Virologia

Aula 1 – Princípios de Virologia

Características Gerais

1 - Acelulares, estrutura compacta e econômica

- Não apresentam organelas, como ribossomos, Golgi, RE etc- Não possuem maquinaria completa para síntese de proteínas- Possuem ácido nucleico, protéinas, lipídeos (alguns)

2 - Parasitas intracelulares obrigatórios

- Usurpam e manipulam a maquinaria celular para formar sua progênie

- Não se multiplicam fora da célula hospedeira (macromoléculas)- Multiplicação depende de encontro com hospedeiro específico

3 - Dimensões ultramicroscópicas

- De 24 nm (bacteriofago MS2) até 800 nm (mimivirus)

Componentes da Partícula Viral: elementos e geometria

Estrutura Viral Básica

1- Envelope (lipoproteico)2- Enzimas e/ou outras proteínas3- Capsídeo (proteico)4- Cerne (Genoma: DNA ou RNA)5- Espículas ou ligantes virais (proteínas e/ou carboidratos)

Capsídeo

- Formado por subunidades proteicas idênticas ou similares (capsômeros)

- Capsômeros podem apresentar auto-montagem- Capsídeo pode apresentar diferentes simetrias dependendo da

forma ou arranjo dos capsômeros o simetria icosaédrica: herpesvirus, papillomaviruso simetria helicoidal: Influenza viruso simetria complexa: Bacteriófago T4, Varíola virus

Genoma viral

- DNA ou RNA

- Fita simples ou dupla

- Linear ou circular

- Fita única ou segmentada (permite rearranjos, aumentando variabilidade)

- Polaridade positiva ou negativa

Vírus de RNA: o apresentam maiores taxas de mutaçãoo multiplicação no citoplasmao RNA polaridade positiva : genoma viral funciona como RNA

mensageiroo RNA polaridade negativa : genoma viral precisa ser

transcrito para iniciar multiplicação (RNA polimerase dependente de RNA é necessária)

Vírus de DNAo Possuem os maiores genomas viraiso Multiplicação nuclear

Mecanismos de economia genética (4):

Relação direta com as características biológicas do

1. Sobreposição de ORFs

2. Proteínas multifuncionais

3. Leitura das fitas do genoma nos dois sentidos

4. Ampla utilização da maquinaria celular

Função da Partícula Viral: ciclo de multiplicação

1. Adsorção2. Penetração3. Desnudamento4. Biossíntese5. Morfogênese6. Liberação

1 – Adsorção

- Ligação específica entre os ligantes virais e receptores celulares localizados na membrana citoplasmática

- Receptores virais estão diretamente relacionados com tropismo celular/tecidual e a especificidade do hospedeiro

- Alguns virus também interagem com receptores secundários (co-receptores)

2 – Penetração

- Envelopados:o Fusão de membranaso Endocitose mediada por receptor

- Não envelopados:o Perfuração da membranao Formação de poros

3 – Desnudamento

- Associado à membrana- Citoplasmático- Associado ao núcleo

4 – Biossíntese

- Dengue virus: o Síntese de RNA polimerase dependente de RNA após

tradução

- Variola virus: o Síntese de DNA polimerase ou utiliza a celular após

tradução

- Rabies virus: o RNA polimerase dependente de RNA presente na partícula

viral e mais síntese após tradução

- HIV:o Transcriptase reversa presente na partícula viral

5 – Morfogênese

- Montagem das subunidades proteicas (e dos componentes da membrana no caso de vírus envelopados) e empacotamento do genoma viral, com formação de novas partículas virais completas em um determinado sítio das células.

