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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Relación epitelio-conectivo en laRelación epitelio-conectivo en lacarcinogénesis experimental bucal:carcinogénesis experimental bucal:variaciones de ploidía variaciones de ploidía epitelial enepitelial en
relación a la expresión del factor derelación a la expresión del factor decrecimiento fibroblástico-básico ycrecimiento fibroblástico-básico y
fibrosisfibrosis
Raimondi, Ana Rosa
2003
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Raimondi, Ana Rosa. (2003). Relación epitelio-conectivo en la carcinogénesis experimentalbucal: variaciones de ploidía epitelial en relación a la expresión del factor de crecimientofibroblástico-básico y fibrosis. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de BuenosAires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3636_Raimondi.pdf
Cita tipo Chicago:Raimondi, Ana Rosa. "Relación epitelio-conectivo en la carcinogénesis experimental bucal:variaciones de ploidía epitelial en relación a la expresión del factor de crecimiento fibroblástico-básico y fibrosis". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires. 2003. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3636_Raimondi.pdf
Tesis Doctoral
Relación epitelio-conectivo en la carcinogénesisexperimental bucal:
Variaciones de la ploidia epitelial en relación a la
expresión del factor de crecimiento fibroblásticobásico y fibrosis
Autor: Lic. Ana Rosa Raimondi
Director: Dra. M. E. Itoiz
Laboratorio de I-Iistoquírnica,Cátedra de AnatomíaPatológica, Facultad de Odontología, Universidad de Buenos
Aires.
3636n— A.
Universidad de Buenos AiresFacultad de Ciencias Exactas y Naturales
Buenos Aires, noviembre de 2003
a papá
'mnICE
A J o oÜ
Resumen en
Resumen en inglés
Abre.’ ‘Y...)
0€»th
Caracteristicas generales de las neoplasias malignasCarcinogénesis 12Agentes 12
Modelosparadignfdíax en el estudio de la cardnogénesis 14Factoresde aedm'ento yoánoer 16
Familiasde factoresde aedmierto reladmadas al tánoer 17Receptores de factores de crecim'ento 21
Interacción epitelio-mesénquima 22
Cáncer de Cabeza y Cuello: Cáncer Bucal 25Cánoerbua-¡I 25
EpiderriologíayEio/ogía 25Biologíadel cánaar bucal 29
Cadnogénesís bucal:'Camfizadán de mmpo' 30Pdologv'adel cáncer bucal 33
inonec pre-neoplásimsde la cavidadbad 34Modelosde cáncer bucal 36
Objetivos 38
Sección I-a 39
Reproducción del modelo de la bolsa de la mejilla del hámster. Análisis macro ymicroscópico.
Introducción 39Objetivos 43Materiales y métodos 43Resultados 44Conclusiones 49
Sección I-b 51
Variacionesde la ploidía epitelial en la carcinogénesis de la bolsa de la mejilla delhámster
Introducción 51Ajuste metodológico del Análisis de ploidia 52Anáisis de Ia Ploiaïa 53
Objetivos 5 7Materiales y métodos 58
Ajuste metodológico del Análisis de ploidía 58Anáisis de la Ploicfia 61Anáisis Estadsfioo 63
Resultados 63Aiuste"Hoddógioo del Análisisde ploidía 63Análisis dela PIoiaïa 65
Camízaa‘ón durantetiemposlargos (desarrollode tunores) 66
Cmoelizaa'ón en tienpos irtenneaïos (lesionespre-neoplásims) 68Conclusiones 71
Sección I-c 72
Análisis de lafibrosis inducida en el conectivo subyacente al epitelio transformado.Introducción 72
Objetivos 74Materiales y métodos 74
Témica de Piero Sirius-Red 74alantificadón 75Análisis Estadistica 76
Resultados 77Conclusiones 81
Sección II-a 82
Expresión delfactor de crecimientoflbroblástico-básico.Introducción 82
Elfadord: ' '4 " " bá’dccfiFGF) 85ReoeptoresdeFGFs 88
Objetivos 89Materiales y métodos 89
1 da’ b-FGF 90Determinación inmunoh‘stoquímicade los FGFR- 2 y 3 91Determinadür dd b-FGFpor westemblds 92Andisis Estadístico 95
Resultadm 95
Expresión de FGFR 2 y 3 103Conclusiones I08
Sección II-b 109
Estudio delfactor de crecimientode endotelios vascularesy la actividadproteollticaIntroducción 109Objetivos l l lMaterialesy métodos l ll
r . . .1 . L. . .1 dd VEGF 111
Zimogamas 113Resultados l 14
Emesión ¡mndüdoquínim del VEGF114Resultados preliminaes sobre edividad ploteo/¡tien 118
Conclusiones l 19
Discusión 120
Conclusiones 129
Bit" a ti. 132
AGRADECMIENTOS
Ala Dra. María Elina ltoiz, mi directora de tesis por introducirme y guiarme en el mundode la anatomía patológica, por permitirme crecer en el laboratorio y por el afecto querecibí todos estos años.
Al Dr. R. L. Cabrini por sus críticas y consejos.
A Víctor Hugo por ser mi compañero de laboratorio todos estos años.
A Mariana por sus consejos y compañía de todos estos años.
A mis compañeros de laboratorio, Miguel, Luisa, Ana, Sara y Pablito, por compartir tantosalmuerzos, charlas, alegrías y frustraciones.
A la Dra. M. B. Guglielmotti por su constante apoyo y consejos.
A todo el personal docente y no docente de la Cátedra de Anatomía Patológica porhaberme hecho sentir acompañada todos estos años.
AI Dr. A. Molinolopor sus ganas, consejos y apoyo constante.
A los directores del laboratorio de Carcinogénesis Hormonal del lByME,Drs. A. MolinoloyC. Lanari, por haberme facilitado los anticuerpos utilizados en este trabajo para el estudiode los receptores del FGF.
A Marina por haberme enseñado y ayudado con el estudio de la actividad enzimática ypor su buen humor constante.
A las chicas del lByME,Caro, Vicky, Rocío, Cecilia y María, por los almuerzos y matescompartidos entre las largas horas de espera entre inmuno e inmuno.
Ala gente del departamento de Radiobiologíade CNEAdonde pasé muchas horascuantificando ADN por su compañía y aliento, principalmente a Mandy.
A Silvi y Erika mis compañeras de CNEA.
A mamá, Diego y Mariana por acompañarme, como siempre.
A Juan por todo y más.
RESUMEN
El modelo de la bolsa de la mejilla del hámster muy aceptado y utilizado. reproduce la
cancerización de la boca humana y una fibrosis subepitelial semejante a la fibrosis de
la submucosa. En el se han analizado extensamente las características de los tumores
que produce, pero se ha prestado menos atención al estudio de las etapas previas a la
aparición de tumores. Las neoplasias que se observan en el modelo se dan en forma
focal, precedidas por lesiones pre-malignas muitifocales, en una clara manifestación
de la instalación de un campo cancen'zado al igual que en la boca humana. Dado que
el carcinoma de la mucosa bucal ha mantenido su incidencia y sus bajos índices de
sobrevida durante los últimos 20 años parece importante disponer de un modelo
experimental bien caracterizado para su estudio. Aproximadamente el 90% de los
cánceres humanos son carcinomas. por lo cual resulta de interés que el abordaje del
estudio de la biología de los carcinomas sea desde la perspectiva de la interacción
epitelio-mesénquima. En base a estas observaciones, el objetivode esta tesis doctoral
fue el de estudiar los cambios que subyacen a la transformación maligna del epitelio, a
través del análisis de ploidía y la desregulación de la interacción epitelio-conectivo,
caracterizándola por medio del estudio de los cuadros fibrosos subyacentes al epitelio
transformado. Tratando de aportar datos que pudieran ser trasladados a Ia biología de
las lesiones pre-malignas humanas y a la búsqueda de marcadores de cancerización
de campo. Para ello describimos las áreas NUMF(epitelios histológicamente normales
pero cancerizados) que configuran los cuadros propios de la cancen'zación de campo.
Como primer paso en el estudio de la interacción epitelio-conectivo evaluamos a
través del análisis de ploidía las alteraciones epiteliales, cuantificamos las áreas
NUMF, pre-neoplásicas y neoplásicas. encontrando que las zonas NUMFpresentan
un mayor contenido de ADN respecto de la mucosa normal a las 16 semanas de
tratamiento. Para analizar las alteraciones en el tejido conectivo caracterizamos los
cuadros desmoplásicos a través de la cuantificación de las áreas de fibrosis.
Encontramos que la fibrohilalinosis aparece muy precozmente, antes que se
evidencien cambios morfológicos en el epitelio transformado (a las 7 semanas de
tratamiento, subyacente a las áreas NUMF) se presentan volúmenes de fibrosis
aumentados significativamente respecto de la mucosa normal. Luego analizamos la
expresión del FGF-2 durante el proceso, tratando de relacionado con los cuadros
fibrosos. Encontramos que las variaciones en la expresión del FGF-2 en el tejido
epitelial coinciden con Ia evolución de la fibrosis subepitelial en las etapas tempranas y
que los carcinomas expresan en muy baja cantidad el factor o no lo expresan (se
observó una regulación a través de la isofonna de 18 kd del factor). Encontramos
expresión de los receptores 2 y 3 del FGF en el tejido epitelial y conectivo en las
lesiones pre-malignas y expresión irregular de los mismos en los tumores. Finalmente
analizamos si existía expresión de VEGF en el modelo. El VEGF presentó un cambio
de su patrón de expresión en el epitelio en relación a los cuadros fibrosos durante las
etapas pre-neoplásicas. También estudiamos si existia actividad proteolitica,
encontrando un patrón de actividad correspondiente al de las MMP-2 y 9 en las
etapas tempranas. El análisis conjunto de los resultados expuestos en esta tesis nos
lleva a considerar que ni el b-FGF ni el VEGF tendrían un rol preponderante en el
proceso angiogénioo general de este modelo, ni en los tumores, pero el b-FGF tendn'a
un rol importante en la producción de fibrosis, de gran magnitud en las etapas
tempranas. Tanto el factor como los cuadros desmoplásicos disminuyen desde las
etapas intermedias en adelante, revelando su influencia en la dismpción temprana de
la interacción epitelio-conectivo. Por lo tanto, la fibrosis junto a la ploidia de las áreas
pre-neoplásicas son una manifestación temprana de la cancerización de campo.
ABSTRACT
The hamster cheek pouch carcinogenesis model is universally accepted and wider
employed as a model of human oral cancer. It closer mimics human oral
carcinogenesis and exhibits a subepithelial fibrosis that resembles the fibrosis of the
submucosa. The tumors that develop as a result of the carcinogenesis protocols have
been extensiver studied. However, the earlier stages of malignant transformation
have been less studied. Foci of neoplastic growth are preceded by multifocal
premalignant lesions that evidence the presence of field canoen'zed tissue as occurs in
the human oral cavity. Given that the incidence and low survival rate of oral carcinoma
have remained unchanged over the last 20 years. a well characterized experimental
model to study the different aspects of this pathology is of great value. Approximately
90% of all human cancers are carcinomas. Within this context it is interesting to
address carcinoma biology from the viewpoint of epithelium-mesenchyma interactions.
Based on these observations, the aim of the present PhD Thesis was to study the
changes that underlie epithelial malignant transformation employing ploidy analysis
and the evaluation of the deregulation of the interaction between epithelium and
connective tissue. We characterized this interaction by evaluating the fibrosis that
underlies the transforrned epithelium. The particular aim was to contribute data that
may be applied to the biologyof human precancerous lesions and search for markers
of field cancerization. Vlfithinthis context we described NUMF areas (histologically
normal but cancerized areas of epithelium), characteristic of field cancerization. As the
first stage in our study of epithelium-connective tissue interactions we performed a
ploidy analysis of the different areas of epithelium, i.e. NUMF, pre-neoplastic and
neoplastic epithelia. We showed that the DNA content of NUMF epithelium at 16
weeks of treatment was larger than that of normal epithelium. We analyzed the
changes in connective tissue in terms of desmoplastic features by quantitative
evaluation of areas of fibrosis. We demonstrated that fibrohyalinosis appears very
early on in the process of malignant transformation before the morphological changes
become apparent in the transfonned epithelium. At 7 weeks of treatment significantly
larger volumes of fibrosis were detected underlying NUMFareas than those underlying
normal tissue. We also analyzed the expression of FG-2 during the process and the
association with fibrosis. We found that variations in the expression of FG-2 in
epithelial tissue conelate with the evolution of subepithelial fibrosis in the early stages
and that carcinomas express the factor very littleor not at all (we observed regulation
via the 18 kd isofon'n of the factor). We detected expression of receptors 2 and 3 of
FG-2 in the epithelium and the connective tissue in precancerous lesions and irregular
expression in tumors. We also examined the expression of VEGF in the model. VEGF
evidenoed a change in its expression pattem in the epithelium above areas of fibrosis
that appear dun'ng the preneoplastic stages. The analysis of proteolytic activity
revealed patterns of activity corresponding to MMP-2 and 9 in the early stages. A
comprehensive analysis of the data presented in the present Thesis suggests that b
FGF and VEGF do not play a central role in angiogenesis in this model or in tumors. b
FGF would have an important role in the induction of fibrosis, a process which is
particularly important in the early stages. Both the factor and the desmoplastic features
decrease from the intermediate stages onwards, revealing their influence on the early
disruption of the interaction between epithelium and connective tissue. In this way,
fibrosis and ploidy in preneoplastic areas would be an early manifestation of field
cancerization.
ABREVIATURAS
a-FGF: factor de crecimiento fibroblástico ácido
b-FGF, FGF-2: factor de crecimiento fibroblástico básico o factor de crecimientofibroblástico 2
BrDu: 5-bromo-2'-deoxiuridina
Ca: carcinoma
CCC: cáncer de cabeza y cuelloCCE : carcinoma de células escamosasCCEB : carcinoma de células escamosas bucal
CCECC: carcinoma de células escamosas de cabeza y cuelloCIS: carcinoma in situ
D: displasia
DMBA:7,12-dimetilbenz(a)antraceno
EGF: factor de crecimiento epidérmico
EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmicoFC: factores de crecimientoFGF: factor de crecimiento fibroblástico
FGFR: receptor del factor de crecimiento fibroblástico
GAG, glucosaminoglucanosGMS: grado de marcación suprabasal
H: hiperplasia|F2: indice de fibrosis 2
IGF: factor de crecimiento similar a insulina
IHQ: inmunohistoquímica
LI: índice de proliferación celularMEC: matriz extracelular
MMP:metaloproteasa de matriz
NUMF: epitelio cancen'zado de aspecto morfológico normal (por sus siglas en inglés: nounusual microscopiofeatures).
OSMF: fibrosis de Ia submucosa bucal
PDGF: factor de crecimiento derivado de las plaquetasPREN: pre-neoplásicasTADS: tracto aero-digestivo superiorTGF-a: factor de crecimiento transformante-a
TGF-B: factor de crecimiento transformante-BVEGF: factor de crecimiento de endotelios vasculares
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS NEOPLASIAS MALIGNAS
Por su etimología neoplasia significa “nuevo crecimiento", entendiendo por "nuevo"
un crecimiento "autónomo", es decir independiente de las señales regulatorias que
impone normalmente el micro-ambiente tisular. Una célula anormal aislada que no
prolifere mas que sus vecinas normales, puede ser controlada por sistemas
homeostáticos, sean cuales fueren las otras propiedades desviadas que pueda tener;
pero si su proliferación esta fuera de control, producirá una masa de células o tumor
(Brugge y col., 1991). La palabra latina tumor se utilizaba en un principio para referirse a
cualquier tumefacción tisular, y actualmente solo se usa como sinónimo de neoplasia.
Realmente fue y es dificil encontrar una definición adecuada para el término
neoplasia. Se puede comenzar con definiciones clásicas como la de Willis,quien en 1952
(VWllis,1952) afirmaba que: “ una neoplasia es una masa anormal de tejido, cuyo
crecimiento excede y carece de coordinación con el de los tejidos normales y
persiste en forma similar luego de cesado el estímulo que le dio origen".
En ésta definición Willis incorpora varias diferencias vitales entre neoplasia y otros
tipos de crecimiento. Primero, el crecimiento es anormal. En muchos puntos del desarrollo
normal, algunos grupos de células proliferanmás rápidamente que sus vecinas, y pueden
también mostrar nuevas propiedades como Ia capacidad de infiltrarse entre las
estructuras adyacentes. Un ejemplo de esto es el trofoblasto. Pero este tejido es normal y,
por último, el hecho de que su crecimiento está estrechamente regulado es obvio. El
crecimiento neoplásico persiste después de la remoción del estímulo inicial. Willis indicó
esto para distinguir neoplasia de hiperplasia reactiva o la proliferación celular inducida por
la reacción inflamatoria y Ia cicatrización, las cuales son reversibles.
A aquella definición se le fueron agregando otros conceptos tales como el de que
esa masa anormal crece desde su inicio sin finalidad positiva para el organismo, es
autónoma y compite por nutrientes con las células normales. La idea de su autonomía
también fue discutida debido a que las neoplasias necesitan de los nutrientes del huésped
e incluso algunos tumores necesitan soporte endócrino.
Estas características y las enunciadas por Willis, son comunes a los tumores
benignos y malignos. Pueden asimismo, establecerse en forma general características
introducción 10
diferenciales entre ambos tipos tumorales. Así, por ejemplo los tumores benignos crecen
más lentamente, se rodean de una cápsula conectiva o establecen un plano de clivaje
entre ellos y los tejidos circundantes y están formados por células casi idénticas a las de
los tejidos normales. Pero en todas estas propiedades se encuentran excepciones cuando
se analizan las entidades en particular. Desde el punto de vista clínico, la diferencia
fundamental es que los tumores malignos, o cánceres, liberados a su evolución
espontánea, terminarán con la vida del portador y los tumores benignos pueden nohacerlo.
Desde el punto de vista biológico las células cancerosas se caracterizan por dos
propiedades hereditarias: ellas y su progenie se reproducen a pesar de las restricciones
normales, e invaden y colonizan tern'ton'osnormalmente reservados para otras células (De
Vita y col., 1993).
El crecimiento desmedido de una población de células neoplásicas es el rasgo
fenotipico más relevante. No obstante, la capacidad de invadir tejidos circundantes y
abandonar el sitio primario constituye un atributo biológico tan importante como el
anterior, que en la mayor parte de los casos determina el pronóstico del individuo
portador. La conjunción de ambas propiedades condiciona las dos características clínicas
mas importantes de los tumores malignos: infiltracióny metástasis.
Las células cancerosas adquieren estas características a través de acumulación de
mutaciones que finalmente conducen a un fracaso de los mecanismos que controlan
normalmente Ia proliferación y maduración celular. Como resultado de la alteración en los
controles del ciclo celular las células neoplásicas tienen en muchos casos cantidades
anormales de ADN y de proteínas citoplasmáticas anómalas, que se traducen
morfológicamente en cambios de forma, volumen y afinidad tinton'al, conocidos como
“atipías”.
La evolución de este proceso, desde la alteración a nivel celular hasta el
desequilibrio a nivel de tejido u órgano con la instalación de un tumor maligno que
finalmente excederá el lugar de origen, se denomina carcinogénesis.Otra característica de las células tumorales es su tendencia a la indiferenciación.
Tras Ia división celular, a partir de un precursor o célula madre, las células normales
asumen una función específica, que implica el desarrollo de estructuras especializadas
como filamentos de queratina, vacuolas mucinosas, microvellosidades o cilios, lo que se
conoce como diferenciación. Mientras las células madre son indiferenciadas, la célula
completamente madura de cualquier tipo celular está altamente diferenciada (figura 1).
introducción 11
,."wimlwmlfi
a diferenciación terminal
FlGURA1
Representación esquemática del control normal y alterado en la producción de células a partir de célulasmadre. a) Proceso normal de diferenciación celular. b) y c) Dos fipos de alteraciones distintas en la diferenciación quepueden producir proliferaciónalterada. El caso c) representa el efecto de una velocidad excesiva de división celular enuna célula madre.
Junto con la pérdida de la regulación del crecimiento celular, las células malignas no
suelen alcanzar su diferenciación final. Así como, las células de las neoplasias benignas
están diferenciadas hasta un punto que se corresponde estrechamente con el de las
células de las que derivan, en las neoplasias malignas pueden observarse distintos
grados de diferenciación:
o neoplasia maligna diferenciada (cuando una proporción importante de las
células que la forman alcanzan la maduración propia del tejido de origen)
o neoplasia maligna pobremente diferenciada (cuando las células tumorales
muestran grados intermedios de maduración)
o neoplasia maligna anaplásica (cuando la indiferenciación es de tal grado que se
hace dificil morfológicamente identificar el tejido de origen).
Todos los tumores, benignos y malignos, poseen dos componentes básicos: 1
células proliferantes neoplásicas que constituyen el parénquima tumoral y 2- estroma de
soporte formado por tejido conectivo y vasos sanguíneos. Las células neoplásicas, al igual
que las normales, interaccionan con los tejidos de sostén e inducen la formación deestroma. Los tumores desarrollan un estroma vascular mediante la secreción de factores
angiogénicos. La capacidad del tumor de inducir y mantener su aporte vascular
representa un factor fundamental para su crecimiento. Una masa tumoral, por tanto,
contiene células neoplásicas genéticamente anormales y un componente de tejidos desostén normales.
introducción 12
En los cánceres de origen epitelial, o carcinomas, como el estudiado en el presente
trabajo, suele haber una distinción clara entre parénquima y estroma fácilmente
identificable histológicamente. Los cánceres de origen conectivo, o sarcomas, se originan
generalmente en uno de los tipos celulares mesenquimáticos y las células neoplásicas
proliferan entre las demás células conectivas por lo que la distinción morfológica entre
parénquima y estroma puede no ser tan neta.
CARCINOGÉNESIS
Es ampliamente aceptado que la carcinogénesis es un proceso de pasos múltiples
que involucra una serie de alteraciones genéticas y epigenéticas, las cuales actúan
activando oncogenes e inactivando genes supresores de tumor. Esas mutaciones se
acumulan en las células y llevan al cambio de su comportamiento, de un crecimiento
normal a uno sin restricciones, el cual puede conducir a Ia invasión del tejido circundante
y a la producción de metástasis (Wu y Pandolfi, 2001). Este proceso de pasos múltiples
ha podido ser identificado en observaciones clínicas, epidemiológicas y experimentos delaboratorio.
Sorprendentemente, el intrincado proceso que implica la iniciacióny la progresión de
un cáncer, depende de la acumulación de mutaciones que guardan semejanzas
asombrosas entre las distintas variantes tumorales. Aunque las neoplasias son muy
diferentes de acuerdo con el tejido donde se originan, la localización anatómica o su
manifestación clínica, los daños moleculares que las iniciaronsuelen ser similares.
Los cambios genéticos más tempranos que ponen en marcha la carcinogénesis
dependen de factores ambientales -a veces alteraciones intrínsecas heredadas- y, al
parecer, fomentan la inestabilidad de todo el genoma. Por Io general se acepta que las
neoplasias tienen un origen clonal. Mientras se expande la población derivada de la
primera célula portadora de daños genéticos irreparables, se van acumulando nuevas
alteraciones en genes específicos, que confieren ventajas adaptativas para proliferar
indiscriminadamente y finalmente, invadir los tejidos normales vecinos.
o Agentes Carcinggénicos
La correlación entre carcinogénesis (la generación de cáncer) y mutagénesis (Ia
producción de un cambio en la secuencia de ADN)está clara para tres tipos de agentes:
introducción 13
los carcinógenos químicos (que habitualmente causan simples cambios en la secuencia
de nucleótidos), las radiaciones ionizantes, como los rayos X (que típicamente causan
roturas de cromosomas y translocaciones) y los virus (que introducen en las células ADN
ajeno).
Ya que en éste trabajo se utilizó un carcinógeno químico analizaremos éstos endetalle.
El origen de los carcinógenos químicos es variado; algunos son productos naturales,
presentes en vegetales, microorganismos y combustibles fósiles, mientras que otros son
productos sintéticos industriales o, inclusive, utilizados en Ia medicina. Estos carcinógenos
forman uniones covalentes con muchos elementos celulares, aunque es la interacción
directa con el ADNla que se asocia con la capacidad de inducir tumores a través de sus
propiedades mutagénicas. Los agentes alquilantes y acilantes se comportan como
carcinógenos directos, el resto de las sustancias identificadas son pro-carcinógenos y
requieren de su activación metabólica en el organismo.
Se considera que la transformación neoplásica inducida por carcinógenos químicos
sigue una serie de pasos, donde los linajes sucesivos de una población celular sufren
exposiciones repetidas a agentes iniciadores y promotores de cáncer. Los carcinógenos
químicos iniciadores son mutagénicos y sus acciones son irreversibles, mientras que los
promotores no alteran al ADNy sus efectos en ausencia de células iniciadas se revierten
después de un tiempo. Los agentes promotores estimulan la proliferación celular y en
general por si mismos son solo hiperplasiantes, pero en presencia del gen mutado por
acción del agente iniciadoro mutagénico favorecen su expresión.
La iniciación y la promoción forman parte del periodo pre-neoplásico de Ia
transformación cancerosa, en el cual la población celular altera su recambio, pero el
proceso todavía puede revertirse si cesa la exposición a los agentes carcinogénicos.
En un determinado momento, cuando se acumulan los cambios genéticos
suficientes, tiene lugar la conversión neoplásica. La población celular entonces adquiere
un crecimiento descontrolado y autónomo, que ya no se revierte aun con la desaparición
de los factores causales (tabla 1) (Nowell, 1986; Root-Bernstein, 1992).
introducción 14
CÉLULA NORMAL
. . .. Exposición a carcinógenos iniciadores1- '"'°'a°'°" CELULAINICIADA
.. Exposición crónica a carcinógenos promotores2- Pr°m°°'°" LESIÓNPRENEOPLASICA
., Cambios genéticos suficientes3- C°"Ve'5'°" NEOPLASIABENIGNAo lNsrru
Inestabilidad genómica, cambios adaptativos,selección de subpoblaciones
NEOPLASIA INVASIVA
Inestabilidad genómica, cambios adaptativos,selección de subpoblacionesCANCER METASTASICO
4. Progresión
TABLA 1
Serie de cambios acumulativos involucrados en la carcinogénesis y la progresión neoplásica.
o Modelos paradigmáticos en el estudio dela carcinggénesis
Cada tipo de cáncer humano en que se ha estudiado el proceso carcinogénico
reveló múltiples alteraciones genéticas que involucraban la activación de distintos
oncogenes y la pérdida de dos o más genes supresores. Cada una de esas alteraciones
representa un paso crucial en la progresión de un tejido normal a uno tumoral. Existen dos
ejemplos ya clásicos y paradigmáticos en la literatura científica. Estos han aportado
muchos datos y siguen haciéndolo, en el avance del entendimiento de la patogenia del
cáncer. Es relevante el hecho de que en esos modelos se correlacionan
morfológicamente y molecularrnente los distintos pasos de Ia tumorigénesis.
Uno de ellos es modelo de la carcinogénesis de cáncer de colon humano. En el
cáncer de colon las mutaciones que inactivan al gen APC (Adenomatous Polyposis Coli)
parecen ser las primeras, o al menos corresponden a una etapa muy temprana. Pueden
ser detectadas en pequeños pólipos adenomatosos benignos con la misma frecuencia
elevada que en los tumores malignos. Su efecto sería el de incrementar la velocidad de
proliferación en relación a la velocidad de pérdida de células, sin afectar Ia forma en que
las células se diferencian o los detalles del patrón histológico. Las mutaciones que activan
al oncogén ras ocurren un poco más tarde, son raras en los pólipos pequeños pero son
comunes en los grandes que ya presentan alteraciones en la diferenciación celular y en el
patrón morfológico, si bien mantiene sus signos morfológicos de adenoma. Las
mutaciones en DCC (delecionado en carcinoma de colon) y en p53 se producen más
tarde. Son raras en pólipos pero comunes en tumores malignos. La pérdida de p53 nativa
libera a las células mutantes de sus últimas inhibiciones. No solo proliferan libremente sin
control sino que también acumulan más mutaciones a rápida velocidad dado que
progresan en el ciclo celular cuando no están preparadas para hacerlo. El resultado
morfológicoes un adenocarcinoma (Fearon y Vogelstein, 1990).
El segundo ejemplo es uno de los modelos mejor establecidos de tumorigénesis: Ia
carcinogénesis experimental en la piel de ratón. La aplicación secuencial de carcinógeno,
seguida por el tratamiento con un promotor no carcinogénico pueden inducir eficazmente
tumores de piel. Ese esquema de cancerización ha permitido establecer 3 etapas en el
desarrollo tumoral: iniciación, promoción y progresión (Yuspa, 1998; Akhurst y Balmain,
1999).
En este modelo, la iniciación se produce por aplicaciones tópicas de una dosis
simple sub-carcinogénica de 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA).El tratamiento causa
un daño irreversible en el ADN, que resulta en la mutación del onoogen Ha-ras de las
células epidérmicas (Quintanilla y col., 1986; Bizub y col., 1986). La promoción se realiza
con aplicaciones repetidas de una sustancia promotora para la piel, las mas comunes son
los ésteres de forbol como el 12-O-tetradecanoyl-forboI-13-acetato (TPA). Aunque la
mayoria de los promotores tumorales no se unen covalentemente al ADN y no son
mutagénicos per se, ellos producen una sen'e de cambios celulares y bioquímicos como
por ejemplo el aumento de la actividad de la proteína quinasa C (PKC), el aumento de Ia
expresión del factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), y los factores de
transcripción c-Jun y c-Fos, los cuales tienen una conexión directa con la regulación del
crecimiento y diferenciación celular (Yuspa, 1998). Esto conduce a una expansión cional
selectiva de las células epidérmicas iniciadas y lleva a la formación de múltiples
papilomas. La etapa de progresión es generalmente un proceso espontáneo,
caracterizado por inestabilidad genómica, en particular las alteraciones cromosomales
identificadas en el modelo resultan en una elevada expresión de los genes que codifican
Ha-ras y la ciclina D1 y la pérdida de la expresión del gen supresor de tumor p53 (Kemp y
co|., 1993a; Kemp y col., 1993b) (figura 2).
Estos cambios le confieren a las células del papiloma una ventaja de crecimiento, y
lo llevan a su conversión en un carcinoma escamoso. Este estado se asocia con cambios
en los marcadores de diferenciación epitelial, como una disminución en la expresión de E
caden'na, queratina K1 y un aumento en la expresión de la integrina (16134(Cano y col.,
1996).
El modelo de carcinogénesis de piel de ratón ha permitido establecer la relación
introducción 16
entre los cambios genéticos y las etapas histológicas de la carcinogénesis y actualmente
sirve de modelo para estudiar la función de muchos otros genes moduladores de este
proceso. Por ejemplo, al tratar con DMBAy TPA ratones deficientes en la ciclina D1 se ha
observado una disminución en el desarrollo de tumores, demostrando que esa ciclina es
un blanco importante de Ha-ras en Ia tumorigénesis de piel (Robles y col., 1998). También
utilizando ratones deficientes genéticamente para la proteína p53 se ha observado una
conversión mas rápida de papiloma a carcinoma revelando la importancia de p53 en el
proceso (Kemp y col_, 1993b).
DMBA TPA
células _c'éllulasepiteliales in¡ola d a s
carcinomal papiloma de Células
¡"má l _ escamosas
en H-ras ciclina D1 p53alteración mutación sobreexpresión inativación
FlGURA 2
Esquema de los distintos pasos característicos en el modelo de carcinogénesis química de la piel de ratón(Wu y Pandolfi, 2001).
o Factores de crecimiento y cáncer
Los organismos multicelulares poseen mecanismos finamente regulados para
controlar la interacción entre células. Esa compleja red de señalización regula el
desarrollo embriológico normal y es responsable de la respuesta sistémica a heridas e
infecciones. Los distintos elementos proteicos que participan en los mecanismos de
transducción de señales celulares se localizan, de acuerdo con su función, en distintos
compartimientos celulares. El extracelular para los factores de crecimiento, la membrana
plasmática, en el caso de muchos receptores, el citoplasma para diferentes proteínas
quinasas o el núcleo celular, para los factores transcripcionales que regulan en forma
directa la expresión de los genes.
