Upload
dimianstefania
View
80
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
METODE MODERNE PENTRU CONTROLUL UNOR BOLIPARAZITARE ALE ANIMALELOR CU IMPLICATII IN PATOLOGIAUMANA
Citation preview
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
1
RAPORT TEHNIC ETAPA A III-A
Iulie-decembrie 2007
Program sectorial contract 361 P.S. 4.3.1.
METODE MODERNE PENTRU CONTROLUL UNOR BOLI
PARAZITARE ALE ANIMALELOR CU IMPLICATII IN PATOLOGIA UMANA
Director de Proiect: Dr. Dumitru MILITARU S.N. Institutul Pasteur
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
2
RAPORT TEHNIC
Etapa a III-a iulie-decembrie 2007
Principalii paraziti intalniti la animale si implicati in patologia
parazitara umana prin transmitere de la animale la om, sunt:
- Toxoplasma gondii, parazitul avand gazda definitiva pisica si gazde
intermediare rumegatoarele si porcul, sursa de contaminare a omului fiind
reprezentata atat de pisica (materii fecale), cat si de ovine si porcine (carne
insuficient prelucrata termic)
- Trichinella spiralis, parazitul evoluand frecvent la porc, porcul
mistret si urs, porcul fiind principala sursa de infestare pentru om;
- Echinococcus granulosus care are drept gazda definitiva cainele, iar
gazde intermediare, unde evolueaza sub forma larvara (chist hidatic), sunt
rumegatoarele, porcul, dar si omul;
Toxoplasmoza:
Protozoonoz cu larg rspndire, deseori neglijat din punct de vedere
a etiologiei, n stabilirea unui diagnostic corect, datorit lipsei de
specificitate a manifestrilor clinice, toxoplasmoza la animale se manifest
deseori prin tulburri de reproducie, avorturi i uneori manifestri nervoase.
Totodat, fiind considerat o important zoonoz, infestaia cu
Toxoplasma gondii pune probleme deosebite n ceea ce privete salubritatea
produselor alimentare de origine animal (de exemplu prezena chisturilor
parazitare n carne sau produse din carne crude).
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
3
Toxoplasma gondii este un parazit protozoar obligatoriu intracelular,
capabil sa infecteze pasarile si animalele cu sange cald. Parazitul T. gondii
are un ciclu de viata complicat cu numeroase stadii de evolutie. Pisicile
infectate (gazda definitiva) imprastie oochisturi prin fecale in mediul
inconjurator, oochisturi care ingerate de animale sau oameni elibereaza
sporozoitii in corpul gazdei contaminate. Tachizoitii, derivati din sporozoiti,
invadeaza apoi organismul animalelor sau oamenilor contaminati, ciclul
biologic incheindu-se prin formarea in musculatura si diferite organe de
chisturi de T. gondii ce contin un numar mare de bradizoiti. Organismele
parazitare (cum ar fi Toxoplasma gondii) pot cauza pierderi semnificative in
fermele de porcine si ovine prin avorturi, afectare embrionara sau infertilitate
maternala. Un raport din 2002 al Institutului de Stiinta si Cercetare a
Mediului Inconjurator din Noua Zeelanda, mentioneaza seroprevalenta
anticorpilor anti-T. gondii la animale. Astfel, in Tazmania din 160 miei
testati, 16,9% erau pozitivi; din 145 oi, 61,7% erau pozitive; din 30 vieri,
22,3% erau pozitivi; din 139 porci, 7,2% erau pozitivi. In Australia, din 1159
de oi, 7,4-9,2% erau pozitive. In Canada din 2800 de porci, 8,6% au prezentat
anticorpi anti-T. gondii. In Norvegia, 18% dintre oi, 5,1% din bovine si 2,5%
din porcine aveau anticorpi anti-T. gondii. In SUA, din 3707 porci testati,
32% au fost pozitivi; din 5936 ovine testate, 37% au fost pozitive si din 2449
caprine, 23% erau pozitive. Studiile au aratat ca, la nivel mondial, din 73717
porcine testate, 22% au fost detectate ca pozitive. Acelasi raport mentioneaza
ca in Anglia, din 67 de probe de carne conservata, 1,5% erau pozitive (la
testare prin PCR si pe culturi celulare); in SUA, din 50 probe tesut musular
porc testate prin bioproba pe soricei, 24% au fost pozitive; iar din 86 probe
tesut muscular ovine 9,3 % au fost pozitive. In SUA, intre 1983-1984, din
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
4
11229 scroafe testate, 42% au fost pozitive, iar din 613 porci sacrificati pentu
consum, 23% au fost pozitivi la T. gondii; in 1990, din 3479 scroafe testate,
20% erau pozitive; in 1995, din 3236 scroafe testate, 15% au fost pozitive, iar
din 4712 porci, 3,2% au fost pozitivi.
Raportul Institutului National Veterinar din Suedia din 2002 catre
Comisia Europeana mentiona ca in Suedia, in anul 1987, 20% dintre ovine si
17,3% din porcii adulti prezentau anticorpi anti-T.gondii. De asemenea,
supravegherea serologica a ovinelor in Norvegia, in anii 90 a condus la
concluzia ca 18% dintre miei si 2% din porcine prezentau anticorpi anti-
Toxoplasma gondii. In America de Nord, se estimeaza ca intre 16-40% dintre
persoane sunt infectate cu Toxoplasma gondii. Din diferite studii
epidemiologice din Norvegia s-a concluzionat ca intre 7-27% din femeile
insarcinate erau seropozitive la T. gondii. S-a estimat ca aproximativ 30% din
adultii din Marea Britanie si intre 50-80% din adultii din Europa au anticorpi
anti-T. gondii. De asemenea, la nivel mondial, cazurile de toxoplasmoza
congenitala se estimeaza ca fiind cuprinse intre 140900-1127200 (0,1-0,8%)
anual. In SUA, 0,6% din populatie se infecteaza in fiecare an, acest procent
reprezentand aproximativ 1500000 de cazuri. Numarul de cazuri de
toxoplasmoza congenitala in SUA s-a estimat la 400 - 4000 cazuri anual in
2000. In Franta prevalenta toxoplasmozei s-a situat in 1996 intre 42-84%, iar
in SUA a fost de pana la 40%.
Date de la Centrul pentru Controlul Bolilor din Canada au situat infectia
cu Toxoplasma gondii pe locul trei (20,7%), dupa infectiile Salmonella
(30,6%) si Listeria monocytogenes (27,6%). Un studiu european efectuat in
anul 2000, pe 1110 femei insarcinate, a demonstrat prezenta infectiei ca fiind
10% in Marea Britanie si Norvegia, 55% in Franta si Grecia. Din cazurile
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
5
depistate pozitive, intre 30-63% din infectii au fost atribuite consumului de
carne infestata.
Controlul infestatiei cu Toxoplasma gondii la animalele de interes
economic, inclusiv la suine si ovine, reprezinta o preocupare continua
intrucat T. gondii determina o infectie zoonotica importanta, fiind una din
cauzele majore a avorturilor la ovine si porcine.
Datorita faptului ca in marea majoritate a cazurilor, toxoplasmoza
evolueaza subclinic, preocuparea actuala este indreptata catre
perfectionarea metodelor de diagnostic existente si elaborarea de metode
noi de diagnostic care sa le inlocuiasca pe cele conventionale (testul pe
culturi tisulare, biproba pe soricei), care nu sunt foarte sensibile si
necesita consum mare de timp, cu metode moderne cum ar fi testele
imunoenzimatice, testele imunohistochimice si moleculare (PCR).
T. gondii cauzeaza o gama mare de manifestari la gazdele infectate.
Cele mai multe tulpini de T. gondii sunt avirulente pentru soricei producand
infectii cronice asimptomatice, in timp ce cateva sunt inalt virulente pentru
soricei, producand toxoplasmoze acute care omoara soriceii la o concentratie
de mai putin de 10 tachizoiti. La o asa diversitate biologica si epidemiologica
a toxoplasmelor, ne putem astepta la o diversitate genetica mare, determinata
de recombinarea meiotica in acest parazit produsa in timpul ciclului sexual al
parazitului. Marea majoritate a izolatelor de T. gondii de la animale si
oameni, studiate pana in prezent apartin numai originilor clonale 2 si 3,
structurate ca tipurile I, II si III.
Genomul T.gondii, asemenea celui al altor celule eucariote, este
compus din acidul dezoxiribonucleic nuclear si cel al organitelor. T.gondii
contine un genom nuclear de aproximativ 86Mb, un genom mitocondrial de 6
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
6
kb si un genom epizomal de 35 kb. Diversitatea alelica identificata pentru cei
mai multi dintre markerii T.gondii a fost foarte mica (2-4 alele). In aceasta
situatie se afla markerii izoenzimatici ce compun 6 sisteme polimorfice
enzimatice (aspartat aminotransferaza, glutation reductaza, amilaza,
glucozofosfat izomeraza, acid fosfataza si propionilesteraza) si care prezinta
numai 2-3 izoforme in populatia de izolate de T. gondii testate. O diversitate
genetica foarte mica (2-4 alele) s-a intalnit si la genele care codifica
antigenele majore ale parazitului (antigene de suprafata, antigenele produse
de granulele dense, de organelele secretoare rhoptry sau antigenele matricei
chisturilor), la genele care codifica sintetizarea altor produsi ai T.gondii (-tubulina, -tubulina, actina, dihidrofolat reductaza-timidilat sintetaza, nucleozid trifosfataza, alfa ADN polimeraza) sau genele cu functii
necunoscute. S-a observat ca din 18 tulpini de T.gondii studiate, toate
prezentau una sau alta din cele doua secvente in genele care codifica atat
antigenele de suprafata cat si cele ale organitelor, fara a exista o variatie
intratipica. Un polimorfism usor mai inalt (3-4 alele) a fost detectat la cativa
microsateliti localizati in intronul genelor cunoscute (TUB 2 pentru -tubulina, TgM-A pentru miozina A) sau in secventele tag expresate
(ESTW35487). De asemenea, au putut fi detectati ca avand un inalt
polimorfism, copii multiple ale locilor, cu functii necunoscute. S-au descris
pentru T. gondii mai mult de 50 de markeri: markeri genetici si fenotipici cu
polimorfism scazut (2-4 alele) si markeri genetici cu polimorfism inalt.
