rekayasa genetik

5/16/2018 rekayasa genetik - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/rekayasa-genetik-55ab4f58f23e9 1/25

DNA recombinant

technology



Serangkaian prosedur utk

menggabungkan fragmen DNA.Pada kondisi tertentu molekul DNArekombinan dpt masuk dlm sel dan

mengalami replikasi.

Definisi teknologi DNA

rekombinan



Dalam rangka karakterisasi gen atau studi fungsi biologi dari suatu protein , perlu dilakukan isolasi dan

amplifika si gen. Teknologi DNA rekombinan adalah

metode isolasi dan amplifikasi gen

Objective

Tujuan utama teknologi rDNA adalah utk

membuat DNA / gen dan atau protein nya dlm

jumlah banyak.Proteins (Ex: Insulin)



Prinsip dasar teknologi DNA

rekombinan

DNA dimasukan kedalam molekul

DNA lain, yg disebut vektor. Vektorrekombinan selanjutnya dimasukankedalam sel host, lalu mengalamireplikasi shg dihasilkan gen



Tahapan teknologi DNA Recombinan

Komponen

Garis besar:

Analisis hasil

. Perbandingan PCR dan teknologi DNA rekombinan

Pemilihan penanda

Pemecahan masalah dari teknologi DNA rekombinan



Teknologi DNA Rekombinan: Kloning DNA

Vektor – Plasmid atau virus. Harusmemilikki:

Gen Antibiotic Resistance &

Gen Lac Z untuk seleksi warna

DNA atau Gene untuk Klon

Restriction Enzyme

DNA Ligase

Antibiotics

Pewarna X-gal yang tidak berwarna

sebuah host, biasanya bacteria

KOMPONEN:

Plasmid Vector dengan

AmpR -

(Ampicillin Resistance

gene)



Meliputi 5 langkah:

Perlakuan dengan enzim restriksi

Ligasi

Transformasi Host

Pertumbuhan Transforman

Teknologi DNA Rekombinan: Kloning DNA

Seleksi recombinan



Tahapan dalam Teknologi DNA Recombinan

Perlakuan dengan Enzim Restriksi

Perlakukan DNA yang akan di Klon & Vektor Enzyme restriksi

yang SAMA. Ex: EcoRI, untuk menghasilkan ujung lancip yang

bersifat komplementer sehingga basa dapat berpasangan



List of Possible Restriction Enzymes



Ligasi


DNA Ligase menyambung ujung DNA klon & DNA vektor

DNA sekarang dimasukan ke dalam DNA Vektor =>

Recombinant DNA

Ligasi ujung lancip vector

dan DNA insert

Recombinant

Plasmid DNA

DNA insert

Vector

AmpR

LacZ gene





b. Beberapa vector mengalami re-ligasi tanpa insert.

a. Beberapa vector berligasi dengan insert.

c. Vektor dan inserts tidak mengalami ligasi


Hasil Ligasi:



Transformation of Host


DNA Recombinandan semua produk

ligasi dicampur dengan larutan host.

Bahan kimia digunakan untuk

mengaktifkan serapan oleh host

Host dengan vector atau DNA

rekombinan dinamakanTransformant

(transformed host)

Host sekarang menjadi antibiotic resistant

Transformandapat mereplikasi DNA

insert





Hasil transformasi:


Beberapa host tidak menyerap apa-

apa

Beberapa host menyerap vector saja

Beberapa menyerap DNA rekombinan



a. Vectors ligated to the insert.

b. Vectors ligated without insert.

d. Vectors ligated to 2 copies of insert

A

B

C

Bacterial Genome

A. = Host transformed by “a”.

B. = Host transformed by “b”.

C. = Host not transformed.

D. = Host transformed by “a” with 2

inserts.

Manakah yang akan tumbuh dalam media agar di atas? Mengapa? Which ones

Mana yang akan membentuk koloni biru? Mana yang membentuk koloni

putih?

Agar Plate with Ampicillin+X-Gal

D

= Insert

= PlasmidHasil transformasi





Pertumbuhan Transforman

Transformants dan produk lainnyaditumbuhkan dalam cawan yang berisi:

nutrients

Antibiotic

a colorless dye called X-gal (5-bro mo-4-kloro-indolil-β-galaktopiranosida)

LacZ merubah X-gal menjadi berwarna

biru.

Transformants yang mengandung DNAplasmid atau DNA plasmid

recombinant akan membentuk KOLONI (benjolan) pada cawan

Transformants yang mengandung vektor virus atau DNA virus

rekombinan membentuk PLAQUES (penyok)

Recombinant l virions

form plaques

Agar Plate with Ampicillin + X-Gal



X-gal dalam cawan nutrisi memungkinan

seleksi keberhasilan ligasi DNA insert :

Inactivation of LacZ gene

Warna putih (tidak ada warna biru)

Ampicillin dalam nutrien memungkinkan

seleksi keberhasilan transformasi


Selection for Recombinant



WHY both blue and white (clear) colonies?

Koloni berwarna apakah yang diinginkan?

Jika anda lupa menambahkan antibiotics pada plate,

Hasil apa yang anda harapkan?

Agar dish after rec DNA Technology

shows both blue and white (clear) colonies.

Selection for Recombinant

Analysis of Recombinant DNA Technology Results



2. Penemuan enzim restriksi menjadi sangat penting dalam

teknologi DNA rekombinan

Baik vector & DNA insert harus diperlakukan dengan enzim

restriksi yang sama

3. Keberhasilan ligasi (recombinasi) DNA vektor dan DNA insert

akan menonaktifkan enzim lacZ => Koloni berwarna putih

1. Teknologi DNA rekombinan dapat menghasilkan sejumlah

besar DNA dan protein

4. Transformasi yang berhasil (mengandung vector saja atau

recombinant DNA) membuat hosts antibiotic resistant

SUMMARY



Aplikasi Teknologi DNARekombinan

Produksi skala besar protein manusiamelalui rekayasa genetika bacteria.

Seperti: insulin, hormonpertumbuhan, Interferons and faktor

pembekuan darah(VIII & IX)



Production of Human Insulin1) Isolasi / mendapatkan gen insulin manusia

Gen insulin manusia dapat diperoleh dengan

membuat kopi DNA komplementer (cDNA)messenger RNA (mRNA) untuk insulin manusia.



2)Memasukan gen insulin manusia kedalam plasmid vector

Plasmid bakteri dan cDNA dicampur. Gen insulinmanusia (cDNA) dimasukan ke dalam plasmid melaluiperpasangan basa komplementer pada ujung lancip.



3)Memasukan DNA plasmidrekombinan ke dalam bacteria

Bakteri E.coli digunakan sebagai host cell. E.coli d an plasmid rekombinan dicampurbersama dalam tabung reaksi.



4)Seleksi bacteria yang telahmengambil bagian yang benar DNA

Bakteri ditumbuhkan dalam nutrient agar. Agar

juga mengandung zat seperti antibiotic yanghanya memungkinkan pertumbuhan bakteritransforman

Documents

rekayasa genetik