En esa compleja red de señalización donde se cruzan diversos tipos de moléculas
señal incluyendo proteínas, pequeños péptidos, aminoácidos, nucleótidos, esteroides,
retinoides, derivados de ácidos grasos e incluso gases disueltos, se encuentran los
factores de crecimiento (FC). Es difícil buscar una definición de FC mas allá de Io que
implica su nombre, que describe su función. Pero entonces resulta útil recordar elcomienzo del desarrollo de los cultivos celulares. Cuando se cultivaban células de
mamíferos solo era posible el crecimiento -aún en medios que incluían glucosa,
introducción 17
aminoácidos y vitaminas- cuando se añadía suero. Luego de un tiempo se demostró que
los componentes fundamentales que aportaba el suero eran proteinas muy específicas a
las que se llamó factores de crecimiento (Pollack, 1981). Esas proteínas tienen en común
el poseer receptores de membrana, en general se sintetizan como precursores, son de
bajo peso molecular y poseen efecto biológico a muy bajas concentraciones (10'g a 10'11
M).
Desde el descubrimiento del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF)
(Westermark y Heldin, 1991) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Carpenter,
1981) se han identificado una gama muy amplia de factores que afectan al crecimiento de
los diversos tipos celulares. Estos factores pueden actuar modulando positiva o
negativamente Ia proliferación y diferenciación celular. La interacción de factores de
crecimiento, citoquinas y hormonas, con sus receptores desencadenan una cascada de
señales bioquímicas intracelulares que resultan en la activación o inactivaciónde diversos
genes. Las alteraciones genéticas en las vías de señalización de factores de crecimiento
están ligadas al desarrollo de diversas patologías. La relevancia de los distintos sistemas
de transducción en el control del “comportamiento social" en los organismos multicelulares
queda de manifiesto en las anomalías relacionadas al rembio celular que afecta a los
tejidos cancerosos.
Cuando una célula capta una señal de su entorno, luego de integrarla la transmite al
núcleo, donde se desarrollará la respuesta. Por ejemplo, para las señales mitogénicas
mediadas por factores de crecimiento el estímulo pone en marcha Ia duplicación del ADN
y la progresión del ciclo celular.
Existen varias clasificaciones para los FC. Se los puede agrupar en base a los
receptores con los que interactúan y el tipo de acción que desencadena su receptor, o sea
por el mecanismo de transducción de la señal. En otros casos se los relaciona con
distintos oncogenes, y se clasifican los proto-oncogenes que codifican FC de acuerdo a
como se descubrieron. También se los clasifica estrictamente en familias de acuerdo a la
homología en sus secuencias proteicas. Brevemente reseñaremos los principales factores
de crecimiento relacionados con la carcinogénesis.
o Familias de factores de crecimiento relacionadas al cáncer
1. Factor de crecimiento epidérmico y Factor de crecimiento transformante-a
introducción 18
El EGF es un polipéptido que estimula proliferación y diferenciación de diversos tipos
celulares in vivo e in vitro (Carpenter, 1981), mientras que el factor de crecimiento
transformante-a (TGF-a) es un mitógeno que fue aislado originalmentede sobrenadantes
de cultivos de fibroblastos transformados y comparte un 40% de homología en su
secuencia con el EGF (Massague, 1983). Ambos están ampliamente distribuidos en
tejidos humanos (Kajikawa y col., 1991) y se unen y activan al receptor del EGF (EGFR),
una proteína quinasa. El EGFR está codificado por el oncogén c-erbB (Downward y co|.,
1984). El EGF, el TGF-a y el EGFR se expresan ampliamente en células tumorales y
actúan en forma autócrina señalizando procesos tumorales (Hunter, 1984). Por ejemplo,
se ha reportado expresión de EGF y TGF-a en células de cáncer gástrico(Yoshida y col.,
1989a; Yoshida y col., 1990a) y expresión de EGFR en carcinomas de mama, laringe y
esófago entre otros (Yoshida y col., 1990b).
2. Factor de crecimiento transformante-B
Es miembro de una familia de al menos 5 citoquinas relacionadas estructuralmente,
(factor de crecimiento transformante-B, TGF-B 1 al 5), que producen respuestas biológicas
pleiotrópicas en diversos tipos celulares (Massague, 1990). Actualmente se sabe que esta
super-familia incluye varias formas de TGF-B, las proteínas morfogenéticas de hueso, y
las activinas, entre otros factores relacionados estructuralmente (Massague, 1998).
El TGF-B1, el primero de la familia en ser descubierto y el mas estudiado, se
describió originalmente como un factor que causaba transformación en células de riñón de
rata. Hoy se sabe que su efecto en muchos tipos celulares por el contrario es inhibitorio
(Moses y col., 1990). Se ha observado expresión de TGF-B en distintos tipos de
carcinomas, como por ejemplo los de pulmón, colon, mama y estómago (Derynck y col.,
1987; Yoshida y col., 1989b).
3. Factor de crecimientoderivado de las plaquetas
El PDGF fue uno de los primeros en ser caracterizado y relacionado con el cáncer.
Es un mitógeno muy potente para células de origen mesenquimático incluyendo
fibroblastos, células de músculo liso (Westermark y Heldin, 1991), y algunas células
neurogliales. Existen 3 subtipos, el proto-oncogén c-sis codifica la cadena B del PDGF.
Hace tiempo se ha descripto que diversos tumores humanos Io producen, por ejemplo
introducción ¡9
gliomas y carcinomas de colon (Tsuda y col., 1989b). También se ha observado que
algunos tumores expresan los receptores para PDGF y allí se observa estimulación
autócrina por parte del factor (Tsuda y col., 1989b).
4. Factor de crecimiento similar a insulina
El factor de crecimiento similar a insulina (IGF) es un polipéptido con alta similitud
estructural a la pro-insulina y existen por lo menos 2 tipos (IGF-1, IGF-2). Estimula
supervivencia y metabolismo celular e interactúa con otros factores en la estimulación de
la proliferación celular. Se ha reportado su expresión en carcinomas de mama, colon y
liposarcomas (Tn’coliy col., 1986; Cullen y col., 1990).
5. Factor de crecimiento fibroblástico
Los factores de crecimiento fibroblástico (FGFS) han sido descriptos como
estimuladores del crecimiento de fibroblastos y células epiteliales (Goldfarb, 1996). La
familia de los FGFs está formada por moléculas señalizadoras que participan en la
regulación de una amplia gama de funciones celulares (crecimiento, sobrevida, apoptosis,
motilidad, diferenciación), influyen en una gran variedad de procesos biológicos
(desarrollo, angiogénesis, metabolismo, reparación de heridas) en organismos muy
diversos, desde los gusanos hasta el ser humano (Jeffers y col., 2002). La secuencia del
FGF se ha conservado notablemente a Io largo de la evolución de los vertebrados. La
mayor parte de los FGFs presentan mas de un 90% de homología en la secuencia
principal (core) de Ia proteína en los mamíferos y mas de un 83% de identidad entre los
vertebrados (Coulier y co|., 1997).
La familia de FGFs humanos está compuesta por 22 miembros (Jeffers y col.,
2002). Cada uno posee una secuencia conservada de 120 aminoácidos en el dominio
central y pueden organizarse en 6 gmpos de acuerdo a su relación filogenética (Kim,
2001). Muchos de ellos tienen nombres alternativos debido a las diferentes circunstancias
en que se dieron sus descubrimientos.
Existen 9 miembros de la familia bien caracterizados, de los que se conoce que
comparten homología en el dominio principal de la molécula de entre un 30 a un 65%.
Estos factores se almacenan en la membrana basal unidos a heparina y esto los
protege de la degradación por enzimas proteolíticas, haciendo así posible la existencia de
introducción 20
un reservorio de FGF. Se liberan por clivaje enzimático de los componentes de la matriz
extracelular (MEC)a través de proteasas o heparanasas.
Del FGF-3 al 9 se sabe que son secretados constitutivamente y en la mayoría de los
casos son glicosilados (Goldfarb, 1996). Su secuencia homóloga, el core de 120
aminoácidos, es la responsable de una estructura terciaria en común entre los FGFs así
como de la habilidad de los FGFs de unirse con alta afinidad a glucosaminoglucanos
(GAG) como la heparina o el heparán sulfato (Shing y col., 1984; Burgess y col., 1986;
Faham y col., 1996).
Los péptidos mejor caracterizados son el FGF básico y ácido (b-FGF y a-FGF
respectivamente). Comparten la mayoría de las características de la familia pero difieren
del resto de los FGFsen que no presentan una secuencia consenso de secreción celular
(en la sección II-a se continúa con los antecedentes sobre b-FGF y su relación en
procesos carcinogénicos).
Ya hemos mencionado que un elemento de suma importancia en la patogenia del
cáncer es la alteración en el control de la proliferación celular, por lo tanto los FGFS, al
igual que otros factores de crecimiento, están involucrados en la tumorigénesis. Es asi
que trabajos con células de mamíferos inmortalizadas revelaron que distintos FGFs son
capaces de inducir desregulación en el crecimiento y transformación de esas células in
vitro y resultaron tumorigénicas al implantarlas en animales inmunosuprimidos (Taira y
col., 1987; Matsumoto -Yoshitomi y col., 1997; Ropiquet y coI., 1999; Jeffers y col., 2001).
La sobre-expresión de FGFs mitogénicos en animales transgénicos induce hiperplasia así
como tumores malignos y benignos. Animales transgénicos para FGF-8 han desarrollado
neoplasias de glándulas salivales e hiperplasia ovárica (Daphna-Iken y co|., 1998). De
carcinomas gástricos humanos se ha aislado el gen hst-1 (FGF-4) (Yoshida y col., 1987).
Este gen y el del FGF-3 están amplificados en cánceres de esófago (Tsuda y col., 1989a).
6. Factor de crecimientode endotelios vasculares
El factor de crecimiento de endotelios vasculares (VEGF)comparte homologia en su
secuencia aminoacídica con el PDGF (Keck y col., 1989). Promueve la formación de
vasos sanguíneos en el desarrollo embrionario (vasculogénesis) y luego del desarrollo en
diversos procesos fisiológicos como por ejemplo la reparación de heridas y los estados
inflamatorios crónicos. Cumple un rol preponderante en la angiogénesis tumoral y se ha
estudiado su expresión en variedad de tumores humanos (Salven y co|., 1998). (en la
introducción 21
sección ll-b se analizaran más detalles sobre la actividad de éste factor).
o Receptores de factores de crecimiento
Los mecanismos por los cuales una célula influye sobre el comportamiento de otra
implicanun sistema de transducción de señales desde la célula productora del estímqu a
la célula blanco. Sea cual fuere la naturaleza de Ia molécula señal, la célula blanco
responde mediante un receptor específico. Este puede ubicarse en distintos
compartimientos celulares. En la superficie celular se conocen tres clases de proteínas
receptoras. Ellas son las asociadas a canales iónicos, las asociadas a proteínas G y las
asociadas a enzimas. Los receptores asociados a enzimas, son proteínas transmembrana
cuya región de unión al Iigando se halla en el dominio extracelular. Poseen un dominio
citosólico que tiene actividadenzimática o están asociados a una enzima.
Existen 5 tipos de receptores asociados a enzimas:
Los receptores guanilato ciclasa.
Los receptores tirosina quinasa.
Los receptores asociados a tirosinas quinasas.
Los receptores tirosina fosfatasa.
.U‘PP’.“ Y los receptores serina-treonina quinasa.
Los receptores para Ia mayoría de los factores de crecimiento descriptos son
proteínas transmembrana que presentan actividad de proteína tirosina quinasa específica
(Clark y col., 1992). La primera proteína receptora que se reconoció que presentaba esa
actividad fue el receptor del EGF y luego se describió la misma actividad para el receptor
del PDGF, de los FGFs, y el lGF-1. En cada caso los receptores se fosforilan a si mismos
para iniciar la cascada de señalización intracelular.
Una excepción la constituyen los receptores de la superfamilia de los TGF-B , estos
receptores son proteínas que atraviesan una vez la membrana plasmática y poseen
dominios serina-treonina quinasa sobre la cara citosólica de la membrana.
introducción 22
INTERACCIÓN EPITELIO-MESÉNQUIMA
Aproximadamente el 90% de los cánceres humanos son carcinomas, quizás porque
la mayor parte de la proliferación celular del cuerpo se produce en los epitelios, o quizás
porque los tejidos epiteliales están expuestos mas frecuentemente a las diversas formas
de lesión fisica y química que favorecen el desarrollo del cáncer (lngber, 2002). Resulta
entonces que uno de los abordajes de interés para el estudio de la biología de los
carcinomas sea desde Ia perspectiva de la ruptura de Ia interacción epitelio-mesénquima
(figura 3). Estas interacciones han sido profundamente estudiadas en el desarrollo del
embrión, donde cobran su máxima expresión. En los embriones, la activa interacción
entre los tejidos vecinos conduce la epiteliogénesis y determina las características
tridimensionales del tejido. Las interacciones epitelio-estroma también juegan un rol clave
en el control de la angiogénesis en el estroma circundante y guían la formación de la
vasculatura funcional requerida para alimentar al órgano en crecimiento. La MEC que se
acumula a lo largo de la interfase epitelio-mesénquima como resultado de esas
interacciones es un elemento crítico en el control del proceso de desarrollo.
FIGURA 3
Mmm«¡o Esquema descriptivo de lascolngcnn
principales caracteristicas del tejido(nnilm .
conectivo normal subyacente a unMim Plnstu‘a . _ . . .
. epitelio celular. Esta oonsüturdo, en sumastocno
mayor parte, por una matriz extracelularglucosummoglutnnns.
prolcoglucanos vglucoprolemas
tejidoconectivo
que es secretada por los fibroblastos.
"361187 '
La génesis del tipo de tejido epitelial característico (acinar, tubular, simple o
estratificado) es determinada a través de complejas interacciones entre el epitelio y su
tejido mesenquimático subyacente en el embrión (Dodson y Hay, 1971; Banerjee y col.,
1977). Estudios en distintos tipos tisulares embriogénicos en donde se aisló el epitelio del
mesénquima y luego se han vuelto a combinar heterotópicamente revelaron que la
precisa forma tridimensional del tejido es determinada por el tipo de mesénquima,
(histodiferenciación) (Sakakura y coI., 1976). En contraste la producción específica de un
tipo epitelial es gobernada por el mismo epitelio (cfiodiferenciación).
introducción 23
En condiciones normales los órganos están formados por tejidos que intercambian
información entre los diversos tipos celulares por medio de la comunicación célula-célula,
las citoquinas y la MEC. La MEC es producida en colaboración entre fibroblastos
estromales y células epiteliales, para proporcionar andamiaje estructural para las células
así como información contextual. La vasculatura endotelial provee nutrientes y oxígeno,
mientras que el sistema inmune combate patógenos y remueve células apoptóticas.
Las células epiteliales se asocian en hojas embrionarias polanzadas continuas y se
comunican a través de una compleja red de interconexiones: fisicas, a través de contacto
directo, por medio de la MEC, o por conexión bioquímica mediante moléculas
señalizadoras solubles e insolubles. En combinación, estas interacciones proveen Ia
información necesaria para mantener el proceso de proliferacióny diferenciación oelular y
crear estructuras tisulares complejas (Bissell y Radisky, 2001).
En los organismos adultos las interacciones epitelio-conectivo se mantienen en la
misma dirección aunque en actividades menos intensas. En condiciones patológicas, las
señales intercelulares que definen el contexto normal pueden ser modificadas.
La superficie basal de las células epiteliales asociadas con la membrana basal, una
forma especializada de la MEC, provee soporte estructural y señales de polarización
epitelial (Schwartz y Baron, 1999; Giancotti y Ruoslahti, 1999). Dependiendo de la
composición y características fisicas de la membrana basal, diferentes factores solubles
que interactúan con ella pueden tener efectos celulares completamente diferentes sobre
la proliferación celular, arresto del crecimiento, diferenciación o apoptosis (Radisky y col,
2001).
Otras condiciones patológicas diferentes a la cancerización modifican
temporariamente Ia interfase epitelio-conectivo. También modifican el proceso de
carcinogénesis si este coexiste con ellas. Por ejemplo, Ia pérdida patológica de la
continuidad del epitelio produce aumento de su proliferación, activación de fibroblastos
mesenquimales y neovasculan'zación, tal como sucede en la reparación de heridas.
Normalmente esta condición es temporaria y reversible, pero cuando la inflamación es
sostenida, se desencadena un proceso automantenido. Bajo condiciones inflamatorias
persistentes el aumento en la expresión de enzimas como metaloproteasas dada por
fibroblastos estromales, puede conducir a una alteración en el equilibrio de la MEC y su
vez las células inmunes infiltrantes pueden aumentar la producción de factores que
promueven la proliferación celular. Si el proceso continúa, la organización normal del
órgano es reemplazada por un desorden funcional. Si dentro de este contexto de cambio
introducción 24
hubiese células epiteliales pre-existentes que posean un potencial tumorigénico, es decir
células iniciadas, podrían comenzar a proliferar, produciéndose así la promoción tumoral.
Alternativamente las interacciones anormales pueden conducir a inestabilidad genómica
dentro de las células epiteliales y a la adquisición de un fenotipo pre-neoplásico o
directamente neoplásico (Bissell y Radisky, 2001).
Si bien las características mas distintivas de las neoplasias malignas son su
descontrol en la proliferación y su capacidad invasiva, visto desde la perspectiva de las
interacciones parénquima-estroma el cáncer no es solo una patología celular. Al aumento
del crecimiento, se suman la pérdida de la histoarquitectura normal, la ruptura de los
límites tisulares normales, los cambios estromales, el proceso angiogénico, y el
compromiso de órganos distantes a través de la diseminación metastásica. El cáncer
debe ser visto como resultado de la desregulación de un proceso coordinado que
gobierna normalmente a las células individuales integradas en un tejido, ese tejido
integrado en un órgano y este en un organismo funcional vivo (Ingber y Jamieson, 1985).
imroducción 25
CÁNCER DE CABEZA Y CUELLO: CÁNCER BUCAL
Bajo la denominación de cáncer de cabeza y cuello (CCC) se agrupan tumores de
muy diversa histologia y ubicación anatómica variada que tienen en común pertenecer al
tracto aero-digestivo superior (TADS) (Dawson y Okamura, 1990). El TADS está revestido
por una mucosa con variaciones según la anatomía a la que corresponde, pero con
respuesta común a diversos carcinógenos ambientales.
La tasa de incidencia de CCC, estandarizada por edad, para hombres, excede
30/100000 en regiones de Francia, Hong Kong, el subcontinente Indio, Europa central, del
este y del sur, regiones de Sudamérica y entre los hombres negros de USA. Entre las
mujeres, la tasa excede 10/100000 en India y Hong Kong (Nagpal y Das, 2003).
El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC) y el carcinoma de
células escamosas bucal (CCEB) presentan un patrón de carcinogénesis y evolución en
común, es por ello que recurrentemente en la literatura se menciona indistintamente a uno
u otro si bien existen datos clínicos y/o experimentales generales y particulares.
CÁNCER BUCAL
o Epidemiolggía y Etiolmía
Los procesos malignos bucales representan un 3% de los canceres diagnosticados
en hombres y el 2% en mujeres en todo el mundo. Por año se diagnostican alrededor de
500000 sos nuevos de cáncer bucal y faríngeo a nivel mundial.Tres cuarta partes de
ellos provienen de países en vías de desarrollo (Nagpal y Das, 2003).
El CCEB representa mas del 95% de los cánceres de la cavidad bucal (Roder y
Wilson, 1983; Chen y col., 1991; Muir y Weiland, 1995; Ostman y coI., 1995) y ocupa el
sexto lugar entre las neoplasias malignas mas frecuentes (Nagpal y Das, 2003). Es una
de las mayores causas de morbilidaden el mundo y la tasa de sobrevida, menor al 50%,
no ha mejorado en las últimas dos décadas (Vokes y col., 1993). Esta tasa de sobrevida
es más pobre que la conocida para cáncer de cérvix, próstata, vejiga, melanoma y
Enfermedad de Hodgkin (Winn y col., 1998). Los problemas funcionales y cosméticos que
acarrea el paciente de cáncer bucal y faríngeo luego del tratamiento son muy frecuentes e
importantes.
La incidencia de cáncer oral difiere ampliamente según los hábitos de consumo de
tabaco prevalentes en diversos países del mundo. Aumenta considerablemente en las
introducción 26
sociedades donde el consumo importante de tabaco comienza a una edad temprana y
continua a lo largo de la vida del individuo. Debido a la diferencia en los hábitos de
consumo de tabaco, en muchas partes del mundo el cáncer de boca es el mayor
problema de salud. Así se observa que en el sub-continente lndio y en diversas zonas de
Asia, debido no solo al hábito de fumar sino al de mascar betel o nuez de areca, en esas
regiones aun hoy el cáncer de boca es una de las formas de cáncer mas frecuentes entre
todos los de la economia (Moore y col., 2000).
En USA, un 35.2% de los cánceres intrabucales se localizan en lengua y el 64.8%
restante correspOnde a otras localizaciones intrabucales (Moore y col., 2000). Todos ellos
tienen en común su etiología, y características clinicas e histológicas (Mashberg y col.,
1989).
La incidencia de CCEB es mayor en hombres que en mujeres y la ocurrencia de su
aparición aumenta con la edad con un pico en la sexta y séptima década de vida (Krollsy
Hoffman, 1976; Chen y col., 1990; Jensen y col, 1990). Estas tendencias varían según de
la población de referencia.
En particular, respecto de la República Argentina, se puede decir que los únicos
datos epidemiológicos controlados existentes son los pertenecientes a los estudios del
grupo Matos (Matos y col., 1997) utilizados en el reporte de Moore, 2000. Se conocen,
además, datos de centros especializados en patología Oral, como los servicios de
Patología y Estomatología de la Facultad de Odontología de la Universidad de Buenos
Aires. Estos datos coinciden en su mayoria con los reportados para América Latina y
ciertas regiones de Europa y USAen cuanto a incidencia entre los demás cánceres de la
economía, edad de aparición y frecuencia por sexo.
Etiología
El proceso de carcinogénesis en el cáncer de cabeza y cuello es complejo e
involucra interacciones dinámicas entre diversos factores (McCoy y col., 1980; Decker y
Goldstein, 1982; Cann y col., 1985; Baden, 1987). Aproximadamente el 90% del CCC
ocurre luego de la exposición a carcinógenos conocidos para el tracto aero-digestivo
superior. De esos carcinógenos los principales son el tabaco, el alcohol y sustancias
den'vadas o relacionadas con ellos corno las hojas de betel. El uso del alcohol esta
estrechamente relacionado al del tabaco. Pertenece al grupo de agentes que potencian la
carcinogénesis por tabaco. Otros factores etiológicos importantes son: virus,
predisposición genética, ocupación, exposición a la radiación solar (para el caso del
introducción 27
cáncer de labio) y Ia dieta alimentaria (Holland y Frei, 2000).
I) Tabaco y alcohol
Se ha descrito que el consumo habitual de tabaco en sus diversas formas,
principalmente cigarrillos, puros, tabaco en pipa, rapé, y tabaco de mascar es el factor
mas importante asociado con la transformación de las células epiteliales de la mucosa
bucal. Los datos epidemiológicosseñalan que 8 de cada 10 pacientes con cáncer de boca
habían sido fumadores durante mucho tiempo (Hays y col., 1995; Sapp y col., 1998). El
tabaco inicia un efecto carcinogénico dosis-respuesta lineal, en el cual, más importante
que la intensidad de la exposición, es la duración de la misma. La mayor actividad
carcinogénica del cigarrillo reside en la fracción particulada (alquitrán) que contiene una
compleja mezcla de carcinógenos iniciadores y promotores que interactúan entre si.
Las localizaciones mas frecuentes del CCEB en los fumadores de cigarrillocoinciden
con las regiones que poseen mayor contacto con la saliva (que retiene los carcinógenos
del cigarrillo) la cual por efecto de la gravedad se acumula en la superficie lateral y ventral
de la lengua y en el piso de boca (Moore y Catlin, 1967).
Hay evidencias clínicas que indican que aproximadamente en 35% de los pacientes
que continúan fumando después del tratamiento del CCEB desarrollan una nueva lesión
en otro punto de la orofaringe, mientras que sólo entre el 6 y el 13% de los que dejaron de
fumar desarrollan nuevas lesiones (Sapp y col, 1998).
En países del sudeste Asiático y la India la población consume extensivamente
tabaco sin humo, en diversas formas, como el betel quid, el pan masala o el naswar entre
otros. En el sudeste asiático, debido a ello, el cánoer bucal en la mucosa de la mejilla
representa la principalzona de desarrollo de cáncer en comparación con la lengua y el
piso de boca, que son las principales zonas de incidencia de cáncer bucal en los paises
occidentales (Paz y col., 1997). También alli se consume tabaco con humo en forma de
cigarrillos al igual que en el resto del mundo.
El alcohol es un importante promotor de la carcinogénesis y es un factor que
contribuye, en al menos un 75% de los casos, al desarrollo de cánceres vías aero
digestivas superiores (Bloty col., 1988).
Como factor independiente tiene un efecto moderado (Spitz y col., 1988). Diversos
estudios le adjudican distintos grados de riesgo dependiendo del tipo de bebida
alcohólica. La mayoría de los estudios reportan al etanol como el factor de mayor
introducción 28
relevancia (Kabat y Wynder, 1989). La mayor significancia clínica del uso y abuso de
alcohol se relaciona con el efecto potenciador sobre el efecto carcinogénico del tabaco.
il) Virus
Los virus han sido implicados en la patogénesis de carcinomas bucales, laríngeos y
nasofaríngeos (Hollinshead y col., 1973; Brachman y col., 1992).
Estudios sero-epidemiológicos en CCEB sugieren la participación del virus herpes
simple tipo 1 (HSV-1), que actuaría como mutágeno en el desarrollo de este cáncer. Se
han encontrado series de pacientes con CCEB que presentan niveles aumentados de
anticuerpos anti- HSV-1 del tipo lgA e lgM (Shillitoe y col., 1986), los cuales son de
significancia pronóstica. En otros estudios relativizan la importancia del HSV-1 dado que
el producto génico del virus aparece en los CCEB en casos aislados (Shillitoe y col.,
1986).
Por otra parte, mas recientemente se ha reportado asociación entre CCC y el virus
del papiloma humano -HPV- (Syrjanen y coI., 1988; Brandsma y Abramson, 1989;
Brachman y col., 1992). Los virus de la familia HPV son al menos 65 subtipos y han sido
extensamente estudiados en cáncer cervical y recientemente relacionados con otros
cánceres epiteliales. Los primeros estudios relacionan a los HPVs con el carcinoma
verrugoso, otra entidad menos agresiva que el CCE que se da en mucosa bucal. Estudios
inmunohistoquimicos realizados con antígenos de la cápside viralde distintos subtipos de
HPV (subtipos 6,11,16, 18) y estudios de hibridación ¡n sr'tu y PCR apoyan la asociación
entre HPVy Ia carcinogénesis bucal (Loning y coI., 1985; Syrjanen y col., 1988). Algunos
de estos estudios son controversiales dado el pequeño número de casos utilizados y el
hallazgo de expresión viral superpuesta entre CCEB y la mucosa bucal normal. Serán
necesarios nuevos trabajos con más sondas y acoplados a importantes análisis
epidemiológicos controlados para proveer datos más concluyentes sobre el rol de la
familia de los HPVsen la carcinogénesis bucal.
iii)Factor genético
Es poca y algo confusa la información bibliográfica existente sobre el rol de factores
genéticos en la etiología del cáncer bucal. Por ejemplo se ha observado un aumento en
los niveles de la enzima aril hidroxilasa, la cual activa a los hidrocarburos aromáticos
policiclicos (el mayor agente carcinógeno del humo del tabaco), en pacientes con cáncer
laríngeo (Holland y Frei, 2000). Por otra parte, se han reportado antígenos leucocitarios
introducción 29
en pacientes con CCC. Datos recientes de diversos grupos sugieren que pacientes con
CCECC presentan una sensibilidad aumentada a la exposición a agentes carcinógenos
(Spitz y col., 1988). Junto con los factores ambientales, los factores genéticos podrían ser
un componente útil para estudios cuantitativos en modelos de riesgo (Schantz y col.,
1990; Lippman y col., 1994).
iv) Ocupación
Aunque la exposición ocupacional probablemente juegue un rol menor en el
desarrollo del CCC, se reconoce su influencia en la producción de cáncer de la región
sinusal, en medio ambientes relacionados a refinerías de níquel o trabajadores del cuero
o la madera. No se ha encontrado otra relación entre factores ocupacionales y cáncer
bucal (Barton y Hogetveit, 1980; Cann y col., 1985).
v) Radiación
Las personas que están sometidas a una exposición ocupacional o recreativa
prolongada a la luz solar directa corren mayor riesgo de desarrollar CCE de labio. En este
caso al igual que en el cáncer de piel la carcinogénesis se asocia a la radiación ionizante
(rayos UV-B).
vr)Factores nutricionales
Existe considerable evidencia epidemiológi que sugiere que la vitamina A y el B
caroteno juegan un rol protector en neoplasias epiteliales (McLaughlin y col., 1988). En
consecuencia las deficiencias en carotenos aparecen como un factor de riesgo para
cánceres de las vías aero-digestivas superiores. De todas maneras no se sabe cual o
cuales de los más de 500 carotenoides conocidos ejercen función de protección. Diversos
grupos han estudiado especificamente la relación entre vitamina A, B-caroteno, riesgo y
cáncer bucal (Henderson y co|., 1976; Winn y col., 1984). Por otra parte se suma como
factor de confusión a los estudios nutricionales el efecto del tabaco, dado que el
tabaquismo se asocia a una disminuciónen la dieta y los niveles séricos de carotenoides.
o Biología del cáncer bucal
El cáncer bucal es una neoplasia epitelial que generalmente comienza corno un
aumento focalizado del crecimiento en un grupo de células progenitoras cercanas a la
membrana basal que se expanden vertical y lateralmente, reemplazando al epitelio
introducción 30
normal.
Histológicamente suele producirse una secuencia de cambios epiteliales:
hiperplasia, displasia, carcinoma in situ, y finalmente carcinoma invasivo (Nagpal y Das,
2003). Todo este proceso esta asociado con acumulación de alteraciones genéticas.
Como en todas las neoplasias, la proliferación celular es excesiva y autónoma, no está
coordinada con el tejido ni con la división celular normal. A pesar del daño al ADN el ciclo
celular continúa, debido a la pérdida de los puntos de control del mismo. Finalmente esas
células neoplásicas llegan a los vasos linfáticosy hacen metástasis generalmente pn'mero
en los ganglios linfáticos locales y luego se inicia la diseminación metastásica general .
La carcinogénesis en diversos órganos y en la cavidad bucal en particular es un
proceso de pasos múltiples.Ese proceso involucra cambios biomoleculares que preceden
a lesiones pre-malignas las cuales a su vez preceden al cáncer invasivo (Bouquot y col.,
1988; Brennan y col, 1995). Ya hemos analizado in extenso el tema de la carcinogénesis
y definimos esquemáticamente las etapas de la carcinogénesis epitelial como: iniciación,
promoción y progresión. Aunque en las neoplasias humanas no es dable observar este
esquema tripartito, sirve como modelo para comprender los fundamentos biológicos y el
tratamiento de esta patología.
Carcinogénesis bucal: “Cancen‘zaciónde campo"
En el ya clásico trabajo de Slaughter (Slaughter y co|., 1953), se propuso Ia idea de
“cancerización de campo" en el cáncer bucal para explicar la carcinogénesis del tracto
aero-digestivo superior. La exposición repetida, de un área extensa de mucosa, a la
agresión carcinogénica (por ejemplo del tabaco y el alcohol) aumenta el riesgo de que ese
tejido desarrolle múltiples focos independientes pre-malignos y malignos (Slaughter y col.,
1953; Strong y col, 1984; Lippman y Hong, 1992). Slaugther et al propusieron su
concepto basados en las siguientes observaciones: a- el cáncer bucal se desarrolla en
áreas múltiples de cambios precancerosos b- el tejido que rodea al tumor presenta
alteraciones premalignas c- el cáncer bucal puede darse en forma multifocald- luego del
tratamiento quirúrgico, con alguna frecuencia se observa la ocurrencia local de segundos
tumores primarios. A partir de entonces, el concepto de campo cancerizado o “efecto de
campo" fue y es utilizado en el contexto de la existencia de procesos pre-neoplásicos en
sitios múltiples, a veces sin probar que esos procesos tengan evolución independiente. La
cancerización de campo ha sido descripta en: CCECC en la cavidad bucal, orofaringe y
laringe (Copper y col., 1993; Braakhuis y col., 2003), pulmón (Franklin y col, 1997),
introducción 31
esófago (Prevo y col., 1999), vulva (Rosenthal y col., 2002), cérvix (Chu y col., 1999),
colon (Jothy y col., 1996), mama (Forsti y col., 2001) y piel (Stern y col., 2002).
