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PRUEBAS DE VIABILIDAD A CINCO CEPAS BACTERIANAS CRIOPRESERVADAS
Y ESTUDIO PARA LA LIOFILIZACIOacuteN DE LAS MISMAS EVALUANDO TRES
COMPUESTOS PROTECTORES PERTENECIENTES AL BANCO GENEacuteTICO DEL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute
DE CALDAS
ANDRES VICENTE CASTANtildeEDA RANGEL
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIOacuteN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGIacuteA
BOGOTAacute DC
2015
PRUEBAS DE VIABILIDAD A CINCO CEPAS BACTERIANAS CRIOPRESERVADAS
Y ESTUDIO PARA LA LIOFILIZACIOacuteN DE LAS MISMAS EVALUANDO TRES
COMPUESTOS PROTECTORES PERTENECIENTES AL BANCO GENEacuteTICO DEL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute
DE CALDAS
ANDRES VICENTE CASTANtildeEDA RANGEL
Proyecto de Trabajo de Grado para optar al tiacutetulo de Licenciado en Biologiacutea
Director
MSc MIGUEL Aacute PIRAGAUTA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIOacuteN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGIacuteA
BOGOTAacute DC
2015
DEDICATORIA
ldquoHay hombres que luchan un diacutea y son buenos Hay otros que luchan un antildeo y son mejores Hay
quienes luchan muchos antildeos y son muy buenos Pero hay los que luchan toda la vida esos son
los imprescindiblesrdquo
Bertolt Brech
Este trabajo va dedicado a todas aquellas personas cercanas a miacute que fueron un apoyo constante
durante estos antildeos en la universidad De igual forma esta dedicatoria concierne a aquellas personas
que hicieron difiacutecil mi camino porque demostrarles que si podiacutea cumplir mis objetivos pese a las
adversidades resultoacute ser una motivacioacuten auacuten maacutes fuerte para miacute
Una dedicatoria especial a mi familia y a mi prometida Adriana Calderoacuten una investigadora cuyas
ensentildeanzas y apoyo afectivo estaacuten muy relacionadas con la finalizacioacuten exitosa de este proyecto
AGRADECIMIENTOS
La realizacioacuten de este trabajo fue posible gracias a muacuteltiples personas que de forma directa o
indirecta intervinieron en su realizacioacuten
La Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas por haberme dado una formacioacuten integral como
Licenciado en Biologiacutea a traveacutes de sus docentes y sus espacios
A mi director el docente Miguel Aacute Piragauta MSc por confiar en miacute y en mi trabajo por abrirme
las puertas del laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos
Naturales por su asesoriacutea y direccioacuten
A los laboratoristas Oscar Romero y Aleyda Ariza por su guiacutea sus consejos durante el desarrollo
del trabajo y su apoyo frente a la realizacioacuten del mismo
A los estudiantes Cesar Romero y Diego Castantildeeda quienes aportaron valiosa informacioacuten y
experiencia durante mi estadiacutea en el laboratorio a traveacutes de su proyecto
A la docente Gloria Stella Acosta Pentildealoza MSc quien amablemente dio su apoyo como revisora
y evaluadora de este proyecto y me guio en las encrucijadas con las cuales los cientiacuteficos solemos
enfrascarnos
A Gineth Adriana Calderoacuten por su colaboracioacuten en distintas etapas de este trabajo
He mencionado a grosso modo solo a algunas personas pido por ello disculpas a aquellos que no
mencioneacute pues sus aportes tambieacuten fueron importantes para el eacutexito de este proyecto
CONTENIDO
RESUMEN 10
ABSTRACT 10
1 INTRODUCCIOacuteN 11
2 MARCO REFERENCIAL 13
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS 13
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS 14
221 Conservacioacuten a corto plazo 14
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten 14
223 Conservacioacuten a largo plazo 15
2231 Liofilizacioacuten 15
2232 Control de calidad de un producto liofilizado 20
2233 Equipamiento para liofilizar 21
3 OBJETIVOS 22
31 OBJETIVO GENERAL 22
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 22
4 METODOLOGIacuteA 23
41 FASE INICIAL 23
411 Acervo Microbiano 23
412 Eleccioacuten de los protectores 23
4121 Crioprotectores 23
4122 Lioprotectores 23
42 FASE INTERMEDIA 1 24
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten 24
4211 Viabilidad 24
4212 Estabilidad Morfoloacutegica 25
4213 Pureza 25
422 Recuperacioacuten de los microorganismos 25
423 Criopreservacioacuten 26
4231 Precriopreservacioacuten 26
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 26
424 Liofilizacioacuten Etapa 1 26
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 26
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 26
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje) 27
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2 29
43 FASE INTERMEDIA 2 29
431 Liofilizacioacuten definitiva 29
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 29
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 30
4313 Posliofilizacioacuten 30
4314 Rehidratacioacuten 30
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos 30
4321 Propiedades fiacutesicas generales 30
4322 Contaminacioacuten 30
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten 31
433 Pruebas adicionales 31
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica 31
4332 Prueba de estabilidad acelerada 31
434 Control de esterilidad 32
4341 Medios 32
4342 Ambiente 32
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 32
44 FASE FINAL 32
441 Base de datos 32
442 Fichas de resumen 33
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 33
444 Formatos de control del banco de liofilizados 33
445 Manual de procedimientos 33
5 RESULTADOS 34
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN 34
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE
ESTUDIO 35
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD
NATURAL 38
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general 38
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado 41
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA 41
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN 42
551 Propiedades fiacutesicas generales 42
552 Contaminacioacuten 45
553 Tiempo de redisolucioacuten 45
56 PRUEBAS ADICIONALES 46
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica 46
562 Prueba de estabilidad acelerada 47
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN 47
571 Base de datos 47
572 Fichas de resumen 47
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 47
574 Formatos de control del banco de liofilizados 48
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten 48
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS 49
7 CONCLUSIONES 54
8 RECOMENDACIONES 55
9 REFERENCIAS 56
10 BIBLIOGRAFIacuteA 60
11 ANEXOS 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten 16
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado 17
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua 18
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten 19
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes 21
Figura 6 Metodologiacutea 23
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 28
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelacioacuten 35
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 38
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilizacioacuten definitiva por cepa bacteriana 41
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes 45
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales 46
Figura 17 Organigrama de la base de datos 47
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas 24
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten 27
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 28
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales 29
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada 31
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados 33
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten) 34
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004 36
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006 36
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007 37
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009 37
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010 38
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad 41
Tabla 14 Tabla de convenciones 42
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1 42
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada 44
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado 46
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencioacuten de los microrganismos y dada su importancia se han
creado colecciones bioloacutegicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologiacutea Existe variedad de meacutetodos de preservacioacuten en este trabajo se determinoacute el estado
de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad estandarizando e
implementando ademaacutes el sistema de liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos
evaluaacutendolos frente a tres compuestos protectores Se realizoacute una evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten teniendo como base tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
encontrando que el sistema de criopreservacioacuten implementado en el laboratorio es oacuteptimo y el
glicerol al 67vv funciona para casi todas las cepas por largos periacuteodos de tiempo la sacarosa
10pv resultoacute ser el mejor lioprotector de los tres evaluados designaacutendolo como lioprotector
general para el laboratorio Se creoacute un manual de laboratorio para la conservacioacuten de cepas que
incluye los protocolos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten y de seguridad de los mismos Este
trabajo aporta al campo de la microbiologiacutea de la conservacioacuten y constituye un peldantildeo maacutes para
el registro del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes
PALABRAS CLAVE Criopreservacioacuten liofilizacioacuten lioprotectores conservacioacuten
microorganismos
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and given its importance have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology Exists variety of methods of preservation in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing standardizing and further
implementing the system freeze-drying taking as a starting point to them evaluating them against
three protective compounds An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators
viability morphological stability and purity was performed finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67 vv works for almost all strains for long
periods of time sucrose 10 wv lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory It was created a manual for conservation
laboratory strains including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions
KEYWORDS cryopreservation freeze-drying lyoprotectants conservation microorganisms
11
1 INTRODUCCIOacuteN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible pues como lo menciona
Hurtado (2009) la vida no es posible sin la actividad de estos ya que estaacuten involucrados en todas
las dinaacutemicas ambientales existentes en el planeta Sin embargo su importancia ha ido maacutes allaacute
desde que fueron descubiertos hace unos 300 antildeos por van Leeuwenhoek potencializaacutendose su
investigacioacuten y utilizacioacuten en distintos campos de la ciencia y la tecnologiacutea en los uacuteltimos 100
antildeos iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi amp Mayz 2003)
Debido a esto se han creado colecciones bioloacutegicas como meacutetodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho Las colecciones de cultivos microbianos estaacuten
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt y a nivel internacional por
la Federacioacuten Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) en donde existen actualmente
2acute520200 microorganismos en 711 colecciones de 71 paiacuteses registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM) Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM el CIAT (Rhizobium Collection America) de coacutedigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccioacuten de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de coacutedigo WDCM 857 (WFCC 2015)
No obstante varias universidades del paiacutes instituciones puacuteblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias bioloacutegicas poseen colecciones microbioloacutegicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN) en otros casos las colecciones estaacuten en proceso de registro o en formacioacuten como en la
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) entre otras
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer meacutetodos de conservacioacuten fiables
que entre otras cosas eviten al maacuteximo el riesgo de peacuterdida o de variabilidad geneacutetica de los
individuos Existe variedad de meacutetodos de conservacioacuten seguacuten sea el tiempo que estaraacuten en la
coleccioacuten o el tiempo en que tardaraacuten en ser usados dentro de ellos destacan la criopreservacioacuten y
la liofilizacioacuten meacutetodos utilizados para la coleccioacuten de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo
Martiacutenez amp Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Geneacutetico en el Laboratorio
de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC siglas de la coleccioacuten microbioloacutegica) utilizando
la refrigeracioacuten como meacutetodo primario implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
criopreservacioacuten
En este trabajo se pretendioacute determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos evaluaacutendolos frente a tres compuestos
protectores Para ello en primera estancia se recibioacute una capacitacioacuten sobre manejo y control de
microrganismos preparacioacuten de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados posteriormente se evaluoacute el estado de criopreservacioacuten de las cinco
cepas seleccionadas utilizando teacutecnicas de recuento en placa estaacutendar y se evaluoacute a tres
lioprotectores para la liofilizacioacuten de cepas microbianas del Banco Geneacutetico ademaacutes se realizaron
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacioacuten y se disentildearon los
protocolos para la implementacioacuten del sistema de liofilizacioacuten con las cinco cepas y el lioprotector
que presentoacute mejores resultados en este estudio
Para la realizacioacuten de estos fines el trabajo fue dividido en cuatro fases comenzando por los
criterios de eleccioacuten de los microrganismos y los lioprotectores seguido de la evaluacioacuten de los
meacutetodos de preservacioacuten utilizando tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
posteriormente una tercera fase de ajustes a la liofilizacioacuten para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo utilizando como indicadores las propiedades fiacutesicas generales la
posibilidad de contaminacioacuten en el proceso y el tiempo de redisolucioacuten finalmente una cuarta
fase que corresponde al proceso de documentacioacuten este incluye la revisioacuten y modificacioacuten de la
base de datos la elaboracioacuten de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados asiacute como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccioacuten y finalmente la
elaboracioacuten del manual de procedimientos Con lo anterior se encontroacute que el sistema de
criopreservacioacuten desarrollado por Martiacutenez amp Mayorga (2013) es eficiente y permite porcentajes
de recuperacioacuten bastante altos incluso superiores al 90 luego de dos antildeos sin embargo no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estaacuten expuestas por
este meacutetodo De otro lado se determinoacute la sacarosa al 10 como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caracteriacutesticas propias de cada organismo)
y se estandarizoacute el sistema de liofilizacioacuten
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacioacuten de un nuevo meacutetodo de
conservacioacuten de microorganismos para el Banco Geneacutetico de la Universidad Distrital Francisco
Joseacute de Caldas ademaacutes aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacioacuten en bacterias y ofrece
informacioacuten yo tips sobre el proceso de liofilizacioacuten en general que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso Tambieacuten se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Geneacutetico en la comunidad cientiacutefica a nivel nacional
e internacional
Este documento consta en su orden de un capiacutetulo de introduccioacuten y un marco referencial de los
objetivos tanto general como especiacuteficos alcanzados en este trabajo una metodologiacutea detallada
paso a paso perfectamente reproducible los resultados encontrados asiacute como el anaacutelisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacioacuten
finalmente un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo el campo de la
conservacioacuten microbiana y los capiacutetulos correspondientes a las referencias y bibliografiacutea utilizada
Se incluye tambieacuten un capiacutetulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientiacutefica del presente trabajo
13
2 MARCO REFERENCIAL
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS
La vida en la Tierra no seriacutea posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado 2009) ya que estaacuten involucrados con las dinaacutemicas en los ecosistemas terrestres aeacutereos
y acuaacuteticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta Existen
microorganismos que degradan la materia orgaacutenica hacieacutendola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) evitando que el mundo sea un vertedero
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnoloacutegicos de la humanidad
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea Bacteria y
Eucarya en donde encontramos como primeros representantes a las bacterias las maacutes numerosas
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) muchas pueden
resultar beneacuteficas para ser utilizadas con fines biotecnoloacutegicos agriacutecolas biomeacutedicos ecoloacutegicos
y de biorremediacioacuten (Morales-Garciacutea et al 2010) Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucioacuten en la naturaleza contribuyendo a la descomposicioacuten de la materia orgaacutenica y
participando en los ciclos bioloacutegicos (Pontoacuten Moragues Geneacute Guarro amp Quindoacutes 2002)
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucioacuten de los
graves problemas de la humanidad (Gonzaacuteles de Oca Martiacutenez Riveroacuten amp Nuacutentildeez 2006) en la
agricultura alimentacioacuten salud y en la buacutesqueda de nuevas fuentes de energiacutea y la conservacioacuten
del medio ambiente Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioquiacutemicas para Atlas (citado por Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez
1998) dicha capacidad se basa ldquoen la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones oxidaciones reducciones y precipitacioneshellip y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierrardquo (paacuteg 289)
Los recursos microbioloacutegicos (microorganismos genes e informacioacuten) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologiacutea las ciencias de la vida (Ivshina amp Kuyukina 2013) el
desarrollo de medicamentos farmaceacuteuticos agentes agroquiacutemicos biocontroles cosmeacuteticos y
productos industriales (Ten Kate 1995) Ademaacutes con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el eacutexito de los primeros aislamientos de microorganismos se marcoacute la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacioacuten de toda la biodiversidad microbiana logrando la inclusioacuten de este tema en el
desarrollo de las poliacuteticas ambientales (Gonzaacuteles et al 2006)
El meacutetodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta fuera de sus
ambientes ecosistemas y nichos ha sido la creacioacuten de colecciones bioloacutegicas cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfoloacutegicos fisioloacutegicos o
geneacuteticos (Montes de Oca et al 2008) Las colecciones de cultivos microbianos variacutean en forma
funcioacuten y tamantildeo Pueden ser pequentildeas privadas mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especiacuteficos (Duratildees Sette Pagnocca amp Rodrigues 2013)
14
El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura baacutesica de
investigacioacuten en ciencias de la vida llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg Dedeurwaerdere amp Pascual 2013) de animales y plantas pero se cuentan con
caracteriacutesticas especiacuteficas para los microorganismos En primer lugar los organismos microbianos
tienen una variacioacuten geneacutetica extremadamente alta y altos iacutendices de mutacioacuten en la reproduccioacuten
en las especies por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al 2013) a su lugar de recoleccioacuten En segundo lugar las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacioacuten asegurar los recursos geneacuteticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes para proporcionar biomateriales autenticados
para materiales de investigacioacuten exploracioacuten y produccioacuten asiacute como su uso contemporaacuteneo por
parte de las entidades privadas y puacuteblicas (Stromberg et al 2013)
Los microorganismos al igual que otros seres vivos poseen una uacutenica e irremplazable
secuencia de ADN por lo que su desaparicioacuten implicariacutea la peacuterdida irreversible de un conjunto
uacutenico de informacioacuten (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) de ahiacute la gran importancia en la
creacioacuten de comiteacutes comisiones federaciones y grupos de microbiologiacutea como World Federation
for Culture Collection (WFCC) International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacioacuten
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC 2010b)
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
En las colecciones es necesario establecer meacutetodos de conservacioacuten confiables y especiales
pudiendo realizarse a corto mediano y largo plazo para asegurar la oacuteptima viabilidad
almacenamiento y pureza (WFCC 2010b) de los diferentes microorganismos Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de peacuterdida cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
miacutenimo dos meacutetodos (WFCC 2010b) de conservacioacuten que consideren el tiempo a emplear en la
preservacioacuten inicial manipulacioacuten y control perioacutedico de las cepas asiacute como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemaacuten Diacuteaz Rosa amp Aacutelvarez Molina 2005)
Se debe tener especial cuidado con geacuteneros y especies todaviacutea no conservadas en colecciones
(especies nuevas) contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
oacuteptimos (WFCC 2010a) de conservacioacuten de estos
221 Conservacioacuten a corto plazo
Comuacutenmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestioacuten seraacute utilizado en un corto
periodo de tiempo Suele utilizarse la teacutecnica de resiembra continua en este el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC
donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garciacutea et al 2010)
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten
Este concepto agrupa a las teacutecnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 antildeos (Weng et al 2005) Existen variedad de teacutecnicas como la
desecacioacuten el gel de siacutelice o perlas de vidrio el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al
2005) o la congelacioacuten La inclusioacuten de esta uacuteltima teacutecnica en este grupo es discutida por algunos
autores ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacioacuten como la criopreservacioacuten (o
15
congelacioacuten) son teacutecnicas de conservacioacuten a largo plazo (Perry 1995 Weng et al 2005) y otros
insisten su inclusioacuten en las teacutecnicas de conservacioacuten a mediano plazo (Morales-Garciacutea et al 2010)
La criopreservacioacuten consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas
Esto permite la eliminacioacuten del agua libre disponible y que en el interior de los individuos ldquosoacutelo
una proporcioacuten del total de agua se convierta en hielordquo (Perry 1995 paacuteg 23)
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 deg C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta peacuterdida de la
viabilidad del cultivo (Perry 1995) por parte del laboratorio Este meacutetodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las ceacutelulas a -80degC
(Morales-Garciacutea et al 2010) Heckly (citado por Perry 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas la viabilidad celular es casi independiente del periacuteodo de almacenamiento ademaacutes
se cree que los individuos criopreservados siguen siendo geneacuteticamente estables
Hubaacutelek (2003) menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacioacuten de microorganismos desde las caracteriacutesticas propias del individuo (cepa
especie tamantildeo y forma de celda fase de crecimiento al momento de congelar composicioacuten de las
ceacutelulas etc) asiacute como los factores antes (composicioacuten del medio de crecimiento pH temperatura
de incubacioacutenhellip) durante y posterior al proceso de criopreservacioacuten (densidad poblacional
aditivos temperatura y duracioacuten del almacenamientohellip) e incluso en su descongelacioacuten
ldquoLos aditivos crioprotectores son compuestos quiacutemicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los dantildeos durante el proceso de congelacioacutenrdquo (Gonzaacuteles et al 2006 paacuteg
16) Estos protectores se pueden clasificar seguacuten su peso molecular (bajo o alto) o seguacuten su tasa
yo capacidad de penetracioacuten los penetrantes de bajo peso molecular que desplazan el agua
intracelular evitando la formacioacuten de hielo (por ejemplo el glicerol) y los no penetrantes de alto
peso molecular que promueven la raacutepida deshidratacioacuten de la ceacutelula (por ejemplo los gluacutecidos)
(Hubaacutelek 2003)
223 Conservacioacuten a largo plazo
Este concepto agrupa a las teacutecnicas que ademaacutes de minimizar al maacuteximo el riesgo de cambio
geneacutetico en las ceacutelulas mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 antildeos o maacutes (Weng et al 2005)
La maacutes popular es la liofilizacioacuten
2231 Liofilizacioacuten
La liofilizacioacuten consiste en la eliminacioacuten del agua de una sustancia congelada por
sublimacioacuten del hielo bajo alto vaciacuteo y a presiones muy bajas (Gonzaacuteles et al 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador Si la liofilizacioacuten es exitosa se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacioacuten por varios antildeos de los microorganismos sin embargo dicho eacutexito depende de
muacuteltiples factores entre otros como los mencionados por Hubaacutelek (2003) para la criopreservacioacuten
(puesto que la liofilizacioacuten posee una etapa de congelacioacuten) asiacute mismo el tiempo de liofilizacioacuten
los paraacutemetros de liofilizacioacuten el medio aditivo o lioprotector usado tipo de liofilizador o
accesorio utilizado influyen en el producto final
16
El proceso de conservacioacuten de microorganismos por liofilizacioacuten se puede dividir en muacuteltiples
etapas desde la formulacioacuten del protector hasta el modo en que se recuperaraacuten los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1)
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacioacuten Asiacute mismo se
representa el efecto de cascada en teacuterminos de la viabilidad de las muestras
a) Formulacioacuten
Se entiende como la mezcla de ceacutelulas con cualquier solucioacuten protectora que tras la
eliminacioacuten del disolvente permita obtener un producto (liofilizado) deseado La solucioacuten
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacioacuten Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de gluacutecidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics 2015)
Las soluciones protectoras oacuteptimas contienen principalmente un soluto protector
denominado lioprotector que estabiliza las ceacutelulas cuando se elimina el disolvente (agua)
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despueacutes de la liofilizacioacuten (Figura 2) Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actuacutean como su propia matriz por ejemplo la sacarosa al
10 (Ops Diagnostics 2015)
La formulacioacuten tambieacuten comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse pudiendo variar de si se parte de un cultivo soacutelido en
agar o de un cultivo liacutequido hasta que sean cultivos soacutelidos densos (edad de 1-2 diacuteas) o
liacutequidos en fase estacionaria Cuando se parte de un medio liacutequido y si es posible las
ceacutelulas se centrifugan retirando el medio de cultivo y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucioacuten protectora (Ops Diagnostics 2015) o de lioprotector (Grauer
Grunberg amp Zardo 2015) Para cultivos desde agar suele lavarse la placatubo con 5-10
ml de medio protector posteriormente recogido con una pipeta esteacuteril (Ops Diagnostics
2015) Aunque en esto uacuteltimo se evita la centrifugacioacuten se obtiene un mayor nuacutemero de
ceacutelulas partiendo de cultivos liacutequidos (Grauer et al 2015)
17
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado
Fuente Adaptado de Jennings T A (2008) Lyophilization Introduction and Basic Principles (paacuteg 5)
New York Informa Healthcare USA Inc
b) Congelacioacuten
La congelacioacuten es la primera etapa del meacutetodo de liofilizacioacuten y uno de los maacutes
importantes para el eacutexito de este Su funcioacuten consiste en obtener una matriz en donde esteacute
separado el disolvente de los solutos Cuando se congela la formulacioacuten el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regioacuten intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings 2008) la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regioacuten intersticial a casi 0 ademaacutes proporciona una estructura
con resistencia casi nula al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings
2008)
Disminuir el flujo de agua raacutepidamente es importante para evitar asiacute la excesiva
concentracioacuten de solutos un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracioacuten de solutos evitando el estreacutes osmoacutetico y permitiendo una organizacioacuten
espacial de los componentes de la formulacioacuten en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al 2015)
La temperatura y el tiempo para una congelacioacuten completa de la formulacioacuten
dependen de la naturaleza de la misma Nireesha et al (citado por Grauer et al 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco de ahiacute que una correcta congelacioacuten reduce la
desnaturalizacioacuten teacutermica del liofilizado ldquoinmoviliza componentes de la solucioacuten y evita
la formacioacuten de espuma cuando se aplica el vaciacuteordquo (Adams 2007)
c) Secado primario
Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacioacuten ademaacutes es la de maacutes larga
duracioacuten En este etapa la presioacuten se reduce y la temperatura de la formulacioacuten congelada
es elevada dando lugar a la sublimacioacuten (Figura 3) y migracioacuten de vapor de agua (Grauer
et al 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador Sin embrago dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
euteacutectica de colapso de transicioacuten viacutetrea (Tg) para minimizar el dantildeo de la muestra
(Adams 2007)
18
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua Se indican los requerimientos de presioacuten
y temperatura que hacen posible la sublimacioacuten del agua durante la liofilizacioacuten
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
El tiempo para el secado primario depende de muacuteltiples factores como la
composicioacuten de la solucioacuten protectora la porosidad del congelado la calidad o resistencia
de la matriz la cantidad de muestras asiacute como tambieacuten el volumen de la formulacioacuten entre
otros Respecto al volumen ldquopara las bacterias las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 025 a 05 mlrdquo (Ops Diagnostics 2015) Aunque no existe un
volumen establecido hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de maacutes
tiempo
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) un periacuteodo de secado primario de un diacutea es suficiente
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras teniendo
como guiacutea un tiempo de liofilizacioacuten de una noche
La etapa de secado primario finaliza ldquocuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacioacuten y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congeladardquo (Jennings 2008 paacuteg 6)
d) Secado secundario
Es la tercera y uacuteltima etapa de la liofilizacioacuten Al terminar el secado primario se ha
eliminado el agua moacutevil de la muestra Sin embargo existe agua atrapada dentro del soacutelido
amorfo que es maacutes difiacutecil de eliminar (Fetterolf 2010) La cantidad de agua es discutible
ya que fluctuacutea en funcioacuten de la temperatura y las caracteriacutesticas propias de los
19
constituyentes de la formulacioacuten por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10 ww del producto seco (Jennings 2008) o del 2-4 (Ops Diagnostics 2015)
La reduccioacuten del contenido de humedad en la torta se logra por desorcioacuten (Adams
2007) sin reducir el volumen de la misma (Jennings 2008) Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presioacuten parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario durante el secado secundario
(Ops Diagnostics 2015) Es importante que la temperatura no se incremente velozmente y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicioacuten viacutetrea la cual aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf 2010)
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) esta etapa es relativamente corta con una duracioacuten de
1 a 2 horas aunque Grauer et al (2015) indica que representa entre el 30-40 del tiempo
total del proceso asiacute mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo
con una duracioacuten de hasta varios diacuteas Esto resulta importante puesto que ldquola cantidad de
agua residente luego del secado afecta la tasa de peacuterdida de viabilidad durante el
almacenamientordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 16)
Finalmente al ser removida la humedad residual la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al 2015) obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2) o pastel esponjoso con poca (inferior al 1) o nula humedad
residual (Fetterolf 2010)
Las tres etapas del proceso de liofilizacioacuten en funcioacuten de la temperatura y la presioacuten
y en contraste con el diagrama de fases del agua pueden ser observadas en la Figura 4
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten De 1-3 Congelamiento (1-2 presioacuten
atmosfeacuterica) de 3-4 secado primario de 4-5 Secado secundario
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
20
e) Sellado y almacenamiento
Terminado el proceso de secado secundario se deben sellar los viales al vaciacuteo (de ser
posible) o de forma hermeacutetica tan pronto como sea posible debido a que la torta actuaraacute
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf 2010) aunque
tambieacuten es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams 2007) e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de siacutelice
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Sin embrago aunque
se logre un correcto sellado al vaciacuteo no se puede asegurar una larga vida uacutetil en condiciones
ambientales ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al 2015)
por ello lo mejor es almacenar los liofilizados a 4deg C en la oscuridad (Ops Diagnostics
2015) reduciendo las posibilidades de peacuterdidas aunque haya quedado agua despueacutes del
secado
f) Reactivacioacuten o rehidratacioacuten
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacioacuten original esto
implica la adicioacuten de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings 2008
Grauer et al 2015) La dilucioacuten raacutepida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings 2008) da cuenta de un correcto proceso de liofilizacioacuten
ldquoTiempos de reconstitucioacuten excesivamente largos la peacuterdida de potencia o la formacioacuten
de una solucioacuten turbia son indicios de un proceso de liofilizacioacuten inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacioacutenrdquo (Jennings 2008 paacuteg 11)
La recuperacioacuten de las ceacutelulas sin embrago tambieacuten se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacioacuten) el tipo
de diluyente su temperatura su pH la osmolaridad (Grauer et al 2015) la potencia del
lioprotector (Jennings 2008) entre otras propiedades de la solucioacuten resultante
Grauer et al 2015 sugieren la utilizacioacuten de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacioacuten de los microorganismos con el fin de evitar el estreacutes
osmoacutetico que pueden causar las soluciones diluidas sin embargo algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacioacuten especiacuteficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato
Ops Diagnostics (2015) indican que una tasa de supervivencia superior al 50 se
considera aceptable por muchos laboratorios
2232 Control de calidad de un producto liofilizado
Las propiedades fiacutesicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayoriacutea un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacioacuten entre los
paraacutemetros de la formulacioacuten y el proceso de liofilizacioacuten por ello permiten el seguimiento y la
deteccioacuten de falencias (Jennings 2008)
21
Esta evaluacioacuten permite caracterizar las diferentes propiedades fiacutesicas quiacutemicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre dichas propiedades Jennings (2008) y Ticoacute
G (1987) recogen algunos de las toacutepicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado por ejemplo las propiedades generales fiacutesicas de la torta (color volumen temperatura
de transicioacuten textura porosidad densidad contraccioacuten o colapso estado del vial entre otras que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacioacuten) su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfeacuterica) la velocidad de redisolucioacuten o
reconstitucioacuten la estabilidad (de la torta el microorganismo o el lioprotector evaluada de forma
natural o acelerada) nivel de humedad residual posibles contaminantes entre otras
2233 Equipamiento para liofilizar
Como ya se mencionoacute inicialmente el proceso de liofilizacioacuten requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5) este equipo consta esencialmente de tres partes
a) Un sistema o bomba de vaciacuteo que reduce la presioacuten del ambiente de la caacutemara que contiene
el material a secar Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dantildeen ldquoEl nivel
de vaciacuteo requerido debe ser entre 50 y 100 μbarrdquo (Grauer et al 2015 paacuteg 9) aunque 200
μbar son aceptables
b) Un condensador con circuito de refrigeracioacuten que comunica con la caacutemara de secado y
condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacioacuten sobre una superficie enfriada
inferior a los -40degC
c) Caacutemara o accesorio de secado que es donde se coloca el material a secar Seguacuten Nireesha
et al (2013) puede ser de tres tipos
- Manifold o colector muacuteltiple
- Rotary
- Tray style de bandejas con o sin estante de taponado eacuteste uacuteltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaciacuteo de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes En la imagen el liofilizador usa una
caacutemara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial
Tomado de httpslideplayercombrslide84760 el 15 de Agosto de 2015
22
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad y liofilizacioacuten de las mismas evaluaacutendolas frente a tres compuestos protectores
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas utilizando teacutecnicas de recuento
en placa estaacutendar
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacioacuten de cepas microbianas
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten
Disentildear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacioacuten a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados
23
4 METODOLOGIacuteA
La metodologiacutea general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases como es ilustrado en la
Figura 6
Figura 6 Metodologiacutea Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia loacutegica de eventos
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra
41 FASE INICIAL
411 Acervo Microbiano
De la coleccioacuten de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Geneacutetico del laboratorio de
microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracioacuten de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologiacutea estas corresponden a CR004 CR005 (sustituida posteriormente
por CR009) CR006 CR007 y CR010 seguacuten los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodriacuteguez (2013) Todas estaban conservadas por el meacutetodo de criopreservacioacuten (o
criocongelacioacuten) a una temperatura de -85 degC plusmn 1degC
412 Eleccioacuten de los protectores
4121 Crioprotectores
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99999) (Mallinckrodt Meacutexico) en
proporcioacuten 67 vv seguacuten lo establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
4122 Lioprotectores
Para la eleccioacuten de los agentes protectores y sus concentraciones en pv (Tabla 1) se
tuvieron en cuenta diferentes estudios en contraposicioacuten a Hensel (1994) se tomaron
concentraciones superiores al 9 de Glucosa (Merck Darmstadt) de forma aleatoria En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed amp
Roos (2004) y Palmfeldt Radstroumlm amp Hahn-Haumlgerdal (2003) Para la leche descremada
(Proleche Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al (2003) Dichos estudios
fueron tomados como referencia teoacuterica aunque los microorganismos en ellos especificados no
correspondan con los del presente trabajo
Criterios de eleccioacuten de los
microorganismos asiacute como de
los lioprotectores a evaluar
Evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten (criopreservacioacuten
y liofilizacioacuten)
Ajustes a la liofilizacioacuten
para la generacioacuten de
protocolos
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
24
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracioacuten
pv
10 4 10
117 10 15
27 15 20
42 FASE INTERMEDIA 1
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
En este trabajo se evaluaron dos meacutetodos de conservacioacuten (criopreservacioacuten y liofilizacioacuten)
dicha evaluacioacuten se realizoacute en teacuterminos de tres (3) indicadores valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al meacutetodo en siacute
4211 Viabilidad
Para evaluar este indicador se utilizoacute
a) Conteo directo con caacutemara de Neubauer 110mm (Boeco) siguiendo la metodologiacutea
planteada por Valencia Z (2004) Sin embargo para obtener el nuacutemero de bacterias se
utilizoacute la ecuacioacuten planteada por Bastidas (2015)
No de bacteriasml=
Fd Factor de dilucioacuten =
El conteo directo con caacutemara de Neubauer solo se realizoacute previamente al meacutetodo de conservacioacuten
evaluado
b) Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa seguacuten lo
descrito por Valencia Z (2004) y Camacho et al (2009) Para el caacutelculo de UFCml se
utilizoacute la siguiente foacutermula
UFCml = Ndeg de colonias times times
Los caacutelculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologiacutea planteada por
Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales se utilizoacute los planteamientos del Instituto
de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacioacuten y solo pos a la criopreservacioacuten en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid
England)
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten
fue calculado a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010)
Tasa de supervivencia (BSR ) = DD Despueacutes de la desecacioacuten
AD Antes de la desecacioacuten
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000
Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucioacuten
1
ml de muestra
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100
Log (Ndeg UFCml AD)
25
4212 Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realizoacute
a) Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) Se elaboroacute un formato (anexo 1) con las
caracteriacutesticas macroscoacutepicas descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz
(2009) para las colonias desarrolladas en superficie a partir del procedimiento de ldquoconteo
de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Se utilizoacute un
contador de colonias CC-1 (Boeco)
- Se seleccionoacute solo una de dos placas de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de
UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron observadas en al menos el 80 de las colonias
de la placa seleccionada
b) Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se
realizoacute una ldquocoloracioacuten de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005
paacuteg 24)
Se compararon con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y macroscoacutepicas descritas por
Rodriacuteguez (2013) y la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se tomoacute
registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio (Zeiss)
con caacutemara Canon G9
4213 Pureza
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en
cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante
teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
422 Recuperacioacuten de los microorganismos
Para la recuperacioacuten de los microorganismos se tomoacute un criovial de cada cepa bacteriana
sometido a una temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua
destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente cinco (5) minutos (Martiacutenez amp Mayorga
2013) Los crioviales se introdujeron en bantildeo seroloacutegico una vez se llegoacute a la temperatura deseada
no antes
De cada criovial se tomoacute un (1) ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (asymp2240rpm) por diez (10) segundos diluyeacutendolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
Se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten a cada criovial (Thomas
Scientific 5150636) por cepa luego de preparado el tubo T01 antes de la incubacioacuten Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martiacutenez amp Mayorga
(2013) y Rodriacuteguez (2013)
26
423 Criopreservacioacuten
4231 Precriopreservacioacuten
Pasado el tiempo de incubacioacuten se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten al tubo T01 con el fin de determinar el nuacutemero de ceacutelulas totales y viables de la
muestra El conteo en Caacutemara de Neubauer se realizoacute solo hasta el final de los procedimientos de
preservacioacuten por lo cual una vez preparadas las diluciones estas fueron llevadas a nevera a 4degC plusmn
1degC para evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Se siguioacute el protocolo de criopreservacioacuten establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas con
algunas variaciones
Con pipeta esteacuteril de 5ml se depositaron en cinco (5) crioviales 12ml de glicerol anhidro
esteacuteril
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02)
Posteriormente se tomaron aliacutecuotas desde T02 de 600microl previo Voacutertex nivel 7 por 15s
depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl Se rotularon y se
realizoacute Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten
Inmediatamente despueacutes de la homogenizacioacuten fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick) a una temperatura de -85degC plusmn 1degC en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestioacuten
Este procedimiento se realizoacute en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar veinte (20) minutos (Martiacutenez amp
Mayorga 2013) desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar
la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
424 Liofilizacioacuten Etapa 1
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Se partioacute del tubo T01 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de
liofilizacioacuten Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel
7 (asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml agua destilada esteacuteril (T03)
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
Partiendo del tubo T03 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se
extrajeron aliacutecuotas de cien (100) microl veintisiete (27) veces depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar En cada criovial se adicionaron novecientos (900) microl de lioprotector en tres
crioviales por cada concentracioacuten de lioprotector de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2)
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior del criovial fuera lo maacutes
exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T03 se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacioacuten
27
Donde el volumen inicial y la concentracioacuten inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado en tanto que el volumen final y la concentracioacuten final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T03
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (aliacutecuota maacutes protector) se
agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacioacuten
Posteriormente a los crioviales se les retiraron las tapas plaacutesticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney PM-996) esterilizado realizando seis (6) perforaciones conceacutentricas en la superficie
con aguja hipodeacutermica 21G x 1frac12rdquo Los crioviales fueron congelados en nitroacutegeno liacutequido por
15min aproximadamente depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD Thermo
Scientific) de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45degC usando el colector muacuteltiple (manifold)
Terminado el proceso se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la caacutemara
de flujo laminar para evitar contaminacioacuten de las muestras alliacute se les retiroacute el Parafilm se les tapoacute
con tapas esteacuteriles y se les rotuloacute
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten
Lioprotector Concentracioacuten
(pv)
Serie
A B C
Glucosa
10 1 1 1
117 1 1 1
27 1 1 1
Sacarosa
4 1 1 1
10 1 1 1
15 1 1 1
Leche
descremada
10 1 1 1
15 1 1 1
20 1 1 1
Total crioviales seguacuten Ndeg 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje)
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten utilizando una etiqueta o
roacutetulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacioacuten
Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de datos el
Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten
bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo)
nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3) con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo
bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas
tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada vial
Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional
a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
Posterior al proceso de rotulado los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano a temperatura ambiente y protegido de la luz
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS
CC en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado riesgo
poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entrantildear un riesgo grave para el personal de
laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado
riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro Existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o
indirectamente Normalmente no existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005)
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio
(paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications
biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
29
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2
Se realizoacute una prueba de estabilidad natural en teacuterminos del aspecto fiacutesico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un periacuteodo prolongado de tiempo (Grauer et al 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente Por ello la rehidratacioacuten de los crioviales se realizoacute en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4)
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales
Primera rehidratacioacuten Segunda rehidratacioacuten Tercera rehidratacioacuten
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota Intervalos de tiempo medidos en diacuteas contados desde el diacutea de almacenaje en los cuales se rehidratoacute
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie ver Tabla 2) El aspecto fiacutesico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacioacuten y comparado con su estado antes del almacenaje
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC tomando
el tiempo de reconstitucioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel
2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten El indicador de viabilidad se evaluoacute solo con el meacutetodo de conteo de
microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la maacutes alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa se eligioacute el
lioprotector y la concentracioacuten de eacuteste que permitioacute obtener un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables
posliofilizacioacuten y que ofrecioacute ademaacutes una menor variacioacuten durante la prueba para la liofilizacioacuten
definitiva de las cepas en estudio Dicho lioprotector se establecioacute ademaacutes como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados del Banco
Geneacutetico del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
43 FASE INTERMEDIA 2
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores con el aacutenimo de
generar un protocolo funcional aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partioacute de cultivos puros sobre medios soacutelidos se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacioacuten liofilizacioacuten y posliofilizacioacuten para la
liofilizacioacuten definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados
431 Liofilizacioacuten definitiva
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracioacuten oacuteptima para cada cepa
de estudio se realizoacute la liofilizacioacuten definitiva
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general Posteriormente se agitoacute con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Esto se realizoacute para cada
cepa
30
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
El tubo T04 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten
definitiva se extrajeron cuatro (4) aliacutecuotas de un (1) ml previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass 62113D-2)
posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por
7s para su homogenizacioacuten
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas a una presioacuten
inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
El proceso de destape parcial y congelacioacuten se realizoacute en caacutemara de flujo laminar para evitar
al maacuteximo la contaminacioacuten El transporte de los viales desde la caacutemara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitroacutegeno liacutequido
para evitar contaminacioacuten y descongelacioacuten
4313 Posliofilizacioacuten
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten Dos viales
designados como trabajo (T) y stock (S) fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4degC plusmn 1degC
4314 Rehidratacioacuten
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacioacuten de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio soacutelido
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos
Se llevoacute un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el aacutenimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacioacuten Al identificarlas se decidioacute repetir la
liofilizacioacuten definitiva con los nuevos paraacutemetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio
4321 Propiedades fiacutesicas generales
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento) color textura brillo aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales teniendo como punto de comparacioacuten la formulacioacuten
luego de congelada Esto se realizoacute para
- Crioviales de la fase intermedia 1
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 431)
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 433)
4322 Contaminacioacuten
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad en
buacutesqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio
31
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten
Se midioacute el tiempo de reconstitucioacuten de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y el tiempo de los crioviales que conteniacutean el lioprotector general fue comparado
con el tiempo de reconstitucioacuten de los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada
433 Pruebas adicionales
Para estas pruebas solo se usoacute la formulacioacuten del lioprotector general y la cepa CM-CR010
por su alta tasa de crecimiento respecto a las demaacutes cepas evaluadas
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticoacute G 1987) se
tomaron los pesos con balanza analiacutetica (AND GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos El cuarto vial y criovial se abrieron solo una vez luego
fueron sellados completamente tomando sus pesos de la misma forma ya descrita
Para determinar si existe un tiempo maacuteximo admisible de cerrado se midioacute el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcioacuten del tiempo utilizando la ecuacioacuten
descrita por Garciacutea C (2007)
Wt () es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4332 Prueba de estabilidad acelerada
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa uno fue rehidratado a los cero (0) diacuteas y el otro
luego de siete (7) diacuteas en el interior de la caacutemara de envejecimiento ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5 Adicionalmente se dataron sus propiedades fiacutesicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada
Ndeg vial t ndash Tdeg - HR
1 0 - ambiente - 25
2 7 - 37degC - 100
Nota Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos t= Tiempo en diacuteas
Tdeg=Temperatura HR=Humedad relativa La prueba de estabilidad se realizoacute en una caacutemara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC luego
incubados a 25 degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente
se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten midiendo viabilidad con el meacutetodo
de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
32
434 Control de esterilidad
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121degC y 210Kpa por 20 minutos las puntas de micropipetas los viales
crioviales y sus respectivas tapas fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y
temperatura en un tiempo de 15 minutos Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas) fueron esterilizados en horno Binder a 160degC por 120 minutos
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo desde la
preparacioacuten de medios hasta el sellado de los viales como se describe a continuacioacuten
4341 Medios
Se realizoacute control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid England) (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Se determinoacute como indicador de contaminacioacuten
cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios
soacutelidos
4342 Ambiente
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realizoacute con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas El periodo de exposicioacuten fue de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en
incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo
b) Cabina de flujo laminar
Se realizoacute el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este
caso la caja de control de ambiente se dejoacute abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeriacutean el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4
horas Este control se llevoacute a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolloacute en el interior de la cabina de flujo laminar
se procuroacute mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y
tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70 al iniciar el trabajo con cada cepa
44 FASE FINAL
441 Base de datos
Se realizoacute una revisioacuten a la base de datos del Banco de cepas creado por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) en el programa Access modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccioacuten para la informacioacuten de los organismos liofilizados
33
442 Fichas de resumen
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccioacuten tanto del Freezer
como del banco de liofilizados utilizando el programa Word 2013
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se realizoacute una revisioacuten de la informacioacuten en los roacutetulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos con el aacutenimo de verificar si se habiacutean cumplido los protocolos y la
logiacutestica establecida por Martiacutenez amp Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias
444 Formatos de control del banco de liofilizados
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013 para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) en la seccioacuten
de criopreservacioacuten
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados
Coacutedigo Tipo de registro Ubicacioacuten Uso
FLf-01 Registro de entrada de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccioacuten
FLf-02 Proceso de
liofilizacioacuten
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacioacuten a
una cepa
FLf-03 Registro de control de
calidad
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccioacuten y antes de liofilizar
una cepa para la coleccioacuten
FLf-04 Solicitud salida de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados
Fuente Adaptado de Martiacutenez Beniacutetez H L amp Mayorga Burgos L P (2013) Implementacioacuten de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (Tesis de
pregrado) (paacuteg 44) Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas Bogotaacute Colombia
445 Manual de procedimientos
Se realizoacute una revisioacuten de la cartilla de procedimientos elaborada por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) Se tomoacute la decisioacuten de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013
34
5 RESULTADOS
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN
A raiacutez de la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en cada criovial por cepa
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno En cuanto a CM-CR005 se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer pero no fue posible recuperarla por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009 la sexta mejor respecto al criterio de eleccioacuten de cepas
Con los datos del proceso precriopreservacioacuten de las cepas de intereacutes correspondientes a la
coleccioacuten de colorantes consignados en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) en conjunto con
los datos de viables poscongelacioacuten del presente trabajo se calculoacute la BSR para cada cepa (Tabla
7) Se encontroacute que los porcentajes de BSR son superiores al 70 luego de dos (2) antildeos de estar
en criopreservacioacuten (Figura 8) salvo CM-CR005
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martiacutenez amp Mayorga (2013) (soacutelo se compararon los datos de la cepa CM-CR010 ya que las demaacutes
cepas no figuran en su trabajo) se encontroacute un porcentaje inferior de recuperacioacuten
poscriopreservacioacuten por parte de las autoras por lo cual se revisoacute la metodologiacutea encontrando un
error metodoloacutegico al calcular la BSR en su trabajo Usando los datos de ldquoresultados prueba de
viabilidad poscongelacioacuten tabla 19rdquo (en Martiacutenez amp Mayorga 2013 paacuteg 54) se corrigioacute la BSR
para esta cepa evidenciando ser la cepa maacutes resistente al proceso de criopreservacioacuten entre las
evaluadas con alrededor de 66 de caiacuteda luego de dos antildeos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8)
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten)
Nota Se muestran los resultados al evaluar la conservacioacuten de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por
el meacutetodo de criopreservacioacuten luego de dos (2) antildeos La BSR que Martiacutenez amp Mayorga (2013) presentan
corresponde a un valor poscriopreservacioacuten luego de dos meses de evaluacioacuten Nrd= No registra datos
Cepa Ceacutelulas
totales
Viables precongelacioacuten
(UFCml) de Martiacutenez
amp Mayorga (2013)
viables pos
congelacioacuten
(UFCml)
BSR
real
BSR de Martiacutenez
amp Mayorga
(2013)
BSR
corregido
CM-CR004 12x1012 61 x109 13 x107 725 Nrd Nrd
CM-CR005 11 x1010 11 x1010 0 00 Nrd Nrd
CM-CR006 14x1010 75 x109 27 x107 752 Nrd Nrd
CM-CR007 13x1011 41 x109 31 x108 883 Nrd Nrd
CM-CR009 19 x1010 44 x109 23 x107 763 Nrd Nrd
CM-CR010 17 x1010 46 x109 72 x108 916 673 982
35
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelacioacuten CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperacioacuten (nuacutemero de
ceacutelulas viables)
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO
En las Tablas 8 9 10 11 y 12 se describen las principales caracteriacutesticas macroscoacutepicas
utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfoloacutegica de las cepas utilizadas No fue
posible realizar la comparacioacuten con los datos de Rodriacuteguez (2013) a nivel macroscoacutepico dado que
los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquiacute utilizados sin embargo si se
compararon las caracteriacutesticas microscoacutepicas las cuales fueron coincidentes aunque estas no eran
del todo claras (descripcioacuten inexacta de forma y tamantildeo y sin un registro fotograacutefico comparable)
por lo cual se decidioacute que las caracteriacutesticas macroscoacutepicas observadas desde la primera siembra
posterior a la descongelacioacuten de los crioviales fuesen las de mayor importancia para evaluar la
estabilidad morfoloacutegica y la pureza Estas se mantuvieron sin cambio o variacioacuten a lo largo del
trabajo
Las microfotografiacuteas tomadas a cada cepa usando la coloracioacuten de Gram al igual que las
fotografiacuteas de las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron anexadas a la base de datos del Banco
Geneacutetico
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 725 00 752 883 763 916
Sup
ervi
ven
cia
36
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR004
Descripcioacuten
Borde o Margen
Ondulado Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de
crecimiento
Frente a luz Brillante
Elevacioacuten Umbonada
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Color Beige maacutes intenso en el centro y maacutes clara hacia los extremos en
colonias de 48h o maacutes extremos color blanco hueso
Forma Circular a maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo desarrollar forma
irregular
Grado de
Transparencia Opaca (No transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Ropa huacutemeda
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR006
Descripcioacuten
Borde o Margen Semiondulado A maacutes de 72h es altamente digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas y con medio huacutemedo se irregulariza
Luego de una semana totalmente digitado
Elevacioacuten Plana con bordes elevados (en craacuteter) Colonias de maacutes de 72h
presentan una ligera elevacioacuten en el centro
Color Amarillo
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Escamosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca (NO transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis Si color amarillo
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
37
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR007
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio muy huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular A maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo es irregular
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 48h y distantes unas de otras (pocas