Markerii genetici si fenotipici cu polimorfism scazut (2-4 alele) sunt compusi
din izoenzime (aspartat aminotransferaza, amilaza, propionilesteraza,
glucozofosfat izomeraza, glutation reductaza, acid fosfataza), gene ce
codifica antigenele majore (antigene de suprafata: SAG1, SAG2, SAG3,
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
7
SAG4, MAG1, BSR4, SRS1, SRS2, SRS3; antigene ale organitelor: GRA1,
GRA2, GRA3, GRA4, GRA6, ROP1 si nucleozidtrifosfataza NTP; gene cu
functii cunoscute: actina ACT1, -tubulina (TUB1), -tubulina (TUB2), B10, dihidrofolat reductaza (FOL1), ADN polimeraza alfa (POL1); gene cu functii
necunoscute: 850, L328, 62B, 226, C19, B1 si microsateliti: -tubulina (TUB2), miozina A (TgM-A), EST W35487. Markerii genetici cu
polimorfism inalt sunt formati din secvente repetate in genom (BS, TGR,
REP) si din microsateliti (EST: N60608, N82375, N83021, N61191,
AA519150 si loci: M6, M33, M48, M95, M102, M163). Inalta putere
discriminatorie a 8 markeri ai microsatelitilor poate avea o utilitate foarte
mare in studiile epidemiologice ale Toxoplasmei gondii, dar si pentru
genotipizarea tulpinilor si detectarea infectiilor mixte. Tipizarea
microsatelitilor este considerata a fi superioara celei a multilocusurilor care
nu poate distinge infectiile mixte din probe.
Concluzionand, au fost stabilite trei genotipuri principale ale
Toxoplasmei gondii, in functie de cateva dintre caracteristicile sale biologice:
tipul I (izolate rar aproximativ 10% din tulpinile de colectie din Europa si
SUA, sunt in principal de origine umana; tulpini inalt virulente pentru soricei
determinand moartea soriceilor inoculati cu mai putin de 10 tachizoiti; in
vitro prezinta o rata inalta de multiplicare si o interconversie tachizoit-
bradizoit redusa); tipul II (izolate foarte des aproximativ 80% din tulpinile
de colectie din Europa si SUA, sunt de origine umana sau izolate de la
porcine, ovine; sunt tulpini nevirulente pentru soricei determinand infectii
cronice cu persistenta in tesuturi a chisturilor; in vitro prezinta o rata scazuta
de multiplicare si interconversie tachizoit-bradizoit usoara, cu formare de
chisturi) si tipul III in care sunt cuprinse tulpinile de T. gondii cu genotipuri
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
8
recombinate si genotipuri neobisnuite cu alele atipice (au fost intalnite foarte
rar in izolatele din Europa si SUA, sunt mult mai des intalnite in izolatele de
la animalele salbatice din regiuni geografice indepartate si de la bolnavi
atipici; aceste tulpini sunt de obicei mai virulente decat cele de tip II).
Descoperirea acestor markeri s-a realizat prin dezvoltarea unor proiecte
de cercetare a genomului parazitului. Rezultatele cercetarilor (mai mult de
73000 de gene ale T. gondii si secventele tag expresate (EST)) sunt
disponibile acum in GeneBank si pot fi analizate prin paginile web ale
genomului T. gondii.
Scopul general al proiectului este reprezentat de dezvoltarea unor
instrumente de diagnostic, profilactice si terapeutice destinate controlului
bolilor parazitere cu caracter zoonotic.
Directiile majore pe care se vor desfasura cercetarile constau in:
- studii epidemiologice privind emergenta si distributia parazitilor
zoonotici, luati in studiu, circulanti in efectivele de animale in
Romania, comparativ cu cei intalniti in cazuistica din medicina umana;
- studiul modalitatilor de transmitere a parazitilor de la gazda definitiva
la om;
- dezvoltarea instrumentelor de diagnostic prin crearea unor metodologii
bazate pe utilizarea tehnicilor imunologice (teste imunoenzimatice-
ELISA, imunohistochimice, nanotehnologice) si de biologie
moleculara (PCR/tehnologia ADN recombinant) pentru stabilirea
diagnosticului la gazdele definitive, respectiv la gazdele intermediare;
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
9
- dezvoltarea unor produse de interventie: vaccinuri si produse
antiparazitare utilizabile in profilaxia si tratamentul parazitozoonozelor
luate in studiu;
- derularea de actiuni suport pentru diseminarea rezultatelor cercetarilor.
Obiectivul pricipal al etapei a III-a a constat in: Stabilirea
metodologiilor de diagnostic precoce si discriminatoriu privind
infestatiile cu Toxoplasma gondii la animale.
Obiective operaionale:
stabilirea conditiilor de lucru in tehnicile de diagnostic imunoenzimatice si imunohistochimice;
validarea metodelor elaborate pe probe cunoscute si pe probe din teren; elaborarea metodelor moleculare de detectie a Toxoplasma gondii
(teste PCR elective si metodologii de obtinere a matritelor ADN din
probe cunoscute);
validarea metodelor moleculare pe probe cunoscute si pe probe din teren.
diseminarea rezultatelor obinute n publicaii de specialitate i cu ocazia comunicrilor tiinifice.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
10
1.1. Stabilirea conditiilor de lucru in tehnicile de diagnostic imunoenzimatice si imunohistochimice. Validarea metodelor
elaborate pe probe cunoscute si pe probe din teren.
1.1.1. Reagentii preparati in etapa anterioara au fost utilizati pentru
stabilirea conditiilor de reactie in tehnicile imunoenzimatice de detectie a
anticorpilor anti-Toxoplasma gondii din seruri provenite de la ovine si
porcine.
ELI-Tox-O: Set de diagnostic al toxoplasmozei la ovine
Ansamblu de componente pentru detectia anticorpilor de tip IgG anti-
Toxoplasma gondii din serul sanguin de la ovine prin tehnica
imunoenzimatica (ELISA varianta indirecta).
Scopul utilizarii: Diagnosticul toxoplasmozei (detectarea anticorpilor
de tip IgG) pe seruri provenite de la ovine prin tehnica ELISA-varianta
indirecta.
Forma de prezentare: Trusa cu componente necesare pentru 90 probe,
180 probe sau 450 probe.
Componentele produsului: Trusa ELI-Tox-O cuprinde urmatoarele
componente, ambalate individual, in cantitati corespunzatoare necesarului de
lucru: Nr.
crt.
Component U/M Cantitate
pentru 90
probe
Cantitate
pentru 180
probe
Cantitate
pentru 450
probe
1. Microplaca ELISA peliculizata cu antigen
Toxoplasma gondii
buc. 1 2 5
2. Martor pozitiv 10X ml 0,1 0,2 0.5
3. Martor negativ 10X ml 0,1 0,2 0.5
4. Conjugat anti-IgG oaie marcat cu peroxidaza ml 0,125 0,250 0.600
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
11
5. Substrat de perhidrol in tampon citrat ml 11 25 60
6. Cromogen (solutie ABTS) ml 0,6 1,2 3
7. Diluant pentru seruri si conjugat ml 100 120 240
8. Solutie de spalare 10 X ml 50 60 150
9. Reactiv de stopare NaF g 0,09 0,18 0.45
10. Instructiuni de folosire a trusei buc. 1 1 1
a) Microplaca ELISA este peliculizata (captusita) cu antigen purificat
stabilizat de Toxoplasma gondii, spalata si uscata, ambalata in folie
de plastic sau metalizata, gata de utilizare.
b) Martorul pozitiv este obtinut de la oi imunizate cu antigen
Toxoplasma gondii purificat. Se prezinta ca un lichid clar, alb-
galbui si contine stabilizator. Se dilueaza 1/10 pentru lucru.
c) Martorul negativ este recoltat de la oi libere de toxoplasmoza. Se
prezinta ca un lichid clar, alb-galbui si contine stabilizator. Se
dilueaza 1/10 pentru lucru.
d) Conjugatul anti-IgG oaie este reprezentat de IgG iepure anti-IgG de
oaie, cuplata cu peroxidaza. Se prezinta ca un lichid clar, de culoare
brun-roscata, concentrat de 100 de ori. Contine stabilizator. Se
dilueaza pentru lucru.
e) Substratul este o solutie de perhidrol (H2O2) in tampon citrat. Se
prezinta ca un lichid clar, incolor.
f) Cromogenul este o solutie concentrata de ABTS. Se prezinta ca un
lichid clar, de culoare verde si este gata de utilizare.
g) Diluantul pentru seruri si conjugat este reprezentat de un tampon
fosfat cu adaos de albumina serica bovina si conservant. Se prezinta
ca un lichid clar de nuanta verzuie si este gata de utilizare. Prin
agitare produce spuma.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
12
h) Solutia de spalare se prezinta ca un lichid clar care prin agitare
produce spuma. Este concentrat de 10 ori. Se dilueaza pentru lucru.
i) Reactivul de stopare (NaF) este o pulbere cristalina de culoare alba. Se dizolva in apa distilata pentru lucru.
Conditii de pastrare : Trusa ELI-Tox-O se pastreaza la 2 - 8 oC, in
ambalajul original.
Valabilitate : 6 luni de la data fabricatiei, in conditiile mentionate mai
sus.
Informatii generale despre boala : Toxoplasmoza este o zoonoza care
afecteaza omul si numeroase specii de animale homeoterme si pasari, fiind
raspandita pe tot globul. Rezervorul de infestare are doua componente si
anume: abiotica- unde se dezvolta oochisturile si biotica- reprezentata de
toate speciile de mamifere din genul Felix si Lynx- gazde definitive ale
parazitului Toxoplasma gondii. Gazdele intermediare sunt reprezentate de
om si alte homeoterme care se pot manifesta si pot fi si surse de infestare
cu Toxoplasma gondii. Toxoplasmoza poate fi considerata ca fiind una
dintre cele mai importante zoonoze, prin impactul social deosebit pe care-l
are, contaminarea femeii gravide soldandu-se cu avortul sau moartea
fatului.
