1. INTRODUÇÃO

1.1.Processo Fermentativo:A fermentação alcoólica é um processo químico de transformação de glicídios em

etanol, por ação das leveduras adicionadas ao mosto. Esta levedura na presença de sacarose elabora uma enzima, que catalisa a hidrólise da sacarose, produzindo glicose e frutose. Em seguida, o microorganismo elabora outra enzima, que catalisa a transformação da glicose e da frutose em álcool etílico. Essa reação é bastante exotérmica e libera gás carbônico, o que dá ao sistema um aspecto de fervura, daí o nome fermentação atribuído por Pasteur. Este processo segue a seguinte equação:

Equação 1 – Equação global do processo fermentativo

As leveduras mais utilizadas no processo de fermentação alcoólica são as Saccharomyces cerevisiae. A fermentação alcoólica ocorre devido ao fato de que as células de levedura produzem a energia que lhes é necessária para sobreviver, através de dois fenômenos de degradação da matéria orgânica: a respiração que necessita do oxigênio do ar ou a fermentação que ocorre na ausência de oxigênio do ar. A fermentação alcoólica corresponde a uma má utilização de energia. Assim, a levedura necessita transformar muito açúcar em álcool, para assegurar suas necessidades energéticas. Nessas condições a multiplicação da levedura é pequena; ao contrário, o rendimento da transformação do açúcar em álcool é grande, em relação ao peso da levedura. Apesar de não ser o único microrganismo capaz de produzir álcool, as propriedades específicas das leveduras, como tolerância a altas concentrações de álcool e gás carbônico, o crescimento rápido e a capacidade de fermentação as tornam os microrganismos mais adequados para a operação em escala industrial. Portanto, o levedo é usado na fabricação de pães, devido à liberação de gás (CO2) na reação, e também na indústria de bebidas fermentadas, porque a reação produz álcool.

Conhecendo as propriedades biológicas das leveduras e suas exigências nutricionais, torna-se simples fazer o tratamento dos mostos para obter fermentações regulares, homogêneas e puras. Visto que estes fatores afetam o rendimento da fermentação, ou seja, a eficiência da conversão de açúcar em etanol.

Quanto à Temperatura: As temperaturas ótimas para a produção industrial de etanol situam-se na faixa de 26-35ºC, com média de 30ºC.

Quanto ao pH: O pH ótimo situa-se entre 4,0 e 5,0 e em substratos com poder tampão elevado, como os melaços entre 5,8 – 5,9.

Exigências Nutricionais: Os elementos nutritivos mais importantes representam-se pelo carbono, nitrogênio, fosfatos, sais de magnésio, potássio e cálcio. Elementos menores como manganês e cobalto atuam favoravelmente em suas atividades vitais. Quando se trabalha com caldo de cana direto, faz-se uma correção mais cuidadosa para oferecer à levedura condições de nutrição que normalmente não se encontram no caldo. Juntam-se fosfatos, sais de amônio e vitaminas. Melhores rendimentos obtém-se quando se trata o caldo de cana-de-açúcar com 0,1g por litro de sais de magnésio, e 0,01g por litro de sais manganês e cobalto.

1.2.Destilação Azeotrópica:O álcool e a água formam uma mistura azeotrópica. O composto azeotrópico se

comporta como um líquido homogêneo que em uma certa composição apresenta ponto de ebulição fixo. A mistura água e álcool apresenta ponto de ebulição variável em função do grau alcoólico. Assim, o ponto de ebulição de uma solução hidroalcoólica é intermediário entre aquele da água e do álcool, e será tanto mais próximo deste último, quanto maior o grau alcoólico da solução. Um azeótropo pode ferver a uma temperatura inferior, intermediária ou

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superior às temperaturas dos componentes da mistura. Quando é inferior, chama-se azeótropo de mínimo ponto de ebulição ou azeótropo negativo. Quando é superior, azeótropo de máximo ponto de ebulição ou azeótropo positivo.

A separação do álcool e da água pode ser realizada por destilação fracionada. Esta consiste no aquecimento da mistura homogênea onde os pontos de ebulição não sejam muito próximos. Os líquidos são separados na medida em que cada um dos seus pontos de ebulição é atingido. A coluna de fracionamento apresenta no seu interior um grande número de bolinhas de vidro, em cuja superfície ocorre condensação dos vapores do líquido menos volátil, ou seja, de maior ponto de ebulição, que voltam para o balão. Enquanto isso, os vapores do líquido mais volátil atravessam a coluna e sofrem condensação fora dela, no próprio condensador, sendo recolhidos no frasco. Só depois de todo o líquido mais volátil ter sido recolhido é que o líquido menos volátil passará por evaporação e condensação.