colonias) umbonadas
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Semitransparente en zona externa
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Mentol
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR009
Descripcioacuten
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas se irregulariza
Elevacioacuten En meseta y ligero hundimiento central (craacuteter) En colonias con maacutes
de 72h ligera elevacioacuten del craacuteter
Color Beige Conforme envejece la colonia toma una coloracioacuten blancuzca
de tonalidad cafeacute en el centro
Tamantildeo Pequentildea (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
38
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR010
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio huacutemedo es suavemente ondulado en medio muy
huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular Despueacutes de 48h se irregulariza En medio muy huacutemedo es
estrellado (sin importar edad de la colonia)
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 72h centro marcado y ligeramente
elevado (forma de huevo frito)
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia
Opaca Semitransparente en la zona externa de colonias de maacutes de
48h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Sin olor
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general
Las Figuras 9 10 11 12 y 13 representan los resultados de la evaluacioacuten de la eficacia del
meacutetodo de conservacioacuten realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1 por medio
del indicador de viabilidad
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 6 x108 Se observa que
la leche descremada 15 como mejor protector y leche descremada 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A - - - 5987 - 5301 5958 6812 -
BSR en serie B - - - 3619 3076 4557 5100 5039 3619
BSR en serie C 3076 3619 - 3619 3076 3418 3418 5873 4723
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR004
39
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 73 x108 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 125 x1010 Se observa
a sacarosa 10 como mejor protector y a glucosa 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 4173 4962 5850 6119 6415 5731 5430 4173 4513
BSR en serie B 3046 - - 4173 4743 5051 4773 - -
BSR en serie C - - - 3046 5147 4622 - - -
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR006
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 9149 8664 6549 9712 9677 8735 9026 9166 8648
BSR en serie B 8472 - 6181 - 8474 - 8413 8052 8086
BSR en serie C 8557 7472 6193 - 9272 - 8604 8202 8414
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR007
40
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 115 x109 Se observa
a Sacarosa 15 como mejor protector y la leche descremada 10 como segundo mejor protector
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 65 x109 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 5494 4609 4609 6641 6401 6987 5585 5440 5186
BSR en serie B 4415 - - 6373 6083 6212 4941 4083 -
BSR en serie C - - - - - 7519 4083 - 4083
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR009
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 8205 - 6303 9521 8634 8207 8153 8022 8332
BSR en serie B 6424 - - 7911 8312 8096 7752 6907 7995
BSR en serie C 6697 - - - 8230 7998 7919 8113 7539
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Sup
erviv
enci
a
BSR en CM-CR010
41
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15
CM-CR006 Sacarosa 10
CM-CR007 Sacarosa 10
CM-CR009 Sacarosa 15
CM-CR010 Sacarosa 10
Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural
ofreciera la maacutes alta BSR en la mayoriacutea de cepas (Tabla 13) se determinoacute la sacarosa al 10
como el mejor lioprotector y se designoacute como lioprotector general para las bacterias del banco de
liofilizados Sin embargo se decidioacute para la liofilizacioacuten definitiva utilizar el lioprotector que
mejores resultados confirioacute a cada una de las cinco cepas de estudio
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado
Dado que el principal indicador de evaluacioacuten de la prueba de estabilidad natural en esta
etapa era la viabilidad en cada liofilizado no se tuvo en cuenta los cambios morfoloacutegicos
presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa pero si fueron tenidos en cuenta
para los ajustes teacutecnicos de la liofilizacioacuten en la fase 3
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilizacioacuten definitiva
con su homoacutelogo de la etapa 2 (es decir los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo) se encontraron diferencias significativas de aumento o disminucioacuten de hasta el 22
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad seguacuten el punto de partida de la formulacioacuten
(medio liquido SMPG vs medio soacutelido SPC) como lo muestra la Figura 14
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilizacioacuten
definitiva por cepa bacteriana Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas seguacuten el intervalo
temporal de la Serie A en tanto que CM-CR007 CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron seguacuten la Serie
B (ver Tabla 4)
- 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Punto
s p
orc
entu
ales
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
L Etapa 2 6812 6415 8474 6212 8312
L definitiva 7330 7629 7757 8461 7234
BSR comparativa
42
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN
551 Propiedades fiacutesicas generales
Se dataron las propiedades fiacutesicas de los liofilizados en la fase intermedia 1 asiacute como los
liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 431 (liofilizacioacuten definitiva) y 4332 (viales
usados para la prueba de estabilidad acelerada) en las Tablas 15 y 16 respectivamente la tabla de
convenciones (Tabla 14) permite comprender los siacutembolos de las anteriores tablas
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilizacioacuten y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilizacioacuten
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transicioacuten conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto fiacutesicamente aceptable Sin embargo pese a que a las propiedades fiacutesicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1 con los cuales se realizoacute la evaluacioacuten de la liofilizacioacuten
y la prueba de estabilidad natural no eran los maacutes adecuados se decidioacute proseguir con ellos
apoyado por los resultados de Vemulapalli Bhonsle amp Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratacioacuten (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperacioacuten de microorganismos ademaacutes el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores
Tabla 14 Tabla de convenciones Siacutembolo Significado Siacutembolo Significado
SBE Si en buen estado A Algunos
SME Si en mal estado T Todos
NBE No en buen estado N Ninguno
NME No en mal estado NS No significativo (lt20)
+ Afirmativo S Significativo (201-309)
- Negativo MS Muy significativo (gt40)
NA No aplica I indeterminado
FS Al finalizar el secado AR Antes de reconstituir
Nota Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15 Aunque no tenga estructura de torta el liofilizado
es estable y funcional por ende utilizable No tiene estructura de torta y ademaacutes no es ni estable ni
funcional por ende no es utilizable
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1
Cepa Viales Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto de
torta
Fractura de
vial 1 2 3
CM
-CR
00
4
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I S Traslucido I + NBEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N S Cafeacute claro Porosa - SMEA -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR NS N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
43
CM
-CR
00
6
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR S S MS Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N NS NS Cafeacute claro Porosa - SBEA -
sm2sc AR S S S Cafeacute oscuro Porosa - SMET -
CM
-CR
00
7
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
s1 NA I I I Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR S I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS I S Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
CM
-CR
00
9
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I NS Traslucido I + NBE -
g2sc AR MS S S Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS S I Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sb AR N N NS Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sc AR N S NS Cafeacute oscuro Porosa - NMEA -
CM
-CR
01
0
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I S S Traslucido I + NMEA -
g2sc AR I MS MS Traslucido I + NMEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
44
Nota Datos de las propiedades fiacutesicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad
natural salvo por el encogimiento que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa) los
demaacutes caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual Se subrayan las
anomaliacuteas encontradas a lo largo de la prueba
g Liofilizados con glucosa como protector
s Liofilizados con sacarosa como protector
sm Liofilizados con leche descremada como protector 1 Formulacioacuten congelada 2 Liofilizados almacenados a temperatura ambiente sa Serie A (antes de rehidratar) sb Serie B (antes de rehidratar) sc Serie C (antes de rehidratar)
1 Concentracioacuten uno del lioprotector
2 Concentracioacuten dos del lioprotector
3 Concentracioacuten tres del lioprotector
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la prueba de
estabilidad acelerada
Nota Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquiacute mencionados corresponden solo a aquellos
que contienen sacarosa al 10 (lioprotector general) Se consignan aquiacute los datos generales de los
liofilizados indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas
a Liofilizados de la prueba de estabilidad natural
b Liofilizados de la liofilizacioacuten definitiva
c Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada 1 Formulacioacuten congelada 2 Viales almacenados a temperatura ambiente 3 Vial usado en la caacutemara de envejecimiento
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto
de torta
Fractura
de vial Viales
a1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
a2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
b1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
b2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
c1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
c2 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR NS Blanco Porosa - SBE -
c3 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR S Blanco Porosa - SME -
45
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes De izquierda a derecha
liofilizados de prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva prueba de estabilidad acelerada
552 Contaminacioacuten
Se encontroacute contaminacioacuten durante la rehidratacioacuten de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006 en tanto que las siembras preliofilizacioacuten no presentaban contaminacioacuten alguna por ello
se tomaron tres viales maacutes que iban a ser rehidratados en la serie B encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilizacioacuten de esta cepa
Las demaacutes cepas no presentaron contaminacioacuten en ninguna prueba realizada
553 Tiempo de redisolucioacuten
Al medir el tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten en cada una de las rehidrataciones se
observoacute que la glucosa tardoacute maacutes tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros
lioprotectores llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Voacutertex en los viales
maacutes concentrados para su total redisolucioacuten Ademaacutes se encontroacute en todos los lioprotectores que
conforme la concentracioacuten aumentaba maacutes tiempo se necesitaba para la reconstitucioacuten de la
formulacioacuten es decir que el tiempo es directamente proporcional a la concentracioacuten de
lioprotector
Al comparar el tiempo de reconstitucioacuten de los viales que conteniacutean el lioprotector general
en la prueba de estabilidad natural con los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales de la
prueba de estabilidad acelerada no se encontraron diferencias significativas sin embargo el vial
de la prueba de estabilidad acelerada que duroacute siete (7) diacuteas en caacutemara de envejecimiento se
reconstituyoacute un segundo menos aproximadamente respecto a los otros viales
46
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado
Lioprotector Tiempo (min)
Glucosa 10 1
Glucosa 117 15
Glucosa 27 120
Sacarosa 4 05
Sacarosa 10 05
Sacarosa 15 06
Leche descremada 10 025
Leche descremada 15 033
Leche descremada 20 05
Estabilidad natural 05
Liofilizacioacuten definitiva 025
Estabilidad acelerada 004
Nota El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada
uno liofilizados con el lioprotector general
56 PRUEBAS ADICIONALES
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica
En la Figura 16 se observa un aumento draacutestico del peso de los viales dentro de la ventana
de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados
al vaciacuteo) Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vaciacuteo) no tuvieron un aumento en
peso tan draacutestico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante Al cabo de cincuenta
(50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente No se encontroacute
por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vaciacuteo
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector La ecuacioacuten presentada pertenece a la liacutenea de tendencia logariacutetmica
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinacioacuten Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba
0 10 20 30 40 50 60
vial (518055g) 0 00724 00772 00782 00840 00869 00849
Criovial (19018g) 0 00079 00158 00315 00473 00578 00605
Promedio 0 00401 00465 00549 00656 00724 00727
y = 00365ln(x) + 00058
Rsup2 = 09647
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
01
AU
MEN
TO D
E P
ESO
(W
)
47
562 Prueba de estabilidad acelerada
Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFCml antes de la liofilizacioacuten al
rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 8398 sin embargo al rehidratar el vial 2 luego de su
estadiacutea en la caacutemara de envejecimiento la BSR fue de 0 Las propiedades fiacutesicas generales de
estos viales son presentadas en la Tabla 15
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN
571 Base de datos
Se eliminoacute una tabla sobrante (constituiacutea informacioacuten redundante de las cepas) dentro de la
base de datos correspondiente a la seccioacuten de criopreservacioacuten Adicionalmente se reorganizoacute la
base de datos al introducir la seccioacuten de liofilizacioacuten y la de refrigeracioacuten Este uacuteltimo meacutetodo de
preservacioacuten fue mencionado en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) pero no fue anexado
sin embargo aunque se incluyoacute la seccioacuten en el banco de cepas debe mencionarse que no existen
registros de las cepas que se hallan conservado por este meacutetodo aun asiacute se decidioacute dejar la seccioacuten
para que lo ocupen trabajos posteriores Ademaacutes se encontroacute que en el Freezer existiacutean colecciones
que no figuran en la base de datos no existen registros de ninguacuten tipo ni caracterizacioacuten alguna en
medios digitales La base de datos quedoacute organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5
Figura 17 Organigrama de la base de datos
572 Fichas de resumen
Las fichas de acceso inmediato designadas como ldquofichas de resumenrdquo para cada coleccioacuten
fueron ubicadas seguacuten el sitio de almacenamiento tanto para las cepas criopreservadas como para
las liofilizadas y refrigeradas Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas las fichas
resumen de este meacutetodo fueron dejadas en blanco para futuras colecciones El formato de las fichas
resumen se presenta en el anexo 6
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se encontroacute que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulacioacuten que
permite la faacutecil confusioacuten entre colecciones criopreservadas sin embargo se decidioacute dejar las
etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martiacutenez amp Mayorga (2013) entre
otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener
que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondriacutea una confusioacuten entre nuevas
y viejas colecciones Este problema fue solucionado con la reorganizacioacuten de la base de datos y las
fichas de resumen
Base de datos del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Informacioacuten de los
microorganismos de
cada coleccioacuten
Meacutetodo de conservacioacuten de cepas
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten
Liofilizacioacuten
48
574 Formatos de control del banco de liofilizados
Se decidioacute que los formatos de control para la seccioacuten de liofilizacioacuten del Banco Geneacutetico
fueran similares tanto para la criopreservacioacuten como para la liofilizacioacuten obedeciendo sus
diferencias a las caracteriacutesticas y datos propios de cada meacutetodo Se encontroacute que los formatos de
la seccioacuten criopreservacioacuten no habiacutean sido llenados nunca desde su creacioacuten Estos se muestran en
el anexo 7
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten
Se editoacute la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martiacutenez amp
Mayorga (2013) Partiendo de esta cartilla se elaboroacute un manual maacutes completo (anexo 8)
introduciendo todos los procedimientos para la liofilizacioacuten las diferentes teacutecnicas empleadas en
los procesos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se complementoacute tambieacuten la seccioacuten sobre el
proceso de refrigeracioacuten y se reescribieron algunos conceptos erroacuteneos de la edicioacuten anterior No
se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservacioacuten pero si
se realizaron pequentildeos ajustes de forma o de edicioacuten
49
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
La recuperacioacuten de microrganismos por criopreservacioacuten se realizoacute de acuerdo a los
lineamientos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) durante todas sus etapas sin embargo
la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la
criopreservacioacuten de la cepa o inclusive en la etapa de descongelacioacuten Garciacutea y Uruburuacute (citados
por Aacutengel A 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y
estabilidad de los organismos conservados edad celular velocidad de congelacioacuten y
descongelacioacuten temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores Dado que las cepas
CM-CR004 006 007 010 e incluso la 009 (que remplazoacute a CM-CR005) presentaron muy buenos
niveles de recuperacioacuten (Figura 8) el factor maacutes probable de falla corresponde al crioprotector
utilizado ya que en el caso del Banco Geneacutetico el crioprotector es general para toda la coleccioacuten
de bacterias y la eleccioacuten del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A
2006) puesto que la efectividad de la criopreservacioacuten se puede ver afectada por las caracteriacutesticas
propias de cada cepa (Hubaacutelek 2003) las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector
Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la
viabilidad los organismos conservados por este meacutetodo sobreviven largos periacuteodos por la
reduccioacuten marcada de su ritmo metaboacutelico incluso por maacutes de 30 antildeos (Gonzaacuteles et al 2006) lo
cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector
como elemento de falla en la conservacioacuten de la cepa perdida
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una uacutenica
liacutenea celular por tanto las caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificacioacuten preliminar Sin embargo estos mismos autores
sentildealan que estas caracteriacutesticas no son uacutenicas ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares como sucedioacute con CM-CR007 y 010 por ello fue preciso observar las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas microscoacutepicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquiacutemicas) de las cepas pero dada la simplicidad de las descripciones microscoacutepicas de
Rodriacuteguez (2013) no se tuvo como principal referencia de identidad Aunque la morfologiacutea de la
colonia depende considerablemente de la composicioacuten del medio de cultivo y las condiciones de
incubacioacuten cuando eacutestas son controladas suelen ser invariables teniendo por lo general un valor
diferencial considerable (Diacuteaz 2009) por lo tanto se tomaron estas caracteriacutesticas como las
principales para la evaluacioacuten de los indicadores de estabilidad morfoloacutegica y pureza
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que ldquolos medios soacutelidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamientordquo (paacuteg 2) Sin embargo se observaron
algunas variaciones las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio Esto se
observoacute maacutes en las cepas CM-CR007 y 010 que al revisar los datos de Martiacutenez amp Mayorga (2013)
y Rodriacuteguez (2013) estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio huacutemedo
tendiacutean a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican Loacutepez T amp Torres (2006)
en bacterias moacuteviles en tanto que sin niveles altos de humedad las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en funcioacuten del tiempo (envejecimiento de la colonia) Esto derivoacute en la
observacioacuten y descripcioacuten de caracteriacutesticas macroscoacutepicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad como son descritas en las Tablas 8 9 10 11 y 12 para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) diacuteas que duroacute la prueba de estabilidad
natural se observoacute que en general de los tres lioprotectores los resultados maacutes bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones Esto tiene su explicacioacuten en las propiedades reductoras
que poseen los monosacaacuteridos ya que como lo menciona Cox C S (citado por Hensel 1994) los
efectos letales de la desecacioacuten se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteiacutenas
de la membrana celular y azuacutecares reductores que aumentan conforme avanza la deshidratacioacuten
(glicacioacuten) si las proteiacutenas de membrana integrales o citosoacutelicas se ven dantildeadas de forma
irreversible durante el secado tendriacutea un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al 1995)
impidiendo la reconstitucioacuten de forma adecuada de las bacterias y por ende generando muerte
celular Sin embargo las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta especialmente en la concentracioacuten maacutes baja incluso para CM-CR007 la glucosa al 10 se
erige como el segundo mejor protector Es probable que estas dos cepas presenten una
configuracioacuten diferente de sus proteiacutenas de membrana que impida la reaccioacuten amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra que proteja a las proteiacutenas de membrana o
citosoacutelicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteiacutenas)
Es conocido que en general los disacaacuteridos mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan Herman White amp Vesey
2006) esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13
A diferencia de la glucosa la sacarosa es un azuacutecar no reductor estos pueden proteger las
ceacutelulas al competir por la unioacuten en la membrana con los azucares reductores (Hensel 1994) Se ha
demostrado que la sacarosa mantiene las proteiacutenas secas igual que en sus conformaciones
hidratadas Leslie et al (1995) indican que este fenoacutemeno sucede probablemente ldquomediante la
unioacuten a los dominios hidroacutefilos de las proteiacutenas y la prevencioacuten de enlaces de hidroacutegeno inter e
intra proteiacutenas durante el secado y la reconstitucioacutenrdquo (paacuteg 3596) lo cual contribuye a las altas tasas
de supervivencia al usar este lioprotector
Para que un protector funcione eacuteste debe proteger la bicapa lipiacutedica y para ello debe existir
dentro y fuera de las ceacutelulas (Leslie et al 1995 Palmfeldt et al 2003) el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transicioacuten de
membrana ya que en eacutesta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentracioacuten (Leslie et al 1995) reemplazando el agua intracelular lo cual se conoce como la
hipoacutetesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al 2003) Si esto se cumple la concentracioacuten
intracelular seraacute alta y el tiempo antes de la congelacioacuten y el secado debe ser corto por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequentildeo (Leslie et al 1995) y los productos polares
extracelulares seraacuten miacutenimos
Ademaacutes tanto la glucosa y la sacarosa estaacuten dentro de la categoriacutea de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo este estado viacutetreo ldquoInduce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una ceacutelula para detener la movilidad
molecular a un miacutenimo El vidrio amorfo inerte tambieacuten es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las ceacutelulas dentro de la estructura de vidrio antes de la congelacioacuten lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquiacutemicos irreversibles en la
membrana plasmaacutetica durante el almacenamientordquo (Morgan et al 2006 paacuteg 186)
51
La retencioacuten de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilizacioacuten
como en la criopreservacioacuten
Cabe mencionar que el proceso de deshidratacioacuten y de reemplazo de agua intracelular por
parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un liacutemite ya que como lo
menciona Heckly (citado por Perry 1995) al congelarse el agua del medio las ceacutelulas sufren
deshidratacioacuten reduciendo el punto de congelacioacuten en el interior y evitando la formacioacuten de
cristales de hielo pero al seguir bajando la temperatura las concentraciones de solutos aumentan
Perry (1995) cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelacioacuten estaacuten posiblemente
asociados a estas soluciones excesivamente concentradas puesto que no se han encontrado
evidencias de lesiones mecaacutenicas por hielo extracelular Esto corresponderiacutea con los resultados
obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores como lo fue la glucosa al 27 en casi
todas las cepas (exceptuando CM-CR006 Figura 10) recordando que un protector funciona mejor
en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmoacutetico con el interior de las bacterias (conocer
la concentracioacuten intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilizacioacuten
por parte de eacuteste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo como se muestra en el
trabajo de Palmfeldt et al (2003)
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta un ejemplo claro es la cepa CM-CR004 la cual de hecho ante los
gluacutecidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentoacute resultados aceptables Morgan et al
(2006) mencionan (teniendo como referencia la investigacioacuten de Buitink et al) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteiacutenas presentes en esta sustancia son
maacutes estables y juegan un importante papel en la formacioacuten del estado viacutetreo lo cual induce a pensar
que una oacuteptima mezcla de proteiacutenas y azucares permite una proteccioacuten maacutes eficiente Esta
posibilidad corresponderiacutea a los resultados obtenidos donde la concentracioacuten de los componentes
de la leche descremada seriacutean propicios para la cepa CM-CR004 en tanto que para las demaacutes cepas
seriacutean maacutes bajas o maacutes altas de lo propicio Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de gluacutecidos y proteiacutenas que la componen pero no
establece cuales son estos pudiendo ser positivos o negativos para la liofilizacioacuten
En general los cultivos liacutequidos ofrecen un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables (Ops
Diagnostics 2015) sin embargo la viabilidad depende muacuteltiples factores incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos El medio SMPG estaacute disentildeado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse raacutepidamente la fuente de carbono (glucosa) una bacteria
de raacutepido crecimiento entraraacute en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio una
de lento crecimiento al cabo del mismo tiempo estaraacute en fase log no obstante en el medio SPC
los nutrientes tardan maacutes tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas todas las bacterias
estaraacuten en fase log Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de raacutepido crecimiento mientras que
CM-CR004 006 y 009 son de crecimiento un poco maacutes lento (datos obtenidos del conteo con
caacutemara de Neubauer no incluidos en el presente estudio)
Morgan et al 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisioloacutegicos
en las bacterias relacionado generalmente con la privacioacuten de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles desencadenando una respuesta ante el estreacutes para permitir la
supervivencia de la poblacioacuten celular Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecacioacuten y las temperaturas menos propicias para su crecimiento por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilizacioacuten Sin embargo la
fase de crecimiento oacuteptima para la supervivencia en la desecacioacuten es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al 2006 paacuteg 185) Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14 indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
liacutequido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log asiacute mismo las cepas CM-CR004 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria pudiendo ser mayor o menor
En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilizacioacuten definitiva se observoacute puffing
y pitting y si bien Vemulapalli et al (2015) indican que estos cambios no afectan la calidad del
producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada Jennings (2008) advierte que su
presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada y que esta puede
deberse a un sistema con composicioacuten diferente de la formulacioacuten principal y podriacutea conducir a
interacciones tales como la agregacioacuten de proteiacutenas ademaacutes se observoacute (Figura 15 izquierda y
centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulacioacuten inicial de glucosa y
sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16) ldquodebido a una accioacuten combinada de la fusioacuten
(maacutes o menos importante) y de la presioacuten reducida dando lugar al puffingrdquo (Ticoacute G 1987 paacuteg
70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings 2008) seguacuten la cantidad del
material afectado por el puffing Esta caracteriacutestica se asocia con un error en los paraacutemetros de
liofilizacioacuten por ello se revisoacute exhaustivamente el proceso de liofilizacioacuten encontrando que los
liofilizados alcanzaron la temperatura de fusioacuten durante el proceso de secado primario por la
inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador el cual no habiacutea sido descrito en el
proceso piloto de liofilizacioacuten con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del
control de calidad A causa de esto los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los
uacutenicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha)
Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura
a los -32 y -42 degC asiacute como un melting inicial a -32degC y -42degC respectivamente seguacuten lo reporta
Moreira Gutieacuterrez amp Delgado (1994) Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento
del liofilizador
Las Tablas 15 y 16 que resumen las caracteriacutesticas tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados muestran que el color textura brillo y fractura de viales estaacuten dentro de los
paraacutemetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilizacioacuten correcta
con las formulaciones utilizadas no obstante se detectaron variaciones posliofilizacioacuten
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales Inicialmente se pensoacute
en una falla durante el tiempo de almacenamiento dado que los liofilizados maacutes afectados fueron
de las series B y C sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada se determinoacute que la causa de fallo yaciacutea en la
obtencioacuten de humedad por parte del producto liofilizado La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vaciacuteo absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vaciacuteo estos habiacutean absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilizacioacuten esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscoacutepica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad maacutes bajo que la sacarosa) debido a la
53
ldquofacilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidroacutegeno con el aguardquo (Badui
Dergal 2006 paacuteg 73) ldquoPara reducir el nuacutemero de moleacuteculas de agua el proceso de liofilizacioacuten y
el sellado de los viales al vaciacuteo debe haber sido exitoso y asiacute obtener un producto con el contenido
de humedad deseadordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 78) por lo cual se descarta la utilizacioacuten del
instrumento manifold para la liofilizacioacuten cepas en el Banco Geneacutetico
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilizacioacuten siempre deben ser
de vidrio ya que el vapor de agua atmosfeacuterico se puede difundir a traveacutes de los tubos de plaacutestico y
por ende las muestras secas terminariacutean absorbiendo agua Esto se comproboacute con la utilizacioacuten de
crioviales que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vaciacuteo sino que ademaacutes en
la serie C casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dantildeados presentaban
