y = 0.1068x - 0.0187

R² = 0.9958

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 1 2 3 4 5 6

Ab

sorb

ân

cia (

ad

imen

sion

al)

Concentração (μmol/mL)

Curva padrão

Biotecnologia experimental

Relatórios das práticas 9 e 10

Alunos: Alexander de Paula, Diogo Mendes, Naiara Farias, Natalia Azevedo e Victor de

Backer

Tanto para a prática 9 quanto para a prática 10 foi utilizado a curva de calibração da

prática 8, conforme sugerido pelo procedimento experimental. Seguem os dados a seguir dessa

curva de calibração feita com uma solução padrão de glicose 5,0 μmol/mL.

Tabela 1 – Dados de volume de solução utilizado, absorbância e concentração para a curva

padrão.

Curva padrão

V sol. Padrão (ml) Abs C (μmol/ml)

0 0 0

0,2 0,075 1

0,4 0,183 2

0,6 0,294 3

0,8 0,419 4

1 0,519 5

Figura 1 – Gráfico da curva padrão.

𝐴𝑏𝑠 = 0,1068 ∗ 𝐶 − 0,0187

𝐶 =𝐴𝑏𝑠 + 0,0187

0,1068

Em que Abs é a absorbância e C a concentração (μmol/mL).

Prática 9: Influência da temperatura sobre a atividade enzimática

A seguir segue a Tabela 1 com os resultados da prática. Vale lembrar que o tempo de

reação foi de 10 min para todas as temperaturas estudadas.

Tabela 1 – Dados de temperatura, absorbância, produto formado, fator de diluição e velocidade

de reação.

Temperatura

(oC)

Absorbância Produto

formado (não

corrigido pela

diluição)

(μmol/mL)

Fator

de

diluição

Produto

formado

(μmol/mL)

Velocidade de

reação

(μmol/mL.min)

0 0,540 5,2313 1 5,2313 0,5231

22,5 0,815 7,8062 2 15,6124 1,5612

50 1,740 16,4672 2 32,9345 3,2934

100 0,415 4,0609 1 4,0609 0,4061

A partir dos dados da tabela, pode-se construir um gráfico de velocidade de reação

(μmol/mL.min) versus temperatura (oC), ver Figura 2.

y = -0.001x2 + 0.1032x + 0.2931

R² = 0.9085

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

0 20 40 60 80 100 120

Vel

oci

da

de

de

rea

ção

(μm

ol/

mL

.min

)

Temperatura (oC)

Figura 2 – Gráfico de velocidade de reação (μmol/mL.min) versus temperatura (oC).

A temperatura na qual a enzima apresenta a maior atividade pode ser obtida derivando

a equação de segundo grau gerada e igualando a zero, já que a parábola gerada possui a

concavidade voltada para baixo:

𝑦 = −0,001𝑥2 + 0,1032𝑥 + 0,2931

𝑣 = −0,001𝑇2 + 0,1032𝑇 + 0,2931

Em que v é a velocidade de reação e T a temperatura. Derivando e igualando a zero:

0 = −0,002𝑇 + 0,1032

𝑇 =0,1032

0,002

𝑇 = 51,6 𝑜𝐶

A velocidade de uma reação química é afetada pela temperatura, e podemos dizer que

o mesmo acontece com as reações catalisadas por enzimas, a variação de temperatura afeta as

constantes cinéticas Km e Vmáx.

Como as enzimas são proteínas, o aumento da temperatura não causa apenas o aumento

da velocidade da reação mas sim, dois efeitos opostos: até determinada temperatura, ocorre um

aumento da velocidade da reação; a partir de determinada temperatura, há uma diminuição na

velocidade da reação. Isso acontece porque as enzimas são proteínas e como tal, podem ser

desnaturadas, ou seja, as enzimas perdem sua estrutura nativa, o que leva à perda de função.

Isso faz com que um máximo seja gerado no gráfico de velocidade de reação versus

temperatura, caracterizando uma temperatura ótima. Com os dados experimentais foi possível

fazer uma regressão de segundo grau, que ao derivar, obteve-se a temperatura de 51,6 oC para

a temperatura na qual a enzima apresenta maior atividade, Vale lembrar que o R2 dessa

regressão foi de 0,9085, ou seja, apesar de ser um valor razoavelmente alto, caso seja necessário

uma maior certeza quanto a esse valor de temperatura ótima, seria recomendado o estudo de

mais temperaturas, a fim de gerar uma curva com o R2 mais próximo da unidade. No entanto,

mesmo assim, é de se esperar que essa temperatura ótima girasse em torno desse valor obtido.

No certo para cada tipo de enzima existe uma temperatura ideal, no qual a velocidade

da reação é máxima, neste caso foi calculado 51,6° C, nesta temperatura é permitindo o maior

número de colisões moleculares sem desnaturar a enzima.

Prática 10: Modelo Cinético de Michaelis-Menten

A seguir segue a Tabela 2 com os resultados da prática:

Tabela 2 – Dados de concentração de substrato [S], absorbância, produto formado, velocidade

de reação V, 1/[S] e 1/V.