Existen reportes sobre análisis de mutaciones en p53 que proveen un soporte
molecular importante para el concepto de cancerización de campo (Chung y col., 1993;
Shin y col., 1994). Brennan y col. reportan asociación significativa entre el uso de tabaco y
alcohol con la alta frecuencia de mutaciones en p53 (Brennan y col., 1995). Esos
resultados preliminares sugieren que esas mutaciones ocurren en sitios no nativos de la
proteína p53, y sugieren un rol del tabaco en las alteraciones moleculares de amplias
regiones de la mucosa.
I)Alteraciones genéticas
Trabajos sobre estudios genéticos del modelo de Slaugther, analizando
microsatélites para la pérdida alélica de los loci cromosomales más relevantes, realizados
en lesiones pre-invasivas y benignas de cabeza y cuello de individuos consumidores de
tabaco, revelaron una pérdida cromosomal progresiva relativa a la gravedad de las
lesiones estudiadas (Califano y co|., 1996; Braakhuis y col., 2003). Se describió un
modelo para cáncer de cabeza y cuello, donde a cada paso histopatológico desde
hiperplasia a displasia, CIS y carcinoma invasivo le correspondían cambios genéticos
progresivos. Las áreas de tejido adyacente sin cambios morfológicos importantes
compartían cambios cromosomales con las lesiones severas, pero las áreas de displasia
severa o CIS exhibieron alteraciones genéticas adicionales (Califano y col., 1996). Otros
estudios clínicos apoyan el modelo de progresión genética con análisis de microsatélites y
señalan que permitirían identificar el riesgo de desarrollo de CCEB en un campo
cancerizado (Partn‘dgey co|., 2000). Recientemente se propuso al CCECC como modelo
de cancerización de campo para el estudio de este proceso a nivel general (Braakhuis y
col., 2003).
El grado de daño genético depende de la exposición al carcinógeno y de la
sensibilidad inherente de un tejido. Los cambios genómicos se acumulan,
presumiblemente en todo el tejido expuesto al carcinógeno. Las alteraciones genéticas al
azar indicadas por micro-núcleos, intercambios de cromátidas hermanas y aneuploidía
pueden ocurrir en la mucosa aero-digestiva normal, pre-maligna y maligna (Doseva y col.,
1984; Bijman y col., 1985; Lippman y col., 1990).
Se piensa que la carcinogénesis es regulada fundamentalmente por el balance
celular entre oncogenes y genes supresores. Esta relación dinámica esta bajo intenso
introducción 32
estudio en el CCECC (Lippman y col., 1995; Sidransky, 1997). La expresión aberrante
(amplificación o mutación) de familias especificas de oncogenes celulares como: myc, ras,
neu, bcl, int, ems-1, ciclina D1 y hst ha sido demostrada en la carcinogénesis del tracto
aero-digestivo (Gallick y col., 1986; Field y ool., 1989; Saranath y col., 1989; Lippman y
coI., 1995). Hasta un tercio de los casos de CCECC primarios presentan inactivación de
p16 por distintos y múltiples mecanismos que incluyen metilación, mutación y
translocación (Spandidos y col., 1985). Las familias de oncogenes: ras, neu, int-2 y myc
están amplificadas en los estadios más avanzados del CCEB, y la activación de estos
oncogenes in vitro altera la respuesta a agentes de diferenciación y promueven el
crecimiento celular descontrolado, aneuploidía y tumorigenicidad (Saranath y col., 1989).
La expresión del receptor del EGF esta amplificada en el CCECC y se ha sugerido como
un factor predictivo de comportamiento biológico agresivo (Liggett, Jr. y Sidransky, 1998).
De igual forma, se ha observado alta expresión de TGF-a en una variedad de tumores
(incluyendo cánceres bucales) y es frecuentemente acompañada por elevados niveles del
receptor del EGF particularmente (Wong, 1987; Grandis y Tweardy, 1993; Wong, 1993).
ir)Alteraciones enla diferenciación
La desregulación de la diferenciación es otro hito en el proceso de múltiples pasos
de la carcinogénesis. El epitelio bucal humano al igual que el del esófago es del tipo
escamoso estratificado. La mucosa bucal está completamente cornificada en la encia y el
dorso de Ia lengua, el resto de sectores intrabucales tienen distintos grados de
queratinización. Las citoqueratinas son una familiade al menos 19 proteínas filamentosas
de peso intermedio que van desde 40 a 68 kd y se expresan con distinto patrón, el cual se
correlaciona con los distintos grados de diferenciación epitelial (Nagle y coI., 1985;
Grandis y Tweardy, 1993). Estos patrones varian substancialmente en la carcinogénesis y
en los tumores. La distribución espacial de otras proteínas estructurales tales como la
filagn’na, las involucn'nas, transglutaminasa l y otros antígenos de diferenciación también
se observan alterados en displasias y carcinomas (ltoiz y col., 1984; Itoizy col., 1985; Itoiz
y col., 1986; Xu y col., 1995).
iii)Alteraciones en la proliferación.
La tercera fase importante de la carcinogénesis en etapas múltiples es la
desregulación de la proliferación. La transición de epitelio normal a hiperplasia y displasia
está asociada con un aumento de las células proliferantes de la capa basal que se
introducción 33
extiende a las suprabasales. Wejos ensayos histológicos han correlacionado este proceso
con el aumento en la frecuencia de figuras mitóticas; más recientemente análisis de
citometría de flujo para cuantificar cantidad de ADN y expresión de Ki-67 y del antígeno
nuclear de proliferación celular (PCNA) han revelado algunas correlaciones positivas, en
el epitelio del tracto aero-digestivo superior, para Ia proliferación anormal de Ia capa
suprabasal y distintos pasos de la carcinogénesis (displasia severa)(Carey y col., 1987;
Coltrera y col., 1990).
o Patología del cáncer bucal
Histología y prognosis
El diagnóstico histopatológico realizado por los patólogos incluye usualmente el
grado de diferenciación del tumor. Tradicionalmente la graduación tumoral se basa en un
criterio desarrollado hace mas de 50 años por Broder que indica en forma subjetiva la
mayor o menor cantidad de queratinización en los cordones tumorales (Broder, 1941;
Crissman y col., 1984). Si bien en general los tumores bien diferenciados son de mejor
pronóstico, Ia agresividad depende además de otros factores que condicionan el
comportamiento biológico (Broder, 1941; Snow y col., 1982). Esos factores incluyen el
tamaño tumoral, localización, vascularización, drenaje linfático y respuesta inmune del
individuo. La edad, sexo, y estado nutricional del paciente influyen también en el grado de
agresividad clinica.
Además del grado de diferenciación, las características consideradas en la
evaluación histológica incluyen las atipias citoplasmáticas y nucleares, el índice mitótico,
la respuesta inflamatoria.la respuesta vascular-estomal, la invasión vascular y el patrón
de invasión. Estas características tienen una correlación variable con el comportamiento
biológico tumoral. El grado de queratinización es el principal determinante en la
graduación de Broder (figura4). Con respecto al estado nuclear se analiza el pleomorflsmo
del núcleo. El aumento del tamaño y coloración nuclear probablemente refleje
anormalidades cromosomales y aumento del contenido de ADN. Numerosos estudios del
contenido de ADN han demostrado altas tasas de aneuploidía en cánceres de epitelios
escamosos y la aneuploidía ha sido asociada con una prognosis pobre (Ensley y col.,
1990; Wolf y col., 1990). El índice mitótico y otros marcadores de proliferación celular
también se utilizan para aportar más datos en la estimación del comportamiento de los
CCEB.
introducción 34
FIGURA 4
Fotomicrografía de un carcinoma de célulasescamosas bucal. H-E,magnificación200X.
LESIONES PRE-NEOPLÁSICAS DE LA CAVIDAD BUCAL
El cáncer bucal es uno de los pocos tipos de cánceres en el cual es posible la
observación clinica de los estadios iniciales de la progresión tumoral. Existe un trabajo
pionero en el estudio de la progresión tumoral que caracterizó las alteraciones genéticas
en el cáncer colo-rectal ya descripto en la página 15 (Fearon y Vogelstein, 1990). Hoy se
cree que el carcinoma de células escamosas bucal sigue un patrón de desarrollo similar al
descripto por Fearon et al. y puede estar precedido por lesiones clínicas tan variadas
como: leucoplasia, eritroplasia, quuen plano y fibrosis de la submucosa bucal (Nagpal y
Das, 2003). La naturaleza exacta de las alteraciones genéticas asociadas a estos
cuadros clinicos no esta del todo aclarada aún, si bien ya ha sido descripto un modelo
preliminar de progresión a nivel molecular para CCC (Califano y col, 1996; Nagpal y Das,
2003). Tampoco se han definido claramente los factores que determinan la transformación
de estas lesiones en un CCE. Debido a ello, se entiende particularmente por lesiones
precancerosas, a aquellas que analizadas a nivel poblacional presentan un riesgo
aumentado de malignización.
Si bien se presentan como entidades clínicas diferentes, que describiremos más
adelante, en todas ellas los cambios epiteliales hacia la transformación maligna pasan
generalmente por: hiperplasia (o acantosis), determinada por una mayor proliferación
celular que genera un aumento del volumen epitelial; displasia, en donde se agregan
atipías celulares y alteraciones en la maduración epitelial que producen cambios en la
histoarquitectura. Cuando estos cambios alcanzan cierta magnitud se catalogan como
displasia severa o carcinoma r'nsitu, en el cual las alteraciones son similares a las de un
CCE pero sin ruptura de la membrana basal. Se considera que en este estadio el epitelio,
liberado a su evolución espontánea progresa indefectiblemente, aunque en tiemposvariables hacia un tumor infiltrante.
introducción 35
o Leucoplasia
El termino leucoplasia es una denominación clínica que significa “placa blanca".
Según la Organización Mundial de la Salud se define como leucoplasia a “una placa
blanca situada sobre la mucosa bucal que no puede ser eliminada mediante raspado ni
clasificada como ninguna otra enfermedad diagnosticable" (Waldron y Shafer, 1975;
Silverman S Jr y col., 1984; Bouquot y col., 1988).
Posee una tasa de aparición de 1,5 a 12% en la población en general (Sapp y col.,
1998). Histológicamente, las alteraciones epiteliales constantes son un aumento del
espesor de Ia capa de queratina (hiperortoqueratosis o hiperparaqueratosis) lo que
condiciona el aspecto macroscópico de placa blanca y un aumento de espesor del estrato
espinoso (acantosis). A estas alteraciones pueden agregarse cambios displásicos de
intensidad van'able. Entre un 5 a 15 % de las placas blancas son clasificadas
histológicamente como displasias (Pindborg y col., 1997; Suarez y coI., 1998). De esas
leucoplasias un 15 a 20% desarrollaran carcinomas (Lumerman y col., 1995). Este
porcentaje aumentará en poblaciones de fumadores. Aunque las lesiones de leucoplasia
se pueden presentan en pacientes no fumadores, el consumo de tabaco con humo y sin
humo se considera el factor etiológico más importante de las leucoplasias. Otros factores
cuya implicanciaetiológi en algunas leucoplasias ha sido demostrada son: infecciones
virales, infección por candida albicans entre otros (Sapp y co|., 1998).
o Eritroplasia
La eritroplasia fue definida por Queyrat (también conocida como eritroplasia de
Queyrat) para describir una lesión roja, aterciopelada del glande del pene de hombres
ancianos (Sapp y col, 1998). Literalmente el termino significa “mancha o placa roja".
En la cavidad bucal se presenta con la apariencia clinica determinada (mancha o
placa roja) y a nivel histológicose caracteriza por ausencia de queratinización superficial y
alteraciones celulares correspondientes a un carcinoma in situ. No se conocen factores
etiológicos definidamente asociados a esta lesión.
o Liguen Plano
Es una lesión con manifestaciones cutáneas e intrabucales. Estas últimas se
caracterizan por estrías o lineas blancas que alternan con mucosa eritematosa.
Histológicamente se observa hiperparaqueratosis u ortoqueratosis con otros cambios
epiteliales variables que condicionan las diferentes variedades o subtipos de esta entidad.
introducción 36
Entre ellos, la forma queratósica y atrófica son consideradas pre-malignas. En la
etiopatogenia del liquen intervienen factores inmunológicos y psicosomáticos.
o Fibrosis dela submucosa bucal
La fibrosis de la submucosa bucal (OSMF) se caracteriza por presentar áreas
blanquecinas, difusas y firmes de cicatrización submucosa. La OSMF es una patología
bucal, de alta prevalencia en Ia lndia y otras poblaciones que tienen hábito de mascar
“nuez de areca" o “betel” (Pillai y coI., 1992; Jeng y col., 1994; Maher y co|., 1994). Esta
lesión, que causa pérdida de Ia elasticidad de Ia mucosa con trastornos en la masticación,
deglución y fonación, es reconocida como precancerosa dado que un alto número de
casos desarrollan posteriormente CCEB (Kaur y col., 1994; Pindborg y col., 1997; Kaur y
coI., 1998), y es la responsable de que la incidencia de cáncer bucal en la India sea muy
superior a la del resto del mundo (Pindborg y col., 1984; Pindborg, 1989).
Histológicamente, en un estadio inicialse observa inflamación crónica del tejido conectivo
submucoso, etapa que es seguida por una fibrosis progresiva difusa y atrofia del epitelio
suprayacente. El epitelio atrófico tiene una mayor tendencia a desarrollar hiperqueratosis
y displasias epiteliales que luego pueden progresar a CCEB.
MODELOS DE CÁNCER BUCAL
Los intentos por encontrar modelos animales para estudiar el cáncer bucal se
remontan a 1925 con el trabajo de Bonne (1925) quien describió un modelo poco ajustado
a Ia realidad, dado que se pincelaba la piel de los animales con el canoerígeno químico
elegido y casualmente se observaban papilomas en boca y estómago, debido a que los
animales ingerian el carcinógeno aI Iamerse la piel (Bonne, 1925). El principal
inconveniente era Ia resistencia de la mucosa bucal a Ia acción de los carcinógenos
químicos comúnmente utilizados en piel. Entre 1927 y 1930 se desarrollan protocolos
específicos de cáncer bucal en ratón y conejo que resultaron muy poco reproducibles
(Bonne, 1927; Roffo, 1930).
En 1954 Salley reporta la combinación exacta de tejido susceptible y carcinógeno
potente (DMBA)en Ia bolsa de la mejilla hamster (Cn'cetus auratus), validando el modelo
más utilizado hasta el momento para estudios de cáncer bucal.
Luego se reportaron modelos en rata también utilizando como carcinógeno al DMBA
introducción 37
(Wallenius, 1966a; Wallenius, 1966b) si bien son modelos de poca eficiencia. En 1972
aparece un modelo de cáncer de lengua con 4-nitroquinolina(4NQO) también en rata, que
es la base de muchos de los modelos actuales de cáncer de lengua (Giunta y Shklar,
1972). En 1974 se descn‘be el modelo de Heyden para paladar de rata cancerizado con
DMBAy 4NQO (Heyden, 1974) que luego sufrió algunas modificaciones y aún hoy es
también utilizado.
En las últimas décadas, se han desarrollado algunos modelos de carcinogénesis
bucal viral combinada con carcinogénesis quimica (Min y col., 1991), para estudiar el rol
de diversos virus en la etiología del cáncer bucal. Actualmente se ha reportado un nuevo
modelo en ratón SENCAR (Kimy col., 2002) aún no validado.
Con respecto a los modelos in vitro, se han desarrollado CCE inducidos en células
de la bolsa de la mejilla del hámster en cultivo (Schwartz y Shklar, 1997), y se ha
desarrollado una línea celular de un carcinoma de la bolsa de Ia mejilla del hámster
(HCPC-1) que es ampliamente utilizada en ensayos ¡n vitro (Odukoya y col., 1983).
38
OBJETIVOS GENERALES
Analizar características del modelo experimental de cancen'zación química de la
bolsa de la mejilla del hámster para evidenciar similitudes, aun no descriptas, con
los cuadros de malignizaciónespontáneos de Ia mucosa bucal humana.
Analizar algunos de los mecanismos involucrados en la alteración de las
interacciones epitelio-conectivas durante la carcinogénesis de Ia mucosa bucal,
especialmente aquellos que conducen a la producción de fibrosis y angiogénesis,
frecuentemente observadas en las lesiones pre-malignas de la mucosa bucalhumana.
Utilizar el modelo para estudiar cambios biológicos que se producen en la
cancen'zación de la mucosa bucal antes de Ia aparición de modificaciones
morfológicas. Analizar Ia posibilidad de utilizar la detección histoquímica de estos
cambios como marcadores de cancen’zaciónde campo.
SECCIÓNI-a
Reproducción del modelo de la bolsa de la mejilla del hámster. Análisis macro y
microscópico.
INTRODUCCIÓN
Como se expuso anteriormente en la página 36 este sistema es el más utilizado para
el estudio de cáncer bucal experimental, porque ofrece un ajustado paralelo con el
desarrollo de pre-malignidad y malignidad en la boca humana (Shklar y col., 1979; Jin y
Lin, 1989; Lin y Chen, 1991; Slaga y Gimenez-Conti, 1992). Además es uno de los
modelos mejor caracterizados para CCE .
El modelo desarrollado originalmente por Salley (Salley, 1954), fue luego
estandarizado por Morris (Morris, 1961; Morris y Reiskin, 1966) para garantizar la
reproducibilidadde las lesiones experimentales.
La bolsa facial del hámster anatómicamente semeja un bolsilloque se puede evertir
fácilmente posibilitando el seguimiento macroscópíco del proceso carcinogénico. Esta
comunicada con la boca solamente a la altura de las comisuras Iabiales y revestida por
una mucosa similar al resto de la cavidad bucal (Salley, 1957). Salley originalmente
enfatizó la necesidad de obtener un modelo de carcinogénesis bucal con hidrocarburos o
sus derivados (en su primer trabajo compara distintos hidrocarburos y distintos solventes
hasta concluir que el DMBAes el óptimo) para comenzar a analizar los efectos del tabaco
y derivados en la carcinogénesis (Salley, 1957). La posterior comprobación del rol del
tabaco en la carcinogénesis bucal resaltaría el valor de su trabajo.
Morris demostró que el epitelio de la bolsa de animales adultos mayores era más
resistente a la acción de DMBAy estandarizó la edad promedio de 5 a 6 semanas
(adultos jóvenes) como ideal para empezar los estudios de carcinogénesis experimental.
Con respecto a la solución del carcinógeno repitió algunas pruebas originales y reportó
otras, demostrando que la solución de DMBAal 0,5% es la óptima para obtener un buen
promedio de tumores con el menor tiempo de latencia y la mínima pérdida de animales.
Morris también reportó la no existencia de diferencias en Ia respuesta a la carcinogénesis
en el modelo en relación al sexo del animal (Morris y Reiskin, 1966).
Si bien el modelo estandarizado es el de la carcinogénesis completa con DMBA,
Sección I a 40
también se pueden inducir tumores con protocolos de 2 etapas, realizando la iniciacióny
promoción por separado (Odukoya y Shklar, 1982; Odukoya y col., 1984). Si bien se han
reportado distintos protocolos de 2 etapas aún no hay consenso para la elección de
alguno en particular y se discute la eficacia de cada uno de ellos (Slaga y Gimenez-Conti,
1992; Gimenez-Conti y Slaga, 1992; Gimenez-Conti y Slaga, 1993). Es por ello que se
sigue buscando el mejor esquema de carcinogénesis con co-carcinógenos para facilitar
los estudios de quimioprevención u otras aplicaciones del modelo (Wani y col., 2001).
En resumen, se reconocen como ventajas de este modelo:
1. Que el desarrollo de los tumores es precedido por alteraciones pre
neoplásicas semejantes a las lesiones pre-malignas en la mucosa bucalhumana.
2. No se conocen carcinomas espontáneos en la mucosa del hámster.
3. El sistema es muy sensible a su modulación sistémica vía vitaminas,
hormonas y drogas.
No obstante algunos autores han discutido algunos aspectos negativos del modelo:
la escasa producción de metástasis o su aparición muy esporádica o tardía,
probablemente debida al casi nulo drenaje linfático de la bolsa; así como algunos
aspectos estructurales diferentes entre la mucosa del hámster y la mucosa bucal humana,
tales como la ausencia de glándulas salivales, el mayor grado de ortoqueratinización y el
menor número de estratos epiteliales con ausencia de papilas conectivas.
Diversos estudios posteriores a los trabajos iniciales de Salley y Morris validaron el
protocolo originaly demostraron que el modelo estándar de la bolsa del hámster, aún con
sus falencias, es ideal para estudiar el cáncer bucal, y un buen modelo para
carcinogénesis en general (Shklar, 1999).
La cancen’zación se realiza mediante la aplicación local de una solución al 0,5 % de
DMBA en aceite mineral, tres veces por semana, durante 14 a 16 semanas (el
procedimiento se detalla en materiales y métodos, página 43 ). En esta forma el DMBAse
comporta como cancerígeno completo con capacidades combinadas de iniciador y
promotor. La cancerización de la bolsa es paulatina, se pueden estudiar las lesiones en su
macroscopía y microscopía, a medida que se van modificando y aumentando en gravedad
hasta la instalación de los tumores. Aunque el carcinógeno es aplicado sobre toda la
superficie de la bolsa facial, el proceso de cancen'zación no es igual en toda su extensión,
sino que es siempre focal al igual de lo que sucede en la boca humana.
Luego de unas pocas aplicaciones de DMBA (aproximadamente entre las 2 y 5
Sección I a 41
semanas) se observa una respuesta hiperplásica e hiperqueratósica y leves cuadros de
inflamación. Entre las 6 y 8 semanas de tratamiento predominan las lesiones displásicas.
Estas lesiones son similares a las leucoplasias y eritroplasia humanas (Gimenez-Conti y
co|., 1990). La secuencia prosigue con la aparición de carcinoma "in situ" y zonas de
micro-invasión aproximadamente entre las semanas 8 a 10. Hacia Ia semana 12 de
tratamiento aparecen tumores exofiticos muy diferenciados, de aspecto verrugoso, y
finalmente (semana 14 a 17) se observan tumores endofiticos de mayor malignidad,
menos diferenciados, que infiltranel conectivo y el múscqu subyacente.
Si bien la gravedad de las lesiones aumenta con el tiempo, al final del proceso
coexisten formaciones tumorales con lesiones pre-neoplásicas separadas por mucosa de
aspecto normal, en forma similar a Io que ocurre en la boca humana en el proceso
conocido como “cancen'zación de campo" bucal. Uno de los objetos de nuestro trabajo
fue precisamente analizar las caracteristicas de este modelo como modelo de
cancen'zación de campo. Con respecto a esto, pusimos especial énfasis en el estudio de
las áreas de mucosa de aspecto normal, sometida al carcinógeno durante meses. En
nuestro laboratorioya se ha estudiado en estas áreas el comportamiento de un marcador
de pre-malignidad, las regiones organizadores del nucleolo (AgNOR) así como en la
mucosa bucal adyacente a CCEB humanos (Schwint y col., 1994; Schwint y col., 1996).
Se encontró que estos epitelios si bien son macro y microscópicamente normales
expresan cambios morfológicos cuantificables de los AgNOR.
También los tumores remedan macro y microscópicamente los tumores humanos
(Malament y Shklar, 1981; Slaga y Gimenez-Conti, 1992). Los carcinomas exofiticos
tienen cierta similitud con los carcinomas verrugosos si bien tienen mayor cantidad de
atipías y mitosis, y los carcinomas endofiticos son en todo similares a los carcinomas de
células escamosas humanos. Asimismo, presentan marcadores metabólicos similares
(Solt, 1981; Solt y Shklar, 1982; Shin y col., 1990) e igual expresión de oncogenes (Wong,
1987; Husain y col., 1989; Wong y col., 1989).
La mayor parte de los trabajos donde se utiliza este modelo se refieren al
comportamiento de tumores frente a las diferentes condiciones experimentales. Los
eventos iniciales y las lesiones pre-neoplásicas particularmente, han sido menos
estudiadas. Otro hecho que no ha sido analizado en este modelo es la inducción de
fibrosis en el conectivo subyacente a los epitelios en transformación. Estos cuadros se
mencionan ocasionalmente como parte de las descripciones histológicas del modelo, pero
nunca se ha realizado una descripción morfológica cuali o cuantitativa de Ia misma en
Sección I a 42
relación a la carcinogénesis. Tampoco se ha tratado de estudiar su patogenia o su
relación con la transformación epitelial
ONCOGENES Y GENES SUPRESORES DE TUMOR
El nivel de expresión de distintos proto-oncogenes se analizó en el desarrollo
tumoral del modelo. Se ha reportado el aumento en la expresión de c-Ha-ras en estadios
tempranos y también el aumento de la expresión de c-erb-B hacia las semanas 8 a 10 de
la cancerización (Husain y col., 1989). Previamente Wong había reportado la amplificación
de c-erb-B1 en los carcinomas del modelo (Wong, 1987) y en Ia tumorigénesis (Wong y
coI., 1989). También Wong reportó la expresión de Ki-ras en epitelio normal y
transformado de cultivos de la bolsa de la mejilla del hamster (Wong y col., 1989). Por
entonces se implicó al aumento de la expresión del oncogén ras con la transformación
inicial y la de c-erb-B en la proliferación y fenotipo maligno (Slaga y Gimenez-Conti, 1992).
Al haberse demostrado Ia presencia aumentada de c-erb-B1, el gen que codifica
para el EGFR se buscó la expresión de EGF en lineas celulares tumorales de hámster. Se
halló expresión de TGF-a y no se encontró expresión de EGF (Wong y col., 1988).
Otros oncogenes estudiados en el modelo han sido c-myc y c-sis, encontrados en el
epitelio normal y sin ser afectados en Ia bolsa cancerizada (Slaga y Gimenez-Conti,
1992). En el caso del gen del factor de transcripción c-fos, no se detectó actividad del
mismo en ningún estado del proceso de carcinogénesis (Slaga y Gimenez-Conti, 1992).
Finalmente en cuanto a la expresión de genes supresores, los únicos trabajos
concluyentes son sobre p53. Se encontró que la acumulación de p53 ocurre
tempranamente en el proceso de carcinogénesis en este modelo y frecuentemente como
en los CCE humanos. Las alteraciones en su expresión se deben a mutaciones en el gen
p53 (Chang y col., 1996; Gimenez-Conti y co|., 1996; Chang y col, 2000). AI analizar la
expresión de p53 en los carcinomas del modelo se confirmó que las mutaciones que
presenta son consistentes con las existentes en los tumores humanos ((Gimenez-Contiy
col., 1996).
Sección I a 43
OBJETIVOS
o Estandan‘zar el modelo de la bolsa de la mejilla del hámster según
descripciones de Ia literatura.
o Estudiar Ia morfología de las lesiones macroscópica y microscópicamente.
Compararlas con las reportadas bibliográficamente y describir aquellas en las
cuales se encontró escasa información.
o Estudiar la posibilidad de utilizar las áreas cancerizadas aún sin cambios
morfológicoscomo modelo de cancerización de campo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron en este trabajo hámsters de la especie Mesocn'cetus auratus, de
aproximadamente 6 semanas de edad, de un peso corporal entre 150-200 grs., provistos
por el bioterio central de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA). Se alojaron
en cajas de 5 hamsters cada una con agua y alimento ad Iibitumy ciclo de luz-oscuridad
de 12-12 horas.
Los animales fueron sometidos al protocolo de carcinogénesis estándar (Shklar y
co|., 1979), que implica la aplicación del cancerígeno mediante una jeringa de tuberculina
estén'l y descartable (sin aguja), en la bolsa derecha. Se vuelca en el fondo de la bolsa 1
cm 3 de una solución de DMBA(Sigma) al 0,5 % en aceite mineral (mineral oil, 400-5,
Sigma Diagnostics, INC.). AI retirar Ia jeringa se adosan las paredes de la bolsa
permitiendo la difusióndel cancerígeno sobre toda la superficie. esta operación se repite 3
veces por semana durante 17 semanas, como tiempo máximo. Se realizaron dos grupos
control: uno de animales sin tratamiento y otro con topicaciones del vehícqu (aceite
mineral), siguiendo los mismos tiempos experimentales. A la octava semana de
tratamiento se practicó un examen clínico de las bolsas anestesiando a los animales
previamente con Ketamina 50 (Holliday)en una dosis de 10 mg cada 100 gramos de peso
corporal, para controlar el estado de la bolsa y el comienzo de la aparición de las lesiones
macroscópicas. Se controló también el peso corporal de los animales.En diferentes intervalos hasta la semana 17 se sacrificaron con sobredosis de
inhalación de éter sulfúrico(analítico, Raudo) en grupos de aproximadamente 5 animales.
Sección I a 44
Treinta minutos antes al sacrificio los animales recibieron por vía intraperitoneal una
solución (5 mg/ml) de 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrDu, Sigma) en solución fisiológica
(dosis: 0.08 mg de BrDu por gr de peso corporal), para la posterior determinación de fase
S del ciclo celular por inmunohistoquimica según técnica que se describe en los
materiales y métodos de la sección l-b.
Se extrajeron las bolsas de Ia mejilla derecha; se realizó un análisis macroscópico
para constatar la presencia de lesiones, y se las fijó en formol al 10% cuando
correspondía o se las almacenó en freezer a —80° C.
En el caso de las muestras necesarias para la detección del FGF-2 por
inmunohistoquimica el material se dividió en dos, una parte se fijó en formol al 10% y se
procesó rutinariamente para su observación microscópica y Ia segunda mitad se fijó en
acetona para procesamiento inmunohistoquimico.
En todos los casos se realizó el procedimiento técnico de rutina (deshidratación e
inclusión en parafina) y posterior coloración de Hematoxilina-Eosina (H-E), con el fin de
realizar el seguimiento del proceso de cancen'zación y Ia clasificación del material.
RESULTADOS
El seguimiento macroscópico y el análisis histológico, en preparados de rutina
coloreados con H-E revelaron que el modelo fue estandarizado tal como se describe
habitualmente en la literatura.
La mucosa normal de la bolsa de Ia mejilla del hámster presenta un epitelio
escamoso estratificado de pocas hileras de células (3 o 4), de aproximadamente 30
micrones de espesor y una capa córnea ortoqueratinizada. El conectivo subepitelial es
relativamente denso sin glándulas ni otras estructuras anexas de aproximadamente 60-80
micrones de espesor (figura 5 a). Por debajo de el hay una capa muscular, ausente solo
en el fondo de la bolsa, que permite los movimientos necesarios para la introducción y
expulsión de alimento en condiciones fisiológicas normales. La capa muscular se continúa
con una adventicia sumamente laxa, donde transcurren vasos y nervios, que separan la
pared muscular de la boca hacia adentro. La Iaxitud de este tejido permite fácilmente la
eversión de Ia bolsa para su examen fuera de la mejillasin daño alguno de las estructuras
anatómicas ni de su irrigaciónsanguínea.
Figura 5
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Áreas caracteristicas de los diferentes estadios de transformación maligna en el modelo de carcinogénesis de labolsa dela mejilladel hámster.a) epitelio normal b) epitelio cancerizado de aspecto morfológiconormal (NUMF)c) hiperplasia d) displasia e) carcinoma ¡nsitu f) carcinoma diferenciado.b, c, d, e yfcorresponden a una bolsa tratada con DMBAdurante 16semanas.Tinción H-E, a, b, c, d, e magnificación final 350 X; f 100 X.
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SecciónI a 46
Cuando esa mucosa fue sometida a topicaciones con aceite mineral, el vehicqu del
cancerígeno, durante 4 meses, no presentó alteraciones morfológicas (figura6).
