Replicarea ADN vs PCR

8/16/2019 Replicarea ADN vs PCR

1/59

REPLICAREA ADN (in

vivo ) vs. PCR (in vitro )


2/59

REPLICAREA ADN – proces prin care se asiguratransmiterea fidela a informatiei genetice la celulele fiice, in urma

diviziunii celulare.

Etape- initiere

- elongare

- terminare


3/59

ÎNTREBĂRI

Care sunt modelele propuse pentru replicareaADN?

Ce este originea replicării?

Care este direcţia replicării?

Cum se realizează sinteza catenelor fiice deADN?

Care sunt enzimele implicate în replicarea ADN?


4/59

1. Matriţa = ADN m.c.;

2. Substratul care urmează să fie încorporat înnoua catenă sintetizat ă;

3. Enzime + alte tipuri de proteine.

“Componentele” replicării (I)


5/59

Noile catene de ADN sunt sintetizate pe baza deoxiribonucleotidtrifosfaţilor (dNTP). Direcţia de sinteză 5’3’.


6/59


7/59

Aceste modele diferă prin modul de iniţiere areplicării şi progresia replicării.

Comun: replicarea semi-conservativă

Modelele replicării ADN


8/59

MODELUL THETA: E. colihttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNA

http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNAhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120073/micro03.swf::Bidirectional%20Replication%20of%20DNA


9/59

Modelul cercului rotativ:

Virusuri şi plasmide (factorul F -E. Coli )


10/59

R

E

P

L

I

C

A

R

E

A

L

I

N

I

A

R

Ă

E

U

C

A

R

I

O

TE


11/59


12/59

1. Replicarea este semi-conservativă

Meselson & Stahl au demonstrat la E. coli că fiecare

catenă a ADN d.c. joacă rolul de matriţă pentrusinteza unei noi molecul de ADN d.c.

http://highered.mcgraw-

hill.com/olc/dl/120076/bio22.swf

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swf


13/59


14/59

2. Replicarea începe la un

situs specific – origineareplicării

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swf

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swf


15/59


16/59


17/59


18/59

3. Replicarea ADN se desf ăşoară îndirecţia 5’-3’

Sinteza ADN se desf ăşoară simultan, dar îndirecţii opuse pe cele două catene.


19/59

Leading strand

lagging strand

Replication fork

Replication fork

4. Replicarea ADN este semi-discontinuă


20/59


21/59

Polaritatea

sintezeiADNdetermină

apariţia unei

asimetrii între catena“leading” şi

catena

“lagging” lanivelul furciide replicare


22/59

AD

N

Po

lime

raza


23/59

DNA Polymerase III

ADN Polimeraze la PK (E. coli )


24/59

Topoisomerase

Complexe proteice

asociate furcii de

replicare


25/59

Helicaza

despiralizează

dublul helix ADN

înaintea ADN

polimerazei

determinând

formarea de

monocatene care

servesc ca tipar.


26/59

PROTEINE ssB single strand DNA binding proteins) se leagă lascheletul pentozofosfat şi lasă bazele expuse acţiunii ADNPolimerazei. Legarea ssB previne reasocierea catenelor.


27/59

ADN Polimeraza necesit ă o catenă tipar şi o

grupare 3’ OH liberă pentru adăugarea de noinucleotideprimeri ARNpentru inţierea sinezei de

ADN.Primaza, enzim

ă

component ă aprimosomului,

sinteizează fragmentemici de ARN (primeri)

care reprezint ă un situsde pornire a sintezei ADNmediat ă de ADN

Polimerază.


28/59

ADN Polimeraza sepoate detaşa uşor de

catena ADN.“Sliding

l mp”necesară pentru menţinereaADN Polimerazei

ataşate la catena ADN

şi replicarea unorregiuni extinse din

ADN.


29/59

“Clamploader:”

aducerea“clemei” la

nivelul AND.


30/59


31/59


32/59

Înaintea furciide replicare

ADNsuperîncolăcit

(supercoiled)

Eliminareasuperîncolăcirilor pentru

a evita creştereatensiunii şi blocarea înaint ării furcii de

replicare.

Superîncolăcirile sunt eliminate sub


33/59

Superîncolăcirile sunt eliminate subacţiunea topoizomerazelor.

Topoisomeraze de tip I


34/59

Topoizomeraze de tip II


35/59

A

DN

LIGAZA


36/59


37/59


38/59


39/59

1. Helicaza desface helixul ADN. Reacţia catalizat ă de aceast ă enzimă necesit ă ATP. La nivelul furcii de replicare, monocateneleADN sunt protejate de legarea ssB (single-strand bindingproteins).

2. Primaza sintetizează primerii ARN. La nivelul grupării 3' OHlibere a primerului se vor ataşa noi dNtP.

3. ADN Polimeraza III ataşează noi dNTP la capătul 3' OH al catenei în extensie (leading strand) care va fi sintetizat ă continuu în

direcţia furcii de replicare 5’ – 3’. După încorporarea unui noudNTP este eliberat ă a grupare PPi care funcţionează ca donor deenergie.

4. Pe catena lagging sunt sintetizaţi mai mulţi primeri. ADNPolimeraza III sinetizează fragmente de ADN în direcţia 5' - 3‘.

5. ADN Polimeraza I (Pol I) îndepărtează primerii ARN şi îi înlocuieşte cu secvenţe ADN.6. Ligaza uneşte fragmentele ADN de pe catena lagging.


40/59

-în faza S a ciclului celular (6-8 ore la mamifere).

