Rezumat DIACONU (AVASILCĂI) LILIANA

UNIVERSITATEA DE MEDICINǍ ŞI FARMACIE “GRIGORE T. POPA” IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

NITRAŢII ŞI NITRIŢII DIN PRODUSELE ALIMENTARE – PRECURSORI AI

NITROZAMINELOR

CONDUCǍTOR ŞTIINŢIFIC: PROF. DR. RODICA CUCIUREANU

DOCTORAND: ASIST. LILIANA AVASILCǍI

2012

Conform deciziei Rectoratului Universităţii de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi nr. 25890 din 22.11. 2011, a fost numită următoarea comisie de doctorat: Prof. dr. Monica Hăncianu Preşedinte Universitatea de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi Prof. dr. Rodica Cuciureanu Conducător ştiinţific Universitatea de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi Prof. dr. Doina Miere Referent ştiinţific Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca Conf. dr. Ana-Corina Ioniţă Referent ştiinţific Universitatea de Medicină şi Farmacie “Carol Davila” Bucureşti Prof. dr. Vasile Dorneanu Referent ştiinţific Universitatea de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi Susţinerea publică a tezei de doctorat va avea loc în data de 24 aprilie 2012, ora 11.00, în Sala Societăţii de Medici şi Naturalişti, Iaşi.

CUPRINS INTRODUCERE ........................................................................................ 3 OBIECTIVE ............................................................................................... 4

PARTEA GENERALA CAPITOLUL I - NITRAŢII SI NITRIŢII – COMPONENTE NATURALE ALE PRODUSELOR ALIMENTARE ............................. 5 CAPITOLUL II - NITRAŢII ŞI NITRIŢII – ADITIVI ALIMENTARI ............................................................................................ 7 CAPITOLUL III - NITRAŢII ŞI NITRIŢII – PRECURSORI AI NITROZAMINELOR .............................................................................. 12

PARTEA EXPERIMENTALA CAPITOLUL IV - ANALIZA CANTITATIVǍ A NITRAŢILOR ŞI NITRIŢILOR DIN PRODUSE ALIMENTARE .................................. 18

IV. 3. 4. DETERMINAREA NITRIŢILOR ..................................................... 18 IV. 3. 5. DETERMINAREA NITRAŢILOR ................................................... 20 IV. 4. REZULTATE................................................................................... 22

CAPITOLUL V - EVIDENŢIEREA FORMǍRII NITROZAMINELOR ÎN PREPARATELE DIN CARNE .................. 25

V. 2. OBIECTIVE ..................................................................................... 26 V. 3. 4. METODE ..................................................................................... 27 V. 4. REZULTATE .................................................................................... 29

CAPITOLUL VI - ESTIMAREA APORTULUI DE NITRAŢI ŞI DE NITRIŢI PRIN CONSUM DE ALIMENTE ................................... 35

VI. 5. OBIECTIV ...................................................................................... 35 VI. 6. MENIURI ....................................................................................... 35 VI. 8. REZULTATE................................................................................... 36

CAPITOLUL VII - EFECTUL ADMINISTRǍRII NITROZODIETILAMINEI ASUPRA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI ŞI HEMATOLOGICI LA ŞOBOLANI .................. 38

VII. 2. OBIECTIVE ................................................................................... 39 VII. 3. 3. ANIMALE DE LABORATOR ....................................................... 39 VII. 3. 5. INVESTIGAŢIA BIOCHIMICĂ ..................................................... 39 VII. 3. 6. INVESTIGAŢIA HEMATOLOGICĂ ............................................... 40 VII. 4. REZULTATE ................................................................................. 41

CONCLUZII GENERALE...................................................................... 42 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ .............................................................. 45

S-a păstrat numerotarea din teza de doctorat pentru capitole, figuri şi tabele.

1

INTRODUCERE

Preocuparea pentru asigurarea resurselor alimentare pe tot parcursul anului a condus la necesitatea conservării alimentelor. Primele metode de conservare aplicate au fost deshidratarea, sărarea şi afumarea. Odată cu descifrarea mecanismelor prin care se produce alterarea alimentelor, s-au putut descoperi şi aplica metode eficiente de conservare, care să asigure atât stabilitatea chimică şi microbiologică a produselor alimentare, cât şi satisfacerea exigenţelor consumatorilor, prin menţinerea nemodificată a proprietăţilor senzoriale şi a valorii nutritive a alimentelor.

Nitriţii prezintă toxicitate directă, manifestată prin oxidarea hemoglobinei la methemoglobină, respectiv toxicitate indirectă, datorată participării nitriţilor la formarea de nitrozamine. Toxicitatea nitraţilor se manifestă şi prin capacitatea de a se transforma în nitrozamine; nitrozaminele se pot forma atât în produsele alimentare (origine exogenă), în timpul păstrării acestora, cât şi în aparatul digestiv (origine endogenă), în special în stomac. Cele mai frecvente nitrozamine întâlnite în produsele din carne sunt: nitrozodimetilamina (NDMA), nitrozodietilamina (NDEA), nitrozodipropilamina (NDPA), nitrozodibutilamina (NDBA), nitrozopirolidina (Npir) şi nitrozopiperidina (Npip). Expunerea populaţiei la doze scăzute de nitrozamine volatile poate avea loc şi pe cale dermică, în principal în urma utilizării produselor cosmetice şi pe bază de cauciuc, dar şi pe cale inhalatorie, atât prin fumat activ, cât şi prin fumat pasiv. Agenţia Internaţională pentru Cercetarea Cancerului a clasificat nitrozo-dimetilamina şi nitrozodietilamina în categoria 2 de carcinogenitate şi mutagenitate. Legislaţia alimentului limitează conţinutul de nitraţi, nitriţi şi nitrozamine al produselor alimentare. Formarea nitrozaminelor în timpul păstrării alimentelor pe seama nitritului rezidual a fost evidenţiată prin analiza în dinamică a concentraţiilor de nitrat, nitrit şi nitrozamine iar toxicitatea NDEA a fost studiată la animale de laborator (şobolani masculi din rasa Wistar).

2

OBIECTIVE

Cercetările din cadrul tezei de doctorat au urmărit ca obiective:

1. Determinarea conţinutului în nitraţi şi nitriţi al unor produse alimentare (fructe, legume, brânzeturi fermentate şi preparate din carne).

2. Determinarea conţinutului în nitrozamine volatile

(nitrozodimetilamina – NDMA şi nitrozodietilamina - NDEA) al unor produse alimentare (brânzeturi fermentate şi preparate din carne); pentru evaluarea dinamicii formării nitrozaminelor s-a urmărit prin experiment, conţinutul acestora în produse din carne (preparate în laborator), respectiv produse industriale.

3. Estimarea aportului de nitraţi şi nitriţi prin consum de

alimente. 4. Studiul experimental privind evoluţia unor parametri

biochimici şi hematologici în intoxicaţia subacută experimentală cu nitrozodietilamină, la animale de laborator.

3

PARTEA GENERALǍ

CAPITOLUL I NITRAŢII SI NITRIŢII – COMPONENTE NATURALE ALE

PRODUSELOR ALIMENTARE I.1. Introducere

Multe dintre produsele de origine vegetală, consumate ca alimente, pot conţine în mod natural compuşi care sunt consideraţi responsabili de îmbolnăviri ale organismului consumatorului. Pentru marea majoritate a acestor produse este cunoscută substanţa responsabilă de acţiunea toxică, precum şi modalităţile prin care se poate reduce nocivitatea asupra organismului.

Azotaţii şi azotiţii au o origine dublă în produsele alimentare. Sunt componenţi naturali ai alimentelor vegetale (în special legume şi fructe) dintre care unele au capacitatea de a acumula aceste substanţe din sol.

În acelaşi timp, azotaţii şi azotiţii sunt aditivi alimentari adăugaţi pentru menţinerea culorii roz a preparatelor de carne, dar şi în scop conservant (preparate de carne, brânzeturi).

Reducerea nitraţilor la nitriţi se realizează de către reductazele microorganismelor din produsul alimentar; nitriţii rezultaţi sunt mult mai toxici decât nitraţii. Efectele toxice sunt directe, prin apariţia methemoglobinemiei, şi indirecte, prin formarea nitrozaminelor cu acţiune cancerigenă şi mutagenă.

I.3. Conţinutul de nitraţi şi de nitriţi al produselor vegetale

Nitraţii şi nitriţii pot să apară în apa potabilă ca urmare a activităţilor agricole. Compuşii ce conţin azotaţi sunt de obicei solubili şi pot să migreze usor în apele subterane. Folosirea îngrăşămintelor pe bază de azot, precum şi a îngrăşămitelor naturale pot creşte concentraţia de nitrat în sol şi implicit în apă. Compusul predominant în apele de suprafaţă cât şi în cele subterane este

4

nitratul, nitritul găsindu-se de obicei în concentraţii mici, acesta fiind uşor oxidat la nitrat. Apele de fântână din zonele poluate pot să conţină niveluri ridicate de nitraţi (Knobeloch et al., 2000).

În alimentaţia unei persoane, apa potabilă este considerată a fi cea mai importantă sursă de nitraţi, după legume, de aceea au fost stabilite anumite limite pentru nitraţi şi nitriţi în apa potabilă : 50 mg/L, respectiv 0,5 mg/L. În România, conţinutul în nitraţi al unor ape îmbuteliate este redus, cu mult sub valoarea admisă de legislaţia sanitară, de 50 mg/L

Concentraţiile de nitraţi în produsele de origine vegetală depind de condiţiile climatice, caracteristicile plantelor cât şi de proprietăţile solului unde au fost cultivate: mărimea plantei, vârsta plantei, intensitatea luminii, temperatura aerului, umiditate, perioada de cultivare, tipul de îngrăşământ, momentul recoltării, condiţiile de păstrare şi depozitare, etc. Îngrăşămintele pe bază de azot şi intensitatea luminii sunt principalii factori care influenţează conţinutul de nitraţi din plante (Santamaria, 2006). În funcţie de aceste niveluri legumele pot fi împărţite în trei categorii (Tamme et al., 2006):

a) plante cu un conţinut în nitraţi > 1000 mg/kg : rucolă (voinicică), salată verde, spanac, sfeclă roşie, etc.

b) plante cu un conţinut în nitraţi cuprins între 50-1000 mg/kg : morcovi, fasole verde, conopidă, ceapă, dovleac, vinete, cartofi, etc.

c) plante cu un conţinut în nitraţi mai mic de 50 mg/kg : fructe, fructe de pădure, cereale, etc.

În general, legumele care acumulează cele mai mari cantităţi de nitrat aparţin familiei Brassicaceae (rucolă, ridiche, muştar, etc), Chenopodiaceae (sfeclă, spanac), Amaranthaceae (Amarathus), Asteraceae (salată) şi Apiaceae (ţelină, pătrunjel) (Santamaria 2006).

Cantităţi mari au fost găsite în rucolă, o legumă exotică ce este originară din ţările mediteraneene. Utilizarea excesivă a îngrăşămintelor pe bază de azot în ultimii ani au dus la creşterea concentraţiilor de nitraţi în plantele de cultură cât şi în sursele de apă potabilă (Santamaria, 2006).

Plantele consumate integral (rădăcină, tulpină şi frunze) conduc la un aport mai mare de nitraţi decât în cazul plantelor a căror părţi

5

comestibile sunt doar fructele (Fytianos et al.,1999). În mod similar Santamaria et al. (1999) a afirmat că nivelul de nitraţi în diferite organe ale plantei diferă în funcţie de intensitatea unor procese metabolice. Concentraţia de nitraţi scade după cum urmează: peţiol > frunze > tulpină > rădăcină > inflorescenţă > tubercul > bulb > fruct > seminţe.