FIGURA 6
Fotomicrografía de una mucosa control de Iabolsa de Ia mejilla del hámster tratada durante16 semanas con el vehiculo del cancerígeno(aceite mineral).H-E, magnificación final 350X.
El proceso de cancerización se da en forma continua a medida que se va aplicando
el cancerígeno en forma constante (3 veces por semana). Los primeras modificaciones
macroscópicas aparecen hacia las 6 semanas de topicación; al evertir la bolsa se
observan lesiones blancas, hiperqueratósicas, en todo semejantes a la Ieucoplasia
(entidad pre-maligna de la boca humana). A las 12 semanas aparecen los tumores como
pequeñas masas exofíticas de 2 a 3 mm de diámetro que se van agrandando hasta
alcanzar 1 a 1.5 mm de diámetro al final de los tiempos experimentales estudiados (17
semanas) (figura7). En ese momento se observan lesiones induradas, a veces ulceradas
que aumentan el espesor de la pared y corresponden a tumores que crecen en formaendofítica.
Todas estas lesiones van aumentando en número y gravedad a medida que se
acumulan los efectos de Ia topicación con el cancerígeno, si bien las lesiones pre
malignas y los tumores son siempre focales y coexisten con zonas de mucosa sinalteraciones evidentes.
Microscópicamente, los primeros cambios se manifiestan en el tejido conectivo, con
una desmoplasia subyacente a epitelios aún sin alteraciones histológicas (figura 8). Nos
referimos en particular al estudio de estas áreas de fibrosis en la sección l-c.
En el epitelio las primeras respuestas son de tipo hiperplásico. El epitelio aumenta
su espesor manteniendo ordenados sus estratos. Estos cuadros predominan hacia la
semana 4 de tratamiento alternando con áreas extensas de epiteliode apariencia
histológica normal. A estas zonas de epitelio cancerizado por el DMBApero de aspecto
morfológico normal las hemos llamado zonas NUMF(por sus siglas en inglés: no unusual
microscopic features) (figura 5 b). A medida que progresa el tiempo de cancerización van
SecciónI a 47
FIGURA7
a) Hamster durante el proceso de topicación. b)Bolsa de la mejilla del hamster tratada conDMBA durante 16 semanas. La bolsa se
observa evertida y presenta un tumor exofiticorodeado de mucosa cancerizada. c) Wstamacroscópica de un carcinoma de célulasescamosas correspondiente a una bolsacancerizada durante 14 semanas.
FIGURA 8
Fotomicrografía de un área desmoplásicasubyacente a un epitelio sin alteracioneshistológicas. La mucosa ha sido sometida altratamiento con DMBAdurante 5 semanas.
H-E, magnificación final 50X.
apareciendo cuadros displásicos. Los epitelios hiperplásicos pierden su ordenamiento en
estratos con diferenciación ordenada hacia la superficie, y la relación núcleo-citoplasma
se altera irregularmente, configurando cuadros semejantes a una displasia leve o
moderada. Luego se suman atipías celulares evidenciadas por núcleos de tamaños y
forma alteradas que alternan con elementos más normales configurando cuadros de
displasia severa o carcinomas “insitu” (ClS) (figura 5).
Un análisis cronodinámico del proceso de carcinogénesis reveló que a las seis
semanas de topicaciones predominaban los cuadros hiperplásicos con algunas imágenes
de displasia leve y moderada y a la semana diez se sumaban cuadros de displasia severa
y esporádicamente aparecía alguna imagen de CIS. Entre las semanas 12 y 14 aparecen
los carcinomas exofiticos, sésiles o pediculados, muy diferenciados pero con signos
variados de atipías celulares (figura 9).
SecciónI a 48
FIGURA 9
Fotomicrografia de un tumor exofiticopequeño, característico luego de 12semanas de cancerización.
H-E, magnificación final 20X.
El epitelio está hiperqueratinizado y las capas córneas acompañan las
invaginaciones del epitelio. Finalmente, entre la semana 16 y 17 aparecen carcinomas
endofiticos constituidos por cordones epiteliales de poco espesor, con escasa o nula
diferenciación córnea que infiltrany engrosan el espesor de la pared de la bolsa, invaden
las capas musculares, llegando a la adventicia. Estos tumores son en un todo similares a
los carcinomas de células escamosas de la boca humana (figura 10).t
FIGURA 10
Fotomicrografias de los distintos tipos decarcinomas de la bolsa de la mejilla delhamster.
a) Carcinoma exofltico diferenciado, H-E,magnificación final 350X.
b) Carcinoma endofitico, H-E, magnificación100X
Aún en estas últimas etapas del proceso pueden encontrarse en una misma bolsa,
uno o dos tumores endofiticos, hasta 4 ó 5 tumores exofiticos, y entre ellos, zonas pre
neoplásicas (hiperplásicas, displásicas o CIS) y zonas NUMF (figura 5, b, c, d, e, f). La
SecciónI a 49
figura 11 muestra un corte transversal completo de una bolsa cancerizada durante 16
semanas donde se observan todas las lesiones mencionadas.
FIGURA 11
Cancerización de campoLa fotomicrografia corresponde a una bolsa de la mejilla del hamster completa cancerizada durante 4 meses. Seobservan todas las lesiones caracteristicas del modelo: A- NUMF,B- carcinoma, C- CIS.H-E, magnificación final 20X.
CONCLUSIONES
El modelo de cancerización con DMBAde la bolsa de Ia mejilla del hámster es
altamente reproducible. Las lesiones pre-neoplásicas y neoplásicas
observadas son coincidentes a las descriptas en la literatura y semejan el
proceso de cancerización de la boca humana.
Las áreas NUMF
constituyen un modelo para estudio de alteraciones sub-microscópicas
(epitelio cancerizado sin alteraciones histológicas)
propias de las etapas iniciales de la cancerización de campo.
Si bien las lesiones epiteliales se dan en forma continua y progresiva
aumentando en severidad a medida que aumenta la cantidad de cancerígeno
aplicado, pueden definirse para su estudio como: lesiones hiperplásicas y
lesiones displásicas leves, moderadas o severas. Todas ellas, según la
modalidad de análisis que se realice sobre el modelo, pueden agruparse
como “lesiones pre-neoplásicas o pre-malignas”.
Las neoplasias del modelo definen dos tipos macro y microscópicamente
Sección I a 50
distintos de tumores: los exofiticos bien diferenciados y los tumores
endofiticos mas indiferenciados, con cordones más atipicos e infiltrantes.
En las últimas etapas de la canoen'zación, los tumores coexisten con lesiones
pre-neoplásicas y zonas epiteliales de apariencia normal (NUMF)
configurando los cuadros propios de la cancen'zación de campo.
SECCION I-b
Variaciones dela ploidia epitelial en la carcinogénesis de la bolsa de la mejilladel hámster
INTRODUCCIÓN
Tanto en la boca humana como en la bolsa de la mejilla del hámster Ia clasificación
de las etapas pre-malignas y malignas se realizan con criterios histológicos. La gradación
de malignidad y pre-malignidad basada en criterios morfológicos ha sido utilizada desde
los comienzos de la patología hasta hoy. No obstante Ia reproducibilidad de la gradación
histopatológica es relativamente baja debido justamente al criterio de evaluación subjetivo
(Cutler y col., 1966; Stenkvist y col., 1979; Delides y col., 1982).
En los epitelios canoen'zados del modelo del hámster se han descripto alteraciones
en la expresión de citoqueratinas, oncogenes y genes supresores (Murase y col., 1986;
Husain y col., 1989; Gimenez-Confi y col., 1990; Chang y col., 1996). Estas alteraciones
se han estudiado en relación a los tiempos de cancen'zación y en general no se han
relacionado a las diferentes lesiones histológicas que coexisten en la bolsa en todos los
tiempos experimentales.
La cuantificación del ADN para estudios de ploidia realizada por el método de
análisis de imágenes de cortes histológicos, permite evaluar separadamente los distintos
tipos de lesiones y obtener indicadores numéricos para cada una de ellas. El análisis de
ploidia se utiliza en diagnóstico y prognosis de diversas entidades tumorales y en
particular en tumores bucales (Schimming y coI., 1998; Paes de Lima A., 1999; Abou
Rebyeh y col., 2001; Russo y col., 2001; Lundgren y col., 2002)y actualmente es uno de
los estudios solicitados por los comites oncológicos para decisión terapéutica y
seguimiento de casos de neoplasias diversas. También se ha postulado que puede
utilizarse como elemento de predicción de transformación maligna de lesiones orales pre
neoplásicas como la leucoplasia (AbdeI-Salam y col., 1987; Sudbo y coI., 2001; Sudbo,
2001).
Se realiza habitualmente mediante 2 técnicas diferentes: la citometría de flujo que
utiliza células en suspensión y proporciona datos sobre grandes poblaciones celulares,
muy manejables estadísticamente y la citometría estática que hace posible conservar la
morfología de la lesión en un corte histológico. La citometría de flujo ha sido
Sección I b 52
extensamente utilizada, pero puede emplearse solamente con volúmenes adecuados de
tejido tumoral disponible de piezas quirúrgicas o Iisados de preparados histológicos. La
cuantificación de ADN por análisis de imágenes es una alternativa a ese método.
Presenta la gran ventaja de ser aplicable a extendidos citológicos y a preparados
histológicos en pequeñas áreas preservando Ia arquitectura del tejido, pero requiere
severos cuidados metodológicos para evitar errores derivados de la reproducibilidadde la
tinción estequiométrica del ADN y de Ia medición citométrica. Por ello, antes de su
aplicación al modelo de cancen'zación de la bolsa de la mejilla del hamster, realizamos su
puesta a punto y las modificaciones necesarias para optimizar Ia técnica.
AJUSTE METODOLÓGICO DEL ANÁLISIS DE PLOIDÍA
o Técnica de Feulgen- Curva de hidrólisis
En la puesta a punto del análisis de ploidía en el tejido a estudiar, el primer paso fue
estandarizar la técnica histoquímica de Feulgen (Feulgen y Rossenbeck, 1924). Esta
técnica es la más utilizada para teñir específicamente el ADNnuclear y luego cuantificarlo
microespectrofotométricamente. La metodología proporciona información “insitu” del ADN
nuclear, basada en una hidrólisis ácida, seguida de un revelado de los grupos aldehído
con el reactivo de Schiff.
El reactivo de Schiffes una solución de fucsina básica decolorada con metabisulfito
de sodio (804 Na) que recupera su color en contacto con grupos aldehídos, por reducción.
Cuando los cortes histológicos se someten a Ia acción hidrolítica del ácido clorhídrico
(HCI),el ADN nuclear se descompone en purinas y pentosas de forma que sobre cada
molécula de azúcar reaparece un grupo carbonilo, que reacciona con la solución de Schiff
produciendo una tinción rojo magenta cuya intensidad es proporcional al ADN hidrolizado.
Dado que Ia reacción de Feulgen es estequiométrica, puede ser cuantificada
microespectrofotométricamente (Riss, 1948; Riss y Misty, 1949).
La hidrólisis ácida del ADN puede realizarse con ácido nítrico (HNOa) o HCl 5N a
temperatura ambiente (Itikawa y Ogura, 1954) obteniéndose una hidrólisis óptima. Si la
hidrólisis no se realiza completamente, el resultado es una coloración más débil de los
núcleos, debido a una reacción de parte del contenido total de ADN. Por el contrario, si el
tiempo se prolonga, se produce una despolimerización y extracción del ADN, dando
también como resultado una coloración más débil (Deitch y Godman, 1966). Esto hace
que, después de preparados los reactivos y el material, en cada laboratorio deba
Sección I b 53
optimizarse el tiempo de hidrólisis en el material a utilizar. La adecuada preparación de los
reactivos para la técnica de Feulgen es crítica para el mantenimiento de la estequiometría.
Particularmente es importante la pureza y densidad del ácido clorhídrico utilizado tanto
para la hidrólisiscomo para Ia preparación del reactivo de Schiff .
ANÁLISIS DE PLODÍA.
a- Factores de corrección
La microfotometriaestática se realiza sobre preparaciones histológicas de dos tipos:
extendidos citológicos o cortes histológicos. En los extendidos, todos los núcleos celulares
están enteros y por ende con su contenido total de ADN. En los cortes histológicos, en
cambio, un porcentaje de núcleos no está contenido totalmente en el espesor del corte.
Cuando los núcleos seccionados no pueden identificarse y son erróneamente medidos en
menos, se produce un error metodológico, dado que se evalúa solamente una parte de
ADN. En muchos tejidos, si se aumenta el espesor de los cortes para obtener mayor
porcentaje de núcleos enteros, las células se superponen aumentando el error de medida
y disminuyendo su visualización. Esto hace que deba optarse en cada caso por un
“espesor de compromiso" donde el error se disminuya estadísticamente aumentando el
número de células medidas (Steinbeck y col., 1999). La otra posibilidad es asumir que el
producto ADN-Schiffestá homogéneamente distribuido en el núcleo, entonces como el
núcleo celular se asemeja geométricamente a una esfera, se puede estimar el contenido
de total de ADN. Por relación de volúmenes entre Ia parte del núcleo contenido en el
espesor del corte y el volumen de una esfera de igual diámetro se calcula el contenido
nuclear. Los analizadores de imágenes brindan datos morfométricos, en pixels, de las
células medidas. Con el valor del radio celular en pixels y el valor del espesor del corte se
calcula el volumen nuclear. Pero si el valor del espesor no es exacto nuevamente se
suma error a la medición, y es sabido que el espesor de corte graduado en el micrótomo
tiene variaciones entre el valor indicado y el real.
Para tratar de solucionar este problema y trabajar con mayor precisión, en nuestro
laboratorio se ha desarrollado un método basado en Ia preparación de material de
referencia, como patrón o "estándar" (Cabn‘niy col., 1998) para saber con mayor exactitud
el espesor del corte utilizado. Estos patrones son cilindros de celoidina 7 %, coloreados
con el método de ácido periódico Schiff (P.A.S.) e incluidos en parafina (ver página 59 de
materiales y métodos). Se realizan cortes de diferente espesor cada uno de los cuales se
Sección I b 54
divide en dos mitades. Una de ellos se monta para su medida microfotométrica. Los otras
mitades se apilan y se vuelven a incluirpara ser cortadas transversalmente para medir el
espesor real con un ocular micrométrico. Con ello se realiza un normograma que
relaciona densidad óptica (D. O.) con el espesor real de los cortes del cilindro de
celoidina. Se reserva un grupo de cilindros procesados simultáneamente para usarlos
como estándar. Antes de realizar los cortes de los tejidos a estudiar se adhiere al taco de
parafina un cilindrode modo de seccionarlos juntos. Se divide el corte para montarlos con
una separación que permita colorear el tejido solamente (figura 12).
A_ i FIGURA 12
Representación esquemática de los, pasos seguidos para Ia obtenciónl del cilindro de celoidina (teñido con
P.A.S.), para realizar el control delespesor del corte.Adaptado de Cabrini y ool. (1998).
e> ®® p a»?!
D
W ,Una vez terminado el preparado, el espesor del corte se determina midiendo la D.O.
del corte del cilindroy entrando con ese valor por la ordenada del normograma, se lee en
la abscisa su espesor real en micrones.
De esta manera en el caso de núcleos de diámetro mayor al espesor del corte, se
puede aplicar un factor de corrección que aproxime el contenido de ADN medido al
contenido real del núcleo completo,
Una segunda fuente de error en las mediciones de ADNen cortes de tejido puede
provenir de la lectura del fondo no especifica de núcleos teñidos con Ia reacción de
Feulgen. Esa medición errónea deriva de la existencia, en núcleos grandes, de áreas de
núcleo no ocupadas por cromatina, en particular cuando se trata de poblaciones celulares
mixtas (Iepto y paquicromáticas).
Aufferman y col. evaluaron el fondo a través de la cuantificación del área alrededor
de cada núcleo en células aisladas en extendidos celulares (Auffermanny col., 1984). Ese
tipo de corrección es muy dificil de implementar en preparados histológicos, por ello se
utiliza como blanco (100% de transmitancia) la medición de una zona del vidrio y del
medio de montaje fuera del tejido. En esos casos no se estima correctamente la lecturade fondo.
Sección I b 55
Para estimar esa corrección, nosotros calculamos el factor de error aportado por la
lectura errónea de fondo en nuestro sistema y obtuvimos un valor de fondo por unidad de
área (expresada en pixels). La metodología para este cálcqu se detalla en la página 64.
Estas modificaciones nos han permitido, con correcciones simples incorporadas a la
rutina, adaptar la medición de ADN a diferentes lesiones que coexisten en la bolsa
cancerizada y hacer mas reproducibles los datos.
b- Control del valor diploide
El análisis de ploidía requiere Ia medida precisa de un valor diploide (2C), en cada
muestra a utilizar, dado que la ploidía de las células tumorales se expresa en valores
relativos a los obtenidos en células patrón que deben ser procesadas simultáneamente.
Se comenzó con Ia medición de los valores de ADN de linfocitos, células maduras en Go,
generalmente disponibles en el mismo corte histológico, que son frecuentemente
utilizadas como estándares de valor diploide en la literatura internacional (Bocking y col.,
1984; Booking y ool., 1989). Sin embargo se sabe que por razones técnicas y de
compactación de la cromatina Ia lectura del ADN de los mismos puede dar valores
menores al valor diploide real. Bohm y colaboradores en 1968, describieron desviaciones
en los valores esperados (por la constancia del ADNde cada especie) de ADNal teñir con
Feulgen hepatocitos, linfocitos, granulocitos y esperma (Bohm y co|., 1968). Los linfocitos
y los granulocitos dieron valores menores que los hepatocitos diploides en todos los
tiempos de hidrólisis estudiados, mientras que las espermátides (haploides) dieron
valores mayores al diploide. Estas diferencias no aparecían cuando los núcleos del mismo
tipo celular, con distintas ploidias (hepatocitos diploides y tetraploides) se comparaban. La
diferencia en las mediciones entre linfocitosy hepatocitos de una misma especie también
se describen en el trabajo de Hale (Hale, 1963).
Se desarrollaron diversas teorías que explicarian esas diferencias presentes en
distintas células, una de ellas supone que los errores proporcionales se deben a
variaciones en el comportamiento de las nucleoproteínas durante la hidrólisis del Feulgen
(Bohm y col., 1968). Por lo cual desde aquellos primeros trabajos en donde se describió el
fenómeno, se sugiere probar la técnica a distintos tiempos de hidrólisis (premáximo,
máximo y postmáximo), práctica que se observa en los trabajos, sobre el tema,
rigurosamente realizados.
Pese a estas dificultades técnicas los linfocitossiguen siendo utilizados como control
diploide dada la facilidadcon que estos se encuentran en las cercanías o dentro del tejido
Sección I b 56
tumoral. Actualmente se recomienda utilizarlos pero se debe establecer un valor de
corrección de su lectura respecto al valor normal de las células del tejido a estudiar
(Bocking y col., 1984; Bocking y col, 1989). Por ello determinamos el factor de corrección
por condensación cromática (FCC)para nuestro sistema de estudio.
Luego que se obtiene el valor diploide normal se pueden estudiar las lesiones
elegidas y analizar sus desviaciones, realizando los análisis de ploidía (figura 13). Ello se
analiza sistemáticamente por medio de histogramas de ploidía. En los mismos se
relacionan los valores de ADN de los núcleos a evaluar con el de los linfocitos ya
corregidos por su FCC.
Con el valor de ploidía luego se pueden calcular diversos índices que ayudan a
aportar mas datos sobre el comportamiento del tejido.
a ' .. V . . b \\
. A0 ‘ '5 A V' . Y
Reacción de Feulgen en un carcinoma dela bolsa cdel hámster
FIGURA 13
Representación esquemática de lasecuencia de pasos necesarios para realizaranálisis de ploidía.a) Realización de la reacción de Feulgen. b)Análisis microespectrofotométrico y obtenciónde los datos digitalizados. c) Confección de —histograma de ploidía.
1o- Histograma de ploidíadel carcinoma
frecuencia
8
ploidía
En el caso de la citometría estática, si bien se puede especular que un tejido o tumor
está en plena proliferación por los valores de ploidía obtenidos, no se puede discriminar
cual etapa del ciclo celular es la afectada. Por ello suelen acompañarse los índices de
ploidía (aportando información sobre poliploidia o aneuploidia) con los datos de algún
marcador de proliferación celular, preferentemente los de incorporación de bromo
deoxiuridina, que estima la fase S del ciclo celular (figura 14).
Sección I b 57
FIGURA 14
Esquema de la variación en la cantidad deADNdurante el ciclo celular de una célula
eucariótica típica. La replicación de ADNseproduce durante la interfase, conocida comofase S, estimada a través de la incorporaciónde BrDu.
contenldodeADN
OBJETIVOS
o Ajustar el método de evaluación de la ploidía por análisis de imágenes para ser
aplicado a las lesiones microscópicas del modelo de cancerización química de la
bolsa de la mejilladel hámster.
o Caracterizar cuantitativamente las lesiones epiteliales de las diferentes estadios
de la carcinogénesis.
o Demostrar lesiones no observables en las preparaciones microscópicas de rutina.
Sección I b 58
MATERIALES Y MÉTODOS
AJUSTE METODOLÓGICO DEL ANÁLISIS DE PLOIDÍA
1) Técnica de Feulgen - Curva de hidrólisis
Como se mencionó en la introducción Ia pureza y densidad del HCI es de suma
importancia para que se cumpla la estequiometría de la reacción. Por ello junto al ajuste
del tiempo de hidrólisis se analizó la variación de los resultados trabajando con ácidos
clorhídricos de distinta marca. Realizando la hidrólisis con cada uno de los HCIy a su vez
controlando la preparación del reactivo de Schiff. Dado que existe una fórmula clásica,
Tomassi, 1936 (Pearse, 1990), y posteriores variaciones de la misma, se preparó el
reactivo de las dos formas y se probaron distintos ácidos clorhídricos. Luego se
compararon los resultados de Ia reacción de Feulgen realizada con reactivo el reactivo
preparado en ambas formas y el reactivo de Schiff comercial.
Ácido Clorhídrico
1) Berna, 6 = 1,18 gr/ml
2) Merck, 6 = 1,19 gr/ml
Reactivo de Schiff
- Fórmula Clásica (según Tomasr)
1 gr de pararosanilina (Sigma, C. l: basic red 9. 42.500)
200 ml de agua destilada hervida a 100° c
Se mezcla y se deja llegar a 50° C, se agregan 20 ml de HCl 1N.
Se deja enfriar hasta 25° C y se agregan 2 gr de metabisuifito de sodio (804 Na').
Se guarda en frasco color caramelo hasta el día siguiente (24 horas), debe tomar un color
pajizo.
Aldía siguiente se agregan 0,5 gr de carbón activado y se filtra.
oFórmula Modificada
2 gr de pararosanilina (Sigma)
250 ml de agua destilada hervida a 100° c
Se mezcla y se agregan 3,8 gr de (804 Na’).
Se agregan 4 ml de HCIpuro.
Se guarda en frasco color caramelo hasta el día siguiente (24 horas).
AIdía siguiente se agregan 0,5 gr de carbón activado, filtrar.
Sección I b 59
- Reactivo comercial
Biopurdel kit comercial para realizarla reacción de PAS.
Para las pruebas se utilizaroncortes de higado de hámster, fijados en formol 10% e
incluidos en parafina
Previo a la técnica histoquímica se prepararon los cortes, se desparafinaron y se
deshidrataron (dos pasajes de cinco minutos por inoI, dos pasajes de cinco minutos por
alcohol absoluto, dos pasajes de cinco minutos por alcohol 96% y luego 3 o 4 lavados con
agua destilada). Luego fueron sometidos a una hidrólisis de 10 minutos a temperatura
ambiente con HCI 1N (para preparar el tejido).
Reacción de Feulgen
-Hidrólisis con HCI5N a temperatura ambiente, tiempos variables y luego dos horas
en oscuridad a temperatura ambiente con el reactivo de Schiff.
-Lavados :
agua destilada
10 minutos en agua sulfurosa (HCI 1N, 5% VN, metabisulfito de K+ 10%. 5% VN)
agua corriente, bajo canilla 10 minutos.
-Deshidratado, aclarado y montaje.
Las curvas realizadas fueron las siguientes:
I) Schiff modificado, hidrólisis con HCI Berna, tiempos 30, 60, 90, 120, 240,
480 minutos.
II) Schiff comercial, hidrólisis con HCI Merck, tiempos 30, 60, 90, 120, 240, 480,
960 minutos.
lll) Schiff según Tomasi, hidrólisis con HCI Merck, tiempos 30, 60, 90, 120, 240,
480, 960, 1620 minutos.
Cada uno de los puntos de las curvas l, II, Ill corresponden a la medición de un
corte de hígado y en cada caso se midieron 50 células. Los datos se expresan como la
media :t DS.
2) Preparación del cilindro de celoidina, patrón de espesorCilindro
Tamaño: 3 mm de diámetro y 1 cm de alto.
Material: celoidina 7% en partes iguales de alcohol absoluto y éter etílico, endurecida
en alcohol 70°.
Sección I b 60
Coloración: P.A.S. (ácido periódico al 1% durante la noche, lavado en agua destilada
1 hora, solución de Schiff en oscuridad y fijación en formol al 10% 6 horas), luego lavado
de 2 horas en agua corriente, deshidratación durante 6 horas en alcoholes crecientes e
inclusión en parafina.
Se realizaron cortes en micrótomo convencional con diferentes grosores. Se
determinaron los espesores reales y las medidas microfotométricas para confección de la
curva de referencia según el método de Cabnni y col. (Cabn’niy col., 1998).
3) Determinación del valor de fondo de la tinción
Para comprobar la existencia de errores por lectura de fondo inespecífico, se
utilizaron cortes de distintos espesores (5, 10 y 15 um) de hígado de hamster y
carcinomas de la bolsa dela mejilladel hámster (8pm), fijados en formol al 10%.
Utilizando como blanco de la medida de 0.0. por fuera del tejido, medimos áreas
extra-nucleares en dos condiciones:
Fondo l) mediciones de distintos sectores de citoplasma, teniendo cuidado de evitar
el núcleo, en cortes de distinto espesor de hígado teñidos con la técnica de
Feulgen,
Fondo ll) las mismas mediciones que en I pero en cortes sin colorear.
Se relativizó la D. O. por píxel.
Se utilizaron 5 animales. Cada punto de la curva se realizó por triplicado.
Luego, para evaluar el error por lectura de fondo en nuestro material realizamos la
lectura de fondo en cortes teñidos de carcinomas de la bolsa del hámster, a 8 um
(espesor utilizado para el análisis de ploidía). Se cuantificó la densidad óptica de distintas
áreas citoplasmáticas y se estableció una correlación entre área y TOD (TOD, de la
abreviatura en inglés: total optical density).
Se utilizaron 7 animales y en cada preparado se midieron en promedio 10 áreas
extranucleares. Con esas mediciones se realizó el cálculo del factor de corrección por
lecturas de fondo FCf.
4) Determinación del valor ZCen hámster
Para la determinación del valor diploide en el modelo utilizado se trabajó sobre
bolsas normales de la mejilla facial del hámster y linfocitos medidos en el estroma de
carcinomas de la bolsa de la mejilla del hámster. Se utilizaron 10 carcinomas y 10
mucosas normales.
Sección l b 61
Estudiamos por separado las células suprabasales y basales del epitelio de lamucosa.
Calcqu del factor de corrección por condensación cromática (FCC):
FCc = TOD células epiteliales/ TOD linfocitos
Se calculó un valor para el estrato suprabasal y uno para el basal.
En nuestro material fue de FCaxsa.)= 1.29, FC(suprab¡ai)= 1.23. Esos valores se
multiplicaron por el valor que se obtiene de Ia medición de los linfocitos en cada
preparado.
ANÁLISIS DE LA PLOlDÍA
Se utilizaron 85 hámsters. Los animales fueron sometidos al protocolo estándar de
cancerización (según materiales y métodos, sección I-a).
Los tiempos de cancerización fueron: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 16 y 17 semanas de
tratamiento. El grupo control fue sometido a cada uno de los tiempos experimentales con
el vehícqu utilizado en la preparación del carcinógeno (mineral oil).
Los animales se dividieron en 2 grupos:
o Tiempos largos de cancerización (16-17 semanas) para el que se utilizaron 35
animales, divididosen 20 animales experimentales y 15 animales control.
o Tiempos intermedios (6 a 10 semanas) para el que se utilizaron 25 animales (5
por cada tiempo experimental), y 15 animales control, 3 por cada tiempo
experimental.
Además se utilizaron 10 animales sin tratamiento para cuantificar la ploidía de la
mucosa normal.
Los animales fueron sacrificados y previamente inyectados con BrdUcomo se indica
en materiales y métodos de la sección l-a.
Las bolsas fueron disecadas y procesadas rutinan’amente para Ia inclusión en
parafina. En cortes teñidos con H-E se seleccionaron áreas de: carcinoma (Ca),
carcinoma in situ (CIS), displasia (D), hiperplasia (H), y epitelio sin cambios morfológicos
(NUMF), en cada tiempo experimental correspondiente. En los animales control tratados
con el vehícqu (C) se midieron entre 5 y 8 áreas.
o Citometría
En cortes adyacentes a los teñidos con H-E (cortes entre 7y 8 pm) se realizó la
tinción de Feulgen. La hidrólisis se realizó durante 90 minutos, de acuerdo con el tiempo
Sección I b 62
obtenido en la curva de hidrólisis para este material (ver resultados) con HCI 5N a
temperatura ambiente. Las áreas previamente seleccionadas en los cortes de H-E fueron
identificadas en proyecciones de los cortes teñidos con Feulgen. El análisis de ploidía se
realizó en cada una de las áreas empleando un microscopio Zeiss MPM-800 con un
objetivo 40X (NA 0.75) un condensador con apertura 0.8 y una cámara blanco y negro
CCD, Hitachi DK 7700-SX K (Hitashi Denshi LTD.), un analizador de imágenes (IBAS
Kontron) y el software para medición de ADN de IBAS versión 1.0, (LANAlS-MEF,
CONICET-CNEA).
Para las medidas densitométricas, las imágenes fueron almacenadas empleando un
filtropasa banda angosto con un pico de absorbancia a 560 nm.
La segmentación se realizó interactivamente. El contenido de ADN de los linfocitos
en los cortes fue tomado como valor de referencia 2C. Aproximadamente se midieron 60
células de cada área seleccionada. Se realizó un software “ad hoc" para corregir las
mediciones por el espesor del corte y las lecturas del fondo. Se corrigió además el valor
de los linfocitos (según se explicó en la página 55), se realizaron histogramas de
frecuencia para cada caso y finalmente se calculó la ploidía.
La ploidía fue tomada como el cociente entre el TOD medio de las células medidas y
el valor 2C de referencia. El software “DNA”calcula además un índice de aneuploidía
(5CER) que es el número de células con contenido de ADN mayor a SC (Bocking y col.,
1984).
PROLIFERACIÓN CELULAR
Un segundo corte adyacente de 5 micrones se utilizó para estudiar la proliferación
celular por medio de la detección inmunohistoquimica de BrDu. Se utilizaron portaobjetos
silanizados para montar los cortes para evitar que los mismos se despeguen el realizar la
recuperación antigénica.
Se realizó la desparafinación y deshidratación en xiloly etanol respectivamente, pero
antes de terminar la deshidratación se incubaron los cortes en metanol peróxido de
hidrógeno en relación 10011(peróxido de hidrógeno 100 volúmenes) durante 30 minutos
para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena. Luego se realizó una recuperación
antigénica en horno de microondas con buffer Citrato a pH 6. Se realizó un bloqueo
inespecifico con lavados en buffer Tris-salino 0.5M, pH 7.6, con albúmina bovina (Gibco
BRL, bovine albumine fraction V) al 0.3%.
Los cortes fueron luego incubados con un anticuerpo anti-BrDu monoclonal de ratón
Sección I b 63
(# 247M, 1:25; Biogenex, San Ramon California, USA) durante toda la noche a 4°C.
Luego de lavados con el buffer Tris-salino-albúmina se realizó la incubación con un
segundo anticuerpo biotinilado (dilución 1:200, IgG antiratón de Biogenex, Kit Multilink)a
temperatura ambiente durante 1 hora en cámara húmeda. Finalmente se incubó en las
mismas condiciones ya mencionadas con un complejo de peroxidasa-estreptavidina
(Biogenex). Se reveló con 3,3-diaminobencidina al 0.05% (DAB, Sigma) en buffer Tn's
0.5M y 1% de peróxido de hidrógeno y se detuvo la reacción con agua destilada. Se
realizó coloración de los núcleos negativos con hematoxilina.