- Sítios replicativos dependem de disponibilidade nutricional e proteção (citoplasmáticos ou nucleares)

- Herpesvirus: interação entre região terminal do genoma e proteína do capsídeo

- Vírus envelopados: envelopes devem ser adquiridos de compartimentos membranosos da célula previamente

modificados por proteínas virais (vírus não são capazes de sintetizar lipídeos)

6 – Liberação

- Vírus volta ao ambiente extracelular- Intimamente relacionada com as características biológicas do

vírus:o Envelopado ou não, sítio de multiplicação celular

Aula 2 – Patogênese Viral

Etapas da Doença

- Infecção: vírus alcança um sítio primário e consegue se multiplicar

- Período de incubação: entre a infecção e o aparecimento dos primeiros sintomas

- Período prodrômico: ocorrem os sintomas inespecíficos- Período de doença: ocorrem sintomas clínicos característicos- Período de convalescência: hospedeiro se recupera

Transmissão do Vírus na Natureza

- Vertical: Mãe −> Embrião/Fetoo HIV, Rubéola

- Horizontalo Contato: sexual, fômites, pele etco Veículos: água, alimentoso Vetores: invertebrados, vertebrados

Requisitos para o Ínicio da Infecção

1. Inóculo viral suficiente: resistência ambiental, diluição, defesas do hospedeiro

2. Sítio de entrada correto: acessibilidade, susceptibilidade e permissividade

3. Vencer as defesas do organismo: mecânicas, químicas, inatas e adaptativas

Rotas de Entrada

Mucosas

- Vastas, imunologicamente muito ativas – prevenção da entrada de patógenos (IgA, células NK, cílios, folículos linfoides, macrófagos etc)

Trato respiratórioo Defesas

Superior: IgA, muco, cílios, tonsilas Inferior: macrófagos e monócitos

o Transmissão Aerossois: saliva e perdigotos Contato direto com secreções

o Infecção pode ser localizada (e.g. rhinovirus) ou sistêmica (e.g. influenza)

o Somente partículas menores que 5 μm atingem alvéolos

Trato gastrointestinalo Vírus precisam ser resistentes a variações de pH, ação de

enzimas digestivas e condições ambientais extremas

o Transmissão Água e alimentos

o Infecções Localizadas

Rotavírus, norovírus e coronavírus: diarreias Sistêmicas

Enterovírus: pólio, hepatite A Reovírus: infecções entéricas Adenovírus: infecções entéricas, renais

o Células M Promotoras de transcitose de agentes de defesa Usada por vários patógenos para a entrada:

reovírus, coronavírus, HIV (via anal)

Trato Urogenitalo Defesas

IgA, muco, fagócitos, pH ácidoo Entrada

Microabrasões TUG feminino mais susceptível, apesar do baixo pH HIV, HHV-1/2, vírus da hepatite B

Conjuntivao Defesas: Secreção da ocular, pálpebraso Entrada: Microabrasões (lente, água)o Disseminação sistêmica rara

Pele

o Defesas: Queratina, células de Langerhanso Entrada: Abrasões, picadas, agulhas, pircing, tatuagens,

mordidaso HIV, dengue, hepatites, vaccinia, HPV

Tropismo

- Acessibilidade: capaz de alcançar órgão ou tecido no qual ele se multiplica

- Susceptibilidade: célula que tenha receptor que permita entrada viral

- Permissividade: célula possui toda maquinaria que permite multiplicação do vírus

Receptores celulares: receptores com função fisiológica, mas que são reconhecidos pelos ligantes virais, aos quais se ligam inadvertidamente.

Disseminação

- Infecção localizadao Multiplicação no sítio de entrada - Disseminação célula-

célulao Ex: papilomavirus (epiderme), rotavirus (vilosidades

intestinais)

- Infecção disseminada1. Sítio primário de infecção2. Linfonodo regional3. Viremia primária4. Sítios secundários de infecção (órgãos linfoides)5. Viremia secundária6. Sítio trópico de infecção7. Eliminação e transmissão

Danos Teciduais

- Efeitos citopáticos- Imunopatologias

o Apoptoseo Superantígenos

Padrões de infecção

HIT-AND-RUN vs STAY-AND-FIGHT(multiplicação rápida) (multiplicação lenta)

- Agudaso Produção rápida de vírus seguida da resolução rápida e

eliminação da infecção pelo hospedeiro. Pode ser aparente ou não.

