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Resumen

Este trabajo se basó en una investigación teórica y experimental, donde nuestro

objetivo fue la clonación del gen de la insulina usando un simulador gratuito en línea

tomando como base, los datos de la forma de obtención de la insulina anteriormente,

su estudio e importancia, así como su obtención del gen de la insulina actualmente.

Los avances tecnológicos, han permitido a la biotecnología poder mostrar con mayor

facilidad la manera en que funcionan ciertos procesos biológicos, aquí se explica el

uso del software llamado “Serial Cloner” simulador de utilidad que nos ayudó a poder

explicar el proceso de la clonación del gen de la insulina, donde también, se explica

la base de datos NCBI, en donde se pueden buscar los posibles plásmidos y

secuencias con que se puede realizar esta clonación del gen de la insulina in silico en

el Serial Cloner.

Sabemos que no son procesos capaces de ser observables al ojo humano, por lo que

se puede tomar como una gran oportunidad de poder apreciar su forma, función e

importancia al alcance de nuestra comodidad.

INTRODUCCIÓN

La insulina fue descubierta por científicos canadienses alrededor de los años 1921 y

1922 (Cannela, 2016). La insulina es la hormona hipoglucemiante. Como tal, su

función primaria es reducir la concentración de glucosa en sangre (glucemia)

promoviendo su transporte al interior de las células, pero sólo actúa en este sentido

sobre el tejido adiposo (adipocitos), el músculo (fibras musculares o miocitos) y el

corazón (fibras cardiacas o miocardiocitos). La insulina realiza esta función activando

el transportador de glucosa GLUT4, que sólo se encuentra en la membrana

plasmática de esas células. La glucosa es una sustancia poco polar, y como tal puede

difundir libremente por las membranas de las células.

La insulina es una hormona polipeptídica formada por 51 aminoácidos, producida y

secretada por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas. Su síntesis

pasa por una serie de etapas. Primero la preproinsulina es creada por un ribosoma

en el retículo endoplasmático rugoso (RER), que pasa a ser (cuando pierde su

secuencia señal) proinsulina. Esta es importada al aparato de Golgi, donde se

modifica, eliminando una parte y uniendo los dos fragmentos restantes mediante

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puentes disulfuro (Unión covalente entre dos átomos de azufre. Este tipo de enlaces

se forman por la oxidación de dos grupos sulfhidrilo (SH), cada uno perteneciente a

una molécula de cisteína. Son frecuentes entre cadenas polipeptídicas diferentes de

una misma proteína.) (Clínica Universidad de Navarra, 2015)

La diabetes es una condición que afecta la capacidad del cuerpo para transformar el

alimento en energía. La insulina lo ayuda a obtener energía de los alimentos. Una

parte de lo que se come, se transforma en azúcar llamada glucosa. La glucosa viaja

a través del cuerpo en la sangre. El cuerpo almacena la glucosa en las células para

usarla como energía. La insulina es la llave que abre la puerta a las células, por lo

que, cuando no se tiene suficiente insulina o ésta no funciona adecuadamente, la

glucosa permanece en la sangre. Con el tiempo, la glucosa se acumula en los vasos

sanguíneos y sale por orina. Esto puede dañar ojos, riñones, nervios, corazón y vasos

sanguíneos. Afortunadamente la insulina y otras medicinas para la diabetes suelen

formar parte del tratamiento de la enfermedad. Junto con la alimentación saludable y

la actividad física, las medicinas pueden ayudarle a controlar la enfermedad.

A partir de ese importante hallazgo, la diabetes humana se ha tratado con insulina

proveniente de otros mamíferos, como los cerdos y las vacas, debido a su gran

parecido con la insulina humana. Todo esto fue antes de las herramientas

biotecnológicas más recientes. Así pues, si se querían obtener 240 mL de insulina

purificada, era necesario que se utilizaran varias toneladas del páncreas cuerpo de

cerdos o vacas. La insulina animal se obtenía directamente del páncreas del animal.