Como control negativo se utilizaron cortes adyacentes que fueron procesados
omitíendo Ia incubación con el anticuerpo primario.
Se calculó el índice de proliferación (Iabeling index= LI) como número de células
marcadas sobre total de células del área elegida (magnificación 40X), utilizando un
software “ad hoc" que reconoce núcleos reactantes a DABy núcleos con hematoxilina. En
promedio se utilizaron5 campos por cada área elegida.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO:
Los datos se expresan como la media :t el ES o media + el ES. Se utilizó el test de
ANOVA,seguido por el test Duncan, LSD o Newman-Keuls como contraste a posteriori
para el análisis de ploidia y de proliferación celular. Se realizó un ANOVAde 2 vías para
estudiar las diferencias entre el estrato basal y suprabasal para cada categoría histológica
y el estudio de las áreas NUMFy PREN entre la semana 6 a 10 de tratamiento.
Se utilizó el "test t" para estudiar las diferencias entre el epitelio normal y el tratado
con el vehiculo. Y se realizó una correlación de Pearson para determinar el valor de fondo
de Ia tinción.
Se consideró significativa una diferencia con una significancia del 5% (ps0.05).
RESULTADOS
AJUSTE METODOLÓGICO DEL ANÁLISIS DE PLOIDÍA
o Determinación del tiempo de hidrólisis
El ajuste correcto de una curva de hidrólisis exige que se defina una meseta de
valores constantes. Si esta meseta es muycorta el margen de tiempo de trabajo se acorta
aumentando el error metodológico. En las curvas l, II, III (figura 15) se observan las
diferencias entre los distintos reactivos de Schiff preparados en laboratorio y el reactivo
Sección 1 b 64
comercial, con el cual la meseta de Ia curva recién se estabiliza a los 120 minutos. Este
tiempo es excesivamente largo si se lo compara con los utilizados en la literatura en otros
modelos y alarga el tiempo total de la técnica haciéndola menos manejable (figura 15b ).
En Ia curva con HCIBerna no se puede establecer claramente una meseta. El mejor
resultado fue el obtenido con el reactivo de Schiff preparado según Tomasi (1936) con
HCIMerck (figura 15c ). Se definió como tiempo de hidrólisis óptimo 90 minutos, dado que
a partir de los 60 minutos se estabiliza Ia curva con una meseta que proporciona
márgenes razonables de trabajo.
a ao c ao alTOD
8
o 1do 23° seo 4.50 560 «La 1700
tiempo (min)FIGURA15Curvas de hidrólisis. En cada uno de las casos serealizaron mediciones de TOD a distintos tiempos dehidrólisis en hepatocitos de hamster teñidos con la
v v v u n y, .n—v técnica histoquimica de Feulgen. Los datos se expresan0 100 2m seo 400 son coo 10m .
ww.» comola media1 DS.
a) Curva I, realizada con reacfivo de Schiff modificado y HCI Berna.b) Curva II,realizada con reactivo de Schiff comercial (Biopur) y HCIMerck.c) Curva III,realizada con reactivo de Schiflrsegún Tomasi (1936) y HCIMerck.
o Determinación del valor de fondo
La figura 16-a muestra valores de D.O. por píer obtenidos de cortes de hígado de
hamster de diferentes espesores (fondo Il). Se observa el error por lectura de fondo
debido exclusivamente a la D.O. del tejido cuando se hace blanco (100% de
transmitancia) fuera del corte sobre el medio de montaje. Cuando se realizaron medidas
en cortes con reacción de Feulgen (fondo I) se observaron los valores producidos por
tinción inespecífica. Habiendo determinado la existencia de error por lectura de fondo,
calculamos el factor de corrección para nuestro material en los cortes teñidos de
carcinomas de hámster sobre zonas citoplasmáticas extranucleares (figura 16-b).
Determinamos que el valor de fondo en nuestras condiciones de trabajo en cortes de 8
Sección I b 65
um de espesor fue de 0.022 j: 0.007 por píxel. Por lo tanto, incorporamos el valor de 0.022
como factor de corrección a nuestras mediciones de ADN, restándolo de los valores
crudos de TOD de la medida directa en cada caso cuantificado, antes de realizar el
análisis de ploidía.
aoa
E ono- FIGURA16.>_<
3' ow Obtención del valor de fondo del
8 Feulgen.m' a) Valores de fondo l (4-), cortes teñidos
mi con Feulgen; valores de fondo II (-o),cortes sin tinción. Los datos se expresan
1 . , como la media i DS.5 to rs
espesor ( )b um b) Correlaciónentre TODy área estudiada.
w Las mediciones corresponden a distintas
u 37332;; “m áreas extranucleares de secciones debolsas de la mejilla del hamster, teñidas
con Feulgen. (espesor del corte 8 pm).Correlación de Pearson, p< 0.0001 F1_¿a=
8 92.848,valordefondo= 0.022/píxel.'
o m ¿o ¿o .¿n 4., ¿o m
área (pixels)
ANÁLISIS DE LA PLOIDÍA
Se estudió si el vehículo del cancerígeno ejercía algún efecto sobre la ploidía. Los
valores de ploidía para el epitelio sin tratar (2.12 i- 0.43, n = 10) no difin'eron
significativamente del epitelio tratado con el vehículo (2.39 i 0.22, n = 6, t14=1.408, p =
0.18).
Luego se analizó si existían diferencias entre el estrato basal y suprabasal en las
categorías histológicas NUMF, H y D (Tabla 2) y no mostraron diferencias significativas.
Por Io tanto se calculó el valor promedio de los FCCde cada estrato obteniéndose un FCc
= 1.26 con el que se corrigió el valor de los linfocitos para obtener el valor diploide y se
trabajó con los valores de todo el espesor del epitelio.
Sección I b 66
C NUMF H D
Basal 2.23i0.13 2.78i0.10 3.11¿0.13 2.92i0.17
Suprabasal 2.01 i 0.17 2.58 i 0.13 2.83 i 0.21 2.96 i 0.24
TABLA 2
Valores de ploidía en áreas NUMFy pre-neoplásicas para los estratos basal y suprabasal. ANOVAde dos vias,variable estrato epitelial F1_124= 1.76 p= 0.18; variable categoria histológica F1 124= 8.18 p<0.0001; Interacción p =0.82. Los datos se expresan como la media + ES.
En Ia figura 17-a se observan los
resultados obtenidos al calcular la ploidía de a
los distintos grupos histológicos analizados.
Como se esperaba los Ca y CIS mostraron
un aumento significativo comparados con el
control. Pero en el caso de las categorías
pre-neoplásicas y la categoría NUMF los
resultados fueron de destacar. Las zonas
hiperplásicas y displásicas presentaron un
aumento significativo de Ia ploidía con
respecto al control y no difirieron entre si. En
el caso de las áreas NUMF,sus valores son
algo menores al de las categorías pre
neoplásicas, pero significativamente mayores
que el control.
La figura 18 presenta un histograma de
ploidía representativo del epitelio control y de
Ia categoria NUMF, donde se manifiesta el
desvío en los valores de ploidía de esta última
hacia la derecha. La figura 18 presenta
histogramas de ploidía característicos de las
categorías pre-neoplásicas y neoplásicas de
la bolsa de la mejilla del hamster.
Al calcular el índice de aneuploidía se
observa claramente la diferencia entre las
Cancen'zación durante tiempos largos (desarrollo de tumores)
C NUMF H
C NUMF H D CIS Ca
FIGURA 17
Análisis de Ploidia de los distintos gruposhistológicos a las 16 semanas de cancerización.a) Valores de ploidía para las distintas categoríashistológicas, ANOVA F5155 = 7.93, p< 0.0001, ' p<0.05 vs C, comparaciones a posteriori, test Duncan.b) Indice de aneuploidía (ScER) en función de lasdistintas categorias hístológicas, ANOVA F5, 155=5.37, p< 0.0001, " p< 0.0001 para Ca vs el resto delas categorías y para CIS vs NUMF.'p< 0.05 vs Cy Ca. Comparaciones a posteriori, test Duncan.Los datos se expresan como la media + ES.
Sección I b 67
categorías pre-neoplásicas y neoplásicas. Los Ca y CIS (12.931 1.91 y 13.01;t 3.97
respectivamente) tienen un valor de 5CER muy elevado respecto de H y D (7.14i 1.6 y
7.061 1.66 respectivamente). Los tumores y Cis no difieren significativamente entre si. Ca
difiere significativamente de todas las categorías y CIS difiere significativamente de NUMF
y C. El índice de aneuploidía de H y D difiere significativamente de C y Ca . En cuanto a
las áreas NUMF su el SCER está disminuido significativamente respecto de CIS y Ca
(figura 17-b).
P=2.0410.07 25 4 P = 2.51 t0.10
P= 3.41i0.14
frecuencia
P = 4.09 :t 0.22 * P=4.4010.19
ploidía
FIGURA18
Histogramas de Ploidia representativos de cada categoria estudiada. a) Epitelio control. b) epitelio NUMF,c)hiperplasia, d) displasia, e) CIS, f) carcinoma.Jr moda
La linea punteada indica el valor 2C. P, valor medio de Ia ploidía i ES.
Sección I b 68
Al estudiar la proliferación celular (figura 19) se observa un aumento significativo del
Ll de Ca respecto del resto de las categorías y un aumento también significativo de la
proliferación celular de CIS, D y NUMFrespecto del control. Los valores de H son también
mas elevados que el control aunque en nuestra serie no alcanzaron significación.
0.3. FIGURA19
Indice de proliferación (LI) para lasdistintas categorias histológicas a las 16semanas de cancerización.ANOVA F5_53= 6.69, p<0.0001, " p< 0.0001
vs todas las categorias, 'p< 0.05 vs C.(comparaciones a posteriori, test Duncan).Losdatosseexpresanoomolamedia+ES.
0_2. ¡It
LI il
0.1'
C NUMF H D CIS Ca
o Cancerización en tiempos intermedios (lesiones pre-neoglásicas)
Se estudiaron bolsas cancerizadas entre 6 y 10 semanas. Al comienzo de este
período (6 semanas) predominan las lesiones hiperplásicas y prácticamente no se
encuentran zonas displásicas y esta relación se va invirtiendoa medida que aumenta el
tiempo de cancerización. Por ello para este estudio agrupamos las lesiones H y D en la
categoria pre-neoplásicas (PREN) separándolos de las áreas NUMF. Los carcinomas
(pequeños) aparecían hacia la semana 10.
En la figura 20-a se observa la dinámica de las áreas NUMFen etapas tempranas
de la cancerización. Si bien hay oscilaciones en la ploidía entre las distintas semanas, no
llegan a diferir del control (el control es un pool con los valores de ploidía de las bolsas
tratadas con el vehículo entre 6 a 10 semanas, no diferían entre sí los distintos tiempos) .
En el gráfico se incluyen los valores de las áreas NUMFmedidos en los tiempos largos de
cancerización (16 semanas). Es interesante notar que las zonas NUMF revelan un
aumento importante de la ploidía luego de 4 meses, al punto que difiere significativamente
de C. Ese aumento podría marcar un acúmulo de mutaciones que ya se evidencian
groseramente por análisis de ploidía y que aún no producen lesiones observables
morfológicamente.
Con respecto a las áreas PREN también observamos oscilaciones en la ploidía pero
el aumento de ploidía a los 4 meses es abrupto de manera que difiere con el resto de las
Sección I b 69
semanas y el control (figura 20-b). En este caso la ploidía podría estar reflejando la
transformación epitelial, que se evidencia morfológicamente en las displasias más severas
y CIS.
a 4i M FIGURAzo
Análisis de Ploidía de los3 - distintos grupos histológicos
para los tiempos intermedios de
5.5 cancerización.‘5 2 a) Valores de ploidía para lasTn. áreas NUMFentre la semana 6 y
10. F5_92= 4.58, p<1 ' 0.0005, comparaciones a
posteriori, test LSD, ' p< 0.0001
J u vsC.° g ; g, g, ¡o " 13 b) Valores de ploidía para las
control semanas áreas PRENentre la semana 6 y
b F5_125= p<4 - 0.00001, comparaciones a
BEN posteriori,test LSD,r p< 0.05 vsa: todas las categorias.
3 ‘ /I Losdatosse expresancomolamedia + ES.
g -Á M SereproducenenamboscasosQ 2 I Y losvalorescorrespondientesa la0- semana 16 pa'a facilitar la
1 comparación.
° g i a s 1.o " 'control semanas
En Ia figura 21 se observa el comportamiento proliferativo (LI)de NUMF y PREN en
los mismos tiempos. No existen diferencias significativas entre el LI de NUMF y PREN,
pero ambos grupos difieren de la mucosa control y solo a partir de Ia semana 7 son
significativas las diferencias.
Para NUMF a las 8 semanas los valores llegan a un punto máximo y a partir de allí
se estabilizan. Por su parte para las áreas PREN el valor máximo se observa a las 9
semanas de tratamiento y a partir de allí el índice disminuye. Ambas categorias muestran
un aumento de la proliferación celular respecto del comportamiento de Ia mucosa normal,
pero entre si la dinámica del LIes distinta.
En particular las áreas PREN disminuyen la proliferación notablemente a la semana
10 y a la semana 16 (figura 19) presentan un LI del mismo orden con leves diferencias
entre H y D. El índice de proliferación de las áreas PREN a las 10 semanas de
Sección I b 70
cancerización es mayor que el LIde las zonas NUMFa los 4 meses (figuras 19 y 21).
En la figura 22 se observan fotomicrografias de Ia reacción inmunohistoquímica para
BrDu, reflejándose la diferencia en la proliferación entre áreas control, NUMF y
carcinomas.
0'4 FIGURA 21
Índice de proliferación (LI). para las distintas categorias hrstologrcas enfunción de los tiempos intermedios0.31 . ..de cancenzacion (semana 6 a 10).ANOVA de 2 vias, factor categoriaF199: 0.85 p= 0.35, factor tiempo F539:
_-_¡02 4 4.95 p<0.0005, interacción F5,99=0.47p= 0.79. Comparaciones a posteriori,test Newman-Keuls * p< 0.05 y **p<
0.001 vs C. T tiempo en el que lasáreas NUMFllegan a un plateau.Los datos se expresan como Ia media
- Y . . . +ES0.0' r I. I I v |6 7 9
FIGURA 22
Fotomicrografias de campos representativos decortes con la reacción inmunohistoquímica paraBrDu. a) Epitelio control, se observan célulaspositivas dispersas (flecha) para BrDu en el estratobasal. Magnificación final 350X. b) Epitelio NUMF,se observó un aumento en la cantidad de células
positivas (flechas) en el estrato basal. Magnificación350X. c) Se observó numerosa cantidad de célulaspositivas (flechas) que reflejan la alta tasa deproliferación tumoral. Magnificación 350X.
Sección I b 71
CONCLUSIONES
La evaluación de Ia ploidía por análisis de imágenes, además de su uso habitual
en la evaluación diagnóstica y pronóstica de neoplasias, permite evaluar lesiones
pequeñas dentro de los cortes histológicos, para lo cual fue necesario realizar
ajustes metodológicos que aumentan la sensibilidad del método. Los ajustes que
hemos realizado fueron fundamentalmente la incorporación de factores de
corrección por el espesor de los cortes y por la lectura de fondo no específico.
Los valores muy elevados del contenido de ADN y el estado proliferativo en los
carcinomas y CIS, se correlacionan con las atipías nucleares observadas en los
preparados histológicos de rutina, teñidos con H-E.
Las alteraciones en la ploidía de las lesiones hiperplásicas y displásicas a los 4
meses de cancerización revelan que antes de la instalación de los carcinomas ya
existe una alteración importante en el contenido de ADN. La cantidad total de
ADN en los epitelios hiperplásicos y displásicos es similar y mayor que en Ia
mucosa control. Pero las áreas hiperplásicas presentaron diferencias entre el
estrato basal y suprabasal, revelando una marcada actividad del estrato basal.
Por su parte las áreas displásicas mostraron valores elevados de ADN en sus
estratos reflejando la pérdida de polaridad en esas zonas.
Las alteraciones de ploidía en las áreas NUMFdespués de tiempos largos de
cancerización revela la existencia de alteraciones de campo cancenzado antes
que se observen lesiones morfológicas. El análisis de ploidía puede por lo tanto
ser usado como marcador de cancerización de campo en nuestro modelo.
SECCIÓNI-e
Análisis de Ia fibrosis inducida en el conectivo subyacente al epitelio transformado.
INTRODUCCIÓN
La transformación maligna de los epitelios induce cambios importantes en su
interacción con el conectivo. En general todas las actividades se intensifican y en cierto
modo vuelven a asemejarse a las embrionarias (en la página 22 nos hemos refen'do al
tema de las interacciones epitelio-mesénquima). Hay mayor producción de algunos
factores de crecimiento por parte de los epitelios transformados, que generan en el
conectivo diferencias en la proporción de sus elementos constitutivos. Además, las células
cancerosas tienen sus propias regulaciones e inducen cambios importantes en el
microambiente (lngber, 2002).
En el modelo de cáncer bucal de la bolsa de la mejilla del hámster se desarrollan
cuadros desmoplásicos muy tempranamente, subyacentes al epitelio cancen'zado pero
todavía sin alteraciones morfológicas evidentes (epitelios NUMF). Se produce una
fibrohialinosis que engrosa notablemente la pared de la bolsa. Cuando aparecen las
displasias epiteliales, estos se acompañan de una marcada angiogénesis sub-epitelial,
caracterizada por una proliferaciónde células endoteliales y neo-vasos rodeados de poca
sustancia intercelular sin fibras colágenas, que desplazan Ia fibrosis hacia planos más
profundos en el espesor de la bolsa. Este tejido Iaxo constituirá finalmente el estroma de
los carcinomas. Las áreas de fibrohialinosis en cambio, quedan formando parte de Ia
pared de Ia bolsa en las áreas cubiertas por epitelio NUMFo hiperplásico.
Pueden plantearse diversas preguntas sobre la fibrosis. Podría ser que influencie la
transformación maligna del epitelio, o por el contrario, que Ia misma sea provocada por
factores liberados por las células transformadas o bien que ambos procesos fueran
expresiones independientes de alteraciones en los dos tejidos inducidas por los
carcinógenos sobre estos distintos tipos celulares. De cualquier manera, la inducción de
fibrosis en el modelo de la bolsa de la mejilladel hámster es un hecho concomitante con
los estadios pre-malignos y no con el desarrollo de los carcinomas.
Del mismo modo, la presencia de fibrosis en las lesiones pre-malignas de la
mucosa bucal humana es un hecho frecuentemente descripto, aún sin conocer su relación
con el comportamiento epitelial. La relación entre fibrosis y cáncer bucal se evidencia
Sección I c 73
fuertemente en la entidad conocida como fibrosis de la submucosa (OSMF entidad
precancerosa prevalente en la lndia, ligada al hábito de mascar betel, descn'pta en la
página 36), la cual, básicamente, es una reacción inflamatoria crónica subepitelial con
cambios fibro-elásticos en la lámina propia (Pindborg, 1989). Su patogenia aún hoy no ha
sido dilucidada ni tampoco el porqué de su naturaleza pre-neoplásica, si bien existen
diversas especulaciones al respecto. Por un lado se piensa que los cambios histológicos
tempranos (la infiltración yuxtaepitelial de células inflamatorias) serían una respuesta al
irritante local (betel, que es un cancerígeno reconocido) (Srinivasan y Jewell, 2001b). Por
otro lado existen trabajos que muestran la falla existente en la remodelación del colágeno
en la OSMF, debido a alteraciones de su síntesis normal por efectos genotóxicos sobre
los fibroblastos (Jeng y col., 1994; Reichart y co|., 1994; Tsai y col., 1999).
Actualmente han comenzado a aparecer trabajos que analizan Ia expresión de
oncogenes implicados en la tumorigénesis del CCEB en pacientes con OSMF. Así
Srinivasan y col. han reportado la expresión aumentada en biopsias de pacientes con
OSMF de: PCNA, c-myc, TGF-o. y EGFR. Estos dos últimos se destacan, ya que
presentan una expresión diferencial en los distintos estratos epiteliales (Srinivasan y
Jewell, 2001a; Srinivasan y Jewell, 2001b). Estos resultados refuerzan la evidencia de la
naturaleza pre-cancerosa dela OSMF.
Existen otras lesiones de la economía, con cuadros fibrosos, relacionadas con los
procesos de transformación o recurrencia maligna. Un ejemplo de ellos es la fibrosis
hepática, responsable del aumento en la recurrencia de carcinoma hepatocelular (Esnaola
y col., 2002). De hecho Esnaola (2002) propone que el grado de fibrosis debería ser
incluido en la estadificación de los hepatocarcinomas. La fibrosis hepática se presenta
comúnmente en respuesta a Ia injuria crónica del higado (incluyendo el abuso de alcohol
e infecciones virales persistentes, enfermedad biliar entre otras). Es sabido que el
mecanismo celular subyacente a la fibrosis hepática es similar a la respuesta del
organismo a diversas injurias. Es por ello que la fibrosis hepática es tomada como
paradigma en la respuesta de un órgano ala injuria(Scott, 1993).
Por otro lado, la cirrosis hepática se comporta como lesión pre-maligna, siendo una
de las causas de carcinoma hepatocelular (Cotran y col., 1999).
También se ha relacionado el comportamiento de otros tipos de tumores con la
naturaleza fibrosa de su estroma. Así por ejemplo el comportamiento biológico de los
carcinomas gástricos cirróticos, caracterizados por un estroma fibroso, es diferente con
respecto a los de otro tipo morfológico (Tanimoto y co|., 1991).
Sección 1 c 74
OBJETIVOS
o Analizar cuantitativamente las áreas de fibrosis inducida en el modelo de
cáncer bucal en la bolsa de la mejilla del hámster.
o Relacionar cronológicamente la evolución de la fibrosis en relación al avance
en agresividad de las lesiones epiteliales.
o Determinar en el modelo la importancia de la fibrosis como indicador
temprano de cancerización de campo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron para este estudio 67 bolsas de hámsters sometidos al protocolo
estándar de cancerización (según se describió en la Sección l-a).
Se estudiaron los siguientes tiempos de cancerización: 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16 y 17
semanas y los correspondientes controles topicados solamente con el vehículo (mineral
oil). En cada grupo se estudiaron entre 5 y 10 bolsas.
TÉCNICA DE PICRO SIRIUS-RED
Se realizaron cortes, de 7 um de espesor, adyacentes a los preparados teñidos con
H-E, utilizados para el estudio microscópico del modelo (Sección l-a). Se seleccionaron
las zonas de estudio. Se realizó la técnica histoquímica de Picro Sirius-Red para
coloración de fibras colágenas (García del Moral, 1993). Para la tinción se utilizó una
solución de rojo Sirio- ácido pícrico (Rojo sirio F3BA) al 1% en solución acuosa saturada
de ácido pícrico. La solución se preparó con 48 horas de anticipación a su utilización para
permitir la maduración de la misma y cuando no se la observó saturada se agregaron
cristales de ácido pícrico.
Los cortes se desparafinaron, hidrataron y Iavaron en agua corriente por 10 minutos.
Con la solución rojo Sirio- ácido pícn'co se colorearon durante 30 minutos a temperatura
ambiente, luego se los deshidrató rápidamente en alcohol absoluto (diferenciación) y
finalmente se aclararon y montaron con bálsamo de Canadá.
Sección I c 75
Con esta técnica se observan las fibras colágenas en color rojo intenso. Las fibras
elásticas y musculares y demás elementos del corte toman una coloración amarillo de
fondo (figura 23). Mediante luz polarizada puede observarse que el colágeno es una
estructura anisotrópica en cortes longitudinales e isotrópicas en cortes transversales. Los
diferentes colores de polarización (verde o amarillo) dependen de la orientación de las
fibras en los cortes. Cuando el colágeno es muy denso o hialinizado se produce una
característica birrefringencia roja.
WMLas áreas seleccionadas de acuerdo con el tipo de lesión epitelial suprayacente se
evaluaron en un analizador de imágenes (LANAlS-Mef., CONICET-CNEA) con un
aumento de 2.5X. Las imágenes se capturaron y digitalizaron para su análisis mediante
dos programas de computación para mediciónde longitudes y áreas.
Se cuantificaron: áreas de fibrosis y de epitelio suprayacente; longitud del epitelio
medida en aproximadamente la mitad de su espesor y la longitud de la membrana basal.
Se calculó: índice de fibrosis 1 (IF1)= área de fibrosis/longitud epitelial, e indice de fibrosis
2 (IF2)= área de fibrosis/área de epitelio, y las relaciones: longitud basal/longitud
epitelial, área de fibrosis/longitud basal.
Luego de procesar los datos se observó que la relación lF1 no discriminaba entre las
distintas categorias de lesiones epiteliales, debido a que con el grado creciente de
malignización la relación longitud basal/longitud epitelial se altera progresivamente. En
efecto la longitud de la membrana basal aumenta en relación al avance del proceso de
cancerización (figura 24). Debido a esto se decidió cuantificar la fibrosis en base al IF2.
Por otro parte el lF1 no permitía incluir en el análisis a los carcinomas dado que en ellos
es muy dificilcuantificar la longitud de las membranas basales.
r4
Sección I c 76
FIGURA 23
Fotomicrografia de una sección de labolsa de la mejilla del hamster teñidacon Picro Sirius-Red. Se observan las
fibras colágenas en color rojo intenso.Las fibras elásticas, musculares y demáselementos del corte toman unacoloración amarillo de fondo. Se
esquematiza en color rojo el áreaepitelial medida y en color celeste el áreafibrosa subyacente medida. Con losdatos de las áreas se calcula el lF2.
E FIGURA24¿13
3 Valores de Ia relación longitud de lag) membrana basal I longitud epitelial para¿9 las distintas categorias estudiadas.’33, Se observa un aumento de dicha relacióng desde NUMF hacia CIS. Los valores sec» expresan como la media + ES.5
c NUMF H D crs
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos se expresan como la media i el ES o media + el DS.
Se utilizó el test de ANOVA, seguido por el test de Newman-Keuls o LSD como
comparación a posteriori.
Se consideró significativa una diferencia con una significancia del 5% (ps0.05).
Sección I c 77
RESULTADOS
La figura 25 muestra el cuadro fibroso característico del modelo CBMH,subyacente
a un epitelio NUMF(semana 7). Se observa también la imagen histológica caracteristica
del modelo entre la semana 8 y 10 cuando aparece un tejido conectivo laxo vascularizado
subyacente al epitelio cancerizado y suprayacente a la fibrosis (figura25 c y d).
FIGURA 25
Áreas desmoplásicas subyacentes al epitelio cancerizado de la bolsa de la mejilladel hámster.a) Muoosa normal. b) Epitelio NUMF con un importante cuadro desmoplásioo subyacente (7 semanas decanoerización). c) Área PREN con tejido laxo subepitelial situado inmediatamente por debajo de la membrana basal ypor encima del área de fibrosis (9 semanas de canoerización). d) Se observa con mayor magnificación el área de tejidolaxo subepitelial por encima de la fibrosis, a las 9 semanas de canoerización.Magnificación final: a, b, d 350X, c 200X
En la figura 26 se observan fotomicrografías de cortes teñidos con Picro Sirius-Red
observados con luz polarizada. En la bolsa normal el tejido conectivo muestra fibras
birrefringentes en verde amarillo. En la bolsa cancerizada, las zonas NUMF,con epitelio
igual al control, muestran la fibrosis subyacente que debido a su densidad refringe en
color rojo intenso. En cambio, el estroma tumoral mas laxo, muestra refringencia de colorverde.
Figura 26
Mucosa normal de la bolsa de la mejilla delhámsterteñida con Picro Sirius-Red
a) Las áreas en color rojo subyacentes al epiteliofueron cuantificadas por análisis de imágenesb) Fotomicrografia de la sección presentada en a),observada bajo luzpolarizadaMagnificación 80 X.
Tinción de Picro Sirius -Red en un área NUMF.
a) Las áreas en ooIor rojo subyacentes al epitelio(flechas) fueron cuantificadas por análisis deimágenes.b) Imagendela sección presentada en a), observadapor microscopía de polarización.
‘ Magnificación 80 X
» , ‘ Tinción de Picro Sirius -Red en un área de un«. 4 carcinoma.
a) Se observó una disminución en la intensidad de lap tinción.
', ‘ b) Imagen de microscopía de polarización del2,, 4 preparado presentado en a), el color verde indica Ia
‘ t}; -_ baja densidad del colágeno.' Magnificación 100 X.
Sección I c 79
AI estudiar el indice de fibrosis 2 (IF2) en cada tipo de lesión epitelial en las bolsas
cancen‘zadas 16-17 semanas, luego de la aparición de los tumores, observamos una
diferencia significativa entre las áreas NUMFy el control (figura 27). A su vez las áreas
NUMFse diferenciaron del resto delas categorías pre-neoplásicas en las que el índice es
notoriamente menor. En los carcinomas se produce una disminución significativa de la
fibrosis respecto del grupo control y del resto de las categorias histológicas (figura 27).
2.0
0.5
C NUMF H D CIS Ca
FlGURA 27
Valores del IF2(área de fibrosis I área epitelial) para las diferentes categorias histológicas a las 16 semanas decancen'zación. ANOVAF5.55: 14.65 p< 0.0001, 'p <0.001 vs todas las categorias. Comparaciones a posteriori, testNewman-Keuls. Los datos se expresan como la media + ES.
EIpatrón de fibrosis decreciente desde las áreas NUMFhacia Ca nos aportó un dato
biológicamente relevante puesto que al igual que en el análisis del contenido de ADNen
donde los epitelios de aspecto normal pero sometidos a la cancen'zación, presentaban
índices de ploidia diferentes, también el tejido conectivo subyacente se observaba
alterado. A partir de estos datos estudiamos la cronodinamia de la fibrosis en relación a la
transformación epitelial.
Al analizar los cuadros fibrosos entre la semana 6 a 10 en las áreas NUMF se
observa un aumento importante del IF2 en la semana 7 (figura 28-a) (el control
corresponde a los datos de un pool de bolsas tratadas con el vehicqu a los distintos
tiempos experimentales). A las 8 semanas esos valores parecen mantenerse para luego
disminuir levemente hasta casi llegar a los valores de la semana 6. Estos valores se
mantenían constantes en la semana 12 (donde comienzan cuadros de CIS y algunos
tumores incipientes) y en Ia 16.
Sección I c 80
En cuanto a las áreas con lesiones PREN (hiperplasias y displasias) (figura 28 b)
observamos claramente un pico de fibrosis a la semana 7 el cual va ir disminuyendo hasta
llegar casi al valor de Ia mucosa normal, entre las semanas 8 y 16.
a 2 5 N MF
2 * a: *
1.5 4NLL
1 J.
0.5
0 ' I l I I I Ñr |s a 1o 12 16
control semanas
b 25* * PREN
2 .
1.5 NL_L T
1- í .L\í 1__ i0.5
0 J ÑI’ ji r I I I I6 7 a 9 1o 12 16
control semanas
Figura 28
Valores del IF2 (área de fibrosis! área epitelial) para las diferentes categorias histológicas para los tiemposintermedios de cancerización.a) Valores de IF2 para las áreas NUMF entre la semana 6 y 10, 12. ANOVAF7,79: 2.23 p<0.05, comparaciones aposteriori, test LSD ‘p<0.005 vs C.b) Valores de IF2 para las áreas PREN entre Ia semana 6 y 10, 12. ANOVAF135: 2.21 p<0.05, , comparaciones aposteriori, test LSD 'p<0.005 vs C.Los datos se expresan como Ia media + ES.
Se reproducen en ambos casos los valores correspondientes a la semana 16 para facilitarla comparación.
Sección l c 81
CONCLUSIONES
La fibrohialinosis en el modelo de cáncer bucal de la mejilla de la bolsa del hámster
aparece muy precozmente, antes de que se evidencien cambios morfológicosen el
epitelio transformado.
El mayor volumen de fibrosis en el modelo se observó en Ia semana 7.
