View
19
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
Citation preview
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
1/221
Departamento de Bioqumica y Biologa
Molecular
Unidad de Bioqumica, Facultad de Medicina
Regulacin de la plasticidad
astrocitaria por ibuprofeno y
FGF2
Mathieu Lichtenstein
TESIS DOCTORAL
Belleterra Junio 2011
http://inc.uab.cat/http://inc.uab.cat/5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
2/221
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
3/221
Departamento de Bioqumica y Biologa
Molecular
Unidad de Bioqumica, Facultad de Medicina
Memoria de tesis doctoral presentada por Mathieu Lichtenstein para
optar al ttulo de doctor por la Universidad Autnoma de Barcelona.
Trabajo realizado en la Unidad de Bioqumica de la Facultad de
Medicina, del Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular
bajo la direccin de la Dra Elena Galea Rodrguez de Velasco.
Proyecto subvencionado por la Fundaci Marat de TV3 y Ministerio
de Ciencia e Innovacin
Bellaterra, 9 de Mayo de 2011
Doctorando Director de Tesis
Mathieu Lichtenstein Elena Galea
http://inc.uab.cat/http://inc.uab.cat/5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
4/221
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
5/221
A mi madre, mis hermanos,
a Paco,
mis abuelos Marie et Robert, Jacqueline et Paul
y a todo el resto de la famila.
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
6/221
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
7/221
NDICE
I. ndice......................................................................1
II. Abreviaturas ............................................................5
III. Resumen..................................................................7
IV. Introduccin ..........................................................11
1. Los astrocitos son un tipo celular altamente plstico ypolivalente1.1... Morfologa y tipos de astroci tos .........................................12
1.2 Fisiologa astrocitaria..........................................................13
Soporte neuronal
Gliotransmisin y participacin a
la sinapsis tripartita
Regulacin de los niveles sinpticos
de glutamatoAcoplamiento neurovascular
2. Participacin de los astrocitos en la neuroinflamacin2.1 Conceptos generales sobre la
inflamacin cerebral .............................................................19
2.2 Privilegio inmune del SNC......................................................19
2.3 La clulas gliales participan enla inmunidad innata del SNC ..............................................20
2.4 Los astrocitos en la inmunidad innata ..................................22
MCP1
ICAM1
COX2
2.5 Migracin astrocitaria.........................................................29
2.6... Rho-GTPasas .......................................................................31
1
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
8/221
NDICE
3. FGF2 en la plasticidad astrocitaria3.1 Recpetores de FGF..................................................................34
3.2 Funciones generales de los FGF ...........................................36
3.3 FGF2 .........................................................................................38Descubr imiento y primeros trabajos
Estructura del FGF2
Secrecin del FGF2
3.4 FGF2 en el SNC........................................................................41
Control de la expresin de FGF2
Funciones de FGF2 en el SNC
3.5 Papel del FGF2 en la inflamacin cerebral ...........................48
4. Efecto protector de los antiinflamatorios no esteroideos sobre la
aparicin de la enfermedad de Alzheimer.
4.1 Etiologia y patologa de la enfermedad
de Alzheimer ...........................................................................50
4.2 Fases de la enfermedad de Alzheimer ..................................54
4.3 Tratamientos ............................................................................54
4.4 Efecto protector de los AINES sobre la AD
V. Objetivos...................................................................59
VI. Materiales y mtodos ...............................................61
1. Material biolgico
1.1 Cultivos primarios de astrocitos
1.2 Tratamiento farmacolgico de las clulas en cult ivo
1.3 Infecciones virales
2. Mtodos bioqumicos
2.1 PCR en tiempo real
2.2 Fraccionamiento subcelular
2
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
9/221
NDICE
2.3 Western Blot
2.4 EMSA
2.5 ELISA para la deteccin de ICAM
2.6 ELISA para la deteccin de MCP2.7 G-LISA
3. Mtodos de biologa celular
3.1 Inmunofluorescencia
3.2 Ensayos de migracin
4. Mtodos estadsticos
VII. Resultados..............................................................71
1. Captulo 1: JNK/ERK/FAK mediate pro-migratory actions ofbasic fibroblast growth factor in astrocytes via MCP1 andCOX2 ............................................................................72
2. Captulo 2: Secretase-independent and RhoGTPase/PAK/ERK-dependent regulation of cytoskeleton dynamics inastrocytes by NSAIDs and derivatives. ...............................110
VIII. Discusin
1. Inflamacin cerebral como diana teraputica en enfermedadesneurodegenerativa........................................................141
2. Nuevo papel de las cascadas de quinasas en la sealizacininflamatoria...................................................................144
2.1 Sealizacin inflamtoria por FGF2
2.2 Regulacin de las kinasas PAK y ERK por los profenos
3. Nuevo papel de las RhoGTPasas en la sealizacininflamatoria...................................................................153
3.1 Dianas de los AINES en astrocitos
3.2 Nuevo papel de las RhoGTPasas en la sealizacin inflamatoria
3
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20930267http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/209302675/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
10/221
NDICE
4. Nuevo papel de la migracin en la respuestaInflamatoria...................................................................156
4.1 FGF2 promueve la migracin astrocitaria
4.2 Los profenos en la migracin astrocitaria
5. Conclusiones y valor teraputico ................................1655.1 FGF2
5.2 AINES
IX.Conclusiones .............................................................168
X. Otras publicaciones...................................................171
1. Staging anti-inflammatory therapy in Alzheimer's disease.
XI.Bibliografa .................................................................178
4
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21152343http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/211523435/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
11/221
ABREVIATURAS
AD Alzheimers disease
AINEs Anti-inflamatorios no esteroideos
APP Amyloid precursor protein
ATP Adenosina trifosfato
A Pptido -amiloide
BHE Barrera hemato-enceflica
cAMP AMP cclico
COX Ciclooxigenasa
CREB cAMP-response element binding
CSPG Chondroitin-sulfate proteoglycan
EAATs Excitatory aminoacid transporters
ELISA Enzyme-linked inmunoassay
ERK Extracelular response kinase
FAK Focal adhesion kinase
FGF Fibroblast growth factor
FGFR Fibroblast growth factor receptor
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate
GLAST Glutamate/Aspartate transporter
GPCR G-coupled protein receptor
GTP Guanidina trifosfato
HSPG Heparan-sulfate proteoglycan
ICAM Intercelular adhesion molecule
IFN Interfern
IL Interleuquina
IP3 Inositol trifosfato
JNK c-Jun N-terminal kinase
5
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
12/221
ABREVIATURAS
LPA cido lipofosfatdico
LPS Lipopolisacrido
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MCP Monocyte chemoatractant protein
MS Multiple sclerosis
NF-kB Nuclear factor kB
PAK p21-activated kinase
PCR Polymerase chain reaction
PD Parkinsons disease
ROCK Rho kinase
SNC Sistema nervioso central
TNF Tumor necrosis factor
VCAM Vascular adhesion molecule
WB Western Blot
6
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
13/221
Resumem
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
14/221
RESUMEN
OBJETIVO GENERAL: Los astrocitos, el tipo celular ms abundante en el sistema
nervioso central (SNC) desempean un papel clave en la homeostasis, la
neurotransmisin y, como tema central en esta tesis, en la neuroinflamacin, es decir,
el conjunto de reacciones del cerebro al trauma, las infecciones virales o bacterianas,
o la neurodegeneracin. El astrocito es extremadamente plstico, respondiendo a un
amplio repertorio de estmulos fisiolgicos o insultos patolgicos con cambios
morfolgicos, migracin, o cambios funcionales por modificacin de su expresin
gnica. El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la plasticidad astrocitaria en dos
paradigmas distintos relacionados con la neuroinflamacin. En el primer bloque hemos
estudiado el efecto de un factor trfico de especial importancia en el SNC, el Factor
Bsico de Fibroblastos, o FGF2, en la expresin de genes inflamatorios astrocitarios.
El FGF2 es un factor de crecimiento cuya expresin en el SNC adulto es muy alta,
localizada principalmente en astrocitos, y que se regula a la alza en condiciones
patolgicas como el Alzheimer- alrededor de la placas de amiloide- o el ictus. As
como las propiedades trficas del FGF2, y su papel en el desarrollo del cerebro, son
ampliamente conocidos, su papel en la respuesta inflamatoria est pobremente
caracterizado. En el segundo bloque hemos analizado la capacidad de frmacos anti-
inflamatorios no esteroideos (AINES) como el ibuprofeno y derivados (R-flurbiprofeno y
CHF5074) los cuales, segn estudios epidemiolgicos, reducen la aparicin de la
enfermedad de Alzheimer, de modular la dinmica del citoesqueleto de actina
astrocitario.METODOS/MODELOS: Modelo de inflamacin (LPS o scratch-wound en cultivos
primarios de astrocitos. Estudio expresion molculas: RTPCR, Western Blot,
inmunocitoqumica, ELISAS, GLISAS. Manipulacin mecanstica: inhibidores
farmacolgicos, sobreexpresin de protenas mutantes dominantes negativos o
constitutivamente activos.
RESULTADOS: En los cultivos primarios mostramos que FGF2 modula de una
manera bifsica la respuesta inflamatoria inducida por LPS aumentando en estados
iniciales la expresin de genes inflamatorios como el de la quimocina MCP1, mientras
que potencia su regulacin a la baja e inhibe la expresin de ICAM1 en estados ms
avanzados. Esta regulacin es dependiente de las vas de sealizacin de ERK, JNK
y FAK a travs de la activacin del receptor FGFR2 pero independiente del factor de
trasncripcin NF-kB. Mostramos tambin que el tratamiento de astrocitos con
ibuprofeno y derivados produce un rpido cambio morfolgico caracterizado por una
retraccin del soma y emisin de procesos dependiente de la modulacin de las
8
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
15/221
RESUMEN
protenas Rho-GTPasas RhoA, Rac1 y cdc42 e independiente de las diana clsica de
los antiinflamatorios las ciclooxigenasas (COX2). Este fenotipo resulta en una
capacidad migratoria acelerada en el caso del ibuprofeno o inhibida en el caso del R-
Flurbiprofeno y CHF5074.
CONCLUSIONES: Los resultados expuestos en esta tesis demuestran el papel
inmunomodulador del FGF2 en la respuesta inflamatoria astrocitaria. Especulamos
que el carcter bifsico de la respuesta permite los efectos beneficiosos de la
inflamacin pero evitando su cronificacin. Adems mostramos que los profenos son
capaces de promover la aparicin de fenmenos plsticos en astrocitos a travs de la
modulacin de nuevas dianas como las Rho-GTPasas, abriendo nuevas perspectivas
en la terapia de enfermedades neurodegenerativas en las que los astrocitos estn
implicados.