Aunque la insulina, sobre todo de cerdo, era muy similar a la humana no era idéntica

y contenía algunas impurezas. Esto provocaba rechazo y en algunos casos alergias.

Estas impurezas se lograron disminuir con la mejora de la técnica. En los años 70, la

cromatografía líquida de alta resolución llegó a depurar la técnica obteniendo un 99%

de pureza. No obstante, las reacciones alérgicas menores no se han podido eliminar

totalmente. Además puede haber contaminación por toxinas y bacterias. La

Federación Internacional de Diabetes ha notificado que:

“Las insulinas animales [modernas y altamente purificadas] siguen siendo una

alternativa perfectamente aceptable”.

Actualmente, con la ingeniería genética se ha conseguido que la bacteria Escherichia

Coli (E. Coli) pueda producir insulina. Esta insulina se le llama insulina con ADN

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recombinante. La ventaja de esta insulina “humana” es que es fácil mantener la

bacteria, se pueden producir grandes cantidades en menor tiempo que la de origen

animal y con costos menores. La compatibilidad de la insulina es del 100%. Aunque

puede haber reacciones debido a otros componentes.

En el caso concreto de México, la diabetes (derivada de la insuficiencia de insulina en

el cuerpo) es una de las enfermedades más mortales hoy en día, tanto en niños como

en adultos y personas mayores; de hecho afecta a un gran porcentaje de nuestra

población ya que 4 millones de personas refirieron haber sido diagnosticadas con

diabetes. La proporción de adultos con diagnóstico previo de diabetes es de 9.2% (.

Esto se debe en gran parte a la cantidad de alimentos y bebidas azucaradas que

proliferan actualmente en nuestro mercado, afectando sobretodo a personas de bajos

recursos, ya que según la Federación Mexicana de Diabetes A.C “Más del 80% de

las muertes por diabetes se registran en países de ingresos bajos y medios”. -al no

poder hacerse con un tratamiento adecuado-, sumado a la herencia genética de ser

propenso a la diabetes, a la falta de ejercicio, obesidad infantil y en adultos.

Los avances en la biotecnología llevaron a que en la década de los 80s, se lograra

producir insulina más eficiente por medio de la inserción del gen humano de esta

hormona en la bacteria E. coli. Actualmente, se sigue utilizando la bacteria E. coli, ya

que es la bacteria más estandarizada, estudiada, secuenciada y su rendimiento es

bastante alto (Cannela, 2016).

Más recientemente, se ha conseguido que el cuerpo humano reaccione diferente a la

insulina suministrada con la ingeniería genética.

Los plásmidos portan el gen del péptido, estos plásmidos son introducidos a las

bacterias donde se habrá de sintetizar la hormona, a través de poros producidos en

las membranas de las bacterias por medio de descargas eléctricas (electroporación)

o bien por medio de un choque térmico. Una vez insertado el plásmido en la bacteria

se induce la síntesis del péptido por medio de especies químicas que activan la

maquinaria de transcripción y traducción del gen.

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Hoy en día se cuenta con herramientas más sofisticadas que antes, como laboratorios

mejor equipados y, sobre todo, con ordenadores potentes que nos brindan la

capacidad de hacer clonación in silico, es decir, hacer todo virtualmente para después

poder aplicar la clonación en el laboratorio experimental. Tal instrumento es el caso

del software llamado “Serial Cloner”.

ADN recombinante y clonación:

La tecnología del ADN recombinante tuvo sus orígenes en la década de los 70´s con

el descubrimiento y caracterización de las endonucleasas de restricción y el desarrollo

de métodos rápidos de secuenciación e hibridación de ADN, que aunado a la técnica

de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la clonación de genes en los 80´s,

sentaron las bases para el desarrollo de esta nueva biotecnología.

El ADN recombinante es una combinación de dos fragmentos de ADN de dos

especies distintas, en donde el material genético del huésped se replica junto con el

del hospedero. Esta técnica es muy usada por los investigadores actualmente.

