UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAU

CENTRO DE CINCIAS DA SADE

DEPARTAMENTO DO CURSO DE FARMCIA

CURSO: FARMCIA

DISCIPLINA: ANLISE BROMATOLGICA

PROFESSORA: Dr. WALESKA FERREIRA DE ALBUQUERQUE

ANLISE MICROBIOLGICA DE GUA E ALIMENTOS E CONTAGEM

PADRO DE PLACAS

Alisson Ribeiro Oliveira 2013947858

Allyson Martins Lopes Sousa 201262944

Ariane Neco de Sousa 201261731

Daiane de Oliveira 200954481

GeffesonWytalo de M. Ferreira 201262597

Jussara Barbosa M. de Carvalho 201260805

Miguel Eusbio P. C. Junior 2010122950

Samara Alves Amorin 201258816

TERESINA-PI

DEZEMBRO- 2014

INTRODUCO

O alimento e a gua so elementos essenciais que todos os seres humanos devem ter

acesso para poder viver. Tanto o acesso " mnima alimentao essencial que seja suficiente,

com valor nutricional adequado e de qualidade", quanto o acesso "gua, suficiente, de

qualidade, aceitvel, fisicamente acessvel e disponvel" so considerados direitos humanos

(BEZERRA et al, 2013).

Os microrganismos esto intimamente associados com a disponibilidade, abundncia e

a qualidade do alimento para consumo humano. Alimentos so facilmente contaminados com

microrganismo da natureza, durante manipulao e processamento. Aps ter sido

contaminado, o alimento serve como meio para o crescimento de microrganismos. Se esses

tiverem condies de crescer, podem mudar as caractersticas fsicas e qumicas do alimento e

podem causar sua deteriorao. Os microrganismos no alimento podem ser responsveis por

intoxicaes e infeces transmitidas por alimentos (PELCZAR JR. et al, 1997).

Alm da identificao do tipo do microrganismo de um meio, tambm importante

em alguns casos sua quantificao. Como exemplo de casos em que a quantificao de

microrganismos torna-se importante, pode-se citar: quantificao da populao de

microrganismos da gua e alimentos para avaliar a qualidade microbiolgica dos mesmos, na

anlise da eficincia de agentes antimicrobianos ou a eficcia de prticas higinico-sanitrias

para se verificar a populao sobrevivente ao tratamento. E, h vrias tcnicas de contagem de

microrganismos.

Assim, os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se

microscopicamente o nmero de clulas presentes num determinado material ou superfcie, ou

indiretamente, efetuando-se anlises da turbidez, determinao do peso seco, concentrao de

substncias qumicas (protenas, pesquisa de determinada enzima ou produto final de uma via

metablica, DNA, RNA) ou atravs da contagem do nmero de microrganismos viveis

utilizando Tcnicas de Contagem Pour-Plate e Spread-Plate.

Os nmeros e tipos de microrganismos presentes dentro ou sobre os alimentos

produzidos podem ser usados para avaliar com segurana a qualidade microbiolgica dos

mesmos. A segurana determinada pela ausncia ou presena de microrganismos

patognicos ou suas toxinas, a quantidade do inculo, e o tempo de controle ou destruio

desses agentes. Testes para organismos indicadores podem ser usados para avaliar tambm a

qualidade microbiolgica ou segurana quando h uma relao entre a ocorrncia de um

organismo indicador e a provvel presena de um patgeno ou toxina for estabelecida,

(DOYLE, BEUCHAT, & MONTIVILLE, 1997). Segundo a ICMSF

(InternationalCommissiononMicrobiologicalSpecifications for Foods) microrganismos indi-

cadores podem ser agrupados em: (I) Microrganismos que no oferecem um risco direto a

sade: contagem padro de mesfila, contagem de psicrotrficos e termfilos, contagem de

bolores e leveduras. (II) Microrganismos que oferecem um risco baixo ou indireto sade:

coliformes totais, coliformes fecais, Enterococcus, Enterobactriaceaetotais e Escherichia

coli, (SILVA, 2002).

O objetivo desse trabalho relatar e discutir os resultados obtidos nas aulas prticas da

disciplina de Anlises Bromatolgicas. As prticas realizadas foram: pesquisa de coliforme

total e fecal em gua, anlise de alimento (pesquisa da presena de Coliforme total e fecal, S

aureus, salmonela).

METODOLOGIA

I ) CONTAGEM PADRO EM PLACAS

No mtodo de contagem em placas foirealizado por meio de duas tcnicas de

inoculao em placas de petri: Spread Plate e Pourplate . Os objetos Analisados foram

celular, fone de ouvido, relgio e a mo de um dos alunos.

