REPARACIÓN DEL DNA

(continuación, parte 2)

Sumario

Daño en el DNA Reparación directa Mecanismos de escisión Reparación de desapareamiento de bases Reparación inducida

Mecanismos de escisión (acción o efecto de escindir, romper, separar) puede hacer referencia:

Son aquellos mecanismos de reparación en los que se elimina la zona en la que se encuentra la lesión. Hay dos tipos de mecanismos de reparación por escisión:

1) BER: Reparación por escisión de bases: la base que se encuentra modificada se escinde. Ejemplo: oxidación de citosinas que se convierten en deoxiuracilos. La N-uracil glicosidasa rompe el enlace glicosídico que une la base con el azúcar, originádose así un hueco en el DNA: sitio apirimidínico si le falta una pirimidina o apurínico si la base que faltara fuera una purina. Existen AP endonucleasas que reconocen el DNA al que le falta una base y producen un corte; una exonucleasa degrada el DNA a partir de este corte y deja una zona que es reparada por la DNA polimerasa y sellada por la ligasa. A veces, la AP endonucleasa corta la cadena con la base modificada. En cada célula humana se generan diariamente unos 10000 sitios AP que son reparados por una máquina proteica, el reparosoma, formado por cuatro proteínas que actúan concertadamente: la UDG (Uracil-DNA glicosilasa, que elimina el uracilo), HAP1 (AP endonucleasa humana, que corta la cadena azúcar-fosfato), la polimerasa β (que introduce el nucletido que faltaba) y la ligasa (que sella el corte).

2) NER: Reparación por escisión de nucleótidos, se corta la cadena de azúcar - fosfato. Los genes implicados, en el caso de E. coli, son Uvr (A, B, C, D). Los mutantes en genes Uvr son muy sensibles a la luz ultravioleta, por tanto, los genes Uvr confieren resistencia a UV. Las figuras siguientes muestran el mecanismo:

2 UvrA rastrean el DNA hasta encontrar una distorsión estructural (por ejemplo un dímero de timina). UvrB queda unido en la zona lesionada, UvrA es eliminado y se recluta UvrC, que produce dos cortes endonucleotídicos a ambos lados de la lesión, unos 5 nts en dirección 3' y unos 8 nt 5'. UvrD que es una helicasa (también llamada helicasa II) desplaza el oligo que incluye la distorsión (aproximadamente 14 nucletidos). La DNA polimerasa I rellena el hueco a partir del extremo 3' OH libre y la ligasa lo sella. (Ver también la figura 14.28 Genes VII y otra representación alternativa del mecanismo).

En organismos eucarióticos también se da este mecanismo. Los pacientes de xeroderma pigmentosa son extremadamente sensibles a la luz solar (sufren quemaduras abundantes en su piel, desarrollan melanomas, etc., por esto suelen vivir muy poco). Tienen mutaciones en genes implicados en vías de reparacin por escisión de nucleótidos. Hay 7 genes implicados: XP A, XP B, XP C, XP D, XP E, XP F y XP G. Si encontramos una lesión en el DNA, por ejemplo de dímeros de timina, la XP A reconoce dicha lesión, entonces se introduce una helicasa TFII y se va abriendo el DNA en la zona adyacente a la lesión. XP G y XP F van cortando y eliminando la zona de la lesión. Se libera el oligo (23-24 nts) y RFC coloca la pinza PCNA para que la DNA polimerasa ε rellene el hueco y la ligasa selle el nick (en esencia es lo mismo que ocurre en E. coli).

Sistemas eucarióticos responsables del mecanismo de reparación por escisión de nucleótidos (NER)

Reparacion de desapareamiento de bases (Mismatch Repair)

Los errores que comete la DNA polimerasa dan lugar a desapareamientos de bases, así si a una G por error se le enfrenta una A, aunque son bases normales, no lo es su apareamiento, (mismatch: bases desapareadas). En condiciones normales la actividad exonucleasa asociada a la polimerasa evita los desapareamientos, pero si no lo hace hay que eliminarlo antes de que la banda se replique, ya que si no, la mutación quedaría fijada. En E. coli existe un grupo de genes llamados Mut, implicados en la eliminacin de estos desapareamientos (si hay mutantes en estos genes Mut se produce una tasa de mutación más elevada de lo normal). El sistema de E. coli usa un reparisoma formado por las siguientes proteínas:

Pasos en el mecanismo de reparación del sistema de Mut:

1. Unión de Mut S al error: Mut S recluta al menos otros 2 polipéptidos Mut H y Mut L.El ensamblaje del complejo activa la endonucleasa latente de Mut H, la cual entonces inicia el proceso de escisión introduciendo una mella en la cadena nuevamente sintetizada, del lado 5' del todavía no metilado GATC. El reconocimiento se lleva a cabo por las secuencias GATC que no están metiladas en la banda de nueva síntesis, ya que la metilasa Dam aún no ha actuado

sobre ellas, recordemos que la actuación de la metilasa Dam tarda unos minutos, este es el tiempo que permite reconocer la base errónea (ver Fig. 14.29Genes VII).

2. La degradación de la cadena conteniendo el nucleótido mal incorporado comienza en esta mella y continúa hacia y después de las bases mal apareadas.Este proceso es mediado por Exo VII, si la mella se encuentra del lado 5' del error o Exo I, si la mella se encuentra del lado 3' del error.

3. La región de simple cadena expuesta es protegida del error por SSB.

4. El hueco es llenado por Pol III y sellado por DNA ligasa.

Se asume que eventos similares tienen lugar durante la corrección de errores en levaduras y humanos, excepto que la discriminación de las cadenas no es dictada por metilación, En su lugar discontinuidades en la cadena nuevamente sintetizada pueden estar implicadas en el proceso.

En organismos eucariotas se han encontrado que cánceres colorrectales (HNPCC, hereditary nonpolyposis colon cancer) están asociados (al menos un 90% de ellos) a mutaciones en genes parecidos a los Mut L y Mut S, estos últimos reconocen las mutaciones, lo que indica que es un mecanismo muy conservado. No se han encontrado homólogos a Mut H, y parece que no se necesita, ya que el mecanismo de reconocimiento se basa en la interacción del homólogo de Mut S con PCNA unido al último cebador en la horquilla de replicación.

En ocasiones el sistema reparador no tiene una forma intríseca de distinguir la base salvaje de la mutada y es esta una forma en que se fijan las mutaciones. Existen sin embargo otras formas de dirigir la restauración de la secuencia salvaje. Por ejemplo para casos tales como la desaminación de 5-metil citosina a timina, hay un sistema especial para restablecer la propia secuencia. La desaminación genera un par G-T, y el sistema que actúa sobre tal par tiene un sesgo para corregilos a G-C (más que a A-T). Se ha observado que el sistema Mut L, S traslada siempre T de los dos apareamientos incorrectos G-T y C-T.

Otra actividad reparadora identificada por mut Y, reemplaza la A en los errores C-A y G-A. Este sistema funciona por el traslado directo de la base del DNA (reparación por escisión de bases).

Es interesante el hecho de que la DNA pol tiene la tendencia a introducir equivocadamente A y la desaminación de 5-metil C es frecuente (conduce a C → U → T/G). Es decir el residuo de G codifica frecuentemente la información correcta y parece que las funciones de la glicosilasa han evolucionado de acuerdo con los errores celulares intrínsecos de la replicación y la reparación del DNA.

Ejemplos de genes mutadores, relacionados con la replicación o reparación del DNA

Reparación inducida

Ante una cantidad masiva de daños en el DNA, se disparan, como respuesta, mecanismos de emergencia que se caracterizan por tener niveles superiores de proteínas implicadas en reparación y recombinación. El ejemplo típico es larespuesta SOS, si la cantidad de lesiones que hay en E. coli es muy superior a lo normal, se induce la respuesta SOS.

En los casos de reparación vistos hasta ahora, los daños estaban en una sola de las dos bandas, con lo que bastaba replicar la complementaria, pero si tenemos mutaciones masivas, se puede replicar la zona antes de que dé tiempo a reparar la lesión. Por ejemplo cómo se reparan los dímeros de timina una vez que la horquilla ha pasado? Ahora la zona dañada está en la banda molde. Hay dos maneras de hacerlo:

1) Por recombinación, suministrando el molde correcto de un DNA homólogo:

2) Por replicación errónea (error-prone). La polimerasa copia un molde defectuoso a costa de introducir errores.

