Rétrovirologie appliquée au diagnostic et au suivi des patients en PED François Simon –...
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Rétrovirologie appliquée au diagnostic et au suivi des patients en PED François Simon – Constance François Simon – Constance Delaugerre Delaugerre Service de Microbiologie Service de Microbiologie CHU saint Louis – Paris 75475 CHU saint Louis – Paris 75475 cedex 10 cedex 10 [email protected][email protected]CHU Saint Louis Paris
Rétrovirologie appliquée au diagnostic et au suivi des patients en PED François Simon – Constance Delaugerre Service de Microbiologie Service de Microbiologie
Rtrovirologie applique au diagnostic et au suivi des patients
en PED Franois Simon Constance Delaugerre Service de Microbiologie
Service de Microbiologie CHU saint Louis Paris 75475 cedex 10
[email protected] CHU Saint Louis Paris
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RETROVIRIDAE Retroviridae : grande famille Associs de
nombreuses pathologies incluant : vtumeurs dveloppement plus ou
moins rapide vsyndrome neurologique vimmunodficience Tous les
rtrovirus ont : une structure une organisation gnomique un mode de
rplication similaires
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Premire preuve du passage inter espces HIV-1 group N &
SIVcpz -1998 env gag-pol virus retrouv uniquement au Cameroun
particularit = virus recombinant entre VIH-1 groupe M (rgion Pol)
et SIV cpz pour lenveloppe
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Un nouveau VIH : passage entre les SIV du gorilles et lespce
humaine le groupe P
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Diversit du VIH HIV-1 4 groupes HIV-2 HIV-1 O HIV-1M HIV-1N A C
virusmosaques B D (E) G H (I) J F A B C D E CRF01-AE* Plus de 40
formes recombinantes ou CRFs ou CRFs CRF04-cpx* K F H G A B CRF02 ?
HIV-1 P
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Groupe M = sous-types purs & formes recombinantes
circulantes actuelles
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Distribution gographique des sous-types et des formes
recombinantes B B, F1, B/F, C B AG, A, G A, A/G, C, D, F1, F2 G, H,
J, K, A/E, O, N C, A, D C B A/E, B B, B/C, A/E A, A/B, B, C
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Impacts de la diversit gntique du VIH Diagnostic : dtection du
VIH-0 mise en dfaut en 1994 Quantification :
sous-quantification/non quantification de sous-types VIH-1 (2) (si
CV basse ou indtectable en labsence de ttt, associe un taux de CD4
bas), VIH-2 Sensibilit aux antirtroviraux : Impact du polymorphisme
du gne de la protase (5) Prdisposition gntique du sous-type C la
rsistance lfavirenz (6), la nvirapine (7), au tnofovir (8)
Transmissibilit : TME plus importante des sous-types D (9) Pas
dimpact des sous-types sur la rponse au traitement (10, 11)
Vaccination : reste lenjeu majeur !
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Gnome et protines structurales enzymes Gnes Protines Prcurseurs
macro-protines env tat nef rev tat LTR pol gag vif vpu vpr rev p160
p55 p68p31/34 p17 p24 gp120 gp41 gp160 enveloppe capside LTR
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VIH - cycle de rplication - interaction GP120 et recepteur CD4
- interaction GP41 et membrane cellulaire fusion des membranes -
ARN viral hybride ADN/ARN ADN Reverse transcriptase polymrase -
intgration au gnome (intgrase): ADN proviral - activation
transcription ADN proviral
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Risque de transmission en fonction des stades de linfection
Primo-infectionPhase asymptomatique SIDA 1/1000 1/10 000 1/25 1/50
1/1000 Galvin S, Cohen M Nat Rev Micro 2004
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Quels sont les examens biologiques qui permettent de faire le
diagnostic de linfection VIH-1 ? VIH-2 ?
