Renata Damiani

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Text of Renata Damiani

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    INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES

    AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO

    INFLUNCIA DO BUTIRATO DE SDIO, DA CICLOHEXIMIDA E DO

    CLORETO DE MANGANS NA PRODUTIVIDADE, GLICOSILAO E

    PROPRIEDADES BIOLGICAS DA TIREOTROFINA HUMANA

    DERIVADA DE CHO

    Renata Damiani

    Tese apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Doutor em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear Aplicaes Orientadora: Dra. Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela

    So Paulo

    2013

  • 2

    Dedico este trabalho

    A meus pais Antonio Estevam Damiani e Helena Maria Damiani, meus

    grandes exemplos de fora, coragem e determinao, por todo amor, carinho,

    compreenso e por estarem sempre, incondicionalmente, ao meu lado, sempre

    me incentivando e me encorajando.

    Sem vocs, nada seria possvel!

    Aos meus irmos Marcelo Estevam Damiani e Karina Damiani pelo amor de

    toda uma vida, s vezes torto, s vezes errado, mas sempre verdadeiro!

    A toda minha famlia, minha base, meu porto seguro, por me darem coragem

    para seguir em frente! Sem vocs meus sonhos seriam apenas sonhos!

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    Agradecimentos

    Agradeo primeiramente a Deus, pelo dom da vida, por sempre guiar meus

    passos e por ter colocado cada uma dessas pessoas em minha vida!

    minha me cientfica Dra. Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela, pela

    orientao, apoio e incentivo, pela pacincia e pelos ensinamentos

    transmitidos. Por ter me ajudado a crescer e amadurecer na minha vida

    profissional e acadmica. voc meu eterno respeito e gratido!

    Ao Dr. Paolo Bartolini, a quem devo muito respeito e gratido, pela confiana,

    apoio e incentivo e por sempre ter acreditado em mim e no meu trabalho.

    Dra. Cibele Nunes Peroni, quem primeiro me acolheu neste laboratrio e

    muito me ajudou nos meus primeiros passos no caminho da pesquisa.

    Ao Dr. Carlos Roberto Jorge Soares e Dra. Kayo Okazaki por toda ajuda no

    desenvolvimento deste trabalho e por todo conhecimento transmitido.

    s amigas Cludia, Eliza, Fernanda, Flvia e Thais por toda cumplicidade,

    pelos desabafos, pela amizade, pelos bons momentos que compartilhamos,

    pelas risadas e at pelas lgrimas! Levarei vocs sempre comigo!

    Ao amigo Johnny, sempre por perto e pronto a ajudar, pelo apoio, incentivo,

    pacincia e preciosa colaborao!

    s amigas Bia e Miriam, que estiveram sempre dispostas a ajudar a qualquer

    hora do dia e a qualquer momento.

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    Aos amigos Junqueira, Z Maria, Perez e Rosngela, sempre presentes e

    prontos a ajudar!

    Aos amigos Arlete, Bruno, Ed, Flvio, Eliana, Hugo, Ivette, Karen, Laura,

    Mrcia, Marcos, Mayara, Mosca, Neide, Patrcia, Regina, Roberto, Rosa, Rute,

    Tas, Tamara e Vincent por todos os almoos divertidos e por ter me

    proporcionado bons momentos de descontrao ao longo de todos estes anos!

    Aos amigos Brbara, Camila, Caicy, Ceclia, Danielle, Maurcio, Natlia, Nlio,

    Karina Corleto, Karina Oliveira, Keli, Larissa, Leandro, Luciene, Marco, Otvio,

    Suellen, Susana, Tas Bunioto, Talita, Tatiana, Tatiane, Tita, Vanessa Fbio,

    Vanessa Kummer e Yuri por terem tornado meus dias em So Paulo mais

    felizes e mais leves!

    s amigas Edna, Nia, Sandra, Marisa, Gi e Elisngela, por todas as fofocas

    do meio do dia!

    Aos amigos Clber, Daniele, Sandra e Thamara por toda torcida e pelo apoio

    de sempre! Por estarem sempre presentes em minha vida, mesmo distantes!

    Por me lembrarem, sempre, do valor da amizade verdadeira!

    todos os colegas do Centro de Biotecnologia do IPEN que, direta ou

    indiretamente, colaboraram para a realizao deste trabalho...

    FAPESP e CNEN pelo apoio financeiro.

    A todos vocs, expresso minha gratido!

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    Por vezes sentimos que aquilo que fazemos no seno

    uma gota de gua no oceano. Mas o oceano seria

    menor se lhe faltasse uma gota.

