi determină vasodilataţia în zona injectată. Doze subconvulsivante de anestezic local exercită influenţe minore asupra vascularizaţiei periferice ca întreg, o mică creştere în rezistenţa periferică este contrabalansată de o scădere a debitului cardiac, astfel că presiunea arterială nu se modifică. Doze toxice produc arteriolodilataţie şi hipotensiune profundă.

III. CERCETĂRI PERSONALE

III.1. Motivarea alegerii subiectului cercetat Marea majoritate a anestezicelor locale au fost suficient cercetate din punct de vedere al

farmacocineticii, ele fiind introduse pe piață de mai mult timp, astfel încât cercetătorii le-au putut studia.

Articaina este un anestezic local relativ nou, fiind sintetizat în 1969 de către Rusching și colab. A fost introdusă pe piață pentru prima dată în 1976 (Ultracaine, Hoechst Pharmaceuticals) iar în Canada în 1982. S-a dovedit a avea posibilități de difuzie foarte bună, durată de acțiune adecvată în prezența unui vasoconstrictor și o performanță eficientă. Un inel tiofen a înlocuit inelul benzenic din porțiunea lipofilică a moleculei și, pentru prima dată, a fost introdus un atom de sulf în moleculă.

Inițial, aceste entități chimice noi au generat scepticism și critică printre cercetători și clinicieni. A durat mai mult de 5 ani până ce FDA a aprobat acest produs pentru folosirea în SUA, deși în Europa și Canada se folosea din 1976, respectiv 1982. De la mijlocul anilor 1970, studii din toată lumea au arătat că siguranța și eficacitatea noului anestezic sunt bune.

Articaina este introdusă în clasa amidelor. În comparație cu predecesorul său, esterul procaină, amidele au o latență mai scurtă (pKa mai apropiat de pH-ul fiziologic), durată de

14

acțiune potrivită și efecte adverse locale și sistemice reduse. Produsul alergenic PABA (acid para-aminobenzoic), un metabolit frecvent al esterilor nu se obține prin hidroliza articainei.

Articaina se distinge de alte amide prin faptul că inelul tiofen conferă o solubilitate mai mare în lipide. Cu cât un anestezic local are solubilitate în lipide mai mare, cu atât crește penetrarea lui prin membranele lipidice ale epinervului. Așa cum solubilitatea în lipide este importantă pentru acțiunea drogului, legarea de proteine poate fi responsabilă de creșterea duratei anesteziei (în special în tehnicile de bloc nervos), de întârzierea sistemică a absorbției, de scăderea riscului de toxicitate și de necesitatea adăugării unui vasoconstrictor în soluția de anestezic (adrenalină 1: 100 000 sau 1: 200 000).

Deși legarea de proteine, în general, se referă la proteinele plasmatice, în anestezia locală, ea se referă și la fenomenele care se petrec în interiorul neuronului, în special în canalele de sodiu. Durata prelungită și eliberarea încetinită a medicamentului în circulația sistemică rezultă din legarea de proteine la nivel celular. Faptul că articaina se leagă în proporție de 95% de proteine are o semnificație mai mare în realizarea blocului nervos, în timp ce adrenalina joacă un rol predominant în tehnicile de infiltrație. Studiile au arătat că articaina soluție 4% cu adrenalină 1: 100 000 a cauzat mai multe efecte simpatomimetice decât articaina cu adrenalină 1: 200 000.

O altă motivație a realizării acestui studiu constă în faptul că dozele maxime recomandate pentru anestezicele locale sunt în majoritate publicate de către producători și sunt foarte conservative. De obicei, exprimarea unei doze maxime este exprimată ca o cantitate (200 mg pentru lidocaină) la adult. Locul de administrare, vârsta pacientului, bolile și medicația pacientului nu sunt luate în calcul. Vascularizația și legarea anestezicului local în țesuturi vor influența rata de absorbție în circulația sistemică. Absorbția din regiuni bogat vascularizate ca pleura, mucoasa bronșică și scalp sunt foarte rapide. Potența vasoactivă a anestezicului local de tip amidă variază. Efectul este dependent de doză, concentrații mari dau vasodilatație, cele mici determină vasoconstricție.

Studiile referitoare la farmacocinetica articainei sunt relativ puține. În 1989, Fox și colab. [13] au prezentat singura metodă cromatografică de gaze, cuplată cu spectrometria de masă pentru analiza articainei, dar metoda a avut ca aplicație clinică doar analize din urină. În 1999, Ohshima și colab. [14] au dezvoltat o metodă cromatografică de gaze cuplată cu spectrometria de masă pentru determinarea anestezicelor locale de tip ester în plasmă și urină, dar articaina nu a fost inclusă în acest studiu. În același an Richter și colab. [15] au propus o metodă cromatografică de lichide cu detecție UV pentru detecția și cuantificarea articainei și a acidului articainic în studii farmacocinetice. Muller și colab. [16] prezintă de asemenea o metodă cromatografică de lichide de dozare a articainei în plasmă. Ei au obținut o concentrație plasmatică maximă de 2.1µg/ml la 12.5 min de la administrare. Cel mai recent articol publicat în 2009 de către Hoizey și colab. [17] pune la punct o metodă LC-MS pentru determinarea articainei în plasma umană. Limita de cuantificare de 78.1 ng/ml este destul de mare în acest caz, dar suficientă pentru detectarea

15

concentrațiilor plasmatice în cazul utilizării unor doze de anestezic de peste 200 mg. Metoda este însă destul de costisitoare din punct de vedere al aparaturii folosite, iar sensibilitatea prezentată mai sus prin limita de cuantificare este scăzută și costurile nu sunt justificate.

Analiza atentă a acestor metode analitice din literatură demonstrează o lipsă de omogenitate a rezultatelor obținute de diverși autori. Cu aproximativ aceeași doză (80 mg) administrată în aceeași zona anatomică sunt obținute rezultate total diferite. Prin administrarea aceleiași doze de anestezic local Muller și colab. [16] au obținut o concentrație plasmatică de 2.1 µg/ml, iar Oertel și colab. [18] au relatat o concentrație maximă de 0.58 µg/ml. În plus, Hoizey și colab. [17] au obținut aproximativ 1 µg/ml prin utilizarea unei doze de 211 mg articaină. Această neconcordanță a rezultatelor obținute recomandă investigații ulterioare. Rezultatele contradictorii sunt datorate în primul rând farmacocineticii diferite a articainei față de farmacocinetica celorlalte anestezice locale. Lipsa cercetărilor legate de aceste aspecte farmacocinetice, precum și tratarea superficială a modului de prelucrare a probei au condus la aceste rezultate. Elaborarea unei metode cromatografice în fază gazoasă este o premieră pentru analiza cantitativă a articainei din sângele integral, iar optimizarea metodelor lichid-cromatografice în vederea obținerii unor rezultate corecte este oportună.

De aceea scopul tezei de doctorat este de a dezvolta două metode simple care utilizează aparatură accesibilă oricărui laborator de analiză: un cromatograf de gaze ce prezintă un detector cu ionizare în flacără (DIF) și un cromatograf de lichide de înaltă performanță cu un detector cu rețea de fotodiode, ambele aflate în dotarea laboratorului de la disciplina „Chimie analitică și metode fizico-chimice de analiză”, din cadrul Facultații de Farmacie a Universității de Medicină și Farmacie din Craiova.

III.2. Design experimental Experimentele efectuate în timpul cercetărilor s-au desfășurat în mai multe etape care

sunt prezentate în continuare: 1.Într-o primă etapă ne-am ocupat de cercetarea literaturii de specialitate în ceea ce

privește farmacocinetica articainei precum și metodele utilizate pentru realizarea acestor studii farmacocinetice și care s-a materializat într-un articol [19] pe care l-am prezentat în capitolul anexe.

2.După analiza acestor metode am căutat modalități de îmbunătățire a lor în ceea ce privește selectivitatea, sensibilitatea, precizia și acuratețea.

3.În continuare am încercat să dezvoltăm metode îmbunătățite (prin cromatografie în fază gazoasă și în fază lichidă) prin încercări repetate, folosind substanțe standard. Aceasta etapă include:

-alegerea coloanei cromatografice potrivite pentru compușii cu caracter slab polar, așa cum este articaina.

-alegerea unui standard intern potrivit pentru analitul în cauză (un compus care să se găsească în stare pură și care să aibă proprietăți apropiate articainei – compus din

16

aceeași clasă, care să aibă același domeniu ca timp de retenție și al cărui peak cromatografic să nu se suprapună cu peak-ul articainei).

-alegerea solventului de extracție potrivit (sau a raportului de amestecare în cazul unei mixturi de solvenți) pentru ca recuperarea la extracție să fie cât mai mare atât pentru analit cât și pentru standardul intern.

-alegerea gazului purtător în cazul cromatografiei în fază gazoasă, respectiv a fazei mobile în cazul cromatografiei de lichide, a debitului acestora și a pH-ului.

-alegerea condițiilor specifice de lucru: temperatura injectorului, a coloanei, a detectorului (în cazul cromatografiei de gaze), temperatura coloanei, raportul amestecării solvenților, alegerea lungimii / lungimilor de undă la care să se facă detecția (în cazul cromatografiei în fază lichidă).

4.Am aplicat aceste metode prin introducerea substanțelor standard (articaina și standardul intern) în probe „blank” de sânge și am ajustat respectivele metode de lucru în funcție de eventualele interferențe generate de compușii endogeni prezenți în sângele uman.

5.În ultima fază am realizat un studiu farmacocinetic prin injectarea unor voluntari sănătoși cu anestezic local și colectarea probelor de sânge la intervale de timp bine stabilite și am comparat aceste date cu cele din literatura de specialitate.

În derularea cercetării au fost respectate normele generale de conduită privind necesitățile etice în cercetare atât la nivel instituțional (Codul de Etică Universitară al UMF Craiova) cât și național (Codul Deontologiei Medicale din 06.06.1997) cât și a Declarației de la Helsinki actualizate de Asociația Medicală Mondială în 1996 și Convenției asupra drepturilor omului și biomedicină a Consiliului Europei adoptată în 1996. Recoltarea probelor de sânge s-a efectuat cu consimțământul informat al pacienților conform Convenției Internaționale a Națiunilor Unite. Studiul efectuat a ținut cont de prevederile Conferinței Internaționale de Armonizare susținută de autoritățile competente în domeniul medicamentului precum și de ghidurile etice internaționale pentru cercetarea biomedicală pe subiecți umani revizuită în 1993, 2001 și 2002.

III.3. Studiul I – Contribuții personale la dezvoltarea unei metode gaz-

cromatografice de analiză a articainei și modalitatea de aplicare într-un studiu farmacocinetic

III.3.1. Motivația și obiectivele studiului Articaina a fost sintetizată mai târziu decât celelalte anestezice locale (1969) astfel că a

fost mai puțin studiată. O singură metodă gaz-cromatografică a fost raportată până în prezent pentru analiza articainei din probe de urină. În schimb, cunoașterea exactă a nivelurilor plasmatice ale articainei în sânge este mult mai importantă, datorită efectelor adverse care pot apărea odată cu creșterea concentrației. Efectele adverse raportate constau în general în efecte SNC: efecte subiective – senzație de cap gol, amețeală,

17

dezorientare, anxietate, tulburări vizuale și auditive, și efecte obiective – tremurături ale mușchilor feței. Aceste efecte nu apar în condițiile utilizării în medicina dentară a unei doze de până la 80 mg (echivalentul unui cartuș care conține 4% articaină). Riscul injectării intravasculare în cazul intervențiilor în medicina dentară poate ajunge până la 20%, datorită vascularizării intense a acestei zone anatomice. În acest caz, pot apărea reacțiile adverse menționate anterior.

Având în vedere faptul că până în prezent a fost dezvoltată numai o singură metodă gaz-cromatografică pentru analiza articainei din urina umană și care nu abordează aspectele mult mai complexe care apar atunci când analiza se face din sânge integral, unul din obiectivele acestui studiu este acela de a elabora și valida o metodă gaz-cromatografică de analiză a articainei din sângele uman. Un alt obiectiv îl reprezintă aplicarea acestei metode în cadrul unui studiu farmacocinetic pentru determinarea concentrațiilor plasmatice ale articainei și evaluarea efectelor adverse care apar la subiecții incluși în studiu. Administrarea articainei s-a efectuat în scopul realizării blocului nervului alveolar postero-superior, procedeu foarte des folosit în medicina dentară.

