UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BIOLOGÍA MOLECULAR LABORATORIO

SECCIÓN 6

TALLER VISUALIZACIÓN DE COMPUESTOS DE LA PCR Y SECUENCIACIÓN

PRIMERA PARTE (ANTES DE LA PRÁCTICA)

ALEJANDRO VALENZUELA

LINA SOTAQUIRÁ

CAROLINA AGREDO

JUAN SEBASTIÁN SANCHEZ

1.

Además de los métodos convencionales, encontramos en el mercado a precios mucho más costosos, kit comerciales que resultan ser más eficientes en la purificación de los productos de PCR. Entre ellos encontramos:

ExoSAP-IT PCR Clean-up Kit:

Está compuesto por dos enzimas hidrolíticas, como lo son la exonucleasa (EXO) y la fosfatasa alcalina de camaron (SAP), y un buffer especializado para la eliminación de primers y dNTPs no deseados. Las ventajas de éste método son: En primer lugar, tarda tan solo 30 minutos para hacer la purificación de los productos de PCR y como segunda ventaja presenta un 100% de recuperación y purificación de productos menores a 100 pares de bases y mayores a 20 pares de bases, sin necesidad de geles, columnas de rosca, filtraciones, separaciones magnéticas o partículas, herramientas caracteristicas de los otros protocolos.

Figura 1.

Diagrama esquemático del método ExoSAP-IT PCR Clean-up

Procedimiento en 30 minutos:- Un solo paso de pipeteado (adición de mezcla de enzimas)- Una incubación de 15 minutos a 37°C

- Inactivación de la enzima a 80°C durante 15 minutos (Las enzimas inactivadas por calor no interfieren en posteriores aplicaciones).

Figura 2. Degradación perfecta de primes

ExoSAP-IT es capaz de digerir por lo menos 25 pmol de primers en 5μl en solo 15 min a 37°C, lo que equivale a diez veces la concentración promedio de primers en una reacción de PCR

CARACTERÍSTICAS:

A. Simple: En un solo paso y en tubo

No necesita de geles, columnas o sedimentaciones, ya que las enzimas EXO y SAP son activas en los buffers de PCR que comunmente se usan, evitando la tapa de intercambio de buffer. La EXO remueve los primers residuales de cadena sencilla y cuaquier ADN extraño de cadena sencilla producida durante la PCR, mientras que la SAP elimina los restantes, dNTPs no incorporados de la mezcla de PCR (ver Fig. 2).

B. Alto rendimiento: 100% de recuperación de la muestra

Figura 3. No hay pérdida de los productos de PCR después del tratamiento de ExoSAP-IT

El marcador de ADN (carril M). Gran variedad de tamaños de productos de PCR pueden ser tratados con ExoSAP-IT, incluyendo por ejemplo un fragmento de 125 pb, sin tener pérdida de muestra.

Otros protocolos poseen metodologías con mayor número de pasos y con recuperciones en rangos del 70 – 90%. EXOSAP-IT purifica procesos de PCR de menos de 100 pb a más de 20 kb sin pérdida de muestra. En la etapa de tratamiento enzimático, se asegura que todos los productos de PCR sean conservados en el único tubo de reacción.

C. Escalable: Menor tiempo y mayor rendimiento

El único paso de pipeteado, permite la adición de enzimas al tubo de reacción de PCR, haciendo más facil el procesamiento de múltiples muestras, de forma manual o automática mediante dispositivos robóticos.

D. Secuenciación de alta calidad con productos de PCR

ExoSAP-IT puede ser utilizado como un método de purificación previo a lasecuenciación de ADN fluorescente o radiactivo (GE Healthcare, 2006).

Aplicaciones:

Es posible encontrar el uso de este método en diferentes artículos científicos, entre ellos tenemos:

- An improved method for post-PCR purification for mtDNA sequence analysis

El análisis de ADN mitocondrial (ADNmt) en muestras tipicamente forenses, es llevado a cabo cuando se evidencia una insuficiente calidad y cantidad de ADN para el análisis de ADN nuclear. Dicho procedimiento puede llegar a ser largo y complejo, es por esto que se propone un procedimiento más simple que requiere la purificación de los amplicones (conjunto de moléculas de ADN similares o clon molecular resultado de una PCR) por filtración centrífuga, posterior a la PCR y previo a la secuenciación del ciclo. Para tal fin, se hace uso de columnas de purificación de PCR Qiagen QlAquick y Concert Rapid, y el reactivo ExoSAP-IT.

Al evaluarse el rendimiento de dichos amplicones purificados, la calidad del perfil de secuencia y la facilidad de la prueba, se decidió reemplazar el método de filtración por el uso del reactivo Exo SAP-IT para la purificación de los productos de PCR (Dugan, Lawrence, Hares, Fisher & Budowle, 2002)..

1.- Sequencher 5.1 from Gene Codes Corporation

Figura 4. Sequencher 5.1 (Gene Codes Corporation)

- The Sequence Manipulation Suite

Figura 5. The Sequence Manipulation Suite (Bioinformatics)

2.

El buscador ORFF (Open Reading Frame Finder) es una herramienta de análisis gráfico, utilizada para encontrar todos los marcos de lectura abiertos de un mínimo tamaño seleccionable en una secuencia proporcionada por el usuario o en una secuencia ya existente en la base de datos.

ORFF los identifica haciendo uso de códigos genéticos preestablecidos y estandarizados. La secuencia de aminoácidos deducida es posible guardarla en diferentes formatos y en las búsquedas de las bases de datos de secuencias, haciendo uso del servidor www blast. En pocas palabras dicha herramienta bioinformática nos permitiría la preparación de una secuencia completa y precisa.

Figura 4. Open Reading Frame Finder (NCBI).

BIBLIOGRAFÍA:

Bioinformatics. (n.d.). The sequence manipulation suite. Retrieved from http://bioinformatics.org/sms/

Dugan, K., Lawrence, H., Hares, D., Fisher, C., & Budowle, B. (2002). An improved method for post-pcr purification for mtdna sequence analysis. (Master's thesis), Available from Medline. (12136989)Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12136989

Gene Codes Corporation. (n.d.). Dna sequence analysis software. Retrieved from http://genecodes.com/?referrer=Google_SA-D_DNA_soft&gclid=CObboq2NoboCFUdk7AodoSAAXg

GE Healthcare. (2006). Exosap-it pcr clean-up kit. Retrieved from http://www.promix.ru/manuf/ge/genom/bro/ExoSAP-IT.pdf

NCBI. (n.d.). Orf finder (open reading frame finder). Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html