Regeneration de la pulpe dentaire par ingenierietissulaire : mise au point dune "pulpe equivalente"

Jean-Baptiste Souron

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Jean-Baptiste Souron. Regeneration de la pulpe dentaire par ingenierie tissulaire : mise aupoint dune "pulpe equivalente". Human health and pathology. Universite Rene Descartes -Paris V, 2013. French.< NNT : 2013PA05T059> . < tel-00931703>

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1

Universit Paris Descartes

Ecole doctorale : GC2ID

Laboratoire de Pathologies, Imagerie et biothrapies orofaciales, EA 2496

Rgnration de la pulpe dentaire par

ingnierie tissulaire: u]}]v[v

pulpe quivalente

Par Jean-Baptiste SOURON

Thse de doctorat de Biologie Cellulaire

Dirige par Madame le Dr S. VITAL, Madame le Pr C. CHAUSSAIN

Prsente et soutenue publiquement le 25 novembre 2013

Devant un jury compos de :

MANZARES Cristina, PR Rapporteur

TASSERY Herv, PU-PH Rapporteur

LETOURNEUR Didier, DR Examinateur

POLIARD Anne, PR Examinateur

VITAL Sibylle, MCU-PH Examinateur

CHAUSSAIN Catherine, PU-PH Examinateur

2

3

Table des matires

INDEX DES ABRVIATIONS .......................................................................................................... 5

INDEX DES FIGURES ....................................................................................................................... 6

CONTEXTE SCIENTIFIQUE ............................................................................................................ 7

I. LA PULPE DENTAIRE............................................................................................................ 11

A. Elments cellulaires de la pulpe ...............................................................................................................13 1. Les fibroblastes .....................................................................................................................................13 2. Les odontoblastes .................................................................................................................................13 3. Les cellules immunitaires. .....................................................................................................................14 4. Les cellules souches pulpaires ...............................................................................................................15

B. Matrice extracellulaire de la pulpe ...........................................................................................................20

C. Vascularisation .........................................................................................................................................21

D. Innervation ...............................................................................................................................................22

E. Pathologies du parenchyme pulpaire. ......................................................................................................23 1. Etiologie des pathologies pulpaires .......................................................................................................23 2. Inflammation ........................................................................................................................................25

II. ENJEUX DE LA REGENERATION .................................................................................... 27

A. d]uv(}u]}v[v}vv]v].......................................................................................29

B. Rgnration partielle in situ de la pulpe ................................................................................................30

C. La synthse de novo de la pulpe: .............................................................................................................31

D. Ingnierie tissulaire ..................................................................................................................................32

E. Rgnration partielle de la pulpe ...........................................................................................................33

III. MATERIEL ET METHODES .............................................................................................. 36

A. Matriel ....................................................................................................................................................37 1. Cultures cellulaires................................................................................................................................37 2. Prparation des matrices ......................................................................................................................38 3. DPo[}v-Indium 111 ...........................................................................................................38

B. In vivo .......................................................................................................................................................39 1. Implantation ectopique ........................................................................................................................39 2. Implantation dans la dent .....................................................................................................................39

C. dZv][]uP] .............................................................................................................................40 1. scanner ...............................................................................................................................................40 2. SPECT ....................................................................................................................................................40 3. Autoradiographie ..................................................................................................................................41

4

D. Analyse histologique ................................................................................................................................41 1. }o}]}vo[, uov-osine ..............................................................................................................41 2. Coloration au Trichrome de Masson .....................................................................................................42 3. Immunohistochimie ..............................................................................................................................42

IV. RESULTATS ......................................................................................................................... 44

A. Mise au point du modle .........................................................................................................................45 1. Prlvement et culture de cellules pulpaires de rat ..............................................................................45 2. Mise au point de la culture en 3D .........................................................................................................45 Implantation ectopique ................................................................................................................................47 3. D]}]vu}o[]uov]}vvou}o] ...........................................................48

Suivi des cellules par imagerie nuclaire...........................................................................................................52 Cytotoxicit du marqueur .............................................................................................................................52 4. Suivi des cellules marques...................................................................................................................53

B. Fonctionnalit du tissu .............................................................................................................................57 1. Analyse histologique .............................................................................................................................57 Analyse en CT .............................................................................................................................................58

V. DISCUSSION ............................................................................................................................ 60

A. Protocole ..................................................................................................................................................61

B. Suivi et devenir des cellules implantes ...................................................................................................63

C. Limites du modle ....................................................................................................................................64

D. Transfert vers la clinique humaine ...........................................................................................................65

VI. CONCLUSION ....................................................................................................................... 67

VII. BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................ 69

VIII. LISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS : ........................................... 76

IX. ANNEXE I .............................................................................................................................. 77

X. ANNEXE II ................................................................................................................................ 86

5

BMSCs : Bone Marrow Stem Cell

CGEP : Calcitonin Gene Related Peptide

CT : Computed Tomography

d : dentine

DMEM : Dulbecco/Vogt modified Eagles minimal essential medium

DPSCs : Dental Pulp Stem Cells

FvW : Facteur von Willebrandt

iDCs : Interdigitating dendritic cell

LB : Lymphocyte B

LPS : Lipopolysaccharide

LT : Lymphocyte T

MAP-kinase : Mitogen-activated protein kinase

MEM : Eagles minimal essential medium

MMP : Mtallo-protase

NFkappaB : Nuclear Factor kappa B

Od : Odontoblastes

PCNA : Proliferating Cell Nuclear Agent

PGA : Polyglycolic Acid

SHED : Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous

SPECT : Single photon emission computed tomography

SVF : Srum de veau ftal

TLR : Toll Like Receptor

W : Zone de Weil

6

Figure 1 : Coupe histologique de dentine et de pulpe ............................................................. 12 Figure 2 : Dentine observe au microscope lectronique balayage ..................................... 14 Figure 3 : DPSCs en culture ....................................................................................................... 16 Figure 4. Marquages par immuno-histochimie de protines des BMSCs et DPSCs ................. 16 Figure 5 : Immnunomarquage de DPSCs. ................................................................................. 17 Figure 6 : Analyse par cytomtrie de flux des marqueurs cellulaires et microphotographie .. 18 &]PW}Z]}o}P][vv]Pv}] vo] ]o~^ovBender) ..................................................................................................................................... 24 &]PW}Z]}o}P][vv]Pv}] vo]] ]o~^ovBender) ..................................................................................................................................... 24 &]PW}Z]}o}P][vvv } ~^ovv .............................. 25 Figure 10 : Cellules pulpaires de rat en culture (P0) ................................................................ 45 Figure 11 : Analyse de la prolifration cellulaire dans les matrices de collagne .................... 46 &]PW/uP]^Wdld[v]uPoooo]vvmatrice collagnique ................................................................................................................ 46 Figure 13 : Imageries obtenues par Beta imager ..................................................................... 47 &]PW}[vu]ooo] ]uov v}-cutan chez le rat .............. 47 Figure 15 : Coupe histologique de matrice implante (coloration au Rouge Sirius) ............... 48 Figure 16 : Schma prsentant les diffrents matriaux implants ........................................ 49 Figure 17 : Perforation du plancher pulpaire ........................................................................... 49 Figure 18 : Pulpotomie sans perforation .................................................................................. 50 Figure 19 : Interface matrice / silicate de calcium (coloration hmalun-osine) .................... 50 Figure 20 : Technique dimplantation des matrices dans la premire molaire maxillaire de rat aprs pulpotomie ..................................................................................................................... 51 Figure 21 : Image de CT juste aprs un essai dimplantation ................................................. 51 Figure 22 : Prolifration et survie des cellules pulpaires de rat avec et sans marquage radioactif ................................................................................................................................... 52 Figure 23 : Suivi par SPECT/CT dune matrice cellularise implante dans une premire molaire de rat ........................................................................................................................... 53 Figure 24. Reconstructions SPECT/CT chez un animal implant avec des cellules entires (flche rouge) et des cellules lyses (flche bleue) .................................................................. 54 Figure 25. Quantification du signal des matrices implantes avec des cellules lyses et des cellules entires. ....................................................................................................................... 55 Figure 26 : Imagerie par SPECT/CT dune tte de rat aprs implantation dans les premires u}o]u]oo]Xv]Pvo]}](v[} vZ}o}v[]uov]}vX ......................................................................................................................... 55 &]PXZ}v]}v^Wdld[v]]]}v}v]X ................................. 56 Figure 28 : Imagerie par micro-CT et coupes histologiques de matrices implantes .............. 57 Figure 29 : Immunohistochimie des matrices implantes ....................................................... 58 Figure 30 : Imagerie par micro CT des matrices implantes .................................................... 59

7

8

Ce travail de recherche a t ralis au sein du laboratoire Pathologies, Imagerie et

Biothrapies Orofaciales dirig par le P}( Z]v Z]vX :[]o[}}v]

[ (] vpremier stage en master 1, puis de pouvoir y poursuivre mon parcours de

ZZvuXD}viZZ[]v]]o}vvZ u]

historiques du laboratoire, la comprhension des mcanismes rgissant la minralisation

v]v]X:[]}uU]oo le rle de la protine pr]}vvo[}}v}PvU

via o[ [v u}o }] ]vo] } } ]vX ]o u]U }

une acquisition des bases scientifiques et techniques indispensables pour mon doctorat, la

o]]}v[v]o]vv]}voen collaboration avec une quipe amricaine de UCSF

(Annexe I).

o[] u}v u U i[] }Z] }] u}v Zu]vuv ]v](] i[]

}(] o}uv [v v}oo Z u] o}}] : le dveloppement

[v Z ] ooo]pour la rgnration pulpaire. Ce projet global est bas sur

o[]o]]}v ooo }Z o o v] } o u] }]v [vthrapie

innovante dans le traitement des pulpes inflammatoires. Nous souhaitons mettre au point

une pulpe quivalente (cellules souches msenchymateuses issues de la pulpe dentaire

ensemences dans une matrice), implantable dans la chambre pulpaire vide suite

o[ vZuo]u oUuvo P v ]}v[v]}vi}v](

fonctionnel, vascularis et innerv.

Dans ce but, nous nous sommes placs dans une optique prclinique et avons travaill

partir de cellules pulpaires de rat. v oooU [ uu o}}]

travaillaient sur des approches plus fondamentales portant sur les proprits des cellules

souches de la pulpe afin de les caractriser et de rechercher leur capacit survivre en

conditions hypoxiques et induire une angiogense. Concernant mon projet, nous avons

dvelopp une culture tridimensionnelle de ces cellules pulpaires dans un lattis de

collagne, afin de constituer une pulpe quivalente iX >[innocuit de ces matrices

ensemences de cellules pulpaires a t teste par des implantations ectopiques chez le rat.