9
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
16/221
RESUMEN
10
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
17/221
Introduccin
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
18/221
INTRODUCCIN
1. Los astrocitos son un tipo celular altamente plstico y
polivalente.
1.1 Morfologa ytipos de astrocitos
Los astrocitos, representan un 90% del total de clulas del SNC (Sistema Nervioso
Central) y son una poblacin diversa, siendo su presencia ms abundante en reas
cerebrales determinadas como el hipocampo o el cerebelo (Norenberg, 1979). In vivo,
presentan una morfologa estrellada, extendiendo desde el soma numerosos procesos
que rodean a las neuronas vecinas y contactan con los microvasos cerebrales
(Nedergaard et al., 2003). Estos procesos, altamente ramificados, se caracterizan por
la presencia de la protena glial acdica fibrilar (GFAP) que se utiliza muy a menudo
como marcador de astrocitos. Poseen una morfologa altamente compleja y
heterognea, y cada uno de ellos ocupa compartimentos o territorios bien definidos
que apenas solapan con el de los astrocitos vecinos (Bushong et al., 2002;Wang and
Bordey, 2008), con los que est conectado a travs de canales tipo gap junction
formando un sincitio funcional (Konietzko and Muller, 1994). Las gap junctions,
formadas por protenas de la familia de las conexinas, son permeables a molculas
cargadas y permiten el flujo de sustratos energticos desde los vasos hasta las
neuronas que se hallan en el territorio de un astrocito (Simard et al., 2003)
Histricamente se ha dividido a los astrocitos en dos grupos atendiendo a su
morfologa y ubicacin. As, los astrocitos protoplasmticos, localizados en la materia
gris cerebral, presentan muchos procesos ramificados que contactan sinapsis y vasos
cerebrales (Frederickson and Silver, 1991), mientras que los astrocitos fibrosos se
localizan en la materia blanca y poseen menos procesos, ms largos y sin ramificar,
que contactan con los ndulos de Ranvier (Wang and Bordey, 2008). Esta clasificacin
puede considerarse actualmente simplista ya que dos astrocitos adyacentes y de
morfologa comparable pueden tener perfiles de expresin muy diferentes. Estudios deexpresin por microarrays demuestran que en realidad hay pocos genes que se
expresen especficamente en todos los astrocitos, y que se producen patrones de
expresin dependientes de la localizacin celular (Bachoo et al., 2004).
A grandes rasgos, los astrocitos presentan un soma relativamente pequeo de 7-9 m
desde donde extienden entre cinco a ocho procesos principales que se ramifican
uniformemente en pequeos apndices distribuidos uniformemente que se infiltran en
la intrincada red neuronal incluyendo terminales sinpticos, dendritas y espinasdendrticas en un volumen que puede llegar a ocupar 66000 m3. Esta morfologa les
12
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
19/221
INTRODUCCIN
permite interaccionar con la mayora de tipos celulares del SNC. En este sentido, se
considera que el 99% de la microvasculatura cerebral est cubierta por pies
astrocitarios (Kacem et al., 1998) y que en el dominio de un solo astrocito en corteza o
hipocampo de un roedor se pueden localizar hasta 105sinapsis (Bushong et al., 2002),
Alaza et al 2007), un valor que en humanos resulta superior, hasta el punto que se ha
propuesto que una caracterstica del cerebro humanos en relacin al de otros
mamferos, es su complejidad astrocitaria (Oberheim et al., 2009).
Se puede considerar a los astrocitos como unidades de integracin local de la
informacin sinptica y no-sinptica de la microregin que cubre cada uno de ellos. La
membrana plasmtica de los astrocitos contiene microdominios especficos que origina
seales intracelulares que pueden propagarse en estos dominios sin afectar la
totalidad de la clula, permitiendo el control por fracciones de territorio dominados por
un astrocito de manera independiente (Wang and Bordey, 2008).
Es importante destacar que todas estas observaciones sobre la morfologa astrocitaria
realizadas in vivo, no se reproducen en cultivos puros de astrocitos in vitro. En efecto,
la mayora de protocolos para conseguir este tipo celular en cultivo da como resultado
monocapas confluentes de astrocitos de morfologa epitelioide (plana y poligonal) que
no reproducen su morfologa original in vivo (McCarthy and de, 1980;Won and Oh,
2000). sta se consigue al tratar las clulas con diferentes factores como el cAMP
(Won and Oh, 2000) algunos neurotransmisores como la noradrenalina (Shao et al.,
1994) o el ATP (Neary et al., 1994) y con factores de crecimiento como el EGF o el
FGF2 (Heffron and Mandell, 2005). Tambin la presencia de neuronas en co-cultivos
de neuronas-astrocitos, genera en estos ltimos una morfologa estrellada. Estas
observaciones denotan que probablemente la compleja morfologa estrellada de los
astrocitos in vivo, depende de numerosos factores, entre ellos el entorno en el que se
encuentren.
1.2 Fisiologa astrocitaria
1.2.1 Soporte neuronal
Se han descrito numerosas funciones esenciales para los astrocitos, especialmente
aquellas relacionadas con el correcto funcionamiento de las neuronas y de la
transmisin neuronal. Ambos tipos celulares comparten varias funciones sobre todo
en el terreno metablico, aunque los astrocitos estn a menudo mejor posicionados
que las neuronas, poseen mecanismos ms eficientes y disponen de reservas
13
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
20/221
INTRODUCCIN
energticas mayores para realizarlas (Fuller et al., 2009). Entre estas funciones de
soporte estructural y metablico las ms importantes son:
- Soporte metablico a neuronas, captando glucosa desde los microvasos y
transformndola a lactato mediante la gliclisis, que al ser liberado al medio
extracelular constituye el principal sustrato energtico para las neuronas
(Tekkok et al., 2005;Pellerin, 2005). Adems los astrocitos son las nicas
clulas del SNC capaces de almacenar reservas de glucosa en forma de
glucgeno, las cuales pueden movilizarse en respuesta a algunos
neurotransmisores (Brunet et al., 2010;Gavillet et al., 2008)
- Regulacin de la concentracin extracelular de iones. La actividad
neuronal, es decir, la generacin de impulsos nerviosos entre neuronas, genera
en el espacio extracelular un gran aumento en las concentraciones de K+y de
protones (resultado del metabolismo del piruvato por parte de las neuronas). La
acumulacin de estos productos, en altas concentraciones, dificultan el
correcto funcionamiento de la actividad neuronal. Los astrocitos disponen de
canales que permiten recaptar especficamente estos iones, y trasladarlos a
zonas donde su concentracin es menor, o directamente al torrente sanguneo
(revisado en Simard and Nedergaard, 2004)
- Sntesis y liberacin de glutatin. El glutatin es un tripptido que en el SNC
es principalmente sintetizado por los astrocitos, y tiene varias funciones
esenciales como antioxidante frente a las especies reactivas de oxgeno, pero
tambin como cofactor en procesos de sntesis de protenas y cidos
nucleicos. Los astrocitos liberan el dipptido CysGly, precursor del glutatin,
que puede ser recaptado por las neuronas (revisado en Dringen and Hirrlinger,
2003).
1.2.2 Gliotransmisin y participacin a la sinapsis t ripartita
El hecho de que no sean clulas excitables elctricamente llev a la conclusin
incorrecta de que los astrocitos eran elementos pasivos en la neurotransmisin. Los
astrocitos expresan en sus membranas receptores acoplados a protena G, (GPCRs)
que les permiten responder a neurotransmisores. Este descubrimiento, all en los 70
(McCarthy and de, 1978;van et al., 1978) puso de manifiesto que poda responder aestmulos extracelulares que se pensaba que eran dirigidos exclusivamente a las
14
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
21/221
INTRODUCCIN
neuronas. A travs de la estimulacin de estos receptores se desencadenan vas de
sealizacin, entre ellas la de calcio y el cAMP, que permiten a los astrocitos
comunicarse entre ellos y con otras clulas vecinas. Hasta entonces la visin
predominante era que los astrocitos eran clulas elctricamente silentes y por lo tanto
no participaban en la neurotransmisin. El descubrimiento de que los astrocitos
respondan a estmulos extracelulares mediante fluctuaciones de Ca2+ puso de
maifiesto que se trataba de clulas excitables, aunque esta excitabilidad no dependa
de potenciales de accin y que existe un sistema de comunicacin neurona-astocito
que permite ligar la actividad neuronal con las ondas de Ca2+ astrocitarias (Agulhon et
al., 2008). Actualmente se sabe que astrocitos expresan una batera de receptores
para la mayora de sustancia neuroactivas incluyendo neurotransmisores,
neuropptidos, factores de crecimiento y citoquinas, que les permiten responder a
estmulos a los que tambin responden las neuronas.
La va molecular ms estudiada en la elevacin del calcio citoslocio es la de la
PLC/IP3. Tras la activacin de los GPCRs, la formacin del segundo mensajero IP3, y
su subsiguiente unin a receptores IP3R, permite la liberacin de Ca2+ del retculo
endoplasmtico (aunque existen otros almacenes de calcio intracelular). Las
oscilaciones de calcio pueden ser muy variables, segn su amplitud, duracin y
frecuencia. Segn estos parmetros afectarn nicamente un microdominio del
astrocito, o se propagarn por toda la clula afectando incluso las clulas vecinas. As,
los astrocitos son clulas capaces de discriminar estmulos de diversos orgenes e
integrar seales concomitantes (Fiacco et al., 2009;Petravicz et al., 2008). Se han
descrito tambin oscilaciones de Ca2+ espontneas, es decir independientes de
seales neuronales. Estas oscilaciones se observan in vivo y podran depender de
canales de calcio dependientes de voltaje (Parri and Crunelli, 2003).
Diversos estudios han puesto de manifiesto que las seales de Ca2+
puedenpropagarse de un astrocito a otro recorriendo distancias relativamente largas. Esto
descubrimientos in vitro, por estimulacin elctrica, mecnica o qumica, han dado a
pensar que puede existir una red de comunicacin entre astrocitos (Sul et al., 2004).