Las etapas para la obtención de ADN recombinante son las siguientes:

a) El rompimiento del ADN tanto del huésped como del hospedero con

endonucleasas (enzimas de restricción).

b) El empalme (“pegar”) de estos dos fragmentos de ADN, mediante la enzima

ADN ligasa.

c) La clonación, en donde se inserta el ADN recombinante en un agente para su

posterior replicación (como por ejemplo en un plásmido , y éste a su vez es

absorbido por una bacteria).

d) El aislamiento de las bacterias deseadas (que portan el ADN con el gen

deseado).

Cabe destacar que además de usar las enzimas de restricción para insertar el gen

deseado en un plásmido, también se usan para introducir un gen de resistencia

antibiótica. Este gen será de utilidad en los siguientes pasos de la clonación, después

de que se haya suministrado calor (por ejemplo) a una solución de bacterias y

plásmidos, y algunas bacterias absorbieran estos plásmidos. Pero habrá bacterias en

la solución que no pudieran absorber los plásmidos, y por lo tanto, no tendrán el gen

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resistente al antibiótico y por lo tanto moriran. Aquí es cuando entra en acción el gen

de resistencia antibiótica, pues teniendo colonias de bacterias dispersas en nuestro

cultivo, se procederá a meter nutrientes junto con antibióticos para conservar aquellas

bacterias que tengan el plásmido con nuestro gen, y matar a las que no son útiles.

Reacción PCR:

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común

utilizada para hacer muchas copias de una región particular de ADN. Esta región de

ADN puede ser cualquier cosa que le interese al experimentador.

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer muchas

copias de una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de

un organismo). La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq

polimerasa, y requiere de cebadores de ADN diseñados específicamente para la

región de ADN de interés. (Omayra, 2007)

En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura

que permiten la producción de muchas copias de la región blanco.

La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza de

forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis forense de

ADN.

Enzimas de restricción:

Las enzimas de restricción son las enzimas encargadas de cortar un fragmento de

ADN en sitios específicos, ello acorde con las bases nitrogenadas (A, T, C, G) del

mismo. Además, estas enzimas cortan el ADN del individuo extraño y del hospedero

en lugares que permiten crear extremos “pegajosos”, con lo que ambos pedazos de

material genético se puedan acoplar, y formar el ADN recombinante.

Son extraídas de organismos procariontes (bacterias), donde actúan como un

mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la

célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para

distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. Las enzimas de restricción no pueden

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cortar ADN metilado, de este modo solo afectan el ADN extranjero y no el ADN

bacterial.

Las enzimas de restricción participan en la primera fase descrita anteriormente del

rompimiento del ADN, y luego la segunda etapa de empalme, se desarrolla con otra

enzima que se llama ADN ligasa.

Serial Cloner:

El software de Serial Cloner es una herramienta en línea y gratuita que permite

desarrollar la clonación in silico, es decir, virtualmente. Ahí el usuario puede descargar

archivos de genes de algún banco de datos para usarlos; le permite encontrar sitios

de restricción y las correctas enzimas de restricción para ello, encontrar nucleótidos

específicos y secuencias peptídicas, le permite visualizar el gen mediante gráficos y

mapas, además de que permite desarrollar el PCR de manera virtual, entre otras

funciones.(http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html)

Base de datos NCBI

NCBI (National Center for Biotechnology, por sus siglas en inglés) es un banco de

datos donde se puede encontrar información respecto a temas de biotecnología,

secuencias genómicas, medicina, así como enfermedades genéticas humanas. Esta

importante fuente de datos ha permitido a los investigadores de muchos países

realizar investigación de nivel, pues cualquiera puede ingresar a buscar información,

y descargar secuencias genéticas específicas, por ejemplo. Es lo que nosotros

hicimos para obtener el gen de la insulina.(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO

Este proyecto acerca de la clonación del gen de la insulina con métodos

computacionales (in silico), usando el Serial Cloner, se realizó mediante una

exhaustiva investigación teórica acerca del tema, consideramos que para poder llevar

a cabo un buen proyecto es muy importante contar con la información que se ha

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publicado con respecto a un tema, y nuestro caso poder explicar cómo se lleva a cabo

la clonación genética. Dado que en la ENP no contamos con la infraestructura

necesaria para poder llevar a cabo de manera experimentar la clonación de genes,

hicimos uso de las ventajas tecnológicas que nos brindan las TIC hoy en día, por lo

que era importante para nuestro trabajo familiarizarnos con el software Serial Cloner,

así como con la base de datos NCBI, que fueron fundamentales para la siguiente

etapa de nuestro proyecto.