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Les moyens du diagnostic ELISA le plus souvent (en UE) combins
( de 4eme gnration dans lUE) : dtectent Antigne VIH et anticorps
anti VIH1 & VIH2 Tests dit rapides sont des dispostifs
unitaires de ralisation simple sans apport de matriel et ne
ncessitant pas de chaine du froid Western Blot confirment la
prsence des anticorps anti VIH-1 ou VIH-2 LARN plasmatique signe la
prsence dun VIH rplicatif partir des cellules infectes. Les tests
dit de charge virale quantifie cette rplication en copie de virus
par mL de plasma LADN proviral ou ADN intgr correspond la prsence
du provirus dans les cellules infectes Les tests de rsistance
recherchent la prsence de mutations du gnome VIH sous la pression
des antirtroviraux
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Cintiques des marqueurs de linfection Cunningham et al
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Les moyens du diagnostic Les EIA combins ( de 4eme gnration
dans lUE) : dtectent Antigne VIH et anticorps anti VIH1 & VIH2
Les tests dit rapides sont des dispositifs unitaires de ralisation
simple sans apport de matriel et ne ncessitant pas de chaine du
froid Les Western Blot confirment la prsence des anticorps anti
VIH-1 ou VIH-2 LARN plasmatique signe la prsence dun VIH rplicatif
partir des cellules infectes. Les tests dit de charge virale
quantifie cette rplication en copie de virus par mL de plasma LADN
proviral ou ADN intgr correspond la prsence du provirus dans les
cellules infectes Les tests de rsistance recherchent la prsence de
mutations du gnome VIH sous la pression des antirtroviraux
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Nature de lantigne de capture des anticorps Virus entier purifi
Protines virales natives ou recombinantes Peptides de synthse
Dtection des anticorps Totaux (IgG + IgM) IgG ou IgM ELISA combine
: dtecte anticorps et antigne Expression des rsultats Qualitatif
(positif ; ngatif ; douteux) Quantitatif (titre) Diagnostic
indirect : Srodiagnostic de dpistage ELISA
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Microplaque ELISA : Les puits color s correspondent des
positivit s Test ELISA indirect (Infection par le VIH)
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Exemple dautomates EIA (VIH & hpatites et autres ) EIA 4me
gnration Ag + Ac Architect Abbott Axym Abbott Vidas bioMrieux
Microplaques Behring-Siemens
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Tests de diagnostic rapide (TDR) : Utiliss depuis plus de 19
ans Contrles interne des tests Raction positive : Prsence possible
danticorps anti VIH-1 C : bande contrle de bon fonctionnement du
test T : bande de ractivit anti VIH c c T Test VIKIA VIH ,
bioMrieux Test Determine HIV 1-2, Inverness
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western blot VIH-1 avec les poids molculaires des principaux
antignes (New Lav blot 1, Biorad-Pasteur). la confirmation des
infections par le Western Blot
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Valeurs prdictives la sensibilit d'un test est sa capacit de
donner un rsultat positif lorsque linfection est prsente. la
spcificit est la capacit d'un test de donner un rsultat ngatif
lorsque linfection n'est pas prsente. La valeur prdictive positive
est la probabilit que le virus soit prsent lorsque le test est
positif. La valeur prdictive ngative est la probabilit que le virus
ne soit pas prsent lorsque le test est ngatif. La valeur prdictive
est fonction de la sensibilit et de la spcificit du test ainsi que
de la prvalence de la condition l'tude
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Sensibilit, spcificit, valeur prdictive a reprsente le nombre
d'individus malades avec un test positif (les vrais positifs), b
reprsente le nombre d'individus non-malades avec un test positif
(les faux positifs), c reprsente le nombre d'individus malades avec
un test ngatif (les faux ngatifs), d reprsente le nombre
d'individus non-malades avec un test ngatif (les vrais ngatifs)
maladeNon malade Test + Test - ab cd sensibilit = a / (a + c)
spcificit = d / (d + b VPP = a / (a + b) VPN = d / (c + d)
