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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
RAPHAEL PATRÍCIO DA SILVA QUINTILIANO
ESTUDO DAS SUBPOPULAÇÕES DE LINFÓCITOS B NO
SANGUE PERIFÉRICO E LÍQUIDO
CEFALORRAQUIDIANO DE PACIENTES COM
ESCLEROSE MÚLTIPLA PRIMÁRIA PROGRESSIVA
STUDY OF B-LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN THE
PERIPHERAL BLOOD AND CEPHALORRAQUIDIAN
LIQUID OF PATIENTS WITH PRIMARY PROGRESSIVE
MULTIPLE SCLEROSIS
CAMPINAS
2020
RAPHAEL PATRÍCIO DA SILVA QUINTILIANO
ESTUDO DAS SUBPOPULAÇÕES DE LINFÓCITOS B NO SANGUE
PERIFÉRICO E LÍQUIDO CEFALORRAQUIDIANO DE PACIENTES COM
ESCLEROSE MÚLTIPLA PRIMÁRIA PROGRESSIVA
STUDY OF B-LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN THE PERIPHERAL
BLOOD AND CEPHALORRAQUIDIAN LIQUID OF PATIENTS WITH
PRIMARY PROGRESSIVE MULTIPLE SCLEROSIS
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biologia da Universidade Estadual
de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção
do Título de Mestre em Ciências, na
área de Fármacos, Medicamentos e
Insumos para Saúde
Dissertation presented to the Biology
Institute of the State University of
Campinas as part of the requirements
for obtaining a Master of Science
Degree in the area of Drugs,
Medicines and Health Supplies
Orientadora: Profa. Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos
ESTE ARQUIVO DIGITAL
CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO
RAPHAEL PATRICIO DA
SILVA QUINTILIANO E
ORIENTADO PELA PROFA.
DRA. LEONILDA MARIA
BARBOSA DOS SANTOS.
CAMPINAS
2020
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de Biologia
Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Quintiliano, Raphael Patrício da Silva, 1990-
Q45e QuiEstudo das subpopulações de linfócitos B no sangue periférico e líquido
cefalorraquidiano de pacientes com esclerose múltipla primária progressiva /
Raphael Patrício da Silva Quintiliano. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.
QuiOrientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos.
QuiDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Qui1. Esclerose múltipla. 2. Linfócitos B. I. Santos, Leonilda Maria Barbosa
dos, 1950-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III.
Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Study of b lymphocyte subpopulations in the peripheral blood and
cephalorraquidian liquid of patients with primary progressive multiple sclerosis Palavras-
chave em inglês:
Multiple sclerosis
B-Lymphocytes
Área de concentração: Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde
Titulação: Mestre em Ciências Banca examinadora:
Leonilda Maria Barbosa dos Santos [Orientador]
Giovanna Rosa Degasperi
Catarina Raposo Dias Carneiro
Data de defesa: 03-03-2020
Programa de Pós-Graduação: Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-7725-8670 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/3133115379895008
Campinas, 3 de março de 2020.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos
(Presidente da Comissão Examinadora)
Profa. Dra. Giovanna Rosa Degasperi
Profa. Dra. Catarina Raposo Dias Carneiro
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata
de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do
aluno.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa Biociências
e Tecnologia de Produtos Bioativos da Universidade Estadual de Campinas – Instituto
de Biologia.
AGRADECIMENTOS
Ao Ser Superior a todas as entidades existentes: Deus. Que transmite a cada ser um
pedaço de Tua alma e que nela vem carregada cheia de conhecimento, sabedoria e
bondade.
Aos meus pais, Sônia e Orlando, que me deram a dádiva de viver cedida pelo Criador.
Propuseram-se a doar suas próprias forças para que pudesse continuar nos trilhos da
vida.
Aos meus queridos “pais” de coração Cláudia e Fábio, que entraram na minha vida no
decorrer da jornada humana e que depositaram fé e esperança no cerne da minha alma,
impulsionando-me sempre no caminho da justiça.
À minha família, especialmente ao Breno, Thaysa, Sinval (in memoriam), Sinval Filho
e Edna que jamais deixaram de me dar suporte.
À querida Profa. Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos pela extrema bondade de
ter me acolhido e ter dado a oportunidade de ouro de aperfeiçoar o Conhecimento.
Agradeço também a todos os colegas do laboratório de Neuroimunologia: Adriel,
Vinícius, Alliny, Verônica, Amanda e Breno
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001,
FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – Nº do
processo: 2014/26431-0) e INCT-NIM (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia
em Neuroimunomodulação).
“O que sabemos é uma gota; o que ignoramos é um oceano.
Mas o que seria o oceano se não infinitas gotas?”
Isaac Newton
RESUMO
Os linfócitos B participam ativamente na patogênese da Esclerose múltipla (EM). Os
autoanticorpos produzidos por estas células podem causar dano tecidual nos neurônios
contribuindo para a neurodegeneração. Os linfócitos B são células apresentadoras de
antígeno mais eficientes quando comparado a outras células, uma vez que o
neuroantígeno é reconhecido especificamente pelo receptor do antígeno de linfócitos B
(BCR), processado e apresentado aos linfócitos T CD4+ autorreativos, também
contribuem para a patogênese da EM através da produção de auto anticorpos, na
apresentação dos neuro-antígenos aos linfócitos T CD4+ e síntese de citocinas pró-
inflamatórias que amplificam a resposta efetora dos linfócitos T. Ainda, os linfócitos T
produzem citocinas pró e anti-inflamatórias que amplificam ou reduzem a resposta
inflamatória. Tecidos linfoides terciários onde predominam linfócitos B foram descritos
nas meninges de pacientes com EM nas formas primariamente progressiva (EMPP) e
secundariamente progressiva (EMSP). Nesse estudo, mostramos o aumento de linfócitos
B citotóxicos no sangue periférico e a presença dessas células no líquido céfalorraquiano
de pacientes com EM primariamente progressiva. O aumento de linfócitos B citotóxicos
está associado ao aumento do fator de transcrição Runx3. Paralelamente ao aumento de
linfócitos B citotóxicos observou-se significativo aumento de neurofilamentos no líquido
cefalorraquiano dos pacientes com EMPP e diminuição dos níveis séricos do fator
neurotrófico cerebral (BDNF). Essas evidências mostram que a citotoxicidade dos
linfócitos B pode contribuir para a neurodegeneração nas formas progressivas da EM.
ABSTRACT
B lymphocytes actively participate in the pathogenesis of Multiple Sclerosis (MS). The
autoantibodies produced by these cells can cause tissue damage in neurons, contributing
to neurodegeneration. B lymphocytes are more efficient antigen presenting cells when
compared to other cells, since the neuroantigen is specifically recognized by the B
lymphocyte antigen (BCR) receptor, processed and presented to autoreactive CD4 + T
lymphocytes, also contribute to the pathogenesis of MS through the production of auto
antibodies, in the presentation of neuro-antigens to CD4 + T lymphocytes and synthesis
of pro-inflammatory cytokines that amplify the effective response of T lymphocytes.
Furthermore, T lymphocytes produce pro and anti-inflammatory cytokines that amplify
or reduce the inflammatory response. Tertiary lymphoid tissues where B lymphocytes
predominate have been described in the meninges of patients with MS in primarily
progressive (EMPP) and secondarily progressive (EMSP) forms. In this study, we showed
the increase in cytotoxic B lymphocytes in peripheral blood and the presence of these
cells in the cerebrospinal fluid of patients with primarily progressive MS. The increase in
cytotoxic B lymphocytes is associated with an increase in the Runx3 transcription factor.
In addition to the increase in cytotoxic B lymphocytes, there was a significant increase in
neurofilaments in the cerebrospinal fluid of patients with PPMS and a decrease in serum
levels of cerebral neurotrophic factor (BDNF). This evidence shows that the cytotoxicity
of B lymphocytes can contribute to neurodegeneration in progressive forms of MS.