III.3.2. Material și metodă III.3.2.1.Designul studiului clinic în vederea recoltării probelor biologice Studiul a fost realizat în conformitate cu normele GCP (Good Clinical Practice) și cu

declarația de la Helsinki (Sommerset West Amendment, 1996). Pentru ca lotul să fie reprezentativ din punct de vedere statistic am stabilit criterii de excludere din studiu. Acestea au inclus au inclus antecedente de alergie la medicamente, abuzul de droguri sau alcool, glaucomul și bolile cronice (afecțiuni care pot reduce activitatea funcțiilor renală și hepatică cu modificări importante în metabolizarea și eliminarea medicamentelor). Toți subiecții și-au dat consimțământul pentru participare după ce au fost informați cu privire la scopul și posibilele riscuri ale acestui studiu.

În studiu au fost incluși 8 voluntari sănătoși (4 bărbați și 4 femei între 23 și 30 de ani, cu indicele masei corporale între 20.4-24.5). A fost realizat blocul nervului alveolar postero-superior cu 1.7 ml clorhidrat de articaină 4% (68 mg) care conține 0.017 mg clorhidrat de adrenalină (Ubistesin forte, 3 M ESPE, Germania). În ziua experimentului, celor 8 pacienți implicați în studiu nu li s-a permis să mănânce, să consume băuturi alcoolice, cafea, cola, ceai sau suc de grape-fruit, alimente care pot influența activitatea enzimelor microzomiale hepatice, influențând astfel concentrația sanguină a analitului.

Recoltarea probelor de sânge s-a efectuat în cabinetul de medicină dentară de la Facultatea de Medicină Dentară din Craiova după efectuarea anesteziei locale în vederea unor tratamente dentare.

Sângele venos a fost colectat în tuburi (câte 4 ml în fiecare tub), în care s-au introdus inițial câte 2 ml soluție neostigmină metilsulfat 0.3 mM) la 5; 10; 12.5; 15; 17.5; 20; 22.5; 25; 27.5; 30; 45; 60; 75 și 90 de minute după administrarea articainei.

Alegerea timpilor de recoltare s-a făcut în funcție de datele prezentate în literatură de alți cercetători, cu scopul de a optimiza metoda de recoltare a probelor.

18

III.3.2.2. Stabilirea metodei cromatografice în fază gazoasă de determinare a

concentrațiilor plasmatice ale articainei III.3.2.2.1. Reactivi Reactivii utilizați, articaina și lidocaina (standardul intern) ca baze libere au fost

procurate de la Sigma-Aldrich, iar acetonitrilul, n-hexanul și alcoolul izoamilic de la Merck. Am considerat necesară evaluarea articainei și lidocainei din punct de vedere al purității, pentru a evita rezultatele ulterioare inexacte. Toți reactivii au îndeplinit standardele de puritate pentru utilizarea în cromatografia în fază gazoasă. Apa ultrapură a fost preparată cu ajutorul unui sistem de purificare a apei “Milli-Q Waters”.

III.3.2.2.2. Prepararea soluțiilor stoc și a soluțiilor de lucru Soluțiile stoc de articaină și lidocaină ca baze libere cu concentrația de 1 mg/ml au

fost preparate în acetonitril și păstrate la 4°C. Soluțiile de lucru (20 µg/ml) au fost preparate zilnic prin diluție cu acetonitril.

III.3.2.2.3. Prepararea standardelor de sânge și a probelor Pentru curba de calibrare, peste sângele heparinizat (1 ml) s-au adăugat pe rând 0.1, 0.2,

0.3, 0.6, 1.2, 2.4 și 4.8 µg articaină, cantități adăugate din soluțiile de lucru. Având în vedere că se folosește metoda standardului intern, în fiecare probă s-au adăugat 0.6 µg (30 µl din soluția de lucru) lidocaină. Pentru a bloca activitatea esterazelor din sânge, 500 µl soluție neostigmină metilsulfat 0.3 mM a fost adăugată înainte de adăugarea articainei.

Pentru testul recuperării și al preciziei în proba de sânge au fost adăugate 0.5, 1 și 2 µg articaină, apoi câte 0.6 µg lidocaină din soluția de lucru. Modul de prelucrare a probelor este prezentat în continuare.

III.3.2.2.4. Extracția lichid-lichid Toate probele au fost identic tratate, după cum urmează: peste 1 ml sânge heparinizat, s-

au adăugat 500 µl soluție neostigmină metilsulfat 0.3 mM, 30 µl soluție lidocaină (0.6 µg) și 300 µl soluție Na2CO3 1 M (pH 10). Amestecul a fost de două ori extras cu câte 1 ml de solvent (amestec n-hexan: alcool izoamilic 90:10 v/v). Probele au fost agitate timp de 5 minute și centrifugate 10 minute la 3000 x g. Apoi, straturile organice au fost transferate în tuburi conice și evaporate la sec sub un curent slab de azot la temperatură ambiantă. Pentru analiza prin gaz cromatografie, reziduul a fost redizolvat în 200 µl acetonitril și 1 µl a fost injectat în sistemul de injecție al cromatografului de gaze.

III.3.2.2.5. Echipamente și condiții cromatografice pentru analiza prin

cromatografie în fază gazoasă Analiza prin cromatografie în fază gazoasă a fost realizată cu un cromatograf produs de

firma Agilent Technologies, modelul HP 6890, echipat cu un injector split-splitless și un detector cu ionizare în flacără. Compușii au fost separați pe o coloană capilară HP

19

INNOwax procurată tot de la Agilent cu dimensiunile 30 m x 0.25 mm (diametrul interior) x 0.25 µm grosimea filmului de fază staționară. Gazul purtător a fost hidrogenul cu un debit de 2 ml/min. Probele de 1 µl au fost injectate în modul splitless.

Temperatura de lucru a injectorului și a detectorului a fost de 240°C. Temperatura cuptorului în care se găsește coloana a fost programată astfel: a fost menținută la 80°C pentru 1 min, apoi crescută cu 20°C/min până la 150°C, apoi cu 5°C/min până la 240°C, unde a fost menținută 10 min. Gazul de întreținere (azotul) a avut un debit de 35 ml/min.

III.3.2.2.6. Curba de calibrare Pentru determinarea linearității, probele standard au fost preparate la 7 nivele de

concentrație (0.1-4.8 µg/ml). Modul de lucru a fost prezentat la extracția lichid-lichid. Fiecare dintre standarde a fost de 3 ori preparat și analizat. Curba de regresie lineară a fost obținută prin realizarea graficului în care pe ordonată avem raportul suprafețelor peak-urilor articainei și lidocainei, iar pe abscisă concentrația articainei din standardul analizat (metoda standardului intern). Concentrația standardului intern a fost aceeași pentru toate probele (0.6 µg).

III.3.3. Rezultate III.3.3.1. Curba de calibrare Rezultatele curbei de calibrare sunt prezentate în tabelul de mai jos prin ecuația de

regresie liniară și coeficientul de corelare.

Metoda

Concentrații (μg/ml)

Ecuația de regresie liniară

r2

Cromatografie în fază gazoasă (metoda standardului intern)

0.1 – 4.8 y = 0.10 + 1.45 x 0.9995

Tabelul 1. Rezultatele curbei de calibrare (n=3)

În figura de mai jos este ilustrată grafic curba de calibrare, unde pe abscisă este

reprezentată concentrația articainei, iar pe ordonată raportul suprafețelor peak-urilor articainei și lidocainei (figura 1).

20

Figura 1. Reprezentarea grafică a curbei de calibrare obținută prin cromatografie în

fază gazoasă (metoda standardului intern)

III.3.3.2. Extracția lichid-lichid Recuperarea absolută a articainei a fost calculată raportând suprafețele obținute

pentru probele de sânge în care s-a introdus analitul în cantitate cunoscută (0.5; 1; 2 µg/ml) la suprafețele obținute prin injecția directă a analitului în cromatograful de gaze (n=5).

Am investigat, de asemenea, recuperarea relativă care reprezintă raportul între suprafețele obținute după introducerea analitului în cantitate cunoscută în probe „blank” (sânge care nu conține analit) și suprafețele obținute după introducerea analitului în apă ultrapură pentru cele 3 niveluri de concentrație (0.5; 1; 2 µg/ml, n=5).

Ca solvenți de extracție, au fost testați mai mulți solvenți și amestecuri de solvenți: ciclohexanul, n-hexanul, n-hexan-i-propanol 80:20 (v/v), ciclohexan-alcool izoamilic 80-20 (v/v), dietileterul și n-hexan-alcool izoamilic. Cele mai bune rezultate, ca și recuperare la extracție a articainei, dar și a lidocainei au fost obținute cu amestecul format din n-hexan-alcool izoamilic 90:10 (v/v) când s-au obținut recuperări între 64-66%. Pentru cele 3 niveluri de concentrație rezultatele au fost între 97-102% atât pentru articaină cât și pentru lidocaină.

III.3.3.3. Separarea prin cromatografie în fază gazoasă Cromatograma prezentată mai jos a rezultat în urma analizei unei probe standard,

utilizată la obținerea curbei de calibrare și indică peak-urile obținute pentru cei doi

21

compuși (articaina și standardul intern-lidocaina). Timpii de retenție ai celor doi analiți au fost de 17.6 min pentru lidocaină și 23.1 min pentru articaină. Rezoluția separării celor doi compuși este mare, peak-urile sunt ascuțite și au o lățime mică la bază și nu se suprapun cu nici un compus endogen fapt care contribuie la o cuantificare corectă a articainei. Forma gaussiană a peak-urilor demonstrează repartiția aproape ideală între faza mobilă și faza staționară fapt care demonstrează o alegere corectă a fazei staționare și grosimii acesteia, a gazului purtător și a debitului prin coloana cromatografică.

Figura 2. Cromatograma unei probe standard care conține 2.4 µg articaină și 0.6 µg

lidocaină . Peak-ul 1-lidocaina (SI), peak-ul 2- articaina.

III.3.4.4. Validarea metodei Limita de detecție a fost determinată ca fiind cea mai mică concentrație a articainei

pentru care raportul semnal / zgomotul liniei de bază a cromatogramei este de 3:1. Această limită de detecție prin această metodă a fost găsită ca fiind 20 ng/ml.

Limita de cuantificare reprezintă cea mai mică concentrație sanguină a articainei pentru care raportul semnal / zgomotul liniei de bază a cromatogramei este de 10:1, iar precizia exprimată prin deviația relativă standard să nu depășească 20%. Prin injecția unor cantități descrescânde de anestezic local, această valoare a fost determinată ca fiind 100 ng/ml.

În ceea ce privește precizia și acuratețea, rezultatele sunt prezentate în tabelul 2. Acuratețea a fost determinată ca fiind raportul procentual între concentrația medie găsită la analiză și concentrația introdusă:

Acuratețe = 100 x (concentrație medie găsită / concentrație introdusă

Precizia a fost determinată ca fiind deviația relativă standard (sau DSR) și a fost

calculată ca un raport procentual între deviația standard și concentrația medie găsită:

22

DSR = 100 x (deviația standard / concentrația medie găsită

Media găsită (μg/ml) DSR % Recuperarea % Metoda

Concentrația studiată (μg/ml) Intra-day Inter-day Intra-day Inter-day Intra-day Inter-

day 0.5 0.48± 0.038 0.475± 0.039 7.92 8.2 96 95 1 0.98± 0.070 0.97± 0.067 7.22 6.90 98 97

Metoda standardului

intern 2 1.94± 0.120 1.96± 0.108 6.15 5.50 97 98

Tabelul 2. Precizia și acuratețea pentru articaina din sângele uman (n=4)

III.3.3.5. Studiul farmacocinetic Metoda a fost aplicată pentru analiza cantitativă a articainei din sângele uman. Analiza

a fost realizată printr-un studiu farmacocinetic care a cuprins un lot de 8 voluntari sănătoși. Din tabelul 3 se observă că media nivelului maxim al concentrației plasmatice a articainei în sânge este 2.34 µg/ml la 20 min după administrare. Tabelul prezintă rezultatele complete ale studiului farmacocinetic realizat pe lotul de 8 pacienți la intervalele de timp corespunzătoare, precum și media și deviația standard.