Într-un studiu realizat de Uwah et al., (2009) sunt prezentate şi valorile nitriţilor, care sunt mult mai mici în comparaţie cu cele ale nitraţilor: 14,46 ± 0,32 mg/kg în varză, 28,83 ± 14,53 mg/kg în salată, 44,85 ± 3,42 mg/kg în spanac.

Alte studii prezintă valori mult mai mici ale nitriţilor în legumele proaspete: 0,09-0,77 mg/kg în spanac (Jaworska, 2005), 0,472 mg/kg în varză albă, 0,29 mg/kg în castraveţi, 0,23 mg/kg în roşii (Zhong et al., 2002), 0,2 mg/kg în varză albă, 0,3 mg/kg în salată verde, 1,2 mg/kg în cartofi (Sušin et al., 2006), 4,15 mg/kg în morcovi, 2 mg/kg în ţelină (Menard et al., 2008). Unii autori au raportat valori ale nitriţilor mai mici de 4,77 mg/kg în varză albă. Pentru salată verde, o valoare maximă de 25 mg/kg a fost obţinută de Menard et al. (2008) şi pentru spanac a fost raportată o valoare maximă de 220 mg/kg.

Concentraţiile de nitriţi pot creşte foarte mult în legume prin reducerea nitraţilor prin mecanisme microbiologice, în timp ce concentraţia de nitraţi va scădea la temperatura camerei..

CAPITOLUL II

NITRAŢII ŞI NITRIŢII – ADITIVI ALIMENTARI II.1. Introducere Majoritatea produselor alimentare îşi modifică proprietăţile organoleptice şi uneori chiar şi compoziţia chimică dacă, după recoltare, nu sunt păstrate în condiţii optime sau nu se întreprind măsurile necesare pentru conservarea lor.

Conservarea alimentelor reprezintă modalitatea prin care se intervine pentru a preveni procesele de alterare, deci pentru a le menţine nemodificate proprietăţile organoleptice şi valoarea nutritivă un timp cât mai îndelungat.

6

Metodele utilizate pentru conservarea alimentelor sunt variate; se bazează pe principii şi acţiuni diferite, iar rezultatele obţinute sunt diferite, în funcţie de metoda aplicată şi de natura produsului alimentar supus conservării. Primele metode de conservare aplicate au fost deshidratarea, sărarea şi afumarea. În timp, prin cunoaşterea mecanismelor prin care se produce alterarea alimentelor, s-au putut aplica metode eficiente de conservare, care să asigure stabiliatea chimică şi microbiologică a produselor alimentare.

Metodele de conservare aplicate în prezent (metode fizice şi metode chimice) urmăresc în tot mai mare măsură satisfacerea exigenţelor consumatorilor, prin menţinerea nemodificată a proprietăţilor organoleptice şi a valorii nutritive a alimentelor.

Calitatea alimentului conservat chimic depinde, în primul rând, de calitatea materiei prime şi de gradul iniţial de contaminare microbiană; conservanţii nu pot îmbunătăţi proprietăţile unui aliment alterat, ci conservă caracteristicile iniţiale ale produsului pentru un anumit interval de timp.

Utilizarea conservanţilor chimici este justificată numai dacă substanţa propusă răspunde următoarelor cerinţe:

este eficientă în concentraţii minime; este utilizată numai atunci când nu se pot aplica alte

metode; are capacitatea de a prelungi viaţa utilă a alimentului; nu diminuează proprietăţile senzoriale ale alimentului; este uşor solubilă; este activă la un interval larg al variaţiilor de pH; este lipsită de toxicitate la concentraţiile în care se

utilizează; se poate analiza chimic prin metode accesibile; nu influenţează negativ activitatea enzimelor digestive; nu interacţionează cu componente ale alimentului cu

formarea unor componente toxice sau cu utilizare digestivă redusă;

se poate încorpora uniform în aliment; manifestă un spectru antimicrobian larg. În general, la dozele în care sunt utilizaţi, conservanţii chimici

nu sunt substanţe bactericide, ci doar bacteriostatice.

7

Acţiunea conservanţilor chimici este influenţată de diferiţi factori: specia microbiană, natura alimentului, pH, temperatură, timpul de contact (Cuciureanu, 2005).

II. 2. Legislaţie Ţările Uniunii Europene (UE) utilizează o legislaţie comună cu privire la aditivii utilizaţi în industria alimentară. Organisme specializate din cadrul UE au examinat rolul unor substanţe chimice în elaborarea alimentelor şi au stabilit distincţii între substanţe exercitând asupra alimentului un efect funcţional permanent (aditiv) şi acela de a fi un simplu component cu efect tranzitoriu (auxiliar tehnologic).

Referitor la utilizarea nitriţilor de sodiu, respectiv de potasiu (E249-E250), Regulamentul (UE) nr. 1129/2011 al Comisiei din 11.11.2011 de modificare a anexei II la Regulamentul (CE) nr. 1333/2008 al Parlamentului European şi al Consiliului prin stabilirea unei liste a Uniunii a aditivilor alimentari face următoarele precizări: “Este necesar să se folosească nitriţi (E 249-250) ca şi conservanţi în produsele din carne pentru a controla eventuala dezvoltare a unor bacterii dăunătoare, în special Clostridium botulinum. Utilizarea nitriţilor în carne poate duce însă la formarea de nitrozamine, care sunt substanţe cancerigene. Autorizarea actuală a nitriţilor ca aditivi alimentari reprezintă o cale de mijloc între aceste efecte, ţinând cont de avizul ştiinţific al autorităţii şi de necesitatea de a menţine anumite alimente tradiţionale pe piaţă.”

II. 3. Mecanismul de acţiune al nitraţilor şi nitriţilor utilizaţi pentru conservarea alimentelor

Nitraţii şi nitriţii de sodiu şi de potasiu (E 249 - E 252) se folosesc atât pentru acţiunea conservantă, dar mai ales pentru fixarea culorii cărnii şi preparatelor de carne, alături de clorura de sodiu, acidul ascorbic şi sorbatul de potasiu.

Ionul azotat ca atare nu are efect asupra culorii cărnii, el servind ca sursă de azotit. Transformarea azotatului în azotit are loc pe cale bacteriană, de către nitrat-reductaze, la pH mai mare de 5,8.

8

Reducerea nitraţilor în nitriţi este lentă; aceasta are loc la 4-6ºC, în mediu microaerofil şi în prezenta unor mici cantităţi de zahăr. Nitraţii, odată transformaţi în nitriţii se comportă ca aceştia

Mecanismul de acţiune al azotiţilor este explicat prin reacţia monoxidului de azot cu mioglobina, cu formarea nitrozo-mioglobinei (coloratul specific al cărnii sărate, netratate termic); prin fierbere, nitrozo-mioglobina trece în nitrozo-hemocromogen. Hemoglobina reacţionează în acelaşi mod cu nitriţii adăugaţi ca aditiv.

În afară de acţiunea de fixare a culorii cărnii, nitraţii introduşi în aliment au rol important în formarea aromei şi gustului cărnii; este unanim acceptat faptul că savoarea alimentelor în care au fost încorporaţi nitraţi este mai plăcută. Acest fenomen s-ar explica prin participarea florei microbiene, care realizează reducerea nitraţilor la nitriţi, la formarea aromei şi gustului cărnii. Nitriţii, adăugaţi ca atare în aliment sau proveniţi din reducerea nitraţilor, manifestă acţiune antimicrobiană moderată (mai ales în asociere cu clorura de sodiu, în mediu acid), acţiune antioxidantă (datorită caracterului reducător); nitriţii sunt implicaţi în formarea unui inhibitor eficace al creşterii bacteriei anaerobe sporulate, Clostridium botulinum, care produce neurotoxine foarte active. Marele risc al utilizării nitriţilor îl reprezintă proprietatea acestora de a reacţiona cu aminele, aminoacizii, şi de a forma nitrozaminele, compuşi puternic cancerigeni; de altfel, chiar nitriţii ca atare, ar putea fi cancerigeni. Risc crescut de formare a nitrozaminelor apare în produsele ce urmează a fi prelucrate termic înainte de consum (are loc reoxidarea NO la NO2). Utilizarea concomitentă a nitriţilor şi a acidului ascorbic ca aditivi în preparatele de carne, manifestă o acţiune benefică, deoarece acesta din urmă, blocând excesul de nitriţi, inhibă formarea nitrozaminelor.

Factorii care afectează consumul nitriţilor în preparatele din carne, sunt: -conţinutul în proteine şi lipide -pH-ul cărnii, temperatura de maturare şi durata procesului de maturare

9

-prezenţa agenţilor reducători (ascorbaţi, erithorbaţi) -conţinutul de mioglobină şi hemoglobină reziduală din carne -activitatea enzimelor proprii cărnii care contribuie la

oxidarea nitritului la nitrat -numărul şi tipul microorganismelor existente în carne sau

adăugate sub formă de culturi starter. Valoaraea pH-ului şi a temperaturii influenţează consumarea

nitritului din preparate din carne, în sensul că la valori mici ale pH-ului şi la temperaturi ridicate, dispariţia acestui agent de înroşire este rapidă (Banu et al., 1997). Intevalul optim de pH este 5,8-6,0 când NaNO2 este instabil. Sub valoarea pH-ului de 5,6 nitritul dispare rapid din mediu, iar sub valoarea de pH de 5,2 formarea NO este practic inhibată. Peste valoarea de pH 6,0 nitritul devine stabil, oxidant şi toxic.(Madrid et al., 2000).

II. 4. Mod de utilizare a nitraţilor şi nitriţilor Nitraţii sunt utilizaţi ca sursă de nitrit; reacţia decurge sub acţiunea bacteriilor denitrificatoare, atât în condiţii aerobe, cât şi în condiţii anaerobe (Izumi et al., 1989); produşii denitrificării pot fi acidul azotos, azotul, amoniacul şi hidroxilamina. În practică se pot aplica trei procedee de conservare a produselor din carne cu nitraţi - nitriţi:

metoda lentă, utilizând nitraţi (NaCl + NaNO3); metoda rapidă, utilizând nitriţi (NaCl + NaNO2); metoda mixtă, cu amestec de nitraţi şi nitriţi (NaCl +

NaNO3 + NaNO2). Utilizarea azotitului de sodiu în locul azotatului permite suprimarea scăderii masei produsului prin depozitarea în vederea dezvoltării şi acţiunii germenilor care realizează reducerea nitraţilor la nitriţi. În prezent, pe plan mondial se manifestă două tendinţe în privinţa utilizării azotaţilor şi azotiţilor:

de interzicere a utilizării azotaţilor în procesul de sărare a cărnii, deoarece acesta nu prezintă acţiune antimicrobiană, iar procesul de transformare în nitriţi este necontrolabil şi cantitatea de nitrat rezidual din produs depinde de activitatea nitrat-reducătoare a microorganismelor;

10

de reducere a nivelului de azotiţi la o valoare cât mai scăzută posibil, în aşa fel încât azotitul rezidual să nu poată forma nitrozamine (Honikel, 2007).