Prin detectarea serologica a toxoplasmozei la ovine se reduc prevalenta
infestatiei parazitare la acestea, pierderile economice reprezentate de
avorturi, fatari de produsi neviabili, dar scad si sursele de infestare pentru
om.
Principiul metodei : Anticorpii anti Toxoplasma gondii, de tip IgG
din ser, sunt detectati prin testul ELISA varianta indirecta. In test,
anticorpii reactioneaza specific cu antigenul Toxoplasma gondii fixat pe
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
13
imunosorbent (microplaca) si apoi cu conjugatul anti IgG de oaie marcat
cu peroxidaza. Complexul antigen-anticorp specific- anti IgG oaie
peroxidaza format, este evidentiat prin actiunea enzimei asupra substratului
specific (H2O2), cu modificarea culorii unui cromogen (ABTS) care se
oxideaza, intensitatea culorii fiind determinata fotometric la 405 nm si
exprimata in unitati densitate optica (DO). Reactia se interpreteaza in
raport cu valorile DO ale martorilor pozitiv si negativ. Pentru detectia
anticorpilor din ser anti- Toxoplasma gondii, trusa ELI-ToxO utilizeaza
un antigen solubil total.
Instructiuni de folosire:
Principiul metodei : Anticorpii anti-Toxoplasma gondii, de tip IgG, din ser,
sunt detectati prin tehnica ELISA, varianta indirecta. In test, anticorpii
reactioneaza specific cu antigenul Toxoplasma gondii fixat pe
imunosorbent (microplaca) siapoi cu conjugatul anti-IgG oaie marcat cu
peroxidaza. Complexul antigen-anticorp specific- anti-anticorp-peroxidaza
format, este evidentiat prin actiunea enzimei asupra substratului specific
(H2O2), cu modificarea culorii unui cromogen (ABTS) care se oxideaza,
intensitatea culorii fiind determinata fotometric la 405 nm. Reactia se
interpreteaza in raport cu valorile densitatilor optice ale martorilor pozitiv
si negativ.
Probe de examinat : Probe de seruri prelevate dupa coagularea sangelui
recoltat de la ovine. Tuburile cu probe de testat trebuie sa fie inchise
ermetic pentru a se evita impurificarile de orice fel. Pana la utilizare in test,
probele se pastreaza la congelator la 20oC.
Modul de lucru :
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
14
Materiale necesare in dotarea laboratorului:
- apa distilata/ deionizata; pipete mono- si multicanal, reglabile si fixe, 2-1000 l; - pipete sticla 10 ml; eprubete/ tuburi polietilena 1-2 ml si sticla 10-20 ml;
- hartie absorbanta (filtru/sugativa); alcool sanitar;
- incubator prevazut cu agitare pentru placi ELISA;
- aparat de spalare automata pentru placi ELISA;
- fotometru multicanal (uv/vis) cu cititor de placi ELISA la 405 nm si imprimanta.
Prepararea reagentilor
Echilibrarea termica a reagentilor:
Componentele trusei, cu exceptia conjugatului 100X se aduc la temperatura
camerei cu cel putin 30 minute inainte de lucru. Dupa echilibrare termica se
agita usor pentru omogenizare. Se vor efectua dilutii conform celor de mai
jos pentru fiecare placa din trusele ELI-Tox-O.
Diluarea martorilor de reactie:
Martorii de reactie, pozitiv si negativ se dilueaza 1/10 in diluantul pentru ser
si conjugat in modul urmator:
25 l martor pozitiv 10X + 225 l diluant 25 l martor negativ 10X + 225 l diluant Diluarea probelor de testat:
Probele de testat (seruri prelevate dupa coagularea sangelui recoltat de la oi)
se dilueaza 1/100 in diluant pentru ser si conjugat in doua etape in modul
urmator:
dilutie 1/10: 10 l proba + 90 l diluant pentru ser si conjugat, dilutie 1/10: 20 l proba diluata 1/10 + 180 l diluant pentru ser si conjugat. Diluarea conjugatului anti - IgG oaie marcat cu peroxidaza:
Conjugatul anti IgG de oaie marcat cu peroxidaza se dilueaza 1/100 in
diluant pentru ser si conjugat in modul urmator:
100 l conjugat + 9,9 ml diluant pentru ser si conjugat.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
15
Diluarea solutiei de spalare 10X:
Solutia de spalare se dilueaza 1/10 cu apa distilata in modul urmator:
30 ml solutie de spalare 10X + 270 ml apa distilata.
Modul de executare a testului:
Reactia cu serul:
Martorul de reactivi: se pipeteaza 100 l diluant pentru ser si conjugat in godeul A1.
Martorii de reactie (pozitiv si negativ) diluati se distribuie in dublet, cate 100
l/godeu. Probele de testat (diluate conform instructiunilor de mai sus) se distribuie fiecare in cate un godeu, cate 100 l/godeu (90 probe/placa). Se incubeaza placa 60 minute la 37 oC, cu agitare.Se spala placa de trei ori cu
250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de filtru.
Reactia cu conjugatul imunoenzimatic:
Se adauga in toate godeurile cate 100 l conjugat diluat (1/100 in diluant pentru ser si conjugat). Se incubeaza 60 minute la 37 oC, cu agitare.
Se spala placa de trei ori cu 250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de
filtru.
Reactia cu substratul specific enzimei:
Se prepara substratul: peste 11 ml substrat de perhidrol in tampon citrat se
adauga 0,45 ml solutie ABTS si se agita usor pentru omogenizare. Se
distribuie in fiecare godeu cate 100 l. Placa se lasa la intuneric, la temperatura camerei. Intre timp, se prepara reactivul de stopare: se dilueaza
agentul de stopare (NaF) in 6 ml apa distilata.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
16
Dupa 30 minute placa se citeste la fotometru multicanal, fata de martorul de
reactivi, la 405 nm si:
- daca parametrii de validare sunt indepliniti, reactia se stopeaza imediat cu
50 l/godeu din solutia de stopare - daca parametrii de validare nu sunt indepliniti, se lasa placa pana la 60
minute dupa care se stopeaza ca mai sus si se citesc valorile finale ale DO
fata de martorul de reactivi.
Criterii de validare :
- Valoarea DO (media) martorului negativ: mai mica de 0,200;
- Valoarea DO (media) martorului pozitiv: mai mare de 0,800.
Interpretarea rezultatelor :
Se calculeaza valoarea S/P pentru fiecare proba conform formulei:
S/P = (DOproba - DO martor negativ)/ (DOmartor pozitiv - DO martor negativ)
a) probele pentru care valorile S/P 0,25 sunt considerate pozitive;
b) probele pentru care valorile S/P < 0,15 sunt considerate negative;
c) probele pentru care 0,15< S/P 0,25 sunt considerate dubioase si animalele de la care provin trebuie retestate dupa 30 zile.
Norme de preparare a setului de diagnostic ELISA Eli-Tox-O :
Prepararea componentelor setului :
Microplaci ELISA peliculizate/captusite cu antigen
Microplaci ELISA cu 96 godeuri captusite cu antigen Toxoplasma gondii
care recunoaste si fixeaza anticorpii specifici din probe de seruri prelevate
dupa coagularea sangelui recoltat de la oi.
Modul de preparare:
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
17
Prepararea antigenului somatic total de Toxoplasma gondii: Antigenul
somatic total este utilizat pentru captusirea microplacilor de reactie care intra
in componenta trusei ELI-Tox O.
Pentru prepararea antigenului Toxoplasma gondii utilizat in tenica ELISA,
varianta indireacta s-au utilizat paraziti recoltati din exsudatul peritoneal de la
soareci infestati cu tulpina RH de Toxoplasma gondii.
Prepararea antigenului se realizeaza in mai multe etape:
- recoltarea exsudatului peritoneal, cu parazitul sub forma de trofozoid de la
soarecii inoculati anterior cu tulpina RH de Toxoplasma gondii; recoltarea
efectuandu-se la 4-5 zile de la inocularea intraperitoneala a soarecilor;
- reluarea exsudatului peritoneal recoltat de la soareci, pe tampon fosfat salin
0,01M (PBS) steril, pH=7,4;
- filtrarea suspensiei parazitare obtinute printr-un filtru de 3mm;
- prelucrarea suspensiei parazitare filtrate prin 3 cicluri de inghetare -
dezghetare, urmate de ultrasonicare de 10 ori, 35W/30 sec./ciclu;
- ultracentrifugarea suspensiei obtinute anterior la 10000 rpm, 40 min la 4 oC;
- supernatantul reprezinta antigenul solubil total utilizat in tehnica ELISA.
Continutul de proteina (determinat prin metoda Lowry) al antigenului
Toxoplasma gondii trebuie sa fie mai mare de 1 mg/ml.
Antigenul Toxoplasma gondii se depoziteaza la congelator la 20 oC pana ce
este utilizat la captusirea placilor ELISA.
Captusirea/peliculizarea placilor cu antigen:
Antigenul Toxoplasma gondii se dilueaza in hidroxid de sodiu 0,1M si se
distribuie cate 100 l in godeurile microplacii. Se incubeaza placa timp de 60 minute la 37 oC, cu agitare. Dupa incubare, placile se spala, se trateaza cu
solutie stabilizatoare si se usuca la 30 oC in curent de aer.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
18
Controlul peliculizarii cu antigen:
Se efectueaza prin sondaj, de catre producator, prin tehnica ELISA.
Modul de ambalare a placilor peliculizate cu antigen:
Microplacile captusite / peliculizate cu antigen se ambaleaza individual, in
folie de plastic sau metalizata, etichetata/inscriptionata cu: denumirea
producatorului;
denumirea produsului; seria; valabilitatea.
Conservarea placilor peliculizate cu antigen: La 2 8 oC, in ambalajul
original.
Valabilitatea placilor peliculizate cu antigen: 6 luni de la data prepararii, in
conditiile mentionate mai sus.
Martor pozitiv anti - Toxoplasma gondii.