Fiecare probă a fost de trei ori analizată. Media obținută este cea trecută în tabelul de mai jos. Figura 3 prezintă evoluția concentrațiilor sanguine ale articainei la cei 8 voluntari în timp. Coeficientul de corelație nonparametric Spearman a fost r<0.01. Figura 4 prezintă evoluția mediei concentrației sanguine a articainei la diferite intervale de timp după administrare.

Pe acest grafic am calculat constanta de eliminare plasmatică cu relația:

1

21

21 min174.0lnln −=

−−

−=tt

CCKe

Timpul mediu de înjumătățire plasmatică l-am calculat cu relația: min98.3

174.0693.02ln

2/1 ===eK

T

Concentrație (μg/ml)

Timp (min)

X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Xm

DS

5 0.127 0.134 0.137 0.139 0.141 0.143 0.147 0.152 0.140 0.008 10 0.318 0.329 0.339 0.346 0.352 0.359 0.367 0.390 0.350 0.023

12.5 0.612 0.633 0.642 0.649 0.652 0.659 0.668 0.685 0.650 0.022 15 1.129 1.163 1.182 1.190 1.212 1.239 1.260 1.305 1.210 0.056

17.5 1.715 1.772 1.805 1.815 1.830 1.841 1.857 1.925 1.820 0.062 20 2.224 2.279 2.287 2.325 2.335 2.355 2.398 2.517 2.340 0.089

22.5 1.840 1.909 1.928 1.940 1.961 1.972 2.010 2.040 1.950 0.062 25 1.134 1.189 1.199 1.215 1.230 1.247 1.272 1.274 1.220 0.047

27.5 0.602 0.628 0.639 0.645 0.661 0.668 0.672 0.685 0.650 0.027 30 0.380 0.395 0.399 0.402 0.410 0.413 0.426 0.455 0.410 0.023

23

45 0.302 0.318 0.324 0.327 0.331 0.335 0.342 0.361 0.330 0.017 60 0.304 0.317 0.323 0.326 0.329 0.336 0.344 0.321 0.325 0.012 75 0.197 0.206 0.211 0.214 0.217 0.221 0.226 0.228 0.215 0.010 90 0.184 0.193 0.199 0.203 0.207 0.212 0.219 0.199 0.202 0.011

Tabelul 3. Concentrații sanguine ale articainei obținute prin analiza gaz-cromatografică la diferiți timpi după administrare (n=3)

Figura 3. Evoluția concentrațiilor plasmatice în funcție de timp la 8 pacienți cărora

li s-a administrat o doză de 60.28 mg articaină pentru realizarea blocului nervos alveolar postero-superior

24

Figura 4. Evoluția mediilor concentrațiilor plasmatice în funcție de timp obținută prin cromatografie în fază gazoasă

III.3.4. Discuții III.3.4.1. Curba de calibrare Rezultatele obținute la realizarea curbei de calibrare au fost datorate unei bune alegeri

a condițiilor de lucru. Domeniul de linearitate a fost verificat între concentrațiile menționate mai sus (0.1- 4.8 µg/ml) prin coeficientul de corelație obținut. Linearitatea poate fi ușor de intuit prin reprezentarea grafică a curbei de calibrare, unde pe abscisă avem concentrația articainei, iar pe ordonată raportul suprafețelor peak-urilor articainei și lidocainei (figura 1).

Se observă foarte clar cum, odată cu creșterea concentrației articainei, raportul semnalelor generate de detector pentru cei doi compuși cresc proporțional (standardul intern fiind mereu în aceeași cantitate), linearitatea fiind cea dată de ecuația de regresie lineară prezentată în tabelul 1. Coeficientul prezentat demonstrează un înalt grad de linearitate.

III.3.4.2. Extracția lichid-lichid Evaluarea solventului folosit la extracție a fost realizată pentru a determina solventul

optim care asigură o recuperare satisfăcătoare atât a analitului, cât și a standardului intern. Am optimizat și timpii de recoltare a probelor pentru a reduce riscul ca timpul corespunzător concentrației plasmatice maxime să se situeze între două recoltări succesive și să fie omis prin recoltare la intervale prea mari de timp (5 min). În apropierea punctului de concentrație plasmatică maximă este recomandat ca aceste intervale să fie mai mici.

După testarea solvenților de extracție menționați anterior, cele mai bune rezultate, ca și recuperare la extracție a articainei, dar și a lidocainei au fost obținute cu n-hexan-alcool izoamilic 90:10 (v/v). Combinația între un solvent aprotic (n-hexanul) și un solvent capabil să formeze legături de hidrogen (alcoolul izoamilic) este potrivită pentru extracția articainei și a lidocainei din sânge.

III.3.4.3. Separarea prin cromatografie în fază gazoasă Separarea unor anestezice locale (mepivacaina și lidocaina) pe o coloană capilară de

tip carbowax (polietilenglicol cu legături încrucișate) a mai fost prezentată anterior [20]. Atunci au fost obținute peak-uri simetrice, în ciuda faptului că atât faza staționară cât și analiții au un caracter polar. După cum se poate observa din figura 2, peak-ul articainei este de asemenea simetric. Compușii au fost stabili termic atât la injector și coloană, cât și la detector.

Obținerea peak-urilor simetrice se datorează în primul rând detectorului folosit. Detectorul cu ionizare în flacără prezintă o selectivitate scăzută, adică generează un semnal evidențiat prin peak-ul cromatografic pentru orice compus care conține carbon.

25

Semnalul este direct proporțional cu numărul de atomi de carbon dar și cu concentrația analitului din probă. Chiar dacă el nu este un detector selectiv, semnalul obținut pentru articaină și standardul intern nu prezintă interferențe cu alți compuși prezenți în probă. După cum se poate observa pe cromatograma din figura 2 acești compuși sunt numeroși, și ei nu pot fi separați prin extracție. Există mai mulți factori care contribuie la separarea analiților pe coloană și la obținerea unor peak-uri pure ale analiților. Unul din factori este reprezentat de separarea analiților prin programarea temperaturii în două rampe și separarea compușilor prin intrarea în coloană în ordinea crescătoare a punctelor de fierbere. Un alt factor foarte important este lungimea coloanei (30 m) care oferă suficient timp analiților să se separe. Viteza gazului purtător este de asemenea importantă, acesta determinând scoaterea analiților de pe faza staționară și conducerea acestora către coloană. Faza staționară are și ea un rol important în separare.

Programarea temperaturii este necesară pentru a putea separa numărul mare de compuși care se găsesc în sânge. Detectorul utilizat de noi (detector cu ionizare în flacără) nu este un detector selectiv. El generează un răspuns (evidențiat prin peak-ul cromatografic) la orice compus care conține carbon, mărimea peak-ului fiind proporțională cu numărul de atomi de carbon și cu concentrația compusului respectiv. La temperatura injectorului, analitul și standardul intern sunt trecuți imediat în fază gazoasă. Temperatura scăzută (80°C) pe care compușii o întâlnesc la intrarea în coloană determină condensarea acestora în capătul coloanei. Pentru a putea separa acești compuși, cuptorul în care se găsește coloana cromatografică este inițial încălzit la o temperatură mai mică la care doar cei mai volatili compuși trec în stare de vapori și pot fi preluați de gazul purtător și apoi pot fi trecuți în coloană și mai departe către detector care generează semnalul respectiv. Pe măsura creșterii temperaturii, analiții trec în fază gazoasă în ordinea crescătoare a punctelor de fierbere și sunt trecuți prin coloană către detector. Practic se realizează o separare a analiților pe baza punctelor de fierbere, cei mai volatili, cu puncte de fierbere mai mici vor elua primii, și deci vor avea retenția cea mai mică, cei cu puncte de fierbere mai mari vor elua mai târziu, când temperatura cuptorului atinge punctul de fierbere al fiecărui compus în parte. Numărul mare de compuși poate fi observat în cromatograma prezentată în figura 2, unde articaina și lidocaina pot fi separate tocmai datorită mecanismului prezentat mai sus.

Faza staționară de tip carbowax utilizată este de fapt un lichid vâscos reprezentat de un polimer (polietilenglicol) cu legături încrucișate. În acest caz separarea se face prin cromatografie în fază gazoasă de repartiție gaz-lichid. Dacă s-ar fi folosit o fază staționară solidă aceasta ar fi avut repercusiuni asupra formei peak-urilor compușilor și integrarea acestora ar fi fost mult mai dificilă și cu erori mari. Peak-ul simetric al articainei a fost obținut în acest caz în ciuda faptului că faza staționară a fost una polară, deci o fază staționară care are tendința să rețină mai mult analitul și să modifice forma peak-ului. Rezultatele obținute la integrare în cazul obținerii curbei de calibrare, precum și pentru testele privind acuratețea și precizia metodei demonstrează că analitul se pretează pentru analiza prin cromatografie în fază gazoasă și datele de validare obținute

26

printr-o metodă simplă și cu aparatură ieftină rivalizează, după cum vom vedea în studiul următor cu cele obținute printr-o metodă modernă și anume prin cromatografie de lichide de înaltă performanță (HPLC).

III.3.4.4. Validarea metodei În termeni de linearitate și limită de detecție, curbele de calibrare obținute pentru

articaină în sângele uman au arătat o bună linearitate prin coeficientul de corelare r2 (vezi tabelul 1). Limita de detecție a fost determinată ca fiind cea mai mică concentrație a articainei pentru care raportul semnal / zgomotul liniei de bază a cromatogramei este de 3:1. Limita de detecție determinată ca fiind 20 ng/ml este suficientă pentru studiul farmacocinetic realizat.

În ceea ce privește precizia și acuratețea, pentru a îndepărta eventualele erori, acuratețea și precizia au fost determinate prin efectuarea a 4 analize pentru o concentrație dată. Determinările au fost efectuate atât în cursul aceleiași zile (“intra-day”), dar și pe standarde lăsate la temperatura camerei pentru a doua zi (determinări inter-day”). Rezultatele obținute și prezentate în tabelul 2 nu arată diferențe semnificative între determinările “intra” și “inter-day”. Atât precizia (exprimată prin DSR), cât și recuperarea obținută sunt satisfăcătoare, încadrându-se în intervalul ±10%.

III.3.4.5. Prelucrarea statistică a datelor Așa cum era de așteptat, analizând din punct de vedere statistic datele prezentate în

tabelul 3 și figura 3, fiecare variabilă din cele opt este corelată înalt semnificativ (r<0.01) cu fiecare din celelalte. Prin variabilă se înțelege o coloană de date, adică analizele făcute unui singur subiect (X1, X2,…X8). Acest fapt se poate observa foarte ușor și din graficul prezentat. Coeficientul de mai sus reprezintă de fapt coeficientul de corelație nonparametric Spearman. Chiar pe grafic se observă la fiecare dintre cele opt variabile (pacienți) tendința de creștere, maxim și apoi scădere.

III.3.4.6. Studiul farmacocinetic Este important să subliniem faptul că, până în prezent, nu există nici un articol în

literatură care să analizeze articaina, din sânge, prin cromatografie în fază gazoasă. Un singur articol publicat de Fox și colab. în 1989 [13] analizează articaina din urină prin gaz cromatografie cuplată cu spectrometria de masă. Acest fapt este cu atât mai surprinzător cu cât rezultatele obținute în cursul cercetărilor noastre arată că acest anestezic local prezintă toate condițiile necesare unei analize corespunzătoare prin cromatografie în fază gazoasă chiar utilizând sânge integral prin metoda prezentată.

Articaina este stabilă la temperaturile înalte ale injectorului și detectorului (240°C), răspunsul la detector este linear cu concentrația în ceea ce privește domeniul de concentrații de interes, peak-urile obținute sunt simetrice și reproductibile fapt care demonstrează o bună alegere a coloanei cromatografice utilizate.

27

Metoda prezentată de către Ohshima și colab. [14] și care analizează, printre alți compuși, și anestezicele locale de tip ester (cocaina și tetracaina) este destul de costisitoare din punct de vedere al aparaturii folosite (cromatografie în fază gazoasă cuplată cu spectrometria de masă). Fox și colab. [13] au analizat articaina prin aceeași metodă, însă doar din probe de urină. În cadrul prezentei teze de doctorat, a fost validată o metodă gaz-cromatografică cuplată cu un detector cu ionizare în flacără pentru determinarea articainei în sângele integral. Au fost obținute recuperări și precizii ale determinărilor bune prin metoda standardului intern. Rezultatele de la validare califică această metodă ca potrivită pentru cuantificarea articainei în studii farmacocinetice.

