Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao Separao por membranas

Extrao em sistemas de duas fases

lquidas

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Processos de Os processos mais empregados para Separao por so os que utilizam purificao de bioprodutos a diferena de presso Membranas como fora motriz;Em razo da natureza e do tipo de solutos e

da presena ou no de partculas em suspenso, existem diferentes membranas com diferentes tamanhos e distribuio de poros caracterizando 4 processos:7/29/12

Principais caractersticas dos processos que utilizam diferena de presso como fora motriz

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Faixas de tamanho de poros das membranas

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Microfiltrao similar a uma filtrao clssica que utiliza Emprega membranas microporosas,

membranas sintticas como barreira seletiva isotrpicas ou anisotrpicas, com tamanho de poros entre 0,05 a 5 m

empregada para reter partculas em

suspenso, tanto no ar quanto em misturas aquosas

So membranas totalmente permeveis aos

compostos solveis, independentemente do 7/29/12 de suas massas molares valor

UltrafiltraoEmprega membranas microporosas

anisotrpicas, com dimetros de poros entre 1 e 500 nm.Capaz de reter macromolculas em soluo, e

permevel a todos os solutos de baixa massa molarBastante utilizada na purificao quanto na

concentrao 7/29/12

de protenas e enzimas

Osmose Inversa Utiliza membranas anisotrpicas densas, portanto, so

permeveis apenas ao solvente, em geral, gua, retendo, praticamente, todas as molculas solveis e materiais em suspenso;

Alta presso faz a gua atravessar a membrana no sentido

da soluo mais concentrada para a menos concentrada.

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Mtodos de Purificao de Baixa ResoluoPrecipitao Separao por membranas

Extrao em sistemas de duas fases

lquidas

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Extrao em sistemas de duas fases aquosasUtilizada na purificao de antibiticos e cidos orgnicos; Consiste na separao da molcula-alvo e impurezas baseada em suas diferentes solubilidades nas fases lquidas

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Extrao em sistemas de duas fases aquosasSistemas de duas fases aquosas so formados

pela reunio de determinados polmeros, polieletrlitos, ou polmeros em combinao com solutos de baixa massa molar formando quatro grupos:2 polmeros no-inicos. Polieletrlito e um polmero no-inico; 2 polieletrlitos Polmero no-inico e um composto de baixa

massa 7/29/12

molecular

Extrao em sistemas de duas fases aquosasSistemas formados por polietilenoglicol e um

sal so intensamente empregados por apresentarem rpida separao das fases, baixo custo e elevada seletividade na separao de molculas com base na solubilidade

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l

imiscveis;l

Extrao em sistemas de duas fases aquosas Duas solues aquosas

Molcula-alvo P apresenta maior solubilidade na fase de topo em relao fase de fundo; Maior grau de pureza da molcula-alvo se os contaminantes apresentarem solubilidade 7/29/12l

Diagrama de Equilbrio em sistemas de duas fases aquosas (SDFA)Curva de equilbrio de um sistema PEG/fosfato

Reta TMB: linha de amarrao (tie-line)7/29/12

Curvas de equilbrio do sistema PEG/fosfato de potssio em funo dos parmetros massa molecular e pH do meio

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Coeficiente de Partio (K)Grandeza adimensional que representa a

relao entre as concentraes da molcula de interesse na fase de topo e na fase de fundo no equilbrio:CFi

K= CTi

CTi = Concentrao de soluto i na fase de topo (g/L); Utilizado para avaliao da extenso das CFi= Concentrao de soluto i na fase de fundo separaes nos sistemas de duas fases aquosas; (g/L); Ocorrncia de purificao: coeficientes distintos para a molcula de interesse e para as demais 7/29/12

Fatores que influenciam no coeficiente de Interaes hidrofbicas partio KCargas superficiais / pH Diferena de potencial eltrico entre as fases Efeito de salting-out da fase salina Diferenas de viscosidade Diferenas de densidade Diagramas de fases (ex.: concentrao de