II. 5. Poate fi redus nivelul de nitraţi din produsele vegetale? Autoritatea Europeană pentru Siguranţa Alimentară

recomandă reducerea aportului de nitraţi prin consum de vegetale. Problema este că odată cu reducerea nitraţilor are loc şi scăderea conţinutului în alte componente nutritive, indispensabile pentru organism (vitamina C, elemente minerale). Modalităţile de reducere a nitraţilor prezenţi în alimente:

- gătitul în apă, fără a consuma lichidul respectiv; - cojitul legumelor şi fructelor (în cartofi nitraţii sunt

localizaţi în coajă şi în zonele apropiate acesteia); cojirea cartofilor reduce nitraţii din produsul final (cartofi prăjiţi) cu până la 30%. Preîncălzirea cartofilor înainte de tăiere reduce 20% din cantitatea de nitraţi. De asemenea, procesul de albire poate diminua conţinutul în nittraţi cu încă 30%. Reîncălzirea legumelor procesate culinar nu contribuie la creşterea conţinutului în nitraţ.

- achiziţionarea pentru consum a legumelor cultivate în sistem descoperit şi nu în solarii, fără acces direct a radiaţiilor solare.

CAPITOLUL III

NITRAŢII ŞI NITRIŢII – PRECURSORI AI NITROZAMINELOR

III. 1. Introducere În toate recomandările din perioada 1990-1995, Comitetul

ştiinţific pentru alimentaţie al UE a inclus necessitatea de a reduce expunerea la nitrozamine preformate în produsele alimentare prin diminuarea cantităţilor de nitrit adăugate la minimul necesar pentru a garanta conservarea şi siguranţa microbiologică pe toată perioada de viată a produsului (EFSA, 2003).

Cercetările efectuate în domeniu au identificat următoarele surse de nitrozamine: alimente (preparatele din carne, peştele), băuturi (bere, whiskies), substanţe utilizate în industrie şi agricultură

11

(pesticide), fum de ţigară, gaze de eşapament, produse cosmetice, farmaceutice şi din cauciuc. Nitrozaminele pot determina apariţia cancerului la diferite organe, la o mare varietate de specii de animale (Andrade et al., 2005) Atunci când sunt activate metabolic, nitrozaminele pot fi cauza apariţiei cancerului uman (Arranz et al., 2007). III. 4. Formarea nitrozaminelor în aliment Formarea nitrozaminelor în preparatele din carne depinde de: concentraţia nitritului utilizat ca aditiv, concentraţia nitritului rezidual, concentraţia acidului ascorbic, a ascorbaţilor sau a α-tocoferolului, precursorii nitrozaminelor, procedurile şi condiţiile de preprocesare, umiditate, procentul de ţesut adipos, prezenţa catalizatorilor/inhibitorilor reacţiei de nitrozare, procedeul de afumare şi de metoda de preparare culinară.(Byun et.al., 2004).

Mecanismul de formare a nitrozaminelor în aliment are loc după reacţiile propuse de Honikel (2007), illustrate în figura III. 2. NaNO2 + H+ → HNO2 + Na+ HNO2 + H+ → NO+ + H2O 2HNO2 → N2O3 + H2O N2O3 → NO + NO2 NO + M+ → NO+ + M Amine primare RNH2 + NO+ → RNH−N=O + H+ → ROH + N2 Amine secundare R2NH + NO+ → R2N−N=O + H+ Amine terţiare R3N + NO+ → nu formează nitrozamine Fig. III. 2. Succesiunea reacţiilor de formare a nitrozaminelor în

preparatele din carne (Honikel, 2007)

Lijinski (1999) afirmă că, în alimente, concentraţia nitrozocompuşilor este adesea foarte scăzută şi astfel, expunerea umană la aceşti compuşi este mică, dar nu ar trebui să fie ignorată din cauza potenţialului cancerigen ridicat al acestor compuşi.

12

Mecanismul şi amploarea formării nitrozoaminelor sunt dependente atât de structura aminoacizilor şi provenienţa agentului de nitrozare, precum şi de condiţiile de reacţie (Challis, 1985). Prin urmare, pH-ul mediului, bazicitatea aminei şi temperatura sunt factori importanţi care influenţează rata de formare a nitrozoaminelor (Mirvish, 1975; Ward et al., 1987).

III.4.1.Conţinutul în nitrozamine al produselor alimentare

Nivelul de toleranţă a expunerii umane la nitrozamine variază între 5-10 µg/kg corp. În multe ţări se aplică un program de monitorizare a concentraţiei nitrozaminelor volatile în alimente; de exemplu, în Statele Unite ale Americii s-a stabilit o concentraţie maximă admisă de 10 µg N-nitrozopirolidină (NPYR)/kg pentru introducerea pe piaţă a produselor alimentare (Ventanas et al., 2006). Formarea nitrozaminelor în alimente este rezultatul utilizării nitritului, afumării, uscării la cald, marinării, contaminării fungice sau a contactului produselor alimentare cu unele ambalaje.(Thicker, 2000).

Principala cauză în formarea nitrozaminelor volatile o reprezintă nitritul rezidual; Lijinsky (1999) a determinat N-nitrozodimetilamina, N-nitrozopirolidina şi N-nitrozopiperidina în probe de cârnaţi, dar speciile şi conţinutul nitrozaminelor pot varia de la ţară la ţară, în funcţie de obiceiurile alimentare. III. 5. Formarea nitrozaminelor în organismul uman

Conform datelor din literatură, nitrozocompuşii produc tumori în 39 de specii de animale. Studiile efectuate asupra a mai mult de 130 de nitrozocompuşi identificați în alimente, elemente de mediu şi din interacţiunea medicamente-nitriţi, indică faptul că peste 80% dintre aceştia sunt cancerigeni pentru animalele de laborator. Aceste constatări sugerează că nitrozocompuşii pot fi deasemenea cancerigeni pentru om, dar în prezent nu a fost riguros confirmată o asociere între expunerea la nitrozocompuşi şi cancerul uman.(Brambilla et. al., 2007).

13

Expunerea umană la nitrozocompuşi poate fi: - exogenă - din alimentaţie, elemente de mediu sau

exercitarea anumitor profesii; - endogenă – formarea nitrozocompuşilor in vivo, din

precursori nitrozabili şi agenţi de nitrozare. Formarea neenzimatică a nitrozaminelor are loc după reacţiile

de mai jos:

2HNO2 ↔ N2O3 + H2O R2NH + N2O3 ↔ R2N-NO + HNO2

Sinteza endogenă a nitrozaminelor are loc preferenţial în

stomac, deoarece prezenţa acidului clorhidric favorizează reacţia de nitrozare. Unul din factorii majori care reglementează formarea nitrozaminelor la nivelul stomacului este concentraţia agenţilor de nitrozare (N2O3, NO+ şi ON-NCS) care derivă din ionul nitrit şi acidul azotos. Nitritul gastric poate proveni din aportul de alimente şi apă, dar se poate forma prin reducere enzimatică din nitrat, în salivă sau în sucul gastric. Au fost identificate două mecanisme distincte ale formării endogene ale nitrozaminelor. Primul, constă în reacţia directă între aminele secundare şi nitrit, este puternic dependent de pH şi nu poate avea loc la pH neutru.

Al doilea tip de mecanism este o reacţiei de nitrozare de natură bacteriană, având loc mult mai rapid la pH neutru.

Nitrozaminele produc diferite efecte biologice adverse, inclusiv inducerea tumorilor ca rezultat al activării metabolice la compuşi reactivi în iniţierea patologiei neoplazice.

Organismul uman este capabil de a efectua astfel de transformări metabolice, fapt indicat de detectarea efectelor genotoxice induse de nitrozamine în celulele umane şi/sau formarea unor aducţi ai ADN. S-a constatat faptul că degradarea şi repararea ADN-ului au fost induse de concentraţii subtoxice de nitrozamine (NDMA, NDEA şi altele), de către N-nitrozoderivaţii unui număr de şase medicamente β-blocante (Robbiano et al., 1991) în culturi primare de hepatocite umane.

14

III. 6. Farmacocinetica nitrozaminelor

Studiile realizate pe animale de laborator arată ca NDMA ingerată este absorbită rapid, preponderent în partea inferioară a tubului digestiv (Pegg et al., 1981). Mai mult decât atât, detectarea NDMA în urina şobolanilor şi a câinilor expuşi la NDMA prin inhalare, arată că această nitrozamină este absorbită şi la nivel pulmonar.

Metabolizarea NDMA are loc prin alfa-hidroxilare sau prin denitrozare. În ambele cazuri se presupune că metabolismul implică un radical intermediar comun [CH3(CH2•)N-N=O] produs de acţiunea sistemului oxidază cu funcţie mixtă dependentă de citocromul P450 CYP2E1 (Haggerty et al., 1990; Lee et al., 1996). În timpul metabolizării prin alfa-hidroxilare, hidroximetilnitrozamina (HOCH2CH3N-N=O) se descompune în formaldehidă (transformată apoi în CO2) şi în monometilnitrozamină (CH3NHN=O). Din cauza instabilităţii, monometilnitrozamina suferă o transformare pentru a forma ionul metildiazoniu, care produce alchilarea macromoleculelor de ADN, ARN şi proteine.

În baza rezultatelor obţinute în testele biologice in vitro pe culturi de celule hapatice de şobolani, Lee et al. (1996) a atribuit hepatotoxicitatea NDMA ionului metildiazoniu care se formează prin alfa-hidroxilare; denitrozarea, dimpotrivă, ar avea o contribuţie redusă la efectul hepatotoxic al acestei nitrozamine la şobolani. Datele disponibile sugerează că efectul toxicologic al NDMA depinde direct de transformarea metabolică dependentă de citocromul P450 [CYP2E1] a acestei nitrozamine în speciile chimice cu reactivitate ridicată. Etanolul este un inhibitor competitiv al metabolismului dependent de citocromul P450 CYP2E1 al NDMA (Anderson et al., 1994).

III. 7. Mecanismul acţiunii toxice la animal

Nitrozocompuşii reprezintă o categorie mare de agenţi carcinogeni. Aproximativ 300 de nitrozocompuşi posedă acţiune carcinogenică şi cel puţin 30 de specii de animale sunt sensibile la efectele acestora (Hecht, 1997). IARC a decis că există suficiente

15

dovezi pentru a confirma efectul carcinogen la animale al nitrozaminelor. În contrast cu alte categorii de compuşi carcinogeni a căror activitate a fost dovedită doar la un număr mic de specii, nitrozaminele îşi manifestă acţiunea în cazul multor specii animale. De exemplu, a fost dovedit faptul că NDMA induce tumori la toate speciile pe care a fost testată, iar NDEA induce tumori la cel puţin 25 de specii (Lijinsky, 1980).

Dovezi clare ale efectului genetic au fost deasemenea colectate în urma studiilor efectuate in vivo. Au fost observate efecte clastogene (formarea de micronuclee, schimb de cromatide surori, aberaţii cromozomiale) în: celulele hepatice (Cliet et al, 1992), celulele măduvei osoase (Morison et al, 1994), celulele splinei (Krishna et al, 1991), limfocitele sângelui capilar (Sato et al., 1992), celulele esofagului (Metha et al, 1987) şi în rinichi (Robbiano et al, 1997) la rozătoarele (şobolani, şoareci şi hamsteri) expuse la NDMA pe cale orală sau prin injecţie intraperitoneală.

Au fost observate, deasemenea, aberaţii cromozomiale, formarea de micronuclee, mutaţii genetice, rupturi de ADN la puii femelelor de hamsteri (Inui et al, 1979) şi ai femelelor de şoareci (Bolognesi et al, 1988) care au fost expuse la NDMA în perioada gestaţiei.

