RESUME BIOTEKNOLOGI

KLONING DNA DAN TRANSFORMASI PLASMID

REKOMBINAN PADA SEL KOMPETEN

ANGGOTA KELOMPOK:

HADAINA ZULFAH K4311031

SIN SYIN LU’LU’ HANDAYANI K4311067

SOLIKHAH K4311071

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2013

A. KLONING DNA

Kloning adalah suatu upaya untuk memproduksi sejumlah individu yang

secara genetic sama persis (identik) (Alberts et al., 1994). Sedangkan istilah klon adalah

sekelompok organisme hewan maupun tumbuh-tumbuhan yang dihasilkan melalui

reproduksi aseksual dan berasal dari satu induk yang sama. Setiap anggota dari klon

tersebut mempunyai susunan dan jumlah gen yang sama dan kemungkinan besar

fenotipnya juga sama. Cloning didasarkan pada prinsip bahwa setiap makhluk hidup

mempunyai kemampuan totipotensi yang artinya setiap sel mempunyai kemampuan

untuk menjadi individu.

Kloning adalah tindakan menggandakan atau mendapatkan keturunan tanpa

fertilisasi, berasal dari induk yang sama, mempunyai susunan (jumlah dan gen) yang

sama dan kemungkinan besar mempunyai fenotip yang sama.

1. Kloning DNA Rekombinan

Kloning DNA adalah memasukkan DNA asing ke dalam plasmid suatu

sel bakteri. DNA yang dimasukkan ini akan bereplikasi (memperbanyak diri) dan

diturunkan pada sel anak pada waktu sel tersebut membelah. Gen asing ini tetap

melakukan fungsi seperti sel asalnya, walaupun berada dalam sel bakteri.

Pembentukan DNA rekombinan ini disebut juga rekayasa genetika. Perekayasaan

genetika terhadap satu sel dapat dilakukan dengan hanya menghilangkan,

menyisipkan atau menularkan satu atau beberapa pasang basa nukleotida penyusun

molekul DNA tersebut. Untuk kloning ini diperlukan plasmid dan enzim untuk

memotong DNA, serta enzim untuk menyambungkan gen yang disisipkan itu ke

plasmid.

Dalam melakukan pengklonan suatu DNA asing atau DNA yang

diinginkan atau DNA sasaran harus memenuhi hal-hal sebagai berikut. DNA plasmid

vektor harus dimurnikan dan dipotong dengan enzim yang sesuai sehingga terbuka.

DNA yang akan disisipkan ke molekul vektor untuk membentuk rekombinan buatan

harus dipotong dengan enzim yang sama. Reaksi pemotongan dan penggabungan

harus dipantau dengan menggunakan elektroforesis gel. Rekombinan buatan harus

ditransformasikan ke E. coli atau ke vektor lainnya.

Rekayasa genetik dengan menggunakan plasmid bakteri E. coli dapat

dilakukan sebagai berikut.

Menentukan gen yang diinginkan untuk disisipkan, misalnya gen pengkode

hormone insulin dari sel-sel pankreas manusia atau gen pengkode hormone

pertumbuhan dari kelenjar pituitari. Kromosom sel-sel pankreas dikeluarkan

dengan memecah membran plasma. Membran plasma ini dipecah dengan diberi

kejutan listrik atau dengan pemberian zat kimia yaitu polietilen glikol atau

kalsium klorida (CaCl2), sehingga kromosom dapat keluar dari sel pankreas.

Kromosom yang diinginkan tadi dipotong dengan menggunakan enzim restriksi

endonuklease untuk melepaskan bagian DNA yang diinginkan, kemudian

memurnikan DNA tersebut. Elektroforesis dapat juga digunakan untuk persiapan

memurnikan fragmen DNA tertentu, selain digunakan untuk menganalisis.

Mengektraksi plasmid dari sel bakteri. Plasmid dipisahkan dari sel dengan cara

memecah dinding sel bakteri. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan

deterjen atau dengan enzim lisozim, kemudian dilisis dengan natrium hidroksida

(NaOH) dan larutan dedosil sulfat. DNA kromosom akan menggumpal dan

dinetralisir dengan natrium asetat. DNA plasmid ini akan menggumpal

membentuk jaring-jaring dan dengan mudah mengendap. Untuk memisahkan

DNA ini dilakukan sentrifugasi.