No obstante no queda claro si este fenmeno se reproduce en condiciones
fisiolgicas. Estudios in vivomuestran que en respuesta a estmulos fisiolgicos no se
generan ondas de Ca2+que viajen de una zona a otra. Ms bien se observa que cada
uno de los astrocitos estimulados responde de manera ms bien independiente
(Schummers et al., 2008). Existen dos modelos que podran explicar cmo las sealesde calcio se propagan de una clula a otra. Intracelularmente el IP3 generado en
15
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
22/221
INTRODUCCIN
respuesta a una seal extracelular puede difundir a travs de las gap-junctions que
unen a los astrocitos entre ellos (Newman, 2001) Extracelularmente, la elevacin del
calcio intracelular puede promover la liberacin de factores como el ATP, que a su vez
podran excitar a las clulas vecinas (Innocenti et al., 2000).
La sealizacin por Ca2+ en algunos casos promueve la rpida liberacin de los
denominados gliotransmisores, molculas provenientes del astrocito que son activas in
situsobre neuronas pre- y post-sinpticas modulando su actividad, como el glutamato,
la D-Serina, el ATP, algunas prostaglandinas y el TNF-, revisado en (Halassa et al.,
2007). Todos estos descubrimientos han colocado a los astrocitos en un puesto muy
activo en la neurotransmisin, aadiendo un nuevo elemento, la glia perisinptica, en
el tradicional modelo de la sinapsis formada por las neuronas pre- y postsinpticas.
Este nuevo modelo recibe el nombre de sinapsis tripartita y es sujeto de un activo
debate en la actualidad (Perea et al., 2009).
1.2.3 Regulacin de los niveles sinpticos de glutamato.
El glutamato es considerado como el principal neurotransmisor excitador en el SNC y
est involucrado en la mayora de procesos que conforman el funcionamiento normal
del SNC como la cognicin, la memoria y el aprendizaje. Aproximadamente el 90% de
las neuronas liberan glutamato al ser excitadas. ste es liberado al espacio sinptico
por exocitosis de las vesculas que lo contienen, donde difunde hasta unirse a sus
receptores en la membrana post-sinptica. Para permitir una sealizacin sinptica
fina, el glutamato sobrante debe ser retirado rpidamente del espacio sinptico
(Danbolt, 2001).
Adems, el glutamato es una potente neurotoxina, y la excitoxicidad producida por
glutamato participa en numerosas patologas del SNC. Altas concentraciones
extracelulares de este neurotransmisor producen una sobrestimulacin de lasneuronas, que provoca daos en stas y que pueden llevar a su muerte, bien por una
va rpida dependiente de Ca2+, bien por apoptosis como ocurre en enfermedades
neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (AD).
El glutamato liberado al espacio intersinptico es rpidamente recaptado por los
astrocitos circundantes, terminando as su funcin neurotransmisora y evitando la
sobrestimulacin neuronal. La recaptacin se lleva a trmino mediante transportadores
especficos para glutamato presentes en la membrana de los astrocitos, siendo losprincipales EAAT1 (GLT1) y EAAT2 (GLAST1). El glutamato recaptado es
16
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
23/221
INTRODUCCIN
transformado a glutamina, a travs de la glutamina sintasa, enzima de expresin
localizada principalmente en astrocitos, y se libera al medio donde es recaptada de
nuevo por las neuronas. El glutamato es recaptado por los EAATs astrocitarios juntos
con tres iones Na+, produciendo una aumento intracelular en la concentracin de este
in. Para reducirla, los astrocitos utilizan la ATPasa Na+/K+, provocando una demanda
energtica en estas clulas que como consecuencia activan las vas de la gliclisis.
Este aumento intracelular de los niveles de Na+ a causa de la recaptacin de
glutamato sirve como un sistema integrador entre la actividad neuronal con la
utilizacin de glucosa y confiere a los astrocitos un nivel adicional de control sobre la
actividad sinptica (Magistretti et al., 1999;Azarias et al., 2011;Danbolt, 2001).
Figura1.
Metabolismo
de
la
recaptacin
del
glutamato
en
la
sinapsis
glutamatrgica.
De
Ma istretti
et
al,
1999
En esta lnea, la recaptacin de glutamato es un proceso dinmico y se incrementa
durante la actividad neuronal, incluyendo la potenciacin a largo trmino (LTP).
Descubrimientos recientes han demostrado que la expresin de los EAATs son
regulados a nivel de la sinapsis por la interaccin neurona-astrocito mediante el
sistema de sealizacin de las efrinas. En el rea CA1 del hipocampo la presencia del
receptor de efrina A4 en la neurona post-sinptica, a travs de su interaccin con suligando, la efrina A3, que se encuentra expresada en los procesos astrocitarios peri-
17
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
24/221
INTRODUCCIN
sinppticos, disminuye la expresin de los EAATs gliales (Carmona et al., 2009) y es
capaz de modular la LTP (Filosa et al., 2009). La sealizacin ephrin-A3/EphA4
modula tambin la longitud y morfologa de las espinas dendrticas (Murai et al., 2003).
En resumen, esta va de sealizacin controla bidireccionalmente la funcin sinptica y
el transporte de glutamato, incidiendo directamente en la funcin hipocampal, una
evidencia adicional sobre la participacin de los astrocitos en la transmisin sinptica.
Se ha mostrado que la regulacin dinmica de los EAATs participa en procesos de
aprendizaje. En ratas sometidas al test del laberinto acutico de Morris, se ha
observado una disminucin en los niveles de expresin en hipocampo de GLAST y
EAAC1 (transportador de glutamato neuronal). Los autores proponen que esta
disminucin en las primeras fases del aprendizaje espacial podra permitir una
transmisin sinptica glutamatrgica de mayor intensidad durante las fases crticas del
aprendizaje (Fraticelli-Torres et al., 2010).
1.2.4Acoplamiento neurovascular
A travs de la interaccin con las clulas endoteliales los astrocitos controlan tambin
la formacin de la barrera hematoenceflica (Abbott et al., 2006), y son capaces de
regular el flujo sanguneo cerebral. El control del flujo sanguneo cerebral (CBF) es
vital para mantener el aporte energtico necesario para el funcionamiento neuronal
correcto. Descubrimientos recientes muestran que los astrocitos participan
directamente en el control del CBF, permitiendo acoplar las demandas energticas de
las neuronas de un rea con alta actividad neuronal con un incremento en el flujo
sanguneo. Este nivel de control parece depender de la gliotransmisin dependiente
de Ca2+ que conlleva variaciones en el tono arteriolar en una zona determinada. As, la
elevacin de la concetracin de Ca2+ intracelular conlleva a la formacin de la
prostaglandina PGE2 capaz de producir vasodilatacin en los capilares cerebrales
(Mulligan and MacVicar, 2004).
18
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
25/221
INTRODUCCIN
2. Participacin de los astrocitos a la neuroinflamacin
2.1 Conceptos generales sobre la inflamacin cerebral
La inflamacin es una reaccin de defensa de los tejidos destinada a neutralizarestmulos perjudiciales y restaurar la integridad tisular. En enfermedades
neurodegenerativas la inflamacin tiene lugar como una respuesta local conducida por
las clulas gliales y el endotelio cerebral.
De una manera simplista, segn su duracin en el tiempo la neuroinflamacin puede
clasificarse en aguda o crnica. La inflamacin aguda consta de las reacciones
inmediatas de las clulas gliales a un dao, y es bsicamente un proceso defensivo
que prepara el terreno para la reparacin del rea lesionada. La inflamacin crnica escaracterstica de las enfermedades neurodegenerativas en las que existe un estmulo
que persiste en el tiempo y se caracteriza por una activacin glial sostenida (Streit et
al., 2004) y en algunos casos, como en la esclerosis mltiple, por la acumulacin de
leucocitos en el parnquima cerebral. Bioqumicamente, el grado de activacin viene
determinado por el espectro de mediadores inflamatorios generados por las clulas
gliales. Este espectro incluye prostaglandinas, protenas del complemento, citoquinas,
quimiocinas, proteasas, molculas de adhesin y radicales libres (McGeer and
McGeer, 2004).
2.2. Privilegio inmune del SNC
El sistema nervioso central (SNC) presenta particularidades en cuanto a la respuesta
inflamatoria respecto a la inflamacin sistmica. La magnitud de las respuestas
inflamatorias en el parnquima cerebral es menor comparada con la de otros tejidos,
fenmeno conocido como privilegio inmune del cerebro (Matyszak, 1998). Esta menor
reactividad inflamatoria est basada en la existencia de la barrera hematoenceflica
(Pachter et al., 2003) y en la presencia de molculas endgenas con propiedades anti-
inflamatorias como la noradrenalina (Frohman et al., 1988;Feinstein et al., 2002;Galea
et al., 2003a).
1. La barrera hematoenceflica (BHE) representa una especializacin del endotelio
cerebral que se caracteriza por una densa red de uniones estrechas entre clulas
endoteliales y la presencia de numerosos procesos astrocitarios que se encuentran
rodeando los vasos cerebrales. Estas caractersticas confieren a la BHE la capacidad
19
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
26/221
INTRODUCCIN
de restringir el acceso de clulas inmunes y sustancias potencialmente nocivas de la
circulacin sistmica al SNC (Wolburg and Lippoldt, 2002).
2. Existen en el SNC sistemas neuronales con capacidad inmunomoduladora: Este
sera el caso de locus coeruleus que manda proyecciones a todo el cerebro y a la
espina dorsal y que en primates produce el 70% de la noradrenalina cerebral (Galea et
al., 2003b). La noradrenalina ejerce un papel inmunomodulador sobre la produccin de
molculas proinflamatorias en clulas gliales (astrocitos y microgla) (Galea and
Feinstein, 1999a) y el endotelio cerebral (Balyasnikova et al., 2000). Estos tres tipos
celulares son los principales responsables del desarrollo de la respuesta inflamatoria
en el cerebro.
3. El SNC es un tejido extremadamente rico en todo tipo de factores de crecimiento y
neurotrofinas. La expresin de algunos de estos factores est regulada por la
activacin de receptores beta-adrenrgicos (que son reconocidos por la noradrenalina)
(Riva et al., 1998a) y podran estar mediando los efectos de los sistemas
neuromoduladores. La hiptesis de la primera parte de este trabajo es que los
factores de crecimiento pueden regular las respuestas in flamatorias en el SNC.
