Real-time_PCR.pdf

Praktikum - Biotestovi 2011/2012 Asistent: Kristina Majsec

10. vježba (14.01.)

Analiza rezultata real-time PCR-a

Upute za praktikum Tema praktikuma je metoda real-time PCR s naglaskom na računalnu analizu rezultata.

Obavezno pročitajte ove materijale, odgovorite na pitanja (u kurzivu) te pripremite vlastita pitanja o nejasnoćama vezanim uz gradivo. Obratite pažnju na termine koji se koriste, jer ćemo njima baratati na praktikumu. Plavo uokvireni tekst se odnosi na izvedbe real-time PCR-a kojima se nećemo baviti na ovoj vježbi, ali se redovito koriste.

Zadnje dvije stranice odnose se na samu izvedbu vježbe.

Uvod Real-time PCR (kvantitativni PCR ili qPCR) je metoda kojom se može detektirati prisutnost ciljnog gena, dijagnosticirati prisutnost patogena ili kvantificirati ekspresija pojedinih gena. U okviru ove vježbe obradit ćemo upotrebu real-time PCR-a u kvantifikaciji genske ekspresije. Količina ekspresije odabranog gena je proporcionalna količini sintetizirane pripadajuće mRNA u stanicama. Stoga je za kvantifikaciju genske ekspresije metodom real-time PCR prethodno potrebno izolirati RNA iz ciljnog tkiva. RNA se prepisuje u cDNA u reakciji reverzne transkripcije, te se takva cDNA koristi u reakciji real-time PCR.

Što znate o reverznoj transkripciji?

Zašto se koristi cDNA umjesto RNA u reakciji real-time PCR?

Kako se možemo osigurati da se u reakciji real-time PCR neće naći:

a) ostaci genomske DNA? b) ostaci neprepisane RNA? c) tRNA, rRNA ili neprocesirana mRNA ? d) zašto bi sve gore navedeno moglo smetati u reakciji real-time PCR?


U osnovi real-time PCR je obična PCR reakcija, modificirana s načinom za praćenje količine novosintetizirane DNA u reakciji. Količina DNA prati se pomoću fluorescencije najčešće na jedan od dva načina: pomoću fluorescenscijskih boja ili hidrolitičkih proba. Primjerice, fluorescencijska boja SYBR Green veže se s velikim afinitetom za dvolančanu DNA, te uređaj tako može pratiti sintezu nove DNA kroz cikluse (Slika 1).

Slika 1. Ovisnost fluorescencije o broju ciklusa u reakciji real-time PCR. Amplifikacija DNA pomoću početnica (primera) za aktin na cDNA izoliranoj iz vrste Nicotiana tabacum. Metoda detekcije je SYBR Green. Na krivulji možemo razlikovati baznu liniju, eksponencijalni i linearni dio.

Kvantifikacija genske ekspresije radi se u eksponencijalnom dijelu krivulje, kada svaki sljedeći ciklus znači udvostručavanje količine PCR produkta. U tom dijelu krivulje odredi se prag fluorescencije („threshold“). Za svaki uzorak koji pri amplifikaciji prijeđe prag fluorescencije se smatra da sadrži ciljnu cDNA, tj. da je za povećanje fluorescencijskog signala iznad bazne linije zaslužna prisutnost odgovarajuće cDNA, koja je u tom trenutku amplificirana na razinu detekcije. Ct je broj ciklusa u kojem je uzorak prešao threshold, te se on uzima za usporedbu kvantifikacije genske ekspresije između pojedinih uzoraka. Primjerice, ako uzorak 1 ima Ct = 25, a uzorak 2 Ct = 28, to znači da se uzorak 2 amplificirao iznad razine detekcije 3 ciklusa nakon uzorka 1.

Razmislite što taj podatak govori o količini početne cDNA u uzorcima 1 i 2.

Bazna linija

Eksponencijalni dio

Linearni dio

Threshold

Ct


Ovakav prikaz nije dovoljno informativan za kvantifikaciju genske ekspresije, te se stoga koristi promjena fluorescencije u odnosu na baznu liniju (Slika 2).

Slika 2. Ovisnost promjene fluorescencije u odnosu na baznu liniju o broju ciklusa u reakciji real-time PCR. Iz ovog je prikaza puno lakše naći eksponencijalni dio reakcije (linarni dio ove transformirane krivulje) te unutar njega postaviti threshold (crvena linija).

TaqMan probe

TaqMan probe su hibridizacijske i hidrolitičke probe specifične za sekvencu ciljne cDNA (Slika 3). Na svoja dva kraja imaju vezane dvije molekule: fluorescencijsku reporter boju i quencher. Dok je proba intaktna, reporter boja ne fluorescira zbog blizine quencher molekule, koja putem FRET-a (Fluorescence resonance energy transfer) onemogućuje fluorescenciju reportera.