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Anticorps anti Enveloppe ARN Annes Phases prcocesInfection
chronique Ag p24 AC -p24 p34 Marqueurs molculaires et srologiques
lors de linfection par VIH-1
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Daprs Cunningham et al 2009 Tests rapides 4 gen EIA
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VIH-2 sous type B VIH-2 sous type A WB HIV-1WB HIV-2
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Principes gnraux des TDR Immuno-filtration ou
immuno-chromatographie ligne contrle Ligne du test Conjug avec or
colloidal +proteine A. Ac anti anticorps humain Antigene HIV-1/2 Or
Colloidal Conjug la Proteine A AC Humains non HIV Ac HIV-1/2
Prlvement
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Sang total : sang non dcant avec globules rouges et plasma, en
gnral sang capillaire ou veineux non centrifug. Ne peut tre conserv
Le papier filtre serait une alternative Contrle, biologie
molculaire Srum ou plasma : recueil aprs centrifugation en milieu
spcialis = utilisable pour tous les autres tests, idal pour
conservation, traabilit Salive : recueil standardis entre gencive
et lvre infrieur : liquide crviculaire ? Les matrices des TDR
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TDR versus ELISA Les TDR actuels marqus CE et utiliss sur srum
: - ne dtectent que les anticorps -tre considrs comme quivalents en
terme de sensibilit en primo infection aux des tests ELISA de
troisime gnration pour les meilleurs dentre eux -- difficilement
valuable sur sang total /liquide crvicualaire pour les primo
infections Les test TDR avec dtection antigne p24 et anticorps : -
Marquage CE en 2009 - quivalent quatrime gnration ? - Difficilement
valuable pour les primo infections
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March mondial anarchique : > 80 tests, nombreux
fabricants,vendeurs et revendeurs (voir du mme test !)
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Des marquages FDA USA et CE UE diffrents (sauf OraQuick)
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Tests rapidesTests ELISA 4 me gnration Avantages facilit
demploi, stockage temprature ambiante, ralisable en tout lieu, tout
endroit rsultats satisfaisants en termes de sensibilit et de
spcificit lors de la phase chronique de linfection grande
sensibilit y compris en primo- infection excellente spcificit
facilement valuable sur les panels congels, automatisables haut
dbit Raliss 37 prix avantageux traabilit et enregistrement
informatique des rsultats. Inconvnients manque de sensibilit dans
les phases prcoces de linfection manque de traabilit, les rsultats
ne pouvant tre enregistrs, subjectivit de lecture problme
dlimination des dchets infectieux si utiliss en dehors des circuits
de soins habituels prix gnralement lev ncessit de chanes de froid
dlectricit et de structures minimales de laboratoire Avantages et
limites des systmes de dpistage pour le VIH
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R-valuation des 4 tests CE Sur sang total et du test salive et
du Determine 4eme gnration en cours St Louis (JM Molina- W
Rozembaum F Simon) 4 tests marqus CE pour lutilisation sur sang
total, un pour la salive Determine Inverness Insti Biolytical
OraQuick sang et salive Vikia bioMrieux
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Resultats - patients VIH+ * p 0.02 - 60 tests ont t lus comme
ngatifs particulirement avec Oraquick salive - 36 patients, soit
20B, 13 non B, 2HIV-2, 1 HIV0 - taux lev dinvalides avec le
Determine 4 th - Aucune dtection dag p24 Ag y compris lors des
primo infection y compris en prsence confirme de p24 sur srum
380pg/ml n =200Oraquick Oral fluid Oraquick blood Vikia blood
Determine blood Determine 4 th blood INSTI blood Negatif271131072
Douteux1061174 Invalide0004332 Positif163183196185153192
Sensibilit86.5% *94.5%98.5%94.9%95.8%99%
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Limites des TDR Difficult dvaluation sur sang total et salive
des primo infections Sensibilit moindre (primo-infection) que les
tests Elisa donc risque de faux-ngatifs y compris dans les mois