Cairan yang mengandung plasmid ini dijenuhkan dengan pengendapan etanol.

DNA plasmid yang dimurnikan dengan filtrasi gel. Plasmid yang berbentuk

lingkaran itu dipotong dengan enzim restriksi endonuklease yaitu enzim yang

sama digunakan untuk memotong DNA pankreas. Enzim ini memecah ikatan

fosfodiester pada molekul DNA. Endonuklease memecah asam nukleat pada

posisi internal, sedangkan enzim eksonuklase memecah molekul DNA dari ujung

molekulnya.

Kemudian pemasangan gen pengkode yang diinginkan tadi ke dalam plasmid

dengan menggunakan enzim ligase yang fungsinya menggabungkan ikatan

fosfodiester antara fragmen ujung-ujung yang terpotong tadi. Proses

penyambungan tersebut disebut ligasi. Karena enzim yang digunakan untuk

memotong DNA sel pankreas dan plasmid sama jenisnya, akan menghasilkan

ujung-ujung yang lengket yang sama strukturnya, sehingga penyambungannya

akan menyatu sempurna. Suhu optimum untuk ligasi adalah 37oC, tetapi

ikatannya tidak stabil. Ligasi akan berhasil jika dilakukan pada suhu 4o-150oC.

Plasmid yang telah disisipi gen pengkode yang diinginkan itu dimasukkan ke

dalam sel bakteri coli dengan cara tranformasi. Transformasi dilakukan dengan

memasukkan bakteri E. coli ke dalam larutan CaCl2 sehingga terbentuk lubang-

lubang sementara, sehingga plasmid dapat masuk ke dalam sel bakteri.

Diharapkan bakteri yang telah disisipi gen tersebut mewarisi sifat gen baru,

sehingga bakteri yang telah disisipi dengan gen pengkode insulin dapatm

memproduksi insulin.

Langkah selanjutnya adalah mengembangbiakkan bakteri hasil rekayasa dalam

tabung fermentasi yang berisi medium untuk pertumbuhan dan

perkembangbiakan bakteri E. coli untuk memproduksi insulin dalam jumlah yang

banyak. Insulin yang terbentuk kemudian dipisahkan dari senyawa yang lain.

(http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-

metode-cacl2/)

2. Manfaat Kloning

Secara garis besar kloning bermanfaat:

Untuk pengembangan ilmu pengetahuan

Manfaat kloning terutama dalam rangka pengembangan biologi,

khususnya reproduksi-embriologi dan diferensiasi. Dengan pengembangan ilmu

pengetahuan baru di bidang bioteknologi akan membuka peluang lebar bagi

peneliti untuk menemukan cara baru lagi untuk memecahkan masalah-masalah

yangberujung pada peningkatan kesejahteraan masyarakat.

Untuk mengembangkan dan memperbanyak bibit unggul

Seperti telah kita ketahui, pada sapi telah dilakukan embrio transfer.

Hal yang serupa tentu saja dapat juga dilakukan pada hewan ternak lain, seperti

pada domba, kambing dan lain-lain. Dalam hal ini jika nukleus sel donornya

diambil dari bibit unggul, maka anggota klonnya pun akan mempunyai sifat-sifat

unggul tersebut. Sifat unggul tersebut dapat lebih meningkat lagi, jika

dikombinasikan dengan teknik transgenik. Dalam hal ini ke dalam nukleus zigot

dimasukkan gen yang dikehendaki, sehingga anggota klonnya akan mempunyai

gen tambahan yang lebih unggul.

Untuk tujuan diagnostik dan terapi

Sebagai contoh jika sepasang suami isteri diduga akan menurunkan

penyakit genetika thalasemia mayor. Dahulu pasangan tersebut dianjurkan untuk

tidak mempunyai anak. Sekarang mereka dapat dianjurkan menjalani terapi gen

dengan terlebih dahulu dibuat klon pada tingkat blastomer. Jika ternyata salah

satu klon blastomer tersebut mengandung kelainan gen yang menjurus ke

thalasemia mayor, maka dianjurkan untuk melakukan terapi gen pada blastomer

yang lain, sebelum dikembangkan menjadi blastosit.