PEG e sal)7/29/12

Massa molecular da biomolcula

Mtodos de Purificao de alta resoluo:

Cromatografia

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CromatografiaPrincpio Geral:Reteno e Liberao da molcula-alvo A matriz slida capaz de reter a molcula

por um determinado perodo de tempo (tempo de reteno) molcula-alvo

Eluio do fluido e consequente separao da

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Cromatografia

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Cromatografia

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CromatografiaCromatografia de excluso molecular Cromatografia de troca-inica Cromatografia de interao hidrofbica Cromatografia de afinidade

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Cromatografia de excluso molecularProcesso:Os solutos de um meio lquido (protenas,

peptdeos, anticorpos) so adsorvidos ou retidos em um leito de material poroso;

As molculas sofrem partio em virtude das

diferenas no tamanho das espcies entre um solvente (fase mvel) e uma fase estacionria de porosidade definida;7/29/12

Cromatografia de excluso molecularSeparao por tamanho das molculas

A ordem de recuperao seletiva das molculas no 7/29/12 eluente tem incio com as maiores molculas, fluxo

Cromatografia de excluso molecular Eluio de uma

mistura de trs protenas de massas moleculares diferentes em uma coluna de permeao em gel, com a formao de faixas distintas medida que a amostra permeia a coluna

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Cromatografia de excluso molecularAplicaes:Dessalinizao Determinao de massas moleculares Determinao de tamanho de poros

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Cromatografia de troca-inicaBaseia-se na afinidade que componentes de

uma amostra tem com os stios inicos em uma matriz slida, ou seja, existe uma competio entre ons de interesse e contaminantes pelos grupos carregados da matriz ou da fase estacionria.

As resinas empregadas apresentam elevada

capacidade de adsoro de protenasA fase estacionria, eletricamente carregada, 7/29/12

Cromatografia de troca-inicaMatrizes de troca-inica:Trocadores aninicos: contm grupos

positivamente carregados e adsorvem protenas com carga lquida negativa

Trocadores catinicos: contm grupos

negativamente carregados e adsorvem protenas com carga lquida positiva

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Cromatografia de troca-inicaPrincpio bsico da cromatografia de troca

inica

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Cromatografia de interao hidrofbicaBaseia-se na reteno das molculas pela

interao da sua regio hidrofbica com a matriz

A protena colocada em meio com elevada

concentrao de sal (expe a regio hidrofbica, aumentando a interao com a matriz)

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Cromatografia de interao hidrofbicaMolcula de protena

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Cromatografia de interao hidrofbica Modelos de adsoro

a: modelo uniponto; b e c: adsoro uniponto; 7/29/12foras hidrofbicas de intensidades d:

Cromatografia de AfinidadeTcnica de separao altamente especfica

que depende das interaes entre os pares de materiais biolgico: enzima-substrato, enzima-inibidor, antgeno-anticorpo.

O ligante imobilizado em uma matriz porosa

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Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas ativas de formas desnaturadas

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Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas nativas de formas desnaturadas

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O complexo formado entre o ligante e a protena tem que ser reversvel; A protena eluda e o ligante regenerado.

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Cromatografia Ampliao de EscalaCritrios:Manter os mesmos graus de pureza,

rendimento, atividade biolgica e, se possvel, rendimento, alcanados em escala de bancada;

Purificao de miligramas a gramas de

produto;

7/29/12 Principal caracterstica: aumento do dimetro

Cromatografia Ampliao de EscalaParmetros que devem ser mantidos constantes:Volume da fase estacionria; Grau de empacotamento; Altura do leito cromatogrfico; Velocidade linear de alimentao (vazo

Colunas industriais volumtrica dividida pela rea de corte transversal da coluna). Altura de leito em torno de 30 cm e dimetro da 7/29/12 ordem de 1 m.

Cromatografia Ampliao de Escala

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