Gráfico 1 – Mistura Azeotrópica

1.3. Ebuliômetro:O ebuliômetro é composto de uma caldeira, onde fica a amostra a ser analisada, um

condensador, que é acoplado à caldeira, onde são condensados vapores provenientes do líquido contido na caldeira, e uma lamparina, que fornece aquecimento à caldeira do ebuliômetro. Foram transferidos 50 mL da amostra para a caldeira do ebuliômetro e, logo após, encheu-se o condensador com água fria e acendeu-se a lamparina. Com um termômetro acoplado à caldeira, mediu-se a temperatura de ebulição da amostra, aguardando-se que a temperatura se estabilizasse, um tempo de aproximadamente 5 min.

Figura 1 - Ebuliômetro

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2. OBJETIVO

Proceder à fermentação alcoólica de um meio sintético previamente preparado e posteriormente determinar o rendimento prático do etanol obtido por este processo.

3. EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES

3.1.Autoclave;3.2.Erlenmeyer de 250 mL;3.3.Pipeta graduada de 1,0 mL;3.4.Balança Analítica FA – 2104N da BIOPRECISA;3.5.Balança Kern 510-63;3.6.Refratômetro de Campo de 0 – 35° Brix / Marca: Polskie Zaklady Optyczne – PZO /

Modelo: RR 12 / NR: 03378;3.7.Bico de Bunsen;3.8.Pipeta Pasteur;3.9.Balão Volumétrico de 50,00 mL;3.10.Proveta de 50,0 mL;3.11.Proveta de 100,0 mL;3.12.Microdestilador Tecnal;3.13.Funil de Vidro;3.14.Ebuliômetro 3300 – Metalúrgica Leonardo LTDA.;3.15.Meio Sintético para fermentação (Tabela 1);3.16.Fermento Biológico.

4. METODOLOGIA

Utilizou-se no processo de fermentação um meio sintético (mosto) previamente preparado pela bolsista do laboratório, este contém:

Tabela 1 – Preparação do Meio SintéticoSubstância Concentração (g/L)Sacarose 1,00

NaCl 1,00MgSO4 0,25KH2PO4 1,00

Extrato de Levedura 0,50CaCl2 0,25

Foi preparado 250,00 mL deste meio que foi posteriormente autoclavado a 1 atm por 10 minutos.

Transferiu-se, assepticamente, 120,0 mL deste mosto para um erlenmeyer de 250 mL que havia sido anteriormente escaldado pela bolsista. Foi utilizado um bico de Bunsen para aumentar a assepsia.

Pesou-se cerca de 0,24 g de fermento biológico (levedura Saccharomyces Cerevisiae) para os 120,0 mL do mosto, ou seja, em uma razão de 2 g/L. A adição da levedura também foi realizada próxima a chama do bico de Bunsen.

Acoplou-se o dispositivo de Alwood como um lacre para o erlenmeyer e adicionou-se uma pequena quantidade de água no reservatório deste dispositivo. Homogeneizou-se o conteúdo do erlenmeyer por agitação manual, e após isto, retirou-se uma gota do mosto com a utilização de uma pipeta Pasteur e colocou-a em um refratômetro para a medição da

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concentração de sacarose em Graus Brix. Em seguida, procedeu-se a pesagem do conjunto (Erlenmeyer com o mosto e o dispositivo de Alwood).

A fermentação do mosto foi realizada por uma semana no laboratório. Após esse período, realizou-se uma nova pesagem do conjunto citado anteriormente e a medição da concentração Graus Brix da sacarose presente no mosto fermentado. As correções realizadas nas concentrações medidas em Graus Brix em relação à temperatura levaram em consideração os valores apresentados na tabela 2.