La rozătoarele (şobolani, şoareci şi hamsteri) cărora li s-a administrat NDMA pe cale orală sau prin injecţie intraperitoneală s-au observat degradări ale ADN-ului la nivel hepatic, renal şi pulmonar (Jorquera et al, 1993; Asakura et al 1994; Tinwell et al, 1994; Webster et al, 1996).

III. 8. Mecanismul acţiunii toxice la om Cancerul gastric şi cancerul pulmonar sunt asociate cu

prezenţa nitrozocompuşilor în mediul înconjurător (Jalas et al., 2003; Raj et al., 2003; Jakszyn et al., 2006). Surse de expunere la astfel de compuşi pot fi: expunerea profesională (industria metalurgică, tăbăcărie şi pielărie etc), stilul de viaţă (inclusiv dieta, fumatul), precum şi utilizare unor produse cosmetice. Expunerea profesională este cea mai cunoscută sursă exogenă de nitrozamine (de Vocht et al., 2007). La acestea se adaugă şi expunerea endogenă prin aportul

16

de precursori ai aminelor şi formarea de compuşi cancerigeni în salivă şi în sucul gastric. (Raj et al., 2003). De aceea, este foarte important să se evalueze riscurile potenţiale cauzate de expunerea la nitrozocompuşi

Helguera et al. (2008) au folosit modelul QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) pentru a estima potenţialul cancerigen al unui set de nitrozocompuşi, printre care NDMA şi NDEA.

Modelarea QSAR este din ce în ce mai importantă, deoarece exploatează cunoştinţele chimice existente, pentru a înţelege interacţiunile dintre substanţele chimice şi organismele vii. Autorii au dezvoltat un model QSAR pentru a predicţiona potenţialul cancerigen al nitrozocompuşilor administraţi pe cale orală, la şobolani. Au identificat o serie de caracteristici structurale sau alerte structurale (SA) la o serie de compuşi chimici, particularităţi asociate cu carcinogenitatea lor.

Nitrozaminele ajung la ficat prin fluxul sanguin. Enzimele prezente în microzomii hepatici, sunt responsabili pentru faza I şi faza a II-a de biotransformare a nitrozaminelor. Scopul principal al ambelor faze de biotransformare a compuşilor xenobiotici este de a creşte solubilitatea lor în apă, care facilitează excreţia lor (Rostkowska et al., 1998). Este faza principală a metabolismului care iniţiază carcinogenitatea nitrozaminelor. Aceste reacţii sunt catalizate de enzimele microzomale ale citocromului P450. Activarea metabolică a nitrozaminelor este mediată de oxidarea la carbonul α faţă de gruparea nitrozo, care generează aldehida corespunzătoare, precum şi un diazohidroxil instabil, care se descompune la ion diazoniu şi apoi într-un ion carboniu. Particulele electrofile rezultate reacţionează cu ADN-ul în centre cu densitate electronică crescută pentru a provoca perturbări ale structurii ADN, care ar putea iniţia procese de carcinogenitate.

Radicalii metil şi etil, acţionează suplimentar drept carcinogeni (Helguera et al., 2008). Este cunoscut faptul că ambele nitrozamine (NDEA şi NDMA) sunt oxidate la compuşi genotoxici şi că enzima CYP2E1 joacă un rol major în activarea acestor doi puternici agenţi cancerigeni (Yamazaki et al., 1992).

17

PARTEA EXPERIMENTALǍ

CAPITOLUL IV ANALIZA CANTITATIVǍ A NITRAŢILOR ŞI NITRIŢILOR

DIN PRODUSE ALIMENTARE IV. 2. Obiective Cercetările efectuate au urmărit evaluarea conţinutului în nitraţi şi nitriţi al unor produse alimentare (fructe, legume, brânzeturi fermentate şi preparate din carne). IV. 3. Material şi metodă

Au fost analizate în vederea determinării conţinutului în nitraţi şi nitriţi probe de legume, fructe, brânzeturi fermentate şi preparate din carne.

IV. 3. 4. Determinarea nitriţilor

Principiul metodei Determinarea nitriţilor se realizează prin metoda

spectrofotometrică cu reactiv Peter-Griess. Nitriţii diazotează acidul sulfanilic, în mediu acid, iar sarea de diazoniu formată se cuplează cu alfa-naftilamină dând un compus azoic, colorat în roz, cu maximum de absorbţie la λ = 520nm.

Determinarea cantitativă a nitriţilor, se realizează în mai multe etape: extracţia analitului din proba de analizat, purificarea extractelor şi determinarea propriu-zisă (trasarea curbei de calibrare, determinarea nitriţilor).

Extracţia nitriţilor Peste 5 g de probă omogenizată se adaugă 50 ml apă distilată la temperatura de 60ºC -70ºC şi câte 2,5 ml soluţie saturată de borax; se menţine pe baia de apă în fierbere15 – 20 minute, agitând din când în când. Se lasă la răcit la temperatura camerei, se adaugă câte 1 ml de soluţie de ferocianură de potasiu, şi câte 1 mL soluţie de acetat de zinc, agitând după fiecare adaos.

Se lasă în repaus 30 minute, se filtrează prin hârtie de filtru cantitativă şi se completează volumul filtratului la 100 ml cu apă

18

distilată. Soluţia serveşte la determinarea spectrofotometrică a nitriţilor.

Trasarea curbei de calibrare pentru determinarea nitriţilor

Într-o serie de eprubete se introduc volume de soluţie etalon nitrit a căror concentraţie variază între 0 şi 10 µg NO2

- (1 ml etalon = 10 µg NO2

-); se aduc la volumul de 19 ml cu apă distilată, se adaugă câte 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv Griess II; se lasă în repaus 20 minute, apoi se citesc extincţiile la λ = 520 nm, faţă de martor. Se trasează curba de etalonare E = f (C) (fig. IV.1)

y = 0.0483x + 0.0017R2 = 0.9977

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8 10 12

micrograme nitrit

abso

rban

ta

Fig. IV.1. Curba de calibrare pentru determinarea nitriţilor Determinarea conţinutului de nitriţi din probe Volume de 1-10 ml de extract purificat se aduc la 19 ml cu

apă distilată, se adaugă câte 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv reactiv Griess II şi după 20 de minute se citesc extincţiile la lungimea de undă λ = 520 nm, faţă de martor. IV. 3. 5. Determinarea nitraţilor

Principiul metodei Determinarea nitraţilor se realizează sub formă de nitriţi

(după reducerea acestora cu pulbere de cadmiu), prin metoda spectrofotometrică cu reactiv Peter-Griess. Nitriţii rezultaţi după reducere diazotează acidul sulfanilic, în mediu acid, iar sarea de

19

diazoniu formată se cuplează cu alfa-naftilamină dând un compus azoic, colorat în roz, cu maximum de absorbţie la λ = 520 nm.

Trasarea curbei de calibrare pentru determinarea nitraţilor

Într-o serie de eprubete se introduc volume de soluţie etalon nitrat a căror concentraţie variază între 0 şi 10 µg NO3

- (1 ml etalon = 10 µg NO3

-); se aduc la volumul de 19 ml cu apă distilată, după care se introduc câte 1 g pulbere de cadmiu şi 5 ml tampon; se agită conţinutul eprubetelor timp de 30 minute, pentru a avea loc reacţia de reducere a nitratului la nitrit; după îndepărtarea cadmiului, se adaugă 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv 0,5 ml reactiv Griess II şi după 20 de minute se citesc extincţiile la λ = 520 nm, faţă de martor. Curba de calibrare este reprezentată în figura IV. 2.

y = 0.048x - 0.0072R2 = 0.9985

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8 10 12

micrograme nitrit

abso

rban

ta

Fig. IV. 2. Curba de calibrare pentru determinarea nitraţilor

Determinarea conţinutului de nitraţi din probe Nitraţii se determină prin aceeaşi metodă, după reducere la

nitriţi cu pubere de cadmiu. Se fac în paralel două determinări: una pentru determinarea nitriţilor şi a doua pentru determinarea nitritului total (obţinut după reducerea nitratului la nitrit).

Volume de 1-5 ml extract, aduse cu apă distilată la 19 ml, se introduc în eprubete împreună cu 1 g pulbere de cadmiu şi 5 ml tampon; se agită energic timp de 30 minute, după care se lasă în repaus; se separă pulberea de cadmiu, apoi se adaugă câte 0,5 ml

20

reactiv Griess I, respectiv reactiv Griess II şi după 20 de minute se citesc extincţiile faţă de martor, la aceeaşi lungine de undă (λ = 520 nm), faţă de martor. În aceste condiţii se determină conţinutul total de nitrit.

Prin diferenţă se obţine cantitatea de nitrit echivalentă cu cantitatea de nitrat din probe.

Înainte de utilizare pulberea de cadmiu se spală cu apă distilată, apoi, succesiv cu 25 ml soluţie HCl 0,1 M, 50 mL apă distilată şi 25 mL soluţie tampon 1:9. Între determinări, pulberea de cadmiu se păstrează în soluţie de clorură de sodiu.

Pentru probele de preparate din carne s-a urmărit evoluţia concentraţiei nitraţilor şi nitriţilor pe o perioadă de 28 de zile; monitorizarea concentratiei s-a realizat săptămânal.

Evaluarea randamentului reacţiei de reducere a nitratului la nitrit

Pentru a calcula randamentul reacţiei de reducere s-a construit curba de calibrare pentru sistemul nitrit – nitrat redus la nitrit, astfel:

- într-o serie de epubete se introduc volume de soluţie etalon nitrit, cu concentraţii cuprinse între 0 şi 10 micrograme de nitrit, respectiv volume de soluţie etalon nitrat, cu concentraţii cuprinse între 0 şi 10 micrograme de nitrat şi se aduc la 19 ml cu apă distilată; se adaugă câte 1 g de cadmiu, se agită timp de 30 minute pentru a se realiza reducerea nitratului la nitrit.

- după îndepărtarea cadmiului se adaugă câte 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv Griess II şi se citesc extincţiile la λ = 520 nm, faţă de martor.

Curba de calibrare este reprezentată în figura IV. 3.

21

y = 0.0238x + 0.0169R2 = 0.9929

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 5 10 15 20 25

micrograme nitrit

abso

rban

ta

Fig. IV. 3. Curba de calibrare pentru evaluarea randamentului reacţiei de reducere a nitraţilor la nitrit

Randamentul reacţiei de reducere se calculează, conform datelor din tabelul IV.5., pentru fiecare nivel de concentraţie din scara de etalonare, după relaţia:

η = C2 •100/ C1

Tabelul IV. 4. Randamentul reacţiei de reducere a nitratului la

nitrit C1

(µg nitrit) C2

(µg nitrit obtinut după reducere)

η, %

η mediu

4 3.494 87.36

94.25 % 8 7.254 90.68 12 11.634 96.95 16 15,827 98.92 20 19.632 98.16

IV. 4. Rezultate Rezultatele obţinute la determinarea nitraţilor din probele de preparate din carne, brânzeturi fermentate, legume şi respectiv, fructe

22

sunt prezentate în tabelele 1, 2, 3 şi 4. Rezultatele sunt media a trei determinări.

Tabelul 1. Conţinutul în nitraţi şi nitriţi al preparatelor din carne

Nr. crt.