Prilikom amplifikacije, DNA polimeraza uklanja probu s kalupa i cijepa probu, čime reporter biva odvojen od quenchera. Time je reporteru omogućeno da emitira fluorescenciju. Taj fluorescencijski signal je proporcionalan količini novosintetizirane DNA.

Slika 3. Način praćenja količine DNA u real-time PCR-u pomoću TaqMan proba.

Linearni dio krivulje (eksponencijalni dio reakcije)


Praktikumska vježba - teorija

U ovoj vježbi analizirat ćemo gensku ekspresiju u listovima biljaka vrste Nicotiana tabacum starih 3 mjeseca, koje su bile izložene teškim metalima kadmiju, željezu i njihovoj kombinaciji tjedan dana. Iz ovih biljaka izolirana je RNA, prepisana u cDNA te je napravljen real-time PCR za gene nikotin-amid sintazu (NAS), pleitropic drug resistance gen (PDR) te transporter NRAMP.

NAS je protein koji sintetizira nikotinamid, helator metala. PDR je transporter koji se nalazi na plazmatskoj membrani te izbacuje štetne tvari iz stanica. NRAMP je transporter koji se nalazi na staničnoj membrani te je odgovoran za unos Fe u stanice, a tim putem u stanice ulazi i Cd. Kao interna kontrola korišten je gen za aktin.

Kvantificirati ćemo promjenu ekspresije ovih gena u biljkama izloženima stresu u odnosu na kontrolu. Takva kvantifikacija genske ekspresije zove se relativna kvantifikacija jer određujemo količinu ekspresije u jednom uzorku u odnosu na drugi uzorak. U tom slučaju, kontrolni uzorak zove se kalibrator („calibrator“), a svi ostali su samo uzorci („samples“).

Geni čiju ekspresiju određujemo (NAS, PDR, NRAMP) zovu se ciljni geni („target“), a gen za aktin je interna kontrola („reference“).

Ct za replike pojedinih reakcija ne smije se razlikovati više od 0,5 °C.

Apsolutna kvantifikacija

Upotrebom real-time PCR-a moguće je kvantificirati gensku ekspresiju relativno ili apsolutno.

Apsolutnom kvantifikacijom saznajemo točan broj kopija ciljne RNA ili DNA u tkivu. To može biti virusna RNA (titar infekcije), mRNA (ekspresija gena), rRNA ili čak DNA (broj kopija gena u stanici). Za apsolutnu kvantifikaciju potrebno je imati standard s točno poznatim brojem molekula RNA ili DNA po jedinici volumena (Slika 4).

y = -3,3912x + 25,702 R² = 1

0 5

10 15 20 25 30

0 1 2 3 4

Ct

log10 konc

Slika 4. Standard se decimalno razrjeđuje te se broj molekula RNA ili DNA u ciljnom uzorku određuje iz pravca ovisnosti Ct o log10 koncentracije standarda. Iz jednadžbe pravca odredi se koncentracija uzorka s obzirom na njegov Ct izmjeren u real-time PCR-u.


Disocijacijska krivulja Kada se za detekciju produkta u real-time PCR-u koristi fluorescencijska boja, primjerice SYBR Green potrebno je provesti dodatnu analizu. Ova boja nije specifična za pojedinu sekvencu, već se veže za svaku dvolančanu molekulu DNA. Stoga je nakon reakcije nužno provjeriti je li produkt nastao u reakcijama s nekim parom početnica (npr. za gen aktin) jedinstveni produkt. To se može vidjeti na disocijacijskim krivuljama (Slike 5 i 6).

S obzirom na nukleotidni sastav određeni produkt PCR-a će imati jedinstvenu temperaturu taljenja („melting temperature“).

Slika 6. Disocijacijska krivulja za gen PR-1 u real-time PCR-u na kalupu cDNA izolirane iz vrste Nicotiana tabacum. Koji bi mogli biti potencijalni uzroci ovakve disocijacijske krivulje?

Slika 5. Disocijacijska krivulja za gen aktina u real-time PCR-u na kalupu cDNA izolirane iz vrste Nicotiana tabacum. Ovakva se krivulja smatra dokazom da je produkt PCR-a u ovim reakcijama jedinstven, jer se pik svih krivulja nalazi na istoj temperaturi (to se može provjeriti na konkretnim brojevima).