Blocarea activității pseudocolinesterazice a mai fost prezentată de diverși autori, dar nu pentru analiza articainei. În acest studiu, a fost stabilită concentrația optimă de neostigmină metilsulfat capabilă să împiedice hidroliza articainei în cursul pregătirii probelor.

În ceea ce privește rezultatele studiului farmacocinetic, principalii parametri vizați (concentrația maximă plasmatică, timpul concentrației maxime și timpul de înjumătățire plasmatic) prezintă o similaritate surprinzătoare cu parametrii obținuți în cel de-al doilea studiu care va fi prezentat în continuare. Rezultatele obținute de alți cercetători sunt total diferite de rezultatele prezentate în prezenta teză de doctorat, mai ales în ceea ce privește timpul de înjumătățire plasmatic. Figura 4 este elocventă în acest sens și confirmă că timpul de înjumătățire plasmatic este de aproximativ 4 min, ceea ce indică o metabolizare mai intensă a probei. Literatura de specialitate prezintă acest parametru ca fiind de aproximativ 15-20 min, funcție de doza de anestezic administrată și de maximul plasmatic obținut. De asemenea timpul concentrației maxime plasmatice este de aproximativ 20 min, alți cercetători stabilindu-l la 10-15 min. În schimb, concentrația maximă obținută (2.34 µg/ml) la utilizarea dozei de 68 mg clorhidrat de articaină diferă de datele din literatură, care pentru această doză stabilesc nivele maxime între 0.5-0.8 µg/ml. Acest lucru poate fi explicat prin utilizarea soluției de neostigmină metilsulfat care împiedică hidroliza articainei la acid articainic, chiar în timpul recoltării, stocării sau pregătirii pentru analiză a probei. Concluzia este că răcirea probei în amestec de apă cu gheață, realizată de alți autori, nu este la fel de eficientă pentru inactivarea esterazelor plasmatice ca blocarea chimică cu neostigmină. Rezultatele acestui studiu sunt practic identice cu cele obținute în studiul prin cromatografie în fază lichidă (HPLC) prezentat în capitolul următor, fapt care demonstrează odată în plus validitatea metodei prezentate.

În subcapitolul amintit mai sus, sunt discutate rezultatele similare obținute prin cele două metode în comparație cu rezultatele din literatura de specialitate și impactul pe care noile descoperiri îl poate avea asupra domeniului studiat.

Metoda dezvoltată și prezentată mai sus [21] este prima din literatură în care concentrația sanguină a articainei este determinată prin cromatografie în fază gazoasă. Detectorul cu ionizare în flacără ca mijloc de detecție nu a mai fost utilizat până în prezent pentru analiza articainei. Acest fapt este surprinzător datorită rezultatelor bune

28

obținute cu acest tip de detector și datorită ușurinței cu care se interpretează datele obținute.

III.3.5. Concluzii În urma studiului prezentat mai sus, pot fi trase mai multe concluzii: 1. În ceea ce privește curba de calibrare, rezultatele obținute demonstrează o

excelentă linearitate în intervalul cercetat, prin coeficientul de corelație. Trebuie subliniat faptul că toate concentrațiile determinate în cadrul studiului farmacocinetic s-au situat în acest interval.

2. Cercetarea a inclus și o evaluare a mai multor solvenți folosiți la extracție. Criteriul cel mai important în alegerea solventului a fost reprezentat de concordanța între recuperările la extracție obținute pentru analit și pentru standardul intern, de aceea am ales solventul pentru care recuperările celor doi compuși au fost cele mai apropiate: n-hexan-alcool izoamilic 90:10 (v/v).

3. Evaluarea recuperării relative este foarte importantă în cazul de față pentru că analiza s-a efectuat dintr-o probă biologică complexă (sânge integral). Influența compușilor aflați în sânge s-a dovedit a fi nesemnificativă și nu a influențat recuperarea la extracție.

4. Programarea rampei de temperatură a coloanei duce la evitarea suprapunerii peak-urilor cromatografice și obținerea unor rezultate bune, ținând cont de numărul mare de compuși care se găsesc în sângele uman.

5. Compușii au fost stabili termic la injector, coloană și detector. Peak-urile cromatografice obținute pentru analit și standardul intern au fost simetrice în ciuda faptului că sunt compuși polari, iar coloana cromatografică este de asemenea una polară, de tip carbowax.

6. Limita de detecție obținută a fost de 20 ng/ml, iar cea de cuantificare 100 ng/ml. Aceste limite sunt suficient de mici pentru realizarea studiului farmacocinetic al articainei administrată în doza de 68 mg pentru blocarea nervului alveolar postero-superior.

7. Blocarea activității pseudocolinesterazice a fost făcută cu neostigmină metilsulfat, căreia i-am determinat și concentrația optimă. Ea reprezintă o etapă importantă a analizei, deoarece pentru probele standard la care nu s-a utilizat inhibitorul de colinesterază, în urma determinărilor am obținut concentrații mai mici de analit.

8. Conform coeficientului nonparametric Spearman, cele opt variabile, reprezentate de cei opt voluntari sunt corelate înalt semnificativ, ceea ce înseamnă că variabilele au același comportament, deci rezultatele sunt semnificative din punct de vedere statistic.

9. Metoda prezentată mai sus este prima din literatură în care se efectuează analiza articainei din sânge integral prin cromatografie în fază gazoasă cuplată cu un detector cu ionizare în flacără. Este de subliniat faptul că metoda este mult mai simplă, atât ca aparatură utilizată (care este mult mai accesibilă), cât și ca modalitate de interpretare a rezultatelor, care se poate face printr-o simplă integrare, spre deosebire de spectrometria de

29

masă unde interpretarea unui spectru este, uneori, destul de dificilă, fapt datorat numeroaselor fragmentări ale ionului molecular.

10. Nivelul maxim al concentrației sanguine a articainei a fost găsit ca fiind de 2.34 µg/ml. În lipsa unor date din literatură cu privire la concentrațiile sanguine ale articainei obținute printr-o metoda cromatografică în fază gazoasă, am comparat rezultatele cu cele obținute prin metoda cromatografică în fază lichidă, similaritatea lor contribuind odată în plus la validarea ambelor metode prezentate.

11. Concentrațiile sanguine mai mari decât cele prezentate de alți autori au fost realizate printr-o prelucrare a probei și o analiză cromatografică corect efectuate și validate.

12. Administrată în doze terapeutice și în lipsa injectării accidentale intravasculare, articaina nu a generat reacții adverse de tip SNC sau cardiovasculare la nici unul din cei opt subiecți cercetați.

III.4. Studiul II – Contribuții personale la dezvoltarea unei metode

cromatografice de lichide de înaltă performanță pentru analiza articainei și modalitatea de aplicare într-un studiu farmacocinetic

III.4.1. Motivația și obiectivele studiului Până în prezent, doar câteva metode lichid-cromatografice au fost prezentate în

literatură cu privire la analiza articainei din sângele uman. În 1993, Oertel și colab. [22] au prezentat o metodă de analiză folosind cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) pentru determinarea cantitativă a articainei și metabolitului său acidul articainic din serul uman, după administrarea în submucoasa bucală a 80 mg de clorhidrat de articaină. După precipitarea cu acid percloric, 70 µl din supernatantul limpede a fost introdus în sistemul HPLC. Limita de cuantificare nesatisfăcătoare (100 ng/ml) precum și posibilitatea pierderii unei părți din analit odată cu precipitarea proteinelor serice fac din această metodă una nepotrivită pentru determinarea articainei și a acidului articainic din serul uman. De asemenea, extracția folosită de autori, cu metil-t-butileter, poate duce la recuperări scăzute ale acidului articainic care este mai polar decât articaina. În 1999, Richter și colab. [15] au prezentat o metodă HPLC cu detecție UV în care se utilizează atât precipitarea proteinelor cu acid percloric, cât și extracția pe fază solidă cu cartușe de extracție care conțin polimeri de stiren-divinilbenzen. Chiar autorii recunosc faptul că analiții (articaina și acidul articainic) ar trebui să aibă un comportament diferit la extracția pe fază solidă cu acest tip de polimer.

Metodele de determinare cantitativă a articainei prin cromatografie în fază lichidă menționate anterior au, evident, anumite neajunsuri. În afară de validarea din punct de vedere analitic a respectivelor metode, care cuprind determinări ale limitei de detecție, limitei de cuantificare, linearității, acurateței și preciziei, este necesară și o validare din punct de vedere farmacocinetic, ceea ce înseamnă că utilitatea unei metode de dozare trebuie certificată prin aplicarea acesteia pe un lot cât mai numeros de pacienți. Acest fapt nu se poate realiza decât printr-un studiu în care să fie implicați cât mai mulți subiecți,

30

pentru ca rezultatele obținute să fie reprezentative din punct de vedere statistic sau cel puțin să manifeste din acest punct de vedere o anumită tendință. Obiectivele prezentului studiu sunt reprezentate de elaborarea unei metode lichid-cromatografice (HPLC) cuplată cu detecție UV potrivită pentru dozarea articainei din sângele uman. După validarea metodei, aceasta este folosită într-un studiu farmacocinetic care să determine concentrația plasmatică a articainei din sânge la diferite intervale de timp, după administrarea acesteia prin injectare în submucoasa bucală.

III.4.2. Material și metodă III.4.2.1. Designul studiului clinic în vederea recoltării probelor biologice Acest studiu a fost realizat în conformitate cu normele GCP (Good Clinical Practice) și

cu declarația de la Helsinki (Sommerset West Amendment, 1996). Criteriile de excludere din studiu au inclus antecedente de alergie la medicamente, abuzul de droguri sau alcool, glaucomul și bolile cronice (afecțiuni care pot reduce activitatea funcțiilor renală și hepatică cu modificări importante în metabolizarea și eliminarea medicamentelor). Toți subiecții și-au dat consimțământul pentru participare după ce au fost informați cu privire la scopul și posibilele riscuri ale acestui studiu.

În studiu au fost incluși 8 voluntari sanătoși (4 bărbați și 4 femei între 23 și 30 de ani, cu indicele masei corporale între 20.4-24.5). A fost realizat blocul nervului alveolar postero-superior cu 1.7 ml clorhidrat de articaină 4% (68 mg) care conține 0.017 mg clorhidrat de adrenalină (Ubistesin forte, 3 M ESPE, Germania). În ziua experimentului, pacienților nu li s-a permis să mănânce, să consume băuturi alcoolice, cafea, cola, ceai sau suc de grape-fruit.

Sângele venos a fost colectat în tuburi (în care s-a introdus inițial neostigmină metilsulfat) la 5; 10; 12.5; 15; 17.5; 20; 22.5; 25; 27.5; 30; 45; 60; 75 și 90 de minute după administrarea articainei. Probele colectate au fost păstrate la -20°C până la efectuarea analizei.

III.4.2.2. Stabilirea metodei HPLC de determinare a concentrației plasmatice a

articainei III.4.2.2.1. Reactivi Articaina și standardul intern, lidocaina ca baze libere și neostigmina metilsulfat au

fost procurate de la Sigma-Aldrich. Acetonitrilul, trietilamina, acetatul de amoniu, acetatul de sodiu, acidul acetic, n-hexanul, ciclohexanul, i-propanolul, dietileterul și alcoolul izoamilic au provenit de la Merck. Apa purificată a fost preparată cu ajutorul unui sistem de purificare a apei „Milli-Q Waters”.

III.4.2.2.2. Prepararea soluțiilor stoc și a soluțiilor de lucru

31

Soluțiile stoc de articaină și lidocaină ca baze libere au fost preparate în acetonitril la o concentrație de 1 mg/ml și păstrate la 4°C. Soluțiile de lucru (20 µg/ml) au fost preparate zilnic prin diluție cu acetonitril.

III.4.2.2.3. Prepararea standardelor de sânge și a probelor Pentru curba de calibrare, peste 1 ml sânge heparinizat s-au adăugat succesiv 0.1, 0.2,

0.3, 0.6, 1.2, 2.4 și 4.8 µg articaină. Pentru recuperare și precizie, dar și pentru evaluarea recuperărilor la extracție, peste 1 ml sânge care nu conține analiți s-au adăugat 0.5; 1 și 2 µg (care corespund concentrațiilor scăzute, medii și mari de articaină). În fiecare probă, s-au adăugat ca standard intern 0.6 µg lidocaină (30 µl soluție de lucru).