LISTA DE ABREVIATURAS
APC = Célula Apresentadora de Antígenos (Antigen Presenting Cell)
BHE = Barreira Hematoencefálica
BHL = Barreira Hematoliquórica
BHM = Barreira Hematomeníngea
BCR = Receptor de célula B
BOC = Bandas Oligoclonais
CCR6 = Receptor de quimiocina 6
CCL20 = Ligante 20 de quimiocina
CEs = Células Endoteliais Especializadas
CD = Cluster of Differentiation 4
CIS = Síndrome Clinicamente Isolada
CpG = (Cytosine Triphosphate Deoxynucleotide)
DC = Células Dendríticas
EBV - Vírus Epstein Bar
EAE = Encefalomielite Autoimune Experimental
EM = Esclerose Múltipla
EMPP = Esclerose Múltipla Primariamente Progressiva
EMSP = Esclerose Múltipla Secundariamente Progressiva
EMSR = Esclerose Múltipla Surto Remissão
FoxP3 = Forkhead Box P3
GrB = Granzima B
HLA = Antígeno Leucocitário Humano
ICAM = Intercellular Adhesion Molecule
IFN-γ = Interferon-γ
IL- Interleucina
LCR = Líquido Cefalorraquiano
MBP = Proteína Básica de Mielina
MHC = Complexo Principal de Histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex)
MOG = Glicoproteína de Mielina presente em Oligodendrócitos
NF = Neurofilamentos
NK = Natural Killer
ODN = Oligodeoxinucleotídeos
PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells
PC = Plexo Coroide
PLP = Proteolipoproteinas
SNC = Sistema Nervoso Central
TGF-β = Fator Transformador do crescimento β (Transforming Growth Factor β)
TLR 9 = Toll Like Receptor 9
Th1 = Linfócitos T helper 1
Th17 = Linfócitos T helper 17
TNF-α = Fator de necrose tumoral α (Tumor Necrosis Factor α)
VCAM = Vascular cell adhesion molecule
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO............................................................................................................................12
OBJETIVOS ............................................................................................................................... 23
METERIAL E MÉTODOS......................................................................................................... 24
RESULTADOS........................................................................................................................... 28
DISCUSSÃO................................................................................................................................41
CONCLUSÃO..............................................................................................................................46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................ 47
ANEXOS .................................................................................................................................... 58
12
INTRODUÇÃO
A esclerose múltipla (EM) é uma doença desmielinizante inflamatória e
neurodegenerativa do sistema nervoso central (SNC). A EM é a mais comum e a principal
causa de incapacidade em adultos jovens excluindo traumatismos crânio-encefálicos
(LASSMANN, 2019). Normalmente, as mulheres são mais suscetíveis à EM, numa
proporção de 2:1 e a doença se manifesta, em geral, na terceira década de vida. No Brasil,
dado a extensão do território, poucos estudos epidemiológicos foram realizados até o
momento.
As primeiras descrições clínico-patológicas da EM foram feitas pelo neurologista
francês Jean Martin Charcot no final do século XIX (HAFLER, 2004 apud). A doença é
definida pela presença de lesões desmielinizantes inflamatórias focais na substância
branca encefálica ou na medula espinhal, que determinam os sintomas clínicos
observados nos pacientes (LASSMANN, 2019). Lesões na substância cinzenta também
são descritas em pacientes com EM e correlacionam positivamente com a incapacidade
física e transtornos cognitivos (LASSMANN, 2019).
As evidências sugerem que a EM é resultado de um processo autoimune
direcionado aos componentes da mielina do SNC. Os danos teciduais na EM resultam da
combinação de predisposição genética, estilo de vida, associados aos fatores ambientais.
Entre os fatores ambientais e estilo de vida, destacam-se exposição aos agentes
infecciosos, baixa exposição à luz solar, deficiência de vitamina D, obesidade e
tabagismo.
Os fatores genéticos são relevantes na fisiopatologia da EM, especialmente os
relacionados à resposta imune, como os genes do sistema HLA (Antígeno Leucocitário
Humano) (SVEJGAARD, 2008). Quanto mais próximo o parentesco com um paciente,
maior o risco de desenvolver a doença (SADOVNICK et al., 2009). No entanto, um
estudo com gêmeos idênticos discordantes para a doença não detectou evidências
genéticas ou epigenéticas determinantes para a manifestação da EM (BARANZINI et al.,
2010).
13
Os sintomas iniciais são normalmente fraqueza nos membros inferiores, distúrbios
sensoriais, neurite ótica, diplopia, ataxia, entre outros. Conforme a doença evolui, pode-
se observar disfunção urinária, fadiga, fraqueza, dor, vertigem e espasmos, por exemplo.
Os déficits cognitivos são comuns especialmente nos casos avançados e inclui perda de
memória, déficit de atenção, dificuldade em solucionar problemas e lentidão no
processamento das informações. A EM exibe distintas formas de evolução, como em
surto-remissão (EMSR), primariamente progressiva (EMPP), e secundariamente
progressiva (EMSP). A forma inicial EMSR corresponde a 85% de todos os casos. Em
10 anos, 50% destes pacientes evoluirão para a forma secundariamente progressiva e em
25 anos, o número de casos aumenta para 90%. Aproximadamente 10-15% dos pacientes
com EM evoluem na forma primariamente progressiva. Nesses doentes, não são
observados com frequência os períodos de exacerbação da doença, normalmente acomete
indivíduos com mais idade, e não há predominância de um sexo (LASSMANN, 2019)
As evidências indicam que há diferença entre a forma surto/remissão das formas
progressivas, no entanto, não se observa diferenças entre as formas primariamente
progressiva da secundariamente progressiva, com exceção da presença de infiltrados
inflmatórios, embora em menor número nos pacientes com a forma EMPP (LASSMANN,
2019). Esta fase da EMSP se caracterizada por um déficit neurológico permanente e
progressivo, determinada por um predomínio de neurodegeneração sobre a
neuroinflamação, levando o paciente a uma dependência física cada vez maior, que pode
evoluir para um estado cadeirante e posteriormente acamado (LASSMANN, 2019).
Fisiopalogia na esclerose múltipla
O SNC foi historicamente referido como imune privilegiado, significando que o
mesmo não apresentava vasos linfáticos ou linfonodos. No entanto, esse conceito mudou
diante da descoberta de vasos linfáticos nas meninges (LOUVEAU et al, 2015) e tecidos
linfoides terciários nas meninges de pacientes com EM nas formas progressivas
(SERAFINI et al., 2004).
14
Embora a mais conhecida dessas barreiras que dificultam a entrada de leucócitos
no parênquima cerebral seja a barreira hematoencefálica (BHE), outras barreiras menos
estudadas, mas ainda assim importantes, são a barreira hematomeníngea (BHM) e a
barreira hematoliquórica (BHL).
A barreira hematoencefálica é uma estrutura formada por células endoteliais
especializadas (CEs) que separam o SNC da circulação sistêmica. As CEs do SNC são
caracterizadas pela presença de fortes junções que limitam o fluxo de solutos e por uma
taxa muito baixa de transcitose. Essas propriedades permitem um controle rígido da troca
entre o cérebro e o sangue (DANEMAN e PRAT, 2015). A manutenção da BHE é
governada por elementos celulares e não celulares que interagem com as CEs, astrócitos
e a matriz extracelular para juntos fornecem suporte estrutural e funcional (JANZER e
RAFF, 1987).
As meninges são compostas por três camadas que circundam o SNC (Dura-máter,
aracnoide e Pia máter) e contêm o LCR no espaço subaracnóideo. No cérebro, a massa
cinzenta está diretamente adjacente às meninges. Enquanto as meninges foram
inicialmente consideradas como uma mera barreira física impedindo a entrada de
infecções e toxinas no SNC, descobertas mais recentes estabeleceram este tecido como
um local de imunidade ativa tanto na fisiologia como na patologia. As meninges podem
abrigar uma grande variedade de células imunocompetentes, como macrófagos, células
dendríticas, mastócitos, células linfoides e fibroblastos que fornecem proteção eficaz
contra os microrganismos e também podem ser o local de inflamação crônica em estados
patológicos.
A descrição das células imunes meníngeas associadas à EM reforçou o conceito
de que a BHM pode ser uma via importante no trafégo de células do sistema imune
(SERAFINI et al., 2004). Outra porta de entrada no SNC é o plexo coróide (PC),
formando uma barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquiano. Essa estrutura vilosa
se estende aos órgãos ventriculares e também é responsável pela produção do LCR. O PC
é constituído por uma camada de células epiteliais em torno de um núcleo de capilares
fenestrados e tecido conjuntivo, permitindo a livre difusão de solutos do sangue para o
parênquima através de espaços interendoteliais (STEFFEN et al., 1996).
A migração de células imunes através das barreiras é normalmente regulada e
envolve um processo de várias etapas. Essas etapas incluem rolamento, adesão e
transmigração.
15
O contato inicial entre leucócitos e o endotélio é geralmente mediado pela adesão
de moléculas da família das selectinas, integrinas expressas nos leucócitos ativados e
moléculas do endotélio como as moléculas de adesão intercelular (ICAM) (IFERGAN et
al., 2008).
Na EM a inflamação é iniciada pelos linfócitos T; no modelo experimental a
função autorreativa dos linfócitos T, principalmente CD4+, pode ser confirmada
diretamente, com a transferência dessas células dos animais com EAE para animais
controle. No homem, observou-se melhora significativa da doença com tratamentos que
retém os linfócitos T e B na periferia impedindo-os de migrarem para o sistema nervoso
central.
Como a doença é iniciada ainda não está totalmente elucidada. Alguns autores
acreditam que a EM tem início depois de algum dano no SNC, principalmente nos
oligodendrócitos (inside out), que posteriormente vai sensibilizar os linfócitos T.
Ultimamente é mais aceito que os linfócitos são ativados na periferia, principalmente
devido à ação de agentes infecciosos, onde o mecanismo de mimetismo molecular é o
mais provável (outside in). Linfócitos T são ativados nos linfonodos periféricos e migram
para o SNC, iniciando uma cascata de inflamação e dano tecidual. Reforçando essa ideia,
alguns estudos mostram a presença de mielina dentro das células apresentadoras de
antígeno nos linfonodos cervicais profundos (van ZWAM et al., 2009) Recentemente,
utilizando estudo de imagens, os autores mostraram aumento no tamanho dos linfonodos
cervicais profundos em pacientes com EM, independentemente de estarem em tratamento
ou não (DI GIULIANO et al., 2018).