Martorul pozitiv este ser sanguin de oaie obtinut prin imunizarea acesteia cu
antigen Toxoplasma gondii.
Modul de preparare:
Oi adulte sunt imunizate prin inoculare cu trofozoiti de Toxoplasma gondii,
intraperitoneal, cu 400 000 trofozoiti/ml de inocul.
Controlul martorului pozitiv:
Martorul pozitiv trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, de culoare alb-
galbuie sau slab rosiatica.
Stabilirea titrului anticorpilor anti Toxoplasma gondii se realizeaza prin
tehnica ELISA . Densitatea optica a martorului pozitiv trebuie sa fie mai
mare de 0,800.
Ambalare si etichetare:
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
19
In trusa ELI-Tox-O, martorul pozitiv se livreaza prediluat, ambalat in
flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand cantitatea necesara
pentru lucru.
Fiecare flacon va purta o eticheta pe care sunt inscriptionate: numele
producatorului; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.
Conditii de pastrare:Martorul pozitiv se pastreaza la 28oC, in ambalajul
original.
Valabilitate: Martorul pozitiv este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in
conditiile de pastrare mentionate mai sus.
Martorul negativ de oaie utilizat in Eli-Tox-O :
Martorul negativ este ser sanguin provenit de la ovine libere de
toxoplasmoza, oi provenite dintr-un efectiv in care nu s-au inregistrat avorturi
de origine parazitara.
Controlul martorului :
Martorul negativ trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, de culoare alb-
galbuie sau slab rosiatica.
Stabilirea titrului anticorpilor anti Toxoplasma gondii se realizeaza prin
tehnica ELISA. Densitatea optica a martorului negativ trebuie sa fie mai mica
de 0,200.
Ambalare si etichetare:
In trusa ELI-Tox-O, martorul negativ se livreaza prediluat, ambalat in
flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand cantitatea necesara
pentru lucru.
Fiecare flacon va purta o eticheta pe care sunt inscriptionate: numele
producatorului; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
20
Conditii de pastrare: Martorul negativ se pastreaza la 2 8 oC, in ambalajul
original.
Valabilitate: Martorul negativ este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in
conditiile de pastrare mentionate mai sus.
Conjugatul imunoenzimatic anti-IgG oaie 100X
Definitia produsului:
Conjugatul imunoenzimatic anti IgG oaie este o imunoglobulina de iepure
anti IgG oaie, cuplata cu peroxidaza, utilizata la determinarea concentratiei
de anticorpi specifici fata de un antigen patogen, prin testul ELISA, varianta
indirecta. Produsul se prezinta sub forma unei solutii clare sau usor
opalescente, de culoare brun-roscata, fara miros.
Modul de preparare: reagent preparat in S.N. Institutul Pasteur S.A.
Peroxidaza (produs comercial) se dizolva in solutie de bicarbonat de sodiu si
se trateaza cu o solutie alcoolica de 2,4-dinitrofluorbenzen 1N la temperatura
camerei. In continuare, se adauga o solutie de periodat de sodiu si, dupa 30-
60 minute, etilenglicol 0,16M. Amestecul se dializeaza fata de tampon
carbonat pH= 9,5. Se adauga imunoglobulina de iepure anti IgG oaie si
amestecul se tine 2 ore la 20 oC. Conjugatul se stabilizeaza cu borohidrura de
sodiu, apoi se dializeaza fata de tampon fosfat. Produsul se utilizeaza
nepurificat. In final, conjugatul obtinut se amesteca cu o solutie
stabilizatoare.
Controlul conjugatului:
Control organoleptic: Produsul trebuie sa fie clar, brun-roscat, fara miros.
Identificare: Se adauga o picatura de conjugat peste 1 ml solutie de substrat
(perhidrol in tampon citrat cu cromogen ABTS). Apare imediat o culoare
intensa, verde, de cromogen oxidat.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
21
Controlul calitatii conjugatelor s-a efectuat prin determinarea urmatoarelor
criterii de calitate: raportul absorbantelor proteinei marcate la 403 nm si 280
nm, specificitatea de specie si capacitatea de anticorp.
Raportul absorbantelor proteinei marcate reflecta gradul de marcare al
anticorpului cu enzima (peroxidaza). Acest raport este limitat de capacitatea
maxima de legare a peroxidazei (sase molecule de peroxidaza la o molecula
de anticorp), avand valori intre 0,3 0,5.
Dupa prepararea conjugatelor, acestea sunt diluate 1/10 in tampon fosfat
0,1M. Citirea absorbantelor se face la un spectrofotometru la lungimile de
unda de 403 si 280 nm.
Determinarea specificitatii de specie si a capacitatii de anticorp a
conjugatului:
Reactivi: tampon carbonat 0,1 M, pH 9,6; albumina serica bovina (BSA);
lichid de diluare; ser normal de pasare; ser normal de cal; ser normal de bou;
ser normal de oaie; ser normal de porc; ser normal de iepure; substrat:
perhidrol in tampon citrat; cromogen: solutie ABTS; lichid de spalare; solutie
de stopare.
Efectuarea determinarii: Se peliculizeaza obisnuit o placa ELISA cu ser
normal de pasare, de cal, de bou, de oaie, de porc, de iepure, in dilutii 1/100
in tampon carbonat (cel putin un rand de godeuri pentru fiecare ser de
specie).
Dupa spalare, se adauga conjugatul IgG de iepure anti IgG oaie, diluat la
dilutia de lucru in PBS cu tween si 1% BSA si se incubeaza o ora la 37 oC.
Dupa spalare, se adauga substratul si cromogenul in conformitate cu
instructiunile de folosire a trusei.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
22
Conjugatul se considera specific si cu capacitate de anticorp satisfacatoare
pentru Ig din specia recomandata omologa daca are DO de cel putin 10 ori
mai mare decat DO corespunzatoare serurilor heterologe.
Alegerea dilutiei de conjugat pentru varianta indirecta a testului se face prin
analiza rezultatelor ELISA obtinute pe placi peliculizate cu antigen
Toxoplasma gondii si seruri martor de reactie, in sistem analitic complet,
similar cu cel de diagnostic. S-a ales dilutia de 1/100 pentru conjugat in
diluantul pentru ser si conjugat.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-O, conjugatul se ambaleaza in
flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, in cantitate corespunzatoare pentru
lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii
producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.
Conditii de conservare: La 2 8 oC, ferit de lumina, in ambalajul original.
Valabilitate: 12 luni de la data prepararii, in conditiile de conservare
mentionate mai sus.
Prepararea substratului (solutie perhidrol in tampon citrat): Substratul este o
solutie de peroxid de hidrogen in tampon citrat 2,3%, pH 4. Se utilizeaza
conform instructiunilor din trusa ELI-Tox-O.
Caracteristici: Substratul se prezinta ca un lichid clar, incolor, cu pH 4.
Modul de preparare: Se cantaresc 6,9 g acid citric (C6H8O7 x H2O) si se
dizolva in 2,5 l apa distilata. Se ajusteaza pH-ul la 4 cu o solutie de NaOH
30%. Se completeaza cu apa distilata pana la un volum final de 3 l. Se
controleaza pH-ul final care trebuie sa fie 4. Se adauga cantitatea necesara de
perhidrol si se sterilizeaza prin filtrare.
Conditionare: Solutia se conditioneaza in flacoane brune la volume de 11 ml,
25 ml si 60 ml.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
23
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-O, substratul, ambalat in flacoane
inchise ermetic, se afla in cantitatea necesara pentru lucru. Fiecare flacon va
purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea
produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Substratul se pastreaza la 2 8 oC, ferit de lumina.
Valabilitate : Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de pastrare mentionate mai sus.
Prepararea si controlul cromogenului (solutie de ABTS) : Cromogenul este o
solutie apoasa de ABTS (2,2Azinodi(3-etil) benztiazolin sulfat) 1,5%. Se
utilizeaza conform instructiunilor din trusa.
Caracteristicile produsului: Solutie limpede de culoare verde.
Modul de preparare: Se cantaresc 2,25 g ABTS si se dizolva in 0,15 l apa
distilata.
Se sterilizeaza prin filtrare.
Controlul cromogenului: Solutia de cromogen trebuie sa fie limpede, de
culoare verde.
Conditionare: Solutia de cromogen se fioleaza in flacoane, in volume de 0,6
ml, 1,2 ml sau 3 ml.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-O, cromogenul se ambaleaza in
cantitatile necesare pentru lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta
inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea produsului;
numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Solutia de cromogen se pastreaza la 2 8 oC, ferita de
lumina, in ambalajul original.
Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de conservare mentionate mai sus.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
24
Prepararea diluantului pentru ser si conjugat : Diluantul pentru ser si conjugat
este reprezentat de tampon fosfat salin 0,01M cu 1% albumina serica bovina,
0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si pH 7,2 7,4. Se utilizeaza conform
instructiunilor din trusa.
Caracteristicile produsului: Lichid clar cu nuanta verzuie si pH 7,27,4. La
agitare produce spuma.
Modul de preparare:
Solutia A: 12,78 g Na2HPO4 anh.
76,5 g NaCl
ad. 9000 ml apa distilata.
Solutia B: 1,38 g NaH2PO4 x H2O
8,5 g NaCl
ad. 1000 ml apa distilata.
Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 7,2 7,4.
Se adauga 1% albumina serica bovina, 0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si
colorantul. Se sterilizeaza prin filtrare si se conditioneaza in flacoane de
sticla/plastic inchise ermetic la volume de 60 ml, 100 ml, 120 ml.
Control pe flux: Diluantul pentru ser si conjugat trebuie sa se prezinte ca o
solutie limpede de nuanta verzuie, cu pH 7,2 7,4.
Ambalare si etichetare: In trusa, produsul se ambaleaza in cantitate
corespunzatoare necesarului de lucru.
Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii
producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Diluantul pentru ser si conjugat se pastreaza la 28 oC,
in ambalajul original.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
25
Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de conservare mentionate mai sus.
Prepararea solutiei de spalare 10X: Solutia de spalare 10X este reprezentata
de tampon fosfat salin 0,1M, pH 6,86,9 cu 0,5% tween 20 si 0,01%
thiomersal. Se utilizeaza la spalarea placilor, conform instructiunilor din
trusa.