Las lesiones hiperplásicas, displásicas y las micro-invasiones se acompañan de un
tejido Iaxo subepitelial situado inmediatamente por debajo de la membrana basal y
por encima del área de fibrosis, la cual va disminuyendo en volumen a medida que
progresan las lesiones epiteliales.
El tejido Iaxo muy vasculan‘zado forma finalmente el estroma de los carcinomas.
La fibrosis junto a la ploidía de las áreas pre-neoplásicas son una manifestación
temprana de la cancerización de campo.
SECCIÓNII-a
Expresión del factor de crecimiento fibroblástico-básico.
INTRODUCCIÓN
En la sección l hemos abordado el estudio de la inducción de cuadros fibrosos en el
tejido conectivo subyacente al epitelio cancerizado desde el aspecto morfológico,
cuantitativo y su relación con la cronodinamia del proceso carcinogénico bucal
experimental. Tanto con el análisis de la fibrosis como con el de los cambios epiteliales,
estimados a través de la ploidía, hemos podido asociar los distintos cuadros histológicos
que se suceden en la cancerización de la bolsa de la mejilla del hámster con los
parámetros estudiados. A la vez esos cambios se presentaron como manifestaciones de
un campo cancerizado semejante al que se produce en la cavidad bucal humana.
Hemos descripto como los cuadros desmoplásicos originales se manifiestan en una
primera instancia como una marcada fibrohialinosis que persiste durante las etapas
tempranas para ser a su vez reemplazada por una proliferación angioblástica que
finalmente posibilitará la nutrición de las masas tumorales, las cuales en este modelo no
presentan un estroma fibroso.
Partiendo de estos resultados nos planteamos nuevas preguntas sobre la existencia
de esa fibrosis y el porqué de su dinámica de aumento y posterior disminución.
Un primer enfoque consistió en el análisis de poblaciones celulares presentes en el
tejido conectivo subyacente al epitelio cancerizado. Diversos trabajos mencionan la
presencia de distintos tipos celulares en el infiltrado celular subepitelial durante la
cancerización. En general se observa una movilización de monocitos, eosinófilos,
mastocitos y linfocitos desde las primeras etapas de la cancerización. Elovic et al han
reportado la presencia de eosinófilos en el infiltrado inflamatorio en el tejido conectivo
adyacente al epitelio transformado en Ia bolsa del hámster y demostraron que eran la
principal fuente de TGF-a (Elovic y col., 1990). Luego Ghiabi demos'tlaque esoseosinófilos productores de TGF-a se reclutaban en las zonas de desarrollo tumoral
(Ghiabi y col., 1992). El TGF- a est aumentado en el epitelio de las lesiones pre
neoplásicas respecto del epitelio sin tratamiento mientras que los carcinomas si bien Io
expresan, esa expresión no difiere en magnitud de la de las lesiones pre-neoplásicas odel CIS.
Sección II a 83
Con respecto a los mastocitos se ha reportado una correlación positiva entre
desarrollo de los carcinomas de la bolsa y la densidad de mastocitos (Flynny col, 1991).
Se observó hacia la semana 8 de cancen'zación un aumento en la densidad de mastocitos
y su degranulación. El máximo infiltrado se describió entre las semanas 12 y 16 (Flynn y
coI., 1991). En este caso no existen reportes que relacionen específicamente alguna
citoquina o factor de crecimiento en particular con la movilización de mastocitos.
Lógicamente los distintos tipos celulares movilizados durante el proceso carcinogénico
liberan diversos factores de crecimiento. Si bien existen reportes de aumento y
disminución en la expresión de determinados FC en la carcinogénesis de la bolsa del
hámster, en general estos cambios no han sido asociados a un determinado tipo celular.
En la sección l-a hemos mencionado los distintos oncogenes y genes supresores
asociados a este modelo. Se ha estudiado el rol del EGF y su receptor. No se ha
encontrado expresión de EGF en Ia bolsa de la mejilla del hámster pero si de TGF-a. AI
analizar la expresión del receptor para estos dos factores de crecimiento se reportó por
análisis inmunohistoquímicopresencia de EGFR en etapas tempranas (4 semanas), en
áreas de displasia y en zonas focalizadas de los carcinomas mientras que no se observó
expresión en el epitelio normal (Shin y col., 1990).
Otro tipo de FC estudiado en el modelo es el TGF-B 1. En cultivos celulares se
analizó la relación del TGF-B1 con el fenotipo angiógo. Se reportó que Ia
transformación al fenotipo angiogénico coincide con la producción elevada de TGF-B1y la
activación del oncogen H-ras (Lingen y col., 1997). Mediante análisis inmunohistoquímico
en cortes de tejido. se reportó expresión extracelular no constante de TGF-B1en el con'on
de la bolsa sin tratar; mientras que en Ia carcinogénesis se observó expresión intra y
extracelular a las 8 semanas. En el caso de los carcinomas la expresión fue solamente
extracelular (Zenklusen y col., 1994).
No existen muchos mas datos reportados sobre otros factores de crecimiento y
principalmente datos que relacionen FC con las diferentes lesiones del proceso
carcinogénico en la bolsa del hamster. En menor medida, existe información sobre FCrelacionados a la fibrosis y/o angiogénsis en el modelo estudiado. Hay reportes que
discuten un posible rol cooperativo del TGF-a con otras citoquinas o inducción de factores
angiogénicos por otros tipos celulares como por ejemplo los fibroblastos (Chang y col.,
1989) sin aventurar concretamente que otras citoquinas estarían involucradas. Por otra
parte existen antecedentes de administración de IGF y PDGF en la bolsa para estudio de
la patcgenia de la enfermedad periodontal. En ese caso no se reportó rol alguno para el
Sección Il a 84
PDGF ni para el IGF en los cuadros displásioos en la bolsa dela mejilladel hamster (Shih
y col., 1996), y ya hemos mencionado (página 21) que tanto el PDGF, como el IGF actúan
por la misma vía de transducción de señal que el EGF.
Sabiendo que el TGF-a y TGF-B habían sido analizados en el modelo, y actúan a
través de distintos tipos de receptores celulares, encaramos el estudio de la expresión de
un factor de crecimiento fibroblástico para explorar otro factor de crecimiento que pudiera
involucrar en su acción Ia interacción entre fibroblastos, angioblastos y el epitelio.
Los factores de crecimiento fibroblástico están involucrados en la transmisión de
señales entre el epitelio y el tejido conectivo e influencian el crecimiento y diferenciación
epidérmico. Ya hemos mencionado que presentan un rol importante en Ia restauración del
tejido normal luego de una injuria así como un posible rol a través de su expresión
aberrante en la tumorigénesis (Partridge y ool., 1996).
En el caso particular del CCEB existen reportes sobre la presencia del FGF básico y
ácido (b-FGF y a-FGF respectivamente) en los mismos. Los reportes son dispares.
Trabajos con biopsias de CCECC describen la expresión de b-FGF, destacando que en
un mismo tumor se observan áreas claramente positivas y otras negativas. Los autores
han interpretado que las zonas negativas para el factor mencionado serían las zonas
hipóxicas del tumor (Schultz-Hector y Haghayegh, 1993). Otros trabajos encuentran que
el nivelde b-FGF en tumores de cabeza y cuello y su mucosa adyacente es igual o menor
al de la mucosa normal; y que dentro de los tumores aquellos diferenciados presentan
una expresión más alta de b-FGF en relación a los pobremente diferenciados. En el
mismo trabajo se reportan CCC en los que no se observó expresión del factor (Janot y
co|., 1995). Otro autor reporta en biopsias de CCEB una intensa expresión
inmunohistoquímica del FGF-2 y del a-FGF en carcinomas diferenciados y no
diferenciados (Myoken y col., 1994). Este último reporte no coincide con el de Wakulich
quien encuentra marca inmunohistoquímica positiva del b-FGF en displasias y CCEB y
poca o ninguna expresión de a-FGF (Wakulich y co|., 2002). En este último trabajo
también se reporta expresión del receptor tipo 2 y 3 de FGF en áreas displásicas y CCEB
(Wakulich y col., 2002).
Con estos antecedentes y Ia hipótesis de que la fibrosis es una manifestación de la
desregulación epitelio-mesénquima en el proceso carcinogénico, decidimos analizar la
expresión inmunohistoquímica del b-FGF en el modelo de la bolsa de la mejilla del
hámster, Io que nos permitía abordar el estudio de los tejidos epitelial y conectivo en
conjunto.
Sección II a 85
EL FACTOR DE CRECIMIENTO FIBROBLÁSTICO-BÁSICO (b-FGF)
El b-FGF o FGF-2, es uno de los prototipos de la gran familia de factores de
crecimiento que unen heparina, se expresa en distintos tejidos y tiene un amplio espectro
de actividad biológica (Yoshitake y Nishikawa, 1992). Está muy relacionado con el a-FGF,
un polipéptido encontrado en un rango mas restringido de tejidos. Ambos péptidos el
ácido y el básico comparten un 55% de homología en sus secuencias aminoacídicas y
presentan las mismas funciones biológicas, aunque el b-FGF parece ser un agente mas
potente en mayor cantidad de tejidos (Mansson y col., 1990; Root y Shipley, 1991).
El b-FGF está relacionado al crecimiento, diferenciación, migración y sobrevida de
una amplia gama de tipos celulares (Bikfalviy col., 1997). Originalmente se reportó acción
del b-FGF sobre células de origen mesodérmico o neuroectodérmico (Folkman y
Klagsbrun. 1987; Gospodarowicz y col., 1987a; Gospodarowicz y col., 1987b), luego se
demostró que también presenta actividad mitogénica sobre tipos celulares den'vados del
ectodermo (Shipley y col., 1989; Takahashi y col., 1989).
El b-FGF fue originalmente identificado en la glándula pituitaria por su actividad
mitogénica sobre la línea celular BaIb/c 3T3 (Gospodarowicz y Moran, 1975;
Gospodarowicz y col., 1975a). Inicialmente se lo identificó como una proteína de 15 kd
(Gospodarowicz, 1975; Gospodarowicz y col., 1975b) luego se encontró que la forma de
15 kd representa un producto de proteólisis de la estructura primaria de la proteína que
originalmente es de 18 kd (Bikfalviy col., 1997). En el humano se han encontrado formas
de mayor peso molecular de la proteína (22, 22.5, 24 kd) que son el resultado de la
iniciación de la traducción en sitios alternativos al AUG, como el CUG. Actualmente se ha
sumado a las formas de alto peso molecular ya conocidas una de 34 kd resultante de un
mensajero con un cuarto codón de iniciación CUG (Arnaud y col., 1999). Por lo tanto las
isoformas de alto peso molecular del FGF-2 son extensiones amino-terminales colineales
de la proteína de 18kd (Delrieu, 2000).
Mientras que la proteína de 18KDa es de localización citosólica, las formas de alto
peso molecular contienen secuencia señal para localización nuclear, secuencia que
posibilita que el núcleo celular sea blanco de acción del FGF-2 en muchos casos (Delrieu,
2000).
La homología de secuencia para los b-FGF en un amplio rango de especies es muy
alta (mayor al 90%) (Nugent y lozzo, 2000). Su secuencia aminoacídica presenta
características distintivas, fue descripta originalmente (Abraham y col., 1986) en pituitaria
Sección II a 86
bovina como una proteína de 155 aminoácidos. La estructura primaria del péptido revela
la presencia de 4 residuos de cisteína, ausencia de puentes disulfuro intramoleculares y
una alta proporción de residuos de naturaleza básica, que hacen que la molécula en su
conjunto presente características alcalinas (pl = 9.6). A su vez posee 2 sitios específicos
(Ser 64 y Thr 112) que pueden ser fosforilados por la proteína kinasa C (Bikfalviy col.,
1997). (figura 29).
Distintos grupos han determinado la
estructura cristalina de la forma de 18kd de la
proteína en presencia o ausencia de fragmentos
de heparán sulfato (Faham y col., 1996). En base
a esos estudios se ha podido determinar que la
unión del FGF-2 a la heparina o al heparán sulfato
casi no modifica la estructura de la misma, pero si
que ellos facilitan que las moléculas de b-FGF se
asocien en dimeros y oligómeros de gran orden
(Conrad, 1998).
La interacción con la heparina protege al _FIGURA29 Modelo espacial de la estructura
FGF-b de la desnaturalización por calor o clivaje de| FGF.2.La estructuracristalinade rayos-Xfue determinada en presencia de heparina (en
a través de proteasas (Nugent y Iozzo, 2000) y rojo)suele almacenarse en la membrana basal unido
a la heparina. La heparina es sintetizada solamente por los mastocitos del tejido
conectivo, pero el heparán sulfato tiene una amplia distribución en la matriz extracelular
de mamíferos así como los proteoglucanos. A estos dos tipos de moléculas se une
también el b-FGF. Esta cualidad de almacenamiento en la MEC de los FGF y del b-FGF
en particular, determina el interés de su estudio en relación al análisis de la disrupción
epitelio-mesénquima.
El FGF-2 interactúa con 4 receptores específicos de superficie celular. Se ha
propuesto que el FGF-2 posee 2 sitios separados de unión a sus receptores, los cuales le
permitirían a una molécula de b-FGF unirse a dos receptores o interactuar con un receptor
en dos posiciones distintas (Kan y col., 1993). Los proteoglucanos pueden aumentar la
afinidad del FGF-2 por sus receptores (Yayon y coI., 1991) y potencialmente actuar como
un puente que facilita la dimerización de los mismos. También se ha identificado un sitio
de unión a la heparina en el FGFR1 dando lugar a conjeturas sobre la posibilidad de un
complejo terciario de unión entre FGF-2, proteoglucano y receptor (figura 30).
Sección II a 87
FIGURA 30
Modelo de la interacción del FGF-2con los
proteoglucanos de matriz extracelular.
hepafán 'V‘ 5 . .. ., ..sulfato Se esquematlza la establllzaCIonde la unIon
FGF2 / \\ del factor con sus receptores de membrana alibre través del heparán sulfato.complejo FGFheparán sulfato
Finalmente ya hemos mencionado en Ia página 20 evidencias de presencia de los
FGF en procesos tumorigénicos. El b-FGF es un potente agente angiogénico que
contribuye al crecimiento de diversos tumores sólidos como melanomas, osteosarcomas y
hepatomas (Pusztai y col., 1996). Se ha probado que actúa en forma autócrina en gliomas
y meningiomas humanos (Takahashi y col., 1990; Takahashi y col, 1992). Se ha
observado sobre-expresado en astrocitomas y recientemente se ha reportado expresión
nuclear de FGF-2 en astrocitomas humanos (Fukui y col., 2003). En algunos tipos
tumorales como en el carcinoma de próstata, se ha observado alterada su expresión y la
de su receptor tipo 1(Giriy col., 1999).
El b-FGF contribuye al desarrollo y progresión de tumores. Se ha reportado el
aumento en la expresión del ARN mensajero del b-FGF, respecto de la mucosa normal,
en carcinomas gástricos cirróticos, caracterizados por un estroma fibroso y un rápido
crecimiento. En esa situación se ha sugerido que el FGF-2 producido por las células
tumorales podria participar en la extensa fibrosis y angiogénesis como un factor parácrino
actuando sobre fibroblastos y células endoteliales (Tanimotoy col, 1991). Otros ejemplos
relacionan al b-FGF con la regulación del crecimiento tumoral mientras que solamente el
VEGF sería el responsable de Ia angiogénesis, como en el caso de los condrosarcomas
humanos (Furumatsu y col., 2002).
Sección II a 88
RECEPTORES DE FGFs
Los receptores que unen FGF; (FGFR) y desencadenan la señal celular
correspondiente, son 4 receptores transrnembrana del tipo tirosin quinasa, y están
codificados por 4 genes independientes (FGFR 1 al 4) (Hatton' y col., 1990; Safran y col.,
1990; Yayon y col., 1991; Partanen y col., 1991). Los FGFR tienen actividad tirosin
quinasa citosólica en el dominio carboxi-terminal y poseen 3 regiones similares a
inmunoglobulina extracelular en el dominio amino-terminal (Lee y col., 1989). Distintos
ARN mensajero generados por splicing son las diversas formas que se conocen de los
FGFR, los cuales difieren en sus secuencias extracelulares y poseen propiedades únicas
de unión al ligando. Un segundo evento de splicing sobre otro exón da como resultado
una tercer variante del dominio similar a inmunoglobulina y así surgen las variantes Illa,
lllb, Illc de los receptores 1 al 3 (Johnson y col., 1991; Werner y col., 1992; Chellaiah y
col., 1994). El FGFR-4 no sufre splicing alternativo en esa región (Vainikka y col., 1992).
La interacción de los FGF; con sus receptores es de alta afinidad e induce la
dimerización del receptor y la activación de su capacidad tirosin quinasa intrínseca. Esta
activación es sucedida por la autofosforilacióndel receptor que luego se convertirá en un
blanco para la unión y activación de una variedad de moléculas señal intracelulares
(Jeffers y col., 2002). Los FGFs también se unen con baja afinidad a los proteoglucanos
presentes en la mayoría de las superficies celulares y de la MEC. Ya hemos mencionado
que la unión de los FGFs a los proteoglucanos estabiliza la interacción FGF/FGFR.
También se han identificado proteínas que unen FGF; y estimulan su actividad, y han sido
identificadas como proteinas chaperonas que liberan a los FGFs' inmóviles en los
proteoglucanos (Tassi y col., 2001; Aigner y col., 2001).
Distintos FGF presentan interacciones de alta afinidad con los 4 receptores,
dependiendo de las variantes del receptor estudiadas.
En particular se ha observado expresión del receptor tipo 2 y 3 de FGF en áreas
displásicas bucales y CCEB (Wakulichy col., 2002). Se ha estudiado también la expresión
del FGFR-1 y 2 en carcinomas de cabeza y cuello en relación al grado de diferenciación
de los mismos (Janot y col., 1995).
Sección II a 89
OBJETIVOS
Analizar la expresión del b-FGF durante el proceso de carcinogénesis de la
bolsa de Ia mejilla del hamster.
Analizar la expresión de los receptores FGFR 2 y 3.
Discn’minarla actividad de las diferentes isoformas del b-FGF en el proceso
de cancen'zación.
Relacionar la expresión del b-FGF, sus isoformas y sus receptores con la
fibrosis y la vascularización característicos del modelo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron para este estudio 108 bolsas de hámster sometidos al protocolo
estándar de cancen'zación (según sección l-a).
El material se dividióen los siguientes grupos:
Determinación inmunohistoquimica de b-FGF y FGFR-2 y 3.
Tiempos experimentales, 6 a 10 semanas, 20 animales y 16-17 semanas, 10
animales. Controles para cada uno de los tiempos experimentales, sometidos
solamente a acción del vehícqu (mineral oil), 20 animales. Bolsas normales sin
tratamiento, 5 animales.
Determinación de b-FGF por western blot (WB).
Tiempos experimentales: 6 a 10 semanas, 30 animales y 16-17 semanas, 8
animales. Controles para cada uno de los tiempos experimentales topicados
solamente con el vehículo (mineral oil), 10 animales. Bolsas sin tratamiento, 5
animales.
El material utilizado para las determinaciones inmunohistoquimicas se dividióen dos
partes. Una mitad se fijó en formol al 10% para el procesamiento de rutina y tinción con H
E y para la detección IHQ de los FGFR. La otra mitad se fijó en acetona para el
Sección II a 90
procesamiento en parafina y posterior detección IHQdel b-FGF.
Las bolsas extraídas para su posterior determinación por WB del b-FGF, se
almacenaron en freezer a -80 °C hasta su procesamiento.
En cortes teñidos con H-Ede cada caso, se seleccionaron áreas de: carcinoma (Ca),
carcinoma in situ (ClS), displasia (D), hiperplasia (H), y epitelio sin cambios morfológicos
(NUMF),en cada tiempo experimental.
DETERMINACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DEL b-FGF
Se utilizaron cortes de 5 pm del material fijado en acetona, montados en
portaobjetos silanizados. Se desparafinaron en xilol y se hidrataron en etanol de
graduación decreciente. Previamente a la hidratación con etanol 96% se incubaron los
cortes en metanol peróxido de hidrógeno de 100 volúmenes (relación 100:1) durante 30
minutos para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena. Luego se terminó la
hidratación y se realizó un bloqueo de sitios inespecificos en PBS-albúmina 0.3% (Gibco
BRL, bovine albumine fraction V) durante 30 minutos. Posteriormente se realizó Ia
incubación con el anticuerpo pn'mariodurante toda la noche a 4°C en cámara húmeda. El
anticuerpo utilizado fue un anti-bFGF humano realizado en cabra (147-G, sc-79,
policlonal, de concentración 200ug/ml, Santa Cruz) dilución 1:100 del vial madre en PBS.
Luego se realizaron lavados en PBS-albúmina 0.3% y los cortes se incubaron con el
anticuerpo secundario (anti-lgG de cabra, concentración 7.1g/l, Dako, Denmark) en
dilución 1:100 en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego de 3
lavados de 5 minutos cada uno en PBS-albúmina 0.3%, se incubaron los cortes con el
complejo peroxidasa - antiperoxidasa (soluble complex, horseradish peroxidase,
concentración 1.29/I. Dako, Denmark) en dilución 1:200 en cámara húmeda a temperatura
ambiente durante 1 hora y luego se realizaron lavados con PBS. Se reveló con 3,3
diaminobenzidina (Sigma) 0.05% en PBS y 1% de peróxido de hidrógeno, bajo
microscopio y se detuvo la reacción con agua destilada. Se realizó una coloración
contraste con hematoxilina seguida de deshidratación, aclaración y montaje con bálsamo
de Canadá.
Como control de especificidad de la señal se utilizaron algunos cortes que fueron
incubados omitiendo el anticuerpo primarioo secundario (figura 31).
Sección Il a 9]
FIGURA 31
Mucosa sometida a la reacción inmunohistoquimicapara el FGF-2omitiendo el anticuerpo primario.
Debido a que los controles (tanto la mucosa normal como la tratada con el vehículo)
muestran una clara y homogénea reacción estrictamente localizada en la capa basal y la
carcinogénesis produce una alteración de éste patrón se calculó el grado de marcación
suprabasal (GMS) como: número de células positivas suprabasales normalizadas por el
número de células totales suprabasales del área elegida (magnificación40X). Para ello se
utilizóun software “ad hoc”, que permite cuantificar las células seleccionadas.
DETERMINACIÓN INMUNOHISTOOUÍMICA DE LOS FGFR- 2 Y 3.
Se utilizaron cortes de 5 um de espesor del material fijado en formol al 10%,
montados en portaobjetos silanizados.
Los cortes se desparafinaron e hidrataron (serie de graduación decreciente de
alcoholes). Previo a la hidratación con alcohol 96% se incubaron los cortes en peróxido de
hidrógeno al 2% en metanol (H202 20 volúmenes) durante 30 minutos para bloquear la
actividad de la peroxidasa endógena y se completó Ia hidratación hasta agua destilada.
Luego se realizó una recuperación antigénica incubando los cortes con HCl 1N durante 25
minutos a temperatura ambiente. Se realizaron lavados con agua y se bloquearon los
sitios inespecíficos con suero fetal bovino (SFB) al 5% en PBS, durante 30 minutos a
temperatura ambiente y posteriores lavados con PBS.
A continuación se incubaron los cortes con los anticuerpos primarios
correspondientes durante toda la noche a 4°C en cámara húmeda.
Los anticuerpos utilizados fueron:
o Bek (C-17) realizado en conejo anti- la porción carboxi-terminal del FGFR-2
humano (sc-122, Santa Cruz, 200ug/ml en PBS), lgG policlonal.
o FGFR-3 (C-15) realizado en conejo anti- la porción carboxi-terminal del
FGFR-3 humano (sc-123, Santa Cruz, 200ug/ml en PBS), IgG policlonal.
La dilución utilizada en cada caso fue 1:100 del vial madre en SFB.
Sección II a 92
Luego de la incubación se realizaron nuevos lavados en PBS y se incubaron con el
anticuerpo secundario (lgG anti-conejo dilución 1:100 en SFB, Vector) en cámara húmeda
a temperatura ambiente, durante una hora. Luego de lavados con PBS, se incubó con el
sistema ABC (Vectastatin ABC,Vector) durante 30 minutos en cámara húmeda a
temperatura ambiente. Se reveló con diaminobenzidina (Sigma) 0.05% en PBS y 1% de
peróxido de hidrógeno, bajo microscopio y se detuvo la reacción con agua destilada. Se
realizó una coloración contraste con verde de metilo y deshidratación, aclaración y
montaje con medio sintético (DPX, Fluka).
Como control de especificidad de la señal se utilizaron cortes incubados omitiendo el
anticuerpo primario o secundario (figura 32).
a FIGURA32
a) Muoosa sometida a Ia reacción inmunohistoquimicapara el FGFR-2 omitiendo el anticuerpo primario.
‘ b) Mucosa sometida a Ia reacción inmunohistoquimica1.}, b para el FGFR-3 omitiendo el anticuerpo pn'man'o.
DETERMINACIÓN DEL b-FGF POR WESTERN BLOTS.
o Preparación de Homogenatos
1-El tejido se cortó con tijera para obtener piezas de menor tamaño y posteriormente
fue disgregado manualmente.
2-EI tejido disgregado se homogenizó en buffer de extracción celular, en la siguiente
composición: Tris 0.5M (ICN, Ultra Pure) pH= 6.8, glicerol (Sigma) al 10% y laurilsulfato de
sodio (SDS) (Sigma) al 20 %. Inmediatamente antes de la utilización del buffer se
agregaron inhibidores de proteasas (Sigma): fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) 10 mM,
leupeptina 1mg/ml, y apoprotinina 1mg/ml. Se utilizaron aproximadamente 5 pl de buffer
por mg de muestra y se continuó la disgregación mecánicamente.
3- Se sonicaron los homogenatos hasta obtener una suspensión homogénea.
4-Se centrifugaron los homogenatos durante 10 minutos a 140009 en ultracentrífuga
refrigerada (4°C).
5- Finalmente se recuperó el sobrenadante. El mismo se almacenó a -80°C hasta su
Sección II a 93
posterior utilización, separándose una alícuota para realizar la determinación de
proteínas.
Cada extracto celular correspondió a una sola bolsa tratada o control.
Determinación de proteinas
Se utilizó el ensayo comercial de Bio-Rad basado en el método de Lowry (Lowry y
col., 1951) para determinación de concentración de proteínas en extractos celulares
obtenidos con detergente (Bio-Rad DC Protein Assay Kit II, Richmond). Luego de la
reacción colorimétrica se realizó Ia lectura dela D.O. en espectrofotómetro a 750 nm.
Se realizaron curvas Standard de albúmina por duplicado en cada determinación
(curva de calibración con BSA del kit Bio-Rad: img/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml, 0.1mg/ml,
0.01mg/ml y blanco con agua destilada).
Western blots
Reactivos utilizados
Archilamida 30% (Sigma)
Buffer Tn's 1.5M, pH 6.8 (se lleva a pH con HCI), para el gel separador (resolving gel).
Buffer Tn's 1M, pH 8.8 (se lleva a pH con HCI), para el gel concentrador (stacking gel).
SDS 10% (Sigma)
Persulfato de amonio, APS 10% (Sigma).
N'N' N... N.. A A
Buffer desnaturalizante (2x, se diluye a 1X con la muestra): SDS 5%, B-mercaptoetanol
(Sigma) 15%, glicerol 60%, Tn's 0.3M, pH 6.8, Azul de Bromo fenol (Sigma) 0.05%.
Buffer de corrida: Tris-Glicina-SDS (10X, Sigma), se diluye en agua destilada antes de
LILIl .edíamiua, TEMED, (Sigma, 99% para electroforesis)
usan
Buffer de transferencia: buffer de corrida 1X (800ml) y metanol (Merck, pro analysi, 200ml).
Marcadores de peso molecular. Kaleidoscope prestained standards, Bio-Rad.
PBST (PBS-Tween 20 al 0.05%), PBS pH 7.4 (Sigma).
Membrana de nitrocelulosa, hybond C (0,2 um) Amersham; PVDF Millipore.
Solución de bloqueo: leche descremada al 5% en PBST.
Sustrato quimioluminiscente: ECL Plus Western Blotting detection reagent, RPN 2132,
Amersham LifeScience.
Pelicula fotográfica, Kodak.
Sección II a 94
Procedimiento
Se realizaron electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes (SDS-PAGE), usando el sistema de buffers disoontinuos-de Laemmli
(Laemmli, 1970). Se utilizó un gel concentrador al 5% y un gel separador al 15%.
Los extractos proteicos (70 ug de proteínas totales por calle), se separaron
previamente a Ia siembra en el gel, disolviéndolos en buffer desnaturalizante y se
hirvieron durante 5 minutos. La electroforesis se realizó durante aproximadamente 60
minutos a 50 mNgel hasta observar la resolución del gel, durante los primeros 20 minutos
de la electroforesis se aplicó una corriente de 30 mApara resolver el gel concentrador.
Luego se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa a 100Vdurante una hora.
Para la determinación inmunológica de la proteína en estudio, se realizó un bloqueo
de sitios inespecíficos en las membranas, durante 30 minutos en agitador a temperatura
ambiente (20-22 oC). Luego se incubaron las membranas con un anticuerpo policlonal
anti-bFGF (FGF-2-147- sc79, rabbit lgG de Santa Cruz), dilución 1:1000 en PBST durante
toda la noche a 4 oCen agitación. Luego se realizaron 3 lavados de 10 minutos cada uno
con buffer PBST, y posterior incubación de las membranas con el anticuerpo secundario,
anti-lgG de conejo realizado en cabra conjugado con peroxidasa (ICN, Cappel, molécula
entera) en dilución 1210000 en PBST, durante 30 minutos en agitación a temperatura
ambiente. Finalmente se realizaron lavados en PBST y se revelaron las bandas positivas
por químioluminiscencia, incubando durante 5 minutos en agitación con el sustrato. Para
visualizar la señal se expusieron las membranas a una placa radiográfica en cuarto
oscuro durante 20 a 25 minutos dependiendo de la señal desarrollada.
En cada gel se separó un conjuntode marcadores de peso molecular.
Como control de carga de las calles, cada membrana fue incubada con un
anticuerpo anti-actína policlonal (actin, C-11, lgG de cabra, sc-1615, Santa Cruz) en
dilución 1:1000 en PBST, durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriores
lavados con PBST. Se utilizó un anticuerpo secundario anti lgG de cabra (ICN, Cappel,
molécula entera) en dilución 1210000en PBST.
Se repitieron los experimentos con 4 a 6 bolsas de cada tiempo experimental.
SecciónII a 95
Controles
Se utilizaron como controles específicos del anticuerpo primario:
1- Una proteina fusión del FGF-2 de 41 kd, producida en E. Coli, correspondiente
a la secuencia aminoacídica del FGF-2 humano entre los aminoácidos 10-140
(FGF-2-10-140, 50-4305 WB, Santa Cruz) sembrada a 10ng por calle.
2- FGF-básico purificado de glándula pituitaria bovina (Sigma F-3133) sembrado
a 5 ng por calle.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos se expresan como la media i ES. Para analizar el GMS se utilizóel test
de ANOVAde dos vias seguido por el test de Newman-Keuls como contraste a posteriori.
Se consideró significativauna diferencia con una significancia del 5% (ps0.05).
RESULTADOS
En la mucosa normal observamos inmunomarcación para FGF-2 solamente en el
estrato basal (figura 34-a). La marcación fue de localización citoplasmática y el patrón de
expresión a Io largo de toda la mucosa se presentó en parches. Importantes zonas de la
mucosa fueron positivas mientras que otras áreas se observaron negativas. El mismo
patrón de expresión se observó en la mucosa tratada con aceite mineral (figura 34- b y c).
Al estudiar las bolsas cancerizadas durante 4 meses encontramos que la expresión
de b-FGF en los carcinomas era baja y que en muchos carcinomas no había expresión
del factor. Por el contrario la mucosa adyacente a los tumores era positiva (figura 33), y su
patrón de marcación dependía del tipo de lesión pre-neoplásica que presentaba.