2.3 La clulas gliales participan en la inmunidad innata del SNC
El sistema inmunitario posee dos grandes rutas de defensa: la inmunidad innata y la
adquirida. La inmunidad innata representa la capacidad inmediata del organismo de
responder a patgenos y otros tipos de trauma, y se caracteriza por la produccin de
novo de mediadores para eliminar los microorganismos y reparar el dao, bien
directamente o a travs de la activacin de clulas fagocticas. Estos mediadores son
las citoquinas, quimiocinas y protenas del complemento. En el SNC los genes que
codifican protenas que participan en la inmunidad innata pueden ser inducidos no slo
por microorganismos sino que tambin por clulas daadas en lesiones y patologasneurodegenerativas (Rivest, 2003;Becher et al., 2000) La inmunidad adquirida se
desarrolla frente a un antgeno especfico y es mediada por clulas del sistema
inmunitario: limfocitos B y T, requiriendo complejas reorganizaciones gnicas para la
produccin de anticuerpos.
Las clulas gliales participan activamente en la respuesta inmune innata del cerebro,
respondiendo ante la presencia de microorganismos patgenos. Los sistemas de
reconocimiento enfocados a patrones moleculares presentes sobre los patgenos(PAMP) son la base de la inmunidad innata, la cual inicia y dirige la respuesta inmune
20
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
27/221
INTRODUCCIN
adaptativa. Entre estos sistema de reconocimiento de patrones moleculares destacan
la familia de los toll-like-receptors(TLRs). Existen hasta once miembros de esta familia
de receptores transmembrana, cada uno de los cuales presenta especificidad por
ligandos presentes en patgenos y son expresados de manera tejido-especfica
(Iwasaki and Medzhitov, 2004). As algunos TLRs reconocen molculas que se
encuentran en la superficie de patgeno, el TLR2 (como heterodmero con TLR1 o
TLR6) se activa tras la unin a lipoprotenas de origen bacteriano, TLR4 se une al
lipopolisacrido de la pared de bacterias gram negativas y a protenas de origen vrico,
mientras que el TLR5 reconoce una protena presente en los flagelos de algunas
bacterias denominada flagelina. Algunos TLRs son capaces de detectar la presencia
intracelular de cidos nuclecos de origen bacteriano o vrico; TLR3 reconoce ARN de
doble cadena, los TLR7/8 reconoce RNA de cadena sencilla y el TLR9 ADN
hipometilado rico en CpG. (Liew et al., 2005). La capacidad de los TLRs de reconocer
cidos nucleicos debe de tenerse en cuenta a la hora de realizar experimentos en los
que se pretende introducir construcciones de ARN mediante transfecciones utilizando
reactivos lpidicos (la mayora de kits comerciales de transfeccin utilizan molculas de
origen lipdico), para silenciar genes mediante siRNA, ya que algunas clulas, entre
ellas los astrocitos, desencadena una respuesta inmune a cadenas cortas de ARN en
conjuncin con lpidos a travs de la activacin de los TLR3 y 7 (Gorina et al., 2009).
Tras la unin de los TLRs a sus ligandos, protenas adaptadoras como MyD88, MAL,
TRIF y TRAM, son reclutadas al dominio intracelular de los receptores y se unen a l a
travs de dominios TIR. Este reclutamiento permite la activacin de kinasas de la
familia IRAK (IL-1 receptor-asociated kinases) 1,2 y 4. IRAK4 es la primera en ser
reclutada, y tas su activacin fosforila a IRAK1, que es capaz de activar a otros
efectores de esta va de sealizacin como son las kinasas del inhibidor de NF-B
(IB) que reciben el acrnimo IKK. La fosforilacin del IB por parte de las IKKs,
resulta en su degradacin va el proteasoma y en la traslocacin nuclear del factor detranscripcin NF-B que media la transcripcin de genes inflamatorios generando una
respuesta pro-inflamatoria (Flannery and Bowie, 2010;Flannery et al., 2011).
Adicionalmente a la capacidad de los TLRs de reconocer PAMPs (Patogen-associated
molecular patterns) presentes en patgenos, recientemente se ha descubierto que
stos pueden ser activados por ligandos endgenos, a los que se conoce como
DAMPs (Danger-associated molecular patterns). Los TLRs extracelulares 2 y 4
reconocen molculas liberadas al medio extracelular por clulas muertes o daadasque han perdido la integridad de la membrana plasmtica. Entre los putativos DAMPs
21
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
28/221
INTRODUCCIN
que activan a TLR2 y 4 se encuentran algunas protenas de choque trmico (HSPs),
protenas del gurpo HMGB1, el cido hialurnico, la fibronectina o el heparan sulfato
(Sirisinha, 2011). El amplio perfil de expresin de los TLRs y su capacidad de de
reconocer a muchos ligandos que se encuentran presentes a consecuencia de
situaciones de infecciones, heridas o estrs, hacen que la sealizacin por TLR
constituya un mecanismo de respuesta rpida frente al dao tisular. Debido a esto,
empiezan a ser considerados como dianas teraputicas, tanto para prevenir el shock
sptico que puede aparecer como consecuencia a algunas infecciones (Kuno et al.,
2009), o en enfermedades autoinmunes en las que los TLR parecen jugar un papel
como es el caso del lupus eritromatoso, la artritis reumatoide, la esclerosis mltiple u
otras patologas como la enfermedad de Alzheimer (Midwood et al., 2009;Marta et al.,
2009).
Los astrocitos expresan el TLR4 (Qin et al., 2005;Bowman et al., 2003a) que reconoce
el LPS (lipopolisacrido). Esta molcula ha sido ampliamente utilizada como estmulo
inflamatorio en todo tipo de modelos celulares y animales por su capacidad de inducir
una respuesta inmune/inflamatoria de tipo innata. La induccin de la respuesta
inflamatoria por LPS se produce por la accin coordinada de 4 protenas que
reconocen a esta endotoxina. Inicialmente LBP (LPS-binding protein) interacciona con
las membranas bacterianas ricas en LPS, o agregados de LPS, catalizando la
extraccin y transfiriendo los monmeros de endotoxina a CD14, que a su vez los
transfiere a la protena MD2. La heterodimerizacin de esta ltima protena con los
receptores TLR4 desencadenan las vas de sealizacin de las que se ha hablado
anteriormente. Es importante destacar que tanto LBP como CD14 son capaces de
detectar a LPS, incluso a muy bajas concentraciones (Jerala, 2007;Teghanemt et al.,
2007). El modelo inflamatorio inducido por LPS es relativamente fcil y econmico de
establecer y presenta la ventaja de que activa vas de transduccin de seales
comunes a las citoquinas inflamatorias IL-1 y TNF- (Palsson-McDermott and O'Neill,2004), conocidas por ser las iniciadoras de diversas patologas con componente
inflamatorio.
2.4 Los astrocitos en la inmunidad innata
La respuesta de los astrocitos a condiciones patolgicas como la inflamacin o lesin,
recibe el nombre de astrogliosis y se caracteriza por hipertrofia, proliferacin, y
migracin a las zona daadas acompaado de un aumento de la expresin de
protenas como GFAP (Hozumi et al., 1990;Pekny and Pekna, 2004), vimentina(Ekmark-Lewen et al., 2010), S100 (Willoughby et al., 2004) y el receptor B de
22
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
29/221
INTRODUCCIN
endotelinas (ETbR) (Peters et al., 2003). Estos marcadores han sido los ms utilizados
para detectar astrocitos reactivos en el SNC en todo tipo de trastornos neurolgicos.
Adems, en el proceso de astrogliosis se sobreexpresan un buen nmero de
molculas de diversos tipos como citoquinas, quimiocinas (Meeuwsen et al., 2003),
molculas de adhesin (Lee and Benveniste, 1999), enzimas del sistema xido-
reduccin, enzimas sintetizadoras de mediadores de inflamacin como NOS2 o COX2
(Galea et al., 1994), componentes de la matriz extracelular, entre ellos los
proteoglicanos (McKeon et al., 1999) y factores de crecimiento (Miklic et al.,
2004;Suzuki et al., 2006).
La astrogliosis puede variar cualitativa y cuantitativamente segn la naturaleza de la
lesin y el microentorno de la zona lesionada, poniendo de manifiesto la plasticidad de
los astrocitos reactivos. En general, la activacin de los astrocitos se considera un
mecanismo beneficioso a travs del cual el SNC normal responde a un dao y
reestablece la homeostasis (Faulkner et al., 2004a). Sin embargo la activacin glial
crnica, caracterstica de las enfermedades neurodegenerativas y de lesiones como la
seccin medular, se considera patolgica en parte por la sobreexpresin de citoquinas
pro-inflamatorias y por la formacin de la cicatriz glial que impide la regeneracin
axonal (Ridet et al., 1997;Wilhelmsson et al., 2004). La naturaleza dual de la reaccin
astrocitaria fue puesta de manifiesto en un estudio donde se muestra que la ablacin
qumica de los astrocitos, en el SNC lesionado. La ausencia de astrocitos reactivos
resulta en una mayor prdida de neuronas adyacentes a la lesin, as como en un fallo
en el restablecimiento de la integridad de la BHE y una mayor infiltracin de leucocitos.
Estos datos ilustran el papel reparador de los astrocitos reactivos en respuesta a
lesiones. Por otra parte la prdida de astrocitos est asociada a un dramtico
incremento en el crecimiento local de neuritas indicando que la formacin de la cicatriz
glial constituye un impedimento para regeneracin axonal (Bush et al., 1999;Faulkner
et al., 2004b).
La cicatriz glial representa un intento por parte de los astrocitos de aislar la zona
lesionada para evitar daos secundarios a las regiones adyacentes al foco. Est
constituida por astrocitos hipertrofiados que presentan alta expresin de GFAP,
rodeados de una densa matriz extracelular formada por una red molecular muy rica en
condroitn-sulfato proteoglicanos (CSPG). Los CSPG, entre ellos el neurocn y
fosfacn (Morgenstern et al., 2002), son glicoprotenas de muy alto molecular, cuya
parte glucdica, entre otros factores, es la que convierte la cicatriz glial en restrictivapara el crecimiento axonal y por la tanto a la completa regeneracin funcional de los
23
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
30/221
INTRODUCCIN
tejidos afectados. Sin embargo, estudios recientes muestran que la formacin y
composicin de la cicatriz glial pueden modularse, resultando en una resolucin de la
lesin acompaada de una mejora en la recuperacin funcional, poniendo en duda la
idea preestablecida de que la presencia de esta cicatriz es siempre perjudicial. As, un
estudio (Renault-Mihara et al., 2011) muestra, que el tratamiento de ratas a las que se
efecta una lesin de espina dorsal con un inhibidor de la GSK3, resulta un aumento
en la migracin astrocitaria, asociada a una mayor compactacin, entendida como
aislamiento, del infiltrado celular inflamatorio, a una reduccin de la desmielinizacin y
a un incremento en el crecimiento axonal. En la misma lnea el tratamiento con FGF2
en un modelo similar de seccin de espina dorsal, da lugar a una mejora en la
recuperacin funcional debido a modificaciones en la composicin de la cicatriz glial
que permiten el crecimiento axonal (Kasai et al., 2010). Estos estudios ponen de
manifiesto que la modulacin de la migracin astrocitaria representa una diana
teraputica en procesos de regeneracin.