III.4.2.2.4. Extracția lichid-lichid Ca solvenți de extracție au fost făcute mai multe teste: ciclohexanul, n-hexanul, n-

hexan-i-propanol 80:20 (v/v), ciclohexan-alcool izoamilic 80:20 (v/v), dietileterul și n-hexan-alcool izoamilic 90:10 (v/v). Toate probele au fost identic tratate: peste 1 ml sânge heparinizat, s-au adăugat 500 µl soluție neostigmină metilsulfat 0.3 mM, 30 µl soluție lidocaină (0.6 µg) și 300 µl soluție Na2CO3 1M (pH 10). Amestecul a fost de două ori extras cu câte 1 ml solvent de extracție. Probele au fost agitate timp de 5 min și apoi centrifugate timp de 10 min la 3000 x g, pentru separarea celor două straturi: stratul superior - solventul utilizat și stratul inferior – care este de fapt sângele folosit pentru analiză. Apoi, straturile superioare au fost transferate în tuburi conice și evaporate la sec sub un curent de azot la temperatura ambiantă. Reziduul rezultat a fost redizolvat în 200 µl de fază mobilă, iar 20 µl au fost injectați în sistemul de injecție al cromatografului de lichide.

III.4.2.2.5. Echipamente și condiții cromatografice Analiza lichid-cromatografică a fost făcută cu ajutorul unui sistem cromatografic

„Thermo Finnigan Surveyor” echipat cu un detector cu rețea de fotodiode care folosește un soft de achiziție a datelor „Thermo Finnigan Xcalibur”. Separarea a fost realizată folosind o coloană cromatografică cu faze inversate de tip C18 (Thermo Scientific Hypersil GOLD) cu dimensiunile 250 mm x 4.6 mm (diametrul interior) și cu grosimea particulelor de fază staționară de 5 µm. Compușii au fost eluați izocratic la un debit de 1 ml/min cu două faze mobile, acetonitril-soluție apoasă de acetat de amoniu 10 mM 50:50 (v/v) pH 7, și acetonitril-soluție tampon acetat de sodiu 10 mM și acid acetic 10 mM 50:50 (v/v) pH 4.7.

Monitorizarea s-a făcut cu ajutorul detectorului cu rețea de fotodiode, atât prin monitorizarea întregului spectru UV, cât și la cele două lungimi de undă discrete, la 274 nm pentru articaină și 190 nm pentru standardul intern lidocaină. Aceste lungimi de undă corespund maximelor de absorbție ale celor doi compuși.

III.4.2.2.6. Curba de calibrare

32

Pentru determinarea linearității, probele standard au fost preparate la 7 niveluri de concentrație (0.1; 0.2; 0.3; 0.6; 1.2; 2.4; 4.8 µg/ml). Aceste probe au fost de trei ori preparate și analizate. Pentru analiza articainei a fost folosită metoda regresiei liniare. Curba de calibrare a fost obținută reprezentând grafic pe ordonată raportul suprafețelor peak-urilor cromatografice ale articainei și lidocainei, măsurate la maximul lungimilor de undă al fiecărui compus, iar pe abscisă concentrația articainei din proba respectivă. Concentrația de standard intern folosită a fost aceeași în toate probele (0.6 µg/ml). Concentrația articainei din probele necunoscute a fost determinată prin aplicarea ecuației curbei de regresie liniară la raportul suprafețelor.

III.4.3. Rezultate III.4.3.1. Curba de calibrare Rezultatele curbei de calibrare sunt prezentate în tabelul de mai jos prin ecuațiile de

regresie liniară și coeficientul de corelare.

Metoda

Domeniul de concentrații studiat (μg/ml)

Ecuația de regresie liniară

Coeficientul de corelare r2

LC, SI Fază mobila cu pH 7

0.1 – 4.8 y = 0.23 + 12.35 x 0.9994

LC, SI Fază mobilă cu pH 4,7

0.1 – 4.8 y = – 0.63 + 12.39 x 0.9960

Tabelul 4. Rezultatele curbei de calibrare obținute prin cromatografie în fază lichidă (n=3)

În figura de mai jos este ilustrată grafic curba de calibrare, unde pe abscisă este

reprezentată concentrația articainei, iar pe ordonată raportul suprafețelor peak-urilor articainei și lidocainei, fiecare integrate la maximul lor de absorbție (figura 5).

33

Figura 5. Reprezentarea grafică a curbei de calibrare obținute prin cromatografie în fază lichidă obținută cu faza mobilă cu pH 4.7 (metoda standardului intern)

III.4.3.2. Extracția lichid-lichid A fost realizată evaluarea recuperărilor la extracție. Recuperarea absolută a articainei a

fost calculată raportând suprafețele obținute pentru probele de sânge în care s-a introdus analitul în cantitate cunoscută (0.5; 1; 2 µg/ml) la suprafețele obținute prin injecția directă a analitului în cromatograful de lichide (n=5). În tabelul de mai jos sunt prezentate rezultatele complete obținute pentru solvenții menționați la cele 3 concentrații.

Am investigat, de asemenea, recuperarea relativă care reprezintă raportul între suprafețele obținute după introducerea analitului în cantitate cunoscută în probe „blank” (sânge care nu conține analit) și suprafețele obținute după introducerea analitului în apă purificată pentru cele 3 niveluri de concentrație (0.5; 1; 2 µg/ml, n=5). Rezultatele au fost între 97-102% atât pentru articaină cât și pentru lidocaină.

III.4.3.3. Separarea prin cromatografie de lichide Separarea lichid-cromatografică a fost făcută pe o coloană cromatografică cu faze

inversate de tip C18 (Thermo Scientific) Hypersil GOLD. Cromatograma prezentată mai jos a rezultat în urma analizei unei probe standard, utilizată la obținerea curbei de calibrare și indică peak-urile obținute pentru cei doi compuși (articaina și standardul intern).

34

Recuperarea %

Solventul de extracție

Concentrația studiată (μg/ml)

Articaina Lidocaina 0.5 41 46 1 43 46

Ciclohexan

2 42 45 0.5 41 47 1 42 47

n-hexan

2 41 46 0.5 59 55

1 59 54

n-hexan- i-propanol 80:20 (v/v)

2 58 55 0.5 61 58 1 61 57

Ciclohexan- alcool izoamilic 80:20 (v/v)

2 62 59 0.5 57 52 1 56 52

Dietileter

2 57 51 0.5 65 66 1 66 65

n-hexan- alcool izoamilic 90:10 (v/v)

2 65 64

Tabelul 5. Evaluarea mai multor solvenți de extracție (n=5)

Figura 6. Cromatograma unei probe de sânge obținută la 20 min după administrarea

articainei la un pacient, cu faza mobilă cu pH 4.7 și lungimea de undă 220 nm (peak-ul 1 – articaina, 2 – lidocaina)

35

III.4.3.4. Validarea metodei Pentru analiza stabilității analitului și standardului intern în soluțiile stoc și de lucru

(n=5), s-a făcut evaluarea atât la temperatura camerei pe o perioadă scurtă de timp (6 ore) cât și în condiții de păstrare (4°C) timp de 30 de zile pentru cele 3 niveluri de concentrație (0.5; 1; 2 µg/ml). Stabilitatea în timp a fost evaluată prin compararea cu soluții proaspăt preparate și a fost de 96-105%. Probele de sânge au fost păstrate la -20°C până la analiză, fiind necesară evaluarea stabilității îngheț-dezgheț (n=5). Stabilitatea pentru trei cicluri de îngheț-dezgheț a fost determinată pentru cele trei niveluri de concentrație și a fost între 97-102%.

În ceea ce privește limita de detecție, un raport de 3:1 între semnalul analitului și zgomotul de fond al liniei de bază a cromatogramei a fost considerată a fi satisfăcătoare. După injecția directă a unor cantități din ce în ce mai mici de articaină, limita de detecție exprimată anterior a fost de 20 ng/ml. În ceea ce privește limita de cuantificare, un raport semnal/zgomot de 10:1 a fost considerat suficient pentru o bună precizie a metodei. Limita de cuantificare reprezintă, de fapt, cel mai joasă concentrație de pe curba de calibrare unde precizia (exprimată ca deviația relativă standard – DSR) este mai mică de 20%. Limita de cuantificare a fost de 100 ng/ml.

În ceea ce privește precizia și acuratețea, rezultatele sunt prezentate în tabelul 6. Acuratețea a fost determinată ca fiind raportul procentual între concentrația medie găsită și concentrația introdusă:

Acuratețe = 100 x (concentrație medie găsită / concentrație introdusă)

Precizia reprezintă deviația relativă standard (sau DSR) și a fost calculată ca un raport

procentual între deviația standard și concentrația medie găsită:

DSR = 100 x (deviația standard / concentrația medie găsită)

În tabelul de mai jos sunt prezentate acuratețea și recuperarea obținută pentru cele 3 niveluri de concentrație cu cele două faze mobile utilizate.

Concentrația medie (μg/ml) DSR % Recuperare % Metoda Concentrația țintă (μg/ml) Intra-day Inter-day Intra-day Inter-day Intra-day Inter-day 0.5 0.42± 0.05 0.42± 0.07 11.90 16.66 85 83 1 0.85± 0.10 0.86± 0.10 11.76 11.62 85 86 Faza mobilă,

pH 7 2 1.68± 0.20 1.64± 0.21 11.90 12.80 86 82 0.5 0.48± 0.04 0.48± 0.05 8.33 10.41 96 94 1 0.98± 0.05 1.07± 0.07 5.10 6.54 101 98 Faza mobilă,

pH 4,7 2 1.98± 0.09 1.92± 0.09 4.54 4.68 98 98

Tabelul 6. Precizia și acuratețea determinărilor articainei în sângele uman prin cromatografie în fază lichidă

36

III.4.3.5. Studiul farmacocinetic Metoda a fost aplicată pentru analiza cantitativă a articainei din sângele uman. Analiza

a fost realizată printr-un studiu farmacocinetic care a cuprins un lot de 8 voluntari sănătoși. Din tabelul 7 se observă că media nivelului maxim al concentrației plasmatice a articainei în sânge este 2.36 µg/ml la 20 min după administrare. Tabelul prezintă rezultatele complete ale studiului farmacocinetic realizat pe lotul de 8 pacienți, precum și media și deviația standard. Figura 7 prezintă evoluția concentrațiilor sanguine ale articainei la cei opt voluntari. Figura 8 prezintă evoluția mediei concentrației sanguine a articainei la diferite intervale de timp după administrare.

Pe acest grafic am calculat constanta de eliminare plasmatică cu relația:

1

21

21 min171.0lnln −=

−−

−=tt

CCKe

Timpul de înjumătățire plasmatică l-am calculat cu relația: min03.4

171.0693.02ln

2/1 ===eK

T

Concentrație (μg/ml)

Timp (min)

X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Xm

DS

5 0.125 0.135 0.137 0.140 0.143 0.145 0.147 0.132 0.138 0.007 10 0.317 0.329 0.339 0.347 0.353 0.358 0.367 0.414 0.353 0.029

12.5 0.611 0.634 0.642 0.648 0.652 0.660 0.668 0.725 0.655 0.033 15 1.128 1.164 1.181 1.190 1.214 1.240 1.261 1.318 1.212 0.056

17.5 1.710 1.772 1.806 1.817 1.827 1.842 1.859 1.967 1.825 0.073 20 2.225 2.281 2.288 2.327 2.337 2.358 2.401 2.663 2.360 0.105

22.5 1.837 1.910 1.926 1.938 1.963 1.971 2.013 2.058 1.952 0.066 25 1.137 1.190 1.201 1.216 1.233 1.247 1.270 1.290 1.223 0.048

27.5 0.605 0.626 0.640 0.647 0.665 0.670 0.674 0.665 0.649 0.024 30 0.378 0.394 0.400 0.403 0.410 0.412 0.425 0.442 0.408 0.019 45 0.303 0.319 0.323 0.328 0.333 0.335 0.341 0.374 0.332 0.020 60 0.304 0.317 0.321 0.323 0.328 0.335 0.344 0.296 0.321 0.015 75 0.195 0.204 0.210 0.214 0.216 0.222 0.226 0.225 0.214 0.010 90 0.182 0.191 0.198 0.201 0.205 0.210 0.219 0.226 0.204 0.011

Tabelul 7. Concentrații sanguine ale articainei obținute prin analiza lichid-

cromatografică la diferiți timpi după administrare (n=3)

37

Figura 7. Evoluția concentrațiilor plasmatice în funcție de timp la 8 pacienți cărora

li s-au administrat 60.28 mg articaină pentru realizarea blocului nervos alveolar postero-superior.