Puis, dans une perspective prclinique, nous avons implant ces pulpes quivalentes dans un

modle de pulpotomie chez le rat.

v }v []vP v]] ]o] ] ooo }ZU v} v} }uu

penchs sur la question cruciale du devenir des cellules implantes dans un organisme. Pour

(]U v} }v ]oo v }oo}]}v o[ ]U698-IFR2 du Docteur

9

Letourneur, et notamment avec le Docteur Rouzet et Madame Petiet, (]v [(( o

suivi des cellules implantes par imagerie. Nous avons opt pour un marquage radioactif des

cellules implantes et un suivi par imagerie nuclaire, permettant une valuation trs

prcise de la migration ventuelle et du devenir des cellules implantes.

Ce travail a donn lieu une publication internationale (Annexe II).

10

11

I.

12

v o ] o u] }]v [v h pulpe quivalente , il est ncessaire de

connatre les lments natifs constitutifs de ce tissu conjonctif htrogne. Classiquement,

sur les coupes histologiques, le tissu pulpaire peut tre divis en 4 zones (Mjor, Sveen et al.

2001):

{>}v}}v}o] (Od) la priphrie, au contact de la dentine (d)

{hv}vooo]~}vt]o, W) juste en-dessous des odontoblastes

{hv}v]Zvooo

{>}vovo ] o v]v(

Figure 1 : Coupe histologique de dentine et de pulpe

Coloration au bleu de Toluidine (document EA2496).

La pulpe contient diffrents types cellulaires, des cellules drives des crtes neurales, des

cellules migratrices provenant du msenchyme para-axial et des cellules msenchymateuses

dj prsentes dans le premier arc branchial. Par ailleurs, ce tissu contient galement des

vaisseaux sanguins et des lments nerveux (Piette 2001; Goldberg 2011). La prsence de

o[vuo }o]}v ooo] }v( o oU (}v]}v v]]}vU

sensitives et de rparation. Les diffrentes populations cellulaires pulpaires jouent un rle

primordial dans la rponse aux agressions.

d Od

W

13

A. Elments cellulaires de la pulpe

1. Les fibroblastes

La zone centrale du parenchyme pulpaire }v]v]v]ouv(]}o[

fu](}u} ]v}vo]v]o(}v]}vo[ o}]}vov}oouv

la matrice extracellulaire (MEC). Ce renouvellement est assur par la synthse de fibres de

collagne de type I et III, de protoglycanes et de glycoprotines.

Les fibroblastes peuvent synthtiser des cytokines en rponse divers stimuli. Aprs

agression, ils sont aussi impliqus dans la cicatrisation des lsions pulpaires, avec par

exemple la scrtion de facteurs angiogniques (Mathieu, El-Battari et al. 2005).

Les fibroblastes, en particulier de la pulpe jeune, ont des activits de synthse et de

scrtion importantes et possdent un rticulum endoplasmique granulaire et un appareil

de Golgi dvelopps. La plupart des fibroblastes sont interconnects par des desmosomes et

des jonctions communicantes (Piette 2001; Goldberg,Smith 2004).

2. Les odontoblastes

Les cellules odontoblastiques apparaissent allonges (corps de 50 60 m) avec un noyau

basal. Elles contiennent de nombreuses organelles associes de multiples vsicules, un

rticulum endoplasmique trs dvelopp et un appareil de Golgi important, situ entre le

noyau et le front dentinaire. Elles tablissent des complexes de jonction entre elles assurant

une cohsion mcanique entre les odontoblastes et crant ainsi une vritable barrire

histologique. Ces cellules possdent un prolongement cytoplasmique (ou fibre de Tomes)

occupant un tubuli dentinaire (Figure 2) et participant activement la minralisation

dentinaire. En effet, ce prolongement contient des mitochondries, des lments du

cytosquelette (microtubules et filaments intermdiaires), et des vsicules de scrtion

permettant la synthse de la dentine (Goldberg,Smith 2004).

Les odontoblastes sont disposs en palissade au contact de la dentine (Ruch, Lesot et al.

1995). Ils participent la proprioception et la nociception (Magloire, Couble et al. 2009;

Magloire, Maurin et al. 2010; Maurin, Couble et al. 2013). Ils secrtent les dentines primaire

puis secondaire et tertiaire (Magloire, Couble et al. 2004).

14

> v]v ]u] vZ ] v o u] v o o v o[ et la

v]v}v]o[ ]}vovXYvov]v]]Uoo

en rponse aux agressions, notamment lors des processus carieux (Smith, Cassidy et al.

1995; Farges, Keller et al. 2009).

Figure 2 : Dentine observe au microscope lectronique balayage

Les tubuli dentinaires dans lesquels se logent les prolongements odontoblastiques sont observables (document EA2496).

3. Les cellules immunitaires. Plusieurs types de cellules immunitaires sont prsents dans la pulpe. La pulpe saine, non

enflamme, ne contient que des cellules dendritiques (iDc myloides), des macrophages et

des lymphocytes T (Jontell, Okiji et al. 1998). Les iDCs et les macrophages constituent

environ 8% de la population totale des cellules pulpaires avec un ratio iDCs/macrophages de

4 pour 1. Deux populations distinctes de cellules dendritiques ont t identifies dans la

pulpe saine : les cellules dendritiques CD11c+, prsentes principalement la jonction

dentine-pulpe, et les cellules dendritiques F4/80+, concentres autour des vaisseaux

sanguins du centre de la pulpe ainsi que dans la rgion sous-odontoblastique partir de

ooo oo vv (]v }o}vPuv v o }}v}oU (}] i[ o

dentine (Farges, Romeas et al. 2003). La fonction principale des iDCs est de prsenter les

v]Pv[oo}vapturs aux lymphocytes T nafs pour les activer. Cette prsentation

15

a lieu aprs maturation des iDCs dans les zones T des ganglions lymphocytes rgionaux

(Zhang, Kawashima et al. 2006).

Les macrophages pulpaires apparaissent comme de grandes cellules ovalaires

principalement localises vo}v ]o]Xvo[vZ}o}P]U]o}v

impliqus principalement dans la phagocytose et l[ o]u]v]}vooou}X

Les lymphocytes T (LTs) sont rares dans la pulpe dentaire et les lymphocytes B (LBs) y sont

exceptionnellement rencontrs. (Farges, Romeas et al. 2003).

4. Les cellules souches pulpaires

a) Origine

La prsence de cellules souches dans la pulpe a u]v ]vo[ ]

de Gronthos, au sein de pulpe de dents permanentes ; elles ont t nommes DPSCs pour

Dental Pulp Stem Cells (Gronthos, Mankani et al. 2000)X>[]v !]v]oo }

de cette nouvelle niche de cellules multipotentes dans la dent rside la fois dans la facilit

[ ooo et dans la possibilit de les conserv v [v]o]]}v (X

Quelques annes plus tard, la mme quipe a montr que des cellules souches pulpaires

taient aussi prsentes dans la pulpe des dents temporaires. Ces cellules sont alors

nommes SHED, pour Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous teeh, ouvrant ainsi la

voie une source de cellules souches unique et naturelle i (] o[(}o]]}v

physiologique des dents temporaires. (Batouli, Miura et al. 2003; Kerkis,Caplan 2012)

b) Caractristiques phnotypiques

Les cellules souches pulpaires ont un phnotype proche des cellules souches issues de la

moelle osseuse, les BMSCs (Bone Marrow Stem Cells). En culture, ce sont de grandes

cellules, fusiformes, avec un grand noyau central, un cytoplasme volumineux (Figure 3).

16

Figure 3 : DPSCs en culture

Les cellules souches pulpaires adoptent un phnotype prsentant de nombreuses similarits avec les BMSCs.

Figure 4. Marquages par immuno-histochimie de protines des BMSCs et DPSCs

Le marquage par immuno-histochimie montre la prsence des marqueurs des cellules souches et de nombreuses similarits avec les BMSCs. [(Gronthos, Mankani et al. 2000)

Au niveau immuno-histologique, les cellules souches pulpaires sont trs proches des cellules

souches de moelle osseuse (Gronthos, Mankani et al. 2000). Les marqueurs de surface

10 m

17

communs sont retrouvs (Figures 4 et 5). In vitro, ces DPSCs sont capables de se diffrencier

dans de nombreux types cellulaires, comme les BMSCs.

Figure 5 : Immnunomarquage de DPSCs.

Rpartition des diffrentes protines mise en vidence par immunohistchimie sur des DPSCs en culture. [(Gronthos, Mankani et al. 2000)

18

Figure 6 : Analyse par cytomtrie de flux des marqueurs cellulaires et microphotographie

Daprs (Eleuterio, Trubiani et al. 2013)

Phnotypiquement les DPSCs prsentent des caractristiques similaires aux BMSCs (figure

6). Les marqueurs de surface et la rpartition des protines sont galement retrouvs de

faon comparable (Figure 6)(Gronthos, Mankani et al. 2000; Gronthos, Brahim et al. 2002;

Eleuterio, Trubiani et al. 2013).

Les DPSCs prsenteraient en outre un taux de prolifration plus important que les BMSCs,

sans perte de leur multipotence (Gronthos, Mankani et al. 2000; Seong, Kim et al. 2010).

19

c) Isolation

Les techniques [isolation qui ont t utilises pour les cellules souches pulpaires sont celles

qui ont t dveloppes pour les BMSCs (Tirino, Paino et al. 2012). En raison du taux

important de prolifration des DPSCsU o[]}o]}v partir de cette proprit a t propose

par (Gronthos, Mankani et al. 2000)X/o[P][]v]]o]oooo, de les ensemencer

et de slectionner les clones ayant le taux de prolifration le plus important. Ce taux de

renouvellement important est maintenu au-del de 25 passages (Rodriguez-Lozano, Insausti

et al. 2012).

Diffrents marqueurs sont proposs pour caractriser les cellules souches pulpaires

humaines (Kawashima 2012), pour la plupart communs aux BMSCs, savoir OCT3/4, CD90,

^dZKY Les marqueurs de surface caractristiques des cellules souches peuvent alors tre

utiliss pour slectionner les cellules par tri au FACS ou grce des anticorps fixs des billes

(Kawashima 2012). Cependant, ]ov[]u ](]DPSCs.

d) Diffrenciation

In vitro, les DPSCs sont capables de se diffrencier dans tous les types de lignes

germinales (Kawashima 2012):

De nombreux protocoles permettent la diffrenciation des DPSCs vers les cellules neurales

(Kim, Bae et al. 2012; Fang, Yang et al. 2013). La diffrenciation en neurones a pu tre

obtenue (Arthur, Rychkov et al. 2008).

