Quantitative Real-time PCR

Andrea MinutiDepartment of Animal Science, Food and Nutrition - DIANA

Proteomics and Nutrigenomics Research Center - PRONUTRIGEN

quantitative Real-time PCR

Simultanea amplificazione e quantificazione del DNA target

AMPLIFICAZIONE: classica reazione PCR

QUANTIFICAZIONE: composti la cui fluorescenza emessa ad ogni ciclo di reazione è proporzionale alla quantità di amplificato

quantitative Real-time PCR

Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione e il relativo CT (Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di

DNA iniziale

Gene expressionSample

RNA extraction

RNA quality assessment

Retro trascription using precise amount of RNA

cDNA dilution (1:4 cDNA:water)

PCR with a precise amount of cDNA

PCR performance and data checking

Normalization and data transformation

Statistical analysis and data interpretation

Mix little amount of cDNA from samples (dilution 1:2)

Build the standard curve(1:2 or 1:10 dilution, 6 or 7 points)

Primers design

Primers validation

Validation of Internal Control Gene

Total RNA composed of:- Ribosomal RNA (rRNA) = ca. 80%

18S and 28S for mammalian rRNA- Transfer RNA (tRNA) = ca. 15%- Messenger RNA (mRNA) = 1-3%

our target!

StepOnePlus

Ottica: LEDPiastra: 96 postiPozzetti: 100-200µl

CFX384 Touch

Ottica: LEDPiastra: 384 postiPozzetti: 50µlVol. reazione 10 µl

Vantaggi – Svantaggi

Experion™Stazione automatizzata per elettroforesi su gel

Quantificazione di acidi nucleici

Integrità RNA quality indicator

RQI (0-10)

>7 5-7 <5

Quantitative Real Time PCR

Fleige and Pfaffl, Molecular Aspects of Medicine, 2006

La qualità è importante

Gene expression

Microbiologia

enzima che aggiunge sequenzeripetitive di DNA non codificante,TTAGGG nei telomeri:

NON presente nelle cellule somatichePresente in:cellule germinalicellule tumoralicellule staminali

Telomerase activity

Capuco et al., Experimental Biology and Medicine. 2009, 234:475-482.

Our friend MIQEMinimum Information for publication of Quantitative

real-time PCR Experiment

Bustin et al., Clinical Chemistry 55:4 (2009)

Our friend MIQE

Bustin et al., Clinical Chemistry 55:4 (2009)

Our friend MIQE

Bustin et al., Nature Methods, 2013

High impact factor journal ⇓

less methodological consideration (at the least for qPCR)...