A nivel molecular la respuesta SOS consiste en la inducción de la expresión de una serie de genes. Todos estos genes (la mayor parte de ellos implicados en reparación), se encuentran reprimidos por la proteína lex A, forman lo que se llama un operón. Lex A se autorregula, es decir, reprime su propia expresión, (cuando decimos que la expresión está reprimida, no es que no haya nada, hay un estado basal, al dispararse la expresión no es de nada a todo sino de "poco" a todo). El represor lex A se proteoliza debido a la presencia de Rec A activado (se activa uniéndose a banda simple), por lo tanto con muchos daños en el DNA tenemos varias zonas de banda simple a las que se une Rec A. El represor lex A se proteoliza por lo que se induce la expresión de todos esos genes incluido el propio lex A. Una vez reparados los daños, Rec A se inactiva y lex A reprime los genes del operón. Es un sistema reversible, que puede representarse por el siguiente esquema:

En la respuesta SOS se induce la expresión de una serie de genes (ver Tabla 25.6 Lehninger):

Uvr (reparación por escisión de nucleótidos).

RecA, proteína con un papel fundamental en recombinación, puede suministrar un molde a la zona dañada para que pueda ser reparada por los mecanismos convencionales

UmuD/C, que hace que la DNA polimerasa replique moldes dañados a costa de introducir mutaciones. Rec A activa, rompe proteolíticamente, además de lex A, a Umu D generando la forma activa de la proteína. El conjunto de Umu C y Umu D hace perder fidelidad a la DNA polimerasa III (que estaba parada como consecuencia de la existencia de daños en el DNA) y que copie la cadena molde aunque está dañada, dándose una replicación errónea y en definitiva, generando mutaciones.

El gen sfi A está implicado en división celular, hace que se pare la división celular y se producen filamentos de células.

Otro efecto de la respuesta SOS es la inducción de lisógenos de λ, en donde el DNA de λ está integrado en el DNA bacteriano; para el mantenimiento de la lisogenia se requiere el represor del fago λ. En la respuesta SOS, Rec A activado degrada (además de lexA y Umu D) el represor del fago λ y como consecuencia se induce el estado lítico, la célula lisa y se liberan los fagos. ¿Qué significado fisiológico tiene esto? Cuando el genoma bacteriano está dañado y la supervivencia de la bacteria está en peligro, se induce el ciclo lítico y el fago "busca otra bacteria".

En células eucariotas, cuando hay un gran número de lesiones en el DNA, aumentan los niveles y se activa la proteínap53, factor de transcripción que activa la expresión de p21. p21 bloquea la ciclina G1 / cdk y por lo tanto se para el ciclo celular en G1, de esta manera se impide la replicación del DNA, dando tiempo para que se reparen los errores (p21 además interacciona con PCNA y frena la replicación en fase S). p53 activa mecanismos de reparación y también induce apoptosis. La apoptosis, muerte celular programada o suicidio celular, es un proceso controlado genéticamente y es fisiológicamente distinto al proceso necrótico. En la apoptosis la célula se deshidrata, se redondea, el núcleo se condensa, se parten los cromosomas, y se degrada en vesículas que son engullidas por los macrófagos (ocurre sin inflamación, no como en necrosis).

La apoptosis es un proceso totalmente normal que se da en:

» Células con gran cantidad de lesiones en el DNA; antes de seguir dividiéndose y acumulando mutaciones que podrían llevar a procesos tumorales, la célula se suicida.

» El desarrollo (por ejemplo: las células que forman la cola de los renacuajos, células nerviosas sobrantes, etc.)

» En el proceso de selección de repertorio de los linfocitos.

p53, por tanto, actúa por diversos mecanismos protegiendo el DNA de daños e impidiendo la proliferación de células defectuosas, se le ha llamado por eso "el ángel guardián del genoma". Es un gen supresor de tumores (el 50% de los tumores tienen p53 mutado). Ratones knock-out en p53 nacen normales pero desarrollan tumores a las pocas semanas, a los 6 meses la mayoría han muerto. En ratones knock-out en p53 no se induce apoptosis.