Espectroscopia de Correlação de Fluorescência de Complexos de Poro Nuclear Intactos

Transporte molecular através de complexos de poro nuclear (NPCs) fornecerm informações que podem ser usados para revelar os mecanismos de comunicação entre o núcleo e o citoplasma. Mas, moléculas individuais sofrem um transporte muito rápido, sendo difícil de seguir o seu movimento em um estado fisiológico em células vivas.

A espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) fornece sensibilidade a uma única molécula, na presença de muitas outras.

Medindo as mudanças na intensidade de fluorescência ao longo da orbita, pode-seobservar o transporte nucleocitoplasmático de moléculas GFP em todo o envelope nuclear (NE), e determinar as correlações no espaço e no tempo de moléculas de ligação individuais e deixando o NPC.

Para realizar o método, foi utilizado o receptor nuclear Kapb1 marcados para GFP (proteína verde fluorescente) e transitoriamente introduzidos em células CHO-K1. Kapb1-GFP serve como um marcador dinâmica do poro, uma vez que transporta através do NE e localmente acumula em NPCs individuais, onde se realiza o transporte bidireccional.

Ao longo da órbita, 64 pontos são amostrados. A orientação do envelope nuclear é selecionado de tal maneira que o ponto de início de digitalização situa-se ele. Assim, a primeira metade da órbita (pontos 0-32) corresponde a um compartimento (por exemplo, o núcleo) e a segunda metade (pontos 32-63) corresponde ao outro compartimento. A intensidade de fluorescência é registado ao longo da órbita e, em seguida, calculada.

Análise FCS é realizado para extrair informações sobre a dinâmica Kapb1 a nível única molécula. A protuberância identifica um tempo característico de correlação de fluorescência nas flutuações detectadas no poro. Se a interpretação do perfil ACF é correcta, o efeito de protuberância deve provar ser 1), dependente da presença de Kapb1); 2), característica da proximidade do poro; e 3), dependente da energia metabólica.

Assim, a combinação de espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) com acompanhamento orbital nos permite extrair as correlações característicos de eventos de transporte no sistema de referência do poro, e na presença de muitas moléculas, sob condições fisiológicas.