Na tcnica Spread Plate, primeiramente com o uso do swab fez-se o esfregao nos

objetos que iam ser analisados, logo aps, colocou-se o swab em soluo salina (10-1), pegou-

se 0,1 ml da diluio com pipeta estril e colocou-se no centro da placa estril no meio Agar

Padro de Contagem (PCA), este j se encontrava slido. A seguir fez-se o espalhamento da

amostra coma ala de Drigalski.

Na tcnica de Pourplate, a mesma diluio feita do esfregao dos objetos usados na

tcnica anterior, foi novamente utilizada. Com pipetas estreis transferiu-se 1ml para placas

de Petri estreis; Em seguida, verteu-se de 15 a 20 ml do meio Agar Padro de

contagem(PCA), previamente fundido e resfriado a 45 C. Homogeneizou-se com movimento

rotatrios (em 8) e aguardou-se o meio solidificar.

Nas duas tcnicas as placas foram colocadas na posio invertida, em estufa com

temperatura de 35 C por 24- 48h para a contagem total de microrganismos aerbios

mesfilos.

II) ANALISE DE GUA

Foi realizado coleta da gua distribuda em um dos bebedouros da UFPI. O bebedouro

possui 2 torneiras de sada de gua. No momento da coleta usou-se gases e lcool 70, para

limpa-las, aps a limpeza deixamos elas abertas por um minuto. Logo a seguir, as amostras de

gua foram coletadas em sacos estreis de 100 ml. No teste presuntivo foram inoculadas 10

ml da gua analisada em cada um dos 10 tubos composto por concentrao dupla de caldo

Lauril Sulfato Triptose, para realizao do teste presuntivo, em seguida, foram incubadas em

estufa a 37C por 48 horas. Para termos a prova confirmatria, foram utilizados 3 tubos de

ensaio contendo de caldo verde brilhante e outros 3 contendo caldo EC. Em todos os tubos foi

inoculada 1 alada da amostra contida no tubo com lauril. Posteriormente foram incubadas em

banho-maria 37C por 48 horas.

III) ANLISE DE ALIMENTO

O alimento analisado foi um salgado, coletado em saco estril. Na analise

microbiolgica do alimento foram pesados 25g do mesmo e homogeneizado em 225 ml de

gua peptonada, correspondendo diluio 10-1. Para as demais diluies foram utilizados 2

tubos contendo 9 ml de gua cada um. No tubo para diluio 10-2 foi inoculado 1 ml do frasco

de diluio 10-1. Para diluio 10-3 foi utilizado 1 ml do tubo com diluio 10-2. Na prova

presuntiva para anlise da presena de coliformes foram usados 9 tubos contendo Lauril

Sulfato Triptose. Em 3 deles foi inoculado 1 ml da diluio 10-1. Em outros 3, foi utilizado 1

ml da diluio 10-2, e nos 3 ltimos da diluio 10-3. Em seguida, foram incubados em estufa a

37C por 48 horas.

Para anlise de Salmonella sp. foram utilizadas alquotas de 1 ml e 0,1 ml retirados da

gua peptonada e inoculadas em 10 ml de caldo rappaport. Esses tubos foram incubados em

estufa a 37C por 24 horas. Passadas 24 horas foram retiradas alquotas de cada meio e, com o

auxlio de uma ala de nquel-cromo, foram estriadas em placas de petri contendo os meios de

cultura Agar Entrico Hektoen (HEA) e Agar Salmonella/Shigela (SS). As placas foram ento

incubadas por 24 horas. Para anlise deStaphylococcus sp. foi retirada uma alquota de 0,1 ml

de cada diluio e, com o auxlio de uma ala de Drigalski, foram distribudas na superfcie

do meio ABP (Agar BairdPaker). As placas foram incubadas invertidas em estufa a 37C por

48 horas.

RESULTADOS

TABELA 1.0 - REGISTRO DA CONTAGEM DE PLACA PELA TCNICA DE SPREAD

PLATE E POUR PLATE. TERESINA-PI, 2014.

OBJETO TCNICA

Spread Plate Pour Plate

Relogio

celular

Mo

Fone

18

139

Incontvel

Incontvel

52

138

157

73

FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2.

TABELA 2.0. REGISTRO DA ANLISE MICROBIOLGICA DE GUA DO

BEBEDOURO DA BIBLIOTECA DA UFPI, UTILIZANDO COMO MEIO DE CULTURA

O LAURIL SULFATO TRIPTOSE EM DUPLA CONCENTRAO TERESINA, 2014.

LOCAL DE COLETA TURVAO PRESENA DE GAS

BEBEDOURO DA

BIBLIOTECA

- -

FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2.

LEGENDA: (-) NEGATIVO.

TABELA 3.0 - REGISTRO DA ANLISE DO NMERO MAIS PROVVEL DE

COLIFORMES FECAIS EM AMOSTRA DE ALIMENTO, INOCULADAS NOS MEIOS

DE CULTURA LAURIL SULFATO TRIPTOSE. TERESINA PI, 2014.