Les DPSCs peuvent se diffrencier en cellules issues de la ligne msodermique : myocites,

ostoblastes, chondrocytes, adipocytes et cardiomyocytes (Jo, Lee et al. 2007; Koyama,

Okubo et al. 2009; Gronthos, Arthur et al. 2011; I, Nargi et al. 2011)

La ligne endodermique (cellules hpatiques) est aussi obtenue par diffrenciation des

DPSCs (Iohara, Zheng et al. 2006; Rodriguez-Lozano, Insausti et al. 2012)

In vivo, ces capacits de diffrenciation ont t utilises lors de la mise en place de cellules

neurales diffrencies partir de DPSCs au niveau de lsions du cerveau chez le rat (Kiraly,

Kadar et al. 2011). Plus spcifiquement, les DPSCs ont montr leur capacit se diffrencier

dans de nombreux types de cellules pulpaires. Un point important est leur capacit se

diffrencier en cellules odontoblastiques synthtisant de la dentine (Yu, Deng et al. 2006;

Onyekwelu, Seppala et al. 2007)

20

B. Matrice extracellulaire de la pulpe A ct des lments cellulairesU o o }v] [v DU v]oouv

compose de collagnes (34%), au premier rang desquels le collagne de type I et de type III.

Les collagnes de type V, VII et IV sont galement retrouvs dans un plus faible pourcentage

(Goldberg 2008).

Les glycosaminoglycanes constituent, quant eux, 50 % des molcules matricielles pulpaires

et ont pour rle pr]v]o [ o v]}v [ (Bogovic, Nizetic et al. 2011). Les

diffrents types retrouvs sont :

- Chondrotines sulfates 4 et 6

- Dermatane sulfate

- Kratane sulfate

- Hparane sulfate

- Acide hyaluronique ou hyaluronane

Tableau 1 : Composants matriciels de la pulpe

[(Goldberg 2008)

Les glycoprotines principalement reprsentes par les fibronectine, tnascine et

thrombospondine, jouent un rle dans la liaison des fibroblastes au rseau fibrillaire

collagnique. La fibronectine aurait un rle dans le maintien de la morphologie spcifique

des odontoblastes, dans leur diffrenciation terminale et dans les interactions entre cellules

(Bender, Seltzer et al. 2003).

21

>[ lastine est prsente au niveau des vaisseaux sanguins o[ o]] }]

(Piette 2001).

Les mtallo-protases matricielles jouent un rle de dgradation des protines

extracellulaires. Elles participent donc aux processus de remodelage de la pulpe normale et

aux phnomnes inflammatoires et cicatriciels (Bogovic, Nizetic et al. 2011)

}u}]]}v o D u o u]v]v o[Z]}v }lP

u}o o [X oo }] o v] u }o]Udes nutriments, des dbris

cellulaires, entre les vaisseaux et les cellules pulpaires (Goldberg, Six et al. 2009)

C. Vascularisation La pulpe dentaire est un tissu richement vascularis. Les vaisseaux sanguins pntrent dans

la pulpe par les foramens apicaux et secondaires. Ils progressent au centre du canal

radiculaire en direction de la chambre pulpaire o ils se ramifient progressivement pour

former en priphrie un fin rseau de capillaires sous-odontoblastiques de 5 10 m de

diamtre. [ ]U ]oo ]v( ]U v v v o ulpe par les

canaux accessoires (Trubiani, Tripodi et al. 2003). Au niveau de la couronne, les artrioles

principales se ramifient en artrioles secondaires qui se ramifient leur tour pour former

la priphrie de la chambre pulpaire un vaste rseau de capillaires vasculaires (5-uX Ces

capillaires sont fenestrs proximit des odontoblastes ce qui permet une meilleure

diffusion des nutriments. Les vaisseaux sanguins pntrent dans la pulpe et en sortent par

l (}uv ]o }v] } o (}u [v } (}] ]}o ~-u

passant au centre du canal de la racine.

Le retour veineux se fait galement par le foramen apical. Il est assur par des veinules post-

capillaires qui se regroupent pour former des veinules collectrices dans la partie centrale du

canal radiculaire.

>[]v [v}u} ]}]vU }]v }uuv]]}v ] v o

cts veineux et artriels de la circulation contribuent la rgulation du dbit sanguin et de

la pression intrapulpaire et uv ]o(ovP]v[]}ovvv

de lsion.

> v [v oymphatique pulpaire i}[Z] X ^o}v ]v

(Marchetti, Poggi et al. 1992; Sawa, Yoshida et al. 1998), ce rseau prendrait naissance dans

la rgion sous-odontoblastique. Les vaisseaux lymphatiques conflueraient vers la partie

22

centrale et sortiraient de la pulpe par le foramen apical. Le drainage lymphatique

s[((rait vers les ganglions sous-mentonniers et sous-mandibulaires, puis vers les

gangliov]X[uovu}vo[vrseau lymphatique au

sein du parenchyme pulpaire (Gerli, Secciani et al. 2010; Martin, Gasse et al. 2010).

D. Innervation Le rseau nerveux pulpaire est essentiellement constitu de fibres sensitives issues du nerf

trijumeau dont les corps cellulaires se trouvent dans le ganglion de Gasser. Les fibres

pntrent dans la pulpe par le foramen apical et les canaux accessoires et se regroupent au

centre du canal radiculaire pour former de volumineux faisceaux qui se ramifient dans la

chambre pulpaire o ils se terminent sous l (}u [v v (] v

appel plexus pulpaire sous-odontoblastique (ou plexus de Rashkow) (Bletsa, Fristad et al.

2009; Magloire, Couble et al. 2009). Si la plupart des fibres nerveuses sensitives se terminent

dans ce plexus, certaines }o}vPvi[o]oo[}}v}opntrent

v o v]vU ] v o v]v v ]v [v]}v u]rons (Maeda,

Iwanaga et al. 1987). Les fibres nerveuses pulpaires sont pour la plupart des fibres

amyliniques de type C qui reprsentent 70 90 % des fibres nerveuses des dents dfinitives

et temporaires. Ce sont des fibres chimio et thermosensibles, actives essentiellement au

} o[]v(ouu]}v o], transmettant la douleur. Elles librent galement un

certain nombre de neuromdiateurs, en particulier la substance P. La pulpe contient

galement des fibres A-w ]uo] oo ] v o vu]]}v }o}X oo

seraient stimules par le dplacement du fluide intratubulaire. Des fibres myliniques A-t

ont t mises en vidence dans la pulpe. Elles pourraient tre impliques dans la

transmission de sensations non douloureuses engendres par des stimulations dentaires de

trs faible intensit, de type vibratoire (Piette 2001). Ces fibres sont donc responsables de la

sensibilit pulpo-dentinaire observe en rponse des stimuli mcaniques, thermiques

chimiques ou lectriques.

Des fibres sympathiques originaires du ganglion cervical suprieur sont galement prsentes

dans la pulpe mais en quantit moins importante. Ce sont principalement des fibres

noradrnergiques qui rgulent la circulation pulpaire grce leurs effets vasoconstricteurs.

23

E. Pathologies du parenchyme pulpaire.

1. Etiologie des pathologies pulpaires Les pathologies endodontiques trouvent leur origine dans trois types dagression :

- bactriennes

- physiques

- chimiques

Les bactries constituent la cause majeure de pulpite. Les toxines bactriennes et les

bactries peuvent entrer en contact avec le parenchyme pulpaire via les tubuli dentinaires

o}[vo ]}v]}[v}]]}vo]X >[ Z((uvpar les instruments,

o}P[vo ]}v]}o ]}v[vv]ante, peut galement

!o[}]P]v[v]v(ouu]}vo]. La section des prolongements odontoblastiques

o[]vuv]}v}]}}ooPP}l]v}-inflammatoires

par les odontoblastes.

Un nombre important de classifications concernant les pathologies pulpaires et priapicales

existe : histologiques, radiographiques, cliniques.

La classification clinique apparat comme la plus adapte car elle est directement oriente

vers lindication ou la contre-indication du traitement. Le diagnostic de ltat pathologique

pulpaire ou priapicalU[]o}v]une tape essentielle, reste difficile poser. En effet, il

est bas sur lanalyse des informations obtenues par l[v]v o patient et les

rsultats des tests cliniques effectus. /ov[}v}i}correspondance entre ce

]Pv}]o[ ]v(ouu}]vZuo](Fadavi,Anderson 1996).

a) Pulpite rversible Cliniquement, la dent est le plus souvent asymptomatique. Dans les cas les plus avancs, des

douleurs sont observes au contact dun agent irritant (froid, sucre, acide). Elles sont

caractrises par leur brivet et leur faible amplitude. Le plus souvent ces sensations

douloureuses sont associes au froid. > } ]v(ouu}] ]oU ] o[Pv

causal est limin et une tanchit par restauration est obtenue.

24

Figure 7: Coupe Z]}o}P][vv]Pv}] vo]versible (Seltzer and Bender)

Au niveau histologique, la pulpite rversible est caractrise par un infiltrat inflammatoire

faible, une vasodilatation proximit de la zone lse, comme le montre la figure 7.

b) Pulpite irrversible

Les douleurs associes ce degr dinflammation de la pulpe sont gnralement

spontanes. Elles sont aussi caractrises par leur rmanence, leur intensit leve et leur

irradiation. Ces douleurs sont la plupart du temps rcalcitrantes tout traitement

mdicamenteux. Dans les stades les plus avancs, une desmodontite est associe, rendant la

dent douloureuse la percussion.

Figure 8 : CoZ]}o}P][vv]Pv}] vo]]versible (Seltzer and Bender)

La pulpite irrversible est caractrise histologiquement par un infiltrat inflammatoire

important, des zones limites de ncrose et une vasodilatation tendue au parenchyme

pulpaire (figure 8).

25

c) Ncrose pulpaire

v o[v ]uvU o[ }o]}v o o] }v] o v } vZu

pulpaire. Ce stade est caractris par une absence de symptme et de rponse aux

diffrents tests de vitalit. Il peut ou non tre associ la prsence de lsions des tissus

priapicaux en raison de la prsence de dbris ncrotiques et de bactries dans le systme

canalaire.

Figure 9 : Coupe Z]}o}P][vvv } (Seltzer and Bender)

La ncrose pulpaire est caractrise histologiquement par de larges zones de ncrose

tissulaire, un envahissement bactrien et la prsence de cellules de dfense lyses (Figure

9).

2. Inflammation

Les odontoblastes, localiss la priphrie de la pulpe sont les premires cellules

rencontrer les bactries et leurs produits. Les odontoblastes sont des cellules

immunocomptentes capables de dclencher une rponse inflammatoire (Veerayutthwilai,

Byers et al. 2007). Lorsque la progression bactrienne parvient au-del de la barrire

odontoblastique, les interactions bactries-cellules augmentent et exacerbent les ractions

inflammatoires.