suivants la sroconverion en EIA frquence des faux positifs Lecture
subjective Archivage difficile (photo ? ) Ngligence des autres IST,
absence de TDR pour HBV marqu CE obligeant EIA, cots
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Un TDR ngatif 3 mois aprs lexposition suppose signera labsence
dinfection pour ce risque Ce dlai est li la moindre sensibilit des
TDR en primo infection et lincidence des VIH dans notre pays couple
la diversit gnotypiques des souches en circulation Quand rendre un
TDR ngatif par rapport un risque
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TDR Sang total + ou +/- HIV ngatif Sauf exposition VIH dans les
3 mois prcdents ou situations dimmunosuppression profonde ou de
variants rares Recherche Ac ant VIH-1 et VIH-2 et d Ag P24 par un
test Elisa 4me gnration (EIA) et par un Western Blot (WB) HIV
positif EIA + & WB + Infection VIH confirme A diffrencier entre
VIH-1 et VIH-2 - raction non spcifique - Erreur didentification
Primo-infection Probable ou VIH-2 TDR Sang total - Nouveau
prlvement Nouveau contrle srologique et explorations complmentaires
= ARN, suspicion variants EIA WB + ou - EIA + WB + EIA + WB +/- ou
-
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Aids, test at home for HIV, 21,95 a reliable, fast and discret
test
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Page 44
QUIZ
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Quantification des CD4
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Minicytomtres de flux Apoge A40 Easy Guava CD4Cyflow
Counter
Plasma RNA VIRAL LOAD Ultra sensitive HIV-1P24 Cavidi RT ExaVir
Quantification du VIH en PED
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La charge virale : une rfrence A D C A D C CRF02 A C D CRF01 F
G H J K, CRF11-cpx Group O N P CRF02-AGVIH-2 C Branched DNA
(Versant) RT rt PCR (NexSys ; 2010) RT PCR (Monitor) Easy V V1.0,
1.2 RT PCR (LCx HIV RNA) RT rt PCR (m2000rt) NASBA RT rt PCR ( in
house ) Siemens RT rt PCR (TaqMan 48) V2.0 RT rt PCR (TaqMan 48)
Easy V V 2.0 2010 Re commercialis en Afrique
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DBS & DPS pour la charge virale et la rsistance Peut on
pooler les plasma pour une surveillance ? Pourrait amliorer le
monitoring sans altrer la sensibilit. Richman DDRichman DD, Benson
CA, Little SJ et al AIDS. 2009 Oct 23;23Benson CALittle SJ Dried
Serum Spots from 47 drug nave and 15 treated patients VL >
100,000 protease 100% RT 100% 10000
Le premier test rapide pour la dtection de lantigne p24 manque
de sensibilit Problme de dtection des non B AgP24 (pg/ml) >
400400-100100-5050-5 Rfrence EIA P24 VIDAS 64 517 Determine 4eme G
Ag POSITIF 43 10 JC Tardy, Lyon 2009 32 HIV-1 p24 positive sera by
EIA Les amliorations de ce type de tests sont en cours. A
surveiller
Page 64
Principe du test HIV RT Cavidi Exavir :
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Principe du test HIV RT Cavidi Exavir : 2
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Simon et al, AIDS. 2003 Feb 14;17(3):331-6.
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HIV RNA copies/ml Number of samples % detected Vs. 3 (n) 50
-4004271% (30) 401 -2,0003692% (33) 2001 -10,0003597% (35) 10,001
-50,0004698% (45) >50,00042100% (42) Cavidi ExaVir Load V 3.0
JCM Accepts, published online 2009
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Plasma RT activity assay for HIV viral load Simon et al, AIDS.
2003 Feb 14;17(3):331-6.
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Trousse PCR rt ExaVirLoad version 2 ELISA ultra sensible
manufacturer Abbott - Roche bioMrieux CavidiPerkin Elmer Principe
real time PCR Activit transcriptase inverse (Seuil 400 copies/ml)
Antignmie p24 sensibilise (Seuil 400 copies/ml) Detection Internal
control of procedure ELISA targets Pol LTR (NEC152/NEC131) Gag
LTR+Gag polgag Sous-types du VIH-1 ? M (A to G) + O + VIH-2 M (A to
G) + O ? FDA CE IVD Yes No Timing for results4-6 h 2,5 days 3 h
machinery 30000 + Maintenance (5000 /y) 10 000 Cost/test15 $ [10-15
]15 10
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Is Routine Laboratory Monitoring of Patients on HAART Necessary
to Improve Treatment Outcomes?