Proba mg NO3-/kg mg NO2

-/kg

1 Salam porc 61,94 8,71 2 Salam săsesc 37,36 1,56 3 Cremwurşti polonezi 27,54 22,85 4 Cremwuşti pui 38,41 32,24 5 Cabanos 61,97 2,55 6 Cârnaţi afumaţi 45,46 6,20 7 Cârnaţi semiafumati 32,50 0,74 8 Bacon 40,28 3,71 9 Parizer pui 65,91 15,42 10 Şuncă pui 74,84 1,69 11 Salam de vară 70,14 2,39 12 Salam italian 61,34 1,31 13 Salam Victoria 68,85 4,78 14 Pastramă porc 79,31 0,94 15 Şuncă presată 73,09 16,91

Tabelul 2. Compoziţia în nitraţi şi nitriţi a brânzeturilor

fermentate Nr. crt.

Proba mg NO2-/ kg mg NO3

-/ kg

1 Especial pasta 0,92 5,32 2 Rapitalia 0,64 1,64 3 Parmezan răzuit 0,43 0,91 4 Paesano italiano 1,05 1,67 5 Caşcaval afumat Hochland 0,70 1,35

23

Nr. crt.


-/ kg

6 Caşcaval clasic Hochland 0,46 1,77 7 Brânză de burduf 0,41 1,90 8 Hochland-brânză tartinabilă 0,43 2,29 9 Hochland-brânză topită felii 1,16 3,12 10 Brânză de capră 0,65 2,20 11 Brânză de capră cu verdeaţă 0,31 15,20 12 Brânză de capră cu piper 0,85 1,98 13 Caşcaval DEL 0.29 2.23 14 Brânză de vaci 0.72 14.03 15 Brânză de oi 0.38 16.84

Tabelul 3. Compoziţia în nitraţi şi nitriţi a legumelor

Nr. crt.


-/ kg

1 Salată verde, frunze din interior 0,69 138,10 2 Salată verde, frunze din exterior 2,24 1363,80 3 Varză albă, frunze din interior 0,42 18,.32 4 Varză albă, frunze din exterior 0,46 30,71 5 Varză roşie, frunze din interior 7,49 164,88 6 Varză roşie, frunze din exterior 0,65 218,36 7 Ţelină frunze 0,46 113,84 8 Ţelină rădăcină 0,41 111,29 9 Morcov 0,38 21,55 10 Ardei Kapia roşu 0,29 18,04 11 Ardei gras alb 0,34 28,02 12 Gogoşari 0,31 19,58 13 Ardei gras roşu 0,34 14,39 14 Ardei gras galben 0,35 17,82 15 Ardei gras verde 0,39 25,15 16 Ceapă albă 0,32 26,02 17 Ceapă roşie 0,34 24,00 18 Usturoi 0,62 35,07 19 Cartofi albi 0,38 165,59

24

Nr. crt.


-/ kg

20 Cartofi roz 0,30 39,26 21 Roşii 0,37 23,87 22 Castraveţi 0,42 17,96 23 Vinete 0,57 227,19 24 Mărar 3,65 382,32 25 Pătrunjel frunze 2,58 1245,20

Tabelul 4. Concentraţiile în nitriţi şi nitraţi a fructelor

Nr. crt.


-/ kg

1 Pepene roşu 0,45 2.25 2 Pepene galben 0,58 7.40 3 Grape-fruit alb 0,55 5.57 4 Grape-fruit roşu 0,58 5.47 5 Portocale 0,53 4.11 6 Lămâi 0,63 10.98 7 Banane 0,65 20.26 8 Piersici 0,68 14.64 9 Nectarine 0,68 7.32 10 Pere 0,65 12.71 11 Caise 1,03 17.95 12 Prune albe 1,35 16.83 13 Prune 1,17 15.61 14 Mere Golden 0,67 5.23 15 Mere Red 0,63 8.73 16 Mere de vară 0,78 6.85 17 Mere pentru diabetici 0,64 6.89 18 Strugure de masă alb 0,58 7.02 19 Strugure de masă roşu 0,75 18.82 20 Strugure Ceasla 0,95 3.98 21 Mure 3,08 21.27 22 Coarne 3,05 18.82

25

CAPITOLUL V EVIDENŢIEREA FORMǍRII NITROZAMINELOR ÎN

PREPARATELE DIN CARNE V. 2. Obiective

Cercetările incluse în acest capitol au urmărit determinarea în dinamică a concentraţiilor nitraţilor, nitriţilor, nitrozodimetialaminei şi nitrozodietilaminei pentru produse preparate industrial, respectiv preparate în laborator, pe o perioadă de 28 de zile. V. 3. Materiale şi metode

Aparatura necesară determinării nitraţilor, nitriţilor şi nitrozaminelor este redată în tabelul V. 2.

Tabelul V. 2. Aparatura utilizată pentru dozarea

cantitativă a nitraţilor, nitriţilor şi nitrozaminelor

Aparat Producator Tip Sistem HPLC Module: Detector UV-VIS Cuptor coloane Pompă cuaternară Degazor on-line Coloană 25 / 4.6 mm, 5 μm

Shimadzu Shimadzu Shimadzu Shimadzu Shimadzu Grace

SPD – 20AV CTO – 20AC LC – 20AD DGU – 20A3 ODS

Agitator magnetic IKA® WERKE GMB&CO.KG

IKAMAG®RT15power

Balanta SCALTEC

SCALTEC INSTRUMENTS GmbH

SBC32

Rotavapor Module: Baie termostatată Controler vid

BÜCHI BÜCHI BÜCHI

R – 210 B 491 V850

26

Aparat Producator Tip Pompă de vid BÜCHI V -700 Spectrofotometru JASCO

JASCO V-550 UV-VIS.

V. 3. 3. Probe de analizat

Analiza în dinamică a conţinutului în nitraţi, nitriţi şi evidenţierea formării nitrozodimetilaminei (NDMA) şi nitrozodietilaminei (NDEA) au fost realizate pe probe de preparate din carne (şuncă de pui, salam bănăţean uscat, salam franţuzesc uscat, cârnaţi tradiţionali şi pastramă de porc), procurate direct de la producător, în prima zi în care puteau fi comercializate. Al doilea set de determinări s-a realizat pe loturi de câte cinci tipuri de preparate din carne (cârnaţi, cremwurşti, muşchi file, salam, şuncă) procurate din reţeaua comercială.

Al treilea set de probe a fost constituit din 5 loturi de cârnaţi de porc, preparaţi conform datelor din tabelul V. 4.Determinările s-au efectuat iniţial şi la intervale de 7 zile, timp de 28 de zile.

V. 3. 4. Metode

a) Determinarea nitraţilor şi nitriţilor

Nitriţii au fost determinaţi prin metoda spectrofotometrică cu reactiv Peter-Griess; nitraţii au fost determinaţi prin aceeaşi metodă, după reducerea acestora la nitriţi, cu pubere de cadmiu.

b) Determinarea nitrozaminelor Determinarea nitrozaminelor se realizează în mai multe etape:

separarea nitrozaminelor din probe, trasarea curbelor de calibrare, determinarea nitrozaminelor.

Separarea nitrozaminelor Câte 10 g din fiecare probă mărunţită a fost tratată cu 50 ml

de tampon fosfat-citrat de pH=6,5 şi 0,175 g acid ascorbic şi omogenizată la blender. Amestecul s-a adus cantitativ în pahar

27

Erlenmeyer, s-a adaugat 150 ml tampon fosfat-citrat şi 0,700 g acid ascorbic, s-a omogenizat timp de două ore , apoi s-a filtrat pe hârtie de filtru cantitativă.

Purificarea extractelor s-a realizat prin filtrare prin coloane de Celite 545. Eluatele au fost extrase cu 300 ml diclormetan şi anhidrizate pe sulfat de sodiu anhidru.

Faza organică s-a evaporat la sec la rotavapor şi a servit la determinarea prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă a nitrozodimetilaminei şi a nitrozodietilaminei.

Condiţii de cromatografiere Instrument: sistem HPLC Shimadzu Coloana: Grace 25 ×4,6 mm, 5 μm, ODS Faza mobilă: acetonitril - acid acetic 1% (20:80, v/v) Debit: 0,8ml / minut Volum injectare: 20 μl Temperatura coloanei: 25°C Detecţia : UV (230 nm) Timp de retenţie NDMA: 4,56 min. Timp de retenţie NDEA: 9,11 min. Timp de analiză / probă : 10 minute. În condiţiile de cromatografiere stabilite, nitrozodimetilamina

(NDMA) şi nitrozodietilamina (NDEA) au picuri distincte. Standardele de calibrare au fost preparate prin diluarea unor

volume din soluţiile de lucru ale NDMA, respectiv NDEA, la un anumit volum.

Trasarea curbelor de calibrare pentru NDMA și NDEA Pentru trasarea curbelor de calibrare s-a lucrat pe concentrații

de NDMA și respectiv, NDEA cuprinse între 0 și 25 µg.

Determinarea nitrozaminelor Reziduul obţinut în urma evaporării extractului purificat s-a

reluat cu 1 ml de fază mobilă, acetonitril-acid acetic 1% (20:80, v/v). Un volum de 20 μl a fost injectat în lichid cromatograf.

28

c) Determinarea concentraţiilor de NDMA şi NDEA

Cromatogramele au fost procesate utilizând programul

informatic LC Solution Software. Concentraţiile nitrozodimetilaminei şi ale nitrozodietilaminei

au fost calculate automat de programul informatic pe baza datelor analitice utilizând aria picului şi metoda standardului extern. Curba de calibrare a fost obţinută prin fitarea datelor utilizând regresia liniară.

Ecuaţia curbei de calibrare: y = b + ax,

unde: x – concentraţia analitului (μg / ml); y – aria picului; a, b – coeficienţii curbei de calibrare standard. V. 4. Rezultate

Cromatogramele soluţiilor standard de nitrozamine sunt redate în figura V. 3 (pentru NDMA), respectiv în figura V. 4. (pentru NDEA). Curbele de etalonare pentru nitrozodimetilamină (NDMA), respectiv nitrozodietilamină (NDEA), sunt redate în figura V. 5., iar în figura V. 6, cromatograma probelor de muşchi file Meda şi pastramă vrac.

NDMA 0.4 micrograme

-5000

-3000

-1000

1000

3000

5000

7000

9000

11000

13000

0 2 4 6 8 10 12

Fig. V. 3 . Cromatograma soluţiei standard de NDMA

29

NDEA 0.4 micrograme

-5000

-3000

-1000

1000

3000

5000

7000

9000

0 2 4 6 8 10 12

Fig. V. 5. Cromatograma soluţiei standard de NDEA

y = 149768xR2 = 0,9991

y = 157821xR2 = 0,9998

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0 5 10 15 20 25

concentraţia, micrograme

aria p

icului

NDEA

NDMA

Fig. V. 3. Curbele de etalonare pentru determinarea NDMA şi NDEA

30

15000 10000 5000 -5000

Legenda: proba A-muşchi file Meda proba B- pastramă de porc

Fig. V. 6. Cromatograma pentru preparate din carne tip jambon

Pe durata studiului concentraţia nitratului şi nitritului rezidual

în probele de preparate din carne (şuncă de pui, salam bănăţean uscat, salam franţuzesc uscat, cârnaţi tradiţionali şi pastramă de porc), procurate direct de la producător, în prima zi în care puteau fi comercializate, scade, după cum este redat în tabelul V. 9. Concentraţia nitrozaminelor creşte, pe durata studiului, la toate preparatele analizate (tabelul V.10).