26

Les rcepteurs TLRs (Toll like receptors) prsents sur les membranes cellulaires et des

endosomes, dtectent les composants bactriens et dclenchent la raction inflammatoire

o[]]}v(vuclaire kappaB (Pevsner-Fischer, Morad et al. 2007).

La scrtion de cytokines pro-inflammatoires par les cellules actives et le relargage par la

dminralisation dentinaire cre un gradient chmotactique, recrutant et activant les

cellules du systme immunitaire (Reing, Zhang et al. 2009; Kokkas, Goulas et al. 2011)

Les cellules de dfense infiltrant la pulpe, les lymphocytes B et T, les plaquettes, les

neutrophiles et les macrophages augmentent en nombre au fur et mesure que la lsion

progresse. Paradoxalement, l[] oooprovoque des dommages au tissu car les

cellules relarguent des enzymes protolytiques digrant la MEC pour atteindre la zone

lse. De plus, ces cellules librent des radicaux libres, des enzymes notamment des MMPs

(( o o } ]vU o[E o o]]X >[}]]}v ooo

molcules peut induire ncrose ou apoptose par activation de la voie des MAP-kinase ou la

voie du NFkappa B (Fiers, Beyaert et al. 1999; Simon, Berdal et al. 2011). Les activateurs de

}] ]Pvo]]}vU o ooo]U o[}]]}v >W^ ]v o Z}

Zu]U]]vo[]v(ouu]}vo](Guha,Mackman 2001).

>o ]oo]v}vvv}uo}o[]v(ouu]}v

o]X > }]o]}v o} o }v ]v(ouu}] u o[} ooo

immunitaires et de progniteurs privasculaires (Sloan,Smith 2007; Toda, Ayajiki et al. 2012)

>[]vv]}v v] ]] ] o }v ]v(ouu}]X >} [v ]v(ommation

neurognique, les nerfs affrents ragissent aux antignes bactriens par le relargage de

neuropeptides qui recrutent et activent le systme immunitaire (Caviedes-Bucheli, Munoz et

al. 2008; Cooper, Takahashi et al. 2010; Manuja, Nagpal et al. 2010). Plusieurs neuropeptides

ont une action reconnue dans ces mcanismes inflammatoires : les Calcitonin Gene Related

Peptide (GRP),Calcitonine (CT),Substance P (SP) sont retrouves dans les pulpes

inflammatoires.

Si le processus inflammatoire pulpaire est relativement bien connu au niveau histologique,

oo]v]vuv}vvoP []v(ouu]}v]pulpaire.

La mise au point de moyens diagnostiques complmentaires aux tests de vitalit

constituerait une tape intressante pour la mise en place de traitement de rgnration

pulpaire.

27

II.

28

>[]v(]}vo pulpe dentaire cause par la carie ou par un traumatisme, ncessite souvent

un traitement endodontiqueX ]uv } [ o]u]v o[vuo

parenchyme pulpaire vascularis et innerv, les bactries et leurs toxines. Le nettoyage par

des agents chimiques est associ une mise en forme mcanique du rseau canalaire afin

[}v] o ]v(]}v vo]X > u]v]v v o u

dsinfection est recherch par une obturation tanche et complte du rseau canalaire par

un matriau inerte.(Huang 2008; Huang 2009).

Malgr un succs clinique rapport, les tudes valuant les traitements endodontiques

u}vv[ Z]u}vUv]}v9]uv]v](]v

uv [ vZ ] U }vu]v]}v ]vv } ]v Z}o}P]

infectieuses ou inflammatoires de la pulpe. v((Uo}uo] o[v}u]]o]

cre des zones non instrumentables, peu accessibles aux solutions de dsinfection

(Robinson, Lumley et al. 2012) }] [}]}v vo]XUne dent traite

endodontiquement a 5 10 fois plus de risques de prsenter une lsion apicale

(Buckley,Spangberg 1995; Friedman, Abitbol et al. 2003) induisant un essaimage bactrien

}v}v]vP(( ]vvv}Pv]o~U]vU]o]}vXXXX

oU (] o[v [} vP]v e la disparition de la proprioception, les

proprits de rsistance de la dentine aux pressions axiales diminuent, conduisant

o[]]}v (]U ] ( ]peuvent condamner o v o[]}v. En

outre, la perte de vitalit pulpaire des dents permanent]uu ]uo] o[! o

formation de la dentine et la maturation de la dent.

Ainsi, les recherches actuelles en endodontie travaillent la mise au point de mthodes

alternatives, efficaces, fiables et sres (Nakashima,Akamine 2005; Murray, Garcia-Godoy et

al. 2007). Il existe notamment une volont de crer des alternatives biologiques au

traitement endodontique, avec le dveloppement de o[endodontie rgnratrice , visant

o[ o]u]v]}v ] o] ]v( } v } o uouv v ]

pulpaire rgnr pour revitaliser les dents.

De nombreux scientifiques et dentistes travaillent ensemble la ralisation de ce projet

ambitieux (Tziafas 2004; Nakashima,Akamine 2005; Huang 2009; Sun, Jin et al. 2011; Rai,

Kaur et al. 2012; Iohara, Murakami et al. 2013; Masthan, Sankari et al. 2013), dont le but

ultime de ce traitement rgnrateur vise reconstituer le continuum de tissu la frontire

29

pulpe-dentine en rgulant les procds spcifiques de dentinogense tertiaire (Tziafas

2004).

Bien que le potentiel de rgnration de la pulpe dentaire ait t considr pendant

longtemps comme extrmement limit, en particulier dans les dents matures, les avances

dans le domaine de lingnierie tissulaire et les connaissances de la biologie des cellules

souches favorisent i}[Z]lmergence de la diversit des approches pour la

rgnration dune pulpe fonctionnelle.

A. Traitement

Comme voqu plus haut, il est dsormais dmontr quune population de cellules

prognitrices se trouve au sein de la pulpe dentaireU[oovdiffrencier en cas

[P]}v o]X ]v]U oodontoblastes dtruits peuvent tre remplacs par de

nouvelles cellules pseudo-odontoblastiques (odontoblast-like), issues de la diffrenciation

des cellules mesenchymateuses indiffrencies (Nakashima,Akamine 2005; Huang 2008;

Huang 2009; Huang, Gronthos et al. 2009; Scheller, Krebsbach et al. 2009; Sun, Jin et al.

2011).

Les thrapeutiques de maintien de la vitalit pulpaire (}u]}v [v }vde dentine

rparatrice, aprs une lsion pulpaire rversible, reposent sur ce principe. Cependant, le

}v}] [v coiffage pulpaire dans les cas de caries dentinaires profondes ou de

traumatismes reste assez imprvisible et doit donc tre limite quelques cas bien

slectionns (Bashutski,Wang 2009). En effet, les rsultats de cette thrapie sont trs

dpendants du type [((]}vo]Uo[ ]v(ouu}]ooUde lge de la

dent, des modalits de traitement (choix du matriau de coiffage) et de ltanchit de la

restauration (Mjor 2002; Murray, Windsor et al. 2002; Ward 2002; Murray, About et al.

2003; Tziafas 2004). De plus, le diagnostic clinique d P []v(ouu]}vpulpaire est

o] }U ]o v[] actuellement de lignes directrices fondes sur la preuve,

permettant aux cliniciens de dterminer quels cas mritent dtre traits par coiffage

pulpaire (Huang 2008; Sun, Jin et al. 2011). (]U ]o v[ o v ]vi

traites ncessitent ensuite un traitement endodontique.

Les progrs dans la comprhension de la composition molculaire et des

mcanismes cellulaires qui rgulent la dentinogense offrent de nouvelles voies de

30

recherche rgnrative, dans lesquelles la pulpe endommage est limine

partiellement ou entirement et remplace par un tissu pulpaire sain issu de la rgnration

pulpaire. AinsiU]o[P]]vP la rgnration partielle in situ de la pulpe, de la

synthse de novo et donc du remplacement total de la pulpe (Nakashima,Akamine 2005;

Huang, Gronthos et al. 2009; Sun, Jin et al. 2011).

B. Rgnration partielle in situ de la pulpe

Les biotechnologies visant la rgnration partielle de la pulpe sont bases sur

lobservation que linflammation pulpaire est compartimente dans un premier temps avant

que lensemble du tissu ne soit concern (Huang 2008; Huang 2009; Huang, Gronthos et al.

2009). Les donnes actuelles suggrent que la partie saine de la pulpe pourrait non

seulement tre conservable mais surtout avoir le potentiel pour rgnrer la partie perdue

(Huang 2009). Afin de favoriser cette rgnration, des dispositifs mdicaux inductifs ou des

pulpes artificielles, constitues de DPSCs peuvent tre insrs dans lespace pulpaire libr

pour faciliter la rcupration totale du tissu et la gnration d[vv}oov]v(Huang

2009; Sun, Jin et al. 2011).

Avant u!u o[]v](]]}v DPSC, la rgnration pulpaire a t tudie

en utilisant des modles in vitro et in vivo de culture de cellules pulpaires

sur des polymres synthtiques dacide polyglycolique (PGA) (Mooney, Powell et al. 1996;

Bohl, Shon et al. 1998; Buurma, Gu et al. 1999). Ces tudes ont } oo[]vP v]]

tissulaire pulpaire en montrant que des tissus apparents la pulpe pouvaient tre ainsi

obtenus in vitro (Mooney, Powell et al. 1996; Bohl, Shon et al. 1998) []o]]vo}

[]uov]}v }] }-cutanes chez la souris immunodprime (Buurma, Gu et

al. 1999). Depuis, les connaissances sur les cellules prognitrices de la pulpe, ont permis de

diffrencier les cellules souches afin leur faire synthtiser de la dentine in vitro puis in vivo

aprs implantation dans une canine de chien (Iohara, Nakashima et al. 2004). >[]o]]}v

matrices implantables, ensemences de cellules souches, a permis de rgnrer trs

partiellement des pulpes lses chez le chien (Huang, Yamaza et al. 2010).

Techniquement, cette approche consiste liminer le tissu pulpaire camral puis mettre

en place dans la chambre pulpaire une matrice cellularise ou non cellularise ralise au

31

pralable. In vitroUo o]]}v[v]}]vovZuo] lis.