As células presentes nos linfonodos apresentam os neuro-antígenos aos linfócitos
T CD4+ tipo Th1 e tipo Th17, as quais são ativadas e migram para o SNC. Há evidências
que dentro do SNC as células apresentadoras de antígeno, como as microglias
reapresentam os neuro-antigenos aos linfocitos T CD4+ que se polarizam para o subtipo
th17 e secretam citocinas pro-inflamatórias como IL17 e IFN-γ ampliando a cascata de
inflamação que resultará na desmielinização (KORN et al., 2009; MAHAD et al., 2015).
As células Th17 desempenham um papel crucial na patogênese da EM induzindo
um meio inflamatório (KORN et al., 2009). A IL-17A está presente em níveis elevados
nas lesões do SNC, no líquido cefalorraquiano e no soro de pacientes com EM. As células
Th17 expressam altos níveis de CCR6 que se ligam à quimiocina CCL20 nas células
endoteliais vasculares, possibilitando sua entrada através da barreira hematoencefálica,
onde secretam citocinas pró-inflamatórias (KEBIR et al., 2007).
16
Receptores para a IL-17 e IL-22 nas células endoteliais da BHE nos pacientes com
EM mostraram que essa citocina está associada ao dano dessa barreira. Ainda, foi
demonstrado que os linfócitos T CD4+ Th17 atravessam com facilidade a BHE,
expressam altos níveis de Granzima B (GrB), lisam os neurônios e promovem inflamação
dentro do SNC (KEBIR et al., 2007). Esse mesmo grupo de autores mostrou a importância
de linfócitos Th17 que produzem simultaneamente IFN-γ na indução de resposta
inflamatória no SNC (KEBIR et al., 2009).
Confirmando a importância da IL-17, verificou-se que a administração de
anticorpo monoclonal anti-IL-17A humanizado (Secuquinumab) aos pacientes com EM
levou a significativa redução de lesões em comparação com indivíduos controle tratados
com placebo (VOLPE et. al, 2015).
As células do sistema imune de uma forma geral migram para o SNC, além de
produzirem citocinas pró-inflamatórias, também secretam moléculas reativas ao oxigênio
e nitrogênio além das metaloproteinases de matriz, que amplificam a resposta
inflamatória e o dano à bainha de mielina (TABARKIEWICZ et al., 2015; Van
HAMBURG et al., 2011).
Os linfócitos T CD8+ são células T citotóxicas que reconhecem peptídeos
presentes na superfície das APCs através do MHC de classe I. Os linfócitos citotóxicos
reconhecem células estranhas, infectadas ou tumorais e após a ativação proliferam e lisam
as células-alvo através da liberação de grânulos contendo perforina e GrB, assim como
fator de necrose tumoral e IFN-γ (SUN e LANIER, 2011).
Essas células estão em maior número que os linfócitos T CD4+ nas lesões da EM,
sugerindo um papel crucial na patogênese da doença (MACHADO-SANTOS et al.,
2018).
Subtipos de células T CD8+ foram identificados e agrupados em diferentes
subconjuntos com base no perfil de citocinas que eles produzem. Assim, as células Tc1
clássicas secretam IFN-γ, Tc2 secretam IL-4, Tc10 secretam IL-10, Tc21 secretam IL-21
e Tc22 secretam IL-22. Mais recentemente foi demonstrado que os linfócitos T CD8+
também secretam IL-17 (SRENATHAN, STEEL, TAAMS, 2016). No SNC, os linfócitos
T CD8+ exercem sua atividade citotóxica sobre as células que expressam as moléculas
de MHC de classe I, como os neurônios e oligodendrócitos (NEWMANN et al., 2002).
Estudos prévios mostraram que nas lesões das formas progressivas da EM predominam
os linfócitos T CD8+ de memória, sugerindo que os mecanismos citotóxicos são
essenciais na manutenção da doença (VAN NIEROP et al., 2017).
17
As lesões na substância cinzenta são menos evidentes que na substância branca,
mas também são mediadas pela resposta imunológica. Lucchinetti e colaboradores (2011)
mostraram a presença de linfócitos T CD8+ nos espaços perivasculares em biopsias da
substância cinzenta de pacientes com a forma inicial (CIS) da EM (LUCCHINETTI et
al., 2011).
Os linfócitos T CD8+ são caracterizados pela alta expressão de RUNX3,
necessário para sua ativação, proliferação, citotoxicidade, migração e produção de
citocinas. O RUNX3 é um fator de transcrição que funciona como regulador chave da
expressão citotóxica durante o desenvolvimento dos linfócitos T (KOHU et al., 2005).
Durante o desenvolvimento dos linfócitos T no timo, os linfócitos T CD8+ expressam
RUNX3, enquanto os linfócitos T CD4+ expressam o fator de transcrição Th-POK
(LEVANON e GRONER, 2004, STEIN et. al, 2004).
A inflamação dentro do SNC é controlada pelas células T reguladoras (T regs) que
modulam a imunidade, mantêm a tolerância contra auto-antígenos e previnem as doenças
autoimunes. Pelo menos três populações de linfócitos T regs foram descritas: as Tregs
que expressam o fator de transcrição Foxp3+CD25+CD4++ (FONTENOT; GAVIN;
RUDENSKY , 2003), as células Tr1 que produzem IL-10 e não expressam Foxp3
(GREGORI e RONCAROLO, 2018), e as células Th3 que preferencialmente produzem
TGFβ e IL 10 e não expressam o Foxp3 (CHEN et al., 1994). Em pacientes com EM, a
participação das células T reg é controversa. Trabalho clássico mostra o aumento dessas
células no período de remissão da doença (VIGLIETTA et al., 2004), no entanto, outros
autores mostraram que o número das células Treg Foxp3+CD25+CD4++ não difere dos
apresentados pelos indivíduos saudáveis (VENKEN et al., 2008). Além disso, a
expressão mRNA e proteína de Foxp3 estão diminuídos nas células de pacientes com EM,
especialmente na EMSR, e são normalizados durante a forma secundária progressiva
(ZOZULYA et al., 2008). Estudos mais recentes mostraram que além da disfunção das
células T regs, as células T efetoras de pacientes com EM apresentam uma resistência à
supressão por essas células, um fenômeno que é chamado resistência à Treg e pode ser
mediado pelos níveis elevados de IL-6 (TRINSCHEK et al., 2013).
18
Linfócitos B na esclerose múltipla
Trabalhos, relativamente recentes, mostram que os linfócitos B têm uma
participação importante na patogênese da EM. Hauser e colaboradores (2008) mostraram
que os pacientes com a forma surto/remissão da EM se beneficiavam com o tratamento
com o anticorpo monoclonal humanizado rituximabe, que depleta a população de
linfócitos B CD20+ (HAUSER et al., 2008).
. A produção de anticorpos que reconhecem os componentes da mielina, axônios
e neurônios contribui ativamente para a patogênese da EM. Os autos anticorpos podem
causar dano tecidual através da fixação do complemento ou através de citotoxicidade
mediada pelos anticorpos. Essa possibilidade foi comprovada em estudos
histopatológicos do SNC de pacientes com EM, onde foi demonstrados depósitos de
proteínas do sistema complemento sobre as bainhas de mielina, indicando a presença
dessas moléculas na patogênese da doença (COLOMBO et al, 2000). Mais recentemente,
anticorpos antineurofascina, uma proteína localizada na interface mielina-axônio (nódulo
de Ranvier) foram detectados no sangue de pacientes com EM, e na EAE esse anticorpo
causou injuria axonal (MATHEY et al, 2007). Outro dado importante é a maior
frequência de bandas oligoclonais (IgG e IgM) no líquido cefalorraquiano (LCR) de
pacientes com EM que indica síntese intratecal de anticorpos (BRANDÃO et al. 2005).
Além da produção de anticorpos, os linfócitos B apresentam o antígeno para os
linfócitos T CD4+. Os linfócitos B são apresentadores de antígenos muito mais eficientes
que os macrófagos e as células dendríticas, pois há o reconhecimento direto do antígeno
pelos receptores de antígeno dos linfócitos B (BCR). Além do reconhecimento e
apresentação do antígeno, os linfócitos B também produzem citocinas pró-inflamatórias
que por sua vez estimulam a polarização de linfócitos Th1 e Th17 o que amplificará o
dano tecidual no sistema nervoso central. Além disso, o estudo dos linfócitos B na
patogênese da EM assume uma importância inquestionável diante da descrição da
formação de centros germinativos nos tecidos linfoides terciários, nas meninges dos
pacientes, principalmente na fase progressiva da EM.
19
A inflamação nas meninges também foi observada na fase inicial da EM e está
associada com uma evolução mais grave da doença (SERAFINI et al., 2004,
LUCCHINETTI et al., 2011). Por outro lado, vários estudos indicam que as células B
podem exercer função imunomoduladora nas doenças autoimunes desmielinizantes.
Dentro da função reguladora dos linfócitos B foi observado que essas células facilitam o
recrutamento das Tregs para o SNC na EAE (FILLATREAU, 2019).
Ainda no modelo da EAE foi demonstrado que os linfócitos B secretores de IL-
10 são importantes para a recuperação da doença (MATSUSHITA et al., 2008,). Trabalho
realizado em nosso laboratório mostrou que a administração in vivo de ODN-CpG um
agonista do TLR 9 reduziu de forma significativa a gravidade da EAE através do aumento
de linfócitos B produtores de IL-10 (LONGHINI et al., 2014).