Tabelul V. 9. Monitorizarea concentraţiei nitratului şi

nitritului în produse din carne preparate industrial

Proba

Concentraţia iniţială

Concentraţia după 28 de zile

Scăderea concentraţiei,%

Nitrit, mg/kg

Nitrat, mg/kg

Nitrit, mg/kg

Nitrat, mg/kg

Nitrit Nitrat

1 26.7 60.4 1.87 17.1 92.3 71.68 2 4.46 14.1 0.18 6.12 82 56.59 3 10.78 27.67 0.39 7.27 96.38 73.72

0 5 10 15 20

Proba AProba BNDEA standardNDMA standard

NDMA

NDEA

31

Proba

Concentraţia iniţială

Concentraţia după 28 de zile

Scăderea concentraţiei,%

Nitrit, mg/kg

Nitrat, mg/kg

Nitrit, mg/kg

Nitrat, mg/kg

Nitrit Nitrat

4 2.7 18.59 0.04 9.12 98.51 82.57 5 25.82 57.56 0.78 3.24 96.97 94.37

Legenda: 1- şuncă de pui; 2-salam bănăţean uscat; 3-salam franţuzesc uscat; 4-cârnaţi tradiţionali; 5-pastramă de porc

Tabelul V. 10. Monitorizarea concentraţiei NDMA şi NDEA în produse din carne preparate industrial

Proba Concentraţia iniţială Concentraţia

după 28 de zile NDMA µg/kg

NDEA µg/kg

NDMA µg/kg

NDEA µg/kg

1 nd 0.43 29.00 11.60 2 nd nd 10.50 22.50 3 nd 2.10 5.30 27.50 4 nd 2.70 0.80 61.90 5 nd nd 23.40 40.00

Legenda: 1- şuncă de pui; 2-salam bănăţean uscat; 3-salam franţuzesc uscat; 4-cârnaţi tradiţionali; 5-pastramă de porc; nd-nedetectabil

Evoluţia concentraţiilor nitraţilor, nitriţilor şi nitrozaminelor în probele de cârnaţi de porc preparaţi în laborator sunt redate in tabelele V. 5, V. 6, V. 7, respectiv V.8.

Tabelul V. 5. Evoluţia concentraţiei ionilor nitrit (mg/kg) în

probele de cârnaţi de porc preparaţi în laborator

Data / lotul

iniţial 7 zile 14 zile 21 zile 28 zile

L1 0,35 0.34 0.25 0.21 0.17 L2 6.73 6.62 5.04 4.47 3,81

32

Data / lotul


L3 0.42 0.38 0.29 0.21 0.15 L4 10.16 9.11 8.01 7.53 6.47 L5 9.74 8.10 7.60 6.81 6.69

Legenda: Lotul 1: carne de porc, sare de bucătărie (4%). Lotul 2: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), extract de usturoi (25 ml) .

Lotul 3: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 4: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 5: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml), condimente pentru cârnaţi (1g/kg).

Tabelul V. 6 Evoluţia concentraţiei ionilor nitrat (mg/kg) în

probele de cârnaţi de porc preparaţi în laborator Data / lotul


L1 6.28 5.16 4.02 2.52 2.20 L2 7.78 4.16 2.56 2.44 1.98 L3 53.09 36.23 33.27 25.23 22.94 L4 194.90 126.38 119.18 82.69 50.92 L5 193.17 174.79 110.19 70.30 49.92


Lotul 3: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 4: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml).

Lotul 5: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml), condimente pentru cârnaţi (1g/kg).

33

Tabelul V. 7. Evoluţia concentraţiei NDMA (μg/kg) în probele de cârnaţi de porc preparaţi în laborator

Data / lotul


L1 nd 0,11 0,18 0,27 0,28 L2 nd 0,15 0,29 0,47 0,47 L3 0,09 0,17 0,27 0,30 0,31 L4 0,16 0,30 0,39 0,47 0,56 L5 0,10 0,29 0,37 0,42 0,48

Tabelul V. 8. Evoluţia concentraţiei NDEA (μg/kg) în probele de

cârnaţi de porc preparaţi în laborator

Data / lotul


L1 nd nd 0,09 0,11 0,13 L2 nd 0,09 0,14 0,20 0,24 L3 nd nd 0,08 0,14 0,16 L4 nd 0,11 0,18 0,21 0,25 L5 nd 0,10 0,12 0,15 0,29


Lotul 3: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 4: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 5: carne de porc, sare de bucătărie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml), condimente pentru cârnaţi (1g/kg).

nd – nedetectabil

Domeniile de variaţie ale concentraţiilor momentane ale nitraţilor, nitriţilor şi nitrozaminelor în preparatele din carne sunt inserate în tabelul V.9.

34

Tabelul V. 9. Concentraţiile analiţilor în preparate din carne

Proba nitrat/nitrit NDMA/NDEA Cârnaţi Cabanos (40.97 - 89.20) mg

nitrat/kg (1.25 – 8.64) mg nitrit/kg

(nd – 2.34) µg/kg

(nd - 6.14) µg/kg

Cârnaţi de casă afumaţi Elit Cârnaţi de casă afumaţi Meda Cârnaţi Pleşcoi Cârnaţi trandafir Caroli Cremwurşti polonezi Elit (29.45 - 55.63)

mg nitrat/kg (9.59 – 24.06) mg nitrit/kg

(nd – 0.36) µg/kg

(nd - 0.84) µg/kg

Cremwurşti de pui Meda Cremwurşti de pui Kosarom Cremwurşti Devro Cremwurşti Caroli

Muşti file Azuga (89.48-112.35) mg nitrat/kg (10.50 – 18.78) mg nitrit/kg

(nd - 0.64) µg/kg

(nd - 0.84)

µg/kg

Muşti file Elit Muşti file Marex Muşti file Radic Muşti file Meda Salam Pontic (54.15-105.25)


(nd - 0.46) µg/kg

(0.04 – 2.7)

µg/kg

Salam cu ierburi fine Salam de Sibiu Angst Salam Parmezan Zimbo Salam piperat Şuncă de Praga (100.23-146.36)


(0.08 – 0.52) µg/kg

(0.77 – 4.0)

µg/kg

Şuncă de Praga Luca Pastramă de porc Vio Şuncă de Praga Meda Şuncă de porc

35

CAPITOLUL VI ESTIMAREA APORTULUI DE NITRAŢI ŞI DE NITRIŢI

PRIN CONSUM DE ALIMENTE VI. 5. Obiectiv Estimarea aportului de nitraţi şi de nitriţi prin trei tipuri de dietă (vegetaliană, vegetariană şi convenţională), pe baza determinării conţinutului în nitraţi şi nitriţi a produselor alimentare. VI. 6. Meniuri

Au fost selectate alimente, astfel încât valoarea energetică a fiecărui tip de dietă să fie de aproximativ 2500 kcal/zi.

S-a considerat, pentru fiecare tip de dietă, un consum zilnic de 1,5 L de apă potabilă cu un conţinut de 50 mg NO3

-/L, precum şi o cantitate de 200 g pâine neagră (cu un conţinut de 4,3 mg NO2

-/kg şi 20 mg NO3

-/kg), inclusă în dieta vegetaliană, respectiv 200 g pâine albă (cu un conţinut de 3,4 mg NO2

-/kg şi 13 mg NO3-/kg),

inclusă în dieta vegetariană şi în cea convenţională. VI. 7. Materiale şi metodă Concentraţiile nitraţilor şi nitriţilor în probe de legume, fructe, brânzeturi fermentate şi preparate din carne, exprimate în mg/kg, determinate în modul prezentat la capitolul IV, au fost calculate în mg/cantitate aliment propus în fiecare tip de dietă. În acest mod s-a determinat aportul zilnic de nitraţi şi nitriţi prin consum de alimente. VI. 8. Rezultate

Aportul de nitriţi prin consum de alimente este prezentat comparativ la tipurile de dietă considerate în figura VI. 1, iar aportul de nitraţi este redat în figura VI.2.

Dieta vegetariană furnizează cele mai mici cantităţi de nitrat şi de nitrit, comparativ cu celelalte tipuri de dietă. Cel mai mare aport de nitrit a fost înregistrat la dieta convenţională, de 1,48 ori mai mare decât cantitatea de nitrit furnizată de dieta vegetaliană şi de 2,62 ori mai mare decât aportul de nitrit prin dieta vegetariană.

36

În ceea ce priveşte conţinutul în nitraţi, la dieta vegetaliană s-a determinat cea mai mare concentraţie (368,52 mg nitrat/zi), comparativ cu 78,373 mg nitrat/zi furnizat de dieta vegetariană, respectiv 99,05 mg nitrat/zi la dieta convenţională (mixtă). Aportul de nitraţi, prin consum de alimente, este cu mult mai mare decât aportul de nitriţi.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

conc

entr

atia

, mg

nitr

it/zi

dieta vegataliana dieta vegetariana dieta conventionala

Fig. VI. 1. Aportul de nitriţi prin dietă

0

50

100

150

200

250

300

350

400

conc

entr

atia

, mg

nitr

at/z

i

dieta vegataliana dieta vegetariana dieta convrentionala

Fig. VI. 2. Aportul de nitraţi prin dietă

Mare parte din cantitarea de nitrat provine din apa de băut; astfel, în dieta vegetariană ponderea apei este de 95,69%, în dieta

37

vegetaliană 20,36%, respectiv 75,71% în dieta convenţională.(figura VI. 4).

dieta vegataliana

dieta vegetariana

dieta conventionala

nitritnitratnitrat din apa

0

50

100

150

200

250

300co

ncen

trat

ia, m

g/zi

Fig. VI. 4. Ponderea nitraţilor din apă în dietele considerate

Pentru un adult cu masa de 60 de kilograme, care ar urma oricare din dietele luate în studiu, s-au calculat dozele de nitrit şi de nitrat exprimate în mg/kg corp/zi (tabelul VI. 6.).

Tabelul VI. 6. Dozele zilnice de nitrat şi de nitrit

Tipul de dietă mg nitrit/kg corp/zi

mg nitrat/kg corp/zi

Dieta vegetaliană 0.030 6.138 Dieta vegetariană 0.017 1.306 Dieta convenţională 0.044 1.650

Din estimările efectuate rezultă depăşiri ale cantităţii maxime

admise (0,003 mg nitrit/kkg corp pentru un adult cu masa de 60 d kg) la toate tipurile de diete după cum urmează: de 5,66 ori la dieta vegetaliană, de 10 ori la dieta vegetariană şi de 13,33 ori la dieta convenţională.

38

CAPITOLUL VII EFECTUL ADMINISTRǍRII NITROZODIETILAMINEI

ASUPRA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI ŞI HEMATOLOGICI LA ŞOBOLANI

VII. 2. Obiective Cercetările incluse în acest capitol au urmărit evaluarea toxicităţii dietilnitrozaminei prin determinarea unor parametri biochimici şi hematologici, după administrarea unei doze unice de 100 mg NDEA/kg corp, la şobolani

VII. 3. 3. Animale de laborator Studiul s-a realizat pe şobolani masculi, rasa Wistar, achiziţionaţi de la Institutul Cantacuzino Bucureşti.

Protocolul experimental pentru acest studiu a fost aprobat de Comisia de Etică a cercetării a Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa” Iaşi.

Şobolanii masculi, în vârstă de 8 luni, sunt menţinuţi timp de şapte zile înainte de începerea experimentului în cuşti colective, în condiţii ambientale relativ constante.

Atât în timpul perioadei de aclimatizare, cât şi în timpul perioadei experimentale animalele primesc hranǎ standard pentru şobolani şi apǎ, ad libitum.

Animalele au fost repartizate în două loturi de câte 5 animale: lotul de control (martor) la care s-a administrat ser fiziologic şi lotul căruia i s-a administrat prin gavaj doza unică de 100 mg NDEA/kg corp.