cambios de coloracioacuten (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloracioacuten
oscura como lo muestra la Tabla 15) o una marcada reduccioacuten en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentracioacuten) Esto tambieacuten se ve correlacionado con la peacuterdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008) la
humedad es la principal responsable en la peacuterdida de viabilidad en el producto liofilizado
reduciendo la vida uacutetil de los organismos La obtencioacuten de agua implica un retroceso del proceso
de liofilizacioacuten el dantildeo de la matriz formada el flujo de los residuos extracelulares polares es
decir la reactivacioacuten del organismo ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquiacutemica el metabolismo (Adams 2007) finalmente la muerte celular al agotarse esta
El tiempo de redisolucioacuten y el tipo de reconstituyente tambieacuten es de gran importancia La
Tabla 17 muestra tiempos de redisolucioacuten bastante altos para las formulaciones de glucosa Con
los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisioacuten del proceso de liofilizacioacuten se determinoacute la
retrofusioacuten producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de
redisolucioacuten causando un efecto grave donde la interaccioacuten entre las moleacuteculas es tal que la matriz
del liofilizado es casi insoluble (Jennings 2008) El aumento de la temperatura demasiado raacutepido
en el proceso de la liofilizacioacuten o por encima de Tg resultoacute en el colapso haciendo la
reconstitucioacuten mucho maacutes difiacutecil (Fetterolf 2010) Jennings (2008) indica que un aumento en el
aacuterea superficial por unidad de volumen de la torta tenderaacute a disminuir el tiempo de reconstitucioacuten
lo cual sucedioacute para todos los liofilizados que presentaron melting puffing y pitting ya que su
volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulacioacuten congelada solo los
liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulacioacuten
congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitucioacuten
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed amp Roos (2004) quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo se sugiere en muacuteltiples estudios
ademaacutes el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4degC plusmn 1degC en la
oscuridad (Ops Diagnostics 2015)
Se siguioacute los procedimientos de documentacioacuten establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
para la criopreservacioacuten y la elaboracioacuten de los nuevos protocolos de liofilizacioacuten encontrando
como lo menciona Gonzaacuteles et al (2006) que es necesario contar con sistemas de documentacioacuten
eficiente ademaacutes contar con duplicados de la informacioacuten en medios fiacutesicos y magneacuteticos evitado
la perdida de informacioacuten (Montes de Oca et al 2008) y el raacutepido acceso a la misma
54
7 CONCLUSIONES
En general el estado de criopreservacioacuten de las cepas evaluadas es oacuteptimo obteniendo tasas
de supervivencia satisfactorias Sin embargo el criopreservante no funciona de igual forma para
todas las cepas debido a las caracteriacutesticas propias de cada organismo que limitan la accioacuten del
glicerol
De acuerdo a la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten realizada con los tres indicadores
(viabilidad pureza y estabilidad morfoloacutegica) la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados siendo la concentracioacuten al 10pv la maacutes oacuteptima No obstante su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado hermeacuteticamente y al vaciacuteo El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada aunque no se determinoacute la concentracioacuten maacutes oacuteptima
En cuanto a la glucosa al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo se observa
que pese a no ser un buen lioprotector concentraciones de glucosa entre el 6 y el 10 pv son
funcionales aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50
No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten estos
fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminacioacuten de las muestras y a su
vez evitar la contaminacioacuten por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso
Se creoacute el protocolo para el proceso de liofilizacioacuten en todas sus etapas Este es
metodoloacutegicamente funcional y faacutecilmente reproducible por ello se estandariza para el Banco
Geneacutetico seccioacuten liofilizacioacuten dentro del nuevo manual de procedimientos de conservacioacuten Se
incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservacioacuten dentro de este
manual ajustado a las necesidades especiacuteficas de seguridad de la liofilizacioacuten
Es importante mantener actualizado los diferentes medios fiacutesicos y magneacuteticos donde reposa
la informacioacuten de las colecciones y los microorganismos en ellos dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Geneacutetico y la informacioacuten se puede perder
La falta de la identificacioacuten hasta cepa (al menos hasta geacutenero) de los microorganismos
presentes en el banco geneacutetico limita la informacioacuten para entender los fenoacutemenos relacionados a
los procesos de conservacioacuten y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo
55
8 RECOMENDACIONES
Existen paraacutemetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente como la edad del cultivo la
concentracioacuten celular entre otros Se propone el estudio de los paraacutemetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilizacioacuten con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos por ello se sugiere la creacioacuten
de un modelo matemaacutetico para que sea funcional esta prueba lo cual generariacutea datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo
Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinacioacuten de lioprotectores con formadores
de matrices y estabilizantes siguiendo los protocolos establecidos Mezclas de sacarosa al 10 pv
con leche descremada 10 pv (de la misma marca usada en este estudio) sacarosa al 10 pv con
leche descremada 10 pv y carboacuten activado asiacute como la utilizacioacuten de estas mezclas con trehalosa
en distintas concentraciones son sugeridas
Es necesaria la creacioacuten de una plataforma online del banco geneacutetico una vez este cuente con la
identificacioacuten de los organismos contenidos asiacute mismo es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco geneacutetico distinto a Access preferiblemente que obedezca a una
creacioacuten propia de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Es necesaria la creacioacuten de una pasantiacutea anual para curaduriacutea del Banco Geneacutetico ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepcioacuten de cepas Ademaacutes se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas como aquellas que sean donadas al Banco Geneacutetico en el futuro
56
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62
11 ANEXOS
Anexo 1 Formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-XX00Xa
Descripcioacuten Fotografiacutea
Borde o Margen
Frente a luz Brillanteopaca
Forma
Elevacioacuten
Color
Tamantildeo
Superficie
Consistencia
Grado de
Transparencia
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis
Pigmentos que desprende la colonia
y se observan sobre el medio
Olor
Hemolisis
MedioT(degC)
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen
un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace
la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad
del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos
Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen
Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta
Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
63
Anexo 2 Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados
a) Recubrimiento (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido cartoacuten y autoadhesivo de
emulsioacuten acuosa
b) Bandeja de liofilizados
c) Soporte para bandeja
d) Cojiacuten de siacutelice gel (reemplazo seguacuten el tamantildeo y cantidad de cojines de 2 meses a 1 antildeo)
El banco de liofilizados estaacute dividido en tres secciones
La seccioacuten de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A B y C respectivamente
La seccioacuten de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D E y F respectivamente
La seccioacuten de hongos (color cafeacute) correspondiente a las bandejas G H e I respectivamente
64
Bandeja de liofilizados
Estaacute hecha de poliestireno expandido viene con 100 compartimientos individuales para un maacuteximo
de 100 viales por bandeja
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
10 20
30 40
50 60
70
80
90 100
01
11 21
31
41
51
61 71
81
91
65
Anexo 3 Esquema general del cepario madre de liofilizados
J Hongos
K Bacterias
L Algas
F Fila
Nuacutemeros compartimento correspondiente a cada vial La numeracioacuten va en zigzag
J K L
F1 F1 F1 F2 F2 F2 F3 F3 F3
1
8 8 8
9 9 9 1 1
16 16 16 24 24 24
17 17 17
66
Anexo 4 Caacutemara de envejecimiento artesanal
Esta caacutemara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y
humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra La humedad relativa
puede controlarse seguacuten si se use agua (100) o una concentracioacuten determinada de solucioacuten salina
ver Colmenares R (2015)
Horno de 37degC (caacutemara externa)
Caacutemara
interna
Termoacutemetro
Tapa de sello
hermeacutetico
Malla de
soporte
Viales
Agua o sn salina
67
Anexo 5 Base de datos en Access
Esquema general de la Base de datos del Banco Geneacutetico
Espacio de trabajo con las tablas
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
informacioacuten
maacutes detallada)
68
Anexo 6 Formato de las Fichas Resumen
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FICHA RESUMEN DE LA COLECCIOacuteN
Ubicacioacuten de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Fuente de obtencioacuten
de las cepas
Fecha de
ingreso
Cantidad de cepas Tipo de organismos
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa)
Ubicacioacuten de cepas (seguacuten todos los meacutetodos
de conservacioacuten utilizados para la coleccioacuten)
Autores o donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos y Formatos de control
69
Anexo 7 Formatos de control de la seccioacuten liofilizacioacuten
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
Lugar (Ciudad y Paiacutes) Fecha de ingreso
Origen de
la cepa
Institucioacuten Organizacioacuten o
Empresa donante
Persona que realizoacute el
aislamiento
Cargo Fecha de
aislamiento
Informacioacuten de contacto
Fuente de obtencioacuten
de la cepa
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Identificacioacuten geneacutetica
de la cepa
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Calidad de la
cepa recibida
Restriccioacuten de
distribucioacuten
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Observaciones Nivel de
Bioseguridad
N1 N2 N3 N4
Persona donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
70
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL
FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN
CM-_ _0_ _
Proceso
Fecha Hora
Ciudad Equipo
Lioprotector y
concentracioacuten
Temperatura (degC)
Presioacuten (mbar)
Duracioacuten (min) Accesorio de
secado
Responsable (s) del proceso
Ubicacioacuten
Coacutedigo de la
cepa
Nombre de
la coleccioacuten
Viales
almacenados
Tipo S T Lf Total Sello al vaciacuteo SI NO
Cantidad Sello de Aluminio SI NO
Pruebas de
Viabilidad
Caracterizacioacuten
macroscoacutepica (resumen)
Caracterizacioacuten
microscoacutepica (resumen)
Concentracioacuten celular
(UCF)
Preliofilizacioacuten
Posliofilizacioacuten
Bioquiacutemicas
Otras
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
71
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS
CEPAS
CM-_ _0_ _
Detalles del
Proceso
Fecha Ciudad
Hora Coacutedigo de cepa
Viales a evaluar T S Lf Temperatura (degC)
Viales en mal estado T S Lf Presioacuten (Mbar)
Fecha de liofilizacioacuten Fecha de evaluacioacuten Total tiempo (meses)
Descripcioacuten
de la cepa
Geacutenero-especie del
microorganismo
Nombre de la
Coleccioacuten
Car
acte
riza
cioacuten
Microscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Microscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Observaciones
Viabilidad Concentracioacuten Celular
(UFC) Preliofilizacioacuten
Concentracioacuten Celular
(UFC) Posliofilizacioacuten
Observaciones
Control
de
Calidad
Bioquiacutemicas
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Pruebas
Cristal
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Otras Pruebas Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Observaciones
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
72
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD
DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS
CM-_ _0_ _
Lugar (Ciudad Paiacutes) Fecha
Informacioacuten
del
solicitante
Institucioacuten Organizacioacuten
o Empresa
Solicitante Cargo
Teleacutefono (s) Email
Descripcioacuten
de la cepa
Coacutedigo de
cepa
Geacutenero ndash especie
Microorganismo
Coleccioacuten
Utilizacioacuten de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
73
Anexo 8 Manual de procedimientos de conservacioacuten para el Banco Geneacutetico del Laboratorio
de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (Ver archivo adjunto)
Manual de procedimientos de
conservacioacuten para el Banco
Geneacutetico del Laboratorio de
Microbiologiacutea Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute
de Caldas
Primera Edicioacuten
Editado por
Andreacutes V Castantildeeda R
Manual de procedimientos de conservacioacuten para el
Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Ingenieriacutea Sanitaria
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
Licenciado en Biologiacutea
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales
Niria Pastora Bonza Peacuterez
Docente encargado del Laboratorio de Microbiologiacutea y
coordinador de Ingenieriacutea Sanitaria
Miguel Aacutengel Piragauta Aguilar
Disentildeo y diagramacioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
avicent29gmailcom
Autoriacutea y Edicioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda R
2015
Todos los derechos reservados
TABLA DE CONTENIDO
TIacuteTULO PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
RECEPCIOacuteN DE CEPAS 2
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS 3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES 5
Medios 5
Reactivos 6
Protectores generales 6
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN 7
Indicador uno Viabilidad 7
Conteo directo con caacutemara de neubauer (110mm) 7
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa 10
Indicador dos Estabilidad morfoloacutegica 12
Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) 12
Tincioacuten de gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) 13
Indicador tres Pureza de la cepa 13
RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS 14
Criopreservados (descongelamiento) 14
Liofilizados (rehidratacioacuten o reconstitucioacuten) 14
REFRIGERACIOacuteN 15
CRIOPRESERVACIOacuteN 16
Precriopreservacioacuten 16
Preparacioacuten del inoculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 16
LIOFILIZACIOacuteN 17
Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano 17
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 17
IV
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Posliofilizacioacuten 18
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos 18
ROacuteTULOS 19
Refrigeracioacuten 19
Criopreservacioacuten 19
Liofilizacioacuten 20
TIacuteTULO 2 PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONSERVACIOacuteN Y EN EL LABORATORIO
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN 23
Medios 23
Ambiente 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores 23
Cabina de flujo laminar 23
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 24
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS 24
Desechos no contaminados (no infecciosos) 24
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en
autoclave y reutilizado 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado 25
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa 25
BIOSEGURIDAD 26
Proteccioacuten personal 26
Procedimientos 27
Aacutereas de trabajo 27
Capacitaciones 27
REFERENCIAS 28
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dilucioacuten en serie 7 Figura 2 Conteo directo 8 Figura 3 Conteo en bacterias 8 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky 10 Figura 5 Contador de colonias 11 Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados 19 Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer 19 Figura 8 Roacutetulos para los crioviales 19 Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso 4 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG 5 Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos 5 Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos 6 Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer 9 Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 21
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIacuteMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL
kPa Kilo pascales
min Minutos
s Segundos
microl microlitros
mm miliacutemetros
degC grados Celsius
pv porcentaje peso a volumen
mTorr militorricelli
mbar milibar
g gramos
ml mililitros
UCF Unidades formadoras de colonias
rpm Revoluciones por minuto
vv Porcentaje volumen a volumen
iexclPrecaucioacuten
iexclA tener en cuenta
VI
INTRODUCCIOacuteN
Este manual representa en conjunto el trabajo a traveacutes del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigacioacuten han sentado los pilares para la formacioacuten del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC ) cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservacioacuten y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigacioacuten que permita a la comunidad acadeacutemica de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbioloacutegicos en las aacutereas de biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnoloacutegica para el paiacutes Aquiacute se presentan los tres meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos aplicados en este Banco Geneacutetico Refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten Se hace eacutenfasis en los diferentes procesos materiales equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Geneacutetico
Protocolos para la
conservacioacuten de
microorganismos
2
RECEPCIOacuteN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco geneacutetico debe contar con las siguientes condiciones miacutenimas de recepcioacuten
La cepa se debe encontrar en estado de pureza Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Geneacutetico
biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnologiacutea Debe contar con un responsable entidad o institucioacuten donante que respalde
la(s) cepa(s) entregadas ademaacutes de contar con la informacioacuten de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad
La cepa o coleccioacuten debe contar con toda la informacioacuten que el Banco
geneacutetico requiera para su mantenimiento conservacioacuten y registro en la base de datos
La cepa o coleccioacuten debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles
de Bioseguridad establecidos por la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) siendo el nivel de bioseguridad 2 el maacuteximo permitido por las instalaciones del laboratorio con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo
Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado
investigaciones entre otras) se debe pasar con 15 diacuteas de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS al docente encargado
Una vez recibida la cepa se diligencian los mismos registros en digital se
anexa la informacioacuten a la base de datos asignaacutendole un coacutedigo y se diligencian las fichas de resumen
3
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS El personal encargado del Banco Geneacutetico debe realizar una verificacioacuten de la
pureza de la cepa esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada sobre una o maacutes cajas de Petri con el medio de cultivo el tiempo y temperatura de incubacioacuten especificados por quien hace la donacioacuten Asiacute mismo a partir de este subcultivo se debe realizar la evaluacioacuten de la efica-cia del meacutetodo de conservacioacuten para verificar la informacioacuten dada por el investi-gador donante
Posterior al proceso de recepcioacuten de cepas es importante tener en cuenta
que se debe verificar la fecha de la uacuteltima siembra para determinar si es apro-piado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder despueacutes al proceso de criopreservacioacuten o liofilizacioacuten
Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las
cepas por maacutes de dos meses antes de la criopreservacioacuten o la liofilizacioacuten se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservaacutendola por el meacutetodo de refrigeracioacuten con el fin de evitar que la cepa se pierda
Si se requieren hacer pruebas bioquiacutemicas pruebas cristal u otras pruebas
complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos se tendraacute que pedir la autorizacioacuten del responsable del Banco Ge-neacutetico y del encargado del laboratorio debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposicioacuten de material en el laboratorio
Nota Si alguna cepa llegara a presentar contaminacioacuten se debe informar a la persona responsable del Banco Geneacutetico y posteriormente a la persona entidad o institucioacuten donante
4
EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservacioacuten
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso
Proceso o meacutetodo Equipo Material
Refrigeracioacuten Nevera Thermolab 14-E0107 Tubo de ensayo tapa rosca
Cabina de flujo laminar Asa redonda
Esterilizador de asas
Criopreservacioacuten
Cabina de flujo laminar Crioviales Voacutertex Puntas azules Micropipeta graduable de 100-1000 microl
Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la coleccioacuten
Frascos Schott con tapa para el glicerol
Pipeteador Pipeta de 1ml o 5ml
Liofilizacioacuten
Esterilizador de asas Asa redonda
Voacutertex Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Cabina de flujo laminar Puntas azules y amarillas Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile
Recipiente de poliestireno expandido cerrado
Crimper Sello de aluminio Micropipetas graduables de 100-1000microl y 20-200microl
Pinzas Vial 5mm con tapoacuten de divisioacuten
Evaluacioacuten del
meacutetodo de
conservacioacuten
Caacutemara de Neubauer 110mm Laminilla de cuarzo
Caacutemara AxioCam ICc5 Laminas porta objetos
Microscopio Axio Scope A1 Laminillas cubre objetos
Contador de colonias CC-1 Marcador
Estereoscopio Zeiss Asa redonda
Incubadora de 25degy 37degC Asa de Drigalsky
Micropipeta graduable 100-1000microl 20-200microl y 5-20microl
Puntas azules amarillas y blancas
Voacutertex Goteros
Recuperacioacuten de
los
microorganismos
Micropipeta graduable 100-1000microl y 20-200microl
Puntas azules y amarillas
Tubos de ensayo
Cabina de flujo laminar Cajas de Petri con medio
Plancha de calentamiento Mechero
Demaacutes equipos y materiales utilizados en la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten
Beaker
Termoacutemetro
Cajas de Petri con medio
Tubos de ensayo
-Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiologiacutea
5
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Geneacutetico cuenta con medios reactivos y protectores generales definidos para los meacutetodos de preservacioacuten manutencioacuten y recuperacioacuten de microrganismos Estos se describen a continuacioacuten y se clasifican de acuerdo al meacutetodo de conservacioacuten en la Tabla 4
Medios CALDO SMPG Este medio es empleado para el crecimiento del inoacuteculo inicial y
en la formulacioacuten de la criopreservacioacuten Su composicioacuten se muestra en las Tablas 2 y 3 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG
Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos
SPC (Standard Plate Count) Este medio se utiliza para la teacutecnica de evaluacioacuten
de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Tambieacuten puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas
Agar nutritivo (AN) o medios especiacuteficos Utilizados como medio de
mantenimiento o para pruebas bioquiacutemicas yo fisicoquiacutemicas (si se realizan) en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Buffer agua peptonada Este medio se utiliza en la rehidratacioacuten y en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 76
Microelementos 076
Peptona 1
Glucosa 01
MACROELEMENTOS Cantidad MICROELEMENTOS Cantidad
MgSO4 2 g CuSO4- 5H2O 005 g
NaNO3 2 g H3BO3 01 g
KCl 015 g MnSO4 ndash H2O 01 g
CaCl2 21 g ZnSO4 ndash 7H2O 01 g
Na2HPO4 09 g Agua destilada 1000 ml
FeSO47H2O 001 g
Agua destilada 1000 ml
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Reactivos Tincioacuten Gram La bateriacutea de reactivos para la Tincioacuten de Gram se utiliza en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Alcohol acetona Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo Agua destilada Se utiliza en todos los procedimientos para la preparacioacuten de
medios la descongelacioacuten y especialmente en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Alcohol Para desinfeccioacuten en todos los procedimientos (70) o para mecheros (95)
Aceite de inmersioacuten Se utiliza para la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten durante las observaciones microscoacutepicas
Nitroacutegeno Liacutequido Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilizacioacuten
Protectores generales Crioprotector Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservacioacuten en
proporcioacuten 67vv respecto al criovial Lioprotector Se utiliza una solucioacuten de Sacarosa 10 pv para las
formulaciones en la liofilizacioacuten bacteriana En hongos se utiliza leche descremada al 12 pv No se tiene detalles de lioprotector oacuteptimo en algas
Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos
Nota Dado que en la refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se realiza la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten se incluyen aquiacute los reactivos implicados en dicha evaluacioacuten
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten Liofilizacioacuten R
eacti
vos
Tincioacuten Gram SI SI SI
Alcohol acetona SI SI SI
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de inmersioacuten
SI SI SI
Nitroacutegeno Liacutequido NO NO SI
Me
dio
s
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios especiacuteficos
OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
Agua peptonada SI SI SI
Pro
tecto
r
Glicerol anhidro NO SI NO
Sacarosa 10pv
NO
NO SI
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EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN
Indicador uno Viabilidad Conteo directo con caacutemara de Neubauer (110mm)
Se parte de un tubo de dilucioacuten (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto el cual tiene por lo general un tiempo de incubacioacuten de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo Figura 1 Dilucioacuten en serie Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser esteacuteriles usando una nueva en cada transferencia El diluyente es agua peptonada al 01 pv
Tome la caacutemara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia
Observe las dos cuadriculas de la caacutemara que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H)
Agite el tubo de dilucioacuten seleccionado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s tomando con una micropipeta una aliacutecuota de 10microl y depositaacutendola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla dejando que se cargue por capilaridad de forma homogeacutenea (Figura 2-A) Posteriormente lleve al microscopio enfocando desde el menor aumento hasta eacutel objetivo 40x al tiempo que ajusta la intensidad lumiacutenica para poder observar las liacuteneas de la caacutemara y las ceacutelulas al tiempo
-Algunos modelos de Voacutertex no poseen un rango de velocidad sino de niveles -Para limpiar la caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo lave primero con agua destilada luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada Deje secar al ambiente -Para una correcta observacioacuten al microscopio utilice el meacutetodo de enfoque de Koumlhler -Procure no limpiar la laminilla con ninguacuten papel o pantildeo lo puede rayar -Este procedimiento debe durar maacuteximo 10min ya que la solucioacuten podriacutea secarse debido a la luz del microscopio
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Figura 2 Conteo directo A Utilizacioacuten de la caacutemara de Neubauer 1 posicioacuten de la laminilla 2 posicioacuten de la punta para el deposito de la muestra B esquema general de la caacutemara de Neubauer Adaptado de Bastidas (2015) httpwwwceleromicscomesresourcesdocsArticlesFormula-Camara-Neubauer-Concentracionpdf amp Universitat de Barcelona (2015) httpwwwubeduLabFisioimagesstoriesFisAnimalBiologiaSangrecontadorTomapng
El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central Las foacutermulas y los cuadros a contar se determinan seguacuten el tamantildeo del microorganismo
Hongos y microalgas Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes
(cuadros 1 y cuadro central Figura 2-B) de izquierda a derecha Bacterias Cuente en el cuadro central que contiene 25 cuadros secundarios
(Figura 2-B) 5 de ellos (Figura 3-A o B) Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios en estos las ceacutelulas deben contarse en la direccioacuten que se indica en la Figura 3-C Los cuadros terciarios contienen tres liacuteneas en los extremos por ello se deben tener en cuenta las ceacutelulas que esteacuten desde la liacutenea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D
Figura 3 Conteo en bacterias A y B Forma de contar los cuadros terciarios C Direccioacuten de conteo en los cuadros terciarios D Ceacutelulas a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios
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Es importante resaltar que las bacterias que esteacuten unidas se contaraacuten como una Una vez obtenido el nuacutemero total de ceacutelulas se realizaran los caacutelculos correspondientes a los cuadros utilizados Para obtener el nuacutemero de bacterias se utiliza la ecuacioacuten planteada a partir de Bastidas (2015) Ndeg de bacteriasml=
En el caso de hongos y microalgas se utiliza la siguiente ecuacioacuten a partir de Bastidas (2015) Ndeg de ceacutelulasml= Fd Factor de dilucioacuten = Nota El meacutetodo de conteo en caacutemara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de ceacutelulas en los procedimientos de conservacioacuten de microorganismos Pero si se requiere la utilizacioacuten de otro meacutetodo se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados
Consideremos el siguiente ejemplo Tenemos un tubo con cultivo en medio liacutequido (10ml) de 36 horas este seraacute
nuestra muestra inicial Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con aliacutecuotas de 1ml en 9ml de diluyente Se realiza el procedimiento descrito en las paacuteginas anteriores haciendo un solo conteo Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de aliacutecuota g o ml de aliacutecuota + g o ml de diluyente
Ndeg Total de ceacutelulas contadas times 10000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
-El conteo directo con caacutemara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al meacutetodo de conservacioacuten evaluado
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
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Aplicando la ecuacioacuten para bacterias anteriormente mostrada tenemos que
Ndeg de bacteriasml=
= 81012 bacteriasml
81012 bacteriasml seraacute la cantidad de bacterias que ldquoexistenrdquo en la muestra inicial Esta en teacuterminos matemaacuteticos de las diluciones equivale a 100
Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas contando en los
cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuacioacuten tenemos que Ndeg de ceacutelulasml= = 321011 ceacutelulasml
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Seleccione tres tubos de la dilucioacuten seriada y de cada uno vierta aliacutecuotas de 100microl (agitando con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) antes de cada extraccioacuten) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio Raacutepidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky esteacuteril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky A La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atraacutes B Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro luego girar 90deg la caja y repetir el proceso
A B
90deg
16 times 250000
10-7 times 5
-Si se quieren datos maacutes fiables se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma aliacutecuota o poner en la caacutemara cinco aliacutecuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras -Al realizar el conteo en la caacutemara de Neubauer obtenemos el total aproximado de ceacutelulas presentes en la dilucioacuten utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado yo las impurezas que pueda contener la muestra por lo cual no es 100 exacto y no indica las ceacutelulas viables
16 times 10000 10-7 times 5
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Deje secar por miacutenimo 15min y lleve a incubacioacuten en posicioacuten invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja) Seguacuten el tipo de organismo las condiciones de incubacioacuten para la lectura de las cajas son
Bacterias temperatura ambiente 37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento
si se conoce Incubacioacuten de 18-24 horas Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas Casos extremos de crecimiento lento una semana
Hongos temperatura inferior a 25degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten de una siembra de solucioacuten de conidios de 4-8 diacuteas
Algas temperatura entre 25-37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten por maacuteximo 7 diacuteas en organismos descongelados o rehidratados
Luego de la incubacioacuten las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura
5) Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFCml)
Figura 5 Contador de colonias La caja de Petri se coloca en posicioacuten invertida y se marcan las colinas el contador cuenta al tacto
-La siembra por tubo se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador -Generalmente se toman las diluciones 10-5 10-6 y 10-7 Sin embargo si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3 10-4 y 10-5 -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70 flamear esperar a que el alcohol se consuma Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar por uacuteltimo palpe raacutepida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender para enfriar totalmente -Puede usarse una siembra en profundidad u otro meacutetodo para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie Sin embargo los demaacutes meacutetodos de conteo limitan la evaluacioacuten del indicador dos -Si al cabo de 30min las cajas no han secado el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condicioacuten -Con la punta de la micropipeta no toque el medio -Siempre use guantes y desinfeacutectelos constantemente durante los procedimientos
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En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250 al suponer que cada ceacutelula forma una colonia Para el caacutelculo de UFCml utilizamos una adaptacioacuten de la foacutermula de Valencia Z(2004)
UFCml = times times
Ejemplo 120 X 107 X 10 = 121010 UFCml
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten se calcula a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010) Tasa de supervivencia (BSR )=
Donde DD Despueacutes de la desecacioacuten AD Antes de la desecacioacuten
Indicador dos Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realiza Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas)
Diligenciar el formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas (anexo 1) descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de ldquoconteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Hay que tener en cuenta que
- Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas) de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas deben ser observadas en al menos el 80 de las colonias de la placa seleccionada
Ndeg de colonias (promedio entre las cajas por dilucioacuten)
Inverso del factor de dilucioacuten
Inverso del volumen de aliacutecuota
-La metodologiacutea y los criterios de eleccioacuten de cajas asiacute como el rango son seguidas de Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo todas las placas por dilucioacuten por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -El inverso del volumen de aliacutecuota corresponde a una medida de correccioacuten obligatoria para la siembra en superficie ya que en la praacutectica se aumenta en 110 el factor de dilucioacuten al sembrar 01ml (100microl) del tubo de dilucioacuten seleccionado
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100 Log (Ndeg UFCml AD)
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Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se realice una ldquocoloracioacuten de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005 paacuteg 24) En el caso de hongos realice una coloracioacuten simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado
Por uacuteltimo comparar los resultados con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y
macroscoacutepicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se toma registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio con caacutemara
Indicador tres Pureza de la cepa
Este indicador evaluacutea la pureza de un vialcriovial rehidratadodescongelado ademaacutes permite determinar si existe un cambio geneacutetico durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservacioacuten Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimaacutetica usando una bateriacutea de pruebas bioquiacutemicas o fisicoquiacutemicas diferenciales dependiendo de los requerimientos especiacuteficos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio Se recomienda realizar cada prueba por triplicado Tambieacuten puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales
-Realice una coloracioacuten de Gram estaacutendar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotograacutefico en un lapso no mayor a dos diacuteas -En los hongos es imprescindible el registro fotograacutefico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonoacutemica -El formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas exige un registro fotograacutefico pero alliacute solo se consignan si las fotografiacuteas son de alta calidad de lo contrario solo se dejan en la base de datos como referencia -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos -La estabilidad morfoloacutegica se evaluacutea pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -Para comparar las caracteriacutesticas macroscoacutepicas con la informacioacuten de origen se deben usar los mismos medios El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos
Si se confirma variacioacuten en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen y estas confirman la variacioacuten geneacutetica de la cepa inmediatamente se saca de la coleccioacuten origen se asigna un nuevo coacutedigo de identificacioacuten y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa Puede incluirse en la coleccioacuten Praacutecticas Acadeacutemicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva coleccioacuten
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RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento) Se toma un criovial (Semistock preferiblemente) sometieacutendolo a una
temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente 5min (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Los crioviales se introducen en bantildeo seroloacutegico una vez se llega a la temperatura deseada no antes
Del criovial se toma 1ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex
nivel 7 (asymp2240rpm) por 10s diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
La evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten se realiza al criovial luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubacioacuten (viables poscriopreservacioacuten) Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Geneacutetico
Liofilizados (Rehidratacioacuten o reconstitucioacuten)
Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC los viales a usar tomando el tiempo de rehidratacioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitando con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se toma un 1ml de este vial partiendo de esta aliacutecuota se realiza evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en medio soacutelido El indicador de viabilidad se evaluacutea solo con el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa u otro meacutetodo de conteo de organismos viables
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-dor donante sugiera otros meacutetodos de recuperacioacuten -La solucioacuten de rehidratacioacuten puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solucioacuten lioprotectora de la formulacioacuten -En el momento en que solo quede un criovialvial disponible de la cepa se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservacioacuten a partir de este
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REFRIGERACIOacuteN
Se implementa el meacutetodo de resiembra continua en este el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-Garciacutea et al 2010) cuando es utilizado para su almacenado nuevamente Se debe tener en cuenta los siguientes paraacutemetros
a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las
caracteriacutesticas del microorganismo ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios despueacutes de diacuteas semanas o meses Tambieacuten depende del tipo de medio de mantenimiento
b) El riesgo de contaminacioacuten y de cambios geneacuteticos se incrementa a mayor nuacutemero de transferencias
De acuerdo a esto para el laboratorio se determina
a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo
tapa rosca con Agar inclinado b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo procurando no
realizar maacutes de 4 transferencias c) La temperatura de refrigeracioacuten debe mantenerse en un rango de 4plusmn2degC d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminacioacuten
cruzada teniendo en cuenta la organizacioacuten interna del refrigerador evitando el amontonamiento de las cajas
e) Se utilizaraacute el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
f) Las cepas preservadas por este procedimiento seraacuten utilizadas para requerimientos internos del laboratorio preferiblemente en praacutecticas acadeacutemicas
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CRIOPRESERVACIOacuteN
Precriopreservacioacuten En el interior de la cabina de flujo laminar tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina Posteriormente son llenados con 1200microl de glicerol esteacuteril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados
Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de criopreservacioacuten (Martiacutenez amp Mayorga 2013) se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae una aliacutecuota de 1ml diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02)
Despueacutes agitar el tubo T02 con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s tomando
luego cinco aliacutecuotas de 600microl depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Se rotulan los crioviales y se realiza Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten Inmediatamente despueacutes de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente seguacuten la coleccioacuten a una temperatura de -85degC plusmn 1degC
Por uacuteltimo se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIOacuteN
culminado el proceso
-No use micropipeta para pipetear el glicerol -Todo el material debe ser correctamente esterilizado -Nunca tocar las tapas en el interior -De ser posible se recomienda una concentracioacuten de 10⁸ - 109 celml -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar 20min desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas (si se han determinado celml totales precongelamiento) -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables aumentando el nuacutemero de viables poscongelacioacuten Esto se puede hacer si no se tiene un nuacutemero determinado de ceacutelulas a una temperatura de 4degC plusmn 1degC por 20-30min -Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y poscriopreservacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas
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LIOFILIZACIOacuteN Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano Desde medio soacutelido
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio soacutelido se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general Posteriormente se debe agitar con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Desde medio liacutequido
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra diluyeacutendolo en un tubo con 9ml agua destilada esteacuteril (designado como T04)
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten Desde medio soacutelido
Del tubo T03 como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten y previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 1ml que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Desde medio liacutequido
Del tubo T04 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 100microl depositados en cuatro viales de vidrio En cada vial se adiciona 900microl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapoacuten de divisioacuten
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior de cada vial
sea lo maacutes exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T04 se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparacioacuten
Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado en
tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T04
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Con un volumen total de 1ml cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Los viales (indistintamente si se parte de medio soacutelido o liacutequido) se destapan parcialmente y se congelan en nitroacutegeno liacutequido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ge15min para ser llevados al liofilizador de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
Posliofilizacioacuten Luego del desmonte y sellado al vaciacuteo de los viales cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper posterior al proceso de liofilizacioacuten Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente El tercer vial (Lf) se almacena a 4degC plusmn 1degC en el cepario madre de liofilizados El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 diacuteas realizando evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten para saber si fue o no exitosa la liofilizacioacuten Por uacuteltimo se debe llenar el registro FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN culminado el proceso
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos En cuanto a los hongos el inoacuteculo inicial durante la preliofilizacioacuten se prepara
llenando con 10ml de agua destilada esteacuteril un cultivo soacutelido altamente esporulado del hongo Luego con un asa o espaacutetula esteacuteril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar Esta suspensioacuten es extraiacuteda con una pipeta esteacuteril y depositada en un tubo de ensayo al cual se le agrega 100microl de solucioacuten Tween 80 al 01 esteacuteril para preparar la solucioacuten de esporas Se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 20s y se prosigue de acuerdo a la ejecucioacuten de la liofilizacioacuten desde de un medio liacutequido
-Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y posliofilizacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas -Se debe realizar Voacutertex cada vez que se vaya a extraer una aliacutecuota -Los mejores resultados en la liofilizacioacuten se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas y en caldo SMPG un rango de 24-48h -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir maacutes tiempo del estipulado para su total congelamiento tener este dato de ser posible -El tiempo de liofilizacioacuten variacutea seguacuten la formulacioacuten Para una formulacioacuten con Sacarosa 10 36 horas es lo ideal -Debe usarse el accesorio para liofilizacioacuten Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vaciacuteo y de forma hermeacutetica -Los tapones de divisioacuten deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimacioacuten del agua de lo contrario no seraacute posible la liofilizacioacuten y pueden incluso quebrarse
-Si el raspado contiene rastros grandes de agar se debe realizar un filtrado con gasa esteacuteril aunque esto disminuiraacute el nuacutemero de esporas -Las esporas en solucioacuten pierden viabilidad conforme avanza el tiempo Se sugiere hacer uso de la solucioacuten antes de dos horas de preparada
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ROacuteTULOS
Refrigeracioacuten Dado que la refrigeracioacuten constituye un meacutetodo de corto plazo no se
requieren roacutetulos especiales para este meacutetodo de conservacioacuten Sin embargo es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente informacioacuten con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha
Criopreservacioacuten
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los roacutetulos de coleccioacuten usados en las cajas del Freezer y los roacutetulos para cada cepa criopreservada
Fecha de ingreso__________________________ Medio___________________________________ Cepa____________________________________ Coacutedigo__________________________________
-Es opcional imprimir este roacutetulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta
Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer
Figura 8 Roacutetulos para los crioviales
Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados
20
Liofilizacioacuten
Los roacutetulos de la Figura 9 contienen la siguiente informacioacuten Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de
datos el Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo) nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten
de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6) con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada
vial Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
-Los roacutetulos de las cajas del Freezer los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo -Los roacutetulos deben colocarse antes de su almacenamiento especialmente los crioviales ya que una vez congelados el adhesivo no funciona
21
Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio (paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
CC en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual moderado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro Existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o indirectamente Normalmente no existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005)
-En la base de datos del Banco Geneacutetico se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos pero el formato y tamantildeo de letra sea igual para todos los roacutetulos -Las etiquetas de liofilizacioacuten y criopreservacioacuten deben imprimirse en papel adhesivo -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos
22
Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservacioacuten y en
el laboratorio
23
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121degC y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro meacutetodo de esterilizacioacuten las puntas de micropipetas los viales crioviales y sus respectivas tapas deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas) pueden ser esterilizados en horno a 160degC por 120min
Sin embargo se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de
todo el trabajo desde la preparacioacuten de medios hasta el sellado de viales y crioviales como se describe a continuacioacuten
Medios Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Son indicadores de contaminacioacuten cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios soacutelidos
Ambiente Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto) evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas El periodo de exposicioacuten va de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo Se recomienda que con un nuacutemero superior de cinco colonias en el control se desinfecte el aacuterea de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminacioacuten Cabina de flujo laminar
Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4 horas Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar
24
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70 al inico durante y al final del trabajo con cada cepa
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005) los residuos se pueden clasificar en cinco grupos La eliminacioacuten de residuos en el laboratorio de microbiologiacutea no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas por ello los desechos se dispondraacuten de la siguiente forma
Desechos no contaminados (no infecciosos) Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que
incluso pueden reutilizarse o reciclarse como el papel
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservacioacuten requiere
de material corto-punzante se cuenta con un guardiaacuten para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plaacutesticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestioacuten Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposicioacuten final de este material
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado
Las cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 20 minutos Posterior al proceso de autoclavado se deben someter a un proceso de desinfeccioacuten con hipoclorito al 15 durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jaboacuten neutro
Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas en todo caso deberaacuten tener el mismo proceso de desinfeccioacuten anteriormente mencionado
25
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado todos los desechos producidos en cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 15 minutos posterior a este proceso se descartaraacute el contenido de las cajas de Petri disponieacutendolos en bolsas rojas para residuos peligrosos Por otra parte los desechos liacutequidos deberaacuten ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa
No es directriz del laboratorio ni del Banco Geneacutetico la incineracioacuten de ninguacuten tipo de material o residuo peligroso solo de su disposicioacuten y almacenaje seguacuten lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos
26
BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2 es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos estos son
ldquoAgentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente La exposicioacuten en el laboratorio puede provocar una infeccioacuten grave pero existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces y el riesgo de propagacioacuten es limitadordquo (OMS 2005 paacuteg 1)
El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Geneacutetico Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005)
Proteccioacuten personal El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial
Se recomienda el uso de batas blancas manga larga y bien abotonada con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar ensuciar o para prevenir alguacuten accidente
Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas bufandas o gorras
Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupcioacuten
Se debe utilizar proteccioacuten ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos
Debe respetarse la prohibicioacuten de beber comer masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como boliacutegrafos ademaacutes de tocarse los ojos y nariz
27
Procedimientos Estaacute estrictamente prohibido pipetear con la boca se deben utilizar
pipeteadores mecaacutenicos Todos los cultivos stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un meacutetodo de descontaminacioacuten aprobado como por ejemplo mediante autoclave
Aacutereas de trabajo Las superficies de trabajo se descontaminan como miacutenimo una vez por diacutea
y luego de todo derrame de material contaminante
En las zonas de trabajo estaraacute prohibido comer beber fumar aplicar cosmeacuteticos manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en aacutereas de trabajo
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ninguacuten momento ropa u objetos personales
Capacitaciones Los encargados del Banco geneacutetico y del laboratorio deberaacuten estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma maacutes eficaz y asiacute reducir riesgos en el proceso
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado asiacute como de las maquinas y elementos del laboratorio
28
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REFERENCIAS
29
Anexos y formatos
30
31
32
BANCO DE LIOFILIZADOS
33
CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
34
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
FORMATO PARA CARACTERIacuteSTICAS MACROSCOacutePICAS DE LAS CEPAS
35
FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN
36
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN LIOFILIZACIOacuteN
37
38
39
40
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN CRIOPRESERVACIOacuteN
41
42
43
44
45
PRUEBAS DE VIABILIDAD A CINCO CEPAS BACTERIANAS CRIOPRESERVADAS
Y ESTUDIO PARA LA LIOFILIZACIOacuteN DE LAS MISMAS EVALUANDO TRES
COMPUESTOS PROTECTORES PERTENECIENTES AL BANCO GENEacuteTICO DEL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute
DE CALDAS
ANDRES VICENTE CASTANtildeEDA RANGEL
Proyecto de Trabajo de Grado para optar al tiacutetulo de Licenciado en Biologiacutea
Director
MSc MIGUEL Aacute PIRAGAUTA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIOacuteN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGIacuteA
BOGOTAacute DC
2015
DEDICATORIA
ldquoHay hombres que luchan un diacutea y son buenos Hay otros que luchan un antildeo y son mejores Hay
quienes luchan muchos antildeos y son muy buenos Pero hay los que luchan toda la vida esos son
los imprescindiblesrdquo
Bertolt Brech
Este trabajo va dedicado a todas aquellas personas cercanas a miacute que fueron un apoyo constante
durante estos antildeos en la universidad De igual forma esta dedicatoria concierne a aquellas personas
que hicieron difiacutecil mi camino porque demostrarles que si podiacutea cumplir mis objetivos pese a las
adversidades resultoacute ser una motivacioacuten auacuten maacutes fuerte para miacute
Una dedicatoria especial a mi familia y a mi prometida Adriana Calderoacuten una investigadora cuyas
ensentildeanzas y apoyo afectivo estaacuten muy relacionadas con la finalizacioacuten exitosa de este proyecto
AGRADECIMIENTOS
La realizacioacuten de este trabajo fue posible gracias a muacuteltiples personas que de forma directa o
indirecta intervinieron en su realizacioacuten
La Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas por haberme dado una formacioacuten integral como
Licenciado en Biologiacutea a traveacutes de sus docentes y sus espacios
A mi director el docente Miguel Aacute Piragauta MSc por confiar en miacute y en mi trabajo por abrirme
las puertas del laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos
Naturales por su asesoriacutea y direccioacuten
A los laboratoristas Oscar Romero y Aleyda Ariza por su guiacutea sus consejos durante el desarrollo
del trabajo y su apoyo frente a la realizacioacuten del mismo
A los estudiantes Cesar Romero y Diego Castantildeeda quienes aportaron valiosa informacioacuten y
experiencia durante mi estadiacutea en el laboratorio a traveacutes de su proyecto
A la docente Gloria Stella Acosta Pentildealoza MSc quien amablemente dio su apoyo como revisora
y evaluadora de este proyecto y me guio en las encrucijadas con las cuales los cientiacuteficos solemos
enfrascarnos
A Gineth Adriana Calderoacuten por su colaboracioacuten en distintas etapas de este trabajo
He mencionado a grosso modo solo a algunas personas pido por ello disculpas a aquellos que no
mencioneacute pues sus aportes tambieacuten fueron importantes para el eacutexito de este proyecto
CONTENIDO
RESUMEN 10
ABSTRACT 10
1 INTRODUCCIOacuteN 11
2 MARCO REFERENCIAL 13
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS 13
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS 14
221 Conservacioacuten a corto plazo 14
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten 14
223 Conservacioacuten a largo plazo 15
2231 Liofilizacioacuten 15
2232 Control de calidad de un producto liofilizado 20
2233 Equipamiento para liofilizar 21
3 OBJETIVOS 22
31 OBJETIVO GENERAL 22
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 22
4 METODOLOGIacuteA 23
41 FASE INICIAL 23
411 Acervo Microbiano 23
412 Eleccioacuten de los protectores 23
4121 Crioprotectores 23
4122 Lioprotectores 23
42 FASE INTERMEDIA 1 24
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten 24
4211 Viabilidad 24
4212 Estabilidad Morfoloacutegica 25
4213 Pureza 25
422 Recuperacioacuten de los microorganismos 25
423 Criopreservacioacuten 26
4231 Precriopreservacioacuten 26
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 26
424 Liofilizacioacuten Etapa 1 26
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 26
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 26
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje) 27
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2 29
43 FASE INTERMEDIA 2 29
431 Liofilizacioacuten definitiva 29
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 29
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 30
4313 Posliofilizacioacuten 30
4314 Rehidratacioacuten 30
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos 30
4321 Propiedades fiacutesicas generales 30
4322 Contaminacioacuten 30
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten 31
433 Pruebas adicionales 31
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica 31
4332 Prueba de estabilidad acelerada 31
434 Control de esterilidad 32
4341 Medios 32
4342 Ambiente 32
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 32
44 FASE FINAL 32
441 Base de datos 32
442 Fichas de resumen 33
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 33
444 Formatos de control del banco de liofilizados 33
445 Manual de procedimientos 33
5 RESULTADOS 34
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN 34
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE
ESTUDIO 35
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD
NATURAL 38
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general 38
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado 41
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA 41
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN 42
551 Propiedades fiacutesicas generales 42
552 Contaminacioacuten 45
553 Tiempo de redisolucioacuten 45
56 PRUEBAS ADICIONALES 46
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica 46
562 Prueba de estabilidad acelerada 47
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN 47
571 Base de datos 47
572 Fichas de resumen 47
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 47
574 Formatos de control del banco de liofilizados 48
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten 48
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS 49
7 CONCLUSIONES 54
8 RECOMENDACIONES 55
9 REFERENCIAS 56
10 BIBLIOGRAFIacuteA 60
11 ANEXOS 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten 16
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado 17
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua 18
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten 19
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes 21
Figura 6 Metodologiacutea 23
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 28
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelacioacuten 35
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 38
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilizacioacuten definitiva por cepa bacteriana 41
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes 45
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales 46
Figura 17 Organigrama de la base de datos 47
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas 24
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten 27
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 28
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales 29
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada 31
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados 33
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten) 34
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004 36
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006 36
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007 37
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009 37
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010 38
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad 41
Tabla 14 Tabla de convenciones 42
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1 42
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada 44
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado 46
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencioacuten de los microrganismos y dada su importancia se han
creado colecciones bioloacutegicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologiacutea Existe variedad de meacutetodos de preservacioacuten en este trabajo se determinoacute el estado
de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad estandarizando e
implementando ademaacutes el sistema de liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos
evaluaacutendolos frente a tres compuestos protectores Se realizoacute una evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten teniendo como base tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
encontrando que el sistema de criopreservacioacuten implementado en el laboratorio es oacuteptimo y el
glicerol al 67vv funciona para casi todas las cepas por largos periacuteodos de tiempo la sacarosa
10pv resultoacute ser el mejor lioprotector de los tres evaluados designaacutendolo como lioprotector
general para el laboratorio Se creoacute un manual de laboratorio para la conservacioacuten de cepas que
incluye los protocolos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten y de seguridad de los mismos Este
trabajo aporta al campo de la microbiologiacutea de la conservacioacuten y constituye un peldantildeo maacutes para
el registro del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes
PALABRAS CLAVE Criopreservacioacuten liofilizacioacuten lioprotectores conservacioacuten
microorganismos
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and given its importance have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology Exists variety of methods of preservation in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing standardizing and further
implementing the system freeze-drying taking as a starting point to them evaluating them against
three protective compounds An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators
viability morphological stability and purity was performed finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67 vv works for almost all strains for long
periods of time sucrose 10 wv lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory It was created a manual for conservation
laboratory strains including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions
KEYWORDS cryopreservation freeze-drying lyoprotectants conservation microorganisms
11
1 INTRODUCCIOacuteN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible pues como lo menciona
Hurtado (2009) la vida no es posible sin la actividad de estos ya que estaacuten involucrados en todas
las dinaacutemicas ambientales existentes en el planeta Sin embargo su importancia ha ido maacutes allaacute
desde que fueron descubiertos hace unos 300 antildeos por van Leeuwenhoek potencializaacutendose su
investigacioacuten y utilizacioacuten en distintos campos de la ciencia y la tecnologiacutea en los uacuteltimos 100
antildeos iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi amp Mayz 2003)