Estudos neuropatológicos recentes indicam um papel importante de células B nos
mecanismos de neurodegeneração da EM que está associado a uma meningite crônica
autoimune (SERAFINI et al., 2004, MAGLIOZZI et al., 2018). Necropsias demonstraram
a presença de tecido linfoide terciário onde predomina agregados de células B na pia-
máter em 20 de 34 pacientes (54%) com a forma secundariamente progressiva da EM.
Estudando biopsia do tecido nervoso central, os autores demonstraram que a inflamação
nas meninges estão presentes em pacientes com EM mesmo no início da doença (CIS)
(LUCCHINETTI et al, 2011).
Subpopulações de linfócitos B também foram descritas de acordo com o
desenvolvimento dessas células. Pelo menos três populações foram descritas B1, B2 e
linfócitos B da zona marginal. Os linfócitos B1 ou CD5+ participam da imunidade inata
enquanto os linfócitos B2 são os convencionais que atuam na resposta imune adaptativa.
Os linfócitos B1 estão associados à produção espontânea (natural) das IgM. Os linfócitos
B CD5+ foram associados com algumas doenças autoimunes como o lúpus eritematoso
sistêmico, a artrite reumatoide, síndrome de Sjogren atuando principalmente no aumento
da produção dos auto anticorpos (FERRACCIOLI e TOLUSSO, 2007). Mais
recentemente, uma subpopulação de linfócitos B produtores de GrmB foi descrita, e
possivelmente essa população celular também contribui para a patogênese da EM (HAGN
e JAHRSDÖRFER, 2012).
20
Estes tecidos linfoides terciários estão associados a uma importante
desmielinização na região subpial e atrofia cortical, com a formação de um gradiente de
perda neuronal e astrocitária principalmente nas camadas mais superficiais do córtex
cerebral (HOWELL et al., 2011). O tecido linfoide se localiza mais frequentemente na
profundidade dos sulcos e giros cerebrais em uma área de baixa circulação do LCR.
Diante de uma ausência de infiltrado celular no córtex, levanta-se a hipótese de
que fatores solúveis, como citocinas e anticorpos, produzidos nestes folículos se
difundiriam e lesariam os neurônios da região subpial (MAGLIOZZI et al, 2018,
LASSMANN, 2019). Além disso, os autores apontam que essa neurodegenração pode ser
mantida pelas células B infectadas com o vírus Epstein Bar (EBV), uma vez que o
aumento dessa infecção já foi descrita na EM (AHMED et al., 2019). A produção de IL-
17 nesses nichos favorece a ação deletéria dos linfócitos B, pois essa citocina foi descrita
como importante auxiliadora na produção de anticorpos, e assim contribuiria para a
síntese de auto anticorpos nos tecidos linfoides terciários (MITSDOERFFER et al., 2010).
Moléculas relevantes na neurodegeneração e neuroregeneração da
esclerose múltipla
Neurofilamentos
Os neurofilamentos são componentes do citoesqueleto dos neurônios e são
particularmente abundantes nos axônios. Os neurofilamentos têm como função dar
suporte estrutural para a manutenção do tamanho, forma e calibre dos neurônios
(PETZOLD, 2005). Essas estruturas pertencem à família dos filamentos intermediários,
e de acordo com o tamanho da molécula são classificados em neurofilamentos de cadeia
leve (NF-L~68kDa), neurofilamentos de cadeia média (NF-M~145 kDa) e
neurofilamento de cadeia pesada (NF.H ~200 kDa) (ZETTERBERG, 2016).
O dano axonal no SNC libera os neurofilamentos para o líquido cefalorraquiano e
o aumento no nível dessas moléculas indica dano axonal. Uma vez que os
neurofilamentos estão no citoplasma dos neurônios, qualquer condição patológica onde
há dano axonal e neuronal leva ao aumento dessas moléculas.
21
Assim, níveis aumentados de NF foram detectados em várias doenças como na
esclerose lateral amiotrófica (ELA), Doença de Alzheimer, acidente vascular cerebral e
EM (ZETTERBERG, 2016, YUAN et al., 2017). Embora o aumento dos NF não seja
específico para uma determinada patologia, a quantificação dessas moléculas tem sido
utilizada com êxito, como biomarcador da neurodegeneração.
Na EM, os NF estão sendo utilizados como biomarcadores do processo de
neurodegeneração (VARHAUG et al., 2019), sendo extremamente uteis na caracterização
da fase da doença, prognóstico e resposta ao tratamento. A presença de NFL no LCR tem
sido motivo de muito estudo e tem mostrado a associação positiva entre os elevados níveis
desse marcador e aumento da gravidade da doença em pacientes com EMSR (PETZOLD,
2007). Estudos recentes, inclusive, mostram que os níveis de NFl no LCR serve como
preditor de EM nos pacientes que apresentaram os sintomas iniciais de neuromielite
optica (OLESEN et al., 2019).
Os níveis de neurofilamentos são facilmente detectados no LCR, no entanto, por
ser um procedimento invasivo, novos métodos foram desenvolvidos com sensibilidade
suficiente para detectá-los no soro ou no plasma, como a plataforma SIMOA (single
molecular assay), que detecta uma molécula isolada de neurofilamento. Estudos recentes
mostram que há correlação positiva nos níveis de NF quantificados em amostras pareadas
de soro e LCR (KUHLE et al.2016, DISANTO et al., 2017)
BDNF (Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro)
As neurotrofinas são moléculas essenciais na regulação das sinapses. São
sintetizadas e secretadas de acordo com a atividade sináptica, agindo nas sinapses ativas
e aumentando a eficiência da neurotransmissão (CANOSSA et al., 2002). Em particular,
o BDNF (Brain-derived neutrophic factor) sintetizado também pelos dendritos tem
atividade crítica na manutenção da neurogênese, diferenciação neuronal, maturação e
desenvolvimento dos neurônios (PARK e POO, 2013).
O BDNF encontra-se em abundância no hipocampo e córtex cerebral (CONNER
et al, 1997), onde exerce atividade neuroprotetiva como aumento da sinaptogenese e
neurotransmissão (Panja & Bramham, 2014). Embora a atividade do BNDF esteja bem
descrita nos neurônios, trabalhos relativamente recentes mostra a sua importância
também nos oligodendrócitos, particularmente após a desmielinização.
22
Por exemplo, em culturas o BDNF aumenta o número dos oligodendrocitos da
região frontal do cérebro (Du et al., 2003). Experimentos conduzidos em animais
mostraram que os oligodendrócitos de camundongos deficientes em BDNF produzem
níveis diminuídos de mielina na fase precoce do desenvolvimento (XIAO et al., 2010).
Na EM, o BDNF é expresso nos astrócitos, linfócitos, micróglia, na região
perivenular e dentro das lesões (KERSCHENSTEINER et al 1999, STADELMANN et
al 2002). Os estudos ainda demonstraram que na fase secundária progressiva da EM, os
níveis de BDNF do LCR estão diminuídos em relação à fase surto/remissão da doença
estável (SARCHIELLI et al., 2002), sugerindo que na fase progressiva da doença, o nível
diminuído de BDNF pode estar associado à progressão da doença. Além disso, muitos
aspectos da biologia celular do BDNF são regulados pela atividade neuronal, que já está
comprometida nessa fase da doença. Além disso, as interações sinérgicas entre a atividade
neuronal e a plasticidade sináptica do BDNF o tornam um regulador ideal e essencial dos
processos celulares subjacentes à cognição e outros comportamentos complexos. De fato,
numerosos estudos estabeleceram que o BDNF desempenha um papel crítico na
regulação das formas de plasticidade de sinapses dependentes de atividade como as de
potência de longa duração (LTP – long-term potentiation), que é o aumento da eficiência
excitatória das sinapses, e está envolvido no aprendizado e na memória (LEAL,
BRAMHAM e DUARTE, 2017). Recentemente, evidências convergentes sugerem que
os déficits na sinalização do BDNF contribuem para a patogênese de várias doenças e
transtornos importantes, como a doença de Huntington, a doença de Alzheimer e a
depressão (LU, NAGAPPAN, LU, 2014). Assim, o BDNF pode tanto atuar nos
mecanismos de neurodegeneração e inflamatórios que regulam também os transtornos
neuropsiquiátricos, transtornos esses que podem ser observados mesmo nas as formas
precoces da EM.
A possibilidade de linfócitos B citotóxicos contribuírem para as lesões na EM
principalmente nas fases progressivas motivou este estudo associando essas observações
com a síntese de marcadores biológicos como o NFL e BDNF.
23
OBJETIVOS
- Estudar as subpopulações de linfócitos B na forma primariamente progressiva da
esclerose múltipla.
Objetivos secundários:
- Identificar a expressão de granzima B (GrB) nos linfócitos B no sangue periférico
e dosar o Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) no soro de pacientes com
EM.
- Identificar a expressão de granzima B (GrB) nos linfócitos B e dosar
Neurofilamentos (NF) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com EM.
24
MATERIAIS E MÉTODOS
Participantes: Foram incluídos neste estudo pacientes de EMPP, EMSP e EMSR,
atendidos no Ambulatório de Neurologia do Hospital das Clínicas da Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP).