El carcter difuso de la reactividad astrocitaria en el SNC sugiere un papel de
mediadores solubles como las citoquinas, y/o a la presencia de un sincitio integrado
entre astrocitos que permite la transferencia de informacin a largas distancias.
Existen evidencias que muestran tanto in vivo como in vitro que ambos sistemas,
mediadores solubles y conexin por sincitio, son operativos en el SNC lesionado. En
este sentido la funcin de las citoquinas en el establecimiento, mantenimiento y, en
algunos casos, resolucin de la reactividad astrocitaria han sido ampliamente
caracterizadas y sigue siendo un tema activamente estudiado. Las citoquinas son
glicopptidos solubles de bajo peso molecular que actan de manera autocrina o
paracrina mediante la interaccin con receptores de membrana. La mayora de
citoquinas pueden actuar como ligando para ms de un receptor. Aqullas con un
claro papel en iniciar las astrogliosis son la IL-1(Giulian et al., 1988;Herx and Yong,
2001) y el TNF- (Rostworowski et al., 1997), mientras que el IFN- (Yong et al.,1991;Balasingam et al., 1994) jugara un papel potenciador, mientras que existen
citoquinas con un claro papel antiinflamatorio como el TGF-(Shrikant et al., 1996a) o
neuroprotector como la IL-6 (Quintana et al., 2008).
Hay que tener en cuenta que el trmino neuroinflamacin engloba fenmenos tan
diversos como la respuesta de las clulas gliales a infecciones, a mecanismos
reparadores como los que ocurren durante la isquemia o las lesiones de espina dorsal,
o a las reacciones a las que estn sometidas los astrocitos en la fases inicialesasintomticas que, en la mayor parte de los casos, preceden la manifestacin de
24
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
31/221
INTRODUCCIN
muchas enfermedades neurodegenerativas. Todos estos procesos inflamatorios, que
pueden considerarse relacionados de alguna manera, no tendran por qu estar
incluidos en un mismo grupo. En efecto, el patrn de expresin gnico de un astrocito
reactivo puede variar segn cul sea la naturaleza del estmulo inflamatorio. Adems
existe una heterogeneidad astrocitaria durante la reactividad glial, que hasta el
momento ha sido pobremente caracterizada. Por eso, hemos credo conveniente
escoger genes candidatos, que cubren diferentes aspectos de la reactividad
astrocitaria, para el estudio de la modulacin de la plasticidad astrocitaria. Estos genes
son la MCP1, ICAM1 y COX2.
2.4.1 MCP1
MCP1 (Monocyte chemoatractant molecule), otramente denominada CCL2, es unaquimiocina de 20kDA que es secretada al medio extracelular donde ejerce sus
funciones. Pertenece al grupo de las quimiocinas tipo CC, que comparten la
caracterstica de presentar en su secuencia aminoacdica dos residuos de cistena
adyacentes (Laing and Secombes, 2004). Las quimiocinas son un amplio grupo de
protenas funcionalmente relacionadas, que, al generar gradientes de concentracin,
guan y atraen al tejido lesionado, a un extenso espectro de clulas inmunes, entre
ellas monocitos, leucocitos, clulas NK y clulas T, y que adems son capaces de
sealizar de manera parecida a las citoquinas (Ubogu et al., 2006). Adicionalmente albien establecido papel que ejercen en el sistema inmune, las quimiocinas ejercen
funciones en el SNC tanto en condiciones fisiolgicas como patolgicas. Por ejemplo,
CXCL1, CXCL8, y CXCL12 regulan la liberacin de neurotransmisores y la actividad
de canales inicos en las pre- y post-sinapsis. (Bertollini et al., 2006). La expresin de
la MCP1 se localiza en poblaciones concretas de neuronas colinrgicas,
dopaminrgicas y de Purkinje en el SNC normal, colocalizando con neurotransmisores
y neuropptidos, sugiriendo un papel como modulador de la actividad neuronal
(Banisadr et al., 2005). En la patologa, las quimiocinas y sus receptores participan en
la patognesis y desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, como la
enfermedad de Alzheimer (Kiyota et al., 2009;Xia and Hyman, 1999) y la esclerosis
mltiple y en trastornos neurolgicos como la isquemia y la demencia asociada al
SIDA (Eugenin et al., 2006;Dhillon et al., 2008).
En particular, la MCP1 ha sido implicado en el dao neuronal que ocurre en la
isquemia y en la esclerosis mltiple ya que los animales KO (knock out) para esta
quimiocina o para su principal receptor, el CCR2, son resistentes a la EAE
25
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
32/221
INTRODUCCIN
(experimental autoinmune encephalomyelitis, modelo in vivo de la esclerosis mltiple)
(Fife et al., 2000) o presentan un menor dao cerebral en respuesta a modelos de
isquemia (Hughes et al., 2002). Adems de su papel quimiotctico sobre los monocitos
y la microgla (Tanuma et al., 2006;El-Hage et al., 2006), recientemente se han
descrito nuevas funciones neuroprotectoras para la MCP1. As, reduce la muerte
neuronal en cultivo inducida por excitotoxicidad, por exposicin a protenas del virus
del VIH (Eugenin et al., 2003) o durante la deprivacin de oxgeno y glucosa (Madrigal
et al., 2009a). Adicionalmente participa en el reclutamiento de precursores neuronales
tras un episodio isqumico (Yan et al., 2007;Xu et al., 2007). Recientemente, se ha
publicado un trabajo que muestra que la MCP1 podra tener per se, un papel
neuromodulador en los astrocitos, disminuyendo la expresin de citoquinas, como la
IL-6, tras un estmulo pro-inflamatorio (Semple et al., 2010b) Todos estos resultados
hacen pensar que la MCP1 desempea un papel importante en procesos de
regeneracin en el SNC.
A pesar de que varios tipos celulares, incluyendo neuronas, endotelio y gla, pueden
expresar la MCP1, (Thibeault et al., 2001;Flugel et al., 2001), los astrocitos parecen
ser su principal fuente en respuesta a lesiones (Khorooshi et al., 2008;Glabinski et al.,
1996). El gen de la MCP1, es del tipo early-response, y se transcribe de manera
rpida en respuesta a estmulos especficos por la accin de factores de trancripcin
como NF-B (Giraud et al., 2010), HIF1 (Mojsilovic-Petrovic et al., 2007) y CEBPs
(Abraham et al., 2005). Su expresin aumenta dramticamente en respuesta a
estmulos proinflamatorios como el TNF (Gao et al., 2010;Giraud et al., 2010), LPS
(Thompson and Van Eldik, 2009), o por A(Smits et al., 2002;Prat et al., 2000) pero es
tambin regulable por gliotransmisores como la noradrenalina (Madrigal et al., 2010) y
ATP (Panenka et al., 2001). La presencia del principal receptor para la MCP1, el
CCR2, de tipo 7 dominios transmembrana asociado a protenas G, se expresa en
astrocitos, sugiriendo que puede tener funciones autocrinas (Andjelkovic et al., 2002)aunque poco se conoce sobre el papel de esta quimiocina sobre los astrocitos. Un
nico estudio muestra que, durante la formacin de las placas de amiloide en estados
iniciales de la enfermedad de Alzheimer, los astrocitos migran hacia las placas
siguiendo un gradiente de MCP1 hasta que contactan fsicamente con el Ade stas,
momento en el cual se detienen. Los autores (Wyss-Coray et al., 2003a) sugieren que
los astrocitos atrados de esta manera a las placas son capaces de degradar el A. La
recopilacin de estos datos pone de manifiesto que es importante estudiar el posible
efecto autocrino de la MCP1, en fenmenos en que la migracin astrocitaria estimplicada.
26
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
33/221
INTRODUCCIN
2.4.2 ICAM1
La molcula de adhesin intracelular (ICAM1) juega un papel importante en las
reacciones inflamatorias en el SNC. ICAM1 es una glicoprotena transmembrana
integral que contiene 5 dominios Ig-like extracelulares. Acta como ligando de las
integrinas del tipo 2 LFA-1 (CD11a/CD18) y Mac-1 (CD11b/CD18) expresadas tanto
por leucocitos y macrfagos como por la microglia. En el cerebro adulto normal se
expresa en bajos niveles y de manera constitutiva en las clulas endoteliales de los
microvasos y en los astrocitos perivasculares , siendo su expresin regulable durante
condiciones inflamatorias (Dietrich, 2002). In vitro su expresin se regula a la alza en
respuesta a citoquinas como TNF-, Il-1.(Fabry et al., 1992)
Su papel en la extravasacin de leucocitos a travs de las paredes vasculares ha sido
extensamente estudiado. Este proceso consta de diversas fases. Inicialmente los
leucocitos deben interaccionan con componentes de la matriz extracelular de los vasos
como las selectinas. A continuacin se produce la adhesin firme a las membranas
luminales de las clulas endoteliales, proceso en el que participan diversas protenas
de membrana como selectinas, VCAM e ICAM. La interaccin de la ICAM con sus
receptores presentes en los leucocitos genera cascadas de sealizacin que conllevan
la activacin del leucocito, permitiendo la diapedesis de estos, entre las culas
endoteliales que forman el vaso para llegar al parnquima del tejido. Hasta hace poco
el papel de la ICAM se limitaba a ser de ancla para los leucocitos, pero nuevos
descubrimientos demuestran su dominio intracelular es tambin capaz de sealizar
tras la interaccin con Mac-1 y LFA-1, dando lugar a cambios en la dinmica del
citoesqueleto y de la expresin gnica en el endotelio (Greenwood et al.,
2002;Dietrich, 2002).