Figura 8. Evoluția mediilor concentrațiilor plasmatice în funcție de timp obținută

prin cromatografie în fază lichidă În figura de mai jos este prezentată evoluția mediilor concentrațiilor plasmatice

obținute prin cele două metode prezentate comparativ.

38

Figura 9. Evoluția mediilor concentrațiilor plasmatice prezentate comparativ pentru

analiza gaz și lichid-cromatografică Următoarea figură prezintă evoluția deviațiilor standard obținute prin cele două

metode, gaz și lichid cromatografică.

Figura 10. Evoluția deviațiilor standard obținute prin gaz și lichid cromatografie

III.4.4. Discuții III.4.4.1. Curba de calibrare Curba de calibrare a fost realizată pornind de la limita de cuantificare de 100 ng/ml

către concentrații superioare. Ecuațiile de regresie liniară și coeficienții de corelare prezentați în tabelul 4 demonstrează o bună linearitate în domeniul de concentrații 0.1-

39

4.8 µg/ml. Odată cu creșterea concentrației articainei, raportul semnalelor generate de detector pentru cei doi compuși cresc proporțional. Figura 5 este elocventă în acest sens prin linearitatea evidentă a punctelor obținute pe grafic și exprimată statistic prin coeficienții de corelare.

III.4.4.2. Extracția lichid-lichid Evaluarea mai multor solvenți de extracție au arătat că extracția cu n-hexan-alcool

izoamilic 90:10 (v/v) este cea mai potrivită pentru determinarea cantitativă a articainei din sângele integral, după cum se poate vedea în tabelul 5. Motivul este combinația între un solvent aprotic, n-hexanul care interacționează cu componenta hidrofobă a moleculei analiților (inelul tiofen și inelul benzen) și un solvent, alcoolul izoamilic, capabil de a forma legături de hidrogen cu părțile hidrofilice ale analiților (grupele ester și amido). Raportul de 90:10 (v/v) dă o polaritate potrivită amestecului pentru a extrage atât articaina cât și lidocaina din sângele integral.

Acest raport (90:10) s-a dovedit a fi, de asemenea, cel mai potrivit, iar recuperarea în acest caz a fost de 65-66% pentru cele 3 niveluri de concentrație. Aceste date sunt comparabile cu cele prezentate de Richter și colab. [15] când recuperarea după extracția pe fază solidă a fost de 72%. Metoda pare a fi mai eficientă decât cea descrisă de Hoizey și colab. [17]. Recuperarea rezultată folosind dietileter într-un singur pas (40-42%) este mai mică decât recuperarea obținută în acest studiu în doi pași cu amestecul n-hexan-alcool izoamilic 90:10 (v/v). Am realizat aceleași cercetări și pentru lidocaină. O bună corelare obținută între recuperările analitului și ale standardului intern arată dacă standardul intern ales este potrivit pentru cuantificarea analitului. În final am folosit amestecul n-hexan-alcool izoamilic 90:10 (v/v) ca solvent de extracție pentru că recuperările obținute cu acest solvent pentru lidocaină au fost foarte apropiate de cele obținute pentru articaină.

În ceea ce privește recuperarea relativă, aceasta a fost realizată pentru a evalua „efectul matricei”, adică efectul diverșilor compuși care se găsesc în sânge și care pot influența extracția prin reținerea analiților. Rezultatele obținute au demonstrat că interferența cu compușii endogeni din sângele uman este neglijabilă.

III.4.4.3. Separarea prin cromatografie de lichide În ceea ce privește separarea lichid-cromatografică, trebuie luați în considerare

factorii care determină separarea și analiza în cromatografia de lichide de înaltă performanță: tipul solventului, procentul de solvent organic, pH-ul fazei mobile, tipul și concentrația soluției tampon, tipul coloanei [23]. Prin modificarea pH-ului fazei mobile utilizate, am încercat să determinăm rolul acestuia în modificarea retenției celor doi compuși polari pe faza staționară de tip C18.

Retenția solutului se schimbă odată cu valoarea pH-ului numai când pH-ul fazei mobile se află în intervalul de ± 1.5 unități față de valoarea pKa-ului analitului. De aici

40

rezultă că, pentru a avea un efect asupra selectivității separării, pH-ul fazei mobile trebuie să fie în acest interval.

Datorită faptului că valorile pKa pentru articaină și lidocaină sunt 7.8, respectiv 7.9, am încercat sa realizăm separarea cu o fază mobilă cu pH apropiat de aceste valori. Analizând tabelul 16, la folosirea unei soluții tampon cu pH 7 (acetonitril-soluție 10 mM acetat de amoniu 50:50, v/v) s-au obținut rezultate nesatisfăcătoare: timpi de retenție lungi, recuperări scăzute (<90%) și precizie slabă (DSR>10%), probabil datorită solubilității mai scăzute a analiților în această fază mobilă. Acest fapt ne-a determinat să schimbăm condițiile de lucru și să folosim un pH mai scăzut.

La pH acid, compușii bazici sunt ionizați total, dar sunt reținuți într-o anumită măsură pe faza staționară lipofilă. Este foarte important ca marea majoritate a moleculelor analitului să fie în aceeași formă, ionizată sau neionizată. Utilizând o fază mobilă formată din acetonitril-soluție tampon acetat de sodiu 10 mM, acid acetic 10 mM 50:50 (v/v), pH 4.7, articaina și lidocaina sunt total ionizate. Timpii de retenție au scăzut de la 6.4 min pentru articaină și 9.7 min pentru lidocaină la 4.7 min respectiv 5.3 min. Figura 6 indică cromatograma unei probe de sânge la 20 min după administrarea articainei unui pacient, utilizând o fază mobilă cu pH 4.7 și lungimea de undă de 220 nm. Prin scăderea timpilor de retenție, viteza de eluare a compușilor fiind mai mare, se obțin peak-uri cromatografice cu lățime mai mică și care pot fi corect integrate și de aici rezultă recuperarea și precizia îmbunătățite. De asemenea, prin folosirea unei faze mobile cu pH scăzut se obține o importantă economie de solvenți cromatografici.

În ceea ce privește separarea compușilor pe coloana cromatografică, cromatografia de repartiție lichid-lichid prezintă o eficacitate a separării superioară tehnicii cromatografice de adsorbție lichid-solid, când faza staționară este un solid. Peak-urile obținute în acest caz sunt de tip gaussian (simetrice), ușor de integrat. Faza mobilă are un rol important în procesul de separare, spre deosebire de gazul purtător în cazul cromatografiei în fază gazoasă. În cazul de față are loc, de fapt, o competiție între analit și moleculele fazei mobile pentru interacția cu moleculele fazei staționare. Cu cât faza mobilă conține mai mult solvent neapos (acetonitril sau metanol), cu atât are tendința să interacționeze mai mult cu faza staționară, și deci să scoată analitul în faza mobilă, micșorându-i retenția.

Spre deosebire de detectorul cu ionizare în flacără, selectivitatea detectorului cu rețea de fotodiode este mai mare. El măsoară, de fapt absorbanța soluției care trece prin dreptul fantei detectorului. Această proprietate este obținută prin baleierea lungimii de undă pe întreg spectrul UV-VIS. Articaina are lungimea de undă la care absorbția este maximă la 274 nm. Pe cromatogramele obținute la această lungime de undă, lidocaina nu apare pentru că ea prezintă absorbție scăzută. Cromatograma prezentată în figura 6 este obținută la o lungime de undă intermediară (220 nm) la care ambii compuși prezintă o absorbanță care poate fi evidențiată printr-un peak cromatografic. Prin alegerea lungimii de undă corespunzătoare putem să determinăm puritatea peak-ului cromatografic. Chiar dacă un analit eluează în același timp cu altul, cei doi compuși prezintă maxime de absorbție la lungimi de undă diferite, iar prin modificarea pe cromatograma obținută a

41

lungimii de undă, putem obține doar peak-ul de interes, eliminând astfel interferența cu compusul nedorit.

În ciuda faptului că lungimea mică a coloanei (25 cm) nu permite totdeauna o separare completă a analiților, utilizarea unui detector selectiv, cum este detectorul cu rețea de fotodiode permite obținerea de rezultate foarte bune.

III.4.4.4. Validarea metodei Datele prezentate referitoare la stabilitatea analitului și a standardului intern se

încadrează în intervalul 95-105%. Evaluarea a fost realizată la temperatura camerei, în condiții de păstrare și în condiții de îngheț-dezgheț. În ceea ce privește limita de detecție și limita de cuantificare, acestea sunt suficiente de mici pentru a evidenția concentrațiile sanguine obținute în urma dozei utilizate în prezentul studiu farmacocinetic.

Conform ultimelor recomandări, acuratețea unei determinări ar trebui să se încadreze în intervalul 85-115% (±15%), iar precizia ar trebui să aibă o valoare mai mică de 15%. Tabelul 6 indică valorile medii (n=5) pentru precizia și acuratețea determinărilor „intra-day” și „inter-day”. Acuratețea a fost de ± 15% după cum era de așteptat, cu excepția recuperării „inter-day” la faza mobilă cu pH 7. Ca precizie, rezultate mai bune au fost obținute în determinările „intra-day” decât în cele „inter-day”, dar valoarea nu a depășit 15%.

Din tabelul 6, se pot face câteva remarci: recuperări mai bune au fost obținute cu faza mobilă cu pH 4.7 dar și o precizie mai bună a fost obținută la acest pH. Absorbanța maximă a articainei este la 274 nm, iar cea a lidocainei la 190 nm. Mici modificări ale lungimii de undă la care se face determinarea pot determina modificări majore ale absorbanței. Din aceste motive, pentru a înlătura eventualele erori datorate diferențelor de absorbție între două lungimi de undă, am măsurat suprafața fiecărui compus la lungimea de undă la care acesta prezintă absorbanță maximă.

Cele mai bune rezultate în termeni de acuratețe (recuperare) și precizie (deviație relativă standard) au fost obținute cu faza mobilă cu pH 4.7 (94-101%, respectiv 4.54-10.41%).

III.4.4.5. Prelucrarea statistică a datelor Analizând din punct de vedere statistic datele prezentate în tabelul 7 și figura 7, fiecare

variabilă din cele opt este corelată înalt semnificativ (r<0.01) cu fiecare din celelalte. Prin variabilă se înțelege o coloană de date, adică analizele făcute unui singur pacient (X1, X2,…X8). Acest fapt se poate observa foarte ușor și din graficul prezentat. Coeficientul de mai sus reprezintă de fapt coeficientul de corelație nonparametric Spearman. Chiar pe grafic se observă la fiecare dintre cele opt variabile (pacienți) tendința de creștere, maxim și apoi scădere.

III.4.4.6. Studiul farmacocinetic

42

Studiul farmacocinetic prezentat mai sus a fost practic realizat prin două metode: o metodă cromatografică în fază gazoasă cuplată cu un detector cu ionizare în flacără și o metodă cromatografică în fază lichidă care utilizează un detector cu rețea de fotodiode. Este foarte important de menționat faptul că, cele două analize au fost realizate pe aceleași

probe de sânge, de aici se subînțelege oportunitatea unei comparații între cele două metode utilizate, din punctul de vedere al rezultatelor obținute și prelucrate statistic.

Din punct de vedere a mediilor concentrațiilor sanguine obținute de la cei opt pacienți prin cele două metode, se poate observa faptul că rezultatele sunt asemănătoare. Din diagrama de tip coloane prezentată în figura 9, se remarcă faptul că mediile concentrațiilor obținute prin cromatografie în fază gazoasă (coloanele albastre) și a celor obținute prin cromatografie în fază lichidă (coloanele roșii) sunt foarte apropiate.

Aceasta demonstrează că ambele metode sunt potrivite pentru studiul articainei din sângele integral.