Critérios de Inclusão: Tanto a coleta de material dos indivíduos saudáveis como
dos pacientes com EM, ocorreu após cada participante ter assinado uma cópia do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) proposto para este trabalho. O
estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP - UNICAMP),
registrada sob o número CAAE: 58498516.3.0000.5404.
Critérios de Exclusão: Foram excluídos da pesquisa indivíduos que:
1. Possuíam histórico de malignidades ou eram portadores de doenças infecto-
contagiosas;
2. Não se enquadravam nos critérios estabelecidos por McDonald revisados.
25
Durante os anos de 2017-2019, foram recrutados 36 pacientes com EM (19 EMPP,
6 EMSP e 11 EMSR) e 25 indivíduos saudáveis para realização deste estudo. Os
dados demográficos dos pacientes estudados estão apresentados na tabela 1:
Tabela 1: Achados clínicos dos grupos de pacientes EMPP, EMSP, EMSR e
controles estudados.
Parâmetros EMPP EMSP EMS
R
Con
troles
Número de
participantes 19 6 11 25
Relação ♀/♂ 10:9 4:2 7:4 15:
10
Idade – média
(faixa), anos
52
(30-76)
51
(36-72)
36
(18-59)
48
(25-65)
EDSS - média (faixa) 6.7
(5.5 – 9.0)
6.6
(6.0 – 8.0)
2.1
(1.0 – 6.0) n.a.
Duração média da
doença (faixa), anos
13 (2
– 30)
12 (4
– 20)
6 (1-
17) n.a.
Presença de BOC 16+/3
- 5+ 6+/4- n.a.
n.a. – não se aplica; BOC – bandas oligoclonais; EDSS – Escala expandida de
incapacidade
26
Coleta de sangue e LCR: As amostras foram obtidas durante o acompanhamento
ambulatorial dos pacientes. As amostras de soro e LCR foram armazenadas em tubos
de polipropileno em biofreezer (Sanyo, USA), à -80°C, para preservação até a
realização do teste de ELISA.
Separação dos linfócitos: As PBMCs dos pacientes EMPP, EMSP, EMSR e
controles foram separados por gradiente de Ficoll-hypaque (Sigma-Aldrich, USA).
O gradiente foi centrifugado por 30 minutos a 1400 rpm e a nuvem de células
mononucleares foi retirada e lavada com solução salina de Hanks (Sigma-Aldrich,
USA). Após contagem das PBMCs obtidas, através da câmara de Neubaeur, foi
possível direcionar a marcação de células para a citometria de fluxo.
Citometria de Fluxo de a partir das PBMC’s: Após separação por gradiente e
obtenção das PBMC’s foi realizada marcação de superfície: CD3 – Percp Cy5.5;
CD5 – PE cy7; CD8+ - APC Cy7 e PE; CD19+ - FITC; CD4+9d - APC (BD
Biosciences USA) e posteriormente intracelular: GrB – Alexa Fluor 700 (BD
Biosciences, USA) e RunX3 – eFluor 660 (Invitrogen, USA)) após permeabilização.
A aquisição foi realizada em citômetro de fluxo Facs Verse (BD Bioscience, USA) e
para as análises utilizou-se o software FlowJo®.
Determinação dos níveis de BDNF e NF por ELISA: Os níveis BDNF presente no
soro dos pacientes EMPP, EMSP, EMRR e indivíduos do grupo controle foram
investigados pelo método de ELISA utilizando o kit R&D Systems® (USA). Os
soros obtidos a partir de centrifugação de sangue periférico total sem anticoagulante
foram diluídos (1:20) em solução PBS (10 microlitros da amostra em 190 microlitros
de PBS) e colocados nas placas contendo anticorpo monoclonal anti BDNF. Foram
adicionados 100 microlitros do diluente (PBS) em cada poço, 50 microlitros do
padrão (concentrações conhecidas de BDNF), controle ou amostra por poço e
incubado por 2 horas. Foi adicionado 100 microlitros do conjugado de BDNF
(anticorpo anti BDNF) e incubado por uma hora. Realizado lavagens e adicionado
200 microlitros da solução de substrato (peróxido de hidrogênio e
tetrametilbenzidina) e incubado por 30 minutos protegido da luz. Após este período
colocado 50 microlitros de solução de parada (ácido sulfúrico 0.1N) que interrompeu
a ação.
27
As microplacas foram lidas em leitor de microplacas Synergy HT (Biotek,
USA) a 450 nm e as concentrações finais foram obtidas em picogramas/mL (limite
de detecção: 20pg/mL). Os níveis de NFs presentes no LCR dos pacientes EMPP,
EMRR e indivíduos do grupo controle foram investigados pelo método de ELISA
com o kit NF light® (Uman, Sweden). Foi realizado a diluição das amostras de LCR
(1:1) em diluente de amostra (PBS) até que o volume total seja 210 microlitros, foi
realizado lavagens da placa e então adicionado 100 microlitros do padrão
(concentrações conhecidas de NFl) e das amostras em duplicata. Foi realizado
incubação por uma hora em temperatura ambiente (20-25°C) em agitação (800 rpm).
Após lavagens foram adicionados 100 microlitros do anticorpo anti NFL marcado
com biotina, em cada poço e incubado por 45 minutos em agitação. Após lavagens
foram adicionados 10 microlitros do anticorpo anti NFL conjugado (streptavidin-
HRP) e incubado novamente por 30 minutos em agitação. Após lavagens foram
adicionados 100 microlitros da solução de substrato (tetrametilbenzidina e peróxido
de hidrogênio) e incubado por 15 minutos. Adicionado 50 microlitros de solução de
parada (ácido sulfúrico 0.1N) que interrompeu a ação. As microplacas foram lidas
em leitor de microplacas Synergy HT (Biotek, USA) a 450 nm e as concentrações
finais foram obtidas em picogamas/mL (limite mínimo: 100pg/mL).
Análise estatística: os resultados foram analisados empregando-se os testes não
paramétricos no software GraphPad Prism 6. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado
para a comparação entre três ou mais grupos e Mann-Whitney para análise de dois grupos
de amostras. Diferenças foram consideradas signifitivas se apresentaram um valor P <
0,05. Os dados foram expressos como mediana e variação entre os valores mínimos e
máximos
28
RESULTADOS
Quantificação dos linfócitos T CD8++ expressando GrB em indivíduos normais e
pacientes com EM nas formas surto e remissão e primariamente progressiva.
A predominância de linfócitos T CD8+ em relação ao número de linfócitos T CD4+ nas
lesões cerebrais de pacientes com EM indica a participação dessas células na patogênese
da doença, inclusive nas formas precoces da doença (LUCCHINETTI et al., 2011). Esse
grupo de experimentos foi conduzido no sentido de quantificar os linfócitos T CD8++
produtores de GrB no sangue periférico de pacientes com as formas surto-remissão e
primária progressiva da EM.
Figura 1. Quantificação dos linfócitos T CD8++ expressando GrB em indivíduos
normais e pacientes com EM nas formas primariamente progressiva e
surto/remissão da doença.
1A
1B
1C
C o n tr o le
n = 2 5
E M P P
n = 1 1
E M S R
n = 9
0
2 0
4 0
6 0
8 0
CD
8+
(%
)
C o n tr o le
n = 2 5
E M P P
n = 1 1
E M S R
n = 9
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
CD
8+
Gz
mB
+ (
%)
29
Os linfócitos T CD8+ foram marcados tanto para a molécula CD8+ da superfície, como
intracelularmente para a detecção de GrB. A identificação dessas moléculas foi feita por
citometria de fluxo. Os três grupos foram analisados pelos métodos de Kruskal-Wallis, e
não houve diferença estatisticamente significativa entre eles. A figura 1A mostra a
estratégia de análise utilizada. A figura 1B mostra a percentagem de linfócitos T CD8++
em indivíduos normais e pacientes com EM nas formas surto-remissão e primariamente
progressivas. Não se observou diferença estatisticamente significativa entre os grupos:
[(CTR) = 25,1 (variação de 12,0 – 50,8); EMPP = 20,0 (variação de 9,95 – 63,7); EMSR
= 22,3 (variação de 11,6 – 35,9). A figura 1C mostra a percentagem de CD8+ GrB + nos
três grupos estudados. Não se observou diferenças estatisticamente significativas: [CTR
= 22,7 (variação de 0,27 – 65,6); EMPP = 20,0 (variação de 3,12 – 63,7); EMSR = 30,4
(variação de 19,4 – 44,4)].
30
Quantificação dos linfócitos B CD19++ expressando GrB no sangue periférico de
pacientes com EM nas formas surto-remissão e de indivíduos normais.
Os linfócitos B são conhecidos pela capacidade de produzir anticorpos, enquanto a
atividade citotóxica estava reservada para os linfócitos T citotóxicos e células NK. Em
conflito com essas observações, recentes estudos mostraram que linfócitos B ativados
podem produzir e secretar GrB (HAGN et al., 2009, 2012). Esse grupo de estudo foi
conduzido no sentido de verificar a presença de linfócitos B citotóxicos no sangue
periférico de pacientes com as formas surto-remissão e primariamente progressiva da EM.
Figura 2. Quantificação dos linfócitos B CD19++ expressando GrB no sangue
periférico em indivíduos normais e pacientes com EM nas formas primariamente
progressiva e surto/remissão da doença.