El significado funcional de la expresin de ICAM en astrocitos ha sido poco estudiado,
y su estudio se ha limitado a la interaccin intercelular entre astrocitos y leucocitos. Suexpresin se ve aumentada en algunas de las enfermedades neurodegenerativas
como AD, PD y MS. En la AD, los astrocitos que rodean las placas de amiloide son
positivos para ICAM. En el interior de las placas se encuentran tambin clulas
microgliales que expresan los co-receptores para la ICAM, sugiriendo un papel para la
interaccin entre astrocitos y microglia mediada por la interaccin LFA/ICAM en la AD.
(Akiyama et al., 1993) Se ha descrito tambin la sobre-expresin de ICAM en
esclerosis mltiple y la enfermedad de Parkinson. Estudios in vitrodemuestran que la
mutacin de la -sinuclena causante de las formas autosmicas dominantes de la PDes capaz de incrementar la ICAM (Klegeris et al., 2006) y que la expresin de sta se
27
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
34/221
INTRODUCCIN
ve aumentada en la substantia nigrade pacientes con dicha enfermedad (Miklossy et
al., 2006).
La activacin de la ICAM puede mimetizarse en astrocitos en cultivo mediante el uso
de anticuerpos anti-ICAM, que generan cross-linkingde esta protena (Etienne et al.,
1998). As, el uso de anticuerpos anti-ICAM desencadena la expresin de TNF- y IL-
6 a travs de las vas de las MAPK y AMPc.(Etienne-Manneville et al., 1999;Lee et al.,
2000) Las consequencias de la activacin de ICAM sobre la morfologa y migracin
astrocitarias no han sido estudiadas.
2.4.3 COX2
Las ciclo-oxigenasas (COX) son enzimas claves en la sntesis de prostaglandinas que
regulan el paso limitante de la produccin de stas utilizando como sustrato el cido
araquidnico. Se conocen dos principales isoformas, siendo la COX1 de expresin
ubicua y constitutiva y la COX2 de carcter inducible en numerosos tipos celulares en
respuesta a estmulos inflamatorios. Las prostaglandinas regulan mltiples funciones
fisiolgicas, como el acoplamiento neurovascular, y desempean un papel importante
en el control de la respuesta inmune innata, actuando bien como segundos
mensajeros pro-inflamatorios (Verma et al., 2011) de manera paracrina mediante de la
activacin de receptores de prostaglandinas, protenas de membrana asociadas a
protenas G, o anti-inflamatoria por activacin de los receptores nucleares PPAR
(Martinez-Gras et al., 2011), segn el tipo de prostaglandina y el contexto celular.
La COX2 se expresa en clulas gliales y endoteliales en condiciones de inflamacin
pero existen algunas situaciones en las que su loclizacin es principalmente
astrocitaria. Por ejemplo, se expresa principalmente en astrocitos en respuesta a
isquemia, mientras la COX1 se observan en neuronas y microgla tanto en basal comoen isquemia (Wu et al., 2011). Se induce tambin por inyeccin de cido kanico intra-
hipocampal especficamente en astrocitos de CA1 y CA3 (Serrano-Perez et al., 2011).
Su expresin es dependiente de factores de transcripcin como NF-kB (Serrano-Perez
et al., 2011) y NFAT (Blanco et al., 2010), AP1 y PPAR(Aleshin et al., 2009). El A la
induce de manera dependiente de NF-B, asociado a un aumento en la liberacin de
PGE2 (Blanco et al., 2010). Las prostaglandinas son molculas vasoactivas. En este
sentido, los astrocitos actan como puentes en el acoplamiento neurovascular, el ATP
liberado por los propios astrocitos en respuesta a la actividad neuronal, induce laexpresin de COX2 que sintetiza prostaglandinas que al actuar sobre las clulas
28
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
35/221
INTRODUCCIN
endoteliales regulan el flujo cerebral y participan en la proteccin ofrecida por el
precondicionamento isqumico (Birnbaum et al., 2005). Las prostaglandinas pueden
participar en la neurotransmisin ya que aumentan excitabilidad neuronal asociado a
un incremento en las sinapsis excitadoras (Koch et al., 2010). A pesar de que los
mecanismos de expresin de la COX2 han sido ampliamente estudiados, y su
presencia se interpreta muy a menudo como un marcador de inflamacin, poco se
conoce sobre el papel de la COX2 y las prostaglandinas sobre los astrocitos.
En otro contexto, es bien conocida la participacin de la COX2 en el desarrollo de
tumores y el establecimiento de metstasis, revisado en (Harris, 2007). En esta lnea,
se ha detectado la sobre-expresin de COX2 en diferentes tipos de tumores y se
conoce que las prostaglandinas son capaces de estimular la migracin de clulas
cancerosas, y que este efecto se revierte en presencia de inhibidores especficos del
enzima como son el NS398 y el celecoxib (Rodriguez et al., 2008), y ocurre a travs de
la activacin de receptores de prostaglandinas. Teniendo en cuenta estos resultados,
resulta interesante preguntarse si la COX2 puede intervenir en fenmenos de
plasticidad astrocitaria como es la migracin.
2.5 Migracin astrocitaria
La migracin celular es esencial para la organizacin y mantenimiento de la integridad
tisular y participa en el desarrollo embrionario, regeneracin, inflamacin e invasin a
travs de la matriz extracelular (Lauffenburger, 1996). La migracin celular es un
proceso vital en todos los organismos multicelulares y es importante no solamente
durante el desarrollo sino que tambin durante toda la vida en fenmenos como la
regeneracin y la inmunidad. La migracin celular es dirigida por seales
extracelulares que actan como atrayentes o repelentes. Estas seales desencadenan
respuestas intracelulares que incluyen cambios en el citoesqueleto (tanto microtbulosde tubulina como microfilamentos de actina), en el transporte vesicular y en la
expresin gnica.
Cuando el SNC atraviesa una situacin traumtica, los astrocitos reactivos migran a
los bordes de la zona lesionada y/o inflamada donde forman la cicatriz glial, separando
el tejido sano de la zona daada. (Ellison et al. 1998; Saadoun et al. 2005).
Numerosas evidencia tanto in vivo como in vitro sealan a los mediadores
inflamatorios, incluyendo citoquinas, factores de crecimiento y ligandos de losreceptores Toll-like (TLRs), como directores de la astrogliosis (Ghirnikar et al.1998;
29
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
36/221
INTRODUCCIN
Caso et al. 2007), aunque el efecto beneficioso o deletreo de los procesos
inflamatorios sigue siendo tema de debate (Kriz, 2006).
Un papel importante de los mediadores inflamatorios podra ser el de regular la
capacidad migratoria de los astrocitos a las zonas daadas (Norton et al. 1992;
Ghirnikar et al. 1998). En numerosos estudios se muestras que citoquinas y LPS son
capaces de estimular la migracin de diferentes tipos celulares. Por ejemplo la IL-1
promueve la migracin de clulas de msculo liso vasculares (Delbosc et al. 2008) y
en clulas tubulares de rin humano (Zhang et al. 2005), TNF- en clulas
epidermales de Langherhans (Griffiths et al. 2005, TNF- e IFN- en precursores
multipotentes neurales (Ben-Hur et al. 2003). Aunque la IL-1 es capaz de dar lugar a
astrogliosis in vivo (Giulian et al. 1988), esta misma citoquina inhibe la migracin de
astrocitos fetales humanos in vitro (John et al. 2004), a diferencia de otros trabajos
(Sato et al., 2011). El papel de los mediadores inflamatorios en la migracin
astrocitaria no queda claro, por ejemplo el LPS, no es capaz de estimular migracin en
astrocitos (Sato et al., 2011), aunque en presencia de otros mediadores de la
inflamacin, como molculas lipdicas como el LPA, s es capaz de acelerar este
proceso. Por lo tanto, parece claro que existe cierta especificidad en las molculas
capaces de regular los fenmenos de migracin astrocitaria.
Es importante destacar tambin que en los ltimos aos est cobrando importancia la
hiptesis de que enzimas que participan en la respuesta inflamatoria pueden participar
tambin en un incremento de la capacidad migratoria de los astrocitos reactivos. De
esta manera MMP-9, una metaloproteinasa capaz de degradar componentes de la
matriz extracelular y ya implicada en otros fenmenos migratorios como en el
establecimiento de metstasis (van Kempen and Coussens, 2002), parece ser pro-
migratoria, ya que al inhibir su actividad, astrocitos tratados con TGF- disminuyen la
velocidad de migracin (Hsieh et al., 2010). Asimismo, la sintasa de xido ntricoinducible (iNOS) es capaz de estimular la migracin astrocitaria a travs de su
producto, el xido ntrico y las especies reactivas de oxgeno que de l se derivan
(Wang et al., 2010). Queda por ver si otras molculas que participan en la reaccin
inflamatoria como las quimiocinas, por su conocido papel de establecer gradientes
quimiotcticos que son reconocidos por las clulas inmunes para localizar zonas de
lesin, y la ciclooxigneasa-2 (COX2), que juega un papel claro en la formacin de
metstasis, o molculas de adhesin como ICAM y VCAM promueven la migracin
astrocitaria.
30
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
37/221
INTRODUCCIN
2.6. Part icipacin de las Rho GTPasas en la reactividad glial
A modo de resumen, el primer paso en la migracin celular es la emisin de un
proyeccin o proceso gua (leading edge), formado por un lamelipodio, que al crecer
establece nuevos puntos de adhesin al frente del sentido migratorio, seguido de una
contraccin del soma celular y la prdida de los puntos de anclaje de la clula en su
parte trasera lo que permite el avance de la clula. Todos estos pasos son posibles
por la reorganizacin del citoesqueleto de actina, el ensamblaje y desensamblaje de
las adhesiones focales y el establecimiento de la polaridad celular que determina el
sentido de la migracin. Estos procesos deben estar coordinados localmente de una
manera muy fina, tanto en el espacio como en el tiempo, para generar un movimiento
productivo. Se han descrito mltiples vas de sealizacin involucradas en el control de
la migracin celular como las MAPKs y las fosfolipasas, pero una familia de protenas,
las Rho GTPasas, destaca sobre las dems por desarrollar un papel esencial en la
regulacin de las vas bioqumicas relevantes en la migracin.