Deux modles de rgnration pulpaire partielle ont t proposs et expriments chez

o[v]uoX > u] u}o }v] ]uov v o} W^ }o}P v]

[v o}}u] ]ooU o }v u v o v u] }ooPne

ensemence de cellules souches tries (CD31-, CD146-) dans la chambre pulpaire aprs

o}}u]Zo[v]uoX

E} }Z o P v ]}v o] [ }v }vv o P v ]}v

]ooU }v o u] v uo o ]uoX hv fois la rgnration partielle

matrise, la meilleure comprhension des mcanismes molculaires de cicatrisation

u[}ovZv}}oov]X

Les concepts dingnierie tissulaire appliqus la pulpe dentaire ont t tudis in vitro et in

vivo (Mooney, Powell et al. 1996)X > }ooPv }v] o[ o uv ]v]o o u]

extracellulaire de la pulpe dentaire o[]uov]}vin vivo de matrices collagniques

ensemences de cellules ont montr la possibilit de vascularisation de ces matrices. Afin de

ne pas crer une inflammation lie la dgradation de produits de la matrice, le collagne

de type I semble parfaitement adapt.

> ]uv o]]}v }v }} o} []v o] v

permanentes immatures. Cette technique semble intressante mais limite aux dents trs

immatures. La nature du tissu prsent dans le canal et l }]]o] [oo}vPuv

]o] (}v o[}i (Neha, Kansal et al. 2011; Nosrat, Seifi et al. 2011;

Andreasen,Bakland 2012)

C. La synthse de novo de la pulpe:

Lorsque le tissu pulpaire est entirement dtruit, la synthse de novo de la pulpe doit avoir

lieu dans le but de rgnrer le tissu. Le volume de la pulpe mature est trs faible (environ

10-oU}v vUo P v ]}voo]!o]uvo]uo

que celle pour les grands organes ou de tissus. Cependant, ce tissu est considr comme un

tissu difficile concevoir et rgnrer en raison des caractristiques suivantes: 1) une

situation unique anatomique des tissus de la pulpe contenus dans une cavit ayant un

foramen apical troit, compliquant langiogense lors de lingnierie tissulaire; 2) la structure

32

du tissu pulpaire, les diffrents types de cellules (par exemple, les odontoblastes) en

diffrents couches et zones dinnervation.

Rcemment, plusieurs quipes ont montr la faisabilit de o[implantation et de la survie de

cellules dans la dent in vivo. >[ ][,vP(Huang 2009) a montr la ralisation de tissu

u]v o] o[]uov]}vooo}}vovZuo]ov]v

chien. Iohara et al (Iohara, Murakami et al. 2013) montrent une rgnration pulpaire

]](( vooo}ZUouv[}v]v]o]re vascularis

et innerv.

D. Ingnierie tissulaire Un type de cellules msenchymateuses souches de la pulpe dentaire humaine a t

identifie par Gronthos et Shi (Gronthos, Mankani et al. 2000). Ces cellules ont t nommes

o[ ]}v v]U ooo }Z o] ~W^ }v u}v o ]

former un complexe dentine/odontoblaste in vitro. En dehors des DPSC, plusieurs autres

types de cellules souches ou prognitrices de tissus dentaires ont t isols et caractris, ce

sont les cellules souches des dents de lait exfolies (SHED), les cellules souches du ligament

(PDLSCs), des cellules souches de papille apicale (SCAPs) et les cellules souches du follicule

(DFPCs). De nombreuses tudes in vitro montrent le potentiel de diffrenciation des cellules

souches pulpaires en de trs nombreux types cellulaires (Kim, Xin et al. 2010). In vivo, ces

cellules ont aussi dmontr leur capacit de rgnration tissulaire. Les cellules souches

pulpaires ont t utilises pour la rgnration osseuse (dAquino, Graziano et al. 2007;

Graziano, dAquino et al. 2007). La rparation du muscle cardiaque a t permise par des

cellules souches dentaires (Gandia, Arminan et al. 2008). }vo[]o]]}v

de cellules souches dentaires dans les dystrophies musculaires ont t ralises (Kerkis,

Ambrosio et al. 2008). Plus rcemment in vivo, les DPSCs ont t utilises pour la

rgnration tissulaire nerveuse (de Almeida, Marques et al. 2011). Au niveau dentaire, des

cellules souches pulpaires ont t utilises pour rparer des dfauts osseux parodontaux

(Mohamadreza, Khorsand et al. 2012).

i}[Z]U ](( v }] ] }}v }}v o ooo }Z

pulpaires (Genecell Internationalfi, USA) issues de dents extraites. Les cellules conserves

pourraient ainsi tre utilises dans le cadre de thrapies impliquant les cellules souches.

33

W} o u}uvU }] ] v[]v]vvvpas en France et dans la plupart des

pays europens. Ces banques de cellules permettraient un accs rapide aux cellules et la

ralisation en un dlai court de matrices implantables chez les patients.

La thrapie cellulaire est efficace pour la rparation de dfauts de taille importante.

>[}Zooo souches fournit de meilleurs rsultats en raison de leurs capacits de

division et de diffrenciation en rponse des signaux micro-environnementaux. En raison

de ces caractristiques, o[uo}] de cellules souches pulpaires en vue de la rgnration

pulpaire parat tre la meilleure voie.

E. Rgnration partielle de la pulpe

Cette technique repose sur le fait que linflammation pulpaire reste compartimente un

certain temps, avant que lensemble du tissu ne soit atteint (Huang 2009). Les donnes

actuelles suggrent que la partie saine de la pulpe pourrait tre conserve et aurait, de plus,

le potentiel pour rgnrer la partie perdue (Huang 2009). Afin de permettre cette

rgnration, des dispositifs mdicaux inductifs ou }v]}v[]vP v]]]o]

de pulpe bases les DPSC, peuvent tre insrs dans lespace pulpaire (Huang 2009).

>[vP]}Pvo[un des points clefs pour la survie des matrices implantes dans la dent,

mais elle est complique par le faible diamtre du foramen apical. La conservation du

parenchyme pulpaire canalaire permet de [la vascularisation radiculaire dj en

place et de mettre la matrice directement en contact avec les vaisseaux prsents.

34

III.

35

]o []v] v v }i Po}o o}}] []vP v]] }}(]o ]

cellules souches msenchymateuses. Il a pour buts de poser les jalons de la rgnration

o]U o u] }]v [v o ]ov ]uov v v u}o

murin. Nous nous sommes placs dans un contexte de rgnration pulpaire partielle, en

utilisant une population de cellules pulpai Z }PvX W} o[vuo

manipulations in vivo, nous avons travaill en allogreffe.

36

IV.

37

d} o }}}o [ ]uv]}v v]uo }v oouv

approuvs par le comit [ Z]o[hv]] W]~EXXXX

A. Matriel

1. Cultures cellulaires

Les cellules pulpaires sont pralablement culti v]uv]}v[o}}}o

Gronthos et coll. (Gronthos, Mankani et al. 2000), vo[]uov]}vvou]

collagne.

Cellules pulpaires humaines

o[}]vUvP]es (patients en bonne sant gnrale,

gs de 18 30 ans) sont collects dans les centres hospitalo-v]]] o[Z]o

}vv W] o[Z]o >}]-Mourrier Colombes. Les surfaces dentaires sont

dsinfectes avec une solution de polyvidone iodine (Betadinefi). Dans un environnement

strile, les dents sont ( oov]]}o ] vo}[uu

de large. Ces blocs sont incubs 4C pendant 1h dans une solution de PBS 1X, 1%

fongizone, 1% pnicilline/strptomycine puis 2h 37C dans une solution de PBS 1X,

collagnase de type I, 3mg/ml (Wothington Biochem, Freehold, NJ) et dispase, 4 mg/ml

~}Z]vPU DvvZ]uU uvX > ]P]}v vu] } i} [r-

MEM, 20%SVF. La suspension cellulaire ainsi obtenue est centrifuge (1000 g) pendant 5

min. Les cellules sont resuspendues et mises en culture dans des flasques T12.5 (Falcon)

avec du r-MEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) supplment avec 20% de SVF, 1%

pnicilline/strptomycine 37C sous une atmosphre de 5% de CO2. Les milieux sont

renouvels 2 fois par semaine.

Cellules pulpaires de rat

Des rats LEWIS (Janvier) gs de 5 jours sont sacrifis afin de prlever les germes de molaires

qui sont mis en culture selon le mme protocole que celui des cellules humaines. Dans ce cas

nous utilisons des flasques T12.5 (Falcon) coates 0.1% de glatine. Nous utiliserons

galement d o[r-MEM, 20% SVF, 1% pnicilline/strptomycine, 1ng/ml FGF2. Les milieux

sont renouvels 2 fois par semaine.

38

2. Prparation des matrices Les cellules pulpaires pralablement cultives en 2 dimensions, selon Gronthos (Gronthos et

al., 2000), seront ajoutes lors de la polymrisation du collagne de type I, (Bell et al., 1979;

Coulomb et al., 1998; Miller et al., 2003). En bref, le pH de la solution de collagne sera

ajust 7,4, les cellules de la pulpe seront ajoutes pour ajuster la concentration finale 2

millions de cellules/ml, le milieu de culture (DMEM, 1 PS%) ajout sans srum.

Du collagne de type I est extrait de tendons de queue de rat dans une solution dacide

actique selon le protocole de (Bell, Ivarsson et al. 1979; Coulomb, Friteau et al. 1998;

Chaussain Miller, Septier et al. 2002).

La prparation de 10 matrices ensemences ncessite le mlange sur glace de collagne de

type I 1 mg/ml ,1X de DMEM, 1X de bicarbonate de soude et du DMEM sans srum

contenant les cellules (8 105 cellules/matrice).

Ce mlange est vers dans une plaque de culture pour suspension cellulaire, afin

[u!ZoZ voooo(}v]U]v Zv9

de CO2. Aprs cette heure de polymrisation du collagne, du DMEM, 1% PS sans srum est

ajout.

Ces matrices constituent les pulpes quivalentes i v v o[]v

heures avant leur implantation.

3. -Indium 111

Pour les exprimentations avec marquage radioactif, o uv]o]}v [ faite au

l}}][vv~Inserm Crb3).

Les DPSCs sont classiquement rinces au PBS1X puis dtaches par de la trypsine 0,05%

/EDTA 0,02% (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 37C puis centrifuges 1000 g pendant

5 min. Le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu et la concentration

cellulaire est mes o[][voooDalassez.

Pour raliser le marquage, 25.106 ooo }v u ovP U D [}v-Indium

111 (Covidien Pharmaceuticals, Elancourt, France) et 1 ml de tampon Tris du kit de

marquage puis incubes pendant 30 min 37 C. Les cellules sont ensuite rinces deux fois

39

avec du DMEM sans srum, et les concentrations de radioactivit des surnageants et culots

cellulaires sont mesures dans un compteur (Cobra II, Packard, USA).

> vuv uP o[}v-Indium 111 peut ainsi tre dtermin, il est exprim

par le rapport du comptage des cellules en suspension aprs le lavage (comptages des

cellules) sur le surnageant du culot (activit totale obtenue juste aprs le marquage).