2A
2B
2C
C o n tro le
n = 2 5
E M P P
n = 1 5
E M S R
n = 9
0
5
1 0
1 5
2 0
CD
19
+ (
%)
(p = 0 ,0 0 5 6 )
(p = 0 ,0 0 0 8 )
* *
* * *
C o n tro le
n = 2 5
E M P P
n = 1 5
E M S R
n = 9
0
2 0
4 0
6 0
8 0
CD
19
+ G
zm
B+
(%
)
* *
*(p = 0 ,0 1 0 4 )
(p = 0 ,0 0 1 5 )
31
Os linfócitos B CD19+ foram marcados tanto para a molécula CD8+ da superfície, como
intracelularmente para a detecção de GrB. A identificação dessas moléculas foi feita por
citometria de fluxo. Os três grupos foram analisados pelos métodos de Kruskal-Wallis e
Mann-Whitney e a diferença entre os grupos foi demonstrada pelo *p<0.05, ** p<0.01,
***p<0.001.
A estratégia de gate é apresentada na figura 2A. A figura 2B mostra uma redução
significativa da porcentagem de linfócitos B no sangue periférico de pacientes com EMPP
em relação ao grupo de indivíduos normais e pacientes com a forma surto-remissão
***p<0.001, **P<0.01. [CTR = 5,00 (variação de 1,64 – 14,6); EMPP = 3,16 (variação
de 0,83 – 8,07); EMSR = 6,41 (variação de 1,51 – 10,20)]. A produção de GrB por
linfócitos B CD19++ no sangue periférico de pacientes EMPP e EMSR é
significativamente maior quando comparada ao grupo controle **p<0.01, *p<0.05. [CTR
= 1,97 (variação de 0,38 – 12,3); EMPP = 7,85 (variação de 0,91 – 22,8); EMSR = 1,83
(variação de 0,50 – 5,66)] (figura 2C).
32
Quantificação dos linfócitos B CD19++ expressando RunX3 e integrina CD4+9d no
sangue periférico.
Durante o desenvolvimento de linfócitos T no timo, o fator de transcrição Runx3 inibe a
expressão de CD4+ nas células duplo-positivas e contribui para a expressão de CD8+
(LOTEM et al., 2013, MILNER et al, 2017) No sentido de verificar se esse fator de
transcrição também está envolvido na expressão de GrB pelos linfócitos B de pacientes
com EM, Runx3 foi quantificado nos linfócitos B de indivíduos saudáveis e pacientes
com EM.
Figura 3. Expressão de Runx3 nos linfócitos B em indivíduos normais e pacientes
com EM nas formas primariamente progressiva e surto/remissão da doença.
Os linfócitos B foram marcados tanto para a molécula CD19+ da superfície, como
intracelularmente para a detecção de RunX3. A identificação dessas moléculas foi feita
por citometria de fluxo. A análise estatística foi feita empregando-se os métodos de
Kruskal-Wallis e Mann-Whitney e a diferença entre os grupos foi demonstrada pelo
*p<0.05, ** p<0.01.
3A 3B
C o n tro le
n = 7
E M P P
n = 6
E M S R
n = 5
0
2 0
4 0
6 0
8 0
CD
19
+ R
un
x3
+ (
%)
(p = 0 ,0 2 2 1 )
(p = 0 ,0 0 5 1 )* *
*
33
A estratégia de gate é apresentada na figura 3A. A expressão de Runx3 foi quantificada
intracelularmente em linfócitos B, por citometria de fluxo. Houve aumento
estatisticamente significativo da expressão de Runx3 no grupo de pacientes com EMPP e
EMSR em relação ao grupo de indivíduos saudáveis *p<0.05, ** p<0.01.
(figura 3B). [CTR = 18,9 (variação de 10,3 – 35,5); EMPP = 57,7 (variação de 19,5 –
60,5); EMSR = 54,94 (variação de 32,9 – 73,1)].
Quantificação dos linfócitos B CD19++ expressando integrina CD4+9d no sangue
periférico.
A transmigração de linfócitos pela barreira hematoencefalica requer a expressão de
integrinas como a alfa 4 (CD4+9d) beta 1 nos leucócitos ativados que se ligam às
moléculas de adesão do endotélio as VCAM-1 (RICE, HARTUNG, CALABRESI, 2005).
Esse grupo de experimentos foi idealizado no sentido de mostrar que os linfócitos B de
pacientes com EM expressam as integrina a4b1 e também migram para o sistema nervoso
central.
Figura 4. Expressão de CD4+9d nos linfócitos B em indivíduos normais e pacientes
com EM nas formas primariamente progressiva e surto/remissão da doença.
4A
4B
C o n tro le
n = 7
E M P P
n = 7
E M S R
n = 5
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
CD
19
+ C
D4
9d
+ (
%)
* * *
* *(p = 0 ,0 0 1 2 )
(p = 0 ,0 0 0 6 )
34
Os linfócitos B foram marcados tanto para a molécula CD19+ e CD4+9d da superfície.
A identificação dessas moléculas foi feita por citometria de fluxo. A análise estatística foi
feita empregando-se os métodos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney e a diferença entre
os grupos foi demonstrada pelo ** p<0.01, ***p<0.001
A estratégia de gate é apresentada na figura 4. Houve aumento estatisticamente
significativo da expressão da molécula de superfície CD4+9d nos linfócitos B CD19++
no grupo de pacientes com EMPP e EMSR em relação ao grupo de indivíduos saudáveis
***p<0.001, ** p<0.01 (figura 4B) [CTR = 41,0 (variação de 33,7 – 59,6); EMPP = 91,1
(variação de 84,7 – 96,6); EMSR = 83,5 (variação de 60,6 – 86,3].
35
Quantificação dos linfócitos B CD19++ expressando CD5+.
Nos últimos 30 anos a nomenclatura das subpopulações dos linfócitos B tem sofrido
modificações e a população que expressa o marcador CD5 foi também chamada de B1 e
posteriormente foi descrita uma população B1a que expressa CD5 e B1b que não expressa
CD5 (ZHAO et al, 2019).
Esse grupo de experimentos foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer se há relação
entre a população de linfócitos B CD5+ e a função citotóxica.
Figura 5. Expressão de CD5 e GrB nos linfócitos B em indivíduos normais e
pacientes com EM na forma primariamente progressiva.
Os linfócitos B foram marcados tanto para a molécula CD19+ e CD5 da superfície, como
intracelularmente para a detecção de GrB. A identificação dessas moléculas foi feita por
citometria de fluxo. Os grupos foram analizados pelo método de Mann-Whitney e não
houve diferença estatisticamente significativa entre eles.
5A
5B
5C
C D 5 + C D 5 - C D 5 + C D 5 -
0
1 0
2 0
3 0
4 0
E M P PC o n tr o le
n = 8 n = 8
CD
19
+ G
rB
+ (
%)
C o n tr o le E M P P
0
2 0
4 0
6 0
n = 8 n = 8
CD
19
+ C
D5
+ (
%)
36
A estratégia de gate é apresentada na figura 5A. A figura 5B mostra que não há aumento
significativo da expressão de CD5+ no grupo EMPP em relação ao grupo controle [CTR
= 18,1 (variação de 11,6 – 28,1); EMPP = 18,7 (variação de 6,36 – 54,2). Também não
houve diferença estatisticamente significativa entre os linfócitos B CD5+ e B CD5-
produtores de GrB (figura 5C). [CTR CD5+ = 9,29 (variação de 1,77 – 15,4); CTR CD5-
= 3,41 (variação de 2,64 – 15,3); EMPP CD5+ = 8,02 (variação de 0,84 – 31,1); EMPP
CD5- = 6,99 (variação de 0,81 – 36,2).
37
Linfócitos B produtores de Granzima B no líquido cefalorraquiano de pacientes com
EM primariamente progressiva
Apesar de o SNC ter sido historicamente referido como imune privilegiado, esse conceito
mudou diante da descoberta de vasos linfáticos nas meninges. A transmigração de
linfócitos pela barreira hematoencefalica pela integrina alfa 4 (CD4+9d) beta 1 pode estar
relacionada a migração de linfócitos B para o sistema nervoso central. Linfócitos esses
que podem estar exercendo uma atividade citotóxica, produzindo e secretando GrB. Esse
grupo de estudo foi conduzido no sentido de verificar a presença de linfócitos B
citotóxicos no líquido cefalorraquidiano de pacientes com a forma primariamente
progressiva da EM.
Figura 6. Quantificação dos linfócitos B CD19++ expressando GrB no líquido
cefalorraquidiano em indivíduos normais e pacientes com EM na forma
primariamente progressiva.