Efikasnost PCR reakcije Pri kvantifikaciji rezultata real-time PCR-a potrebno je znati koliko je uspješna/efikasna PCR reakcija. Efikasnost PCR reakcije se izražava kao postotak u odnosu na idealnu reakciju. U idealnoj PCR reakciji svaka molekula kalupa biva duplicirana u svakom ciklusu. To znači da se broj molekula DNA u PCR reakciji mijenja ovisno o broju ciklusa sljedećom pravilnošću N(DNA) = x*2n; gdje je n = broj ciklusa, a x = broj početnih molekula DNA.

Pretpostavka da je svaka PCR reakcija 100% efikasna nije dovoljno točna te se na taj način mogu krivo protumačiti rezultati. Razmislite zašto na sljedećem hipotetskom primjeru.

Kvantificiramo ekspresiju gena NAS između dva uzorka, K- kontrola i S- stres. Oba uzorka sadrže cDNA porijeklom iz vrste Nicotiana tabacum. Ne računajući replike i negativne kontrole, potrebne su nam 4 različite reakcije: kalup K + primeri aktin, kalup S + primeri aktin, kalup K + primeri NAS, kalup S + primeri NAS. Svi ostali sastojci reakcija su identični. Koji su ostali sastojci? Što može utjecati na različitu efikasnost ove 4 reakcije PCR? Možemo li znati prije same real-time PCR reakcije da se efikasnost između ove 4 reakcije razlikuje?

Kako se računa efikasnost? Potrebno je imati serijsko razrjeđenje kalupa (za uhodane reakcije 2 razrjeđenja su dovoljna). Iz real-time PCR reakcije uzima se Ct i računa se ovisnost Ct o log koncentracije. Ovisno o tipu razrjeđenja koristi se drugačiji logaritam (log10 za decimalna razrjeđenja, log2 za binarna razrjeđenja) (Slika 7).

y = -3,4x + 30,55 R² = 0,9998

0 5

10 15 20 25 30 35

0 1 2 3 4

Ct

log2 konc

Slika 7. Ovisnost Ct o log2 koncentracije kalupa. Iz nagiba pravca računa se efikasnost.

slope (s) = -3.4

E = 10−1𝑠 − 1

E = 96,84 %


Analiza s računalnim programom 7300 System SDS Software Pokrenite računalni program 7300 System SDS Software.

U gornjem redu izbornika postoje polja Setup, Instrument i Results. Pod Setup možete vidjeti kakav je raspored uzoraka na 96-well pločici u reakciji. Pod Instrument se nalaze podatci o reakciji koja je završena.

Pod Results se nalazi više polja. Prođite kroz njih i pokušajte zaključiti čemu služe različiti prikazi. Polja na reakcijskoj pločici odabiru se kao u Excel tablici.

Pri analizi potrebno je provesti sljedeće korake:

pregledati amplifikacijske krivulje pregledati disocijacijske krivulje pregledati i po potrebi ručno namjestiti baseline i threshold za svaki gen pregledati negativne kontrole pregledati uzorke izvesti podatke u excel kvantificirati gensku ekspresiju u excelu

Threshold ne mora biti isti za sve gene, ali mora biti isti za sve reakcije koje se odnose na ekspresiju jednog gena. Zašto?

Kakve su disocijacijske krivulje?

Ima li kontaminacije u negativnom kontrolama? Do koje mjere to može smetati u analizi?

Koliko se razlikuju duplikati? Koje uzorke morate isključiti iz analize?


Kvantifikacija u excelu – metoda po Pffaflu

Nakon što provjerimo sve rezultate u računalnom programu 7300 System SDS Software, prebaciti ćemo podatke u excel dokument i tamo izračunati relativnu ekspresiju gena.

Omjer ekspresije između dva uzorka izračunava se na sljedeći način:

omjer = 𝐸𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡𝛥𝐶𝑡_𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡(𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑡𝑜𝑟−𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒)

𝐸_𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑒𝛥𝐶𝑡_𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑒(𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑡𝑜𝑟−𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒)

E – efikasnost PCR reakcije za par primeri+kalup

ΔCt – razlika između Ct za uzorak i kontrolu

Nakon što ste prebacili podatke u excel, uz pomoć asistentice, napravite sljedeće:

izračunajte srednje vrijednosti duplikata izračunajte efikasnosti za sve gene izračunajte ΔCt za svaki uzorak u odnosu na pripadajući kalibrator izračunajte omjer ekspresije gena metodom prema Pffaflu za svaki uzorak stresa u

odnosu na kontrolu prikažite rezultate grafički u obliku histograma

Što možete zaključiti o djelovanju teških metala na biljke iz rezultata ove real-time PCR reakcije?

Documents

Real-time_PCR.pdf