Caracteristicile produsului: Se prezinta ca un lichid clar care prin agitare
produce spuma. Daca solutia de spalare 10X prezinta un depozit cristalin, se
aduce la temperatura camerei si se agita ca toate cristalele sa se dizolve, iar
apoi se dilueaza conform instructiunilor din trusa.
Mod de preparare:
Solutia A: 14,2 g Na2HPO4 anh.
85 g NaCl
ad. 1000 ml apa distilata.
Solutia B: 13,8 g NaH2PO4 x H2O
85 g NaCl
ad. 1000 ml apa distilata.
Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 6,8 6,9. Se adauga
0,5% tween 20 si 0,01% thiomersal. Solutia se sterilizeaza prin filtrare si se
conditioneaza in flacoane de 50 ml si 60 ml.
Control pe flux: Solutia de spalare trebuie sa se prezinte ca un lichid clar cu
pH- ul cuprins intre 6,86,9. Dupa diluare 1/10 in apa distilata, pH-ul devine
7,2 7,4.
Ambalare si etichetare: In trusa, produsul se ambaleaza in cantitate
corespunzatoare necesarului de lucru.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
26
Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii
producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Solutia de spalare 10X se pastreaza la 28 oC, in
ambalajul original.
Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de conservare mentionate mai sus.
Reactivul de stopare : Reactivul de stopare este NaF care se utilizeaza in trusa
ca solutie 1,5%.
Se cantaresc 0,09 g/flacon, 0,18 g/flacon sau 0,45 g/flacon.
Produsul este ambalat in flacoane de sticla/plastic, in cantitate
corespunzatoare pentru lucru.
Norme tehnice de control :
Determinarea intensitatii raspunsului probelor martor
Intensitatea raspunsului probelor martor se executa prin tehnica ELISA,
varianta indirecta. Titrurile martorilor de reactie (la dilutia mentionata in
instuctiunile de folosire a trusei) trebuie sa corespunda normelor tehnice:
DOn < 0,200 DOp > 0,800
Aceste valori reprezinta criteriile de validare ale trusei.
Variabilitate inter-godeuri:
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, cate 4 godeuri/ser,
in patru zone ale placii.
conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
27
Coeficientul de variabilitate (deviatia standard a replicatelor/media
replicatelor) trebuie sa fie sub 0,2.
Variabilitate inter-placii:
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, 5 placi, cate 4
godeuri/ser/placa, in patru zone ale placilor.
conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.
Coeficientul de variabilitate (deviatia standard a replicatelor/media
replicatelor) trebuie sa fie sub 0,2.
Detectabilitatea : Curba de titrare a serului martor pozitiv, aplicat in 9 dilutii
(1/10; 1/15; 1/20; 1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve
proportionalitatea dintre titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si
valoarea DO. Valoarea limitei de pozitivare (cut-off pozitiv) trebuie sa fie
mai mica decat valoarea DO a serului martor pozitiv la dilutia 1/20.
Specificitatea: Determinarea specificitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor
testa 10 seruri prelevate de la oi confirmate ca fiind negative printr-un alt test
(testul de imunofluorescenta indirecta).
Cele 10 seruri trebuie sa fie negative si prin testare cu trusa ELI-Tox-O.
Sensibilitatea : Determinarea sensibilitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor
testa 10 seruri negative si 10 seruri pozitive confirmate printr-un alt test
(testul de imunofluorescenta indirecta).
Cele 10 seruri negative trebuie sa fie intotdeauna negative si cele 10 seruri
pozitive sa fie intotdeauna pozitive prin testare cu trusa ELI-Tox-O.
Reproductibilitatea
Controlul reproductibilitatii intraplaca:
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
28
Se vor testa in duplicat 10 seruri negative si 10 seruri pozitive confirmate
printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).
Coeficientii de variatie ai densitatilor optice trebuie sa se situeze sub 20%.
Controlul reproductibilitatii interplaci:
Se vor testa, pe cate doua placi, 10 seruri negative si 10 seruri pozitive
confirmate printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).
Coeficientii de variatie ai densitatilor optice trebuie sa se situeze sub 20%.
Valabilitate
Toti parametrii calitativi trebuie sa se reproduca in perioada de valabilitate, in
conditiile de conservare specificate in normele tehnice.
Performantele produsului
Limita de detectie:
Serurilor martor (pozitiv si negativ) au fost titrate, stabilindu-se limita de
detectie a testului.
Curba de titrare a martorului pozitiv, aplicat in 9 dilutii (1/10; 1/15; 1/20;
1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve proportionalitatea dintre
titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si valoarea DO. Rezultate:
30 min
dilutie Mp Mn 60 min
dilutie Mp Mn
1/10 1.443 0.075 1/10 2.217 0.108
1/15 1.257 0.057 1/15 1.996 0.078
1/20 1.068 0.047 1/20 1.690 0.065
1/25 1.013 0.043 1/25 1.629 0.055
1/30 0.980 0.038 1/30 1.526 0.048
1/35 0.924 0.036 1/35 1.447 0.046
1/40 0.825 0.031 1/40 1.287 0.043
1/45 0.802 0.029 1/45 1.252 0.041
1/50 0.759 0.024 1/50 1.168 0.039
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
29
Controlul valorii de diagnostic al testului ELISA s-a realizat prin efectuarea
de teste comparative cu alte teste, pe probe din teren (probe de seruri
provenite de la oi). Astfel, au fost testate 69 probe, iar ca teste comparative
s-a utilizat testul de imunofluorescenta indirecta (IFI).
Rezultate: Probele pozitive testate prin IFI au fost pozitive la ELISA, iar cele
negative s-au prezentat la ELISA ca fiind negative .
Sensibilitate: (10 probe de la oi, IFI pozitive)
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutii:
- pentru martorii de reactie: 1/10 in diluant pentru ser si conjugat
- pentru probele de testat: 1/100 in diluant pentru ser si conjugat.
Conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.
REZULTATE: DO: 1,621 S/P = (1,621 0,075)/(1,443-0,075) = 1,546/1,368 = 1,13
1,257 S/P = (1,257 0,075)/(1,443-0,075) = 1,182/1,368 = 0,864
1,033 S/P = (1,033 0,075)/(1,443-0,075)= 0,958/1,368 = 0,700
0,602 S/P = (0,602 0,075)/(1,443-0,075)= 0,527/1,368 = 0,385
1,526 S/P = (1,526 0,075)/(1,443-0,075)= 1,451/1,368 = 1,060
0,454 S/P = (0,454 0,075)/(1,443-0,075)= 0,379/1,368 = 0,277
1,822 S/P = (1,822 0,075)/(1,443-0,075)= 1,747/1,368 = 1,277
1,610 S/P = (1,610 0,075)/(1,443-0,075) = 1,535/1,368 = 1,122
0,509 S/P = (0,509 0,075)/(1,443-0,075)= 0,434/1,368 = 0,317
0,770 S/P = (0,770 0,075)/(1,443-0,075)= 0,695/1,368 = 0,508
Mp: 1,443
Mn: 0,075
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
30
Valorile S/P seruri testate > 0,25 Concluzie: toate probele testate sunt pozitive.
Specificitate: (10 probe de la oi, IFI negative)
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutii:
- pentru martorii de reactie: 1/10 in diluant pentru ser si conjugat
- pentru probele de testat: 1/100 in diluant pentru ser si conjugat.
Conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.
Rezultate:
DO: 0,143 S/P = (0,143 0,075)/(1,443-0,075)= 0,068/1,368 = 0,049
0,254 S/P = (0,254 0,075)/(1,443-0,075)= 0,179/1,368 = 0,130
0,146 S/P = (0,146 0,075)/(1,443-0,075)= 0,071/1,368 = 0,052
0,171 S/P = (0,171 0,075)/(1,443-0,075)= 0,096/1,368 = 0,070
0,155 S/P = (0,155 0,075)/(1,443-0,075)= 0,080/1,368 = 0,058
0,154 S/P = (0,154 0,075)/(1,443-0,075)= 0,079/1,368 = 0,057
0,193 S/P = (0,193 0,075)/(1,443-0,075)= 0,118/1,368 = 0,086
0,271 S/P = (0,271 0,075)/(1,443-0,075)= 0,196/1,368 = 0,143
0,134 S/P = (0,134 0,075)/(1,443-0,075)= 0,059/1,368 = 0,043
0,239 S/P = (0,239 0,075)/(1,443-0,075)= 0,164/1,368 = 0,119
Mp: 1,443
Mn: 0,075
Valorile S/P seruri testate < 0,25 Concluzie: toate probele testate sunt negative. Repetabilitate:
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
31
Au fost testate, din punct de vedere al repetabilitatii, serurile martor si s-au
obtinut urmatoarele valori ale coeficientilor de variabilitate inter-godeuri:
Placa 1: citire 30 min. godeu 1 godeu 2 godeu 3 godeu 4 Coef. variab. (%)
Mp 1.485 1.452 1.432 1.459 1.502 Mn 0.075 0.075 0.072 0.072 2.356 Mp 1.449 1.438 1.463 1.458 0.756 Mn 0.074 0.071 0.069 0.075 3.811 Mp 1.410 1.436 1.428 1.432 0.804 Mn 0.078 0.075 0.075 0.077 1.967 Mp 1.428 1.461 1.435 1.451 1.038 Mn 0.073 0.072 0.077 0.075 2.986
Placa 2: citire 7 min. godeu 1 godeu 2 godeu 3 godeu 4 Coef. variab. (%)
Mp 1.465 1.466 1.450 1.458 0.507 Mn 0.076 0.079 0.078 0.077 1.665 Mp 1.436 1.455 1.463 1.463 0.875 Mn 0.078 0.074 0.072 0.079 4.361 Mp 1.399 1.421 1.419 1.430 0.922 Mn 0.079 0.076 0.076 0.081 3.140 Mp 1.413 1.432 1.436 1.445 0.941 Mn 0.075 0.074 0.071 0.075 2.566
Au fost testate, din punct de vedere al repetabilitatii, serurile martor si
s-au obtinut urmatoarele valori ale coeficientilor de variabilitate inter-placi: Rezultate: citire 30 minute
Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Coef. variab. (%) 1.448 1.470 1.459 1.456 0.624 1.450 1.440 1.452 1.439 0.463 1.443 1.396 1.397 1.399 1.623
0.0735 0.07225 0.07625 0.07425 2.262 0.0775 0.07575 0.078 0.07375 2.525
0.07625 0.078 0.078 0.07625 1.604
Valoarea de diagnostic a testului ELISA, comparativ cu alte teste :
Valoarea de diagnostic a testului ELISA cu trusa ELI-Tox-O a fost stabilita
comparativ cu IFI (testul de imunofluorescenta indirecta).
