“Quenching” de fluorescencia

quenching = desactivación= apagamiento = menor emisión

IF (Q) < IF (-Q)

Reacciones en el estado excitado (Quenching colisional)

Entrecuzamiento intersistema a estado Triplete

Rearreglos moleculares

Transferencia de energía

Transferencia de carga

Formación de complejo en el estado basal (Quenching estático)

F Q F Q

F Q F Q

F Q F Q

F Q P

*

* *

* + -

*

Mecanismos de desactivación bimolecular

d[F*]

dt[F*] + [F*] + [F*][Q]r nr d k k k

Quenching colisional

Transferencia de energía

Transferencia de carga

Reacción

0

/ 0 = F/F0

Quenching colisional o dinámico

X

X*

hν

hν’

< 0

Q

XQ*

X + Q

X kQ

A una concentración fija del fluoróforo, medimos cómo varía la fluorescencia con concentraciones crecientes de quencher y se calcula:

F0/F (F0: fluorescencia en ausencia de quencher)

F0/F

[Q]

1

Ksv

Gráfico de Stern-Volmer F0/F = 1 + Ksv [Q]

Ksv = constante de Stern-Volmer, depende de:

• tipo de fluoróforo y quencher

• accesibilidad del fluoróforo

(viscosidad,temperatura)

Quenching colisional o dinámico

Quenching colisional o dinámico

F0/FStern-Volmer

Quenching de triptofano por O2

KSV = 32 M-1

Quenching colisional o dinámico

KSV = kq 0 kq = cte. vel. quenching

k0 = cte. vel. colisional (controlada por difusión)

fQ = fracción de encuentros efectivos que terminan en quenching

kQ se determina experimentalmente a partir de KSV. Se estima la eficiencia de

quenching fQ calculando k0 según Smoluchowski:

O se conoce la eficiencia de quenching fQ entonces se calcula k0 para estimar el coeficiente de difusión D usando la ecuación de Stokes-Einstein:

Quenching dinámico o colisional

• Se requiere contacto entre Q y F, interacción molecular

• Quenching dinámico o colisional: Q + F*

• Q debe difundir hacia F distancias moderadas (a diferencia de relajación por solvente)

Indica localización del F, exposición de F de manera de ser accesible a Q

Colicin E1 = proteina de membrana12 W

Quenchers of W emission: Iodide, acrylamide, disulfide, e-defficient groups like –NH3+, -COOH, histidine protonated

Carga del quencher afecta el quenching (Ksv)

DHE = dihidroequinelin = esteroide fluorescenteSBP = steroid binding protein

Impedimento estérico disminuye quenching (Ksv)

Transferencia de energía

hDonante Aceptor

h

FRET

h

Cuando una molécula del donante absorbe un fotón y hay una molécula de aceptor cerca, puede ocurrir la transferencia de energía del estado excitado del donante al aceptor por una via no radiativa.

Como resultado de la transferencia de energía se observa una disminución en la intensidad de fluorescencia emitida por el donante y, si el aceptor es fluorescente, la aparición de una nueva señal fluorescente.

RESONANCE ENERGY TRANSFER (RET o FRET):

EM D EX A

A

EM A

A

EM A

EX D

D*

EX D

D

F

A *

D

Solapamiento espectral

Donante

Aceptor

Solapamiento

Absorbancia

Absorbancia

Fluorescencia

Fluorescencia

La eficiencia de la transferencia depende de:

• la distancia entre D y A

• el grado de solapamiento entre el espectro de emisión de D y el de absorción de A

• la orientación relativa entre D y A

• el tiempo de vida de D*

Eficiencia de la transferencia de energía

Experimentalmente, E puede calcularse a partir de los tiempos de

vida o intensidades de fluorescencia del donante en ausencia y presencia del aceptor.

d,a d,a

d d

I1 1

I E = - -

TE

TE + i

kE =

k k

Eficiencia de la transferencia de energía

ER

r R

6

6 6d,a

E

k

k

TE

d TE1 / k R

( od

) 1

R

J

No

d

a6

5

9000 10

128

2

4

ln Q

kJ

N rTE

d,a d

d

a

9000 10

128

2

45 6

ln Q

Dependencia con la distancia

ER

r R

6

6 6d,a

Donante Aceptor Ro (Å)

Fluoresceina Tetrametilrodamine 55

IAEDANS Fluoresceina 46

Fluoresceina Fluoresceina 44

BODIPY FL BODIPY FL 57

0

0.25

0.5

0.75

1

0 20 40 60 80 100

Distance in Angstrom

Eff

icie

nc

y o

f tr

an

sfe

r

Se pueden medir distancias por

FRET entre ~0.5 R0 and ~1.5R0

¿Para que sirve?• para medir distancia inter o intramoleculares.

Con esa informacion se puede:

-estudiar cambios conformacionales

-medir asociaciones

- colocalizar in vivo

etc,etc

EM AEX D

F

• se puede ver la disminución de la fluorescencia de D o el aumento de la emisión de A. En general se usa la primera forma.

Hidrólisis de un sustrato

TIBS (2000) 25; 631-637

FRET

Eficiencia FRET

Dador (λexc 1, λem1) Uso λexc 1 y λem2

Aceptor (λexc 2, λem2)

Eficiencia FRET, E = 1 – F (D+A)/FD

E = Ro6/ Ro6 + r6

Ro = radio Forster, r = distancia entre D y A

Formación de agregados moleculares

Usos de fluorescencia en bioquímica

• Localización subcelular• Cambios en la concentración • Interacciones moleculares• Cambios conformacionales• Distancias intra/intermoleculares• Difusión rotacional • Caracterización estructural• Actividad enzimática

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