OBJETIVOS

● Realizar una investigación teórica sobre la insulina y el proceso de ADN

recombinante para obtener la insulina en grandes cantidades.

● Buscar en el banco genómico NCBI información sobre plásmidos (para vector

de clonado) y sobre la insulina humana.

● Sintetizar insulina mediante el uso del simulador Serial Cloner, proceso “in

Silico”

DESARROLLO

Lo primero se hizo para empezar con la clonación in silico del gen de la insulina, fue

descargar el software de Serial Cloner, que sería nuestra herramienta principal a lo

largo del proceso. (http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner-Download.html)

En la interfaz se encuentra un menú con herramientas para buscar secuencias de

nucleótidos y sus posibles enzimas de restricción; para construir, escanear,

recombinar, alinear, hacer el PCR, entre otros. Además, permite al usuario visualizar

gráficos, simulaciones y mapas de los “features” o características del material

genético con la herramienta que esté utilizando.

Después de descargado el Serial Cloner, se buscó la secuencia genética de la

preinsulina en un artículo científico de la revista Nature (Bell, 1979), la cual tuvimos

que reescribirla en un documento de notas para poder ingresarlo al software e iniciar

con su clonación. Este texto científico fue de suma utilidad, pues al principio

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buscábamos en NCBI un gen de la insulina humana, pero después de leer el artículo

comprendimos más acerca del gen de la insulina humana, y cómo se manipula.

Después de obtenido el gen, procederíamos a buscar el vector de clonado, en nuestro

caso el plásmido pUC18 en NCBI. Una vez descargado éste, con la opción FIND se

buscaron los sitios de restricción que usaríamos para cortarlo. No obstante, estos

sitios de restricción no deben estar en el gen de la preinsulina, pues de ser así las

enzimas que actúen en estos sitios cortaran el gen en lugares indeseados. De modo

que al elegir las enzimas de restricción en el plásmido, se debe cerciorar que no estén

en el gen. Nosotros elejimos las enzimas Ndel y HindIII.

Una vez seleccionadas las dos enzimas de restricción, una irá al 5’ “forward” (Ndel) y

la otra irá al 5’ “reverse” (HindIII). Para que estas enzimas puedan actuar en base a

un fragmento complementario del ADN de nuestro gen, se adicionan los cebadores o

“primers”, que son secuencias cortas de nucleótidos. En nuestro caso, con la enzima

Ndel se usó un primer de 20 nucleótidos, iniciando con “cat” (parte no idéntica a

nuestro gen) y luego 17 nucleótidos idénticos a nuestro gen. Luego para la enzima

HindIII fue “aagctt” (no idéntica) y los siguientes 16 nucleótidos idénticos a la parte

complementaria de nuestro gen. Todo ello se realizó con un PCR en el Serial Cloner.

Y una vez que se hizo el PCR, y se obtuvo el gen deseado, se procede a insertar éste

al vector de clonado, que es el plásmido pUC18, con la opción CONSTRUCT del

Serial Cloner. Para ello se seleccionan las enzimas de restricción del gen de la

insulina y el plásmido, dándole siempre la orientación correcta, es decir, de Ndel a

HindIII y no al revés. Al hacer esto, obtenemos el plásmido con el gen de la insulina

virtualmente, pero en el laboratorio, ya se podría meter en una bacteria para su

clonación, con las técnicas de electroporación o choque térmico.