În ceea ce privește evoluția deviațiilor standard, se observă că există tendința ca, pentru concentrații mai mari, aceasta deviație să fie mai mare în cazul determinărilor realizate prin cromatografie în fază lichidă. Diagrama de tip coloane prezentată în figura 10 ilustrează aceste rezultate.

Deviația standard ușor crescută în cazul determinărilor prin cromatografie în fază lichidă arată faptul că gradul de împrăștiere a rezultatelor obținute prin această metodă este mai mare, și deci distanța față de medie este mai mare decât în cazul determinărilor prin cromatografie în fază gazoasă. Să luăm ca exemplu deviația standard relativă pentru concentrația sanguină maximă, exprimată ca procent față de media concentrațiilor sanguine maxime. Pentru determinările cromatografice în fază gazoasă, aceasta este de 3.80%, pe când în cazul determinărilorcromatografice în fază lichidă este de 4.44%. Această diferență este, probabil datorată folosirii ca detector în analiza cromatografică în fază lichidă a detectorului cu rețea de fotodiode. În cadrul acestei metode, ecuația de regresie liniară pe baza căreia s-au obținut aceste rezultate, cuprinde pe abscisă concentrațiile standardelor de articaină, iar pe ordonată un raport între suprafața peak-ului articainei (măsurată la lungimea de undă de 274 nm) și suprafața peak-ului lidocainei, standardul intern (măsurată la lungimea de undă de 190 nm). Detectorul cu rețea de fotodiode măsoară, de fapt, absorbanța soluției eluate de faza mobilă, și este posibil, ca anumiți compuși din sânge să elueze aproximativ în același timp cu articaina. Concentrația acestor compuși interferenți este foarte mică, fapt demonstrat de deviațiile standard mici obținute pentru toate concentrațiile înregistrate, care nu influențează în mod semnificativ analiza.

După injecția submucoasă, nivelurile serice ale articainei cresc foarte rapid, lucru evidențiat și de alți cercetători. În tabelul următor sunt prezentate comparativ date din literatură care cuprind doza administrată, zona anatomică, concentrația plasmatică maximă (C max), timpul la care se obține aceasta (T max) și timpul de înjumătățire (T ½).

43

Autori Doza (mg) Zona antomică T max(min) C max (µg/ml) T 1/2 (min) Rahn și colab. [24] 80 Submucoasa bucală 10-15 0.5-0.8 15-20 Van Oss și colab. [23] 600 Administrare epidurală - 5 - Muller și colab [16] 80 Submucoasa bucală 12.5±2.5 2.1 - Rahn și colab. [25] 80 Submucoasa bucală 10-15 0.4-0.58 15-20 Oertel și colab. [18] 80 Submucoasa bucală 11 0.58 - Richter și colab. [15] 16 Submucoasa bucală - 0.125 - Hoizey și colab. [17] 211 Submucoasa bucală - 1 -

Tabelul 8. Parametrii farmacocinetici ai articainei obținuți prin

cromatografie în fază lichidă Maximul concentrației articainei în sânge după injectarea în submucoasa bucală este în

funcție de doza administrată și nu depinde nici de volumul, nici de concentrația soluției de anestezic local utilizate. Articolul prezentat în 2001 de către Rahn și colab. [24] susține că după injecția unei doze de 80 mg de articaină în submucoasa bucală, nivelul maxim seric este în intervalul 0.5-0.8 µg/ml. Pragul peste care apar efecte toxice este de aproximativ 5 µg/ml (obținută conform autorilor pentru doze de 500-800 mg articaină). Maximele se obțin la 10-15 min după injecție, funcție de doza administrată și de concentrațiile de articaina sau adrenalină din soluție. Timpul de înjumătățire este, conform autorilor 15-20 min, indiferent de doza administrată sau de concentrațiile articainei și adrenalinei din soluție. Acești parametri farmacocinetici reflectă rapida metabolizare a articainei.

În cadrul prezentului studiu, nivelul sanguin al articainei pentru o doză de 60.28 mg articaină bază a fost de 2.36 µg/ml, semnificativ mai mare decât cel prezentat de alți autori. Pentru o singură doză administrată nu are semnificație deosebită, nivelul plasmatic fiind sub jumătatea concentrației la care apar efecte toxice. La injecții repetate însă nivelurile plasmatice pot crește, iar efectele toxice pot apărea.

Există mai multe diferențe între rezultatele publicate de diverși autori și rezultatele obținute prin cele două metode prezentate anterior. În primul rând, nivelul concentrației plasmatice maxime se obține la 20 min față de numai 15 min în studiile anterioare. Apoi nivelul plasmatic scade, cu un timp de înjumătățire de aproximativ 4 minute față de cel prezentat de alți autori (20 min). Acest fapt pune în discuție metodele analitice folosite de autorii care prezintă aceste date. Concentrațiile maxime scăzute obținute de alți cercetători demonstrează o descompunere a analiților din probă fie în timpul recoltării, fie în timpul stocării, fie în timpul pregătirii probei pentru analiză. Utilizarea unui inhibitor de

44

colinesterază (enzimă care degradează rapid compuși de tip ester cum este articaina) este obligatorie, celelalte tehnici de răcire a probei nefiind eficiente. Validarea celor două metode analitice, în special prin curba de calibrare corect reprezentată, nu lasă loc de interpretare. Explicația poate fi acțiunea rapidă a colinesterazelor plasmatice care degradează rapid articaina din sânge.

Concentrația maximă de articaină în sânge a fost 2.36 µg/ml obținută la 20 min după administrare. În 1989, van Oss și colab. [23], după administrarea epidurală a 600 mg articaină au obținut o concentrație plasmatică de aproximativ 5 µg/ml. Concentrația se situează la limita la care apar efecte toxice pe SNC. Concentrația plasmatică ridicată este datorată atât dozei mari utilizate, cât și absorbției crescute a articainei de la locul administrării. În 1991, Muller și colab. [16], după administrarea aceluiași preparat utilizat de noi, dar într-o doză superioară (80 mg articaină) pentru blocul nervului mandibular la 10 pacienți, au obținut 2.1±1.3 µg/ml după 12.5±2.5 min de la administrare, parametrii care sunt mai apropiați de cei prezentați de noi. În 1997, doi cercetători de la Institutul de Farmacologie Clinică al Universității tehnice din Dresden au determinat concentrațiile plasmatice ale articainei și ale principalului său metabolit, acidul articainic prin HPLC [25]. După administrarea injectabilă în submucoasa bucală a 80 mg articaină sub formă de soluție 4% cu sau fără adrenalină, autorii au obținut concentrații maxime plasmatice de 0.4 µg/ml, respective 0.58 µg/ml la 10-15 min după injectare. Timpul de înjumătățire al articainei este în jur de 20 min. Toxicitatea sistemică scăzută este legată de transformarea rapidă a articainei în metabolitul său inactiv, acidul articainic. Concentrația articainei în alveola dentară, după extracția dintelui a fost de 100 de ori mai mare decât în circulația sistemică. În 1999, cu aceeași cantitate administrată, Oertel și colab. [18] au obținut 0.58 µg/ml, fără adrenalină, la 11 min după administrare. Ei susțin că răcirea sângelui la 4°C reduce activitatea esterazelor plasmatice. Acest fapt este însă contrazis de concentrațiile plasmatice scăzute obținute de autori, mai ales în condițiile în care s-a utilizat un preparat fără adrenalină care ar determina o absorbție sistemică crescută a articainei comparativ cu formulările care conțin adrenalină. Acest lucru conduce la concluzia că răcirea sângelui la 4°C nu este suficientă pentru inactivarea esterazelor plasmatice.

În același an, Richter și colab. [15] prezintă o metodă HPLC cu detecție UV despre care susțin că este potrivită pentru studii farmacocinetice consecutive injectării unor doze scăzute de articaină. Ca metodă de pregătire a probei, autorii folosesc extracția pe fază solidă cu polimeri de stiren-divinilbenzen. Ei au injectat la un singur subiect, prin injecție în submucoasa bucală, 16 mg clorhidrat de articaină, iar concentrația plasmatică maximă obținută a fost de 125 ng/ml. Totuși, experimentul realizat pe un singur pacient nu poate fi extrapolat și nu dovedește faptul că metoda este potrivită pentru studii farmacocinetice în care se injectează doze mici de articaină în submucoasa bucală.

Un articol recent, prezentat în 2009 de Hoizey și colab. [17] prezintă o metodă cromatografică de lichide cuplată cu spectrometria de masă pentru determinarea articainei în plasmă. După administrarea în aceeași zonă anatomică utilizată în acest studiu a unei

45

doze de 211 mg articaină (ca bază liberă), care conține și epinefrină 1:200000, probele au fost colectate la diferite intervale de timp și răcite imediat în amestec de apă cu gheață (deci aproximativ 0°C), autorii susținând că astfel este redusă activitatea esterazelor plasmatice. Acest fapt este infirmat însă de concentrațiile plasmatice obținute, nivelul plasmatic maxim fiind de aproximativ 1 µg/ml, în condițiile în care, utilizând o doză de aproximativ 3 ori mai mică studiul nostru a relevat o concentrație plasmatică maximă de 2.36 µg/ml.

Rezultatele eterogene obținute de-a lungul timpului nu sunt datorate variațiilor individuale. Ele sunt datorate metodelor de analiză utilizate. O metodă bine pusă la punct trebuie să țină seama de particularitățile articainei, pornind de la structura sa chimică și profilul farmacologic special. Luând în considerare toate aceste aspecte, prin cele două metode de analiză prezentate au fost evidențiate concentrații plasmatice mai mari decât la alți autori și un timp de înjumătățire mult mai scurt. Rezultatele practic identice obținute prin cele două metode demonstrează acuratețea datelor obținute.

Metoda dezvoltată în decursul cercetărilor noastre, care folosește metilsulfatul de neostigmină pentru blocarea esterazelor plasmatice și deci hidroliza articainei, a relevat concentrații sanguine semnificativ mai mari pentru articaină. Concentrația poate să difere într-o mică măsură de la un pacient la altul, dar diferențele majore sunt datorate metodei de analiză utilizate.

Legarea crescută a anestezicului local de proteinele plasmatice aduce în discuție oportunitatea precipitării proteinelor plasmatice în cursul prelucrării probei. Prin precipitarea proteinelor plasmatice o parte din analit poate fi pierdută odată cu eliminarea precipitatului. Cele mai bune rezultate au fost obținute în lipsa utilizării acestei modalități de prelucrare a probei. Autorii care au utilizat acest procedeu au obținut concentrații plasmatice mai mici decât în prezentul studiu.

În cursul cercetărilor am observat faptul că nivelurile concentrației articainei cresc rapid de la 0.2 µg/ml la 10 min la 2.36 µg/ml la 20 min și scad în aceeași manieră la 0.3 µg/ml la 30 min după administrare. Din această cauză am decis ca, în apropierea punctului maxim al concentrației plasmatice, să colectăm sângele la fiecare 2.5 min pentru a obține mai multe puncte pe curba concentrație plasmatică-timp.

Într-un articol din 2011, Nizharadze și colab. consideră articaina de primă alegere în anestezia locală din domeniul stomatologiei [26]. Folosirea în medicina dentară pentru prevenirea sau combaterea durerii în concentrații de 4% realizează un nivel anestezic foarte ridicat cu o toxicitate sistemică scăzută. Caracteristicile fizico-chimice superlative și profilul farmacologic prin solubilitatea lipidică crescută, legarea de proteinele plasmatice și tisulare înaltă, metabolizarea rapidă, timpul de înjumătățire prin eliminare rapid, nivelul sanguin scăzut impun utilizarea sa în țesuturi cu inflamație supurativă la adult și copilul peste 4 ani, bătrâni, femeie gravidă sau care alăptează, pacienți cu funcții hepatică sau renală scăzute.

III.4.5. Concluzii

46

În urma studiului efectuat pot fi trase mai multe concluzii: 1. În ceea ce privește curba de calibrare, atât pentru faza mobilă cu pH 4.7, cât și

pentru faza mobilă cu pH 7, rezultatele obținute demonstrează o excelentă linearitate în intervalul de concentrații cercetat, prin coeficienții de corelație obținuți. Trebuie subliniat faptul că toate concentrațiile determinate în cadrul studiului farmacocinetic s-au situat în acest interval.