MEIO DE CULTURA DILUIO / TUBOS CRESCIMENTO

CALDO LAURIL

SULFATO TRIPTOSE

10-1 (1)

(2)

(3)

( - )

( - )

( - )

10-2 (1)

(2)

(3)

( - )

( - )

( - )

10-3 (1)

(2)

(3)

( - )

( - )

( - )

FONTE:LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2

LEGENDA: ( - ) NEGATIVO.

TABELA 4.0 REGISTRO DA ANLISE GAR ENTRICO HEKTOEN (HEA), GAR

SALMONELLA/SHIGELA (SS), GAR DE FERO COM TRS AUCARES (TSI) E

GAR LISINA FERRO (LIA) OBTIDA DA AMOSTRA DE ALIMENTO. TERESINA-PI,

2014.

TESTES RESULTADO

HES ( - )

SS ( - )

TSI ( - )

LIA ( - )

FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2.

LEGENDA:( - ) NEGATIVO.

TABELA 5.0 REGISTRO DO TESTE DA COAGULASE E CATALASE DA AMOSTRA

DE ALIMENTO. TERESINA-PI, 2014.

TESTES RESULTADO

CATALASE ( + )

COAGULASE ( - )

FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2.

LEGENDA: ( + ) POSITIVO; ( - ) NEGATIVO.

TABELA 6.0- REGISTRO DA ANLISE DA PRESENA/AUSNCIA DE Salmonella EM

AMOSTRA DE ALIMENTO OBTIDO NA UFPI E INOCULADAS NOS MEIOS DE

CULTURA LAURIL SULFATO TRIPTOSE. TERESINA, 2014.

MEIO DE CULTURA CRESCIMENTO NO MEIO DE CULTURA

CALDO RAPPAPORT

(-)

AGAR Salmonella/Shigela (-)

AGAR ENTRICO HEKTOEN (-)

FONTE: LABORATRIO DE ALIMENTOS DA UFPI, ALUNOS DE FARMCIA 2014.2

LEGENDA: ( - ) NEGATIVO.

DISCUSSO

Para a contagem padro em placas utilizou-se para a quantificao de grupos

microbianos, como S. aureus; que na inoculao da amostra homogeneizada em um meio

slido, contido em placas de petri, seguida da incubao das placas at crescimento visvel,

cada clula microbiana presente na amostra ir formar uma colnia isolada, no qual se

variando o meio de cultura e as condies de incubao possvel selecionar o grupo, gnero

ou espcie que se deseja contar, ressaltando que essa correlao feita entre o nmero de

colnias e o nmero de Unidades Formadoras de Colnia UFC, que podem ser tanto

clulas individuais como agrupamentos caractersticos de cada microorganismo. (SILVA et

al, 2007).

A diferena de um mtodo para o outro que o mtodo Pour-Plate coloca-se,

primeiramente, a alquota de 1 ml da amostra com os microrganismos em uma Placa de Petri

estril sem, o meio de cultura, pois esse ser colocado por cima dos microrganismos na placa.

E, na tcnica Spread-Plate o meio de cultura j se encontra na placa e os microrganismos

so colocados por cima do meio e so espalhados com o auxlio da Ala. Para o mtodo de

Spread-Plateforam encontrados os seguintes valores: relgio (180 UFC), celular (139 UFC),

mo (incontveis), fone (incontveis). Para o mtodo Pour-Plateforam: relgio (520 UFC),

celular (138 UFC), mo (1570), fone (730).

O mtodo do NMP de contagem de coliformes totais e termotolerantes em gua e

alimentos consiste em trs etapas: 1 (presuntivo)- seria a inoculao da amostra em tubos

contendo caldo lauril sulfato triptose (LST) que contm lactose e a observao de

crescimento com produo de gs (tabela 2.0) a partir da lactose, aps 24-48 hrs de

incubao a 35C considera suspeita da presena de coliformes; 2 (confirmatria)- a

observao de crescimento com produo de gs nos tubos de VB (verde brilhante bile 2%),

aps 24-48 horas de incubao a 35C considerada confirmativa da presena de coliformes

totais; j a produo e gs nos tubos de EC (caldo E.coli) so considerados positivos para a

presena de coliformes termotolerantes; 3 (confirmatrio para E.coli)- os tubos EC positivos

so suspeitos para a presena de E.coli que so inoculados em meio seletivo diferencial para

E. coli, (L-EMB), e que se houver desenvolvimento de colnias tpicas elas so isoladas para

as provas bioqumicas de indol, VM, VP e citrato (SILVA et al, 2007).