    Madre Teresa de Calcut

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    Influncia do butirato de sdio, da cicloheximida e do cloreto de

    mangans na produtividade, glicosilao e propriedades biolgicas da

    tireotrofina humana derivada de CHO

    Renata Damiani

    Resumo

    A influncia do butirato de sdio (NaBu), do cloreto de mangans (MnCl2),

    combinados ou isolados, e da cicloheximida (CHX) na sntese de tireotrofina

    humana recombinante (r-hTSH) derivada de clulas CHO foi investigada pela

    primeira vez. Com exceo da CHX, que gerou uma reduo de 1,5 vezes na

    produtividade volumtrica, todos os reagentes geraram um aumento (1,4 vezes

    para o MnCl2 e 3 vezes para o NaBu e NaBu+MnCl2) na produtividade

    volumtrica. Tambm foi observada uma diminuio no nmero de clulas

    viveis com a utilizao de todos os reagentes. A adio destes reagentes ao

    meio de cultura de clulas CHO produtoras de hTSH gerou tambm alteraes

    na glicosilao do r-hTSH. As alteraes geradas pela presena de CHX foram

    todas negativas, resultando em uma diminuio de 5,5% no contedo de cido

    silico, 10% na ocupao dos stios de glicosilao, alm de uma diminuio

    no contedo de todos os monossacardeos neutros. Os demais reagentes, por

    outro lado, resultaram em alteraes positivas. A presena de NaBu no meio

    de cultura acarretou um aumento de 12% no contedo de cido silico e de 3%

    na ocupao dos stios de glicosilao. Com relao s estruturas de

    carboidratos presentes no hTSH, foi observado um aumento de 14% nas

    estruturas bi-antenrias, aumento no contedo de manose e fucose e uma

    diminuio no contedo de galactose e N-acetilglucosamina. A presena de

    MnCl2 no meio de cultura resultou em um aumento de 1,7% no contedo de

    cido silico e de 1,3% na ocupao dos stios de glicosilao. Houve ainda um

    aumento no contedo de manose e N-acetilglucosamina e uma diminuio no

    contedo de fucose e galactose. Um aumento de 7% na freqncia de

    estruturas bi-antenrias foi tambm observado quando MnCl2 foi utilizado. O

    uso simultneo de NaBu e MnCl2 proporcionou um aumento de 14% no

    contedo de cido silico e de 3% na ocupao dos stios de glicosilao, bem

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    como um aumento no contedo de todos os monossacardeos neutros. No

    houve, entretanto, alteraes na freqncia das estruturas de carboidratos.

    Apesar de todas as alteraes causadas pelos diferentes reagentes, no foram

    observadas diferenas na atividade biolgica ou no comportamento

    farmacocintico das diferentes preparaes de hTSH estudadas. Este estudo

    extremamente relevante, tanto do ponto de vista do desenvolvimento de novos

    biofrmacos, quanto do ponto de vista do controle de qualidade das

    glicoprotenas hormonais j utilizadas na clnica mdica.

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    Influence of sodium butyrate, cycloheximide and manganese

    chloride on productivity, glycosylation and biological properties of human

    thyrotropin CHO-derived

    Renata Damiani

    Abstract

    The influence of sodium butyrate (NaBu), manganese chloride (MnCl2),

    combined or isolated, and cycloheximide (CHX) on the synthesis of human

    thyrotropin CHO-derived (r-hTSH) was investigated for the first time. Exception

    made for CHX, which caused 1.5-fold reduction on volumetric productivity, all

    other reagents caused an increase in the volumetric productivity of 1.4-fold with

    MnCl2 and 3-fold with NaBu and NaBu+MnCl2. The number of viable cells

    decreased in presence of all these reagents. They also caused alterations in the

    glycosylation of r-hTSH. When CHX was utilized, a decrease in the content of

    sialic acid (5.5%), in the site occupancy (10%) and in the content of neutral

    monosaccharides was observed. In contrast, the addition of NaBu to culture

    medium caused an increase of about 12% in the sialic acid content and of 3% in

    the site occupancy. Concerning to carbohydrate structures, an increase of 14%

    of bi-antennary structures was achieved. In addition, an increased content of

    mannose and fucose and a decrease in the content of galactose and N-acetyl

    glucosamine was also observed. When MnCl2 was utilized, an increase of 1.7%

    in the sialic acid content and of 1.3% in site occupancy occurred. An increased

    content of mannose and N-acetyl glucosamine was also observed, while the

    content of fucose and galactose decreased. Concerning to carbohydrate

    structures, an increase of 7% on bi-antennary structures was achieved. When

    NaBu and MnCl2 were utilized simultaneously, we observed an increase of

    about 14% in the sialic acid content, of 3% in the site occupancy, as well as an

    increase in the content of all neutral monosaccharides. The frequency of

    carbohydrates structures, however, was not altered. Despite all the changes

    caused by these different reagents, in vivo biological activity and

    pharmacokinetic behavior were found not significant different in all the hTSH

    preparations studied in the present work.

  • 9

    Sumrio 1. INTRODUO.............................................................................................. 12

    2. OBJETIVOS................................................................................................. 26

    3. MATERIAL E MTODOS............................................................................. 27

    3.1 MATERIAL................................................................................................. 27

    3.1.1 Preparaes hormonais utilizadas........................................................... 27

    3.1.2 Cultivo ce