Las Rho-GTPasas son una familia de protenas G pequeas que, fluctuando entre
estados activos (cuando se encuentran unidas a GTP) e inactivos (al transformar el
GTP a GDP) coordinan cambios en la organizacin del citoesqueleto de actina y en la
transcripcin de genes, regulando as procesos biolgicos como la morfognesis, la
quimiotaxis, el crecimiento de los axones y la progresin del ciclo celular. La actividad
de las Rho-GTPasas est regulada por las GEFs (guanine-nucleotide-exchange
factors) que facilitan el intercambio de GDP por GTP y por las GAPs (GTPase
activating proteins), que tienen el efecto contrario al aumentar la velocidad de
hidrlisis del GTP. En su forma inactiva las Rho-GTPasas se encuentran formando un
complejo con GDIs (GDP-dissociation inhibitors) en el citoplasma mientras que su
activacin implica translocacin a la membrana con la que interaccionan mediante una
isoprenilacin. Las Rho-GTPasas incluyen a las Rho (A, B y C), las Rac, y las Cdc42,
que regulan diferentes aspectos de la dinmica del citoesqueleto. Generalizando, lasRho activan la formacin de complejos actina-miosina que forman las fibras de estrs
en cuyo extremo se forman focos de adhesin a la matriz extracelular. Las Rac
inducen la formacin de una red de filamentos de actina en la periferia celular que da
lugar a la formacin de lamelipodios, mientras que las Cdc42 inducen extensiones
ricas en actina en la membrana llamadas filopodios (revisin en Bishop and Hall,
2000)). En su conformacin activada las Rho-GTPasas son capaces de interaccionar
de manera especfica con sus protenas efectoras que median sus efectos. La
serina/treonina kinasa ROCK es activada por la unin a Rho-GTP (Kubo andYamashita, 2007), as como mDia (Narumiya et al., 2009); por otro lado Rac1 y cdc42-
31
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
38/221
INTRODUCCIN
GTP promueven la actividad de la kinasa PAK (Szczepanowska, 2009;rias-Romero et
al., 2010), entre otras (Bishop and Hall, 2000).
Existe un cierto consenso en atribuir la formacin de las protrusiones que establecen
el sentido migratorio y el establecimiento de la polaridad celular a la cdc42 (Yokota et
al., 2010) y a la Rac1, mientras que la RhoA regula adhesin/deadhesin de la parte
trasera mediante el control de la contractibilidad de las fibras de actina-miosina, y la
formacin de adhesiones focales. Las adhesiones focales son microrregiones
especializadas de la membrana plasmtica, que constituyen puntos de unin con el
sustrato. Estas uniones se establecen a travs de protenas como las integrinas que
reconocen componentes de la matriz extracelular a los que se unen, y actan como
anclas que ligan en el citoesqueleto de actina con la matriz a travs de toda una serie
de protenas adaptadoras. Entre ellas se encuentran la paxilina (Yu et al., 2010) o la
kinasa de adhesiones focales (FAK). La FAK regula el reciclaje
(formacin/desensamblaje) de las adhesiones focales a travs de la fosforilacin de
varias protenas efectoras, y su actividad est directamente relacionada con la
adhesin y migracin celular (Chalkiadaki et al., 2011).
Se han desarrollado distinto modelos experimentales in vitropara poner de manifiesto
la capacidad migratoria de las clulas y as estudiar las vas de sealizacin
implicadas en este fenmeno. Uno de los ms utilizados, el ensayo de scratch wound
assay, consiste en realizar una herida en una monocapa de clulas confluentes,
eliminando los contactos inhibidores clula-clula, estimulando as la migracin celular
para regenerar la herida. En el caso de los astrocitos, stos se polarizan en direccin
perpendicular a la herida, emitiendo largos procesos y cerrando totalmente zona libre
de clulas 48h despus de su generacin (Etienne-Manneville, 2006). Este ensayo
reproduce varios de los fenmenos que ocurren durante la migracin in vivo, y permite
ensayar cmo modulan la capacidad migratoria frmacos y molculas sobre lapolaridad, morfologa y velocidad migratoria.
32
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
39/221
INTRODUCCIN
3. FGF2 en la plasticidad astrocitaria
Los factores de crecimiento fibroblstico (FGF) y sus receptores (FGFR) constituyen
un elaborado sistema de sealizacin que participa en numerosos procesos durante eldesarrollo embionario y la edad adulta en virtualmente todos los tejidos en mamferos.
Fue una de las primeras familias de factores de crecimiento en ser descritas. El primer
miembro de esta familia fue identificado por su capacidad de estimular la proliferacin
de fibroblastos, de all su nombre. Hasta la fecha se conocen veintitrs miembros de
esta familia que sealizan a travs de cuatro receptores distintos. No todos los FGFs
pueden ser detectados en todas las especies incluyendo la humana. As, en humanos
el FGF15 no se detecta en el genoma resultando en un total de veintids miembros de
esta familia (Itoh and Ornitz, 2008). Por anlisis filogentico la familia de los genesFGF humanos pueden dividirse en siete subfamilias compartiendo algunos de los
miembros de cada subfamilia funciones y patrones de expresin parecidos.
La mayora de FGFs se expresan durante el desarrollo con patrones de expresin
diferenciales y muy dinmicos. En el adulto la expresin de algunos de estos factores
se mantiene y en algunos casos de manera muy restringida a ciertos rganos. A
menudo varios FGFs se co-expresan en el mismo tejido, lo que resulta en cierta
redundancia funcional que se refleja en la generacin de KOs para FGFs especficos.
Este es el caso del ratn KO para FGF2, que es viable y no presenta un fenotipo
dramtico a pesar de que este factor est implicado en procesos tan importantes como
la induccin del mesodermo, angiognesis y formacin de extremidades (Ortega et al.,
1998). Es posible que la redundancia funcional haya sido un mecanismo seleccionado
evolutivamente para conferir robustez a un sistema de sealizacin
Los genes de todos los FGFs conocidos se estructuran en tres exones codificantes
siendo el exn 1 el que contiene el codn de inicio (Arnaud et al., 1999;Prats et al.,
1989). An as numerosos FGFs presentan secuencias codificantes en 5 cuya
transcripcin se inicia a travs de codones CUG alternativos. Respecto a su
localizacin cromosmica los genes de los FGF no se localizan en un cluster
delimitado si no que muestran una localizacin altamente dispersa en el genoma (Itoh
and Ornitz, 2008).
Los FGFs son molculas evolutivamente antiguas. Han sido identificados tanto en
invertebrados como en vertebrados, pero no se encuentran en el genoma de
33
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
40/221
INTRODUCCIN
organismos unicelulares como E. coli o S. cerevisae.En Drosophila se conoce un solo
gen de FGF, branchless, y en C. Elegans dos (egl-17 and let-756), contrastando con el
alto nmero de FGFs identificados en vertebrados. La mayora de protenas FGF
ortlogas se encuentran altamente conservadas entre especies mostrando un 90% de
identidad en la secuencia aminoacdica. El tamao de estos factores oscila entre 17 y
34 kD y la mayora contienen un secuencia interna altamente conservada de 28
aminocidos (core domain) que determinan la interaccin con heparina y con los
FGFRs (Beenken and Mohammadi, 2009).
3.1 Los FGF sealizan a travs de los FGFR
Los FGFs ejercen sus funciones extracelulares a travs de la unin y activacin de
receptores de alta afinidad presente en la membrana extracelular, los FGFR. Los
FGFR son una subfamilia de receptores tirosina-quinasa de membrana, que en
vertebrados consta de cuatro miembros FGFR1-4. Son protenas con un solo dominio
transmembrana con un motivo de unin a ligando extracelular y dominios tirosina-
kinasa intracelulares. La regin extracelular est compuesta de tres dominios Ig (IgI,
IgII, IgIII) que son los responsables de la unin a FGF, determinando las especificidad
y afinidad por el ligando. Localizado entre los dominios IgI y II, se halla un motivo de
aa cidos (acdic box domain) seguido de un motivo de unin a heparina y un dominio
de homologa a molculas de adhesin (CHD). Estos dominios permiten la interaccin
de los FGFRs con molculas de la matriz extracelular, principalmente la heparina de
los heparan-sulfato-proteoglicanos (HSPGs) y molculas de adhesin como N-CAM.
Contigua a la parte extracelular se encuentra el domino transmembrana seguido de la
parte intracelular. Esta ltima consta de una regin yuxtamembrana, un dominio
tirosina-quinasa partido por un dominio interquinasa no cataltico y una cola C-terminal
corta. Adems del dominio cataltico, la regin intercelular contiene varios motivos de
fosforilacin as como de unin a protenas adaptadoras como FRS2 (Mohammadi et
al., 2005a;McKeehan et al., 1999;Gotoh, 2008).
La mayora de FGFs pueden unirse a ms de un FGFR. La diversidad de funciones
que presentan los distintos FGFs se consigue, a parte de la existencia de cuatro
receptores diferentes, gracias a la generacin de isoformas por splicingalternativo en
los ARN mensajeros de los receptores. La regin con un mayor impacto sobre la
afinidad del ligando por el receptor es la IgIII, para la cual existen tres variantes de
splicingdenominadas IgIIIa, IgIIIb, IgIIIc (Mohammadi et al., 2005b).
34
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
41/221
INTRODUCCIN
El mecanismo de activacin de los FGFR no est del todo dilucidado. Se piensa que el
mecanismo comn a todos los receptores es la formacin de dos complejos FGF-
FGFR independientes que son de baja afinidad. Estos complejos pueden dimerizar y
subsecuentemente ser conectados por una molcula de heparina o HSPGs
estabilizando y activando el complejo, formado finalmente por dos molculas de FGF,
dos de FGFR y una de heparina (McKeehan et al., 1999).
La activacin del complejo conlleva un aumento en la actividad tirosina quinasa del
dominio intracelular resultando en la autofosforilacin de varios residuos tirosina del
propio receptor. Estas fosforilaciones sirven como puntos de amarre (docking sites)
para el reclutamiento y unin de varias protenas de docking como FRS2, GAB1,
protenas adaptadoras como GRB2 y protenas sealizadoras como la fosfatasa Shp2.