Na amostra de gua foi investigada a presena ou no de coliformes totais e

termotolerantes (fecais); que segundo Franco e Landgraf (2008), os coliformes totais um

grupo composto por bactrias da famlia Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose

com produo de gs, quando incubados a 35-37 C, por 48 horas, sendo bacilos gram-

negativos e no formadores de esporos possuindo como representante a E. coli; j os

coliformes fecais um grupo que incluem as bactrias dos coliformes totais que tem a

capacidade de continuar fermentando lactose com produo de gs, quando incubadas

temperatura de 44-45,5C. Nessas condies cerca de 90% das culturas de E. coli so

positivas, enquanto entre os demais gneros, apenas algumas cepas de Enterobacter e

Klebsiella mantm essa caracterstica, sendo negativo as amostras conforme pode ser visto na

tabela 2.0 porque no ouve turvao do meio nem produo de gs.

Na amostra do alimento (empada)foram realizados a investigao de Coliformes,

Salmonellac dando negativas conforme pode ser visto nas tabelas 3.0, 4.0 e 6.0 e para

Staphylococcus, sendo positivo para o teste de catalase conforme visto na tabela 5.0.

Para a investigao da Salmonella h primeiro um enriquecimento em caldo seletivo

objetivando inibir a multiplicao da microbiota acompanhante e promover a elevao

preferencial do nmero de clulas de Salmonella, um dos meios utilizados o caldo

Rappaport e sua seletividade baseada na presena de verde de malaquita oxalato, na alta

presso osmtica e no pH relativamente cido (5,1). Em seguida h o plaqueamento seletivo

diferencial que promove o desenvolvimento preferencial de Salmonella, com caractersticas

tpicas que as distinguem dos competidores, um dos exemplos desse meio de cultura o gar

Entrico de Hectoen (HE) que diferencia a bactria atravs da no fermentao da lactose e da

produo de cido sulfdrico (H2S); e por fim tem-se a confirmao que as colnias so, ou

no, de Salmonella atravs de provas bioqumicas (SILVA et al, 2007).

A contagem do S. aureus em alimentos tem como objetivo: confirmar o envolvimento

em surtos de intoxicao alimentar, verificar se o alimento uma fonte potencial ou indicar

contaminao ps-processo (SILVA et al, 2007).

As principais caractersticas seletivas utilizadas no isolamento de S. aureus so a

habilidade de crescer na presena de NaCl (5,5-10%), telurito de potssio (0,0025-0,05%),

cloreto de ltio (0,01-0,05%), glicina (0,12-1,26%) e polimixina (40 mg/l) e as caractersticas

diferenciais so: a capacidade de reduzir o telurito de potssio (produzindo colnias pretas em

meios slidos), a capacidade de hidrolisar a gema de ovo, capacidade de utilizar o manitol e

de crescer a 42-43C em condies seletivas, a atividade de coagulase e atividade de

termonuclease (SILVA et al, 2007).

O meio mais amplamente utilizado o gar Baird- Parker (ABP) que combina o

telurito de potssio, glicina e cloreto de ltio; a presena de colnias aps a incubao a 35-

37C/45-48hrs formam colnias circulares, pretas ou cinzas escuras, com 2-3 mm de

dimetro, lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de clulas esbranquiadas nas bordas,

rodeadas por uma zona opaca e/ou transparente se estendendo para alm da zona opaca

(SILVA et al, 2007). Sendo positivo para este teste.

CONCLUSO

As aulas prticas realizadas tiveram notvel relevncia no aprendizado das anlises

microbiolgicas e deixou claro sua importncia para a determinao da segurana e

potabilidade das amostras, gua e alimentos. O presente trabalho apontou que os produtos

esto dentro das condies de segurana para o consumo humano, uma vez que no apontam

valores significativos para a presena de microrganismos prejudicais para a sade, no

acarretando na condenao dos produtos.

REFERENCIA BIBLIOGRFICA

BEZERRA, Ilana Nogueira et al. Consumo de alimentos fora do domiclio no Brasil.Rev.

Sade Pblica, So Paulo, v. 47, supl. 1, Feb. 2013.

FRANCO, B.D.G.M. & LANDGRAF, M.; Microbiologia dos Alimentos. 1 ed, So Paulo:

editora Atheneu, 2008.

PELCZAR JR. et al. Microbiologia: conceitos e aplicaes. 2.ed. So Paulo: McGraw-Hill,

1997. v.2. p.372-397.

SILVA, M. C. Avaliao da qualidade microbiolgica de alimentos com a utilizao de

metodologias convencionais e do sistema simplate. 2002. Tese (Mestre em Cincias) Escola Superior de Agricultura, Universidade de So Paulo, 2002, Piracicaba. Disponvel em

http://www.teses.usp.br/. Acesso em: 12 dezembro 2014.

SILVA, Neusely. et al. Manual de mtodos de anlises microbiolgica de alimentos. 3. ed.

So Paulo: Livraria Varela, 2007.