Au fost testare un numar de probe 69, seruri prelevate de la oi si s-au
obtinut urmatoarele rezultate:
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
32
ELI-Tox O IFI
Probe testate 69 69
Probe pozitive 43 45
Probe negative 23 24
Probe dubioase 3 -
ELI-Tox-P: Set de diagnostic al toxoplasmozei la porcine
ELI-Tox P: Ansamblu de componente pentru detectia anticorpilor de tip
IgG anti-Toxoplasma gondii din serul sanguin de la porcine prin tehnica
imunoenzimatica (ELISA varianta indirecta).
Scopul utilizarii : Diagnosticul toxoplasmozei (detectarea anticorpilor de
tip IgG) pe seruri provenite de la porcine prin tehnica ELISA-varianta
indirecta.
Forma de prezentare : Trusa cu componente necesare pentru 92 probe, 184
probe sau 460 probe.
Componentele produsului : Trusa ELI-Tox-P cuprinde urmatoarele
componente, ambalate individual, in cantitati corespunzatoare necesarului
de lucru: Nr.
crt.
Component U/M Cantitate
pentru 92
probe
Cantitate
pentru 184
probe
Cantitate
pentru 460
probe
1. Microplaca ELISA peliculizata cu
antigen Toxoplasma gondii
buc. 1 2 5
2. Martor pozitiv 10X ml 0,1 0,2 0.5
3. Martor negativ 10X ml 0,1 0,2 0.5
4. Conjugat anti-IgG porc marcat cu
peroxidaza
ml 0,125 0,250 0.600
5. Substrat de perhidrol in tampon citrat ml 11 22 55
6. Cromogen (solutie ABTS) ml 0,6 1,2 3
7. Diluant pentru seruri si conjugat ml 100 120 240
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
33
8. Solutie de spalare 10 X ml 50 60 120
9. Reactiv de stopare NaF g 0,09 0,18 0.45
10. Instructiuni de folosire a trusei buc. 1 1 1
a) Microplaca ELISA este peliculizata (captusita) cu antigen purificat
stabilizat de Toxoplasma gondii, spalata si uscata, ambalata in folie de
plastic sau metalizata, gata de utilizare.
b) Martorul pozitiv este obtinut de la porci imunizati cu antigen
Toxoplasma gondii purificat. Se prezinta ca un lichid clar, alb-galbui si
contine stabilizator. Se dilueaza 1/10 pentru lucru.
c) Martorul negativ este recoltat de la porci liberi de toxoplasmoza. Se
prezinta ca un lichid clar, alb-galbui si contine stabilizator. Se dilueaza
1/10 pentru lucru.
d) Conjugatul anti-IgG porc este reprezentat de IgG capra anti-IgG de
porc, cuplata cu peroxidaza. Se prezinta ca un lichid clar, de culoare brun-
roscata, concentrat de 100 de ori. Contine stabilizator. Se dilueaza pentru
lucru.
e) Substratul este o solutie de perhidrol (H2O2) in tampon citrat. Se prezinta
ca un lichid clar, incolor.
f) Cromogenul este o solutie concentrata de ABTS. Se prezinta ca un lichid
clar, de culoare verde si este gata de utilizare.
g) Diluantul pentru seruri si conjugat este reprezentat de un tampon fosfat
cu adaos de albumina serica bovina si conservant. Se prezinta ca un lichid
clar de nuanta verzuie si este gata de utilizare. Prin agitare produce spuma.
h) Solutia de spalare se prezinta ca un lichid clar care prin agitare produce
spuma. Este concentrat de 10 ori. Se dilueaza pentru lucru.
i) Reactivul de stopare (NaF) este o pulbere cristalina de culoare alba. Se
dizolva in apa distilata pentru lucru.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
34
Conditii de conservare : Trusa ELI-Tox-P se pastreaza la 2-8 oC, in
ambalajul original.
Valabilitate : 12 luni de la data fabricatiei, in conditiile mentionate mai sus.
Informatii generale despre boala : Toxoplasmoza este o zoonoza care
afecteaza omul si numeroase specii de animale homeoterme si pasari, fiind
raspandita pe tot globul. Rezervorul de infestare are doua componente si
anume: abiotica- unde se dezvolta oochisturile si biotica- reprezentata de
toate speciile de mamifere din genul Felix si Lynx- gazde definitive ale
parazitului Toxoplasma gondii. Gazdele intermediare sunt reprezentate de
om si alte homeoterme care se pot manifesta si pot fi si surse de infestare
cu Toxoplasma gondii. Toxoplasmoza poate fi considerata ca fiind una
dintre cele mai importante zoonoze, prin impactul social deosebit pe care-l
are, contaminarea femeii gravide soldandu-se cu avortul sau moartea
fatului.
Prin detectarea serologica a toxoplasmozei la porcine se reduc prevalenta
infestatiei parazitare la acestea, pierderile economice reprezentate de
avorturi, fatari de produsi neviabili, dar scad si sursele de infestare pentru
om.
Principiul metodei :
Anticorpii anti Toxoplasma gondii, de tip IgG din ser, sunt detectati prin
testul ELISA varianta indirecta. In test, anticorpii reactioneaza specific cu
antigenul Toxoplasma gondii fixat pe imunosorbent (microplaca) si apoi
cu conjugatul anti IgG de porc marcat cu peroxidaza. Complexul antigen-
anticorp specific- anti IgG porc peroxidaza format, este evidentiat prin
actiunea enzimei asupra substratului specific (H2O2), cu modificarea culorii
unui cromogen (ABTS) care se oxideaza, intensitatea culorii fiind
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
35
determinata fotometric la 405 nm si exprimata in unitati densitate optica
(DO). Reactia se interpreteaza in raport cu valorile DO ale martorilor
pozitiv si negativ.
Pentru detectia anticorpilor din ser anti- Toxoplasma gondii, trusa ELI-
ToxoP utilizeaza un antigen solubil total.
Instructiuni de folosire trusa Eli-Tox-P pentru diagnosticul
imunoenzimatic al toxoplasmozei la porcine:
Scopul utilizarii : Eli-Tox-P este o trusa de diagnostic, bazata pe tehnica
ELISA, varianta indirecta, utilizata in detectarea anticorpilor de tip IgG
anti-Toxoplasma gondii din seruri de porcine.
Anticorpii specifici anti-Toxoplasma gondii din serurilerecoltate de la
porcine recunosc antigenul T. gondii utilizat la captusirea microplacilor.
Principiul metodei : Anticorpii anti-Toxoplasma gondii, de tip IgG, din ser,
sunt detectati prin tehnica ELISA, varianta indirecta. In test, anticorpii
reactioneaza specific cu antigenul Toxoplasma gondii fixat pe
imunosorbent (microplaca) si apoi cu conjugatul anti-IgG de porc marcat
cu peroxidaza. Complexul antigen-anticorp specific-anti-anticorp-
peroxidaza format este evidentiat prin actiunea enzimei asupra substratului
specific (H2O2), cu modificarea culorii unui cromogen (ABTS) care se
oxideaza, intensitatea culorii fiind determinata fotometric la 405 nm.
Reactia se interpreteaza in raport cu valorile densitatilor optice ale
martorilor pozitiv si negativ.
Probe de examinat: Probe de seruri prelevate dupa coagularea sangelui
recoltat de la porcine. Tuburile cu probe de testat trebuie sa fie inchise
ermetic pentru a se evita impurificarile de orice fel. Pana la utilizare in test,
probele se pastreaza la congelator la 20oC.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
36
Modul de lucru :
Materiale necesare in dotarea laboratorului: apa distilata/ deionizata;
pipete mono- si multicanal, reglabile si fixe, 2-1000 l; pipete sticla 10 ml; eprubete/ tuburi polietilena 1-2 ml si sticla 10-20 ml; hartie absorbanta
(filtru/sugativa); alcool sanitar; incubator prevazut cu agitare pentru placi
ELISA; aparat de spalare automata pentru placi ELISA; fotometru
multicanal (uv/vis) cu cititor de placi ELISA la 405 nm si imprimanta.
Prepararea reagentilor
Echilibrarea termica a reagentilor:
Componentele trusei, cu exceptia conjugatului 100X se aduc la temperatura
camerei cu cel putin 30 minute inainte de lucru. Dupa echilibrare termica
se agita usor pentru omogenizare. Se vor efectua dilutii conform celor de
mai jos pentru fiecare placa din trusele ELI-Tox-P.
Diluarea martorilor de reactie:
Martorii de reactie, pozitiv si negativ se dilueaza 1/10 in diluantul pentru
ser si conjugat in modul urmator:
25 l martor pozitiv 10X + 225 l diluant 25 l martor negativ 10X + 225 l diluant Diluarea probelor de testat:
Probele de testat (seruri prelevate dupa coagularea sangelui recoltat de la
porci) se dilueaza 1/400 in diluant pentru ser si conjugat in doua etape in
modul urmator:
dilutie 1/20: 10 l proba + 190 l diluant pentru ser si conjugat, dilutie 1/20: 10 l proba diluata 1/20 + 190 l diluant pentru ser si conjugat.
Diluarea conjugatului anti - IgG porc marcat cu peroxidaza:
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
37
Conjugatul anti IgG de porc marcat cu peroxidaza se dilueaza 1/100 in
diluant pentru ser si conjugat in modul urmator:
100 l conjugat + 9,9 ml diluant pentru ser si conjugat. Diluarea solutiei de spalare 10X:
Solutia de spalare se dilueaza 1/10 cu apa distilata in modul urmator:
30 ml solutie de spalare 10X + 270 ml apa distilata.