Menolong atau menyembuhkan pasangan infertil mempunyai turunan

Manfaat yang tidak kalah penting adalah bahwa kloning manusia dapat

membantu/menyembuhkan pasangan infertil mempunyai turunan. Secara medis

infertilitas dapat digolongkan sebagai penyakit, sedangkan secara psikologis ia

merupakan kondisis yang menghancurkan, atau membuat frustasi. Salah satu

bantuan ialah menggunakan teknik fertilisasi in vitro. (in vitro fertilization =

IVF). Namun IVF tidak dapat menolong semua pasangan infertil. Misalnya bagi

seorang ibu yang tidak dapat memproduksi sel telur atau seorang pria yang tidak

dapat menghasilkan sperma, IVF tidak akan membantu.

Dalam hubungan ini, maka teknik kloning merupakan hal yang

revolusioner sebagai pengobatan infertilitas, karena penderita tidak perlu

menghasilkan sperma atau telur. Mereka hanya memerlukan sejumlah sel

somatik dari manapun diambil, sudah memungkinkan mereka punya turunan

yang mengandung gen dari suami atau istrinya.

Melestarikan Spesies Langka

Meskipun upaya terbaik dari konservasionis di seluruh dunia, beberapa

spesies yang hampir punah. Kloning Dolly sukses merupakan langkah pertama

dalam melindungi satwa langka. Contoh lainnya adalah hasil cloning yang

melahirkan Noah, hewan gaur (spesies dari Asia Tenggara yang mirip bison),

yang merepresentasikan percobaan pertama yang dilakukan oleh para ilmuwan

untuk mengkloning hewan yang terancam punah. Para ilmuwan di Amerika

berharap bisa mengambil langkah besar dalam upaya melindungi spesies yang

terancam punah dengan melahirkan kloningan gaur di sebuah peternakan di

Iowa.

Meningkatkan pasokan makanan

Kloning dapat menyediakan sarana budidaya tanaman yang lebih kuat

dan lebih tahan terhadap penyakit, sambil menghasilkan produk lebih. Hal yang

sama bisa terjadi pada ternak serta di mana penyakit seperti penyakit kaki dan

ulut bisa menjadi eradicated. Kloning karena itu bisa secara efektif memecahkan

masalah pangan dunia dan meminimalkan atau mungkin kelaparan (Brookes,

2005)

3. Efek Negatif Kloning

Jika kloning pada tanaman bertujuan menghasilkan tanaman baru yang

memiliki sifat-sifat identik dengan induknya maka kloning pada tanaman akan

menghasilkan individu baru yang sama dengan sifat induknya. Hal ini hal ini akan

menurunkan keanekaragaman tanaman baru yang dihasilkan. Akibatnya,

keanekaragaman tumbuhan yang merupakan sumber daya alam hayati pun akan

semakin menurun. Demikian juga kloning pada hewan, akan menurunkan

keanekaragaman hewan. Keanekaragaman genetik memainkan peran yang sangat

penting dalam sintasan dan adaptabilitas suatu spesies, karena ketika lingkungan suatu

spesies berubah, variasi gen yang kecil diperlukan agar spesies dapat bertahan hidup

dan beradaptasi. Spesies yang memiliki derajat keanekaragaman genetik yang tinggi

pada populasinya akan memiliki lebih banyak variasi alel yang dapat diseleksi.

Seleksi yang memiliki sangat sedikit variasi cendering memiliki risiko lebih besar.

Dengan sedikitnya variasi gen dalam spesies, reproduksi yang sehat akan semakin

sulit, dan keturunannya akan menghadapi permasalahan yang ditemui

Kloning pada hewan dan manusia masih dipertentangkan karena akibat

yang ditimbulkan seperti contohnya: resiko kesehatan terhadap individu hasil kloning.