Debido a esto se han creado colecciones bioloacutegicas como meacutetodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho Las colecciones de cultivos microbianos estaacuten
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt y a nivel internacional por
la Federacioacuten Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) en donde existen actualmente
2acute520200 microorganismos en 711 colecciones de 71 paiacuteses registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM) Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM el CIAT (Rhizobium Collection America) de coacutedigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccioacuten de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de coacutedigo WDCM 857 (WFCC 2015)
No obstante varias universidades del paiacutes instituciones puacuteblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias bioloacutegicas poseen colecciones microbioloacutegicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN) en otros casos las colecciones estaacuten en proceso de registro o en formacioacuten como en la
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) entre otras
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer meacutetodos de conservacioacuten fiables
que entre otras cosas eviten al maacuteximo el riesgo de peacuterdida o de variabilidad geneacutetica de los
individuos Existe variedad de meacutetodos de conservacioacuten seguacuten sea el tiempo que estaraacuten en la
coleccioacuten o el tiempo en que tardaraacuten en ser usados dentro de ellos destacan la criopreservacioacuten y
la liofilizacioacuten meacutetodos utilizados para la coleccioacuten de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo
Martiacutenez amp Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Geneacutetico en el Laboratorio
de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC siglas de la coleccioacuten microbioloacutegica) utilizando
la refrigeracioacuten como meacutetodo primario implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
criopreservacioacuten
En este trabajo se pretendioacute determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos evaluaacutendolos frente a tres compuestos
protectores Para ello en primera estancia se recibioacute una capacitacioacuten sobre manejo y control de
microrganismos preparacioacuten de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados posteriormente se evaluoacute el estado de criopreservacioacuten de las cinco
cepas seleccionadas utilizando teacutecnicas de recuento en placa estaacutendar y se evaluoacute a tres
lioprotectores para la liofilizacioacuten de cepas microbianas del Banco Geneacutetico ademaacutes se realizaron
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacioacuten y se disentildearon los
protocolos para la implementacioacuten del sistema de liofilizacioacuten con las cinco cepas y el lioprotector
que presentoacute mejores resultados en este estudio
Para la realizacioacuten de estos fines el trabajo fue dividido en cuatro fases comenzando por los
criterios de eleccioacuten de los microrganismos y los lioprotectores seguido de la evaluacioacuten de los
meacutetodos de preservacioacuten utilizando tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
posteriormente una tercera fase de ajustes a la liofilizacioacuten para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo utilizando como indicadores las propiedades fiacutesicas generales la
posibilidad de contaminacioacuten en el proceso y el tiempo de redisolucioacuten finalmente una cuarta
fase que corresponde al proceso de documentacioacuten este incluye la revisioacuten y modificacioacuten de la
base de datos la elaboracioacuten de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados asiacute como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccioacuten y finalmente la
elaboracioacuten del manual de procedimientos Con lo anterior se encontroacute que el sistema de
criopreservacioacuten desarrollado por Martiacutenez amp Mayorga (2013) es eficiente y permite porcentajes
de recuperacioacuten bastante altos incluso superiores al 90 luego de dos antildeos sin embargo no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estaacuten expuestas por
este meacutetodo De otro lado se determinoacute la sacarosa al 10 como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caracteriacutesticas propias de cada organismo)
y se estandarizoacute el sistema de liofilizacioacuten
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacioacuten de un nuevo meacutetodo de
conservacioacuten de microorganismos para el Banco Geneacutetico de la Universidad Distrital Francisco
Joseacute de Caldas ademaacutes aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacioacuten en bacterias y ofrece
informacioacuten yo tips sobre el proceso de liofilizacioacuten en general que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso Tambieacuten se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Geneacutetico en la comunidad cientiacutefica a nivel nacional
e internacional
Este documento consta en su orden de un capiacutetulo de introduccioacuten y un marco referencial de los
objetivos tanto general como especiacuteficos alcanzados en este trabajo una metodologiacutea detallada
paso a paso perfectamente reproducible los resultados encontrados asiacute como el anaacutelisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacioacuten
finalmente un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo el campo de la
conservacioacuten microbiana y los capiacutetulos correspondientes a las referencias y bibliografiacutea utilizada
Se incluye tambieacuten un capiacutetulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientiacutefica del presente trabajo
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2 MARCO REFERENCIAL
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS
La vida en la Tierra no seriacutea posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado 2009) ya que estaacuten involucrados con las dinaacutemicas en los ecosistemas terrestres aeacutereos
y acuaacuteticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta Existen
microorganismos que degradan la materia orgaacutenica hacieacutendola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) evitando que el mundo sea un vertedero
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnoloacutegicos de la humanidad
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea Bacteria y
Eucarya en donde encontramos como primeros representantes a las bacterias las maacutes numerosas
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) muchas pueden
resultar beneacuteficas para ser utilizadas con fines biotecnoloacutegicos agriacutecolas biomeacutedicos ecoloacutegicos
y de biorremediacioacuten (Morales-Garciacutea et al 2010) Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucioacuten en la naturaleza contribuyendo a la descomposicioacuten de la materia orgaacutenica y
participando en los ciclos bioloacutegicos (Pontoacuten Moragues Geneacute Guarro amp Quindoacutes 2002)
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucioacuten de los
graves problemas de la humanidad (Gonzaacuteles de Oca Martiacutenez Riveroacuten amp Nuacutentildeez 2006) en la
agricultura alimentacioacuten salud y en la buacutesqueda de nuevas fuentes de energiacutea y la conservacioacuten
del medio ambiente Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioquiacutemicas para Atlas (citado por Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez
1998) dicha capacidad se basa ldquoen la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones oxidaciones reducciones y precipitacioneshellip y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierrardquo (paacuteg 289)
Los recursos microbioloacutegicos (microorganismos genes e informacioacuten) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologiacutea las ciencias de la vida (Ivshina amp Kuyukina 2013) el
desarrollo de medicamentos farmaceacuteuticos agentes agroquiacutemicos biocontroles cosmeacuteticos y
productos industriales (Ten Kate 1995) Ademaacutes con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el eacutexito de los primeros aislamientos de microorganismos se marcoacute la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacioacuten de toda la biodiversidad microbiana logrando la inclusioacuten de este tema en el
desarrollo de las poliacuteticas ambientales (Gonzaacuteles et al 2006)
El meacutetodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta fuera de sus
ambientes ecosistemas y nichos ha sido la creacioacuten de colecciones bioloacutegicas cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfoloacutegicos fisioloacutegicos o
geneacuteticos (Montes de Oca et al 2008) Las colecciones de cultivos microbianos variacutean en forma
funcioacuten y tamantildeo Pueden ser pequentildeas privadas mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especiacuteficos (Duratildees Sette Pagnocca amp Rodrigues 2013)
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El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura baacutesica de
investigacioacuten en ciencias de la vida llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg Dedeurwaerdere amp Pascual 2013) de animales y plantas pero se cuentan con
caracteriacutesticas especiacuteficas para los microorganismos En primer lugar los organismos microbianos
tienen una variacioacuten geneacutetica extremadamente alta y altos iacutendices de mutacioacuten en la reproduccioacuten
en las especies por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al 2013) a su lugar de recoleccioacuten En segundo lugar las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacioacuten asegurar los recursos geneacuteticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes para proporcionar biomateriales autenticados
para materiales de investigacioacuten exploracioacuten y produccioacuten asiacute como su uso contemporaacuteneo por
parte de las entidades privadas y puacuteblicas (Stromberg et al 2013)
Los microorganismos al igual que otros seres vivos poseen una uacutenica e irremplazable
secuencia de ADN por lo que su desaparicioacuten implicariacutea la peacuterdida irreversible de un conjunto
uacutenico de informacioacuten (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) de ahiacute la gran importancia en la
creacioacuten de comiteacutes comisiones federaciones y grupos de microbiologiacutea como World Federation
for Culture Collection (WFCC) International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacioacuten
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC 2010b)
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
En las colecciones es necesario establecer meacutetodos de conservacioacuten confiables y especiales
pudiendo realizarse a corto mediano y largo plazo para asegurar la oacuteptima viabilidad
almacenamiento y pureza (WFCC 2010b) de los diferentes microorganismos Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de peacuterdida cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
miacutenimo dos meacutetodos (WFCC 2010b) de conservacioacuten que consideren el tiempo a emplear en la
preservacioacuten inicial manipulacioacuten y control perioacutedico de las cepas asiacute como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemaacuten Diacuteaz Rosa amp Aacutelvarez Molina 2005)
Se debe tener especial cuidado con geacuteneros y especies todaviacutea no conservadas en colecciones
(especies nuevas) contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
oacuteptimos (WFCC 2010a) de conservacioacuten de estos
221 Conservacioacuten a corto plazo
Comuacutenmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestioacuten seraacute utilizado en un corto
periodo de tiempo Suele utilizarse la teacutecnica de resiembra continua en este el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC
donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garciacutea et al 2010)
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten
Este concepto agrupa a las teacutecnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 antildeos (Weng et al 2005) Existen variedad de teacutecnicas como la
desecacioacuten el gel de siacutelice o perlas de vidrio el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al
2005) o la congelacioacuten La inclusioacuten de esta uacuteltima teacutecnica en este grupo es discutida por algunos
autores ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacioacuten como la criopreservacioacuten (o
15
congelacioacuten) son teacutecnicas de conservacioacuten a largo plazo (Perry 1995 Weng et al 2005) y otros
insisten su inclusioacuten en las teacutecnicas de conservacioacuten a mediano plazo (Morales-Garciacutea et al 2010)
La criopreservacioacuten consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas
Esto permite la eliminacioacuten del agua libre disponible y que en el interior de los individuos ldquosoacutelo
una proporcioacuten del total de agua se convierta en hielordquo (Perry 1995 paacuteg 23)
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 deg C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta peacuterdida de la
viabilidad del cultivo (Perry 1995) por parte del laboratorio Este meacutetodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las ceacutelulas a -80degC
(Morales-Garciacutea et al 2010) Heckly (citado por Perry 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas la viabilidad celular es casi independiente del periacuteodo de almacenamiento ademaacutes
se cree que los individuos criopreservados siguen siendo geneacuteticamente estables
Hubaacutelek (2003) menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacioacuten de microorganismos desde las caracteriacutesticas propias del individuo (cepa
especie tamantildeo y forma de celda fase de crecimiento al momento de congelar composicioacuten de las
ceacutelulas etc) asiacute como los factores antes (composicioacuten del medio de crecimiento pH temperatura
de incubacioacutenhellip) durante y posterior al proceso de criopreservacioacuten (densidad poblacional
aditivos temperatura y duracioacuten del almacenamientohellip) e incluso en su descongelacioacuten
ldquoLos aditivos crioprotectores son compuestos quiacutemicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los dantildeos durante el proceso de congelacioacutenrdquo (Gonzaacuteles et al 2006 paacuteg
16) Estos protectores se pueden clasificar seguacuten su peso molecular (bajo o alto) o seguacuten su tasa
yo capacidad de penetracioacuten los penetrantes de bajo peso molecular que desplazan el agua
intracelular evitando la formacioacuten de hielo (por ejemplo el glicerol) y los no penetrantes de alto
peso molecular que promueven la raacutepida deshidratacioacuten de la ceacutelula (por ejemplo los gluacutecidos)
(Hubaacutelek 2003)
223 Conservacioacuten a largo plazo
Este concepto agrupa a las teacutecnicas que ademaacutes de minimizar al maacuteximo el riesgo de cambio
geneacutetico en las ceacutelulas mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 antildeos o maacutes (Weng et al 2005)
La maacutes popular es la liofilizacioacuten
2231 Liofilizacioacuten
La liofilizacioacuten consiste en la eliminacioacuten del agua de una sustancia congelada por
sublimacioacuten del hielo bajo alto vaciacuteo y a presiones muy bajas (Gonzaacuteles et al 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador Si la liofilizacioacuten es exitosa se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacioacuten por varios antildeos de los microorganismos sin embargo dicho eacutexito depende de
muacuteltiples factores entre otros como los mencionados por Hubaacutelek (2003) para la criopreservacioacuten
(puesto que la liofilizacioacuten posee una etapa de congelacioacuten) asiacute mismo el tiempo de liofilizacioacuten
los paraacutemetros de liofilizacioacuten el medio aditivo o lioprotector usado tipo de liofilizador o
accesorio utilizado influyen en el producto final
16
El proceso de conservacioacuten de microorganismos por liofilizacioacuten se puede dividir en muacuteltiples
etapas desde la formulacioacuten del protector hasta el modo en que se recuperaraacuten los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1)
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacioacuten Asiacute mismo se
representa el efecto de cascada en teacuterminos de la viabilidad de las muestras
a) Formulacioacuten
Se entiende como la mezcla de ceacutelulas con cualquier solucioacuten protectora que tras la
eliminacioacuten del disolvente permita obtener un producto (liofilizado) deseado La solucioacuten
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacioacuten Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de gluacutecidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics 2015)
Las soluciones protectoras oacuteptimas contienen principalmente un soluto protector
denominado lioprotector que estabiliza las ceacutelulas cuando se elimina el disolvente (agua)
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despueacutes de la liofilizacioacuten (Figura 2) Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actuacutean como su propia matriz por ejemplo la sacarosa al
10 (Ops Diagnostics 2015)
La formulacioacuten tambieacuten comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse pudiendo variar de si se parte de un cultivo soacutelido en
agar o de un cultivo liacutequido hasta que sean cultivos soacutelidos densos (edad de 1-2 diacuteas) o
liacutequidos en fase estacionaria Cuando se parte de un medio liacutequido y si es posible las
ceacutelulas se centrifugan retirando el medio de cultivo y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucioacuten protectora (Ops Diagnostics 2015) o de lioprotector (Grauer
Grunberg amp Zardo 2015) Para cultivos desde agar suele lavarse la placatubo con 5-10
ml de medio protector posteriormente recogido con una pipeta esteacuteril (Ops Diagnostics
2015) Aunque en esto uacuteltimo se evita la centrifugacioacuten se obtiene un mayor nuacutemero de
ceacutelulas partiendo de cultivos liacutequidos (Grauer et al 2015)
17
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado
Fuente Adaptado de Jennings T A (2008) Lyophilization Introduction and Basic Principles (paacuteg 5)
New York Informa Healthcare USA Inc
b) Congelacioacuten
La congelacioacuten es la primera etapa del meacutetodo de liofilizacioacuten y uno de los maacutes
importantes para el eacutexito de este Su funcioacuten consiste en obtener una matriz en donde esteacute
separado el disolvente de los solutos Cuando se congela la formulacioacuten el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regioacuten intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings 2008) la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regioacuten intersticial a casi 0 ademaacutes proporciona una estructura
con resistencia casi nula al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings
2008)
Disminuir el flujo de agua raacutepidamente es importante para evitar asiacute la excesiva
concentracioacuten de solutos un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracioacuten de solutos evitando el estreacutes osmoacutetico y permitiendo una organizacioacuten
espacial de los componentes de la formulacioacuten en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al 2015)
La temperatura y el tiempo para una congelacioacuten completa de la formulacioacuten
dependen de la naturaleza de la misma Nireesha et al (citado por Grauer et al 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco de ahiacute que una correcta congelacioacuten reduce la
desnaturalizacioacuten teacutermica del liofilizado ldquoinmoviliza componentes de la solucioacuten y evita
la formacioacuten de espuma cuando se aplica el vaciacuteordquo (Adams 2007)
c) Secado primario
Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacioacuten ademaacutes es la de maacutes larga
duracioacuten En este etapa la presioacuten se reduce y la temperatura de la formulacioacuten congelada
es elevada dando lugar a la sublimacioacuten (Figura 3) y migracioacuten de vapor de agua (Grauer
et al 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador Sin embrago dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
euteacutectica de colapso de transicioacuten viacutetrea (Tg) para minimizar el dantildeo de la muestra
(Adams 2007)
18
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua Se indican los requerimientos de presioacuten
y temperatura que hacen posible la sublimacioacuten del agua durante la liofilizacioacuten
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
El tiempo para el secado primario depende de muacuteltiples factores como la
composicioacuten de la solucioacuten protectora la porosidad del congelado la calidad o resistencia
de la matriz la cantidad de muestras asiacute como tambieacuten el volumen de la formulacioacuten entre
otros Respecto al volumen ldquopara las bacterias las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 025 a 05 mlrdquo (Ops Diagnostics 2015) Aunque no existe un
volumen establecido hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de maacutes
tiempo
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) un periacuteodo de secado primario de un diacutea es suficiente
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras teniendo
como guiacutea un tiempo de liofilizacioacuten de una noche
La etapa de secado primario finaliza ldquocuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacioacuten y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congeladardquo (Jennings 2008 paacuteg 6)
d) Secado secundario
Es la tercera y uacuteltima etapa de la liofilizacioacuten Al terminar el secado primario se ha
eliminado el agua moacutevil de la muestra Sin embargo existe agua atrapada dentro del soacutelido
amorfo que es maacutes difiacutecil de eliminar (Fetterolf 2010) La cantidad de agua es discutible
ya que fluctuacutea en funcioacuten de la temperatura y las caracteriacutesticas propias de los
19
constituyentes de la formulacioacuten por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10 ww del producto seco (Jennings 2008) o del 2-4 (Ops Diagnostics 2015)
La reduccioacuten del contenido de humedad en la torta se logra por desorcioacuten (Adams
2007) sin reducir el volumen de la misma (Jennings 2008) Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presioacuten parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario durante el secado secundario
(Ops Diagnostics 2015) Es importante que la temperatura no se incremente velozmente y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicioacuten viacutetrea la cual aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf 2010)
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) esta etapa es relativamente corta con una duracioacuten de
1 a 2 horas aunque Grauer et al (2015) indica que representa entre el 30-40 del tiempo
total del proceso asiacute mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo
con una duracioacuten de hasta varios diacuteas Esto resulta importante puesto que ldquola cantidad de
agua residente luego del secado afecta la tasa de peacuterdida de viabilidad durante el
almacenamientordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 16)
Finalmente al ser removida la humedad residual la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al 2015) obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2) o pastel esponjoso con poca (inferior al 1) o nula humedad
residual (Fetterolf 2010)
Las tres etapas del proceso de liofilizacioacuten en funcioacuten de la temperatura y la presioacuten
y en contraste con el diagrama de fases del agua pueden ser observadas en la Figura 4
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten De 1-3 Congelamiento (1-2 presioacuten
atmosfeacuterica) de 3-4 secado primario de 4-5 Secado secundario
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
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e) Sellado y almacenamiento
Terminado el proceso de secado secundario se deben sellar los viales al vaciacuteo (de ser
posible) o de forma hermeacutetica tan pronto como sea posible debido a que la torta actuaraacute
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf 2010) aunque
tambieacuten es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams 2007) e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de siacutelice
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Sin embrago aunque
se logre un correcto sellado al vaciacuteo no se puede asegurar una larga vida uacutetil en condiciones
ambientales ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al 2015)
por ello lo mejor es almacenar los liofilizados a 4deg C en la oscuridad (Ops Diagnostics
2015) reduciendo las posibilidades de peacuterdidas aunque haya quedado agua despueacutes del
secado
f) Reactivacioacuten o rehidratacioacuten
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacioacuten original esto
implica la adicioacuten de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings 2008
Grauer et al 2015) La dilucioacuten raacutepida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings 2008) da cuenta de un correcto proceso de liofilizacioacuten
ldquoTiempos de reconstitucioacuten excesivamente largos la peacuterdida de potencia o la formacioacuten
de una solucioacuten turbia son indicios de un proceso de liofilizacioacuten inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacioacutenrdquo (Jennings 2008 paacuteg 11)
La recuperacioacuten de las ceacutelulas sin embrago tambieacuten se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacioacuten) el tipo
de diluyente su temperatura su pH la osmolaridad (Grauer et al 2015) la potencia del
lioprotector (Jennings 2008) entre otras propiedades de la solucioacuten resultante
Grauer et al 2015 sugieren la utilizacioacuten de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacioacuten de los microorganismos con el fin de evitar el estreacutes
osmoacutetico que pueden causar las soluciones diluidas sin embargo algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacioacuten especiacuteficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato
Ops Diagnostics (2015) indican que una tasa de supervivencia superior al 50 se
considera aceptable por muchos laboratorios
2232 Control de calidad de un producto liofilizado
Las propiedades fiacutesicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayoriacutea un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacioacuten entre los
paraacutemetros de la formulacioacuten y el proceso de liofilizacioacuten por ello permiten el seguimiento y la
deteccioacuten de falencias (Jennings 2008)
21
Esta evaluacioacuten permite caracterizar las diferentes propiedades fiacutesicas quiacutemicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre dichas propiedades Jennings (2008) y Ticoacute
G (1987) recogen algunos de las toacutepicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado por ejemplo las propiedades generales fiacutesicas de la torta (color volumen temperatura
de transicioacuten textura porosidad densidad contraccioacuten o colapso estado del vial entre otras que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacioacuten) su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfeacuterica) la velocidad de redisolucioacuten o
reconstitucioacuten la estabilidad (de la torta el microorganismo o el lioprotector evaluada de forma
natural o acelerada) nivel de humedad residual posibles contaminantes entre otras
2233 Equipamiento para liofilizar
Como ya se mencionoacute inicialmente el proceso de liofilizacioacuten requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5) este equipo consta esencialmente de tres partes
a) Un sistema o bomba de vaciacuteo que reduce la presioacuten del ambiente de la caacutemara que contiene
el material a secar Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dantildeen ldquoEl nivel
de vaciacuteo requerido debe ser entre 50 y 100 μbarrdquo (Grauer et al 2015 paacuteg 9) aunque 200
μbar son aceptables
b) Un condensador con circuito de refrigeracioacuten que comunica con la caacutemara de secado y
condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacioacuten sobre una superficie enfriada
inferior a los -40degC
c) Caacutemara o accesorio de secado que es donde se coloca el material a secar Seguacuten Nireesha
et al (2013) puede ser de tres tipos
- Manifold o colector muacuteltiple
- Rotary
- Tray style de bandejas con o sin estante de taponado eacuteste uacuteltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaciacuteo de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes En la imagen el liofilizador usa una
caacutemara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial
Tomado de httpslideplayercombrslide84760 el 15 de Agosto de 2015
22
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad y liofilizacioacuten de las mismas evaluaacutendolas frente a tres compuestos protectores
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas utilizando teacutecnicas de recuento
en placa estaacutendar
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacioacuten de cepas microbianas
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten
Disentildear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacioacuten a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados
23
4 METODOLOGIacuteA
La metodologiacutea general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases como es ilustrado en la
Figura 6
Figura 6 Metodologiacutea Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia loacutegica de eventos
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra
41 FASE INICIAL
411 Acervo Microbiano
De la coleccioacuten de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Geneacutetico del laboratorio de
microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracioacuten de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologiacutea estas corresponden a CR004 CR005 (sustituida posteriormente
por CR009) CR006 CR007 y CR010 seguacuten los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodriacuteguez (2013) Todas estaban conservadas por el meacutetodo de criopreservacioacuten (o
criocongelacioacuten) a una temperatura de -85 degC plusmn 1degC
412 Eleccioacuten de los protectores
4121 Crioprotectores
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99999) (Mallinckrodt Meacutexico) en
proporcioacuten 67 vv seguacuten lo establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
4122 Lioprotectores
Para la eleccioacuten de los agentes protectores y sus concentraciones en pv (Tabla 1) se
tuvieron en cuenta diferentes estudios en contraposicioacuten a Hensel (1994) se tomaron
concentraciones superiores al 9 de Glucosa (Merck Darmstadt) de forma aleatoria En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed amp
Roos (2004) y Palmfeldt Radstroumlm amp Hahn-Haumlgerdal (2003) Para la leche descremada
(Proleche Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al (2003) Dichos estudios
fueron tomados como referencia teoacuterica aunque los microorganismos en ellos especificados no
correspondan con los del presente trabajo
Criterios de eleccioacuten de los
microorganismos asiacute como de
los lioprotectores a evaluar
Evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten (criopreservacioacuten
y liofilizacioacuten)
Ajustes a la liofilizacioacuten
para la generacioacuten de
protocolos
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
24
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracioacuten
pv
10 4 10
117 10 15
27 15 20
42 FASE INTERMEDIA 1
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
En este trabajo se evaluaron dos meacutetodos de conservacioacuten (criopreservacioacuten y liofilizacioacuten)
dicha evaluacioacuten se realizoacute en teacuterminos de tres (3) indicadores valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al meacutetodo en siacute
4211 Viabilidad
Para evaluar este indicador se utilizoacute
a) Conteo directo con caacutemara de Neubauer 110mm (Boeco) siguiendo la metodologiacutea
planteada por Valencia Z (2004) Sin embargo para obtener el nuacutemero de bacterias se
utilizoacute la ecuacioacuten planteada por Bastidas (2015)
No de bacteriasml=
Fd Factor de dilucioacuten =
El conteo directo con caacutemara de Neubauer solo se realizoacute previamente al meacutetodo de conservacioacuten
evaluado
b) Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa seguacuten lo
descrito por Valencia Z (2004) y Camacho et al (2009) Para el caacutelculo de UFCml se
utilizoacute la siguiente foacutermula
UFCml = Ndeg de colonias times times
Los caacutelculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologiacutea planteada por
Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales se utilizoacute los planteamientos del Instituto
de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacioacuten y solo pos a la criopreservacioacuten en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid
England)
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten
fue calculado a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010)
Tasa de supervivencia (BSR ) = DD Despueacutes de la desecacioacuten
AD Antes de la desecacioacuten
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000
Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucioacuten
1
ml de muestra
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100
Log (Ndeg UFCml AD)
25
4212 Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realizoacute
a) Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) Se elaboroacute un formato (anexo 1) con las
caracteriacutesticas macroscoacutepicas descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz
(2009) para las colonias desarrolladas en superficie a partir del procedimiento de ldquoconteo
de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Se utilizoacute un
contador de colonias CC-1 (Boeco)
- Se seleccionoacute solo una de dos placas de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de
UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron observadas en al menos el 80 de las colonias
de la placa seleccionada
b) Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se
realizoacute una ldquocoloracioacuten de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005
paacuteg 24)
Se compararon con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y macroscoacutepicas descritas por