Modul de executare a testului:
Reactia cu serul:
Martorii de reactie (pozitiv si negativ) diluati se distribuie in dublet, cate
100 l/godeu. Probele de testat (diluate conform instructiunilor de mai sus) se distribuie fiecare in cate un godeu, cate 100 l/godeu (92 probe/placa). Se incubeaza placa 60 minute la 37 oC, cu agitare.Se spala placa de trei ori
cu 250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de filtru.
Reactia cu conjugatul imunoenzimatic:
Se adauga in toate godeurile cate 100 l conjugat diluat (1/100 in diluant pentru ser si conjugat). Se incubeaza 60 minute la 37 oC, cu agitare.
Se spala placa de trei ori cu 250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de
filtru.
Reactia cu substratul specific enzimei:
Se prepara substratul: peste 11 ml substrat de perhidrol in tampon citrat se
adauga 0,45 ml solutie ABTS si se agita usor pentru omogenizare. Se
distribuie in fiecare godeu cate 100 l. Placa se lasa la intuneric, la temperatura camerei. Intre timp, se prepara reactivul de stopare: se dilueaza
agentul de stopare (NaF) in 6 ml apa distilata. Dupa 30 minute reactia se
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
38
stopeaza imediat cu 50 l/godeu din solutia de stopare si placa se citeste la fotometru multicanal la 405 nm.
Criterii de validare : - Valoarea DO (media) martorului negativ: mai mica de 0,300;
- Valoarea DO (media) martorului pozitiv: mai mare de 0,800. Interpretarea rezultatelor :
Se calculeaza valoarea S/P pentru fiecare proba conform formulei:
S/P = (DOproba - DO martor negativ)/ (DOmartor pozitiv - DO martor negativ)
- probele pentru care valorile S/P 0,25 sunt considerate pozitive;
- probele pentru care valorile S/P < 0,15 sunt considerate negative;
- probele pentru care 0,15< S/P 0,25 sunt considerate dubioase si animalele de la care provin trebuie retestate dupa 30 zile.
Norme tehnice de preparare :
Microplaci ELISA peliculizate/captusite cu antigen
Definitia produsului: Microplaci ELISA cu 96 godeuri captusite cu antigen
Toxoplasma gondii care recunoaste si fixeaza anticorpii specifici din
probe de seruri prelevate dupa coagularea sangelui recoltat de la porci.
Modul de preparare: Prepararea antigenului somatic total de Toxoplasma
gondii: Antigenul somatic total este utilizat pentru captusirea microplacilor
de reactie care intra in componenta trusei ELI-Tox P. Pentru prepararea
antigenului Toxoplasma godii utilizat in tenica ELISA, varianta indireacta
s-au utilizat paraziti recoltati din exsudatul peritoneal de la soareci infestati
cu tulpina RH de Toxoplasma gondii.
Prepararea antigenului se realizeaza in mai multe etape:
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
39
- recoltarea exsudatului peritoneal, cu parazitul sub forma de trofozoid de la
soarecii inoculati anterior cu tulpina RH de Toxoplasma gondii; recoltarea
efectuandu-se la 4-5 zile de la inocularea intraperitoneala a soarecilor;
- reluarea exsudatului peritoneal recoltat de la soareci, pe tampon fosfat salin
0,01M (PBS) steril, pH=7,4;
- filtrarea suspensiei parazitare obtinute printr-un filtru de 3 mm;
- prelucrarea suspensiei parazitare filtrate prin 3 cicluri de inghetare -
dezghetare, urmate de ultrasonicare de 10 ori, 35W/30 sec./ciclu;
- ultracentrifugarea suspensiei obtinute anterior la 10000 rpm, 40 min. la 4 oC;
- supernatantul reprezinta antigenul solubil total utilizat in tehnica ELISA.
Continutul de proteina (determinat prin metoda Lowry) al antigenului
Toxoplasma gondii trebuie sa fie mai mare de 1 mg/ml.
Antigenul Toxoplasma gondii se depoziteaza la congelator la 20 oC pana ce
este utilizat la captusirea placilor ELISA.
Captusirea/peliculizarea placilor cu antigen: Antigenul Toxoplasma gondii
se dilueaza in hidroxid de sodiu 0,1M si se distribuie cate 100 l in godeurile microplacii. Se incubeaza placa timp de 60 minute la 37 oC, cu agitare. Dupa
incubare, placile se spala, se trateaza cu solutie stabilizatoare si se usuca la 30 oC in curent de aer.
Controlul peliculizarii cu antigen: Se efectueaza prin sondaj, de catre
producator, prin tehnica ELISA.
Modul de ambalare a placilor peliculizate cu antigen: Microplacile captusite
/ peliculizate cu antigen se ambaleaza individual, in folie de plastic sau
metalizata, etichetata/inscriptionata cu: denumirea producatorului; denumirea
produsului; seria; valabilitatea.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
40
Conservarea placilor peliculizate cu antigen: La 28 oC, in ambalajul
original.
Valabilitatea placilor peliculizate cu antigen: 12 luni de la data prepararii, in
conditiile mentionate mai sus.
Martor pozitiv anti-Toxoplasma gondii: Martorul pozitiv este ser sanguin
de porc obtinut prin imunizarea acestuia cu antigen Toxoplasma gondii.
Modul de preparare:
Porci adulti sunt imunizati prin inoculare cu trofozoiti de Toxoplasma gondii,
intraperitoneal, cu 400 000 trofozoiti/ml de inocul.
Controlul martorului pozitiv: Martorul pozitiv trebuie sa se prezinte ca un
lichid clar, de culoare alb-galbuie sau slab rosiatica.
Stabilirea titrului anticorpilor antiToxoplasma gondii se realizeaza prin
tehnica ELISA. Densitatea optica a martorului pozitiv trebuie sa fie mai mare
de 0,800.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, martorul pozitiv se livreaza
prediluat, ambalat in flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand
cantitatea necesara pentru lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta pe care
sunt inscriptionate: numele producatorului; denumirea produsului; numarul
seriei; valabilitatea.
Conditii de pastrare: Martorul pozitiv se pastreaza la 28 oC, in ambalajul
original.
Valabilitate: Martorul pozitiv este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in
conditiile de pastrare mentionate mai sus.
Martor negativ de porc : Martorul negativ este ser sanguin provenit de la
porcine libere de toxoplasmoza, porci proveniti dintr-un efectiv in care nu s-
au inregistrat avorturi de origine parazitara.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
41
Controlul martorului :
Martorul negativ trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, de culoare alb-
galbuie sau slab rosiatica.
Stabilirea titrului anticorpilor antiT. gondii se realizeaza prin tehnica
ELISA. Densitatea optica a martorului negativ trebuie sa fie mai mica de
0,300.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, martorul negativ se livreaza
prediluat, ambalat in flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand
cantitatea necesara pentru lucru.
Fiecare flacon va purta o eticheta pe care sunt inscriptionate: numele
producatorului; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.
Conditii de pastrare:Martorul negativ se pastreaza la 28 oC, in ambalajul
original.
Valabilitate: Martorul negativ este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in
conditiile de pastrare mentionate mai sus.
Conjugatul imunoenzimatic anti-IgG porc 100X : Conjugatul imunoenzimatic
anti IgG porc este o imunoglobulina de caprare anti IgG porc, cuplata cu
peroxidaza, utilizata la determinarea concentratiei de anticorpi specifici fata
de un antigen patogen, prin testul ELISA, varianta indirecta. Produsul se
prezinta sub forma unei solutii clare sau usor opalescente, de culoare brun-
roscata, fara miros.
Modul de preparare: Peroxidaza (produs comercial) se dizolva in solutie de
bicarbonat de sodiu si se trateaza cu o solutie alcoolica de 2,4-
dinitrofluorbenzen 1N la temperatura camerei. In continuare, se adauga o
solutie de periodat de sodiu si, dupa 30-60 minute, etilenglicol 0,16M.
Amestecul se dializeaza fata de tampon carbonat pH= 9,5. Se adauga
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
42
imunoglobulina de capra anti IgG porc si amestecul se tine 2 ore la 20 oC.
Conjugatul se stabilizeaza cu borohidrura de sodiu, apoi se dializeaza fata de
tampon fosfat. Produsul se utilizeaza nepurificat. In final, conjugatul obtinut
se amesteca cu o solutie stabilizatoare.
Controlul conjugatului:
Control organoleptic: Produsul trebuie sa fie clar, de culoare brun-roscata,
fara miros.
Identificare: Se adauga o picatura de conjugat peste 1 ml solutie de substrat
(perhidrol in tampon citrat cu cromogenABTS). Apare imediat o culoare
intensa, verde, de cromogen oxidat.
Controlul calitatii conjugatelor s-a efectuat prin determinarea urmatoarelor
criterii de calitate: raportul absorbantelor proteinei marcate la 403 nm si 280
nm, specificitatea de specie si capacitatea de anticorp.
Raportul absorbantelor proteinei marcate reflecta gradul de marcare al
anticorpului cu enzima (peroxidaza). Acest raport este limitat de capacitatea
maxima de legare a peroxidazei (sase molecule de peroxidaza la o molecula
de anticorp), avand valori intre 0,3 0,5.
Dupa prepararea conjugatelor, acestea sunt diluate 1/10 in tampon fosfat
0,1M. Citirea absorbantelor se face la un spectrofotometru la lungimile de
unda de 403 si 280 nm.
Determinarea specificitatii de specie si a capacitatii de anticorp a
conjugatului:
Reactivi: tampon carbonat 0,1 M, pH 9,6; albumina serica bovina (BSA);
lichid de diluare; ser normal de pasare; ser normal de cal; ser normal de bou;
ser normal de oaie; ser normal de porc; ser normal de iepure; substrat:
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
43
perhidrol in tampon citrat; cromogen: solutie ABTS; lichid de spalare; solutie
de stopare.