- Persistenteso Infecções não são eliminadas rapidamente, podendo

evoluir para cronicidade, latência ou com recidivas

- Abortivaso Infecção não produtiva. Célula susceptível, mas não

permissiva, ou partícula viral defectiva

Infecção Aguda

Ex: Varíola, Caxumba, Gripes e resfriados

Infecção Lenta – “Aguda com recorrência tardia”

Ex: Varicela, Herpes Zoster, Sarampo

Infecção Crônica

Ex: Hepatite B, AIDS, HTLV

Infecção Latente

Ex: Herpes e Hepatite C

Excreção

- Etapa fundamental para a manutenção e circulação da progênie viral na natureza

o Secreções respiratóriaso Sangueo Lesões ulceradas na peleo Leite maternoo Fezeso Trato genitourinário

Evolução da Infecção: multi-fatorial

- Víruso Espécie

o Amostrao Variabilidade genéticao Tamanho do inóculoo Rota de entrada

- Hospedeiroo Genéticao Idade

Habilidade das células suportarem a multiplicação viral

Resistência à perda celular (grande capacidade de renovação tecidual)

Resposta imune

Imunopatologias podem ser mais graves em adultos saudáveis do que em idosos ou crianças

o Estado nutricionalo Outros

Maior em jovens

Aula 3 – Diagnóstico Viral

Detecção

- Vírus em cultura (crescimento viral)o mais utilizado em pesquisas

- Antígenos virais (proteínas)o ELISA, imunofluorescência, Western-Blot

- Ácidos nucleicos viraiso PCR

- Anticorpos contra víruso Mais utilizadoo ELISA, ensaio de neutralização, inibição de

hemaglutinação

Coleta de Espécimes para Diagnóstico

- Local: em infecções agudas, no local da doençao Lícor (meningite), biópsia (mucosa)

- Tempo: títulos virais são maiores nos primeiros dias de doença aguda

Métodos Empregados

- Cultura viral em células- Microscopia óptica (cospúsculos de inclusão)- Microscopia eletrônica- Exame citológico (Papanicolau)- Detecção de antígeno viral- Detecção de ácidos nucleicos- Sorologia (detecção de anticorpos)

Cultura viral em células

Observa-se o efeito citopático

- Vantagenso Obtenção do patógeno vivoo Específico

- Desvantagenso Caroo Mão de obra treinadao Demoradoo Alguns vírus não se multiplicam em cultura ou não

causam efeito citopático

Diagnóstico HIV

Sorologia:

o ELISA (triagem) – alta sensibilidadeo Western-blot (confirmatório)

o ELISA – Detecção de anticorpos séricos contra proteínas do HIV

1. Preparação da placa de teste (ligação de antígenos HIV)

2. Adição do soro teste (anticorpo primário)3. Adição de anticorpos Anti-Ig humano conjugado

com enzima (anticorpo secundário)4. Adição de substrato enzimático cromogênico

Resultado s Reações cromogênicas indicam soro

positivo Podem haver resultados intermediários

(automatização)

o Western-Blot – Análise individual da presença de anticorpos anti-proteínas do HIV

1. Separação das proteínas em gel2. Transferência das proteínas separadas para

membrana3. Adição do soro teste, de anticorpos anti-humano

conjugados a enzima e substrato cromogênico

Resultado s Considerado positivo se pelo menos três

bandas são visualizadas, sendo uma a da polimerase (TR)

- Observações quanto à detecção de anticorpos o Indicador de status imunológicoo Indicador de infecções agudaso Nem sempre diferencia infecções ativas de pregressaso De importância relativa em infecções crônicas ou latenteso Não distingue indivíduo vacinado do doenteo Importante para acompanhamento do paciente

Marcadores de carga viral

PCR

- Vantagenso Altíssima especificidade e reprodutibilidadeo Simplicidadeo Potencial para automação e análise em larga escalao Diagnóstico rápido (~4h)

- Procedimentos1. Preparação da reação2. Reação de amplificação3. Análise em gel de agarose

Obs: PCR em tempo real é quantitativo