Rodriacuteguez (2013) y la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se tomoacute
registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio (Zeiss)
con caacutemara Canon G9
4213 Pureza
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en
cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante
teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
422 Recuperacioacuten de los microorganismos
Para la recuperacioacuten de los microorganismos se tomoacute un criovial de cada cepa bacteriana
sometido a una temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua
destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente cinco (5) minutos (Martiacutenez amp Mayorga
2013) Los crioviales se introdujeron en bantildeo seroloacutegico una vez se llegoacute a la temperatura deseada
no antes
De cada criovial se tomoacute un (1) ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (asymp2240rpm) por diez (10) segundos diluyeacutendolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
Se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten a cada criovial (Thomas
Scientific 5150636) por cepa luego de preparado el tubo T01 antes de la incubacioacuten Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martiacutenez amp Mayorga
(2013) y Rodriacuteguez (2013)
26
423 Criopreservacioacuten
4231 Precriopreservacioacuten
Pasado el tiempo de incubacioacuten se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten al tubo T01 con el fin de determinar el nuacutemero de ceacutelulas totales y viables de la
muestra El conteo en Caacutemara de Neubauer se realizoacute solo hasta el final de los procedimientos de
preservacioacuten por lo cual una vez preparadas las diluciones estas fueron llevadas a nevera a 4degC plusmn
1degC para evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Se siguioacute el protocolo de criopreservacioacuten establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas con
algunas variaciones
Con pipeta esteacuteril de 5ml se depositaron en cinco (5) crioviales 12ml de glicerol anhidro
esteacuteril
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02)
Posteriormente se tomaron aliacutecuotas desde T02 de 600microl previo Voacutertex nivel 7 por 15s
depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl Se rotularon y se
realizoacute Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten
Inmediatamente despueacutes de la homogenizacioacuten fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick) a una temperatura de -85degC plusmn 1degC en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestioacuten
Este procedimiento se realizoacute en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar veinte (20) minutos (Martiacutenez amp
Mayorga 2013) desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar
la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
424 Liofilizacioacuten Etapa 1
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Se partioacute del tubo T01 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de
liofilizacioacuten Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel
7 (asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml agua destilada esteacuteril (T03)
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
Partiendo del tubo T03 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se
extrajeron aliacutecuotas de cien (100) microl veintisiete (27) veces depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar En cada criovial se adicionaron novecientos (900) microl de lioprotector en tres
crioviales por cada concentracioacuten de lioprotector de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2)
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior del criovial fuera lo maacutes
exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T03 se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacioacuten
27
Donde el volumen inicial y la concentracioacuten inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado en tanto que el volumen final y la concentracioacuten final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T03
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (aliacutecuota maacutes protector) se
agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacioacuten
Posteriormente a los crioviales se les retiraron las tapas plaacutesticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney PM-996) esterilizado realizando seis (6) perforaciones conceacutentricas en la superficie
con aguja hipodeacutermica 21G x 1frac12rdquo Los crioviales fueron congelados en nitroacutegeno liacutequido por
15min aproximadamente depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD Thermo
Scientific) de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45degC usando el colector muacuteltiple (manifold)
Terminado el proceso se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la caacutemara
de flujo laminar para evitar contaminacioacuten de las muestras alliacute se les retiroacute el Parafilm se les tapoacute
con tapas esteacuteriles y se les rotuloacute
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten
Lioprotector Concentracioacuten
(pv)
Serie
A B C
Glucosa
10 1 1 1
117 1 1 1
27 1 1 1
Sacarosa
4 1 1 1
10 1 1 1
15 1 1 1
Leche
descremada
10 1 1 1
15 1 1 1
20 1 1 1
Total crioviales seguacuten Ndeg 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje)
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten utilizando una etiqueta o
roacutetulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacioacuten
Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de datos el
Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten
bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo)
nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3) con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo
bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas
tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada vial
Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional
a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
Posterior al proceso de rotulado los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano a temperatura ambiente y protegido de la luz
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS
CC en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado riesgo
poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entrantildear un riesgo grave para el personal de
laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado
riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro Existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o
indirectamente Normalmente no existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005)
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio
(paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications
biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
29
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2
Se realizoacute una prueba de estabilidad natural en teacuterminos del aspecto fiacutesico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un periacuteodo prolongado de tiempo (Grauer et al 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente Por ello la rehidratacioacuten de los crioviales se realizoacute en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4)
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales
Primera rehidratacioacuten Segunda rehidratacioacuten Tercera rehidratacioacuten
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota Intervalos de tiempo medidos en diacuteas contados desde el diacutea de almacenaje en los cuales se rehidratoacute
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie ver Tabla 2) El aspecto fiacutesico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacioacuten y comparado con su estado antes del almacenaje
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC tomando
el tiempo de reconstitucioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel
2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten El indicador de viabilidad se evaluoacute solo con el meacutetodo de conteo de
microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la maacutes alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa se eligioacute el
lioprotector y la concentracioacuten de eacuteste que permitioacute obtener un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables
posliofilizacioacuten y que ofrecioacute ademaacutes una menor variacioacuten durante la prueba para la liofilizacioacuten
definitiva de las cepas en estudio Dicho lioprotector se establecioacute ademaacutes como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados del Banco
Geneacutetico del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
43 FASE INTERMEDIA 2
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores con el aacutenimo de
generar un protocolo funcional aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partioacute de cultivos puros sobre medios soacutelidos se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacioacuten liofilizacioacuten y posliofilizacioacuten para la
liofilizacioacuten definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados
431 Liofilizacioacuten definitiva
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracioacuten oacuteptima para cada cepa
de estudio se realizoacute la liofilizacioacuten definitiva
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general Posteriormente se agitoacute con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Esto se realizoacute para cada
cepa
30
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
El tubo T04 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten
definitiva se extrajeron cuatro (4) aliacutecuotas de un (1) ml previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass 62113D-2)
posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por
7s para su homogenizacioacuten
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas a una presioacuten
inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
El proceso de destape parcial y congelacioacuten se realizoacute en caacutemara de flujo laminar para evitar
al maacuteximo la contaminacioacuten El transporte de los viales desde la caacutemara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitroacutegeno liacutequido
para evitar contaminacioacuten y descongelacioacuten
4313 Posliofilizacioacuten
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten Dos viales
designados como trabajo (T) y stock (S) fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4degC plusmn 1degC
4314 Rehidratacioacuten
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacioacuten de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio soacutelido
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos
Se llevoacute un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el aacutenimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacioacuten Al identificarlas se decidioacute repetir la
liofilizacioacuten definitiva con los nuevos paraacutemetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio
4321 Propiedades fiacutesicas generales
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento) color textura brillo aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales teniendo como punto de comparacioacuten la formulacioacuten
luego de congelada Esto se realizoacute para
- Crioviales de la fase intermedia 1
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 431)
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 433)
4322 Contaminacioacuten
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad en
buacutesqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio
31
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten
Se midioacute el tiempo de reconstitucioacuten de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y el tiempo de los crioviales que conteniacutean el lioprotector general fue comparado
con el tiempo de reconstitucioacuten de los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada
433 Pruebas adicionales
Para estas pruebas solo se usoacute la formulacioacuten del lioprotector general y la cepa CM-CR010
por su alta tasa de crecimiento respecto a las demaacutes cepas evaluadas
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticoacute G 1987) se
tomaron los pesos con balanza analiacutetica (AND GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos El cuarto vial y criovial se abrieron solo una vez luego
fueron sellados completamente tomando sus pesos de la misma forma ya descrita
Para determinar si existe un tiempo maacuteximo admisible de cerrado se midioacute el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcioacuten del tiempo utilizando la ecuacioacuten
descrita por Garciacutea C (2007)
Wt () es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4332 Prueba de estabilidad acelerada
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa uno fue rehidratado a los cero (0) diacuteas y el otro
luego de siete (7) diacuteas en el interior de la caacutemara de envejecimiento ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5 Adicionalmente se dataron sus propiedades fiacutesicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada
Ndeg vial t ndash Tdeg - HR
1 0 - ambiente - 25
2 7 - 37degC - 100
Nota Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos t= Tiempo en diacuteas
Tdeg=Temperatura HR=Humedad relativa La prueba de estabilidad se realizoacute en una caacutemara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC luego
incubados a 25 degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente
se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten midiendo viabilidad con el meacutetodo
de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
32
434 Control de esterilidad
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121degC y 210Kpa por 20 minutos las puntas de micropipetas los viales
crioviales y sus respectivas tapas fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y
temperatura en un tiempo de 15 minutos Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas) fueron esterilizados en horno Binder a 160degC por 120 minutos
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo desde la
preparacioacuten de medios hasta el sellado de los viales como se describe a continuacioacuten
4341 Medios
Se realizoacute control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid England) (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Se determinoacute como indicador de contaminacioacuten
cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios
soacutelidos
4342 Ambiente
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realizoacute con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas El periodo de exposicioacuten fue de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en
incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo
b) Cabina de flujo laminar
Se realizoacute el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este
caso la caja de control de ambiente se dejoacute abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeriacutean el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4
horas Este control se llevoacute a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolloacute en el interior de la cabina de flujo laminar
se procuroacute mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y
tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70 al iniciar el trabajo con cada cepa
44 FASE FINAL
441 Base de datos
Se realizoacute una revisioacuten a la base de datos del Banco de cepas creado por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) en el programa Access modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccioacuten para la informacioacuten de los organismos liofilizados
33
442 Fichas de resumen
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccioacuten tanto del Freezer
como del banco de liofilizados utilizando el programa Word 2013
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se realizoacute una revisioacuten de la informacioacuten en los roacutetulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos con el aacutenimo de verificar si se habiacutean cumplido los protocolos y la
logiacutestica establecida por Martiacutenez amp Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias
444 Formatos de control del banco de liofilizados
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013 para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) en la seccioacuten
de criopreservacioacuten
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados
Coacutedigo Tipo de registro Ubicacioacuten Uso
FLf-01 Registro de entrada de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccioacuten
FLf-02 Proceso de
liofilizacioacuten
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacioacuten a
una cepa
FLf-03 Registro de control de
calidad
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccioacuten y antes de liofilizar
una cepa para la coleccioacuten
FLf-04 Solicitud salida de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados
Fuente Adaptado de Martiacutenez Beniacutetez H L amp Mayorga Burgos L P (2013) Implementacioacuten de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (Tesis de
pregrado) (paacuteg 44) Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas Bogotaacute Colombia
445 Manual de procedimientos
Se realizoacute una revisioacuten de la cartilla de procedimientos elaborada por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) Se tomoacute la decisioacuten de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013
34
5 RESULTADOS
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN
A raiacutez de la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en cada criovial por cepa
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno En cuanto a CM-CR005 se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer pero no fue posible recuperarla por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009 la sexta mejor respecto al criterio de eleccioacuten de cepas
Con los datos del proceso precriopreservacioacuten de las cepas de intereacutes correspondientes a la
coleccioacuten de colorantes consignados en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) en conjunto con
los datos de viables poscongelacioacuten del presente trabajo se calculoacute la BSR para cada cepa (Tabla
7) Se encontroacute que los porcentajes de BSR son superiores al 70 luego de dos (2) antildeos de estar
en criopreservacioacuten (Figura 8) salvo CM-CR005
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martiacutenez amp Mayorga (2013) (soacutelo se compararon los datos de la cepa CM-CR010 ya que las demaacutes
cepas no figuran en su trabajo) se encontroacute un porcentaje inferior de recuperacioacuten
poscriopreservacioacuten por parte de las autoras por lo cual se revisoacute la metodologiacutea encontrando un
error metodoloacutegico al calcular la BSR en su trabajo Usando los datos de ldquoresultados prueba de
viabilidad poscongelacioacuten tabla 19rdquo (en Martiacutenez amp Mayorga 2013 paacuteg 54) se corrigioacute la BSR
para esta cepa evidenciando ser la cepa maacutes resistente al proceso de criopreservacioacuten entre las
evaluadas con alrededor de 66 de caiacuteda luego de dos antildeos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8)
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten)
Nota Se muestran los resultados al evaluar la conservacioacuten de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por
el meacutetodo de criopreservacioacuten luego de dos (2) antildeos La BSR que Martiacutenez amp Mayorga (2013) presentan
corresponde a un valor poscriopreservacioacuten luego de dos meses de evaluacioacuten Nrd= No registra datos
Cepa Ceacutelulas
totales
Viables precongelacioacuten
(UFCml) de Martiacutenez
amp Mayorga (2013)
viables pos
congelacioacuten
(UFCml)
BSR
real
BSR de Martiacutenez
amp Mayorga
(2013)
BSR
corregido
CM-CR004 12x1012 61 x109 13 x107 725 Nrd Nrd
CM-CR005 11 x1010 11 x1010 0 00 Nrd Nrd
CM-CR006 14x1010 75 x109 27 x107 752 Nrd Nrd
CM-CR007 13x1011 41 x109 31 x108 883 Nrd Nrd
CM-CR009 19 x1010 44 x109 23 x107 763 Nrd Nrd
CM-CR010 17 x1010 46 x109 72 x108 916 673 982
35
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelacioacuten CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperacioacuten (nuacutemero de
ceacutelulas viables)
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO
En las Tablas 8 9 10 11 y 12 se describen las principales caracteriacutesticas macroscoacutepicas
utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfoloacutegica de las cepas utilizadas No fue
posible realizar la comparacioacuten con los datos de Rodriacuteguez (2013) a nivel macroscoacutepico dado que
los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquiacute utilizados sin embargo si se
compararon las caracteriacutesticas microscoacutepicas las cuales fueron coincidentes aunque estas no eran
del todo claras (descripcioacuten inexacta de forma y tamantildeo y sin un registro fotograacutefico comparable)
por lo cual se decidioacute que las caracteriacutesticas macroscoacutepicas observadas desde la primera siembra
posterior a la descongelacioacuten de los crioviales fuesen las de mayor importancia para evaluar la
estabilidad morfoloacutegica y la pureza Estas se mantuvieron sin cambio o variacioacuten a lo largo del
trabajo
Las microfotografiacuteas tomadas a cada cepa usando la coloracioacuten de Gram al igual que las
fotografiacuteas de las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron anexadas a la base de datos del Banco
Geneacutetico
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 725 00 752 883 763 916
Sup
ervi
ven
cia
36
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR004
Descripcioacuten
Borde o Margen
Ondulado Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de
crecimiento
Frente a luz Brillante
Elevacioacuten Umbonada
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Color Beige maacutes intenso en el centro y maacutes clara hacia los extremos en
colonias de 48h o maacutes extremos color blanco hueso
Forma Circular a maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo desarrollar forma
irregular
Grado de
Transparencia Opaca (No transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Ropa huacutemeda
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR006
Descripcioacuten
Borde o Margen Semiondulado A maacutes de 72h es altamente digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas y con medio huacutemedo se irregulariza
Luego de una semana totalmente digitado
Elevacioacuten Plana con bordes elevados (en craacuteter) Colonias de maacutes de 72h
presentan una ligera elevacioacuten en el centro
Color Amarillo
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Escamosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca (NO transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis Si color amarillo
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
37
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR007
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio muy huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular A maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo es irregular
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 48h y distantes unas de otras (pocas
colonias) umbonadas
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Semitransparente en zona externa
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Mentol
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR009
Descripcioacuten
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas se irregulariza
Elevacioacuten En meseta y ligero hundimiento central (craacuteter) En colonias con maacutes
de 72h ligera elevacioacuten del craacuteter
Color Beige Conforme envejece la colonia toma una coloracioacuten blancuzca
de tonalidad cafeacute en el centro
Tamantildeo Pequentildea (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
38
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR010
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio huacutemedo es suavemente ondulado en medio muy
huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular Despueacutes de 48h se irregulariza En medio muy huacutemedo es
estrellado (sin importar edad de la colonia)
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 72h centro marcado y ligeramente
elevado (forma de huevo frito)
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia
Opaca Semitransparente en la zona externa de colonias de maacutes de
48h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Sin olor
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general
Las Figuras 9 10 11 12 y 13 representan los resultados de la evaluacioacuten de la eficacia del
meacutetodo de conservacioacuten realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1 por medio
del indicador de viabilidad
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 6 x108 Se observa que
la leche descremada 15 como mejor protector y leche descremada 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A - - - 5987 - 5301 5958 6812 -
BSR en serie B - - - 3619 3076 4557 5100 5039 3619
BSR en serie C 3076 3619 - 3619 3076 3418 3418 5873 4723
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR004
39
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 73 x108 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 125 x1010 Se observa
a sacarosa 10 como mejor protector y a glucosa 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 4173 4962 5850 6119 6415 5731 5430 4173 4513
BSR en serie B 3046 - - 4173 4743 5051 4773 - -
BSR en serie C - - - 3046 5147 4622 - - -
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR006
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 9149 8664 6549 9712 9677 8735 9026 9166 8648
BSR en serie B 8472 - 6181 - 8474 - 8413 8052 8086
BSR en serie C 8557 7472 6193 - 9272 - 8604 8202 8414
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR007
40
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 115 x109 Se observa
a Sacarosa 15 como mejor protector y la leche descremada 10 como segundo mejor protector
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 65 x109 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 5494 4609 4609 6641 6401 6987 5585 5440 5186
BSR en serie B 4415 - - 6373 6083 6212 4941 4083 -
BSR en serie C - - - - - 7519 4083 - 4083
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR009
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 8205 - 6303 9521 8634 8207 8153 8022 8332
BSR en serie B 6424 - - 7911 8312 8096 7752 6907 7995
BSR en serie C 6697 - - - 8230 7998 7919 8113 7539
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Sup
erviv
enci
a
BSR en CM-CR010
41
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15
CM-CR006 Sacarosa 10
CM-CR007 Sacarosa 10
CM-CR009 Sacarosa 15
CM-CR010 Sacarosa 10
Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural
ofreciera la maacutes alta BSR en la mayoriacutea de cepas (Tabla 13) se determinoacute la sacarosa al 10
como el mejor lioprotector y se designoacute como lioprotector general para las bacterias del banco de
liofilizados Sin embargo se decidioacute para la liofilizacioacuten definitiva utilizar el lioprotector que
mejores resultados confirioacute a cada una de las cinco cepas de estudio
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado
Dado que el principal indicador de evaluacioacuten de la prueba de estabilidad natural en esta
etapa era la viabilidad en cada liofilizado no se tuvo en cuenta los cambios morfoloacutegicos
presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa pero si fueron tenidos en cuenta
para los ajustes teacutecnicos de la liofilizacioacuten en la fase 3
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilizacioacuten definitiva
con su homoacutelogo de la etapa 2 (es decir los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo) se encontraron diferencias significativas de aumento o disminucioacuten de hasta el 22
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad seguacuten el punto de partida de la formulacioacuten
(medio liquido SMPG vs medio soacutelido SPC) como lo muestra la Figura 14
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilizacioacuten
definitiva por cepa bacteriana Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas seguacuten el intervalo
temporal de la Serie A en tanto que CM-CR007 CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron seguacuten la Serie
B (ver Tabla 4)
- 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Punto
s p
orc
entu
ales
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
L Etapa 2 6812 6415 8474 6212 8312
L definitiva 7330 7629 7757 8461 7234
BSR comparativa
42
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN
551 Propiedades fiacutesicas generales
Se dataron las propiedades fiacutesicas de los liofilizados en la fase intermedia 1 asiacute como los
liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 431 (liofilizacioacuten definitiva) y 4332 (viales
usados para la prueba de estabilidad acelerada) en las Tablas 15 y 16 respectivamente la tabla de
convenciones (Tabla 14) permite comprender los siacutembolos de las anteriores tablas
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilizacioacuten y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilizacioacuten
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transicioacuten conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto fiacutesicamente aceptable Sin embargo pese a que a las propiedades fiacutesicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1 con los cuales se realizoacute la evaluacioacuten de la liofilizacioacuten
y la prueba de estabilidad natural no eran los maacutes adecuados se decidioacute proseguir con ellos
apoyado por los resultados de Vemulapalli Bhonsle amp Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratacioacuten (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperacioacuten de microorganismos ademaacutes el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores
Tabla 14 Tabla de convenciones Siacutembolo Significado Siacutembolo Significado
SBE Si en buen estado A Algunos
SME Si en mal estado T Todos
NBE No en buen estado N Ninguno
NME No en mal estado NS No significativo (lt20)
+ Afirmativo S Significativo (201-309)
- Negativo MS Muy significativo (gt40)
NA No aplica I indeterminado
FS Al finalizar el secado AR Antes de reconstituir
Nota Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15 Aunque no tenga estructura de torta el liofilizado
es estable y funcional por ende utilizable No tiene estructura de torta y ademaacutes no es ni estable ni
funcional por ende no es utilizable
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1
Cepa Viales Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto de
torta
Fractura de
vial 1 2 3
CM
-CR
00
4
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I S Traslucido I + NBEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N S Cafeacute claro Porosa - SMEA -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR NS N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
43
CM
-CR
00
6
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR S S MS Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N NS NS Cafeacute claro Porosa - SBEA -
sm2sc AR S S S Cafeacute oscuro Porosa - SMET -
CM
-CR
00
7
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
s1 NA I I I Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR S I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS I S Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
CM
-CR
00
9
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I NS Traslucido I + NBE -
g2sc AR MS S S Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS S I Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sb AR N N NS Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sc AR N S NS Cafeacute oscuro Porosa - NMEA -
CM
-CR
01
0
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I S S Traslucido I + NMEA -
g2sc AR I MS MS Traslucido I + NMEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
44
Nota Datos de las propiedades fiacutesicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad
natural salvo por el encogimiento que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa) los
demaacutes caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual Se subrayan las
anomaliacuteas encontradas a lo largo de la prueba
g Liofilizados con glucosa como protector
s Liofilizados con sacarosa como protector
sm Liofilizados con leche descremada como protector 1 Formulacioacuten congelada 2 Liofilizados almacenados a temperatura ambiente sa Serie A (antes de rehidratar) sb Serie B (antes de rehidratar) sc Serie C (antes de rehidratar)
1 Concentracioacuten uno del lioprotector
2 Concentracioacuten dos del lioprotector
3 Concentracioacuten tres del lioprotector
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la prueba de
estabilidad acelerada
Nota Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquiacute mencionados corresponden solo a aquellos
que contienen sacarosa al 10 (lioprotector general) Se consignan aquiacute los datos generales de los
liofilizados indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas
a Liofilizados de la prueba de estabilidad natural
b Liofilizados de la liofilizacioacuten definitiva
c Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada 1 Formulacioacuten congelada 2 Viales almacenados a temperatura ambiente 3 Vial usado en la caacutemara de envejecimiento
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto
de torta
Fractura
de vial Viales
a1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
a2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
b1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
b2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
c1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
c2 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR NS Blanco Porosa - SBE -
c3 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR S Blanco Porosa - SME -
45
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes De izquierda a derecha
liofilizados de prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva prueba de estabilidad acelerada
552 Contaminacioacuten
Se encontroacute contaminacioacuten durante la rehidratacioacuten de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006 en tanto que las siembras preliofilizacioacuten no presentaban contaminacioacuten alguna por ello