Terjadi kekecauan kekerabatan dan identitas diri dari klon maupun

induknya. Klon atau individu hasil cloning akan diangggap sebagai kopian dari

individu lain yang dianggap sebagai induknya karena memiliki sifat yang sama

dengan induknya. Sehinggga terjadi kekacauan apakah status klon tersebut adalah

anak atau merupakan kembaran dari individu aslinya.Transformasi adalah proses

pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang dengan vektor yang

digunakan berupa plasmid. Plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan

plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi

gen marka yang dibawa oleh plasmid tersebut. Ekspresi materi genetik asing masuk

melalui dinding sel. Pada dasarnya dinding sel berfungsi melindungi sel dari

masuknya benda-benda asing termasuk DNA, tapi dalam kondisi tertentu, dinding sel

ini bisa memiliki semacam celah atau lubang yang bisa dimasuki DNA. Ada lebih dari

1% spesies bakteri mampu melakukan transformasi secara alami. Dimana mereka

memproduksi protein-protein tertentu yang dapat membawa DNA menyeberangi

dinding sel.

B. TRANSFORMASI PLASMID REKOMBINAN PADA SEL KOMPETEN

Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten (istilah untuk

bakteri yang siap bertransformasi).  Sel kompeten  merupakan sel yang memiliki

kemampuan untuk disisipi DNA dari luar karena telah mendapat perlakuan fisik maupun

kimia. Kita dapat membuat suatu bakteri menjadi kompeten, misalnya dengan

mendinginkannya pada larutan yang mengandung kation divalen seperti Ca2+ untuk

membuat dinding sel menjadi permeable dan dapat dilalui oleh DNA plasmid. Sel juga

dapat dibuat kompeten melalui perlakuan dengan garam kalsium klorida (CaCl2) atau

rubidium klorida (RbCl). Fungsi penambahan CaCl2 pada pembuatan sel kompeten belum

diketahui secara jelas. Penambahan etanol pada pembuatan sel kompeten menurunkan

efisiensi transformasi. Hal ini dikarenakan adanya leaching terhadap lipopolisakarida dari

dinding sel. Hasil ini menguatkan dugaan bahwa adsorpsi DNA didukung oleh LPS

dinding sel bakteri. Mekanisme yang diajukan adalah pengikatan DNA pada molekul LPS

sel kompeten dilanjutkan dengan pemasukan DNA ke sitosol karena adanya disintegrasi

membran sel akibat CaCl2 (Sarkar et al. 2002).

Menurut Primrose & Twyman (2006), CaCl2 mempengaruhi dinding sel dan

mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama

menyebutkan bahwa penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh

perlakuan kejut panas.Selain itu, perlakuan untuk memasukkan sel kompeten dapat

dilakukan dengan menggunakan metode kejutan panas (heat shock) atau kejutan pulsa

listrik (metode electroporation).

Chemical Transformation (image from biochem.arizona.edu)

Selain teknik ‘heat-shock’, sejak tahun 1980 telah digunakan teknik

‘elektroforasi’ yaitu dengan mengejutkan sel bakteri dengan medan listrik berkekuatan

tinggi (10-20 kV/cm). Saking terkejutnya, akan terbentuk lubang-lubang pada dinding sel

yang bisa diterobos DNA plasmid berukuran besar dan kemudian lubang tersebut akan

tertutup dengan sendirinya.

Electrophoretic Transformation (image from biochem.arizona.edu)

Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah

dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah,

sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel

nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid,

sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi

transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang disisipkan pada plasmid.

Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada sel transforman yang

tidak dimiliki oleh sel bukan transforman.

Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium

padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel

yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media

seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja.

1. Cara Gen Ditransformasi

Umumnya transformasi bertujuan mengekspresikan suatu gen tertentu di

dalam sel inang. Agar gen yang berupa fragmen DNA (biasa disebut insert) ini dapat

masuk, ia harus dibuat menjadi DNA plasmid dulu dengan menyisipkannya pada

suatu DNA vektor. Berikut ini tahapan-tahapan insersi gen ke plasmid/vektor.

Insert Digestion (image from biochem.arizona.edu)

Plasmid (Vector) Digestion (image from biochem.arizona.edu)

Insert-Plasmid Ligation (image from biochem.arizona.edu)

2. Cara memastikan transformasi berhasil

Kita tahu bahwa setiap sel termasuk bakteri memiliki sistem pertahanan

diri terhadap benda asing termasuk DNA. Jika sel bakteri menemukan adanya DNA

asing, maka enzim restriksi sebagai penjaga benteng akan memotong-motong DNA

tersebut hingga menjadi pendek dan tak berfungsi lagi. Agar DNA plasmid yang

ditransformasi tidak dicincang oleh enzim restriksi, maka ia harus memiliki bagian

yang dinamakan ori atau origin of replication yang dikenali oleh bakteri yang

bersangkutan. Ori ini berfungsi ‘mengelabui’ bakteri agar tidak menganggapnya

sebagai DNA asing. Ori juga merupakan signal agar bakteri tersebut melakukan

replikasi alias penggandaan DNA plasmid secara independen seiring dengan replikasi

DNA genomnya.