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Is Routine Laboratory Monitoring of Patients on HAART Necessary
to Improve Treatment Outcomes? The DART Study DART compares
outcomes in patients on antiretroviral therapy according to whether
they received routine laboratory and clinical monitoring (LCM), or
clinically driven monitoring (CDM) alone. LCM group would be
monitored in a manner similar to how patients in the developed
world are monitored, CDM group would be managed according to
clinical symptoms only, without routine access to laboratory tests.
James G. Hakim, MBChB, MMed, MSc, FRCP:
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Is Routine Laboratory Monitoring of Patients on HAART Necessary
to Improve Treatment Outcomes? 3316 participants in Uganda and
Zimbabwe World Health Organization (WHO) stage II, III, or IV HIV
disease, CD4+ cell count < 200 cells/mm3 Patients were
randomized on a 1 to 1 basis to the 2 study arms. Twelve-weekly
biochemistry analyses, full blood counts, and CD4+ cell count were
conducted in both study arms. Results of all these tests were
provided in the LCM arm, CDM arm, results were only provided if
clinically indicated or if there was grade 4 toxicity. CD4+ cell
count results of patients in the CDM arm were not provided to
physicians under any circumstances. James G. Hakim, MBChB, MMed,
MSc, FRCP:
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Results median CD4+ cell count 86 cells/mm3. more than three
quarters had either WHO stage III or IV disease. Most received
tenofovir with zidovudine/lamivudine (74% to 75%); 16% in each arm
received nevirapine and 9% received abacavir. After 5 years of
follow-up, survival rates were high in both study arms90% in the
LCM arm vs 87% in the CDM arm. However, access to laboratory
monitoring in the LCM arm was associated with a small but
significant reduction in survival (hazard ratio [HR] CDM:LCM: 1.35;
95% confidence interval [CI]: 1.10-1.65; P =.004), difference was
observed only after 2 years of treatment. James G. Hakim, MBChB,
MMed, MSc, FRCP:
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2009 Revisions of WHO recommendations on use of Antiretroviral
Therapy (ART) HIV/ATC October 2009
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Proposed WHO 2009 Criteria for the ART Initiation in adults and
adolescents (ART Guidelines Meeting, October/2009) Clinical
SituationART initiation Recommendations Quality of Evidence
Strength of Recommendatio n WHO clinical stage 3 or 4Start ART
irrespective of CD4 Moderate- High Strong WHO clinical stage 1 or
2Need CD4 to decideVery LowStrong CD4 < 350 cells/mm 3 Start ART
irrespective of WHO stage ModerateStrong Active TBStart ART
irrespective of CD4 ModerateStrong PregnancyStart ART for stage 3/4
or CD4 < 350/mm 3 ModerateStrong Active chronic hepatitis BStart
ART irrespective of CD4 LowStrong
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Proposed WHO 2009 Preferred Regimens for ART Initiation in
adults and adolescents (ART Guidelines Meeting, October/2009)
Clinical Situation Preferred ART Regimen Quality of Evidence
Strength of Recommendatio n ARV naive HIV+ Adults AZT+3TC+NVP or
TDF+3TC/FTC+EFV Moderate Strong ARV naive HIV+ Adolescents
AZT+3TC+NVP or AZT+3TC+EFV Moderate Strong ARV naive HIV+ pregnant
women AZT+3TC+NVP or AZT+3TC+EFV (2 nd trimester onwards) Moderate
Low Strong Weak NVP exposed HIV+ pregnant women (no ARV tail, <
12 months) PI containing regimen 3 NRTI Low Very Low Strong Weak
ART Naive HIV + with active TB AZT+3TC+EFV or TDF+3TC/FTC+EFV
Moderate Strong ART naive HIV+ with active chronic hepatitis B
TDF+3TC/FTC+ EFV or TDF+3TC/FTC+ NVP Moderate Strong
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Recommendations on Lab Monitoring Recognise and describe the
following phases of HIV management : Phase of HIV
managementRecommendedDesirable At HIV diagnosisCD4HBsAg, ?HCV test
Pre ARTCD4 (6 monthly)Viral Load At start of ARTCD4 Hb for AZT
Renal screen for TDF On ARTCD4Viral load At clinical
failureCD4Viral load At immunological failureViral load Hb
recommended prior to AZT use. TDF can be used in absence of renal
screening or monitoring (benefits outweigh the risks). Symptom
directed laboratory monitoring for toxicity is recommended.