6A
6B
CD
19
+ (
%)
C o n tr o le
L C R
n = 4
E M P P
L C R
n = 8
0
5
1 0
1 5
2 0(p = 0 ,0 2 8 3 )
*
CD
19
+ G
zm
B+
(%
)
C o n tr o le
L C R
n = 4
E M P P
L C R
n = 8
0
1 0
2 0
3 0
4 06C
38
Os linfócitos B foram marcados tanto para a molécula CD19+ da superfície, como
intracelularmente para a detecção de GrB. A identificação dessas moléculas foi feita por
citometria de fluxo. O método de Mann-Whitney mostrou que há aumento
estatisticamente significativo dos linfócitos B no LCR *p<0.05
A estratégia de gate é apresentada na figura 6A A figura 6B mostra um aumento
significativo da porcentagem de linfócitos B no líquido cefalorraquidiano de pacientes
com EMPP em relação ao grupo de indivíduos normais *p<0.05 [CTR = 1,70 (variação
de 0,59 – 3,27); EMPP = 8,80 (variação de 2,72 – 17,9). Não houve diferença
estatisticamente significativa entre os linfócitos B CD19++ produtores de GrB entre os
pacientes com EMPP e o grupo controle (figura 6C) [CTR = 12,1 (variação de 7,06 –
20,0); EMPP = 13,7 (variação de 2,72 – 35,0).
39
Quantificação dos níveis de Neurofilamentos leves no líquido cefalorraquiano e de
BDNF no soro de pacientes com esclerose múltipla nas formas surto e remissão,
secundária e primariamente progressiva.
Os neurofilamentos foram estudados extensivamente em diferentes condições
neurológicas e são considerados promissores marcadores da destruição axonal tanto
aguda como crônica. (BERGMAN, 2016, ZUCCHI et al., 2018). Por outro lado, as
neurotrofinas como o BDNF emergem como importantes moduladores da regeneração
axonal (MCGREGOR & ENGLISH, 2019). Esse grupo de experimentos foi conduzido
no sentido de quantificar os níveis de NF e BDNF no LCR e soro de pacientes com EM
(respectivamente) e em indivíduos saudáveis.
Figura 7. Níveis de neurofilamentos leves no LCR de pacientes com esclerose
múltipla (6A) e BDNF no soro (6B).
A figura 7A mostra o resultado da quantificação de NFL no LCR dos pacientes com EM.
Os dados foram analisados pelos métodos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney que
demonstrou aumento estatisticamente significativo dos níveis de NFL no LCR de
pacientes EMPP [CTR = 314,88 (variação de 173,40 – 452,61); EMPP = 1254,08
(variação de 593,06 – 2185,29)] **p<0.01 e EMSR [CTR = 314,88 (variação de 173,40
– 452,61); EMSR = 2508,93 (variação de 220,91 – 6553,91) ***p<0.001.
7A 7B
C o n tr o le
n = 1 0
E M P P
n = 8
E M S R
n = 1 1
0
2 0 0 0
4 0 0 0
6 0 0 0
8 0 0 0
NF
- L
CR
(p
g/m
L) * *
* * *
(p = 0 ,0 0 2 8 )
p < 0 ,0 0 0 1 )
BD
NF
So
ro
pg
/mL
C o n t r o le
n = 9
E M P P
n = 9
E M S P
n = 6
E M S R
n = 1 0
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
*
* *(p = 0 ,0 0 1 6 )
(p = 0 ,0 1 0 6 )
40
A figura 7B mostra diminuição estatisticamente significativa dos níveis de BDNF de
pacientes com EMPP *p<0,05 [CTR = 2316,34 (variação de 1343,34 – 3813,99); EMPP
= 1554,00 (variação de 930,43 – 2435,30)] e EMSP **p<0.01 [EMSP = 1310,55 (variação
de 801,14 – 1828,85); CTR = 2316,34 (variação de 1343,34 – 3813,99)]. Entanto, não
houve mudança dos níveis de EMSR em relação ao grupo saudável.
41
DISCUSSÃO
Nesse estudo demonstramos o aumento de linfócitos B citotóxicos nos pacientes
com EM primariamente progressiva. Embora a atividade citotóxica não seja comum nos
linfócitos B, esse estudo sugere que a citotoxicidade é um dos mecanismos que leva ao
dano tecidual na EM a exemplo do que ocorre com os linfócitos T CD8+ e células NK.
Estudos prévios mostraram que o número de linfócitos T CD8+ supera o de
linfócitos T CD4+ nas lesões da substância branca de pacientes com EM, e os linfócitos
T CD8+ estão associados às lesões dos axônios e oligodendrocitos (LIBLAU et al., 2002,
NEUMANN et al., 2002). Linfócitos T CD8+ expressando GrB e IFN-γ também foram
encontrados em níveis aumentados no líquido cefalorraquiano (LCR) (IFERGAN et al.,
2011). Estudando material de biopsia do SNC, Lucchinetti e colaboradores (2011)
mostraram aumento de linfócitos T CD8+ na região perivenular nas lesões
desmielinizantes corticais de pacientes com a forma precoce (CIS) da EM
(LUCCHINETTI et al., 2011). Ainda, a análise das células que infiltram o SNC mostrou
a maior expansão oligoclonal de linfócitos T CD8+ e não T CD4+ dentro das lesões
(BABBE et al., 2000, JUNKER et al., 2007) e no LCR (JACOBSEN et al., 2002).
Os TCR dos linfócitos T CD8+ (TCR) reconhecem o peptídeo antigênico
apresentado pela célula alvo através das moléculas de MHC de classe I. Estudos prévios
mostraram associação entre alelos de MHC de classe I e suscetibilidade à EM (FUGGER
et al., 2009, MARS et al., 2011).
No conjunto, esses resultados sugerem que linfócitos T CD8+ específicos para os
neuroantigenos migram para o SNC e estão envolvidos na patogênese da EM. Uma vez
feita a ligação do TCR dos linfócitos T CD8+ e o peptídeo antigênico, juntamente com
as moléculas de MHC de classe I, os linfócitos T CD8+ liberam proteases como as
perforinas e granzimas no citoplasma das células alvo levando-as à apoptose (IZAAZ et
al., 1995). A GrB é uma serina protease que normalmente age em colaboração com as
perforinas. As perforinas formam poros nas membranas das células alvo, enquanto a GrB
age sobre vários substratos intracelulares que são clivados dependendo ou não das
caspases (ANDRADE et al., 1998).
42
Na ideia de evitar a destruição das células produtoras de GrB pelas próprias
proteases, as células lançam mão de mecanismos inibidores como, a GrB que é secretada
como zimogênio inativo ou ainda moléculas como as serpinas, que estão presentes no
citoplasma celular inibem a atividade citotóxica das GrB (POTEMPA, KORZUS e
TRAVIS, 1994).
Estudo prévio mostrou que linfócitos T CD4+ encefalitogênicos expressam GrB
o que facilita a passagem da BHE no modelo da EAE (KEBIR et al., 2007).
Nesse estudo, os linfócitos T CD8+ de pacientes com EM nas diferentes formas
clínicas e de indivíduos normais foram analisados. Verificou-se que não houve diferença
estatisticamente significativa entre os grupos de indivíduos estudados em relação à
quantidade de linfócitos T CD8+ no sangue periférico.
Os linfócitos T CD8+ são encontrados no SNC, inclusive nas leptomeninges, no
entanto, estas células circulam num equilíbrio dinâmico, sendo que em pacientes com EM
não tratados a quantidade dessa população celular não se altera significativamente. Sob
tratamento, no entanto, os linfócitos T CD8+ têm a concentração alterada para mais ou
para menos dependendo do tratamento ao qual o paciente com EM é submetido.
Os linfócitos B são conhecidos pela capacidade de produzir anticorpos, enquanto
a atividade citotóxica era observada normalmente nos linfócitos T CD8+ e células NK.
Em conflito com essas observações, estudos relativamente recentes mostraram que
linfócitos B ativados produzem e secretam GrB (HAGN et al., 2012).
Como foi mencionado, o tratamento com anticorpos monoclonais (quimérico)
humanizados anti linfócitos B (anti CD20) tem beneficiado os pacientes com EM
(HAUSER et al., 2008). Mais recentemente, outro anticorpo monoclonal humanizado anti
CD20 foi lançado no mercado brasileiro, com a vantagem de não ser quimérico e causar
menos inflamação pós infusional, o ocrelizumab (BARKHOF et al., 2019). Esse novo
arsenal terapêutico para a EM visa diminuir o efeito patogênico dos linfócitos B, tanto os
circulantes que podem atravessar a BHE como os presentes nos centros germinativos do
tecido linfoide terciário das meninges. É interessante, portanto, entender que subtipo de
linfócito B responde ao tratamento, ou se todos os linfócitos B expressam a molécula
CD20 da mesma forma, sofrendo igualmente a ação dos anticorpos anti CD20.
No intuído de investigar se os linfócitos B citotóxicos participam do dano tecidual
na EM nas formas progressivas, estudamos essa população celular nos pacientes com EM
primariamente progressiva em comparação com indivíduos saudáveis.
43
Nossos dados mostram aumento significativo de linfócitos B citotóxicos no
sangue periférico de pacientes com EMPP e a presença dessas células no LCR. Por razões
óbvias, não foi colhido LCR de indivíduos normais, e nesses dados apenas mostramos
que há linfócitos B citotóxicos no LCR desses pacientes com EM.
É muito importante ressaltar que as células do sistema imune podem ter acesso ao
SNC através do LCR. Estudos prévios mostraram que quimiocinas como a CCL20 são
liberadas por células do plexo coróide no LCR, e ligam-se aos receptores CCR6 de
linfócitos ativados atraindo-os para o parênquima cerebral (REBOLDI et al., 2009).