RESULTADOS

Se obtuvo el gen de la preinsulina (Figura 1), así como la secuencia del vector de

clonado, pUC18 (Figura 2). Una vez teniendo ambos, se determinaron las enzimas y

sitios de restricción que unirían ambas secuencias posteriormente.

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Figura 1. Secuencia del gen de la preinsulina

Figura 2. Plásmido pUC18, secuencia

y Graphic Map

Las enzimas de restricción empleadas fueron Ndel y HindIII; al gen de preinsulina se

le añadió el sitio de resticción (secuencia) “cat” para la enzima Ndel, y luego a su

reverso complementario, el sitio “aagctt” para HindIII. Estas secuencias de sitios de

restricción ya están presentes en el plásmido pUC18, cabe añadir. Así con esta

información, e ingresando los nucleótidos de la secuencia de la preinsulina a los

cuales se querían añadir los sitios de restricción (primers), se realizó el PCR de ésta

en el Serial Cloner (Figura 3).

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Figura 3. PCR de la preinsulina. A la izquierda se puede ver “cat” y los demás

nucleótidos, que forman el Primer Forward; y “aagctt” con el otro segmento que son

el Primer Reverse. A la derecha se ve como queda la secuencia.

Luego de tener nuestro gen de la preinsulina con los sitios de restricción “cat” y

“aagctt”, se procedió a insertarla en el vector de clonado con la opción en el Serial

Cloner de CONSTRUCT (Figura 4). Para esto se seleccionan ambas secuencias, se

establecen las enzimas de restricción que cortan los genes, y la correcta dirección

(sentido) en el que se acoplan, que es muy importante.

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Figura 4. CONSTRUCT de la preinsulina y el pUC18. El Graphic Map de la derecha

muestra de manera gráfica el gen (gris) inserto en el plásmido (azul). La orientación

se puede ver en la flecha circular que va de derecha a izquierda.

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Como se puede apreciar en la Figura 4, que es el CONSTRUCT de ambas

secuencias, el vector de clonado aparece en color azul, y el gen de la insulina en color

gris (ello en la derecha de la imagen), lo que nos indica que se ha realizado con éxito

la inserción de nuestro gen deseado en el plásmido.

La dirección que se le dio al vector de clonado fue igualmente la correcta, pues si se

hubiera tratado de hacer en la dirección contraria, sólo se obtendría un muy pequeño

fragmento del plásmido, que no serviría para ejecutar la clonación del gen.

Además, el PCR que se hizo antes del CONSTRUCT también fue efectivo, pues a

pesar de que no se indica explícitamente en el programa como con el CONSTRUCT,

si hubiésemos añadido sitios de restricción incorrectos, el insertar el gen en el vector

hubiera sido imposible; o si no se hubiera puesto el reverso del gen de la preinsulina

por ejemplo, donde corresponde, el PCR tampoco se hubiera logrado.

CONCLUSIONES

Todo el proceso de clonar con el Serial Cloner puede resultar complicado, e incluso

difícil de entender, pues se necesita saber qué enzimas de restricción son adecuadas,

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cuáles sitios de restricción vamos a usar, cuál es el reverso de la secuencia (Reverse),

y seleccionar las enzimas del gen y el plásmido para dar bien la orientación, entre

otros.

No obstante, nos queda claro que la clonación in silico de un gen, y todas las

herramientas computacionales que conlleva, son fundamentales para comprender,

estudiar y mejorar este proceso, y permite a los investigadores visualizar eventos que

antes sólo podían con los experimentos mismos, y no con un paso intermedio, como

es el Serial Cloner.

Además, nuestra investigación empleamos herramientas que hemos aprendido de las

asignaturas académicas, como bien lo fueron el idioma inglés y conocimientos de

biología para poder encontrar y utilizar el gen de la preinsulina del artículo (“Nucleotide

sequence of a cDNA clone encoding human preproinsulin”) en inglés; también usamos

la química, las matemáticas, y sobre todo la computación para adentrarnos en el

Serial Cloner e intentar hacer una clonación un tanto compleja, como lo puede ser el

de la insulina.

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DNrecombinante