FIGURA 33
Reacción inmunohistoquimica del FGF-2 en uncarcinoma de la bolsa de la mejilla del hamster y sumucosa adyacente.No se observó inmunomarcación para el factor en elcarcinoma, mientras que la mucosa adyacente revelóexpresión del factor (flechas).Magnificación final 50X.
w
Figura 34 \
Sección II a 97
FIGURA 34
Expresión Inmunohlstoquímlca del FGF-2en el epitelio normal, control y carcinomas de la bolsa de la mejilladel hamster.a) Se observó expresión del FGF-2 en el estrato basal de la mucosa normal, marcación citoplasrnáfica, la marcación nofue homogénea a lo largo de todo el epitelio (detalle).b) y c) Mrcosa control, topicada durante 16 semanas con aceite mineral.d) y e) Ejemplos de carcinomas negativos para Ia IHQdel FGF-2.f) y g) Distintas áreas de carcinomas, con expresión del factor, clasificados como positivos.h) Detalle de un área positivade un carcinoma, se observan algunos núcleos positivos.l) Zona hiperplásica de la mucosa adyacente al tumor. Se observó marcación basal y suprabasal para el factor.
Magnificaciónfinaka,b,c130X;dye30X;fyg100X;hei300X.
Sección II a 98
AI analizar solamente los tumores observamos que aquellos que expresaban el
FGF-2 lo hacían por zonas. En un mismo tumor existían áreas positivas y otras negativas.
Las áreas positivas eran en su mayoria zonas diferenciadas del carcinoma, y dentro de
esas áreas la marca tendía a ser basal, de localización citoplasmática y en muy pocos
casos nuclear (figura 34, f- g-h).
Para clasificar los carcinomas en positivos y negativos, definimos como positivos a
aquellos que presentaban alguna zona positiva y como negativos a los que no
presentaron ningún tipo de reacción (tabla 3).
porcentaje TABLA3
negativos 64-3 (n = 9) Expresióndel FGF-2en carcinomas dela bolsa deI ¡l ' _
positivos 357 (n ___5) a me] la del hamster
Los datos de la tabla 3 revelan que un 65% de los tumores fueron negativos. El 35%
restante de los carcinomas presentó algún tipo de expresión de FGF-2. La mucosa
adyacente a los carcinomas expresa el FGF-2, pero no Io hace en forma homogénea. Las
áreas positivas de la mucosa se corresponden histológicamente con imágenes de
hiperplasia, displasia y hasta CIS, asi como también se observó una gran cantidad de
áreas NUMFpositivas. Tanto en las zonas NUMFcomo en las áreas pre-neoplásicas la
marcación fue basal y suprabasal. La cantidad de marcación suprabasal era mayor en las
lesiones de mayor gravedad (figura 34-i).
En las etapas mas tempranas, entre las semanas 6 y 10 del proceso carcinogénico,
el patrón de expresión fue similar al observado en la mucosa adyacente a los tumores y el
grado de marcación suprabasal difería entre las distintas semanas del tratamiento. En la
figura 35 se observa el grado de marcación suprabasal (GMS) para las áreas NUMFy
PREN, las cuales difieren significativamente entre si y con respecto a los epitelios control.
El GMS de las áreas PREN es notoriamente mayor que el de las áreas NUMF.A su vez
éstas presentaron un aumento significativodesde la sexta semana de tratamiento (figura
36), con un pico en Ia marcación a la semana 7, valor que luego vuelve al dela semana 6
y se mantiene así hasta Ia semana 10. Estas variaciones coinciden en tiempo con el
aumento de los cuadros de fibrosis subyacentes a las áreas NUMF descriptos en Ia
sección l-c. Esto indicaría una acción de este factor más preponderante en el desarrollo
de la fibrosis pre-tumoral que en el desarrollo de los tumores.
Sección I] a 99
0.6
l + NUMF—e— PREN
0.4 '
GMS
0.2
o.“ icontrol semanas
FIGURA 35
Cuantificación de la expresión inmunohistoquímica del FGF-2 a través del GMS en los tiempos intermedios decanoen'zación (semana 6 a 10) para áreas NUMFy PREN.ANOVA de dos vias, factor categoria F1143:26.8 p< 0.0001 ("), factor tiempo F5143: 6.25 p< 0.0001 , interacción F5.143:1.92 p = 0.09. Comparaciones post-hoc Nevwnan-Keuls ' p< 0.05 vs. control.
T máximo valor de GMS para NUMF.
Los datos se expresan como la media i ES.
Las zonas PREN presentaron un aumento de la expresión suprabasal del FGF-2
muy importante respecto de C y áreas NUMFdesde la semana 6 y con un patrón distinto
al de NUMF (figura 36- c-f-g). El GMS de las zonas PREN es elevado con oscilaciones
entre la semana 8 y 9 para disminuir hasta casi alcanzar el valor de las áreas NUMFa la
semana 10. El notable aumento en el GMS refleja Io observado en áreas H y D entre las
semanas 6 y 9 donde en muchos casos (semana 9 en general) se observó todo el
espesor epitelial positivo para la expresión de FGF-2 (figura 36). Nuevamente estos
resultados recuerdan a la dinámica de los cuadros fibrosos subyacentes a las zonas
PREN analizados en la sección I-c. A su vez en los carcinomas tanto la expresión de b
FGF como la fibrosis disminuyen hasta casi desaparecer.
ósemanas7semanas
8semanas9semanas
\
10semanas
Figura 36
SecciónII alOl
FIGURA 36
Expresión lnmunohlstoquímica del FGF-2en áreas NUMFy PRENentre la semana 6 y 10 de cancerizaclón.
AreasNUMF:a)yb),alas6semanasdecancenzaciónseobservómarcación basalysuprabasal.d)ye)Alas7semanasdetratanüentoseobsewómarcaciónentodoelespesorepitelial.h)AIas8semanasseobserva marcación basal y suprabasal.j) y k) A las 9 semanas se observa marcación basal y suprabasal y algunas zonas NUMFpresentan solo marcaciónbasal.
m) A las 10 semanas algunas zonas presentan solo marca basal.
Áreas PREN: c) 6 semanas, se observó expresión del FGF-2 en el estrato basal y suprabasal con localizaciónde lamarca citoplasmática.f) y g) A las 7 semanas la marcación es basal y suprabasal. Se observa en algunos casos marcación nuclear (flechas).i) 8 semanas, patrón similaral de las 6 semanas.l) 9 semanas, se observa marcación en todo el espesor epitelial.n) y o), 10 semanas, n) CIS, con marcación supraba'sal y estratos superiores negativos, o) área displásica negativa.
Nagnificación final: a, b, d, h, j, m 120X; g 600X; resto 500X
SecciónII al 02
Los WB confirmaron la expresión de b-FGF en la mucosa normal y en la tratada con
el vehículo. Se observó la expresión de 2 bandas de 18 y 24 kd respectivamente para la
proteína estudiada. En algunos casos se observó una banda de menor peso molecular
(16 kd), en muy baja intensidad (figura 37b-c).
Los extractos celulares de las bolsas tratadas por 6, 9 y 10 semanas revelaron en
todos los casos las mismas bandas observadas en la mucosa normal, con un aumento
importante en la intensidad de la banda de 18 kd respecto de la mucosa control. Las
bandas de 24kd y 16 kd presentaron intensidad disparar entre los distintos casos. Algunos
homogenatos correspondientes a bolsas tratadas durante 6 y 9 semanas presentaron las
bandas de 16 y 24 kd respectivamente mientras que otros extractos de 6, 9 y 10 semanas
no expresan la banda de 16 kd, pero si expresaron la banda de 24 kd (figura 37 c-d).
FC-Ïvl:n FGF, Ca Ca
FIGURA 37
Detección de b-FGFpor análisis de Western Blot.
Los extractos de bolsas normales, control, cancerizadas en distintostiempos y carcinomas con su mucosa adyacente fueron sometidos a SDSPAGE 15% y transferidos a membrana de nitrocelulosa. Las membranas
aK“ fueron incubadas con anti-FGF-2.7rd
o <0 6‘ <0 <0 6‘MC 956 oa 09 MN MC 696 gafas?“ MC 656958 «056 (P o'ó
12‘“ ‘ ‘ , tskd V.
V ¿a “gd ,,»
a) Controles positivos: calle 1, FGF-2 de pituitaria bovina, calle 2, FGF-2 proteina fusión (santa Cruz); calles 3 y 4carcinomas de la bolsa de la mejilladel hamster. b) calle 1, mucosa control; calle 2 extracto de una bolsa tratadadurante 9 semanas con DMBA;calles 3 y 4 extractos de bolsas cancerizadas durante 16 semanas quepresentaban tumores. c) calle 1, mucosa normal; calle 2 mucosa control; calles 3, 4 y 5 mucosas cancerizadasdurante 6, 9 y 10 semanas respectivamente con DMBA. d) calle 1, mucosa normal; calle 2, 3 y 4 bolsascancerizadas durante 6, 9 y 10 semanas respectivamente con DMBA; calles 5 y 6 extractos de bolsascancerizadas durante 16 semanas que presentaban carcinomas. Se destacan las bandas corespondientes al FGF2 de 18 y 24 kd y en los detalles inferiores el control interno de cada gel (actina). En cada calle se sembró elextracto proveniente de un animal experimental del tratamiento mencionado.
Sección II a103
Alestudiar las bolsas canoerizadas durante 4 meses observamos en todos los casos
la disminución en la expresión de la banda de 18kd respecto de las semanas 6, 9, 10 y del
control. La banda de 24 kd presentó una expresión variada (algunas bolsas no la
expresaron y otras si) y la banda de menor peso molecular (16 kd) no se observó en
ninguno de los casos.
Estos resultados además de definir el comportamiento de las diferentes isoformas,
globalmente coinciden con el patrón e intensidad del b-FGF observados por IHQ. En el
caso de los WB debe tenerse en cuenta que las bandas observadas en las calles
indicadas como carcinoma son la resultante de la expresión de la proteína en el tumor y la
mucosa adyacente.
EXPRESIÓN DEL FGFR-2 Y DEL FGFR3.
FGFR-2
En la mucosa normal observamos inmunomarcación para el receptor en todo el
espesor epitelial (figura 38-a). En el tejido conectivo subyacente la expresión del receptor
se observó en endotelios vasculares y fibroblastos. La marcación fue de localización
citoplasmática (aspecto puntillado)o de membrana y el patrón de expresión a lo largo de
toda la mucosa no fue homogéneo, con algunas zonas que no presentaron expresión del
receptor. El mismo patrón de expresión se observó en la mucosa tratada con aceite
mineral (figura 38-b).
AI analizar los carcinomas y la mucosa adyacente a los mismos observamos un
patrón de marcación similar al de la mucosa normal, con leves cambios. AI estudiar solo
los carcinomas se puede observar que la marca epitelial es importante con tendencia a
predominar en zonas basales en algunas zonas del tumor y en otras áreas se observa
marca en todo el cordón epitelial independientemente de su grado de diferenciación
(figura 38-f y g). En cuanto al estroma tumoral claramente se observa una disminución de
la marca, hasta encontrar áreas negativas. En Ia mucosa adyacente al tumor se observa
el mismo patrón de expresión que en la mucosa normal. En algunas áreas
(independientemente de su histología)se encontró una tendencia a la marca suprabasal.
Al analizar la expresión del FGFR-2 en las etapas tempranas de la cancerización
tampoco observamos diferencias ostensibles con la expresión del receptor en la mucosa
control. Al analizar detenidamente los casos correspondientes a la semana 6 y 7 también
observamos algunas áreas que independientemente del cuadro histológicopresentaban
una tendencia a la marca suprabasal, pero este patrón no era uniforme a lo largo de la
mucosa (figura 38-c y d). En algunos cuadros, se pudo observar marcación epitelial
Sección II a104
nuclear, sin encontrarse en cantidad, ni poder correlacionarse claramente con el cuadro
histológico o la etapa del proceso de canoerización. En cuanto al tejido conectivo se
evidenció la marca en endotelios y fibroblastos. En los casos de cuadros desmoplásicos la
marcación conectiva podía desaparecer u observarse por debajo del cuadro fibroso (figura
38).
v
Figura 38
Expresión inmunohistoquímica del FGFR-2enla carcinogénesis dela bolsa de la mejilladel hámster.a) Mucosa normal representativa que presentó expresión del receptor en todo el espesor epitelial y en el tejido conectivo.b) Mucosa control (16 semanas de topicación con aceite mineral) que presentó el mismo patrón de expresión que la mucosanormal. c) Epitelio cancerizado durante 6 semanas, se observó una tendencia a la marcación suprabasal y la misma fue delocalización citoplasmátioa. Se observó marcación en fibroblastos y endotelios. cl)A las 7 semanas de tratamiento se observó elmismo patrón de marcación que el observado alas 6 semanas. e) Ejemplode un área displásica a las 7 semanas de tratamiento,se observó igualpatrón de marcación que en d), evidenciándose marcación nuclear (flecha). f) Carcinoma con expresión estromaldel receptor con una tendencia ala marcación basal. g) Detallede un cordón tumoralcon marcación en todo el espesor epitelial.Magnificación final: a, 55X; b, c, d, 150X; e, 600X; f, iOOXy g 300X.
Sección II a106
FGFR-3
La mucosa normal también presentó expresión de FGFR-3. La marcación epitelial
fue de gran intensidad, mayor en Ia zona suprabasal y de localización citoplasmática. Los
fibroblastos y endotelios vasculares también presentaron una marca intensa (figura 39-a).
La marca fue homogénea a lo largo de toda la mucosa. La mucosa tratada con vehicqu
presentó el mismo tipo de marcación (figura 39-b).
Los carcinomas también presentaron una marca importante para el receptor y en
este caso el estroma tumoral fue claramente positivo tanto en fibroblastos como
endotelios vasculares (figura 39-f y g). La mucosa adyacente a los tumores presentó un
patrón similar al de los controles, con una acentuación en la tendencia de la marca
suprabasal.
En las etapas tempranas de cancen’zación (semana 6 a 10), no se observaron
diferencias ostensibles con la mucosa normal ni con lo observado a los cuatro meses de
cancen'zación (figura 39 c, d, e).
Figura 39
Expresión inmunohistoquímica del FGFR-3enla carcinogénesis dela bolsa de la mejilladel hámster.a) La mucosa normal presentó expresión del receptor 3 en todo el espesor epitelial, Ia marcación fue de localizacióncitoplasmática. Se evidenció intensa marcación de endotelios y fibroblastos. b) El epitelio control presentó las mismascaracteristicas que la mucosa normal. c) A las 6 semanas de tratamiento se observó el mismo patrón de expresión que elcontrol. d) y e) A las 7 semanas de tratamiento no se encontraron diferencias en Ia marcación respecto de c. f) Ejemplo de uncarcinoma, se observó expresión de FGFR-3 en estroma y parenquima. g) Detalle de un cordón tumoral con marcación en todoel espesordel mismo.
Magnificación final: f, 80X; b y g 200X; resto 160X.
Sección II a108
CONCLUSIONES
o El b-FGF se expresa en el epitelio de la mucosa normal de Ia bolsa de la
mejilla del hámster exclusivamente en la capa basal. Durante la
carcinogénesis aumenta su intensidad y su actividad se extiende a las células
suprabasales.
o En los carcinomas la expresión del b-FGF disminuye hasta casi desaparecer.
La isoforma que deja de expresarse es la de 18kd.
o Las variaciones del b-FGF coinciden con la evolución de la fibrosis
subepitelial.
o Los receptores FGFR-2 y 3 se expresan en el epitelio y en los fibroblastos y
endotelios de la mucosa normal. Su actividad aumenta en las lesiones pre
malignas y se mantiene algo mas irregularmente en los tumores.
o Se interpreta que el b-FGF en el modelo de la bolsa de la mejilla del hámster
cumple un rol autócn'no-parácn'no en la interfase epitelio-conectivo con un
papel predominante en el desarrollo de la fibrosis temprana y en menor grado
en la angiogénesis tumoral, papel este último comprobado en muchas
neoplasias experimentales y humanas.
o La isoforma de 18kd del b-FGF sería Ia más involucrada en el desarrollo dela
fibrosis. Las otras isoformas podrian interactuar con los receptores que
mantienen su expresión, durante todo el proceso, en los fibroblastos,
endotelios vasculares y epitelios, incluyendo el epitelio tumoral.
SECCIONll-b
Estudio del factor de crecimiento de endotelios vasculares y la actividad proteolítica
INTRODUCCIÓN
En distintos tipos de neoplasias y especificamente en carcinomas bucales humanos
se ha estudiado la actividad angiogénica de los factores de crecimiento b-FGF y VEGF.
Como ya hemos comentado el b-FGF es un potente factor mitogénico de fibroblastos y
endotelios. En nuestro modelo de CBMH hemos encontrado (sección l-c) que el b-FGF
está primordialmente asociado a la producción de fibrosis pre-neoplásica y en mucho
menor grado a la neovasculan’zación de los tumores. En base a estos hallazgos
encaramos el estudio de la expresión del VEGF como una aproximación al estudio de Ia
angiogénesis en nuestro modelo.
Además, dado que se ha reportado (Miyagi y col., 1998; Un'a y col., 1998; Lo y
Hurta, 2002) regulación de actividad de proteasas por parte del b-FGF en distintos tipos
tumorales estudiamos actividad proteolíticade bolsas control y bolsas en distintas etapas
de cancerización.
El VEGF es el único factor angiogénico específico, dado que actúa selectivamente
sobre las células endoteliales que expresan sus receptores (Senger y col., 1983; Dvorak
y col., 1991). Bioquímicamente el VEGF es una glicoproteína que se une a heparina. Se
conocen 4 formas moleculares generadas por splicing alternativo, de 121, 165, 189 y 205
aminoácidos respectivamente (Ferrara y col., 1992; Ferrara, 1996). Las tres variantes de
menor peso molecular son producidas por células y de ellas la de 21 kd es soluble (Park
y col., 1993). Las formas de alto peso molecular se asocian a las células en la matriz
extracelular (Neufeld y coI., 1999). El VEGF induce permeabilidad vascular, regula la
producción de proteasas y promueve la diferenciación, movimiento y sobrevida de células
endoteliales, propiedades que determinan su actividad angiogénica.
Existen diversos reportes sobre la expresión y rol del VEGF en el CCEB. Muchos
trabajos relacionan Ia expresión del VEGF en el CCEB con la agresividad tumoral (Sauter
y col., 1999) o como un indicador pronóstico de sobrevida, dado que se encontró que
pacientes con tumores positivos para la expresión del VEGF presentaron menor
sobrevida que aquellos negativos para el factor (Sauter y col._ 1999). Sin embargo estos
Sección II b 110
resultados son controversiales debido a que otros reportes presentan evidencia de
disminución de expresión inmunohistoquímica del VEGF a medida que avanza la
tumorigénesis del CCECC (Tae y coI., 2000). Así mismo Carlile y col. reportan un rol
fisiológico del VEGF en la mucosa bucal pero no logran asociarlo a la angiogénesis en la
carcinogénesis bucal (Carliley col., 2001). En líneas celulares de CCEB se ha observado
promoción de angiogénesis con expresión del VEGF y aumento de la expresión de sus
receptores, KDR/fltk-1,en células endoteliales (Michiy coI., 2000).
El proceso angiogénico, la formación de nuevos capilares provenientes de vasos
sanguíneos ya existentes, es un evento fundamental en procesos biológicos como el
desarrollo embrionario, la reparación de heridas y la proliferación del endometrio y en
condiciones patológicas como las enfermedades neoplásicas o la artritis reumatoidea
(Folkman, 1995). Se ha calculado que una lesión en crecimiento de tamaño mayor 1-2
mm3 necesita la formación de nuevos vasos para su nutrición (Folkman, 1986; Folkman,
1990a; Folkman, 1990b).
Datos experimentales obtenidos en modelos de carcinogénesis química y animales
transgénicos demuestran que la angiogénesis precede a la formación tumoral, sugiriendo
que la progresión depende de un cambio de una etapa pre-vascular a una fase
angiogénica (Hanahan y Folkman, 1996). El proceso angiogénico tumoral involucra
distintos pasos secuenciales, que incluyen la degradación de la membrana basal y la
matriz extracelular de los vasos parentales, el movimiento de las células endoteliales
hacia la masa tumoral a nutrir, mitosis, formación de un lumen, formación de los nuevos
brotes vasculares, la formación de una nueva membrana basal y finalmente el
reclutamiento de los pericitos (Ausprunk y Folkman, 1977; Folkman, 1995). Cada uno de
estos pasos es regulado delicadamente (Kumar y coI., 1998). La inducción del proceso
angiogénico es mediada por liberación de moléculas por parte del tumor y las células del
huesped, que regulan positiva y negativamente el proceso y su evolución depende del
balance neto entre los factores angiogénioos estimulatorios e inhibitorios (Liottay Stetler
Stevenson, 1991; Hanahan y col., 1996).
Se han identificado muchos factores angiogénioos como: interluekinae8, PDGF, el
factor de crecimiento de los hepatocitos y el VEGF asi como el b-FGF entre otros
(Folkman y Klagsbrun, 1987a; Folkman y Klagsbrun, 1987b; Folkman, 1995). Se han
identificado diversos agentes inhibitorios de la angiogénesis como trombospondina-l,
angiostatina, endostatina, interferon-a e inhibidores de metaloproteasas entre otros
(Folkman, 1995). Entre los agentes pro-angiogénicos los mas importantes son el VEGF,
Sección II b 111
el b-FGF y algunos autores incluyen al TGF-B (Rifl<iny col., 1993; Ferrara y Keyt, 1997;
Bikfalviy col., 1997). Nosotros hemos analizado la expresión del b-FGF en este modelo y
se ha reportado un aumento del TGF-B en lneas celulares de Ia bolsa de la mejilla del
hámster en el pasaje a fenotipo angiogénico de esas líneas celulares (Lingen y col.,
1997). El VEGF no ha sido estudiado en este modelo.
OBJETIVOS
o Estudiar la actividad de un factor de crecimiento angiogénico específico como el
VEGF a través de su expresión inmunohistoquímica en el proceso carcinogénico y en
los carcinomas del modelo de cáncer bucal de Ia bolsa de la mejilladel hámster.
o Analizar preliminarmente Ia existencia de actividad proteolítica en la carcinogénesis
de este modelo a través de zimogramas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la realización de zimogramas se utilizaron20 bolsas de hamsters, sometidos al
protocolo estándar de cancerización (según sección I-a) correspondiente a 4, 6, 9 y 10
semanas de cancerización (12 bolsas) y 16-17 semanas (3 bolsas) y sus
correspondientes controles con el vehícqu del canoerígeno (1 bolsa por cada tiempo) y 3
bolsas de animales sin ningún tratamiento.
Las bolsas se almacenaron en freezer a -80° C hasta su utilización.
Para determinar VEGF por IHQ se utilizómaterial fijado en formol neutro 24 horas e
incluidoen parafina. Se trabajo con el mismo material que se utilizópara la determinación
IHQ de los FGFR 2 y 3.
DETERMINACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DEL VEGF
Se utilizaroncortes de 5 um de espesor montados en portaobjetos silanizados, para
evitar su desprendimiento durante la recuperación antigénica.
Los cortes se desparafinaron e hidrataron en xiloI y etanol de graduacióndecreciente. Previo a Ia hidratación con etanol 96% se incubaron en alcohol metílico
Sección II b l 12
peróxido de hidrógeno en relación 10021 (H202100 volúmenes) durante 30 minutos para
inhibir la actividad de la peroxidasa endógena. Luego se terminó la hidratación y se
realizó una recuperación antigénica incubando los cortes en buffer citrato (pH 4), en olla
a presión en horno de microondas a potencia máxima durante 5 minutos. Se dejaron los
cortes durante 20 minutos a temperatura ambiente, para luego continuar con el bloqueo
de sitios inespecíficos en PBS-albúmina 0.2% (Gibco BRL, bovine aibumine fraction V)
durante 10 minutos. Posteriormente se realizó la incubación con el anticuerpo primario
correspondiente durante toda la noche a 4°C en cámara húmeda.
El anticuerpo utilizado fue un anti-VEGF humano realizado en cabra (VEGF-147,
200uglml, Santa Cruz) dilución 1:20 del vial madre en PBS.
Luego de la incubación se realizaron lavados en PBS-albúmina 0.3% y los cortes se
incubaron con el segundo anticuerpo biotinilado (dilución 12200, IgG Biogenex, Kit
Multilink)a temperatura ambiente durante 1 hora en cámara húmeda. Luego de nuevos
lavados con PBS-0.2% albúmina, se incubó con el complejo de peroxidasa
estreptoavidina (Biogenex). Se reveló con 3,3-diaminobencidina (Sigma) al 0.05% en
PBS y 1% de peróxido de hidrógeno bajo microscopio y se detuvo la reacción con agua
destilada. Se realizó una coloración de contraste con hematoxilina y se realizó la
deshidratación, aclaración y montaje con bálsamo de Canadá.
Como control de especificidad de la señal se utilizaron algunos cortes que fueron
incubados omitiendo el anticuerpo primario o secundario.
Como control positivo se utilizaron cortes de riñón humano normal (Maeda y col.,
1998) (figura 40).
FIGURA 40
Control positivo para la reaccióninmunohistoquímica del VEGF.Corte histológico de riñón humano con reaccióninmunopositiva para el VEGF en los túbulosrenales.
Sección II b 113
ZIMOGRAMAS
MMArchilamida 40% (Sigma)
SDS 20%
Persulfato (APS) 10%
TEMED
Gelatina (solución stock 30mg/10ml).
Buffer Tris 1.5M, pH 8.8 (se lleva a pH con HCI), 0.4% SDS, para el gel separador.
Buffer Tn's 0.5M, pH 6.8 (se lleva a pH con HCI), 0.4% SDS, para el gel concentrador .
Buffer desnaturalizante: 0.25M Tn's, SDS 10%, sucrosa 4%, Azul de Bromo fenol
(Sigma) 1mg/ml.
Buffer de com'da: glicina 0.25M, Tris 25 mM, SDS 1%, pH 8.3 (solución stock 10X), se
diluye en agua destilada antes de usar.
Solución para activación enzimática: 2.5% Tn'tónX-100 (Sigma).
Buffer enzimático: 100mM Tn‘s, 15 mM C8CI2, pH 7.4.
Comassie: 0.1% Comassie R-250 (Sigma), 10% ácido acético, 30% metanol.
Homogenatos y Zimograma
Los bolsas se homogenizaron en buffer RIPA (50mM Tris, pH 8.0 con 150 mM
NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycolato y 1% NP40) y los homogenatos resultantes se
centrifugaron durante 15 minutos a 4°C. Se fraccionó el sobrenadante y congeló a -80°C
hasta ser utilizado.Los pellets se descartaron. Las muestras (70ug/calle) se sembraron y
corrieron en geles de poliacrilamida (8,7%) conteniendo un 1,5% de gelatina (Sigma)
hasta su resolución. Una vez finalizada la electroforesis, los geles fueron incubados
durante media hora en 2,5% tritonX-100 y luego durante 18 horas en el buffer para la
actividad enzimática a 37°C. Los geles fueron teñidos con Coomasie Blue R-250 y
desteñidos con agua, con la aparición de bandas claras (indicativas de actividad
proteolítica) en un fondo azul.
Sección II b l 14
RESULTADOS
EXPRESIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DEL VEGF.
La mucosa normal de la bolsa de la mejilla del hámster presentó expresión del
VEGF en el epitelio en todo su espesor, con escasa reacción en los fibroblastos
conectivos (figura 41-a). La marcación fue claramente citoplasmática. Los controles
tratados con aceite mineral presentaron el mismo tipo de inmunomarcación (figura 41- b).
Al estudiar las bolsas cancerizadas durante 4 meses (luego de la aparición de
tumores) observamos expresión de VEGF tanto en los carcinomas como en la mucosa
adyacente (figura 42). El patrón de expresión en el epitelio de la mucosa adyacente fue
similar al del control, pero la marcación fue de mayor intensidad. El tejido conectivo
subyacente presento marcación fibroblástica y endotelial, la intensidad y cantidad de
marca parecía depender de la magnitud los cuadros de fibrosis. Los carcinomas
presentaron una marcación citoplasmática intensa en el parénquima tumoral con mayor
intensidad en los estratos suprabasales. Algunos carcinomas presentaron una débil
reacción en vasos y fibroblastos del estroma (figura 41c, d, e, f).
FIGURA 42
Reacción inmunohistoquímica para el VEGF enun carcinoma de la bolsa de la mejilla delhamster y su mucosa adyacente.Se observó inmunomarcación para el factor en elcarcinoma (flechas azules) asi como en la mucosaadyacente (flechas rojas).
Magnificación final 1OOX.
En las etapas tempranas de la cancerización, la expresión del VEGF muestra
patrones muy similares al descripto. A las 6 semanas de tratamiento también
observamos marcación epitelial, de mayor intensidad que la mucosa normal y de
tendencia suprabasal. No encontramos diferencias relacionadas con el tipo de lesión pre
neoplásica que presentaba el epitelio, pero si en relación al cuadro observado en el tejidoconectivo.
Figura 41
Expresión inmunohistoquímica del VEGFen el epitelio normal, control y carcinomas de la bolsa de la mejilla delhamster.a) Muoosa normal, se observó expresión del VEGFen todo el espesor epitelialy escasa marcación en eI tejido oonectivo. b) Lamucosa control (16 semanas de tratamiento con aceite mineral)presenta el mismo patrón de marcación que Iamucosa normal.c, d y e) Ejemplos de carcinomas que expresaron eIVEGFen el estroma tumoral.f)Detalle del carcinoma presentado en e), seobserva localizacióncitoplasmática dela marcación.
Magnificación final: b y e 100X; f 350X; resto 300X.
Sección II b 116
El tejido conectivo subyacente presentó marcación fibroblástica y de endotelios
vasculares (figura 43-a, b). Cuando existían importantes cuadros desmoplásicos se
observó marcación de tendencia suprabasal y las áreas fibrosas eran positivas (Figura43
c, d).
EI mismo patrón de expresión epitelial y conectiva se repitió avanzada la
carcinogénesis. Donde existían cuadros fibrosos se observó expresión del VEGF. Donde
el tejido conectivo era menos denso o laxo igualmente se encontró expresión fibroblástica
o endotelial del VEGF (figura 43 g y h).
En algunas bolsas con importantes cuadros fibrosis (6 y 7 semanas de tratamiento)
se observó infiltrado celular positivo para el VEGF.
FIGURA 43
Expresión lnmunohistoquimica del VEGFentre la semana 6 y 10 de cancerización.a) Epiteliotratado durante 6 semanas, área NUMF,se observó marcación epitelial de gran intensidad pa'a el VEGF aligualqueeneltejidoconeclivo. b)AlasGsemanasdelIalamiento,en unejemplodeárea PREN,seobservaelmisrnopatrón que en la mucosa normal. c) 7 semanas de tratamiento, área NUMF con un importante cuadro fibrososubyacente, se encontró marcación epitelialde tendencia suprabasal y también en el área librosa. d) 7 semanas, áreaPREN, se observó el mismo patrón que en c. e y f) 8 sermnas, zonas NUMF (e) y PREN (f), se observa el mismopatrón que en las semanas anteriores.g y h) 10 semanas, se encontró marcación en el tejidoepitelialy conectivo con los patrones observados previamente;h, detalle de Ia marcación con tendencia suprabasal y marcación vascular.
Magnificación final: g 150X; c, d,f 200X; resto 350X
Inca3
Sección II b 118
RESULTADOS PRELIMINARES SOBRE ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA.
El zimograma reveló actividad proteolitica muy baja para la mucosa normal, que se
corresponde con el patrón de la metaloproteasa-2 (MMP-2)en su forma latente (LMMP
2) (figura 44).
A las 4 semanas de tratamiento encontramos un aumento de la actividad
proteolitica para la forma latente de la MMP-2 y actividad de la forma activa (AMMP-2)de
la enzima, respecto del control. AI mismo tiempo experimental aparece una banda
correspondiente al patrón de actividad de la metaloproteasa-9 en su forma latente
(LMMP-9),no observado en la mucosa normal (figura 44, calle 1 y 2-3).
A las 6 semanas de caroinogénesis se repite el resultado de las 4 semanas pero la
actividad de la LMMP-2y AMMP-2es ostensiblemente mayor. Para la MMP-9se observa
el mismo patrón que a las cuatro semanas (figura 44, calles 4- 5). A las 9 semanas la
actividad de MMP-2 disminuye hasta casi desaparecer en los carcinomas (figura 44
calles 6 a 9). La actividad de la MMP-9es muy baja a las 9 semanas e indetectable en
los carcinomas.