Dans nos exprimentations chez le rat, le contrle choisi est constitu de matrices

ensemences de cellules marques radioactivement, puis lyses, avant mlange avec le

collagne. La lyse cellulaire est obtenue par la suspension du culot cellulaire dans une

solution hypotonique (eau distille) pendant 5 min.

B. In vivo

1. Implantation ectopique Les 6 rats utiliss lors de cette manipulation sont des rats LEWIS (Janvier) de 6 semaines Les

rats s}v vZ ] v ]vi]}v ]v ]}v o [v }o]}v X uolP

ktamine 20% (Imalgne 500, Bayer Pharma) et xylazine 5% (Rompun 2%, Merial Inc.). Le rat

est plac en dcubitus ventral. Le dos est ras puis dsinfect (Betadinefi). Une incision est

] o[][v]}] }]]v}Z}v o] o[]

de ciseaux. Un lattis avec ou sans cellules est dispos dans la poche sous-cutane. Les berges

de la plaie sont sutures (fil non rsorbables, 4-0, Ethiconfi). La mme opration est rpte

ct gauche avec une matrice sans cellules si le ct droit a reu une matrice cellularise et

vice-versa Le sacrifice de 3 animaux a eu lieu 15 jours o[]uov]}vet les 3 autres

animaux 30 jours o[]uov]}v.

2. Implantation dans la dent Le u}o ]uvo }v] (] }o o u}o [((]}v o]U ]o]

depuis de nombreuses annes dans le laboratoire (Decup, Six et al. 2000; Lacerda-Pinheiro,

Jegat et al. 2006; Jegat, Septier et al. 2007; Six, Septier et al. 2007; Goldberg, Farges et al.

2008; Tran, Gorin et al. 2012).

Les 10 rats (5 rats implants avec des cellules lyses, 5 rats avec des cellules entires) sont

vZ ] v ]vi]}v ]v ]}v o [v }o]}v X uolP l u]v

40

20% (Imalgne 500, Bayer Pharma) et Xylazine 5% (Rompun 2%, Merial Inc.). Au niveau de la

premire molaire maxillaire, une cavit occlusale est ralise par fraisage (fraise boule

surtaille, ISO 005, Maillefer, turbine Kavo GentleSilence) sous microscope (Zeiss, Pico)

uv o[ o Zu o]X > o(}v oa chambre pulpaire est ensuite

((}v o[ vZyme pulpaire camrale complte. >[Z u}

}v}u]}vo[]v] ]oX>es matrices cellularises sont

mises en place v o[ [}] o o u oX > ] [ ensuite

]}o (}v vZ o u] v o [v ]uv ]}}u]o ~]}v]vU

^}}v ] [v }Z }u}] Z}}}ou ]o(FloRestore, Denmat). Les

rats sont ensuite sacrifis 1 mois.

C. Techn

1. scanner

Le systme (Microscanner Skyscan 1172#060 t Camra CCD 5x10 cm) est compos

[v]}(][vXLes images ont t obtenues 80 V et 100 A, un

(]oou]v]u[uu[ ] vu]voX>chantillons taient placs dans

v}}vvvo[o}}oUo}Z}v}v}o]]o[axe de

rotation du micro-scanner. Pour chaque chantillon, une srie de 400 acquisitions a t faite

avec une rotation de 0,45 entre cha ]uPX > ] []]]}v }v v]

reconstruites pour chaque chantillon, enregistres sous le format DICOM puis analyses.

2. SPECT > ooo uuv ] }v u o[}v-Indium 111 (Covidien

Pharmaceuticals, Elancourt, France) avant leur mise en place chez les rats. Cette technique

permet de localiser les cellules marques grce aux mthodes de scintigraphie. Le systme

NanoSPECT/CT de Bioscan a t utilis, il permet notamment de superposer en 3D le signal

du marqueo[v}u]}vv o[]]]}vvvX

Les acquisitions scanner ont t ralises pendant 9 minutes (acquisition de la tte

uniquement), 25 min (corps entier) 55kVP.

41

Les acquisitions SPECT ont t ralises pendant 15 min minutes (acquisition de la tte

uniquement), 35 min (corps entier).

3. Autoradiographie }(]]}v o[} o]]U o u] ooo] }v }}u

aprs inclusion en Kd (]v [obtenir d } Ru [ ] } s sur une

lame de verreX > ou }v v }v] o[o]]}v [Z ]( u oo]

du ct libre de la lame puis place dans la chambre du beta-imageur (BIOSPACE LAB), sous

u}Z]oo[P}vX>}vv }v ]v toute la nuit.

D. Analyse histologique Lors du sacrifice, aprs anesthsie, la fixation des tissus est ralise par une perfusion

intracardiaque de para-formaldhyde 4%. Les maxillaires sont prlevs, puis immergs

dans une solution de para-formaldhyde 4% pendant 5 jours. La dminralisation est

o] ]uu]}vvv}o]}v[]v]]9vvZX

Les pices histologiques sont ensuite dshydrates par passage successifs dans des bains

[o}}o }]v ] }ovU ant inclusion dans la paraffine (Paraplastfi). Des

}o}vP]]voRu[ ]}v o] u]}}uX

Les coupes en paraffine sont dparaffines dans des bains de tolune et rhydrates dans

]v[o}}o }]vv}o}]on ou immunohistochimie.

1. Coloration -osine }o}]}vuo[}]}vZ]}o}P]]v] ]v]X

> } ((]v Z }v o}vP v v ]v[Z uovvv

minutes. Aprs rinage, oo }v ]uuP v u]v v v]v [ }]v ]

]v o[ ](] X

hv v] ]vP o[ ] o Z]}v v o}}o }]v v(]v v ]v

}ov v o u}vP ou WyX >[}]}v vite se faire en

microscopie photonique.

42

2. Coloration au Trichrome de Masson

}o}]}v uo} }o[ Z]}o}P]u]o vo}

des animaux.

> } ((]v Z }v o}vP v v ]v[Z uov pendant 4

minutes. Aprs rinage, elles sont immerges durant 4 minutes dans de la Fuchsine Ponceau

]]v o[ ](] U9Xoo}vv]o}vP vo[KvP -Molybdique, 4

u]vU v} ]v o[ ](] ] }v-colores au Vert-Lumire pendant 5

min.

hv v] ]vP o[ ] o Z]}v v o}}o }]v v(]v v ]v

}ov v o u}vP ou WyX >[}]}v v] (] v

microscopie photonique.

3. Immunohistochimie >[]uuv}Z]}Z]u] u o}o] v } ]v []v ! v o ] P o

o]]}v ](] [v v]} ]u] ~u}v}- ou polyclonal) ciblant notre antigne

recherch. Cet anticorps primaire est mis en vidence par un anticorps secondaire coupl

une peroxydase.

Les coupes sont dparaffines et dshydrates selon le protocole classique.

Les lames sont immerges pendant 30 minutes dans un bain de mthanol (150 mL) 0,4 %

}[Z}Pv9~R>

Le blocage des sites antigniques non spcifiques se fait directement par immersion des

lames dans une solution de PBS 1X-BSA 1%

>Zv]} v] ( s}v t]oov (FvW) dilu au 1/200 (Abcam ab-6994), o[v]}

anti-CGRP, Calcitonine gene related peptide (CGRP) dilu au 1/2000 (Sigma-Aldric C189),

o[v]} v]-Proliferating Cell Nuclear Agent (PCNA), dilu au 1/200 (Calbiochem) ou

o[v]}anti alpha-Smooth Muscle Actin (SMA) dilu au 1/300 (Abcam ab-5694) sont

dposs sur les coupes et incubs 1h30 en chambre humide temprature ambiante.

> ou }v v] ]v v Zu Zu] vv Z o[v]}

secondaire, concentr au 1/100me (coupl une peroxydase).

43

Les lames sont immerges dans une solution de3-[ ]u]v}benzidine (DAB) 0,04% de

} [Z}Pv 9 ~ uP DABU ^]PuU u> W^y R> [,2O2)

pendant 20 min temprature ambiante. Entre chaque tape, les lames sont soigneusement

rinces au PBS 1X/BSA 1%.

Les lames sont ensuite montes en m]o] ~Wy (]v [! } v

microscopie photonique.

44

V.

45

A. Mise au point du modle

1. Prlvement et culture de cellules pulpaires de rat (]v }}] ]uov o ooo o] Z [ U >t/^ }v

utiliss. Les germes de molaires sont extraits chez des rats gs de 5 jours, les pulpes sont

ensuite dissques et mises en culture selon le protocole.

Figure 10 : Cellules pulpaires de rat (P0) en culture (A) et cellules pulpaires humaines (B)

Diverses conditions de cultures ont t testes, et les meilleurs rsultats en termes de

prolifrat]}v }v }v o[rMEM supplments 20% SVF, 1% PS. Le

phnotype des cellules pulpaires de rat est lgrement diffrent par rapport aux cellules

pulpaires humaines: les cellules pulpaires de rat apparaissent moins fusiformes que les

cellules humaines (Fig.10)

2. Mise au point de la culture en 3D

>oooov]uv]}vv v]oovo[]uov]}v

u] o o vZu o] u oX v ((U o[v]}vvuv v

dimensions permet de replacer les cellules dans des conditions proches des conditions

physiologiques.

>](( v[vuvuvooo]o}voov] ooo]

coupes histologiques des lattis ont permis de dterminer une densit cellulaire optimale 1

million de cellules pour 100 l.

La prolifration au sein des matrices, a t mise en vidence. En effet, nous avons constat

vPuv]}vv}uoooi[me jour de culture (Fig.11).

A B

46

Figure 11 : Analyse de la prolifration cellulaire dans les matrices de collagne

>oooo]}vo}o]( ]v[vu]}ooPv/X

>[vo o ]]}v ooo ]v u] o ]}]]

ral] u]}}] }] }]}PZ] ooo u o[}v-

Indium. Les premires matrices fortement ensemences montraient une mauvaise

rpartition des cellules (figures 12 et 13, A) ]vou]o v[P Ps.

Figure 12W/uP]^Wdld[v]uPoooo]vvu]}ooPv]

Nombre de cellules par

ml (en million)

Temps

Prolifration cellulaire

TO

J2

J4

J6

J8

47

>[u o]}]}v }}}o [vuvuv ooo o} o o]]}v

u] u] [}v]une rpartition homogne des cellules au sein de ces matrices

~(]PUX>[}]}PZ] des coupes de matrices cellularises montre une rpartition

homogne des cellules au sein des matrices.

Figure 13 : Imageries obtenues par Beta imager

>[]uP] (}v] o -imager montre une rpartition inhomogne lors des premiers essais (A) puis une ]]}vZ}u}Pv]v}ou]~ov}ooZv][vuvuvX

3. Implantation ectopique Avant o] v Zv] }uo []uov]}v v o vU o ]}}u]]o]

des matrices cellularises et non cellularises a t teste in vivo en implantation ectopique.