2. Curba de calibrare demonstrează o foarte bună linearitate exprimată prin coeficientul de corelare pentru întreg domeniul de concentrații de interes clinic.

3. Precipitarea proteinelor plasmatice nu este indicată pentru că articaina prezintă un procent de peste 50% în formă legată, iar o parte din analit se poate pierde, acest fapt influențând negativ rezultatele obținute.

4. A fost necesară o evaluare a mai multor solvenți folosiți la extracție. Criteriul cel mai important în alegerea solventului a fost reprezentat de concordanța între recuperările la extracție obținute pentru analit și pentru standardul intern, de aceea am ales solventul pentru care recuperările celor doi compuși au fost cele mai apropiate: n-hexan-alcool izoamilic 90:10 (v/v).

5. Având în vedere faptul că analiza s-a efectuat dintr-o probă biologică complexă (sânge integral), evaluarea recuperării relative este foarte importantă în cazul de față. Influența compușilor aflați în sânge care ar putea influența procentul de extracție al analitului și al standardului intern s-a dovedit a fi nesemnificativă și nu a influențat recuperarea la extracție.

6. Am optimizat metoda de lucru prin folosirea unei faze mobile cu un pH scăzut. În aceste condiții, deși analitul și standardul intern sunt total ionizați, ei sunt totuși reținuți pe faza staționară lipofilă, retenția lor scăzută neinfluențând separarea.

7. Utilizarea detectorului cu rețea de fotodiode permite obținerea unei purități a peak-ului cromatografic necesară analizei. Selectivitatea obținută prin modificarea lungimii de undă către maximul de absorbție al analitului este esențială pentru o corectă determinare cantitativă a analitului.

8. Limita de detecție obținută a fost de 20 ng/ml, iar limita de cuantificare a fost de 100 ng/ml. Aceste limite sunt suficient de mici pentru realizarea studiului farmacocinetic al articainei administrată în doza de 68 mg pentru blocarea nervului alveolar postero-superior.

9. Blocarea activității pseudocolinesterazei a fost făcută cu neostigmină metilsulfat 0.3 mM. Această etapă reprezintă o fază importantă a analizei, deoarece pentru probele standard la care nu s-a utilizat inhibitorul de colinesterază sau el a fost utilizat în concentrații mai mici, datele au arătat o scădere a conținutului de analit în probă.

10. Rezultatele sunt semnificative din punct de vedere statistic. Conform coeficientului nonparametric Spearman, cele opt variabile, reprezentate de cei opt voluntari sunt corelate înalt semnificativ, ceea ce înseamnă că rezultatele obținute prezintă o tendință convergentă.

11. Metoda prezentată mai sus aduce ca noutate în afară de aspectele enumerate mai sus faptul că a fost validată și din punct de vedere farmacocinetic. Media concentrației

47

maxime plasmatice de 2.36 µg/ml, în contrast cu valorile obținte de alți autori (între 0.4-2.1 µg/ml) se explică prin limitarea descompunerii analitului atât în timpul stocării cât și în timpul pregătirii probelor.

IV. CONCLUZII FINALE Cercetările efectuate până în prezent referitoare la farmacocinetica articainei sunt relativ

puține. În cadrul prezentei teze de doctorat au fost elaborate și validate două metode analitice pentru determinarea articainei din sângele integral. De asemenea, a fost realizat un studiu farmacocinetic care să evidențieze nivelurile plasmatice ale articainei. Din analiza datelor prezentate anterior pot fi trase următoarele concluzii:

1. Metodele gaz și lichid-cromatografică prezentate în cadrul acestei teze de doctorat sunt metode care poate fi folosite chiar și pe sânge integral. Acest lucru este foarte important, datorită faptului că, prin precipitarea proteinelor plasmatice o parte din analit se poate pierde.

2. Curbele de calibrare obținute pentru cele două metode de analiză demonstrează o foarte bună linearitate, exprimată prin coeficienții de corelare, pentru domeniul de concentrații cercetat, iar concentrațiile obținute în urma studiului farmacocinetic au fost toate situate în acest domeniu.

3. Precipitarea proteinelor plasmatice determină pierderea unei cantități din analit și nu este recomandată în cazul compușilor cu legare crescută de proteine cum este cazul articainei.

4. Am stabilit, de asemenea, cel mai potrivit solvent pentru extracția lichid-lichid, prin evaluarea recuperărilor absolute la extracție atât pentru analit, cât și pentru standardul intern. Cercetările noastre au evaluat și recuperarea relativă, adică „efectul matricei” asupra recuperărilor analitului și a standardului intern, lucru neluat în seamă de alți cercetători.

5. Au fost obținute recuperări și precizii ale determinărilor bune prin metoda standardului intern. Rezultatele de la validare califică aceste metode ca potrivite pentru determinarea cantitativă a articainei în sângele uman, în studii farmacocinetice.

6. În ceea ce privește separarea gaz și lichid-cromatografică, nu au existat suprapuneri ale peak-urilor analitului sau standardului intern cu cele ale compușilor endogeni. Cele două metode au fost optimizate astfel încât metodele să poată fi validate din punct de vedere analitic.

7. Metoda gaz-cromatografică este validată și este pentru prima dată utilizată în analiza articainei dintr-o proba biologică complexă așa cum este sângele integral.

8. Limita de detecție prin ambele metode a fost de 20 ng/ml. Limita de cuantificare de 100 ng/ml (aceeași prin ambele metode) este suficientă pentru studiul concentrațiilor plasmatice ale articainei în doza utilizată în acest studiu.

48

9. În lipsa blocării activității colinesterazei rezultatele obținute prin ambele metode au fost mai mici, deci acest pas în pregătirea probei este obligatoriu în vederea evitării degradării unui procent din analit.

10. Pentru toți cei 8 subiecți implicați în studiu, am obținut concentrații sanguine mai mari decât cele existente în literatură prin ambele metode utilizate, ceea ce demonstrează că pregătirea probei are un rol important în analiză și că anestezicul local se pretează analizei prin metodele prezentate.

11. Din punct de vedere al analizei statistice, coeficientul nonparametric Spearman (r<0.01) arată un înalt grad de semnificație în cazul ambelor metode, deci demonstrează o tendință convergentă a rezultatelor obținute.

12. Analiza articainei prin cele două metode a fost realizată în paralel și pe aceleași probe de sânge. Rezultatele similare obținute sunt un argument în plus în ceea ce privește validarea celor două metode.

13. În cadrul prezentei teze de doctorat s-au obținut concentrații sanguine mai mari (2.36 µg/ml ) ale articainei și un timp de înjumătățire mult mai scurt (aproximativ 4 min) decât cel obținut de alți autori în condițiile utilizării aceleiași doze administrată în aceeași zonă anatomică.

14. Concentrația sanguină a articainei nu s-a apropiat de nivelurile toxice (5 µg/ml) în cazul folosirii dozei terapeutice. Nivelurile mai mari de articaină decât cele prezentate până în prezent în literatură indică prudență în cazul reinjectării unei noi doze de anestezic, necesară uneori în timpul intervențiilor în medicina dentară.

49

V. BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ [1] F. Bonnet, J. Montblanc, A. Mouhou, Anesthesie loco-regionale, La revue du

practicien 51 (2001) 846-850. [2] J.E. Fontan, Les bases pharmacologiques du choix des anesthesiques locaux,

Actualite odonto-stomatologiques no. 179, sept.1992, 523-529. [3] G.R Strichartz, J.M. Ritchie, The action of local anesthetics on ion channels tissues,

in Handbook of experimental pharmacology, vol. 81, Springer-Verlag, Berlin, 1987. [4] G.R. Strichartz, G.K. Wang, Rapid voltage-dependent dissociation of scorpion α-

toxins coupled to Na+ channel inactivation in amphibian myelinated nerves, J. Physiol. 88 (1986) 413-435.

[5] B. Cuparencu, M. Timar, The pharmacological receptors, 2nd edition (1998) 154-173.

[6] J.F. Butterworth, G.R. Strichartz, Molecular mechanism of local anesthesia - A review, Anesthesiol. 72 (1990) 711-734.

[7] V. Vedantham, S.C. Cannon, The position of the fast-inactivation gate during lidocaine block of voltage-gated Na+ channels, J. Gen. Physiol. 113 (1999) 7-16.

[8] R.A. Seymour, J.G. Meechan, M.S. Yates, Local anesthetics (local analgesics) and vasoconstrictors, In “Pharmacology and dental therapeutics”, 3rd edition, Oxford (1999) 105-127.

[9] J.P. Mariotinni, P. Jammet, F. Soyris, J.P. Santoro, L’utilisation de l’adrenaline avec les anesthesiques locaux est-elle dangereuse chez les cardiaques?, Actualite odonto-stomatologiques 179 (1992) 507-517.

[10] G.R. Arthur, A. Santos, M.D. Finister și colab., Comparative pharmacokinetics of ropivacaine and bupivacaine, Anesthesiology, r. 81, no.3a, sept. 1994, 11-78.

[11] H. Gall, R. Kaufmann, C.M. Kalveram, Adverse reactions to anesthetics: analysis of 197 cases, J. Alergy Clin. Immunol. 4 (1996) 933-937.

[12] E.J. Darrow, J.M.M.D. Badgwell, J.E. Heavner, Bupivacaine and epinephrine sinerggistically to produce ventricular arrhythmics in young pigs, Anesthesiology, r.81, no. 3a, sept.1994, pag. A1357.

[13] S.M. Fox, S.C. Chan, D.H. van Middleworth, Gas chromatographic and mass spectrometric analysis of articaine in urine, J. Chromatogr. 424 (1989) 331-334.

50

[14] T. Ohshima, T. Takayasu, Simultaneous determination of local anesthetics including ester-type anesthetics in human plasma and urine by gas chromatography-mass spectrometry with solid-phase extraction, J. Chromatogr. B 726 (1999) 185-194.

[15] K. Richter, R. Oertel, Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic determination of articaine and its metabolite articainic acid in human serum, J. Chromatogr. B 724 (1999) 109-115.

[16] W.P. Muller, P. Weiser, K.L. Scholler, Pharmacokinetics of articaine in mandibular nerve block, Regional-Anaesthesie 14 (1991) 52-55.

[17] G. Hoizey, D. Lamiable, C. Gozalo şi colab., Determination of articaine in human plasma by liquid chromatography-mass spectrometry and its application in a preliminary pharmacokinetic study, J. Pharm. Biomed. Anal. 49 (2009) 1082-1087.

[18] R. Oertel, U.Ebert, R.Rahn și colab., The effect of age on pharmacokinetics of local anesthetic drug articaine, Regional Anesthesia and Pain Medicine 24 (1999) 524-528.

[19] M. Băniceru, C.V. Manda, S.M. Popescu, Chromatographic analysis of local anesthetics in biological samples, J. Pharm. Biomed. Anal. 54 (2011) 1-12.

[20] M. Băniceru, O. Croitoru, S.M. Popescu și colab., Analysis of mepivacaine in human serum by gas chromatography after solid-phase extraction, Chromatographia 59 (2004) 351-354.

[21] C.V. Manda, M. Băniceru, S.M. Popescu și colab., Quantitative analysis of articaine in human blood by gas chromatography and its application in pharmacokinetic study, Annals of the University of Craiova, the Chemistry Series, volume XXXIX, no 1 (2010) 26-32.

[22] R. Oertel, K. Richter, K. Weile și colab., A simple method for the determination of articaine and its metabolite articainic acid in dentistry: application to a comparison of articaine and lidocaine concentrations in alveolus blood, Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 15 (1993) 541-547.

[23] G.E. van Oss, T.B. Vree, A.M. Baars și colab., Pharmacokinetics, metabolism and renal excretion of articaine and its metabolite articainic acid in patients after epidural administration, Eur J Anaesth 6 (1989) 49-56.

[24] R. Rahn și B. Benedikt, Articaine and epinephrine for dental anesthesia, Local anesthesia in dentistry, 1st Edition November 2001.

[25] R. Rahn și W. Kirch, Clinical Pharmacokinetics of articaine, Clin. Pharmacokinet. 33(6) (1997) 417-425.

[26] N. Nizharadze, M. Malamadze și N. Chipashvili, Articaine – the best choice of local anesthetic in contemporany dentistry, Georgian Med News 190 (2011) 15-23.