MN 5‘46“ 629“ (¿995° o'ó
FIGURA 44
Actividad proteolitica en las etapas tempranas de cancerización del modelo de la bolsa de la mejilladel hamster y carcinomas. Los extractos de bolsas individuales normales, cancerizadas en distintostiempos y carcinomas con su mucosa adyacente fueron sometidos a electroforesis 8.7%—gelatina1.5%.
calle 1, mucosa normal.calles 2 y 3 extractos de bolsas cancerizadas durante 4 semanas.calles 4 y 5 extractos de bolsas cancerizadas durante 6 semanas.calles 6 y 7 extractos de bolsas cancerizadas durante 9 semanas.calles 8 y 9 extractos de bolsas cancerizadas durante 16 semanas.
Sección II b 119
CONCLUSIONES
o El análisis IHQ reveló la expresión de VEGF en el epitelio y los endotelios
vasculares de la mucosa normal de la bolsa de la mejilla del hámster. Su
expresión no fue alterada por el tratamiento con el solvente del cancerígeno.
o Durante el proceso carcinogénico se observó un aumento de la expresión del
VEGF, pero no se observaron diferencias ostensibles en el patrón de expresión y
no se puedo relacionar el aumento a ningún tipo histológico de lesión en
particular.
o El cambio en el patrón de expresión epitelial se relacionó con la existencia
subyacente de cuadros fibrosos. Ante esa situación Ia expresión en el epitelio
trasfonnado tiende a observarse en los estratos suprabasales. Los cuadros de
fibrosis expresaron el VEGF.
o El tejido conectivo subyacente al epitelio transformado presentó un aumento de
la marcación en endotelios vasculares y fibroblastos .
o Los carcinomas presentaron intensa expresión del VEGF en el parénquima, en
sus capas suprabasales.
o No observamos relación entre la expresión del VEGF y la cronodinamia de
expresión del b-FGF.
o El zimograma realizado reveló un claro aumento de la actividad proteolitica a la
sexta semana de cancerización, respecto del control, las semanas 4 a 9 y de los
carcinomas. El patrón de actividad se corresponde con el de Ia MMP-2y MMP-9.
DISCUSIÓN
Siendo el modelo de cancerización de Ia bolsa de la mejilla del hamster el más
aceptado y más utilizado para estudios de cáncer bucal, se han analizado extensamente
las características de los tumores producidos en cuanto a número, tamaño y tipos
histológicos. Se ha prestado menos atención, en cambio, al estudio de las etapas previas
a la aparición de tumores. Sin embargo, el modelo reproduce no solamente los
carcinomas que se dan espontáneamente en la boca humana, sino que, también en
similitudcon Ia carcinogénesis humana, las neoplasias se dan en forma focal, precedidas
por lesiones pre-malignas multifocales, en una clara manifestación de la instalación de un
campo cancerizado. Dado que el carcinoma de la mucosa bucal, a pesar de los avances
logrados en metodologías diagnósticas y terapéuticas, ha mantenido su incidencia y sus
bajos índices de sobrevida (50% a 5 años) durante los últimos 20 años (Vokes y col.,
1993; Nagpal y Das, 2003), parece importante disponer de un modelo experimental bien
caracterizado que pudiera ser aplicado a estudios en el área de la detección precoz y la
prevención.
Durante la utilización del modelo en distintos protocolos experimentales en nuestro
Iaboraton’o (Schwint y col., 1996; Kreimann y col., 2001a; Kreimann y col., 2001b;
Kreimann y col., 2003) se han observado dos características de interés, hasta ahora no
analizadas en la literatura. Una de ellas es la inducción de alteraciones en el conectivo
subyacente al epitelio cancerizado. con la aparición muy precoz de una intensa fibrosis.
Estos cuadros semejan a las áreas de fibrosis que a veces se detectan en Ia base de
lesiones pre-malignas humanas y en particular, las manifestaciones más avanzadas
guardan estrecha similitudcon la fibrosis dela submucosa, entidad pre-cancerosa de gran
incidencia en los países en donde, como en nuestro modelo, los carcinógenos
permanecen durante tiempos largos sobre la superficie de Ia mucosa, debido al hábito de
mascar compuestos con componentes quimicos carcinogénicos.
La segunda caracteristica de notar en este modelo es la persistencia, aún en las
últimas etapas de aparición de múltiples tumores, de áreas de mucosa
macroscópicarnente sanas y microscópicamente cubiertas por un epitelio de
características morfológicas normales. Estas áreas, que obviamente, se dan también en la
cancerización humana, han sido denominadas en las primeras publicaciones (Schwint y
col., 1996) como zonas NUMF (no unusual microscopic features) y son un excelente
modelo para estudios de cancerización de campo.
Discusión 121
En base a estas observaciones, hemos dado especial énfasis en el presente trabajo
a la caracterización objetiva de algunos de los cambios que subyacen en la
transformación maligna del epitelio y en la desregulación de la interacción epitelio
conectivo en un intento de aportar datos que pudieran ser trasladados a la biologíade las
lesiones pre-malignas humanas y a la búsqueda de marcadores de cancen'zación de
campo.
El análisis de ploidía, método utilizado en oncología para la gradación y pronóstico
de neoplasias, mostró en nuestro modelo, como era de esperar la aneuploidía de los
carcinomas, con datos coincidentes con lo reportado en CCE humanos (Kinoshita y col.,
1992; Schimming y col., 1998; Remmerbach y col., 2001).
El método resultó útilademás en la objetivación de las lesiones pre-neoplásicas. Los
núcleos de las áreas hiperplásicas y displásicas mostraron un aumento en la cantidad de
ADN de magnitud similar en promedio. Sin embargo al analizar separadamente los
estratos epiteliales se observa en las áreas hiperplásicas que el estrato basal presentó
mayor cantidad de ADN que el suprabasal, reflejando su preponderante actividad
proliferativa. En zonas displásicas en cambio, el aumento es homogéneo reflejando la
pérdida de polaridad del epitelio.
Esos datos junto a los de proliferacióncelular de las categorías preneoplásicas (H y
D presentaron valores de LIaumentados pero solo D difiere significativamente del control)
ponen nuevamente de manifiesto las diferencias entre áreas H y D. Las hiperplasias si
bien son un paso en la transformación del epitelial, también pueden ser cuadros reactivos
que se presentar en la bolsa frente a agresiones mínimas durante su uso fisiológico,de
modo que alguna de ellas pueden no corresponder a células transformadas
irreversiblemente (de allí su variabilidad en ploidía y proliferación) no así las zonas
displásicas. Estas últimas también son variables en contenido de ADN, pues presentan
distintos grados (leve, moderado y severo) al igual que en la boca humana, pero no son
compatibles con cuadros reactivos, sino de transformación epitelial.
La alteración en el contenido de ADN en lesiones displásicas de la cavidad bucal
humana han sido reportadas en un estudio sobre biopsias de leucoplasias (Sudbo y col.,
2001a); entre un 5 y 15% se clasifican histológicamente como displasias, y de ellas, un
15 a 20% avanzan hacia carcinoma (Sudbo y col., 2001a; Sudbo y col., 2001c). De
acuerdo al mencionado estudio, sus autores proponen que las leucoplasias con contenido
de ADN normal o diploide deben ser controladas; las leucoplasias con contenido de ADN
Discusión 122
intermedio a tetraploide son cuadros de muy dificil manejo clinico y evolución incierta,
debiendo también ser controladas y los cuadros con contenido de ADN aneuploide son
frecuentes y deben ser tratados como carcinomas. Hay un pequeño porcentaje de
lesiones Ieucoplásicas no displásicas. que se cree presentan un mínimo riesgo de
transformación a carcinoma, si bien el análisis de ploidía reveló un cierto grado de
aneuploidía (Sudbo y col., 2001b).
Nuestro modelo estaría poniendo de manifiesto esta situación y demostrando a la
vez el comportamiento de las lesiones no displásicas.
El dato mas relevante obtenido a partir del análisis de ploidía fue el relativo a las
áreas NUMF luego de 4 meses de cancerización, los cuales revelan un aumento
significativo en el contenido de ADN y del índice de proliferación celular respecto de la
mucosa control. Al analizar las etapas tempranas de la cancenzación, las zonas NUMF
presentaron un índice de proliferación aumentado pero no así el contenido de ADN,
reflejando probablemente la inestabilidad del tejido desafiado por el carcinógeno, pero que
aún no a sufn'do alteraciones suficientes para ser detectadas por el análisis de ploidía. A
los 4 meses, en cambio, este análisis se revela como un marcador de canoen’zaciónde
campo.
Al estudiar la inducción de fibrosis en el conectivo subyacxante al epitelio
transformado, encontramos que esos cuadros eran otra manifestación temprana de un
campo cancerizado.
El conectivo relativamente laxo subyacente a epitelios morfológicamente normales
(áreas NUMF) es tempranamente reemplazado por áreas desmoplásicas densas
aumentadas en volumen, que engrosan la pared de la bolsa. Esta reacción persiste
debajo de los epitelios NUMF hasta las últimas etapas, cuando este epitelio presenta
alteraciones de la ploidía, Pero la fibrosis de la bolsa tomada en su conjunto va
disminuyendo a lo largo del proceso dado que la aparición de hiperplasias, displasias y
tumores se acompaña de la generación de un conectivo laxo, de proliferación
predominantemente endotelial que aleja la fibrosis de la superficie epitelial y al mismo
tiempo provoca su reabsorción.
Esa alteración del tejido conectivo podría ser una manifestación temprana de la
alteración en la interacción epitelio-conjuntivo, inducida por el epitelio cancerizado. O por
el contran'o, podría ser simplemente un intento de respuesta defensiva ante la agresión
del carcinógeno filtrado a través del epitelio. En ese sentido, la fibrosis es una respuesta
Discusión 123
clásica del organismo ante diversas agresiones como se observa en patologías
inflamatorias crónicas como la gingivitis o en órganos viscerales como el apéndice, la
vesícula o la próstata entre otros (Choi y Claman, 1987). También se presentan
respuestas fibrosas asociadas a infecciones en patologías como la filan’asis o la
esquistosomiasis (Choi y Claman, 1987) en todas ellas la hiperplasia conectiva contribuye
a vehiculizar Ia respuesta inmune y detener la infección si bien puede tomarse en un
factor de disfunción. Ya hemos mencionado (sección l-c) ejemplos de cuadros fibrosos
asociados al cáncer pero en ellos la fibrosis se asocia al tumor, en general salvo en el
caso de la cirrosis hepática, la fibrosis no precede al tumor sino que aparece como
componente de su estroma. La otra excepción ya mencionada y estrechamente vinculada
a nuestra temática es la fibrosis de la submucosa bucal. En esa patología el cuadro
fibroso es muy extendido, los fibroblastos han sufrido alteraciones genotóxicas (Tsai y
col., 1999), y se presenta expresión aumentada TGF-a y EGFR. Estas alteraciones se
vinculan a la naturaleza precancerosa de la OSMF (Srinivasan y Jewell, 2001a; Srinivasan
y Jewell, 2001b). Sin embargo, aún hoy no esta claro cual es el rol de Ia fibrosis en esta
carcinogénesis, si bien es aceptado que el infiltrado inflamatorio yuxtaepitelial que se
observa tempranamente y luego cede paso a los cuadros de fibrosis, se debe a una
respuesta defensiva ante la agresión del canoerígeno (Srinivasan y JeweII, 2001b).
Una característica importante en el contexto tisural normal es la generación y
mantenimiento de la polaridad epitelial. Las células epiteliales reciben una gran variedad
de claves orientacionales que las ayudan a establecer sus superficies apical y basal y a
mantener su estado diferenciado. Se ha demostrado que la pérdida de polaridad conduce
al aumento de proliferación y a la turnorigénesis (Bissell y Radisky, 2001; Radisky y co|.,
2001). En nuestro modelo, el epitelio NUMF no posee un contexto normal, dado que el
tejido subyacente está fibrosado, cambiando así la estructura fisica del tejido conectivo y
por Io tanto su relación mecánica con el epitelio.
Esa sobreproducción de fibras colágenas por parte de los fibroblastos además de
ser una manifestación de Ia estimulación de los mismos, es una clave más de la alteración
en la relación epitelio-conectivo. Es por ello que se ha postulado a la conservación de un
contexto normal para el epitelio como mecanismo anticancerígeno innato (Bissell y
Radisky, 2001).
La superficie basal de una célula epitelial esta unida a la membrana basal que le da
soporte estructural y señales de polarización aI epitelio. La membrana basal es una
estructura dinámica. Los cambios en su composición llevan a cambios en la forma y
Discusión 124
comportamiento epitelial (Roskelley y col., 1995; Roskelley y Bissell, 1995) asi como en la
afinidad de unión celular debido a la alteración en la distribución receptores de membrana
(Schwartz y Baron, 1999). En la CBMHlos cuadros de fibrosis estrictamente subepitelial
desaparecen cuando la alteración epitelial es evidente morfológicamente y comienza a
alterarse la membrana basal como paso previo a la microinvasión.
Un aspecto de interés en nuestro trabajo ha sido el de poder relacionar el desarrollo
de la fibrosis con Ia expresión del b-FGF.
El b-FGF ha sido estudiado en diversos tipos tumorales por su potencial rol en la
angiogénesis y en la estimulación autócn'na en el crecimiento tumoral. Su rol se ha
documentado en tumores de cerebro (Morrison y col., 1990; Takahashi y coI., 1992;
Morrison y col., 1993) asi como en otros tipos de tumores sólidos (Luqmani y col., 1992;
Nanus y col., 1993; Yamanaka y col., 1993). Aún hoy no existen datos contundentes
sobre el rol del b-FGF en la iniciación y progresión tumoral de los CCECC (Janot y coI._
1995).
Nuestro análisis inmunohistoquímico reveló que el b-FGF es producido por las
células del estrato basal del epitelio de la mucosa normal de la bolsa del hamster. La
marcación es citoplasmática, en concordancia con Io reportado por Myoken (Myoken y
col., 1994). A las seis semanas de cancen'zación tanto en áreas NUMFcomo PREN esa
expresión ya es anómala, en cuanto a que tanto las células basales como las
suprabasales producen el factor, y cuanto más severa es la lesión epitelial, más células
producen el factor. En las áreas NUMFesa alteración llega a su máxima expresión a las 7
semanas de tratamiento, coincidentemente con la mayor producción de fibrosis. A su vez
las áreas pre-neoplásicas presentan un nivelmuy alto de expresión suprabasal de b-FGF
desde la semana 6 a la 9 para luego disminuir hasta casi el nivel de expresión de las
áreas NUMF.Los carcinomas, que en el modelo no producen fibrosis del estroma, en su
mayoria no expresan el b-FGF y si lo hacen es en zonas diferenciadas del tumor.
Estos datos coinciden en general con los reportados en carcinomas bucales
humanos. Varios trabajos han tratado de relacionar la expresión del factor con el grado de
diferenciación histológico de los carcinomas. Asi por ejemplo Partridge (Partn'dge y col.,
1996) ha reportado la expresión de b-FGF en las células atípicas de CCEB y la presencia
del ARN mensajero del b-FGF en esos mismos tumores. Ese mismo autor al describir la
localización de la marcación inmunohistoquímica remarca que la misma no fue
homogénea, que dentro de los tumores positivos existían zonas negativas y que del total
Discusión 125
de carcinomas analizados solamente el 40% realmente presentaba una expresión
definida. Finalmente concluye que no se puede relacionar la expresión del b-FGF en los
CCEB con parámetros clínico-patológicos incluyendo histología tumoral y velocidad de
crecimiento tumoral.
Sin embargo, Janot (Janot y col., 1995) observó expresión del FGF-2 en CCECC
bien diferenciados mientras que en los carcinomas no diferenciados reportó muy baja o
ninguna expresión del factor .
En cuanto al análisis de las isoformas del FGF-2 en biopsias humanas, se ha
reportado la presencia de las tres isoformasconocidas (18, 22 y 24 kd) en la mucosa
normal y solo la isoforma de 18 kd en los carcinomas (Janot y col., 1995). Esta regulación
en la expresión del FGF-2 a través de la isoforma de 18 kd se revela también en nuestro
modelo con una mayor tendencia a la desaparición de la isoforma de 18 kd en los
carcinomas, mientras que en las primeras etapas de la carcinogénesis se presenta
aumentada con respecto a los controles. Los reportes sobre las isoformas del factor en los
carcinomas bucales humanos son muy escasos y la informaciónrelevante es sobre lineas
celulares, en donde los datos son dispares.
Finalmente algunos autores concluyen que la expresión del b-FGF en los CCEB se
correlaciona con el crecimiento tumoral in vitro (Myoken y col., 1994). Mientras Janot
quien encuentra bajos niveles de expresión de b-FGF en los tumores no tiene evidencia
suficiente para adjudicar un rol concreto al b-FGF, pero tampoco puede negarle un rol
debido a que encuentra expresión de los receptores para FGF en los tumores (Janot y
col., 1995).
Para profundizar en Ia interpretación del rol biológico del b-FGF en el modelo
estudiamos la expresión de sus receptores 2 y 3. En los carcinomas el FGFR-3 se
expresó tanto en el estroma como el parénquima tumoral, mientras que el FGFR-2 Io hizo
en el parénquima de los carcinomas, en algunos de ellos a veces en todo el espesor de
los cordones epiteliales y en otros en la zona basal. En carcinomas bucales humanos se
ha reportado la expresión de los receptor 2 y 3 y se ha estudiado la expresión del FGFR-1
con resultados dispares. Se ha reportado expresión IHQ del FGFR-1 en el parénquima
tumoral (Dellacono y col., 1997), mientras que en otros trabajos no se detecta la expresión
ni del gen ni del mensajero del FGFR-1 en CCEB (Janot y coI., 1995; Partridge y col.,
1996). Los reportes coinciden en cuanto a la expresión del FGFR-2 y 3 para los
carcinomas bucales. Para el receptor 2 algunos autores analizan las distintas variantes
Discusión 126
que se expresan en los tumores, llegando a la conclusión que predomina la variante del
FGFR-2 que une KGF (Janot y col., 1995; Partn'dge y col., 1996), y el balance hacia la
expresión de esa isoforma explicaría la disminución en la marcación de b-FGF en los
carcinomas bucales. Pero esa hipótesis no coincide con los datos de otros autores que
analizaron la variante del receptor 2 especifica para b-FGF. Wakulich reporta expresión
del FGFR-2 en todos los estratos epiteliales de displasias bucales humanas así como en
los carcinomas, datos que coinciden con la expresión del FGF-2. También reporta
expresión del FGFR-3 en esos mismos casos observando una localizaciónde Ia marca en
los estratos epiteliales superiores y en los carcinomas la marca tiende a observarse en las
zonas diferenciadas de los tumores. Por Io tanto concluye que la co-Iocalización del FGF
2 y sus receptores de alta afinidad en tejidos neoplásicos revelan un mecanismo autócrino
que influye en el proceso carcinogénico (Wakulich y col., 2002). Si bien nosotros no
hemos observado una co-localización importante para los FGFR-2 y 3 en los carcinomas
si encontramos aumento en la expresión de los 2 receptores estudiados en el tejido
conectivo durante la carcinogénesis (semana 6 a 10), datos que se correlacionan con la
alteración en la expresión del b-FGF en las etapas tempranas de inducción tumoral.
Nuestros resultados podrían reflejar una acción autócrina del b-FGF con los receptores 2
y 3 en las etapas pre-neoplásicas, mientras que en los carcinomas la presencia de los 2
receptores pero fundamentalmente la del R 3 tanto en estroma como parénquima tumoral
podrían indicar la interacción con algún otro péptido de la familia FGF.
A pesar de las observaciones realizadas en nuestro modelo y los datos reportados
en la literatura a partir de carcinomas humanos, no tenemos evidencia suficiente para
descartar directamente un rol angiogénico del b-FGF, tal como ha sido acabadamente
demostrado en diversos tipos tumorales. Es por ello que hemos analizado Ia expresión del
VEGF como factor angiogénico de mayor especificidad.
Hemos encontrado expresión del VEGF en el epitelio normal de la bolsa del
hámster. Esa expresión aumenta en intensidad con la carcinogénesis. Entre Ia semana 7
y 9 de tratamiento los epitelios que presentan cuadros de fibrosis subyacentes
presentaron una más intensa expresión del VEGFen las capas suprabasales. También el
tejido conectivo presentó un aumento en la cantidad de Ia marca localizado en endotelios
y fibroblastos. Los carcinomas expresan el VEGF en su parénquima y no hemos
encontrado diferencias en el patrón de expresión en relación al grado de diferenciación.
Discusión 127
En general podemos concluir que el VEGF se expresa con muy pocas van'antes en
la bolsa normal y durante todo el proceso de la carcinogénesis, con un aumento en
intensidad en las etapas tempranas que se mantiene hasta constituirse el parénquima
tumoral. No podemos atribuir al VEGF un rol preponderante en la angiogénesis en alguna
etapa en particular, sino que mas bien pareciera ejercer una función continua y
colaborativa con otros péptidos inductores de vasculanzación.
Existe evidencia de que el b-FGF y el VEGF pueden actuar en forma sinérgica en
procesos carcinogénicos. Se ha reportado en carcinomas de pulmón un rol sinérgico de
los dos factores en la angiogénesis y metástasis (Slodkowska y co|., 2000). También se
ha reportado inducción dela expresión del VEGF en respuesta al TGFB1en fibroblastos y
células epiteliales (Pertovaara y col., 1994). No hemos encontrado en la bibliografiadatos
concluyentes sobre actividad de factores inductores de angiogénesis en el modelo CBMH.
Lindgen y col. (Lingen y col., 1997) estudiaron inducción de angiogénesis en líneas
celulares provenientes de mucosa de hámster sometida a tratamiento con DMBA,con
distintos péptidos, entre ellos b-FGF, VEGF, PDGF, TGF-B1. Encontraron que el TGF-B1
es el factor angiogénico más potente para los cultivos celulares y definieron un cambio de
fenotipo no angiogénico a angiogénico a la quinta semana de tratamiento. Esta
interpretación podría corresponderse con nuestras observaciones morfológicas, con
algunas diferencias en los tiempos de canoerización seguramente debidos a diferencias
de respuestas que existen entre los modelos in vitro e in vivo. Tomados en conjunto
nuestros resultados parecen indicar que ni el b-FGF ni el VEGF tendrían un rol
preponderante en el proceso angiogénico general y especialmente en Ia vascularización
de los tumores. Según Lindgen ese rol Io cumpliría el TGF-B1 (Lingen y col., 1997). Si
bien el b-FGF contribuiría a la angiogénesis tendría en este modelo, como ya hemos
comentado, un rol preponderante en la producción de fibrosis, de gran magnitud en las
etapas tempranas. Tanto el factor como los cuadros desmoplásicos disminuyen desde las
etapas intermedias en adelante.
Hemos tratado preliminarrnente de analizar un probable mecanismo para esta
disminución buscando la posibilidad de existencia de actividad proteolítica. En los tiempos
intermedios del proceso, encontramos un aumento distinguible de actividad proteolítica
respecto de la mucosa normal y los carcinomas. La actividad proteolítica observada
corresponde claramente al patrón zimográfico de la MMP-2, y no tan claramente se
observa algo de actividad de la forma latente de la MMP-9. Esa actividad proteolítica
podría estar contribuyendo a la disminución de la relación fibrosa y a mantener las
Discusión 128
características del estroma Iaxo propio de los carcinomas de este modelo. Son datos
realmente preliminaresy habría que constatar la actividad de esas metaloproteasas.
En relación a ello, se reportado aumento de la expresión del b-FGF y el FGF-7 en
células NIH-3T3en las cuales provoca expresión alterada de las metaloproteasas de
matriz, MMP-2 y MMP-9 (Lo y Hurta, 2002). También se ha visto que la colagenasa 3
(MMP-13) es regulada por el b-FGF en los condrosarcomas (Uria y col., 1998). Y se ha
reportado Ia regulación de la producción de MMPs a través del FGF-2 y 9 en gliomas
humanos (Miyagi y coI., 1998).
Con respecto a las proteasas y su rol en la carcinogénesis la bibliografiaes extensa
(Coussens y Werb, 1996; Coussens y Werb, 2002). Así la sobre-expresión de
estromelisina-1 en glándula mamaria de ratón lleva a la formación de lesiones
preneoplásicas y tumores (Sympson y col., 1995). En animales que no expresan la
estromelisina -3 (ratones knock-out para esa MMP)se encontró aumentada la incidencia
de tumores luego de someterlos a carcinogénesis química (Masson y col., 1998).
Se ha reportado producción de MMP-2 y 9 por los mastocitos (Coussens y col.,
1999; Coussens y Werb, 2002) y se sabe también que en Ia bolsa del hamster
cancen'zada existe gran movilizaciónde mastocitos en la carcinogénesis temprana (Flynny col., 1991). Iamaroon y col. trabajando sobre carcinomas bucales humanos han
reportado movilización de mastocitos y han relacionado su actividad a la angiogénesis
(Iamaroon y coI., 2003). Ranien’ demuestra que no hay relación entre el infiltrado de
mastocitos y las evidencias de angiogénesis (Ranieri y col., 2002). Parecería que la
movilización de ese tipo celular esta indicando su participación en la regulación del
proceso carcinogénico de una manera aún no bien conocida.
Los mastocitos producen una gran cantidad de mediadores de la inflamación que
incluyendesde heparina, heparanasa, rnetaloy serin-proteasas hasta diversos factores de
crecimiento polipeptídicos que incluyen al b-FGF y el VEGF (Coussens y col., 1999).
También proveen mitógenos para los fibroblastos, células endoteliales y epiteliales, así
como actividad enzimática involucrada en el remodelado dela matriz extracelular, además
de su conocido rol en las alergias, el aumento de mastocitos se asocia a respuestas
fibrosas, en muchas enfermedades inflamatorias crónicas (Choi y co|., 1987; Choi y
Claman, 1987), tales como la fibrosis pulmonar, la aterosclerosis y los procesos
carcinogénicos (Choi y Claman, 1987).
Hemos mencionada Ia existencia de un infiltrado celular con predominancia de
mastocitos y eosinófilos durante las etapas tempranas de la carcinogénesis en la bolsa
Discusión 129
del hámster. Se ha demostrado que los eosinófilos producen TGF-d (Elovicy col., 1990),
pero, en el caso de los mastocitos, ninguna de sus múltiples citoquinas se ha podido
vincular directamente con el proceso de malignización en la cavidad bucal. En algunos
modelos se ha asociado a los mastocitos con un posible rol en la angiogénesis debido a
su infiltraciónen zonas de neo-vasculan'zación, conjuntamente a la expresión de VEGF
(Aoki y col., 2003).
Aún siendo preliminares en algunos aspecto, nuestros datos son los primeros en
abordar un conjunto de interacciones epitelio-conectivo en el modelo CBMH. Dada Ia
comprobada eficacia del modelo en la reproducción de los cuadros de cancerización de la
boca humana, parece de interés continuar estos estudios. Seria importante por ejemplo
constatar la actividad de Ia MMP-2,en cada uno de los tiempos experimentales, confirmar
in vivo, la existencia de la expresión de TGF-[31y correlacionarla morfobgicamente con
los distintos cuadros de neo-angiogénesis y caracterizar la infiltración de células
productoras de citoquinas relacionadas con el proceso. Sería también de interés evaluar
la cronodinamia y la magnitud de la angiogénesis, hecho cuyo estudio ¡n vivo requeriría la
elaboración de anticuerpos utilizables en la marcación de endotelios en el hámster, que
actualmente no se disponen.
CONCLUSIONES
- El modelo de cancerización química de la bolsa de la mejilla del hámster (CBMH)
reproduce eficazmente Ia secuencia de lesiones pre-malignas y malignas de la boca
humana, no solamente en cuanto a las alteraciones epiteliales, ya bien descriptas en la
literatura, sino también en cuanto a cambios en el conectivo, especialmente Ia inducción
de fibrosis y angiogénesis como cuadros característicos de la pre-malignidad.
Las lesiones avanzan en malignidad histológica a medida que se prolonga el tiempo
de cancerización, pero en todas las etapas del proceso, aun después de la aparición de
los carcinomas, las lesiones pre-malignas coexisten con áreas de epitelio de aspecto
histológico normal, configurando los cuadros propios de la “cancerización de campo" de Ia
mucosa bucal humana. Estas áreas (NUMF: “no unusual microscopic features")
constituyen un buen modelo para el estudio de las alteraciones tempranas de la relación
epitelio-conectivo y para la búsqueda de marcadores de campo cancerizado, de
aplicación diagnóstica.
Discusión 130
-La evaluación de la ploidía por análisis de imágenes, si se realizan determinados
ajustes metodológicos, además de su uso habitual en el diagnóstico de malignidad,
permite evaluar lesiones epiteliales en áreas pequeñas de cortes histológicos. Con esta
metodología se pudieron caracterizar numéricarnente las distintas lesiones epiteliales del
modelo. Especialmente, se pudieron detectar alteraciones de los valores de ploidíaen las
áreas NUMF, como evidencia de cancerización de campo antes de la aparición de
cambios morfológicos.
- La fibrosis se desarrolla muy tempranamente con localización subepitelial En
estrecha relación con el aumento de la gravedad de las lesiones, la fibrosis es luego
desplazada hacia la profundidad por la proliferación angioblástica, y posteriormente
reabsorbida. En las etapas finales, el estroma de los tumores es un tejido Iaxo, muy
vasculan'zado y la fibrosis persiste solamente debajo de los epitelios NUMFo con lesiones
pre-malignas leves.
- El b-FGF aumenta su expresión en el epitelio desde las etapas iniciales y luego
disminuye hasta casi desaparecer en los parénquimas tumorales. La isoformaque deja de
expresarse es Ia de 18 kd. Estas variaciones del b-FGF coinciden con la evolución de la
fibrosis subepitelial.
Los receptores FGFR 2 y 3 se expresan en el epitelio y en fibroblastos y endotelios.
Este patrón es constante desde el iniciode la carcinogénesis y algo más irregular en los
parénquimas tumorales.
A diferencia de lo demostrado en otros tipos de neoplasias experimentales y
humanas, en las cuales el FGF-2 tiene actividad principalmente angiogénica, en el modelo
CBMH este factor tendría un rol autócrino-parácn'no en la desregulación de las
interacciones epitelio-conectivo con preponderancia en el desarrollo dela fibrosis a través
de la isoforma de 18 kd, y en menor grado en Ia angiogénesis tumoral.
- El VEGF también aumenta su actividad en el epitelio al iniciarse el proceso
carcinogénico. Se expresa además en los endotelios vasculares y en áreas de fibrosis.
Este aumento es sostenido y de comportamiento homogéneo, sin que existan cambios
ostensibles de actividad en relación a las diferentes lesiones pre-malignas y tumorales. El
VEGF, lo mismo que el b-FGF estarían involucrados solo parcialmente en la angiogénesis
Discusión 131
de este modelo y actuarían en colaboración con otros péptidos inductores devasculan’zación.
- Se observó actividad proteolítica con un patrón correspondiente con el de la MMP
2 y MMP-9. La etapa de mayor actividad parecería corresponder a tiempos
experimentales que se solapan con los de máxima expresión de la fibrosis y luego Ia
disminución paulatina de la actividad proteolítica parece disminuir con la disminución de
las áreas de fibrosis.
- Los datos arn'ba resumidos indican que durante el proceso de carcinogénesis de la
mucosa bucal, se producen importantes modificaciones en las interacciones normales del
epitelio y el conectivo subyacente. Profundizar su conocimiento contribuye a un mejor
entendimiento del proceso y podría tener implicancias en la búsqueda de instrumentos de
ayuda en el diagnóstico y la prevención. Así por ejemplo, si se lograra la transferencia a la
clínica de los datos encontrados en el presente trabajo, Ia detección precoz de un campo
cancen'zado sin modificaciones morfológicas,en situaciones de riesgo, podría basarse en
la conjunción de un epitelio con ploidía alterada, fibrosis subyacente y expresión
aumentada de b-FGF. El análisis de esta posibilidad cobra mayor interés si se considera
que estas detecciones pueden realizarse sobre el mismo material biópsico utilizado para
diagnostico histopatológico de rutina.,fiTesista: Lic. Ana R. Raimondi
QDirector: Dra. . E. ltoiz
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