A 15 jours, les matrices taient bien intgres dans les tissus au niveau du site

[]uov]}vU vv ]((]]o o o}o]]}vX u}]U u] }v

} (]uv ]v P ] ] []uov]}vX ,]}o}P]uvU

vv[]v(ouu]}v ]v} X

Figure 14 W}[vu]ooo] ]uov v}-cutan chez le rat

}o}]}vo[, uov-osine (m : matrice implante, D : derme). La matrice est parfaitement intgre aux tissus voisins (A). A plus fort grandissement, les cellules et les vaisseaux sont mis en vidence (B)

200 m m

m

D

A B

48

>}Z]}o}P]}o} o[Z uov-osine montrent la prsence de nombreuses

cellules ]v u] ooo] [v o]]}v v] e la matrice

implante (Figure 14, A, B).

Figure 15 : Coupe histologique de matrice implante (coloration au Rouge Sirius)

La coloration au rouge Sirius observe en lumire polarise (Fig.15 B) ne montre pas

[}Pv]]}v particulire des fibres de collagne (absence de mineralization foci au sein

de la matrice), ne laissant pas suggrer de dbut de minralisation de la matrice implante.

E} }}}v ]] v o ]ovU }u} [v u] }ooPvensemence de cellules souches pulpaires. Ce modle vise reconstruire une matrice ooo] u]uv o[v]}vvuv vo oooX >[]vv}] v} u] u}vv(]}o vo[}Pv]uX

4. on dans la molaire de rat

> u}o ]]}vvo [((]}v o] o}}] v o] v }]vU v}

}v ]o] o[ ]v ] } u }]v o u}o o}}u] ]

[]uov]}vu]voZuo] (Fig.16).

49

Figure 16 : Schma prsentant les diffrents matriaux implants

^oovZ }]Uou]vuoo]uv]uoX

Un premier test utilisant des cellules sans marquage radioactif a permis de cerner les

difficults techniques (Figure 17).

Figure 17 : Perforation du plancher pulpaire

La faible paisseur des parois de dentine explique les perforations du plancher observes lors des premires tentatives. ~}o}]}vo[Z uov }]v

Les essais prliminaires ont pu mettre en vidence des fractures dentaires msio-distales et

de la crte marginale distale causes par une limination trop importante des tissus

u]v o] Xvo[v(Uv[}]}vv[ v} (Figure 18). La

matrice tant dispose sur une compresse strile avant la mise en place dans la chambre

o]U }v }ou ] ]u]v o[]]}v o]] o ]U [} v

volume et une paisseur tro (]o u] v o[]uov]}vX /o ((]

dposer la matrice sur une plaque de culture cellulaire pour viter ce problme.

d

500 m

50

Figure 18 : Pulpotomie sans perforation

> ] }v u] [}]u] o }}}o [}v] v ]]] o}}u] u] v o matrices.

>[v }]v ]u}v Zv] []uov]}v o u] v o [v

ciment biocompatible au contact direct de la matrice cellularise. Un silicate de calcium,

Biodentine (Septodont) a t utilis lors de nos exprimentations (Figure 19X /ov[

not de raction inflammatoire au niveau de cette interface

Figure 19 : Interface matrice / silicate de calcium (coloration hmalun-osine)

>]((]o Zv]v u}v Uo o]]}vo[]uov]}vu]

dans la premire molaire maxillaire de rat a pu tre ralise de faon rptitive.

m d

51

Figure 20 : Technique dimplantation des matrices dans la premire molaire maxillaire de rat aprs pulpotomie

>]o]o]uv[vv ]vo[]}v((]vUvZ ](v

composite flow sont utiliss (Figure 20).

>[vlyse par CT des essais a permis de constater le volume occup par la matrice et la

bonne stratification silicate de calcium et composite flow (Figure 21).

Figure 21 : Image de CT juste aprs un essai dimplantation

52

La mise au p}]voZv]o}}u]]]o[]uov]}v[vu]voZuo]]ou]vo[v]}v]}}u]o vZ ]v}uo] o(]o]oou}o]X>u]}]v]u}]o[}ntion de la rptitivit des gestes, ce qui a t obtenu.

B. Suivi des cellules par imagerie nuclaire

1. Cytotoxicit du marqueur >[]}} ]}](U o[Kv /v]u ~K]v []v]u Doo]vl}U }]]v /uP]vP

France), a t choisi car il est employ en routine dans le diagnostic oncologique et de

o[]v(ouu]}v Z o[Z}uuU v o]}v }v]oo }}]] o (ois sur les

cellules de rat tait ncessaire.

Chez le rat, le taux de marquage des cellules pulpaires tait de 80 %. La prolifration et la

survie cellulaire ont t analyss et ne sont pas statistiquement diffrentes entre les cellules

marques et non marques (figure 22, A et B)

Figure 22 : Prolifration et survie des cellules pulpaires de rat avec et sans marquage radioactif

> uP o[Kv /v]u v u}](] o }o]( ]}v ooo] o ] ooo] faon statistiquement significative.

La stabilit du marquage a aussi t value in vitro, Z o uPU o[ o]}v

ouv9o[]] }oX

Paralllement des pr-manipulations sur des cellules pulpaires issues de dents temporaires

(SHEDs) ont t ralises, avec un rendement de marquage de 80%, ce qui correspond au

rendement observ pour les autres types cellulaires humains.

53

>uPo[Kv-/v]u]v] o] }ooooo]X[cellules pulpaires prsentent aussi de bons rsultats au marquage radioactif et pourraient tre utiliss dans des protocoles proches.

2. Suivi des cellules marques Le suivi in vivo par SPECT / CT aprs implantation a t ralis sur des matrices ensemences

de cellules pulpaires marques vivantes ou lyses. Le signal est dtectable dans les dents

implantes avec une matrice de cellules marques pendant 3 semaines aprs implantation

sans dcroissance significative (aprs correction de la dcroissance due la demi-vie

radioactive) au fil du temps pour les cellules entires ; au contraire le signal est trs faible

o[]uov]}v}ooooo X

Figure 23 : Suivi par SPECT/CT dune matrice cellularise implante dans une premire molaire de rat

54

>[]uP]^Wdlduo]o}vv]uov]}vou]vov

io[]uov]}v]]ov]oooo[]uov]}vP

leur marquage radioactif (figures 23 et 24).

Figure 24. Reconstructions SPECT/CT chez un animal implant avec des cellules entires (flche rouge) et des cellules

lyses (flche bleue)

Le marquage est suivi pendant 21 jours. Le marquage de la matrice avec les cellules vivantes (flche rouge) est plus fort que la matrice ensemence de cellules lyses (flche bleue).

Le signal des matrices ensemences de cellules vivantes est 5 fois plus fort que celui des

matrices contenant des cellules lyses (figure 25) alors que le marquage des cellules

o[}v/v]u]uvou!uX ou}vv} o]}vvo[]v P]

ooo]o[]vv] ]PvoX

55

Figure 25. Quantification du signal des matrices implantes avec des cellules lyses et des cellules entires.

Le signal des cellules pulpaires vivantes est statistiquement plus important que le signal des cellules lyses J0, J7 et J14.

Pour savoir si les cellules implantes restent localises dans la chambre pulpaire ou se

dissminent v o[}Pv]uU o }v nio-(]o o[vuo } }v

vv o[] ^WdldX v ]Pvo v[ v Z} o Zu

pulpaire pendant toute la dure du suivi, suggrant que les cellules implantes restent

localises dans la dent (Figures 26 et 27X > }Pv [ o]u]v]}v ] ooo]

(foie, reins, rate ou poumon en ces de diffusion veineuse) ont t particulirement scruts et

ne montrent aucun signal radioactif.

Figure 26 : Imagerie par SPECT/CT dune tte de rat aprs implantation dans les premires molaires maxillaires. Aucun ]Pvo]}](v[} vZ}o}v[]uov]}vX

56

Figure 27XZ}v]}v^Wdld[v acquisition de corps entier.

>[]]]}v } v] v u}v ] u]v]}v ooo] v Z} o }v ]uov U ] ]v }]u] v[v]}Pv[ o]u]v]}vX

Lintensit du signal SPECT in vivo est lie lintgrit des cellules implantes, et a permis un suivi longitudinal non-invasif pendant au moins 3 semaines des cellules pulpaires implantes. v ]Pvo ]}](U o[]}v u] u}o] ]uov U v[st mis en vidence au niveau crnio-(]oUv]v]}Pv[ o]u]v]}vX

57

C. Fonctionnalit du tissu Le processus de rparation a t examin par les techniques histologiques classiques et

o[][vRd haute rsolution.

1. Analyse histologique De nombreux fibroblastes sont retrouvs dans la matrice de collagne ensemences de

cellules vivantes. Plusieurs de ces cellules sont immunomarques pour le PCNA (proliferating

nuclear agent), indiquant une activit mitotique de ces cellules. Dans les matrices

ensemences de cellules lyses vooov[} U}]o}o}]}v

histologique ou par immunomarquage du PCNA (Figure 28).

Figure 28 : Imagerie par micro-CT et coupes histologiques de matrices implantes

La coloratiovo[Z uov }]vu}vvu]]ooovooooo ~}v]uvou] vuv ooo ]v ~X >[]uuv}Z]}Z]u] WE u}v ooo v }o]( ]}v vcette mme matrice (F).

58

Des structures vasculaires sont observes auprs des matrices ensemences de cellules

]vX }v u o[v]} v] &tX } ooo

ensemences de cellules pulpaires lyses, ces structures vasculaires ne sont pas retrouves

(Figure 29).

Figure 29 : Immunohistochimie des matrices implantes

>[]uuv}Z]}Z]u] u}v o u] v o ] ~v]} v] &t (] v ~v]} v]CGEP) proximit des matrices cellularises implantes (B et D), mais non dans les matrices ensemences de cellules lyses (A et C).

>[]uuv}Z]}Z]u]]]P }vWu}vo v[vv}Pv}v

de o}v[]uov]}v~&]P).

2. Analyse en CT

Des analyses histologiques et par CT complmentaires sont ncessaires pour connatre la

composition du tissu noform long terme et notamment une apposition dentinaire

voov}v[}vu]v ]vZ]}o}P]uv~&]P0).

59

Figure 30 : Imagerie par micro CT des matrices implantes

Un mois aprs implantation, des cellules fibroblastiques vivants, en prolifration sont prsentes dans les pulpes quivalentes. De plus, de nouveaux vaisseaux et des fibres nerveuses en formation sont visibles dans les matrices. Tandis que les lattis contrles ensemences avec des cellules lyses, sont dpourvus de colonisation cellulaire et [ o uvo]vX

60

VI.