Simplified algorithms for ART failure being developed and
evaluated. Viral load threshold of 5000 copies /ml used for detect
or confirm treatment failure.
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RESISTANCE AUX ANTIRETROVIRAUX
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Modlisation de la cintique de dcroissance de la charge virale
plasmatique chez un patient qui dbute un traitement antirtroviral
efficace Dure du traitement antirtroviral efficace (jours) Seuil de
dtection Charge virale en ARN plasmatique 1re phase (T1/2 : 1 jour)
2me phase (T1/2 : 14 jours) Rplication virale rsiduelle Virus issus
du rservoir lymphocytaire Eradication ?
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Taux derreur de la TI: 1/10.000 nuclotides Production virale:
10 9 -10 10 particules par jour Toutes les mutations pr-existent
avant traitement Taux de recombinaison: 5 10 vnements par cycle
Evolution constante de la quasiespce Demie-vie dun virus
plasmatique = 0.3 jours Demie-vie des cellules infectes = 2.2 jours
Pourquoi y a til slection de virus rsistants ?
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Pression de slection antirtrovirale Slection de variants
rsistants Suppression incomplte Dfaut de puissance Taux
plasmatiques insuffisants Dfaut dobservance Pr-existence de
rsistance Charge virale Temps Variants sensibles Variants rsistants
Dbut du traitement
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Mutations de rsistance Prsentes dans les gnes cibles des
antirtroviraux : -->TI, protase, gp41, intgrase Elles confrent
un avantage rplicatif aux virus en prsence de drogues :
-->slection de variants muts Certaines ont un effet ngatif sur
la fonction de lenzyme M184V (sauvage) position (mut)
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Facteurs influenant le profil de rsistance Barrire gntique de
lantirtroviral Concentration de lantirtroviral (plasma,
compartiment) Combinaison antirtrovirale (drogues associes) Niveau
de charge virale Sous type viral VIH-1
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Analyse des mutations des gnes RT, protase, gp 41 VIH-1
associes la rsistance aux traitements antirtroviraux Gnotype de
rsistance -VIH1 Choix du premier traitement Gestion des checs
virologiques
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Mutations aux INTI Didanosine Emtricitabine Lamivudine
Stavudine Zidovudine Abacavir Tenofovir www.iasusa.org
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u Liste International AIDS Society USA (www.iasusa.org)
Corrlation avec donnes phnotypiques u Algorithmes dinterprtation
groupe rsistance AC11 - ANRS (www.hivfrenchresistance.org)
Corrlation avec rponse clinique Stanford University (www.
hivdb.stanford.edu) Pondration des mutations Gnotype de rsistance
-VIH1 Analyse des mutations de rsistance gnes RT, protase, gp41,
intgrase Interprtation complexe
Page 87
INDICATIONS DES TESTS DE RESISTANCE (Rapport Yni 2008)
RECOMMANDE Primo-infection Ds le diagnostic ou avant initiation du
traitement Tous les checs thrapeutiques (rplication virale sous
traitement) Grossesse Nouveau-n Enfant (diagnostic et chec) NON
RECOMMANDE AES Accident dexposition au sang/sexe