Concentracão

de substrato

[S]

Absorbância Produto

formado

(μmol/mL)

Velocidade de

reação V

(μmol/mL.min)

1/[S] 1/V

0 0,0000 0,00 0 - -

5 0,3385 3,34 0,3344 0,2 2,9899

10 0,5600 5,42 0,5418 0,1 1,8455

25 0,9150 8,74 0,8742 0,04 1,1438

50 1,5340 14,54 1,4538 0,02 0,6878

100 1,6200 15,34 1,5343 0,01 0,6517

250 1,8900 17,87 1,7871 0,004 0,5595

500 1,5880 15,04 1,5044 0,002 0,6647

Construindo um gráfico de velocidade de reação versus concentração de substrato:

Figura 3 – Gráfico de velocidade de reação (μmol/mL.min) versus concentração de

substrato (μmol/mL).

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0 100 200 300 400 500 600Vel

oci

dad

e d

e re

ação

(μ

mo

l/m

L,m

in)

Conncentração de substrato (μmol/mL)

Velocidade de reação x Concentração de substrato

Modelo Experimental

A seguir, na Figura 4, está representada o comportamento da cinética enzimática

previsto na literatura [1].

Figura 4 – Curva da literatura de velocidade contra concentração de substrato.

Dessa forma, percebe-se que o gráfico obtido experimentalmente apresenta o mesmo

perfil do previsto pela literatura. Vale lembrar que o último ponto possui um valor de

velocidade abaixo do esperado. Esse resultado foi obtido também numa replicata e pelos outros

grupos que realizaram a prática, levando a conclusão de que, provavelmente, a solução padrão

para este ponto estava na concentração errada.

Agora, pelo modelo de Michaelis-Menten para cinética enzimática temos:

𝑉 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]

𝐾𝑚 + [𝑆]

Rearranjando, podemos escrever:

1

𝑉=

𝐾𝑚

𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]+

1

𝑉𝑚𝑎𝑥

y = 12.318x + 0.5588

R² = 0.9926

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

1/V

(m

L.m

in/μ

mo

l)

1/[S] (mL/μmol)

Logo, é de se esperar um comportamento linear quando plota-se um gráfico de 1/[S]

versus 1/V. Além disso, a partir do gráfico, pode-se obter os parâmetros Km e Vmax. A figura a

seguir é este gráfico:

Figura 5 – Gráfico 1/[S] versus 1/V.

Pela coeficiente de correlação gerado, percebe-se que a equação gerada descreveu bem

o sistema. Para o cálculo dos paramêtros:

1

𝑉𝑚𝑎𝑥= 0,5588

𝑉𝑚𝑎𝑥 = 1,7895 μmol/mL. min

E também:

𝐾𝑚

𝑉𝑚𝑎𝑥= 12,318

𝐾𝑚 = 22,0437 μmol/mL

Através do processo de linearização do modelo de Michaelis-Menten, foi possível com

a equação da reta do gráfico 1/[S] versus 1/V obtermos a velocidade máxima da reação e a

constante de Michaelis-Menten.

É sabido que a Michaelis-Menten relaciona a velocidade inicial da reação, com a

concentração de substrato e a velocidade máxima de reação, onde todas as enzimas (E) estão

com substratos ligados em seus sítios ativos, formando o complexo ES. Essa relação pode ser

melhor entendida através da seguinte reação:

Onde E representa as enzimas; S sítios ativos; ES o complexo formado e Produto

formado. Portanto, a medida que a concentração de substrato aumenta, as velocidades de

substratos também aumentam. Esse aumento é linear para concentrações baixas. Porém, esse

aumento linear não acontece para concentrações maiores, já que acontece a saturação dos

sítios-ativos. Dessa forma, a velocidade continua aumentado até atingir um patamar, a

velocidade máxima, que na verdade é calculada como sendo a assíntota da curva desse gráfico

de velocidade de reação contra concentração de substrato. Esse comportamento pode ser

observado no gráfico da figura 3, onde é possível observar esse comportamento do aumento

da velocidade de reação com o aumento da concentração de substrato no meio.

O gráfico da Figura 3 relaciona os dados obtidos experimentalmente com os dados

modelos através do modelo de Michaelis-Menten, após a obtenção do Km e da Velocidade

máxima. Com a obtenção dos dois dados, foi possível identificar que os dados obtidos

experimentalmente preveem uma velocidade máxima próxima da velocidade máxima obtida

pelo modelo. Ainda é possível observar que através do modelo, em concentrações elevadas de

substrato, a velocidade de reação tende a se manter constante, enquanto em nossos dados

experimentais identificamos que a mesma tendeu a diminuir. Esse erro experimental pode ter

sido oriundo da etapa do preparo das soluções do experimento, além dos erros e incertezas

associadas aos equipamentos e vidrarias utilizados.

No gráfico gerado pelos dados experimentais pode-se observar esses dois perfis – o

aumento linear para baixos valores de [S] e a formação de um plateau para concentrações

maiores – assim como no gráfico da Figura 4.

A constante de Michaelis-Menten (Km) é a concentração de substrato quando a

velocidade máxima é a metade. Analisando nossos resultados obtivemos um valor de Km de

22.0437 μmol/mL.

Referências

[1] Retirado de <http://sistemas.eel.usp.br/docentes/arquivos/5840494/383/6-

Cineticaenzimatica.pdf>. Acesso em 09/07/2015.