Durante a resposta inflamatória, o endotélio dos vasos inflamados aumentam a expressão
de moléculas de adesão como a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e VCAM-1
e seus respectivos ligantes, as integrinas (LFA1 e α4β1 (very late antigen 4) expressas
nas células T autorreativas (CAYROL et al., 2008), contribuindo para a entrada dessas
células no parênquima do SNC. Nossos resultados estão em concordância com esses
estudos, pois mostramos que os linfócitos B de pacientes com EMPP expressam níveis
elevados da integrina CD4+9d (VLA 4).
A migração dos linfócitos B para o SNC é um fenômeno bem conhecido. Estudos
mostraram que os linfócitos B residem em compartimentos distintos dentro do SNC como
nas meninges, no LCR e no parênquima. Dentro do SNC as células B participam da
produção de anticorpos que formam as bandas oligoclonais e a presença desses anticorpos
auxiliam no diagnóstico da EM, uma vez que cerca de 81% desses doentes apresentam a
bandas (BRANDÃO et al., 2005). Ainda, os linfócitos B são as células mais abundantes
nos tecidos linfoides terciários observados nas meninges dos pacientes com EM
(SERAFINI et al. 2004). Mais recentemente, foi demonstrado que os linfócitos B do SNC
estão em equilíbrio dinâmico e circulam para a periferia. Estudando clones de linfócitos
B, os autores demonstraram que as células que estavam presentes no LCR também foram
encontradas na periferia (von BUDINGEN et al., 2012).
Nossos dados mostram ainda que os linfócitos B citotóxicos não pertencem ao
subgrupo de linfócitos CD5+, os quais estão associados à algumas doenças autoimunes
(FERRACCIOLI e TOLUSSO,2007).
No sentido de entender a atividade citotóxica dos linfócitos B, determinou-se a
expressão do fator de transcrição RUNX3 e os resultados mostram que a expressão desse
fator está significativamente elevada no grupo de pacientes com EM estudado. RUNX é
uma família de fator de transcrição responsável por vários processos de desenvolvimento,
proliferação e diferenciação celular.
44
Nos vertebrados esse fator de transcrição consiste em três grupos RUNX1,
RUNX2 e RUNX3. Desses três grupos de proteínas o RUNX1 e RUNX3 são importantes
na hematopoese, sendo que o RUNX3 é importante para as funções dos linfócitos e
células mielóides.
As proteínas RUNX são cruciais para a determinação da expressão da molécula
CD4+ ou CD8+ durante a maturação das células T no timo. Modificação genética
(silenciar) o fator de transcrição RUNX1 ou o ThPOK nos timócitos duplo positivos
reprime a expressão de CD4+, enquanto a supressão de RUNX3 impede o
desenvolvimento da linhagem de linfócitos T CD8++ (COLLINS et al.,
2011; SETOGUCHI et al., 2008). O RUNX3 regula positivamente a expressão de CD8+
e participa na indução de células T citotóxicas (HASSAN et al., 2011; KOHU et al.,
2005).
Os fatores de transcrição RUNX2 e RUNX3 também estão envolvidos na
maturação tardia dos linfócitos B, embora o exato mecanismo ainda não esteja elucidado.
Foi demonstrado que animais KO para RUNX3 não produzem IgA quando os linfócitos
B foram estimulados in vitro (SHI e STAVNEZER, 1998).
Nesse estudo mostramos que o aumento da expressão de RUNX3 está associado
ao aumento da função citotóxica dos linfócitos B citotóxicos. No entanto, não
apresentamos evidência da função citotóxica dessas células. Os mecanismos pelos quais
os linfócitos B contribuem para as lesões na EM estão sendo estudados. Trabalhando com
o sobrenadante de linfócitos B in vitro de pacientes com EMSR e de indivíduos normais
previamente ativados in vitro, os autores mostraram a presença de várias citocinas como
TNF-α, IL-6, IL-10 TGF-β1 e a co-cultura desses fatores provenientes de pacientes com
EM e não de indivíduos saudáveis causavam morte de oligodendrócitos. No entanto, os
autores não foram capazes de identificar o fator responsável pela morte celular, podendo
ser uma ou a combinação de várias moléculas (LISAK et al., 2012). Outro estudo mostra
que linfócitos B de pacientes com EMSR não estimulados in vitro secretam fatores
tóxicos para neurônios humanos e de murinos. Os autores não identificaram esse fator,
mas sugerem que moléculas secretadas pelos linfócitos B dos pacientes com EM
contribuem para a formação das lesões na doença (LISAK et al., 2017).
Nosso estudo terá continuidade no sentido de verificar o efeito da GrmB nas
células do SNC. Não excluímos a possiblidade de os linfócitos B citotóxicos estarem
agindo diretamente sobre as células do sistema nervoso central.
45
O neuroantígeno pode ser apresentado aos linfócitos B através das células
dendríticas presentes nos centros germinativos tanto da periferia como no SNC. Essa
apresentação ativaria os linfócitos B a liberarem GrB levando ao dano tecidual. Ainda, os
linfócitos B podem reconhecer o neuroantígeno através do BCR e apresentá-los aos
linfócitos T CD4+ (Th1 ou Th17) que por sua vez causariam o dano tecidual.
Nosso estudo mostra a expressão de integrina α4β1 na superfície dos linfócitos B
e a presença dessas células no LCR, confirmando que as células B citotóxicas migram
para o sistema nervoso central.
No sentido de mostrar que os linfócitos B citotóxicos podem contribuir para a
neurodegeneração no SNC, quantificamos os neurofilamentos leves e observamos níveis
aumentados desse biomarcador de neurodegeneração no LCR de pacientes com EMPP.
Nosso estudo está em concordância com outros que mostraram a associação positiva dos
elevados níveis do NFL e aumento da gravidade da doença em pacientes com EMSR.
Estudos recentes, inclusive, mostram que os níveis de NFl no LCR serve como preditor
de EM nos pacientes que ainda apresentam os sintomas de neuromielite optica (OLESEN
et al., 2019).
A neurodegeneração pode ser explicada, pelo menos em parte, pela redução de
neurotrofinas como o BDNF. O BDNF tem atividade crítica na manutenção da
neurogênese, diferenciação neuronal, maturação e desenvolvimento dos neurônios
(PARK e POO, 2013). Nosso estudo mostra significativa diminuição dos níveis séricos
de BDNF em pacientes com EM. Na EM os resultados sobre as dosagens de BDNF são
conflitantes. Alguns autores mostraram aumento dessa neurotrofina nos leucócitos e soro
na EMSR (CAGGIULA et al., 2005, SARCHIELLI et al., 2002). No entanto, outros
autores mostraram significativa redução do BDNF no soro dos pacientes com EM
também na fase surto/remissão da doença (AZOULAY et al., 2008, AZOULAY et al.,
2005).
Resumindo, nosso estudo mostra o aumento de linfócitos B citotóxicos no sangue
e LCR de pacientes com EM na forma progressiva primária. O aumento desse grupo de
células está associado ao aumento de neurofilamentos no LCR dos pacientes o que indica
que a citotoxicidade apresentada por esses linfócitos pode contribuir para o processo de
neurodegeneração observado nas formas progressiva da EM. Assim, novas terapias com
os imunobiológicos que têm como objetivo lisar os linfócitos B ganham espaço no arsenal
terapêutico que visa inibir a progressão da EM.
46
CONCLUSÕES
Os resultados apresentados nesse estudo permitem as seguintes conclusões:
1. Não existe mudança significativa na porcentagem de linfócitos CD8++ no
sangue periférico, entre os pacientes com EMPP e EMSR quando comparado
aos indivíduos saudáveis;
2. Linfócitos CD19++ do sangue periférico de pacientes com EMPP expressam
aumento significativo de GrB, RunX3 e CD4+9d em comparação aos
linfócitos B de indivíduos saudáveis.
3. Não há diferença significativa na expressão de GrB pelos linfócitos CD19++
CD5+ no sangue periférico, entre indivíduos com EMPP quando comparado
aos indivíduos saudáveis.
4. Não existe diferença significativa na expressão de GrB pelos linfócitos
CD19++ no líquido cefalorraquidiano, entre indivíduos com EMPP quando
comparado a indivíduos saudáveis.
5. Existe significativa redução dos níveis de BDNF no soro de pacientes EMPP
quando comparado aos indivíduos saudáveis.
6. Foi observado aumento estatisticamente significativo de NFL no LCR de
pacientes com MSPP e MSSR.
47
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ANEXO
Anexo 1: Parecer consubstanciado do CEP – Comitê de ética
59
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61
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63
64
65
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Anexo 2: Declaração de direitos autorais
DECLARAÇÃO
As cópias de artigos de minha autoria ou de minha co-autoria, já publicados ou submetidos para a publicação em revistas científicas ou anais de congresso sujeitos a arbitragem, que constam de minha Dissertação/Tese de Mestrado/Doutorado, intitulada "Estudo das sobpopulações de linfócitos B no
sangue periférico e líquido cefalorraquidiano em pacientes com esclerose múltipla primária progressiva", não infringem os dispositivos da Lei n. 9.610/98, nem o direito autoral de qualquer editora.
Campinas, 03 de maio de 2020
Assinatura
Nome do(a) autor(a): Raphael Patrício da Silva Quintiliano
RG n. 47097860-0
Assinatura:
Nome do (a) orientador (a): Profa. Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos
RG n. 5549245-9