Las interacciones entre estas protenas se llevan a cabo a travs de dominio SH2 (src-
homology2) y PTB (phosphotyrosine binding). Estos componentes se ensamblan en
complejos sealizadores que inician distintas vas de sealizacin que modifican la
expresin gnica y el comportamiento celular
Figura2.PrincipalesvasdetrasduccindesealesactivadasporlaactivacindelFGFR1.Launin del FGFR con su ligando, provoca la dimerizacin del receptor y la activacin de diversasvas de trasduccin de seales. La activacin de la fosfolipasa C (PLC) y la movilizacin de calciointracelular producen cambios morfolgicos en la clula, mientras que la accin de la fosfatidil-inositol kinasa (PI3K) media la activacin de la proten quinasa B que regula la supervivenciacelular. La estimulacin de la va de las MAP quinasas transduce las seales iniciadas por elreceptor al ncleo modificando la expresin de genes. (Mohammandi et al, 2005)
35
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
42/221
INTRODUCCIN
Un fenmeno intrigante en la sealizacin por receptores FGFR es que, segn el
contexto y el tipo celular, tras la unin del ligando al receptor, el complejo es
internalizado y transportado al ncleo (Clarke et al., 2001). Esto sugiere que el
complejo ligando-receptor puede tener acciones nucleares facilitando la expresin de
genes (Peng et al., 2002;Stachowiak et al., 2003). Este proceso de internalizacin y
sealizacin intracrina representa una peculiaridad del sistema FGF-FGFR sobre otros
sistemas de sealizacin por factores trficos a los que se atribuye un mecanismo de
accin paracrino.
3.2 Funciones de los FGFs
Un nmero relativamente bajo de factores de crecimiento orquestan el desarrollo,
sealizando sobre clulas indiferenciadas proliferacin, diferenciacin y organizacin
en patrones especficos. Entre ellos se encuentran los FGFs y su receptores
involucrados en la mayora de procesos embrionarios tempranos como: el
establecimiento de los ejes corporales, formacin del mesodermo y el endodermo,
induccin neural y regionalizacin de la placa neural y somitognesis (Bottcher and
Niehrs, 2005;Mason et al., 2004).
Los FGFs a menudo sealizan de manera direccional y recproca en fronteras epitelio-
mesenquimales. Por ejemplo en vertebrados, en el desarrollo de las extremidades, el
FGF10 expresado por el mesodermo de placa lateral induce la formacin de la cresta
apical ectodrmica. La cresta expresa entonces FGF8 con el que sealiza sobre el
mesodermo. Esta sealizacin direccional inicia feedback loops, que junto con otros
factores solubles, promueven el crecimiento y la correcta organizacin de la
extremidad (Grieshammer et al., 1996). La expresin diferencial de las distintas
variantes de splicingde los receptores FGFR (que determinan la especificidad por el
ligando) permite esta sealizacin direccional evitando la sealizacin autocrina sobre
el mismo compartimiento.
Los FGFs juegan un papel importante en el desarrollo del SNC. El FGF3 y FGF8 han
sido implicados en el establecimiento de la regionalizacin del la estructuras
embrionarias que darn lugar al SNC maduro (Raible and Brand, 2004). Adems
participan en el desarrollo de los rganos sensoriales, en la condrognesis y en la
formacin del sistema esqueltico, de las extremidades, as como del corazn y
sistema digestivo
36
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
43/221
INTRODUCCIN
Para estudiar las funciones de los FGF, el abordaje utilizando en la mayora de los
casos ha sido la generacin de knock-outs mediante recombinacin homloga. Los
fenotipos varan de una letalidad severa embrionaria por fallos importantes en la
organognesis a cambios sutiles en el adulto. Es difcil atribuir funciones especficas a
cada uno de los FGFs por la redundancia funcional que presentan. An as, algunas
de las subfamilias de los FGFs presentan funciones bien delimitadas.
Figura3.AgrupacinfilogenticadelosFGFsdemamferoporsubfamilias.Anlisis
filogenticos sugieren que los FGFs pueden dividirse en siete subfamilias quecontienen entre dos y cuatro miembros. La longitud de las ramificaciones esproporcional a la distancia evolutiva de cada uno de los genes. (Ithoh N., 2008).
La familia de hFGF (formado por los FGF19, FGF21, FGF23) presenta un claro papel
en la regulacin metablica, funcionando como hormonas endocrinas. FGF19 podra
ser un regulador energtico por su control sobre el metabolismo de lpidos y formacinde bilis, FGF21 regula tambin el metabolismo de la glucosa y lpidos, mientras que
FGF23 controla el metabolismo de la vitamina D e iones fosfato. Otra peculiaridad de
esta subfamilia es que sus miembros muestran poca afinidad por los FGFRs,
requiriendo la presencia de co-receptores como Klotho y -Klotho para activar los
FGFR de manera eficiente (Itoh, 2010).
La familia del FGF11 (FGF11-14) se expresan tanto en el SNC en desarrollo como en
el adulto lo que hace pensar que estos factores desarrollan un papel importante en eldesarrollo y mantenimiento de este sistema, Como peculiaridad los miembros de esta
37
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
44/221
INTRODUCCIN
subfamilia no se secretan y su localizacin subcelular es principalmente nuclear
(Smallwood et al., 1996). La familia del FGF7 (FGF7, FGF10 y FGF22) presenta
funciones en la formacin de sinapsis como organizadores presinpticos. (Umemori et
al., 2004).
Las dems subfamilias de FGFs no presentan funciones ms definidas. En
organismos adultos los FGFs estn implicados en la regeneracin de tejidos,
angiognesis y homeostasis tisular (Lee and Kay, 2006a;Chang et al., 2006). Tiene
adems una importancia capital en cncer. Los FGF3-6 fueron inicialmente
identificados como proto-oncogenes. Adems junto con los FGFRs, los FGFs tiene un
importante papel en la proliferacin celular. Numerosas evidencias muestran que estn
involucrados en la carcinognesis y formacin de tumores de origen mamario, de piel,
de prstata, del tracto urinario, as como de patologas de tipo hematolgico (Lin and
Wang, 2010;Knights and Cook, 2010).
Adems por la importancia de la sealizacin de FGFs en el desarrollo del sistema
esqueltico, mutaciones en los FGFR generan displasias esquelticas que se pueden
agrupar en dos grupos: acondroplasias (Aviezer et al., 2003), la forma ms comn de
enanismo de origen gentico en humanos o craneosinostosis (cierre prematuro de las
suturas craneales, (Hatch, 2010).
3.3. FGF2
3.3.1 Descubr imiento y primeros t rabajos
El FGF2 fue uno de los primeros factores de crecimiento en ser descubierto, hace ms
de 30 aos. Se identific en extractos de la glndula pituitaria bovina un factor capaz
de estimular la proliferacin de fibroblastos murinos (Armelin, 1973). Posteriormente
Gospodarowich et al lo purificaron de la pituitaria y lo nombraron factor de crecimiento
de fibroblastos (FGF). El FGF2 se expresa en grandes cantidades en esta glndula,as como en el resto del cerebro, representando 5 mg de factor por kg de tejido. El
FGF2 se purifica con un punto isoelctrico de pH 9.6 por lo que fue llamado bFGF (b
de bsico) para diferenciarlo del aFGF (acdico o FGF1), que fue caracterizado en la
misma poca. Se demostr tambin que el FGF2 actuaba a travs de receptores de
membrana (Neufeld and Gospodarowicz, 1985).
La sospecha de que se tratara de un factor neurotrfico vena dada por haber sido
purificado en la pituitaria y en el cerebro. En 1986 se demostr que el FGF2 mejorabala supervivencia de neuronas corticales en cultivo (Morrison et al., 1986). Ms tarde el
38
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
45/221
INTRODUCCIN
FGF2 humano fue clonado de fibroblastos de piel y se determin que estimulaba la
proliferacin celular al ser transfectado su cDNA y que se secretaba al medio
extracelular (Kurokawa et al., 1987). Desde entonces las funciones que se atribuyen al
FGF2 no han parado de aumentar.
3.3.2 Estructura del FGF2
El FGF2 es un polipptido de cadena sencilla compuesto por 146 aminocidos que
carece de la secuencia seal de secrecin pero ha adquirido una secuencia de
localizacin nuclear NLS (Florkiewicz et al., 1991). Se originan mltiples isoformas del
FGF2, todas provenientes del mismo ARNm, por el uso alternativo de distintos inicios
de la traduccin en el extremo 3 del mensajero. La isoforma de 18kDa se sintetiza a
partir del codn AUG, a diferencia de las isoformas de mayor peso molecular (HMW:
21, 21.5 y 22kDa en rata) que se sintetizan a partir de los codones CUG upstream.
Todas las isoformas de alto peso molecular contienen la NLS en su extremo N-
terminal, lo que causa su acumulacin nuclear. Esta localizacin nuclear es ms
prominente en el nucleolo a pesar de que distribuye por todo el ncleo. Por el
contrario, el FGF2 18kDa, que no posee la NLS, presenta una localizacin
predominantemente citoplasmtica y es secretado al medio extracelular por
mecanismos independientes del aparato de Golgi, donde puede ejercer sus funciones
extracelulares a travs de los FGFR1-4 (Mohammadi et al., 2005c)
GFAP FGF2
GFAP FGF2
18 kD
21 kD
22 kD
18 kD
B
NUCCITC
22KD
21 kD
22 kD 21KD
18KD
39
Esquema
4.
Isoformas
del
bFGF
y
localizacin
subcelular
en
astrocitos. A, Diagrama mostrando laestructura polipeptdica con los sitios de inicio de transcripcin de las distintas isoformas del FGF2(Adaptado de Ornitz et al.); B, Inmunocitoqumica para la GFAP (verde) y FGF2 (rojo) mostrando lalocalizacin predominantemente nuclear de FGF2 en astrocitos primatios en cultivo, identificados porla deteccin de GFAP. C, Western Blot de fracciones nucleares y citoslicas de astrocitos. El FGF2de 18kD es exclusivamente citoslico y el ncleo est enriquecido en isoformas de alto pesomolecular.
5/19/2018 REGULACION DE LA PLASTICIDAD ASTROCITARIA
46/221
INTRODUCCIN
Las isoformas de alto peso molecular se expresan de manera especfica de tejido
detectndose in vivo en el cerebro y corazn entre otros tejidos y ejercen funciones
intracrinas en las clulas que los expresan. Su funcin es poco conocida pero parece
tener un papel en la regeneracin y la supervivencia de los tejidos en los que se
expresa, a travs de la interaccin con otras protenas como el factor antiapopttico
Api65 o factores de splicing como SMN ( survival of motoneurons) (Claus et al.,
2003;Gringel et al., 2004), lo que hace pensar que algunas de las funciones intracrinas
del FGF2 de alto peso molecular podran acontecer a travs de la regulacin del
splicingde diversos trnscritos.
3.3.3 Secrecin del FGF2
La mayora de factores solubles de origen pep