Tabela 2 – Correção da concentração de sacarose em função da temperatura

Conteúdo de sacarose em percentagem

Tempera-

tura °C

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

,

Subtraia da percentagem de sacarose

, ,10 0,50 0,54 0,58 0,61 0,6

40,66 0,68 0,70 0,72 0,73 0,74 0,75 0,76 0,78 0,79

11 0,46 0,49 0,53 0,55 0,58

0,60 0,62 0,64 0,65 0,66 0,67 0,68 0,69 0,70 0,7112 0,42 0,45 0,48 0,50 0

,520,54 0,56 0,57 0,58 0,59 0,60 0,611 0,61 0,63 0,63

13 0,37 0,40 0,42 0,44 0,46

0,48 0,49 0,50 0,51 0,52 0,53 0,54 0,54 0,55 0,5514 0,33 0,35 0,37 0,39 0

,400,41 0,42 0,43 0,44 0,45 0,45 0,46 0,46 0,47 0,48

15 0,27 0,29 0,31 0,33 0,34

0,34 0,35 0,36 0,37 0,37 0,38 0,39 0,39 0,40 0,4016 0,22 0,24 0,25 0,26 0

,270,28 0,28 0,29 0,30 0,30 0,30 0,31, 0,31 0,32 0,32

17 0,17 0,18 0,19 0,20 0,21

0,21 0,21 0,22 0,22 0,23 0,23 0,23 0,23 0,24 0,2418 0,12 0,13 0,13 0,14 0,

140,14 0,14 0,15 0,15 0,15 0,15 0,16 0,16 0,16 0,16

19 0,06 0,06 0,06 0,07 0,07

0,07 0,07 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08

°C Adicione à percentagem de sacarose

21 0,06 0,07 0,07 0,07 0,07

0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08

22 0,13 0,13 0,14 0,14 0,15

0,15 0,15 0,15 0,15 0,16 0,16 0,16 0,16 0,16 0,1623 0,19 0,20 0,21 0,22 0

,220,23 0,23 0,23 0,23 0,24 0,24 0,24 0,24 0,24 0,24

24 0,26 0,27 0,28 0,29 0,30

0,30 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,32 0,32 0,32 0,3225 0,33 0,35 0,36 0,37 0

,380,38 0,39 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40

26 0,40 0,42 0,43 0,44 0,45

0,46 0,47 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,4827 0,48 0,50 0,52 0,53 0

,540,55 0,55 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56

28 0,56 0,57 0,60 0,61 0,62

0,63 0,63 0,64 0,64 0,64 0,64 0,64 0,64 0,64 0,6429 0,64 0,66 0,68 0,69 0

,710,72 0,72 0,73 0,73 0,73 0,73 0,73 0,73 0,73 0,73

30 0,72 0,74 0,77 0,78 0,79

0,80 0,80 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81

Com uma proveta mediu-se 40,0 mL desse mosto e que foi destilado em um

microdestilador. Recolheu-se 25,0 mL de destilado que foi transferido para um balão volumétrico de 50,00 mL e avolumado até o traço de aferição.

Transferiu-se o conteúdo do balão volumétrico para alcoômetro, que forneceu um valor de temperatura, que foi corrigido por meio de uma régua própria do aparelho.

5. RESULTADOS

5.1.Massa de fermento biológico (Levedura):2 g ↔ 1000mLx ↔ 120mL

x=mLevedura(Teórica )=2×1201000

=0,24 g

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mLevedura (real)= 0,2592 g

5.2.Massa do conjunto (Erlenmeyer com o mosto e o dispositivo de Alwood):5.2.1. Antes da Fermentação:m Antes da fermentação= 317,2 g

5.2.2. Depois da Fermentação:m Depois da fermentação= 312,1 g

5.3.Concentração de sacarose em Graus Brix no mosto corrigido pela temperatura:5.3.1. Antes da Fermentação:[Sacarose]= 10,5° BrixTemperatura da Solução= 20° C

1.1.1. Depois da Fermentação:[Sacarose]= 3,4° BrixTemperatura da Solução: 27° C

0 ° Brix 3,4 ° Brix 5 ° Brix↓ ↓ ↓

0,48 ? 0,50

5−0 ↔ 0,50−0,483,4−0 ↔ ∆f

∆ f =0,02×3,45

=0,0136≅ 0,01

f '=∆ f +0,48f '=0,01+0,48=0,49

[Sacarose]= 3,4° Brix + 0,49= 3,89° Brix 3,9° Brix

1.2.Massa de CO2 liberado pelo processo de fermentação (Diferença entre as massas do conjunto antes e depois da fermentação):

mCO2=317,2−312,1=5,1g

5.5.Rendimento teórico da fermentação alcoólica:[Sacarose] Consumida= 10,5 – 3,9= 6,6° Brix

Considerando-se a densidade do mosto antes da fermentação como algo em torno a 1 g/mL, pode-se afirmar que 100 g desse mosto é aproximadamente igual a 100 mL, com isso:

6,6 g ↔ 100mLmSacarose ↔ 120mL

mSacarose=6,6× 120

1007,92g

Segundo a equação 1, 1 mol de sacarose gera 4 mols de etanol, ou seja:

342g ↔ 4× 46 g7,92g ↔ mEtanol

5

mEtanol=4× 46×7,92

3424,26g

Sendo assim, 7,92 g de sacarose gerariam teoricamente 4,26 g de etanol. Sabendo que a densidade deste último é de aproximadamente igual a 0,79 g/mL, pode-se determinar o seu volume teórico:

d=mV

0,79=4,26V

V= 4,260,79

=5,39mL

5.6.Rendimento prático da fermentação alcoólica:Temperatura Alcoômetro= 95,7° CTeor de álcool (leitura da régua) = 5,4° GL