61

Ce travail de doctorat nous a permis de franchir un premier jalon dans le projet de

o}uv [v Z ] ooo] } o P v ]}v o]X ]v]U v} }v

dmontr la faisabilit de reformer un tissu conjonctif fonctionnel contenant des cellules

prolifratives, une n }o]]}v v }]vv]}v v o o[u]}v

partielle de la pulpe dentaire chez le rat.

A ce stade, il reste de nombreux points en suspens avant un potentiel transfert vers la

clinique humaine.

A. Protocole

Mme si notre protocole a volu au cours des diffrentes manipulations, nous avons fait le

Z}] [v }}}o }Z o o]v] Zu]vU v o ] [v v(

Z ]Zo[Z}uuX

- choix des cellules :

Nous avons pris le parti de prendre une population totale de cellules pulpaires, sans tri

cellulaire pralable. Dans notre dmarche de mise au point du modle, nous avons estim

[]o ] ( o[]v]]o ]uv]}vv}o]}vo]Z }PvX

>[v]Z]uvvoooprognitrices pourra se faire par la suite. Cependant, ce jour,

en dpit de recherches actives, aucun marqueur spcifique permettant une purification

}o}P v]oov[ } Xooo}Zoo}v

tries sur leur expression de marqueurs de surface comme STRO-1 ou CD34 ou sur leur

capacit dexclusion dun colorant de liaison lADN ou en fonction de leur taille (Gronthos,

Brahim et al. 2002; Iohara, Zheng et al. 2008). Les diffrents types de sous-populations de

cellules obtenues pourraient conduire diffrents potentiels de diffrenciation. Dans

o[}i]( }v] v o (}v]}vvooU o[v]Z]uv v }v]o]

diffrenciation odonto/ostoblastique ne semble pas pertinent, car il pourrait conduire

v u]v o]]}v o[vuo o Zu o]U ] v[ }Z]oX W

}vU v} }]}v v]P []o] o[v] W^ v]Z] v ooo

}P v]] vv}] vP]}P v]} ]vo[Z}]X

Il a notammv u}v o W^ l vv v }v]o

angiognique trs important dans lischmie crbrale (Sugiyama, Iohara et al. 2011)).

62

- choix du biomatriau pour la culture 3D :

Il est vident que les interactions entre les cellules souches et de leur milieu sont

essentielles, non seulement en terme de trafic cellulaire, de survie, de prolifration et de

diffrenciation, mais galement pour dterminer le potentiel de lenvironnement sur la

rgnration des tissus. Ce biomatriau doit bien sr tre biocompatible et non toxique et

avoir des caractristiques physiques et mcaniques optimales (Landrigan, Flatley et al.

2010).

Dans le contexte de rgnration de la pulpe dentaire, parmi les diffrents types de

]}u ] ]}v]oU v} Z}] [ } v u ] voU o }ooPv

type 1, car il permet de reproduire le microenvironnement de la pulpe (Nakashima,Reddi

2003; Iohara, Nakashima et al. 2004; Nakashima,Akamine 2005; Murray, Garcia-Godoy et al.

2007; Prescott, Alsanea et al. 2008; Ishimatsu, Kitamura et al. 2009; Kim, Xin et al. 2010). De

plus il prsente une excellente biocompatibilit (Hubbell 1995; Helary, Bataille et al. 2010).

Par ailleurs, un hydrogel de collagne est biodgradable avec des produits de dgradation

physiologiquement acceptables (Middelkoop, de Vries et al. 1995), ne ncessitant pas ainsi

v v}oo ]vv]}v v [v o]}v Z]P]oX oU ]o }(( v }}]

adquate pour faciliter la pntration des cellules et leur prolifration, pour permettre le

transport des nutriments, de loxygne et de dchets mtaboliques efficacement (Geiger, Li

et al. 2003). Des travaux ont montr que les cellules dans ces matrices de collagne

prsentaient des divisions cellulaires rgules et que le processus de diffrenciation des

progniteurs / cellules souches tait activ (Ortinau, Schmich et al. 2010; Estes,Guilak 2011).

Dans notre tude, nous navons pas mis en vidence de minralisation de la chambre

o]U ooo }v ] [v v ]uovv ooo }v (]ouv

subir un processus de diffrenciation odonto / ostognique. Cela confirme que lutilisation

[vu]oZ}ooPvapte pour reconstruire la pulpe dentaire.

hvov]u ]voU]o[]o]]}v}ouvZ ]U}uu

le PGA (acide polyglycolique), dont la biocompatibilit est moins bonne mais dont le taux de

dgradation et les proprits mcaniques sont plus contrlables (Mooney, Powell et al.

1996; Bohl, Shon et al. 1998; Buurma, Gu et al. 1999; Vasita,Katti 2006; Vasita,Katti 2006). Il

}] ! i]] []o] oo u]U ] v} i}]}v ] }

molcules proangiogniques aux pulpes quivalentes. Le taux de libration pourrait tre

]v]o}voovo[vou(Ferracane, Cooper et al. 2010).

63

B. Suivi et devenir des cellules implantes Une des problmatiques lies lingnierie tissulaire concerne le devenir des cellules

implantes en pralable une utilisation clinique potentielle. En effet, il est capital de

dterminer si les cellules implantes restent dans la pulpe artificielle pour participer aux

} P v ]}v[v]o]o] ]vv U}]v]oou]Pv

via la circulation sanguine vers un autre tissu, ou encore si elles dgnrent et sont

limines par phagocytose.

Si les marquages cellulaires la Green Fluorescent Protein (GFP) ou par la beta-galactosidase

sont des techniques couramment dcrites, elles sont inutilisables dans notre modle

v]v]}vo v]u]v o] XW}o[]uov]}v ](]o

pulpe quivalv v o Zu o]U o[]uP] vo ] o[/ZD }v o

seules mthodes envisageables dimagerie non invasives.

Nous avons choisi de faire le suivi in vivo des cellules par marquage par imagerie nuclaire.

Le marquage des cellules pulpai (] o[/v]u-oxine suivi dune dtection par

scintigraphie monophotonique (SPECT). Cet isotope a t valid dans les marquages

cellulaires dans des tudes prcliniques (Aicher, Brenner et al. 2003). Il est couramment

]o] ZoZ}uu } o ]}uP o} v o o[]uP]

o[]v(]}v(Thakur, Lavender et al. 1977; Thakur, Segal et al. 1977; Roca, de Vries et al.

2010). Il et est bien tabli pour surveiller des cellules implantes dans plusieurs modles, y

}u] o u]u v]v ]PU o[]Z u] o o]v(X hv o uP

radioactif permet de suivre la migration des cellules avec une grande sensibilit en utilisant

la scintigraphie monophotonique (SPECT). En outre, le processus de marquage radioactif na

pas modifi la viabilit ni la capacit de prolifration des cellules de la pulpe in vitro.

>[]uP]vo ]}((vv]]o] o o}]]o] v](]]}v]Pvo

des concentrations trs faibles (de lordre de 10-12 10-15 mole /l), idale pour le suivi

ooo]XoUZv]u[}v]]v(}u]}vobiodistribution

de cellules marques dans tout le corps. Cela permet de vrifier quil ny a pas

daccumulation de dbris cellulaires dans les organes impliqus dans la clairance du sang

(reins, foie et rate) ni dans les poumons en cas de diffusion veineuse. En outre, limagerie du

corps entier permet la dtection dune diffusion possible des cellules implantes, ce qui,

64

dans le cas des DPSCs, pourrait conduire des minralisations ectopiques, un problme

critique en ingnierie tissulaire.

Par contre, la radioactivit diminuant avec le temps, le suivi ne peut se faire que sur une

priode de temps limite, et la manipulation des isotopes reste contraignante.

Dans lavenir, lutilisation de lIRM, pourrait permettre un suivi plus long terme des cellules

]uov U }(}] v v]]o] ]v( ] o[]uP] vo ]X W} o[/ZDU o

marquage des cellules est magntique. Les agents de marquage de rfrence sont les

nanoparticules supermagntiques de fer (AMNP pour anionic superparamagnetic

nanoparticles), utiliss pour de nombreux types cellulaires sans effet dltre

(Bulte,Kraitchman 2004; Poirier-Quinot, Frasca et al. 2010; Robert, Fayol et al. 2010; Brule,

Levy et al. 2011). Pour nos exprimentations, le domaine de frquence radio spcifique reste

dvelopper.

d}(}]U oo }] o u Z} []uP] ]o] U oovu }v

]o]}vo[}]P]vooo}o]( ]U} voo]XD!u

si la quantit de signal SPECT est importante uniquement dans le cas des pulpes

quivalentes avec des cellules intgres, ce qui suggre que les cellules implantes restaient

viables, nous ne pouvons exclure la possibilit que les cellules en prolifration mises en

vidence en histologie, soient des cellules de lhte recrutes. La preuve scientifique pourrait

tre apporte soit en implantant des cellules humaines chez des rats immunodprims ou

grce lanalyse FISH avec des sondes spcifiques donneurs/receveurs, qui toutes deux

permettraient de distinguer les cellules implantes des cellules htes.

C. Limites du modle

- Inflammation

vv}Uoooo}v ]uov vv]vUo}[vo]v]U

les cellules seraient implantes dans les dents prsentant une inflammation gnre par une

infection bactrienne ou un traumatisme. Il serait pertinent dans o[v] []o] v

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cliniciens mais non prouve histologiquement et du diagnostic de cette inflammation se

retrouverait alors au centre de ces recherches (Eba, Murasawa et al. 2012) proposent un

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u}o Z o Z]v []v(ouu]}v u} []v(ouu]}v ]v] v

exposant au milieu buccal la pulpe respectivement pendant 24 et 72h avant coiffage.

- Evolution vers un modle prclinique

Mme en faisant voluer le modle chez le rat en tenant compte de paramtres cliniques,

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des obturations, ce qui bien entendu limite le suivi dans le temps.

Nous envisageons donc de faire voluer notre travail vers un autre modle animal, savoir

le mini-porc. Le transfert vers un modle animal non-rongeur permettrait en effet une

relle tape prclinique. En effet, cet omnivore prsente une physiopathologie assez

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anatomique. Ceci semble galement vrai pour le systme buccodentaire. Les porcs

prsentent par exeuo v u v]]}v }uo o[Z}uuU

dentures. Il nous sera donc possible de cultiver des cellules pulpaires de dents temporaires,

}v o (]]o] i } X (]v (] o }vU ]v []o }]

rapport des greffes de cellules, de mini-cochons consanguins, nous envisageons de rester,

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seraient donc prpares de manire similaire avant implantation dans les prmolaires et

molaires aprs pulpotomie.

D. Transf