Untuk membedakan antara bakteri yang sudah dimasuki DNA plasmid

dengan tidak,cara yang paling umum adalah dengan seleksi antibiotik. Kita tahu

umumnya bakteri tidak dapat hidup pada media yang mengandung antibiotik. Untuk

itu pada DNA plasmid yang kita transformasikan harus ada gen penyandi antibiotik

resisten agar bakteri hostnya menjadi tahan hidup di media yang mengandung

antibiotik. Jadi bakteri yang tidak berhasil disusupi oleh plasmid akan mati dengan

sendirinya.

Reaksi Ligasi tidak akan 100% berhasil menyambungkan vektor dan

insert. Bisa saja terjadi vektor berligasi sendiri (vector self-ligation), atau justru insert

yang berligasi sendiri (insert self-ligation). Insert biasanya disisipkan di pertengahan

gen lacZ yang merupakan penyandi lacZ-å subunit dari enzim ß-galactosidase,

subunit lainnya, yaitu lacZ-w subunit dihasilkan oleh gen yang terdapat pada

kromosom bakteri host-nya. Enzim ini dapat memecah substrat seperti X-gal (suatu

galaktosa yang dimodifikasi) menjadi galaktosa dan pre-chromophore 5-bromo-4-

chloro-3-hydroxyindole, yang selanjutnya dioksidasi menjadi 5,5′-dibromo-4,4′-

dichloro-indigo yang berwarna biru.

Mechanism of X-gal degradation by ß-galactosidase (image from

biochem.arizona.edu)

Jika gen LacZ ini masih utuh, maka koloni bakteri akan berwarna biru

akibat pengaruh zat warna indigo yang dihasilkan. Tetapi jika insert berhasil

disisipkan (diligasikan) dengan vektor, otomatis gen lacZ-nya akan terdisrupsi alias

rusak dan ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan indigo yang berwarna biru,

sehingga koloni bakteri akan berwarna putih. Jadi hanya koloni putih yang tumbuh

pada media yang mengandung antibiotik dan X-Gal sajalah yang kemungkinan

mengandung gen yang kita transformasikan. Inilah yang dinamakan seleksi biru-

putih.

Insert-Plasmid Ligation (image from biochem.arizona.edu)

DAFTAR PUSTAKA

http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-metode-cacl2/ diakses pada tanggal 1 Oktober 2013

Akberts, B., et al. (1994). Molecular Biology of The Cel. Ed. Ke-3. Garland Publishing, New York

Brookes, Martin. (2005). Genetika. Jakarta : Erlangga

Lodish. Berk. Matsudaira. Kaiser. Krieger. Scott. Zipursky. Darnell. 2000. Molecular CellBiology fifth Edition. Freeman and Company. New York.

Primrose SB, Twyman RM. 2006. Principles of Gene Manipulation and Genomics. Ed. Ke-7. Oxford: Blackwell Publishing.

Sarkar S, Chaudhuri S, Basu T. 2002. Mechanism of arttificial transformation of E.coli with plasmid DNA-clues from the influence of ethanol. Current Science 83:1376-1380.

Tsen et al. 2002. Natural plasmid transformation in Escherichia coli. Journal of Biomedical Science 9:246-252.

Tu et al. 2005. An improved system for competent cell preparation and high efficency plasmid transformation using different Escherichia coli strains. Electronic Journal of Biotechnology 8.

Williams HG, Day MJ, Fry JC. 1996. Use of EDTA to prevent spontaneous cell-to-cell transformation provides a more accurate estimation of gene transfer frequencies. Biology Techniques 10:941-946.

Zhang et al. 2007. Effects of Mg2+ on supported bilayer membrane on a glassy carbon electrode during membrane formation. International Journal of Electrochemical Science 2:788-796.