40mLdo mosto ¿↓ ¿

25mL deetanol ¿Balão V olumétricode50,00mL ¿

Com isso, vemos que o fator de diluição (FD) é:

FD=5040

=1,25

Com a utilização dele, efetuou-se a correção do valor de teor de álcool obtido pela leitura da régua que acompanha o alcoômetro:

Teor deálc ool=Valor da leituradarégua × FD

Teor deálcool=5,4×1,25

Teor deálcool=6,75 °GL

Sabendo que Grau Gay-Lussac (° GL) equivale ao volume de álcool em 100 mL de solução, calculou-se o volume de álcool em 50 mL, ou seja, o volume prático obtido de álcool:

6,75mL ↔ 100mLV Etanol ↔ 50mL

V Etanol=6,75× 50

1003,38mL

Através da comparação entre o volume de etanol teórico e o volume prático pode-se determinar a eficiência do processo de fermentação:

5,39mL ↔ 100%3,38mL ↔ x

x=3,38×1005,39

=62,71 % deeficiência

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6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

Por meio da razão estipulada pelo procedimento da prática pode-se calcular a massa necessária de levedura para realizar a fermentação dos 120 mL do mosto.

O Bico de Bunsen foi utilizado para fazer uma esterilização do meio próximo ao local onde foram realizadas as transferências e do bocal do erlenmeyer, causando assim um aquecimento do ar contido dentro do mesmo e matando assim outros microorganismo que poderiam influenciar de maneira negativa a fermentação.

Efetuou-se a pesagem do conjunto utilizado, composto pelo erlenmeyer, Dispositivo de Alwood e pelo mosto, antes e depois da pesagem a fim de determinar a massa de CO2 que foi liberada durante o processo, pois a diferença entre as massas do conjunto equivale a massa de CO2.

Mediu-se também a concentração de sacarose presente no mosto por meio de um refratômetro devidamente calibrado. A concentração encontrada antes do processo de fermentação foi de 10,5° Brix, sendo que este valor não precisou ser corrigido, pois a solução se encontrava na mesma temperatura de referência da calibração do aparelho. Já a concentração após a fermentação, determinamos uma concentração de 3,4° Brix, valor que foi corrigido com a utilização da Tabela 2 para 3,9° Brix. Essa diferença apresentada entre os valores obtidos antes e depois da fermentação representa a quantidade de sacarose que foi convertida a etanol pela levedura durante o processo.

Através da concentração de sacarose consumida, que foi obtida pela diferença entre os valores antes e depois da fermentação (6,6° Brix), calculou-se o rendimento teórico de etanol esperado no processo de fermentação, por meio da massa de sacarose convertida em etanol referente a essa concentração em 120 mL do mosto. Com esse valor e com o balanceamento da equação 1, calculou-se o que 7,92g poderia gerar teoricamente 4,26 g, ou 5,39 mL.

Para o cálculo do rendimento prático de etanol foi utilizado um ebuliômetro para se determinar a graduação alcoólica presente na mistura azeotrópica que foi destilada, onde se obteve o valor da temperatura 95,7° C, este valor é então convertido por meio de uma régua própria para a concentração em ° GL, sendo o valor encontrado de 5,4° GL. Como o destilado foi diluído antes de ser levado ao aparelho, o valor da concentração alcoólica foi corrigido em função do fator de diluição, obtendo-se 6,75° GL. Como Graus Gay-Lussac exprimem a concentração em relação ao volume de álcool para 100 mL de solução, calculou-se diretamente o volume de álcool obtido no processo de fermentação.

A eficiência do processo foi feita por meio dos volumes obtidos pelo rendimento teórico e pelo rendimento prático. Por meio desses valores, viu-se que produção de etanol teve uma eficiência de 62,71% em relação ao teórico, que é 100%.

7. CONCLUSÃO

Podemos concluir que o processo de fermentação realizado apresentou eficiência satisfatória.

8. REFERÊNCIA

CINÉTICA E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO FERMENTADO DO PSEUDOFRUTO DO CAJU (ANACARDIUM OCCIDENTALE L.). Disponível em: < http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-40422006000300015>. Acessado em: 22/05/2009 às 12h19min.

Disponível em: <http://cienciaxpto.freehostia.com/Artigos/Fermalc.htm>. Acessado em: 22/05/09 às 13h08min.

7

Disponível em:<http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_grad/trabalhos_grad_2006-1/alcool.ppt>. Acessado em: 23/05/2009 às 15h48min

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