Efectuarea determinarii: Se peliculizeaza obisnuit o placa ELISA cu ser
normal de pasare, de cal, de bou, de oaie, de porc, de iepure, in dilutii 1/100
in tampon carbonat (cel putin un rand de godeuri pentru fiecare ser de
specie).
Dupa spalare, se adauga conjugatul IgG de capra anti IgG porc, diluat la
dilutia de lucru in PBS cu tween si 1% BSA si se incubeaza o ora la 37 oC.
Dupa spalare, se adauga substratul si cromogenul in conformitate cu
instructiunile de folosire a trusei.
Conjugatul se considera specific si cu capacitate de anticorp satisfacatoare
pentru Ig din specia recomandata omologa daca are DO de cel putin 10 ori
mai mare decat DO corespunzatoare serurilor heterologe.
Alegerea dilutiei de conjugat pentru varianta indirecta a testului se face prin
analiza rezultatelor ELISA obtinute pe placi peliculizate cu antigen
Toxoplasma gondii si seruri martor de reactie, in sistem analitic complet,
similar cu cel de diagnostic. S-a ales dilutia de 1/100 pentru conjugat in
diluantul pentru ser si conjugat.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, conjugatul se ambaleaza in
flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, in cantitate corespunzatoare pentru
lucru.
Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii
producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.
Conditii de conservare: La 2 8 oC, ferit de lumina, in ambalajul original.
Valabilitate: 12 luni de la data prepararii, in conditiile de conservare
mentionate mai sus.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
44
Prepararea substratului (solutie perhidrol in tampon citrat) : Substratul este
o solutie de peroxid de hidrogen in tampon citrat 2,3%, pH 4. Se utilizeaza
conform instructiunilor din trusa ELI-Tox-P.
Caracteristicile produsului: Substratul se prezinta ca un lichid clar, incolor,
cu pH 4.
Modul de preparare: Se cantaresc 6,9 g acid citric (C6H8O7 x H2O) si se
dizolva in 2,5 l apa distilata. Se ajusteaza pH-ul la 4 cu o solutie de NaOH
30%. Se completeaza cu apa distilata pana la un volum final de 3 l. Se
controleaza pH-ul final care trebuie sa fie 4. Se adauga cantitatea necesara de
perhidrol si se sterilizeaza prin filtrare.
Contro: Produsul trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, incolor, cu pH 4.
Conditionare: Solutia se conditioneaza in flacoane brune la volume de 11 ml,
22 ml si 55 ml.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, substratul, ambalat in flacoane
inchise ermetic, se afla in cantitatea necesara pentru lucru.
Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii
producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Substratul se pastreaza la 2 8 oC, ferit de lumina, in
ambalajul original.
Valabilitate : Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de pastrare mentionate mai sus.
Prepararea si controlul cromogenului (solutie de ABTS) : Cromogenul este o
solutie apoasa de ABTS (2,2 Azino di (3-etil) benztiazolin sulfat) 1,5%.
Se utilizeaza conform instructiunilor din trusa.
Caracteristicile produsului: Solutie limpede de culoare verde.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
45
Modul de preparare: Se cantaresc 2,25 g ABTS si se dizolva in 0,15 l apa
distilata. Se sterilizeaza prin filtrare.
Controlul cromogenului: Solutia de cromogen trebuie sa fie limpede, de
culoare verde.
Conditionare: Solutia de cromogen se fioleaza in flacoane, in volume de 0,6
ml, 1,2 ml sau 3 ml.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, cromogenul se ambaleaza in
cantitatile necesare pentru lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta
inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea produsului;
numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Solutia de cromogen se pastreaza la 2 8 oC, ferita de
lumina, in ambalajul original.
Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de conservare mentionate mai sus.
Prepararea diluantului pentru ser si conjugat : Diluantul pentru ser si conjugat
este reprezentat de tampon fosfat salin 0,01M cu 1% albumina serica bovina,
0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si pH 7,2 7,4. Se utilizeaza conform
instructiunilor din trusa.
Caracteristicile produsului: Lichid clar cu nuanta verzuie si pH 7,2 7,4. La
agitare produce spuma.
Modul de preparare:
Solutia A: 12,78 g Na2HPO4 anh.
76,5 g NaCl
ad. 9000 ml apa distilata.
Solutia B: 1,38 g NaH2PO4 x H2O
8,5 g NaCl
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
46
ad. 1000 ml apa distilata.
Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 7,2 7,4. Se adauga 1%
albumina serica bovina, 0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si colorantul. Se
sterilizeaza prin filtrare si se conditioneaza in flacoane de sticla/plastic
inchise ermetic la volume de 60 ml, 100 ml, 120 ml.
Control pe flux: Diluantul pentru ser si conjugat trebuie sa se prezinte ca o
solutie limpede de nuanta verzuie, cu pH 7,2 7,4.
Ambalare si etichetare: In trusa, produsul se ambaleaza in cantitate
corespunzatoare necesarului de lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta
inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea produsului;
numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Diluantul pentru ser si conjugat se pastreaza la 2 8 oC, in ambalajul original.
Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de conservare mentionate mai sus.
Prepararea solutiei de spalare 10X : Solutia de spalare 10X este reprezentata
de tampon fosfat salin 0,1M, pH 6,8 6,9 cu 0,5% tween 20 si 0,01%
thiomersal. Se utilizeaza la spalarea placilor, conform instructiunilor din
trusa.
Caracteristicile produsului: Se prezinta ca un lichid clar care prin agitare
produce spuma. Daca solutia de spalare 10X prezinta un depozit cristalin, se
aduce la temperatura camerei si se agita ca toate cristalele sa se dizolve, iar
apoi se dilueaza conform instructiunilor din trusa.
Mod de preparare:
Solutia A: 14,2 g Na2HPO4 anh.
85 g NaCl
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
47
ad. 1000 ml apa distilata.
Solutia B: 13,8 g NaH2PO4 x H2O
85 g NaCl
ad. 1000 ml apa distilata.
Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 6,8 6,9. Se adauga
0,5% tween 20 si 0,01% thiomersal. Solutia se sterilizeaza prin filtrare si se
conditioneaza in flacoane de 50 ml si 60 ml.
Control: Solutia de spalare trebuie sa se prezinte ca un lichid clar cu pH- ul
cuprins intre 6,86,9. Dupa diluare 1/10 in apa distilata, pH-ul devine 7,2
7,4.
Ambalare si etichetare: In trusa, produsul se ambaleaza in cantitate
corespunzatoare necesarului de lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta
inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea produsului;
numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Solutia de spalare 10X se pastreaza la 28 oC, in
ambalajul original.
Valabilitate:Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile de
conservare mentionate mai sus.
Prepararea reactivului de stopare : Reactivul de stopare este NaF care se
utilizeaza in trusa ca solutie 1,5%.
Mod de preparare: Se cantaresc 0,09 g/flacon, 0,18 g/flacon sau 0,45
g/flacon. Produsul este ambalat in flacoane de sticla/plastic, in cantitate
corespunzatoare pentru lucru.
Norme tehnice de control :
Determinarea intensitatii raspunsului probelor martor : Intensitatea
raspunsului probelor martor se executa prin tehnica ELISA, varianta
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
48
indirecta. Titrurile martorilor de reactie (la dilutia mentionata in instuctiunile
de folosire a trusei) trebuie sa corespunda normelor tehnice:
DOn < 0,300 DOp > 0,800
Aceste valori reprezinta criteriile de validare ale trusei.
Variabilitate inter-godeuri:
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, cate 4 godeuri/ser,
in patru zone ale placii.
conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.
Coeficientul de variabilitate (deviatia standard a replicatelor/media
replicatelor) trebuie sa fie sub 0,2. Variabilitate inter-placi:
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, 5 placi, cate 4
godeuri/ser/placa, in patru zone ale placilor.
conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.
Coeficientul de variabilitate (deviatia standard a replicatelor/media
replicatelor) trebuie sa fie sub 0,2.
Detectabilitatea
Curba de titrare a serului martor pozitiv, aplicat in 9 dilutii (1/10; 1/15; 1/20;
1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve proportionalitatea dintre
titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si valoarea DO. Valoarea limitei
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
49
de pozitivare (cut-off pozitiv) trebuie sa fie mai mica decat valoarea DO a
serului martor pozitiv la dilutia 1/20.
Specificitatea
Determinarea specificitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor testa 10 seruri
prelevate de la porci confirmati ca fiind negativi printr-un alt test (testul de
imunofluorescenta indirecta).
Cele 10 seruri trebuie sa fie negative si prin testare cu trusa ELI-Tox-P.
Sensibilitatea
Determinarea sensibilitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor testa 10 seruri
negative si 10 seruri pozitive confirmate printr-un alt test (testul de
imunofluorescenta indirecta).
Cele 10 seruri negative trebuie sa fie intotdeauna negative si cele 10 seruri
pozitive sa fie intotdeauna pozitive prin testare cu trusa ELI-Tox-P.
Reproductibilitatea
Controlul reproductibilitatii intraplaca:
Se vor testa in duplicat 10 seruri negative si 10 seruri pozitive confirmate
printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).
Coeficientii de variatie ai densitatilor optice trebuie sa se situeze sub 20%.
Controlul reproductibilitatii interplaci :
Se vor testa, pe cate doua placi, 10 seruri negative si 10 seruri pozitive
confirmate printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).
Coeficientii de variatie ai densitatilor optice trebuie sa se situeze sub 20%.
Performantele produsului :
Limita de detectie:
Serurilor martor (pozitiv si negativ) au fost titrate, stabilindu-se limita de
detectie a testului.
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana
50
Curba de titrare a martorului pozitiv, aplicat in 9 dilutii (1/10; 1/15; 1/20;
1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve proportionalitatea dintre
titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si valoarea DO. Rezultate:
30 min dilutie
Mp Mn
1/10 1.443 0.175 1/15 1.257 0.157 1/20 1.068 0.147 1/25 1.013 0.143 1/30 0.980 0.138 1/35 0.924 0.136 1/40 0.825 0.131 1/45 0.802 0.129 1/50 0.759 0.124
Controlul valorii de diagnostic al testului ELISA s-a re