Probele de sânge au fost recoltate prin puncţie cardiacă, la 10 zile de la ultima administrare a soluţiei de nitrozodietilamină, după 12 ore fără hrană, sub anestezie cu ketamină. Probele s-au recoltat în vacutainere adaptate tipului de analiză preconizat. VII. 3. 4. Interpretarea statistică

În interpretarea statistică a datelor a fost utilizată o metodă de analiză a factorilor de variabilitate în experimentul biologic - ANOVA.

39

Datele statistice au fost prelucrate de programul Stats Direct, versiunea 2.7 şi Microsoft Excel 2007. Datele calculate pentru fiecare grup sunt exprimate ca valoare medie ± eroarea standard a mediei.

VII. 3. 5. Investigaţia biochimică După recoltare, probele de sânge destinate determinărilor biochimice au fost centrifugate pentru 15 minute, la 3000 rotaţii pe minut, la centrifuga Hettich-Rotifix 32A. Plasma obţinută a fost supusă imediat determinărilor biochimice care s-au realizat prin metode standardizate folosind kituri ELITech®. Investigaţiile biochimice realizate au urmărit: Testarea integrităţii celulare a ţesutului hepatic după administrarea de NDEA – evidenţierea modificării permeabilităţii membranei hepatocitului, prin evaluarea activităţii următorilor parametri biochimici:

- activitatea aspartat-aminotransferazei (AST sau GOT); - activitatea alanin-aminotransferazei (ALT sau GPT); - determinarea activităţii γ-glutamil transferazei (γ-GT sau

GGT) Evaluarea activităţii hepatice prin:

- determinarea bilirubinei totale şi a bilirubinei directe; - determinarea colesterolului total şi a HDL-, respectiv

LDL-colesterolului; - determinarea ferului plasmatic;

Evaluarea activitătii renale prin: - determinarea concentraţiei ureei; - determinarea concentraţiei acidului uric; - determinarea concentraţiei creatininei. Toate rezultatele prezentate reprezintă media a 5 determinări

(fiecare parametru a fost determinat individual pe plasma recoltată de la 5 şobolani). VII. 4. 2. Investigaţia hematologică Au fost determinaţi 11 parametri hematologici, după cum urmează:

40

- numărul de eritrocite, RBC - a fost determinat pentru evaluarea eritropoiezei; prin măsurarea concentraţiei de hemoglobină (HGB) şi a hematocritului (HCT), analizorul a calculat indicii eritrocitari (VEM- volumul eritrocitar mediu, HEM- hemoglobina eritrocitară medie, CHEM- concentraţia eritrocitară medie de hemoglobină, RDW- lărgimea distribuţiei eritrocitare), care evaluează calitativ populaţia eritrocitară.

- numărul de trombocite (PLT)- plachetele sunt implicate în hemostază şi în procesele de reparare tisulară.

-numărul de leucocite (WBC): neutrofile (PMN), euzinofile (EO), bazofile (BASO), limfocite (LYMPH) şi monocite (MONO)-a fost determinat pentru evaluarea răspunsului imun. -formula leucocitară- constă în diferenţierea numărului total de leucocite circulante în cele cinci tipuri de leucocite, exprimate procentual şi respectiv în număr absolut şi a fost corelată cu numărul de leucocite. VII. 4. Rezultate

Variaţia parametrilor biochimici şi hematologici în urma

administrării dozei unice de 100 mg NDEA/kg corp sunt înregistrate în tabelele VII. 2, respectiv VII. 8.

Tabelul VII. 2. Variaţia parametrilor biochimici în urma administrării a 100 mg NDEA/kg corp la şobolani

Parametrul U.M. Lotul martor Lotul NDEA

ALT (U/L) 46,6 ± 4,47 62,4 ±6,11 AST (U/L) 125,6 ± 7,69 153,2 ± 10,41 GGT (U/L) 1,0 ± 0,0 1,4 ± 0,24 Bilirubina totală

(mg/dL) (0,16 ± 0,01 0,22 ± 0,01

Bilirubina directă

(mg/dL) 0,03 ± 0,01 0,05 ± 0,01

Colesterol total (mg/dL) 61,8 ± 3,13 66,4 ± 3,74

41

Parametrul U.M. Lotul martor Lotul NDEA HDL-colesterol (mg/dL) 19,4 ± 0,87 24,4 ± 1,96 LDL-colesterol (mg/dL) 4,2 ± 0,3 5,0 ± 0,31 Fier (µg/dL) 275,2 ± 42,9 259,8 ± 17,65 Uree (mg/dL) 38,0 ± 4,03 37,0 ± 2,73 Creatinină (mg/dL) 0,61 ± 0,01 0,63 ± 0,02 Acid uric (mg/dL) 0,97 ± 0,05 1,17 ± 0,06

Tabelul VII. 8. Variaţia parametrilor hematologici în urma administrării a 100 mg NDEA/kg corp la şobolani

Parametrul U.M. Lotul martor Lotul NDEA

Numărul de eritrocite

x106celule/μL

7,75 ± 0.71 8,50 ± 0.12

Hematocrit % 44,80 ± 0.74 44.30 ± 0.78 Hemoglobină g/dL 15,52 ± 0.28 15,48 ± 0.25 Concentraţia eritrocitară medie de hemoglobină

g/dL 34,64 ± 0.38 34,28 ± 0.12

Lărgimea distribuţiei eritrocitare

% 20,27 ± 0.56 20,81 ± 0.57

Hemoglobina eritrocitară medie

pg/celulă 18,34 ± 0.25 18,24 ± 0.09

Volum eritrocitar mediu

fL (µm3) 52,96 ± 1.29 53,14 ± 0.26

Numarul de trombocite

x103celule/μL

1072,50 ± 53.00 1060,40 ± 87.48

Numărul de leucocite

x103celule/μL

4,82 ± 0.59 4,27 ± 1.16

CONCLUZII GENERALE

Pentru determinarea nitriţilor din produse alimentare (legume, fructe, preparate din carne şi brânzeturi fermentate) s-a

42

aplicat metoda spectrofotometrică cu reactiv Peter-Griess. Determinarea nitraţilor s-a realizat prin aceeaşi metodă, după reducerea acestora la nitriţi, cu pulbere de cadmiu. Randamentul reacţiei de reducere a fost de peste 90%. Au fost analizate 77 probe de produse alimentare, dintre care 15 probe de preparate din carne, 15 probe de brânzeturi fermentate, 25 probe de legume şi 22 probe de fructe, obţinându-se rezultate concordante cu cele din literatură. Cele mai mari concentraţii de nitraţi s-au determinat la salata verde (1363,80 mg/kg) şi la frunzele de pătrunjel (1245,20 mg/kg), la polul opus aflându-se ardeiul gras roşu (14,39 mg/kg) şi ardeiul gras galben (17,82 mg/kg). Concentraţiile nitriţilor în probele de legume au variat între 0,29 mg/kg la ardeiul Kapia roşu şi 7,49 mg/kg la varza roşie. În probele de fructe, cele mai mici cantităţi de nitraţi şi de nitriţi s-au determinat la pepenele roşu (2,25 mg nitrat/kg, respectiv 0,45 mg nitrit/kg). Murele au avut concentraţia cea mai mare de nitraţi şi nitrţi (21,27 mg nitrat/kg, respectiv 3,08 mg nitrit/kg). La preparatele din carne analizate conţinutul de nitraţi a înregistrat variaţii mari, între 27,54 mg/kg la proba de cremwurşti polonezi şi 79,31 mg/kg la proba de pastramă de porc. Concentraţiile nitriţilor s-au situat într-un interval larg, fară a se depăşi concentraţia maximă admisă (0,74 mg/kg la proba de cârnaţi semiafumaţi, respectiv 32,24 mg/kg la proba de cremwurşti de pui). În probele de brânzeturi fermentate concentraţiile nitraţilor şi nitriţilor au fost cu mult sub limitele maxime admise. Domeniile de variatie ale concentraţiilor analiţilor au fost: 0,91 mg nitrat/kg (la proba de parmezan răzuit) -16, 84 mg nitrat/kg (la proba de brânză de oi), respectiv 0,29 mg nitrit/kg (la proba de caşcaval DEL) – 1,16 mg nitrit/kg (la proba de brânză topită Hochland). Dozarea nitrozaminelor s-a realizat prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă cu detecţie UV. S-a evidenţiat formarea nitrozaminelor în preparate din carne, pe seama nitritului rezidual, prin monitorizarea concentraţiilor nitraţilor, nitriţilor şi nitrozaminelor pe o perioadă de 28 de zile, atât pentru preparate din carne procurate direct de la producător în prima zi în care puteau fi

43

comercializate cât şi în probe de cârnaţi preparaţi experimental, în laborator. S-a constat scăderea concentraţiei nitraţilor şi nitriţilor în paralel cu apariţia şi creşterea concentratiei nitrozaminelor. La proba de şuncă de pui, concentraţia nitratului a scăzut în procent de 71,68 % iar cea a nitritului în procent de 92,3 %; în proba de salam bănăţean uscat, scăderea concentraţiilor nitratului şi nitritului a fost de 56,59 %, respectiv de 82 %; în salamul franţuzesc uscat concentraţiile nitratului şi nitritului s-au micşorat în procent de 73,72 %, respectiv 96,38 %: în proba de cârnaţi tradiţionali descreşterea concentraţiilor a fost de 82,57 % pentru nitrat şi de 98,51 % pentru nitrit, iar în proba de pastramă de porc 94,37 % pentru nitrat, respectiv 96,97 % pentru nitrit. În cadrul loturilor de cârnaţi proaspeţi preparaţi experimental s-au constatat descreşteri ale concentraţiilor nitraţilor şi nitriţilor în procente mai mici comparativ cu scăderea concentraţiilor analiţilor în preparatele industriale, care s-au încadrat între 31,31 % şi 64,28 % pentru nitrit, respectiv 56,79 % şi 74,55 % pentru nitrat. Cercetările întreprinse au evidenţiat faptul că procesul de formare a nitrozaminelor în preparatele din carne este lent şi progresiv; intervalul de evidenţiere a primelor valori cuantificabile ale nitrozaminelor a fost cuprins între 14 şi 21 de zile. Remarcăm faptul că pentru unele produse preparate industrial, nivelul de NA determinat după 28 de zile a fost peste limita maximă admisă pentru acest tip de produse (1μg/kg). La preparatele din carne obţinute industrial, la finalul studiului, concentraţia NDMA (nitrozodimetilaminei) a variat între 0,80-23,40 μg/kg, iar concentraţia NDEA a variat între 11,60 şi 61,90 μg/kg. Pentru probele de cârnaţi de porc preparaţi în laborator, la finalul studiului, concentraţiile nitrozaminelor s-au situat în intervalele de valori 0,28-0,56 μg NDMA/kg şi (0,13-0,29) μg NDEA/kg.