Comparativ cu PK, FR se deplasează doar o zecime, în timp ce materialul genetic de replicat este de 108

bp mai numeros.FR multiple = repliconi.

Complexul ORC Origin Recognition Complex )conţine 6 proteine cu funcţie ATP-azică şi reprezint ă echivalentul funcţional al proteinei DnaA de la PK.

REPLICAREA ADN LA EUCARIOTE


41/59

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf


42/59

ADN POLIMERAZE LA EK


43/59

Polymerase chain reaction(PCR)


44/59

T ehnică de biologie moleculară prin care se realizează amplificarea (obţinerea a milioane de copii) unei regiunispecifice din ADN genomic.

Pusă la punct de către K. Mullis şi colab. care şi-auimaginat un proces prin care ADN sa poată fi multiplicat

artificial prin cicluri repetate de replicare direcţionate de ADN Polimerză. Iniţial – nu se foloseau ADNpolimeraze termostabile şi nici aparate automate pentrureproducerea ciclurilor de temperatură.

În 1993, Mullis primeşte Premiul Nobel pentru Chimie.

Principiu


45/59

Practic se realizează amplificarea unui fragmentdintr-o matriţă ADN utilizând oligonucleotide sintetice

(primeri ADN) complementare la matriţa ADN. Numărul de copii ale secvenţei alese pentruamplificare este dublat la fiecare replicare.

Principiu

REPLICAREA ADN


46/59

46

In vivo In vitro (PCR)

REPLICAREA ADN


47/59

47


48/59

Componentele reacţiei PCR

Matriţa ADN (10 -100 ng) - poate proveni dintr-omare varietate de probe biologice.

Primerii = secvente oligonucleotidicecomplementare la secventa ADN tinta;

ADN polimeraza;

Mg Cl2;

dNTP (dATP; dTTP; dCTP; dGTP).


49/59

ADN polimeraza ADN Polimeraze termostabile (Taq/ Amplitaq) izolate

din Thermus.Dezavantaj comite erori în copierea catenei de ADN,conducând la erori în secvenţa ADN, din moment ce îilipseşte activitatea de proofreading 3'->5'exonucleazică.Pwo (Pyrococcus woesei ), Pfu (Pyrococcus furiosus) posedă mecanisme de proofreading prin care suntcorectate erorile apărute în cursul ciclurilor dereplicare şi pot reduce semnificativ numărul erorilor

care apar în copierea catenei de ADN.La ora actuală sunt disponibile combinaţii de Taq şi Pfu , fapt ce conferă atât o fidelitate înaltă, cât şi oamplificare corespunzătoare a ADN.


50/59

Amestec de nucleotide

Soluţie amestec a celor patru nucleotide (dATP, dCTP, dGTP şi dTTP).

Concentraţiile optime depind de lungimea fragmentului cetrebuie amplificat şi de numărul de cicluri de amplificare.

Soluţia tampon a polimerazei

Conţine TRIS, HCl, KCl şi are pH 8,3.

Există şi variante de tampon care includ clorura de magneziu.

MgCl2Ionii de magneziu sunt cofactori ai ADN Polimerazelor.

Apă ultrapură – Nuclease Free


51/59

Reactiv Concentratie Volum(µL)

Tampon PCR 10 X 2.5

Mg Cl2 25 mM 1.5

Amestec denucleotide

10 mM 2

Primer sens(F)

80 pmoli/ µL 0.25

Primerantisens (R)

80 pmoli/ µL 0.25

PolimerazaAmpliTaq

5 U/ µL 0.2

Apa ultrapura 13.3

Amestec PCR

Proba

50-60 ng ADN

51

PCR î di t d t t ă


52/59

PCR în gradient de temperatură

60 - 51º C

Selectarea

temperaturii optimede hibridizare a

primerilor

APARAT

PCR

Timpii şi temperaturile de incubare

Etapa

iniţială

35 de cicluri Extensie

finală Denaturare Anelare Extindere

iCycler

BioRad

3 min.

95oC

1 ciclu

30 sec.

95oC

30 sec.

51-60 oC

1 min.

72oC

10 min.

72oC

1 ciclu

∞

4oC

52

Vizaualizarea produsilor rezultati in urma PCR in


53/59

• Electroforeza in gel de agaroza (2%)

Principiul: ADN (-) se deplaseaza spre (+) atunci cand este plasat intr-un

camp electric; un gel de agaraoza este utilizat pentru a incetini deplasareamoleculelor de ADN si separarea acestora in functie de marime.

V zaua zar a pr us r r zu tat n urma ngradient de temperatura

micmare

+-

SursaAgaroza polimerizata este poroasa sipermite deplasarea ADN.

53


54/59

Echipament pentru electroforeza

SURSA TANC DE

ELECTROFOREZA

TAVITAPENTRU GEL

PIEPTEN

54


55/59

Tavita pentru gel & piepteni

Izolarea tavitei

55


56/59

(1)Agaroza

(2)Tampon demigrare TAE 1X

(3) Agaroza estesolubila la temperatura

camerei

(4) Solutia de

agaroza esteincalzita

PREPARAREAGELULUI DEAGAROZA

Et Br

56


57/59

Turnarea gelului de

agaroza

Polimerizare la

temperatura camerei/ 30

minute57


58/59

ADN

ANOD

(+)CATOD(-)

godeuri

58


59/59

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/micro04.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf

http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Fork

http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replication
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/bio23.swf::How%20Nucleotides%20are%20Added%20in%20DNA%20Replicationhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro04.swf::DNA%20Replication%20Forkhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swfhttp://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio23.swf

Documents

Replicarea ADN vs PCR