În funcţie de tipul dietei alimentare abordate, aportul de nitraţi şi nitriţi prin alimentaţie este diferit. Expunerea umană la nitraţi şi nitriţi prin consum de alimente, evaluată în urma efectuării studiului, este în concordanţă cu recomandările OMS (157 mg nitrat/zi) în cazul dietelor vegetariană şi convenţională, în timp ce în dieta vegetaliană cantitatea de nitrat evaluată este de 2,34 ori mai

44

mare decât cantitatea recomandată. EFSA recomandă un consum zilnic de 400 g legume, ceea ce înseamnă un aport de 0,003 mg nitrit/kg corp/zi pentru un adult cu greutatea de 60 de kg. Din estimările efectuate rezultă depăşiri ale cantităţii recomandate la toate tipurile de diete după cum urmează: de 5,66 ori la dieta vegetaliană, de 10 ori la dieta vegetariană şi de 13,33 ori la dieta convenţională. Studiile efectuate asupra a trei tipuri diferite de diete: vegetaliană, vegetariană şi convenţională, au scos în evidenţă importanţa unei conduite alimentare care să aducă în organism cantitatea minimă posibilă de nitrit. Modificarea unor parametri biochimici şi hematologici în urma administrării unei doze unice de 100 mg nitrozodietilamină/kg corp la şobolani masculi din rasa Wistar, concretizată prin creşterea valorilor AST, ALT, GGT, bilirubină, colesterol (care caracterizează activitatea hepatică) şi prin micşorarea hematocritului, a concentraţiei eritrocitare medii de hemoglobină, a hemoglobinei asociată cu scăderea concentraţiei fierului, sugerează manifestarea toxicităţii nitrozodeietilaminei.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ Knobeloch L, Salna B, Hogan A, Postle J, Anderson H. Blue babies

and nitrate-contaminated well water. Environ Health Persp 2000; 108: 675-678.

Tamme T, Reinik M, Roasto M, Juhkam K, Tenno t, Kiis A, Nitrates and nitrites in vegetable-based products, and their intakes by the Estonian population, Food Additives and Contaminants, 2006; 23: 355-361.

Santamaria P, Nitrate in vegetables: Toxicity, content, intake and EC regulation, Journal of the Science of Food and Agriculture,2006; 86:10-17.

Santamaria P, Elia A, Serio F, Todaro E, A survey of nitrate and oxalate content in fresh vegetables, Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999; 79: 1882-1888.

45

Zhong et al., 2002 Zhong W, Hu C, Wang M, Nitrate and nitrite in vegetables from north China: content and intake.Food Additives and Contaminants, 2002; 19: 1125-1129.

Sušin J, Kmeci V, Gregorcic A, A survey of nitrate and nitrite content of fruit and vegetables grown in Slovenia during 1996-2002. Food additives and Contaminants, 2006; 23: 385-390.

Menard et al. (2008) Menard C, Heraud F, Volatier J.L, Assesment of dietary exposure of nitrate and nitrite in France. Food Additives and Contaminants, 2008; 25: 971-988.

Cuciureanu R. Elemente de Igiena alimentaţiei. Iaşi: Ed. Gr.T. Popa, 2005.

Regulamentul (UE) nr. 1129/2011 al Comisiei din 11.11.2011 de modificare a anexei II la Regulamentul (CE) nr. 1333/2008 al Parlamentului European şi al Consiliulu

Banu C, Alexe P, Vizireanu C. Procesarea industrială a cărnii. București: Ed. Tehnnică, 1997, 208-213, 455.

Madrid VA, Madrid CJ. Los aditivos en los alimentos (Según la Unión Europea y la Legislación Española), 1a Edición, AMV Ediciones, Mundi Prensa, 2000;

Honikel K. The use and control of nitrate and nitrite for the processing of meat products, Meat Sci 2008; 78: 68–76.

EFSA, Opinion of the scientific panel on biological hazards on the request from the commission related to the effects of nitrates/nitrites on the microbiological safety of meat products, EFSA Journal, 2003; 14 (1), 31.

Andrade R, Reyes FGR, Rath S. A method for the determination of volatile N-nitrosamines in food by HS-SPME-GC-TEA. Food Chemistry 2005; 91: 173–179.

Arranz N, Hanza AI, Garcia A, Rafter J, Morales P. Protective effect of vitamin C towards N – nitrosamine - induced DNA damage in the single-cell gel electrophoresis(SCGE)/HepG2 assay. Toxicol In Vitro 2007; 21(7): 1311-1317.

Byun MW, Ahn HJ, Kim JH, Lee JW, Yook HS, Han SB. Determination of volatile N-nitrosamines in irradiated fermented sausage by gas chromatography coupled to a thermal analyzer. J Chromatogr A 2004; 1054: 403-407.

46

Lijinsky W. N-nitroso compounds in the diet. Mutat. Res 1999; 443 :129–138.

Challis BC. Nutrition and nitrosamine formation. P Nutr Soc 1985; 44: 95–100.

Mirvish SS. Formation of N-nitroso compounds: Chemistry, kinetics and in vivo occurrence, Toxicol Appl Pharm 1975; 31: 325–351.

Ward FW, Coates ME. Dietary fats and N-nitrosation in the rat. Brit J Nutr1987; 58: 221–231.

Ventanas S, Ruiz J. On-site analysis of volatile nitrosamines in food model systems by solid-phase microextraction coupled to a direct extraction device. Talanta 2006; 70: 1017-1023.

Thicker, 2000).Thicker A.R, in F.J. Francis (Ed.), Encyclopedia of Food Science and Technology, second ed., vol.2, Wiley, New York, 2000, p.1707.

Brambilla G, Martelli A. Genotoxic and carcinogenic risk to humans of drug-nitrite interaction products. Mutat Res 2007; 635: 17-52.

Robbiano L, Martelli A, Allavena A, Mazzei M, Gazzaniga GM, Brambilla G. Formation of the N- nitroso derivates of six B-adrenergic-blocking agents and their genotoxic effects in rat and human hepatocytes. Cancer Res 1991; 51: 2273-2279.

Pegg AE, Perry W. Alkylation of nucleic acids and metabolism of small doses of dimethylnitrosamine in the rat. Cancer Res 1981; 41: 3128-3132.

Haggerty HG, Holsapple MP. Role of metabolism in dimethyl nitrosamine-induced immunosuppression: a review. Toxicology 1990, 63:1–23.

Lee VM, Keefer LK, Archer MC. An evaluation of the roles of metabolic denitrosation and alpha-hydroxylation in the hepatotoxicity of N-nitrosodimethylamine. Chem Res Toxicol 1996; 9: 1319–1324.

Anderson LM, Koseniauskas R, Burak ES, Logsdon DL, Carter JP, Driver CL et al. Suppression of in vivo clearance of N-nitrosodimethylamine in mice by cotreatment with ethanol. Drug Metab Dispos 1994; 22:43-49.

47

Hecht SS. Approaches to cancer prevention based on an understanding of N-Nitrosamine carcinogenesis. Proc Soc Exp Biol Med 1997; 216: 181-191.

Lijinsky W. Comparative carcinogenesis of N-nitroso compounds in different species. In: Walker EA, Griciute L, Categnaro M, Borzsoni M editors. N-Nitroso Compounds:Analysis, Formation and Occurrence. IARC Scientific Publications No.31,International Agency for Research on Cancer. Lyon, France, 1980, 745-753.

Cliet I, Fournier E, Melcion C, Cordier A. In vivo micronucleus test using mouse hepatocytes, Mutat Res 1989; 216: 321-326.

Morison V, Ashby J. Reconciliation of five negative and four positive reports of the activity of dimethylnitrosamine in the mouse bone marrow micronucleus assay. Mutagenesis 1994; 9: 361-365.

Sato S, Taketomi M, Morita T. Simplified mouse peripheral reticulocyte micronucleus test with dimethylnitrosamine, Mutat. Res 1992; 278: 103-107.

Robbiano L, Mereto E, Morando AM, Pastore P, Brambila G. An in vivo micronucleus assay for detecting the clastogenic effect in rat kidney cells. Mutat Res 1997; 390: 51-57

Inui N, Nishi Y, Taketomi M, Mori M. Transplacental action of sodium nitrite on embryonic cells of Syrian golden hamster, Mutat Res 1979; 66:149-158.

Bolognesi C, Rossi L, Santi L. A new method to revealthe genotoxic effects of N-nitrosodimethylamine in pregnant mice. Mutat Res. 1988; 207:57-62.

Jorquera R, Castonguay A, Schuller HM. Effects of age ethanol on DNA single-strand bresks and toxicity induced by 4 - (methylnitrosamino) - 1 - (3-pyridyl) – 1 - butanone or N-nitrosodimethylamine in hamster and rat liver. Cancer Lett 1993; 74: 175-181.

Asakura S, Sawada S, Daimon H, Fukuda T, Ogura K, Yamatsu K et al. Effects of dietary restriction on induction of unscheduled DNA synthesis (UDS) and replicative DNA sunthesis (RDS) in rat liver. Mutat Res 1994; 322(4): 257-264.

48

Tinwell H, Lefevre PA, Ashby J. Mutation studies with dimethylnitrosamine in young and old lac I transgenic mice, Mutat Res 1994; 307: 501-508.

Webster KS, Gawde MD, Bhattacharya RK. Protective effect of rutin, a flvonol glycoside, on the carcinogen-induced DNA damage and repair enzymes in rats, Cancer Lett 1996; 109: 185-191.

Jalas JR, McIntee EJ, Kenney PM, Upadhyaya P, Peterson LA, Hecht SS. Stereospecific deuterium substitution attenuates the tumorigenicity and metabolism of the tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), Chem Res Toxicol 2003; 16: 794–806

Raj A, Mayberry JF, Podas T. Occupation and gastric cancer. Postgrad Med J 2003; 79: 252–258.

Jakszyn P, Bingham S, Pera G, Agudo A, Luben R, Welch A et al. Endogenous versus exogenous exposure to N-nitroso compounds and gastric cancer risk in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC-EURGAST) study. Carcinogenesis 2006; 27(7): 1497–1501.

de Vocht, Burstyn I, Straif K, Vermeulen R, Jakobsson K, Nichols L, Peplonska B et al. Occupational exposure to NDMA and NMor in the European rubber industry, J Environ Monit 2007; 9: 253–259.

Helguera AM, Gonzalez MP, Cordeiro MNDS, Cabrera MA. Quantitative structure-carcinogenicity relationship for detecting structural alerts in nitroso compounds: species, rat; sex, female; route of administration, gavage. Chem Res Toxicol 2008; 21:633–642

Rostkowska K, Zwierz K, Różański A, Moniuszko-Jakoniuk J, Roszczenko A. Formation and metabolism of N-nitrosamines. Polish J Environ Stud 1998; 7: 321–325.

Yamazaki H, Oda Y, Funae Y, Imaoka S, Inui Y, Guengerich FP et al. Participation of rat liver cytochrome P450 2E1 in the activation of N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiethylamine to products genotoxic in an acetyltransferase-overexpressing Salmonella typhimurium strain (NM2009). Carcinogenesis 1992; 13: 979–985.

49

Jaworska G. Content of nitrates, nitrites, and oxalates in New Zealand spinach. Food Chemistry 2005; 89(2): 235-242.

Uwah EI, Abah J, Ndahi NP, Ogugbuaja VO. Concentration levels of nitrate and nitrite in soils and some leafy vegetables obtained in Maiduguri, Nigeria. JASES 2009; 4 (3): 233-244.

LUCRĂRI PERSONALE PUBLICATE IN EXTENSO DIN DOMENIUL TEZEI

1. Avasilcăi L., Cuciureanu R. (2008) Nitraţii şi nitriţii din

preparatele din carne-precursori ai nitrozaminelor, disciplina Chimia mediului şi alimentului Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa” Iaşi, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iaşi-2011-vol115, nr.2.

2. Avasilcăi L., Şlencu B., Ciobanu C., Cuciureanu R. (2011)

Effects of sodium selenite administration during diethylnitrosamine intoxication in rats. Studia Universitatis “Vasile Goldiş”, Seria Ştiinţele Vieţii Vol.21, issue 2, 2011, pp.169-174.

Documents

Rezumat DIACONU (AVASILCĂI) LILIANA