se tomaron tres viales maacutes que iban a ser rehidratados en la serie B encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilizacioacuten de esta cepa
Las demaacutes cepas no presentaron contaminacioacuten en ninguna prueba realizada
553 Tiempo de redisolucioacuten
Al medir el tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten en cada una de las rehidrataciones se
observoacute que la glucosa tardoacute maacutes tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros
lioprotectores llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Voacutertex en los viales
maacutes concentrados para su total redisolucioacuten Ademaacutes se encontroacute en todos los lioprotectores que
conforme la concentracioacuten aumentaba maacutes tiempo se necesitaba para la reconstitucioacuten de la
formulacioacuten es decir que el tiempo es directamente proporcional a la concentracioacuten de
lioprotector
Al comparar el tiempo de reconstitucioacuten de los viales que conteniacutean el lioprotector general
en la prueba de estabilidad natural con los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales de la
prueba de estabilidad acelerada no se encontraron diferencias significativas sin embargo el vial
de la prueba de estabilidad acelerada que duroacute siete (7) diacuteas en caacutemara de envejecimiento se
reconstituyoacute un segundo menos aproximadamente respecto a los otros viales
46
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado
Lioprotector Tiempo (min)
Glucosa 10 1
Glucosa 117 15
Glucosa 27 120
Sacarosa 4 05
Sacarosa 10 05
Sacarosa 15 06
Leche descremada 10 025
Leche descremada 15 033
Leche descremada 20 05
Estabilidad natural 05
Liofilizacioacuten definitiva 025
Estabilidad acelerada 004
Nota El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada
uno liofilizados con el lioprotector general
56 PRUEBAS ADICIONALES
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica
En la Figura 16 se observa un aumento draacutestico del peso de los viales dentro de la ventana
de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados
al vaciacuteo) Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vaciacuteo) no tuvieron un aumento en
peso tan draacutestico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante Al cabo de cincuenta
(50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente No se encontroacute
por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vaciacuteo
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector La ecuacioacuten presentada pertenece a la liacutenea de tendencia logariacutetmica
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinacioacuten Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba
0 10 20 30 40 50 60
vial (518055g) 0 00724 00772 00782 00840 00869 00849
Criovial (19018g) 0 00079 00158 00315 00473 00578 00605
Promedio 0 00401 00465 00549 00656 00724 00727
y = 00365ln(x) + 00058
Rsup2 = 09647
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
01
AU
MEN
TO D
E P
ESO
(W
)
47
562 Prueba de estabilidad acelerada
Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFCml antes de la liofilizacioacuten al
rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 8398 sin embargo al rehidratar el vial 2 luego de su
estadiacutea en la caacutemara de envejecimiento la BSR fue de 0 Las propiedades fiacutesicas generales de
estos viales son presentadas en la Tabla 15
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN
571 Base de datos
Se eliminoacute una tabla sobrante (constituiacutea informacioacuten redundante de las cepas) dentro de la
base de datos correspondiente a la seccioacuten de criopreservacioacuten Adicionalmente se reorganizoacute la
base de datos al introducir la seccioacuten de liofilizacioacuten y la de refrigeracioacuten Este uacuteltimo meacutetodo de
preservacioacuten fue mencionado en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) pero no fue anexado
sin embargo aunque se incluyoacute la seccioacuten en el banco de cepas debe mencionarse que no existen
registros de las cepas que se hallan conservado por este meacutetodo aun asiacute se decidioacute dejar la seccioacuten
para que lo ocupen trabajos posteriores Ademaacutes se encontroacute que en el Freezer existiacutean colecciones
que no figuran en la base de datos no existen registros de ninguacuten tipo ni caracterizacioacuten alguna en
medios digitales La base de datos quedoacute organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5
Figura 17 Organigrama de la base de datos
572 Fichas de resumen
Las fichas de acceso inmediato designadas como ldquofichas de resumenrdquo para cada coleccioacuten
fueron ubicadas seguacuten el sitio de almacenamiento tanto para las cepas criopreservadas como para
las liofilizadas y refrigeradas Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas las fichas
resumen de este meacutetodo fueron dejadas en blanco para futuras colecciones El formato de las fichas
resumen se presenta en el anexo 6
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se encontroacute que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulacioacuten que
permite la faacutecil confusioacuten entre colecciones criopreservadas sin embargo se decidioacute dejar las
etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martiacutenez amp Mayorga (2013) entre
otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener
que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondriacutea una confusioacuten entre nuevas
y viejas colecciones Este problema fue solucionado con la reorganizacioacuten de la base de datos y las
fichas de resumen
Base de datos del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Informacioacuten de los
microorganismos de
cada coleccioacuten
Meacutetodo de conservacioacuten de cepas
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten
Liofilizacioacuten
48
574 Formatos de control del banco de liofilizados
Se decidioacute que los formatos de control para la seccioacuten de liofilizacioacuten del Banco Geneacutetico
fueran similares tanto para la criopreservacioacuten como para la liofilizacioacuten obedeciendo sus
diferencias a las caracteriacutesticas y datos propios de cada meacutetodo Se encontroacute que los formatos de
la seccioacuten criopreservacioacuten no habiacutean sido llenados nunca desde su creacioacuten Estos se muestran en
el anexo 7
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten
Se editoacute la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martiacutenez amp
Mayorga (2013) Partiendo de esta cartilla se elaboroacute un manual maacutes completo (anexo 8)
introduciendo todos los procedimientos para la liofilizacioacuten las diferentes teacutecnicas empleadas en
los procesos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se complementoacute tambieacuten la seccioacuten sobre el
proceso de refrigeracioacuten y se reescribieron algunos conceptos erroacuteneos de la edicioacuten anterior No
se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservacioacuten pero si
se realizaron pequentildeos ajustes de forma o de edicioacuten
49
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
La recuperacioacuten de microrganismos por criopreservacioacuten se realizoacute de acuerdo a los
lineamientos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) durante todas sus etapas sin embargo
la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la
criopreservacioacuten de la cepa o inclusive en la etapa de descongelacioacuten Garciacutea y Uruburuacute (citados
por Aacutengel A 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y
estabilidad de los organismos conservados edad celular velocidad de congelacioacuten y
descongelacioacuten temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores Dado que las cepas
CM-CR004 006 007 010 e incluso la 009 (que remplazoacute a CM-CR005) presentaron muy buenos
niveles de recuperacioacuten (Figura 8) el factor maacutes probable de falla corresponde al crioprotector
utilizado ya que en el caso del Banco Geneacutetico el crioprotector es general para toda la coleccioacuten
de bacterias y la eleccioacuten del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A
2006) puesto que la efectividad de la criopreservacioacuten se puede ver afectada por las caracteriacutesticas
propias de cada cepa (Hubaacutelek 2003) las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector
Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la
viabilidad los organismos conservados por este meacutetodo sobreviven largos periacuteodos por la
reduccioacuten marcada de su ritmo metaboacutelico incluso por maacutes de 30 antildeos (Gonzaacuteles et al 2006) lo
cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector
como elemento de falla en la conservacioacuten de la cepa perdida
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una uacutenica
liacutenea celular por tanto las caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificacioacuten preliminar Sin embargo estos mismos autores
sentildealan que estas caracteriacutesticas no son uacutenicas ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares como sucedioacute con CM-CR007 y 010 por ello fue preciso observar las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas microscoacutepicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquiacutemicas) de las cepas pero dada la simplicidad de las descripciones microscoacutepicas de
Rodriacuteguez (2013) no se tuvo como principal referencia de identidad Aunque la morfologiacutea de la
colonia depende considerablemente de la composicioacuten del medio de cultivo y las condiciones de
incubacioacuten cuando eacutestas son controladas suelen ser invariables teniendo por lo general un valor
diferencial considerable (Diacuteaz 2009) por lo tanto se tomaron estas caracteriacutesticas como las
principales para la evaluacioacuten de los indicadores de estabilidad morfoloacutegica y pureza
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que ldquolos medios soacutelidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamientordquo (paacuteg 2) Sin embargo se observaron
algunas variaciones las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio Esto se
observoacute maacutes en las cepas CM-CR007 y 010 que al revisar los datos de Martiacutenez amp Mayorga (2013)
y Rodriacuteguez (2013) estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio huacutemedo
tendiacutean a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican Loacutepez T amp Torres (2006)
en bacterias moacuteviles en tanto que sin niveles altos de humedad las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en funcioacuten del tiempo (envejecimiento de la colonia) Esto derivoacute en la
observacioacuten y descripcioacuten de caracteriacutesticas macroscoacutepicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad como son descritas en las Tablas 8 9 10 11 y 12 para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) diacuteas que duroacute la prueba de estabilidad
natural se observoacute que en general de los tres lioprotectores los resultados maacutes bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones Esto tiene su explicacioacuten en las propiedades reductoras
que poseen los monosacaacuteridos ya que como lo menciona Cox C S (citado por Hensel 1994) los
efectos letales de la desecacioacuten se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteiacutenas
de la membrana celular y azuacutecares reductores que aumentan conforme avanza la deshidratacioacuten
(glicacioacuten) si las proteiacutenas de membrana integrales o citosoacutelicas se ven dantildeadas de forma
irreversible durante el secado tendriacutea un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al 1995)
impidiendo la reconstitucioacuten de forma adecuada de las bacterias y por ende generando muerte
celular Sin embargo las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta especialmente en la concentracioacuten maacutes baja incluso para CM-CR007 la glucosa al 10 se
erige como el segundo mejor protector Es probable que estas dos cepas presenten una
configuracioacuten diferente de sus proteiacutenas de membrana que impida la reaccioacuten amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra que proteja a las proteiacutenas de membrana o
citosoacutelicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteiacutenas)
Es conocido que en general los disacaacuteridos mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan Herman White amp Vesey
2006) esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13
A diferencia de la glucosa la sacarosa es un azuacutecar no reductor estos pueden proteger las
ceacutelulas al competir por la unioacuten en la membrana con los azucares reductores (Hensel 1994) Se ha
demostrado que la sacarosa mantiene las proteiacutenas secas igual que en sus conformaciones
hidratadas Leslie et al (1995) indican que este fenoacutemeno sucede probablemente ldquomediante la
unioacuten a los dominios hidroacutefilos de las proteiacutenas y la prevencioacuten de enlaces de hidroacutegeno inter e
intra proteiacutenas durante el secado y la reconstitucioacutenrdquo (paacuteg 3596) lo cual contribuye a las altas tasas
de supervivencia al usar este lioprotector
Para que un protector funcione eacuteste debe proteger la bicapa lipiacutedica y para ello debe existir
dentro y fuera de las ceacutelulas (Leslie et al 1995 Palmfeldt et al 2003) el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transicioacuten de
membrana ya que en eacutesta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentracioacuten (Leslie et al 1995) reemplazando el agua intracelular lo cual se conoce como la
hipoacutetesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al 2003) Si esto se cumple la concentracioacuten
intracelular seraacute alta y el tiempo antes de la congelacioacuten y el secado debe ser corto por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequentildeo (Leslie et al 1995) y los productos polares
extracelulares seraacuten miacutenimos
Ademaacutes tanto la glucosa y la sacarosa estaacuten dentro de la categoriacutea de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo este estado viacutetreo ldquoInduce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una ceacutelula para detener la movilidad
molecular a un miacutenimo El vidrio amorfo inerte tambieacuten es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las ceacutelulas dentro de la estructura de vidrio antes de la congelacioacuten lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquiacutemicos irreversibles en la
membrana plasmaacutetica durante el almacenamientordquo (Morgan et al 2006 paacuteg 186)
51
La retencioacuten de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilizacioacuten
como en la criopreservacioacuten
Cabe mencionar que el proceso de deshidratacioacuten y de reemplazo de agua intracelular por
parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un liacutemite ya que como lo
menciona Heckly (citado por Perry 1995) al congelarse el agua del medio las ceacutelulas sufren
deshidratacioacuten reduciendo el punto de congelacioacuten en el interior y evitando la formacioacuten de
cristales de hielo pero al seguir bajando la temperatura las concentraciones de solutos aumentan
Perry (1995) cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelacioacuten estaacuten posiblemente
asociados a estas soluciones excesivamente concentradas puesto que no se han encontrado
evidencias de lesiones mecaacutenicas por hielo extracelular Esto corresponderiacutea con los resultados
obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores como lo fue la glucosa al 27 en casi
todas las cepas (exceptuando CM-CR006 Figura 10) recordando que un protector funciona mejor
en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmoacutetico con el interior de las bacterias (conocer
la concentracioacuten intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilizacioacuten
por parte de eacuteste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo como se muestra en el
trabajo de Palmfeldt et al (2003)
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta un ejemplo claro es la cepa CM-CR004 la cual de hecho ante los
gluacutecidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentoacute resultados aceptables Morgan et al
(2006) mencionan (teniendo como referencia la investigacioacuten de Buitink et al) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteiacutenas presentes en esta sustancia son
maacutes estables y juegan un importante papel en la formacioacuten del estado viacutetreo lo cual induce a pensar
que una oacuteptima mezcla de proteiacutenas y azucares permite una proteccioacuten maacutes eficiente Esta
posibilidad corresponderiacutea a los resultados obtenidos donde la concentracioacuten de los componentes
de la leche descremada seriacutean propicios para la cepa CM-CR004 en tanto que para las demaacutes cepas
seriacutean maacutes bajas o maacutes altas de lo propicio Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de gluacutecidos y proteiacutenas que la componen pero no
establece cuales son estos pudiendo ser positivos o negativos para la liofilizacioacuten
En general los cultivos liacutequidos ofrecen un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables (Ops
Diagnostics 2015) sin embargo la viabilidad depende muacuteltiples factores incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos El medio SMPG estaacute disentildeado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse raacutepidamente la fuente de carbono (glucosa) una bacteria
de raacutepido crecimiento entraraacute en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio una
de lento crecimiento al cabo del mismo tiempo estaraacute en fase log no obstante en el medio SPC
los nutrientes tardan maacutes tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas todas las bacterias
estaraacuten en fase log Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de raacutepido crecimiento mientras que
CM-CR004 006 y 009 son de crecimiento un poco maacutes lento (datos obtenidos del conteo con
caacutemara de Neubauer no incluidos en el presente estudio)
Morgan et al 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisioloacutegicos
en las bacterias relacionado generalmente con la privacioacuten de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles desencadenando una respuesta ante el estreacutes para permitir la
supervivencia de la poblacioacuten celular Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecacioacuten y las temperaturas menos propicias para su crecimiento por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilizacioacuten Sin embargo la
fase de crecimiento oacuteptima para la supervivencia en la desecacioacuten es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al 2006 paacuteg 185) Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14 indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
liacutequido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log asiacute mismo las cepas CM-CR004 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria pudiendo ser mayor o menor
En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilizacioacuten definitiva se observoacute puffing
y pitting y si bien Vemulapalli et al (2015) indican que estos cambios no afectan la calidad del
producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada Jennings (2008) advierte que su
presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada y que esta puede
deberse a un sistema con composicioacuten diferente de la formulacioacuten principal y podriacutea conducir a
interacciones tales como la agregacioacuten de proteiacutenas ademaacutes se observoacute (Figura 15 izquierda y
centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulacioacuten inicial de glucosa y
sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16) ldquodebido a una accioacuten combinada de la fusioacuten
(maacutes o menos importante) y de la presioacuten reducida dando lugar al puffingrdquo (Ticoacute G 1987 paacuteg
70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings 2008) seguacuten la cantidad del
material afectado por el puffing Esta caracteriacutestica se asocia con un error en los paraacutemetros de
liofilizacioacuten por ello se revisoacute exhaustivamente el proceso de liofilizacioacuten encontrando que los
liofilizados alcanzaron la temperatura de fusioacuten durante el proceso de secado primario por la
inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador el cual no habiacutea sido descrito en el
proceso piloto de liofilizacioacuten con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del
control de calidad A causa de esto los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los
uacutenicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha)
Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura
a los -32 y -42 degC asiacute como un melting inicial a -32degC y -42degC respectivamente seguacuten lo reporta
Moreira Gutieacuterrez amp Delgado (1994) Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento
del liofilizador
Las Tablas 15 y 16 que resumen las caracteriacutesticas tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados muestran que el color textura brillo y fractura de viales estaacuten dentro de los
paraacutemetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilizacioacuten correcta
con las formulaciones utilizadas no obstante se detectaron variaciones posliofilizacioacuten
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales Inicialmente se pensoacute
en una falla durante el tiempo de almacenamiento dado que los liofilizados maacutes afectados fueron
de las series B y C sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada se determinoacute que la causa de fallo yaciacutea en la
obtencioacuten de humedad por parte del producto liofilizado La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vaciacuteo absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vaciacuteo estos habiacutean absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilizacioacuten esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscoacutepica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad maacutes bajo que la sacarosa) debido a la
53
ldquofacilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidroacutegeno con el aguardquo (Badui
Dergal 2006 paacuteg 73) ldquoPara reducir el nuacutemero de moleacuteculas de agua el proceso de liofilizacioacuten y
el sellado de los viales al vaciacuteo debe haber sido exitoso y asiacute obtener un producto con el contenido
de humedad deseadordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 78) por lo cual se descarta la utilizacioacuten del
instrumento manifold para la liofilizacioacuten cepas en el Banco Geneacutetico
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilizacioacuten siempre deben ser
de vidrio ya que el vapor de agua atmosfeacuterico se puede difundir a traveacutes de los tubos de plaacutestico y
por ende las muestras secas terminariacutean absorbiendo agua Esto se comproboacute con la utilizacioacuten de
crioviales que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vaciacuteo sino que ademaacutes en
la serie C casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dantildeados presentaban
cambios de coloracioacuten (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloracioacuten
oscura como lo muestra la Tabla 15) o una marcada reduccioacuten en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentracioacuten) Esto tambieacuten se ve correlacionado con la peacuterdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008) la
humedad es la principal responsable en la peacuterdida de viabilidad en el producto liofilizado
reduciendo la vida uacutetil de los organismos La obtencioacuten de agua implica un retroceso del proceso
de liofilizacioacuten el dantildeo de la matriz formada el flujo de los residuos extracelulares polares es
decir la reactivacioacuten del organismo ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquiacutemica el metabolismo (Adams 2007) finalmente la muerte celular al agotarse esta
El tiempo de redisolucioacuten y el tipo de reconstituyente tambieacuten es de gran importancia La
Tabla 17 muestra tiempos de redisolucioacuten bastante altos para las formulaciones de glucosa Con
los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisioacuten del proceso de liofilizacioacuten se determinoacute la
retrofusioacuten producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de
redisolucioacuten causando un efecto grave donde la interaccioacuten entre las moleacuteculas es tal que la matriz
del liofilizado es casi insoluble (Jennings 2008) El aumento de la temperatura demasiado raacutepido
en el proceso de la liofilizacioacuten o por encima de Tg resultoacute en el colapso haciendo la
reconstitucioacuten mucho maacutes difiacutecil (Fetterolf 2010) Jennings (2008) indica que un aumento en el
aacuterea superficial por unidad de volumen de la torta tenderaacute a disminuir el tiempo de reconstitucioacuten
lo cual sucedioacute para todos los liofilizados que presentaron melting puffing y pitting ya que su
volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulacioacuten congelada solo los
liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulacioacuten
congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitucioacuten
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed amp Roos (2004) quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo se sugiere en muacuteltiples estudios
ademaacutes el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4degC plusmn 1degC en la
oscuridad (Ops Diagnostics 2015)
Se siguioacute los procedimientos de documentacioacuten establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
para la criopreservacioacuten y la elaboracioacuten de los nuevos protocolos de liofilizacioacuten encontrando
como lo menciona Gonzaacuteles et al (2006) que es necesario contar con sistemas de documentacioacuten
eficiente ademaacutes contar con duplicados de la informacioacuten en medios fiacutesicos y magneacuteticos evitado
la perdida de informacioacuten (Montes de Oca et al 2008) y el raacutepido acceso a la misma
54
7 CONCLUSIONES
En general el estado de criopreservacioacuten de las cepas evaluadas es oacuteptimo obteniendo tasas
de supervivencia satisfactorias Sin embargo el criopreservante no funciona de igual forma para
todas las cepas debido a las caracteriacutesticas propias de cada organismo que limitan la accioacuten del
glicerol
De acuerdo a la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten realizada con los tres indicadores
(viabilidad pureza y estabilidad morfoloacutegica) la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados siendo la concentracioacuten al 10pv la maacutes oacuteptima No obstante su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado hermeacuteticamente y al vaciacuteo El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada aunque no se determinoacute la concentracioacuten maacutes oacuteptima
En cuanto a la glucosa al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo se observa
que pese a no ser un buen lioprotector concentraciones de glucosa entre el 6 y el 10 pv son
funcionales aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50
No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten estos
fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminacioacuten de las muestras y a su
vez evitar la contaminacioacuten por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso
Se creoacute el protocolo para el proceso de liofilizacioacuten en todas sus etapas Este es
metodoloacutegicamente funcional y faacutecilmente reproducible por ello se estandariza para el Banco
Geneacutetico seccioacuten liofilizacioacuten dentro del nuevo manual de procedimientos de conservacioacuten Se
incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservacioacuten dentro de este
manual ajustado a las necesidades especiacuteficas de seguridad de la liofilizacioacuten
Es importante mantener actualizado los diferentes medios fiacutesicos y magneacuteticos donde reposa
la informacioacuten de las colecciones y los microorganismos en ellos dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Geneacutetico y la informacioacuten se puede perder
La falta de la identificacioacuten hasta cepa (al menos hasta geacutenero) de los microorganismos
presentes en el banco geneacutetico limita la informacioacuten para entender los fenoacutemenos relacionados a
los procesos de conservacioacuten y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo
55
8 RECOMENDACIONES
Existen paraacutemetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente como la edad del cultivo la
concentracioacuten celular entre otros Se propone el estudio de los paraacutemetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilizacioacuten con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos por ello se sugiere la creacioacuten
de un modelo matemaacutetico para que sea funcional esta prueba lo cual generariacutea datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo
Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinacioacuten de lioprotectores con formadores
de matrices y estabilizantes siguiendo los protocolos establecidos Mezclas de sacarosa al 10 pv
con leche descremada 10 pv (de la misma marca usada en este estudio) sacarosa al 10 pv con
leche descremada 10 pv y carboacuten activado asiacute como la utilizacioacuten de estas mezclas con trehalosa
en distintas concentraciones son sugeridas
Es necesaria la creacioacuten de una plataforma online del banco geneacutetico una vez este cuente con la
identificacioacuten de los organismos contenidos asiacute mismo es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco geneacutetico distinto a Access preferiblemente que obedezca a una
creacioacuten propia de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Es necesaria la creacioacuten de una pasantiacutea anual para curaduriacutea del Banco Geneacutetico ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepcioacuten de cepas Ademaacutes se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas como aquellas que sean donadas al Banco Geneacutetico en el futuro
56
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62
11 ANEXOS
Anexo 1 Formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-XX00Xa
Descripcioacuten Fotografiacutea
Borde o Margen
Frente a luz Brillanteopaca
Forma
Elevacioacuten
Color
Tamantildeo
Superficie
Consistencia
Grado de
Transparencia
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis
Pigmentos que desprende la colonia
y se observan sobre el medio
Olor
Hemolisis
MedioT(degC)
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen
un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace
la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad
del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos
Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen
Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta
Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
63
Anexo 2 Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados
a) Recubrimiento (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido cartoacuten y autoadhesivo de
emulsioacuten acuosa
b) Bandeja de liofilizados
c) Soporte para bandeja
d) Cojiacuten de siacutelice gel (reemplazo seguacuten el tamantildeo y cantidad de cojines de 2 meses a 1 antildeo)
El banco de liofilizados estaacute dividido en tres secciones
La seccioacuten de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A B y C respectivamente
La seccioacuten de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D E y F respectivamente
La seccioacuten de hongos (color cafeacute) correspondiente a las bandejas G H e I respectivamente
64
Bandeja de liofilizados
Estaacute hecha de poliestireno expandido viene con 100 compartimientos individuales para un maacuteximo
de 100 viales por bandeja
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
10 20
30 40
50 60
70
80
90 100
01
11 21
31
41
51
61 71
81
91
65
Anexo 3 Esquema general del cepario madre de liofilizados
J Hongos
K Bacterias
L Algas
F Fila
Nuacutemeros compartimento correspondiente a cada vial La numeracioacuten va en zigzag
J K L
F1 F1 F1 F2 F2 F2 F3 F3 F3
1
8 8 8
9 9 9 1 1
16 16 16 24 24 24
17 17 17
66
Anexo 4 Caacutemara de envejecimiento artesanal
Esta caacutemara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y
humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra La humedad relativa
puede controlarse seguacuten si se use agua (100) o una concentracioacuten determinada de solucioacuten salina
ver Colmenares R (2015)
Horno de 37degC (caacutemara externa)
Caacutemara
interna
Termoacutemetro
Tapa de sello
hermeacutetico
Malla de
soporte
Viales
Agua o sn salina
67
Anexo 5 Base de datos en Access
Esquema general de la Base de datos del Banco Geneacutetico
Espacio de trabajo con las tablas
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
informacioacuten
maacutes detallada)
68
Anexo 6 Formato de las Fichas Resumen
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FICHA RESUMEN DE LA COLECCIOacuteN
Ubicacioacuten de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Fuente de obtencioacuten
de las cepas
Fecha de
ingreso
Cantidad de cepas Tipo de organismos
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa)
Ubicacioacuten de cepas (seguacuten todos los meacutetodos
de conservacioacuten utilizados para la coleccioacuten)
Autores o donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos y Formatos de control
69
Anexo 7 Formatos de control de la seccioacuten liofilizacioacuten
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
Lugar (Ciudad y Paiacutes) Fecha de ingreso
Origen de
la cepa
Institucioacuten Organizacioacuten o
Empresa donante
Persona que realizoacute el
aislamiento
Cargo Fecha de
aislamiento
Informacioacuten de contacto
Fuente de obtencioacuten
de la cepa
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Identificacioacuten geneacutetica
de la cepa
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Calidad de la
cepa recibida
Restriccioacuten de
distribucioacuten
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Observaciones Nivel de
Bioseguridad
N1 N2 N3 N4
Persona donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
70
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL
FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN
CM-_ _0_ _
Proceso
Fecha Hora
Ciudad Equipo
Lioprotector y
concentracioacuten
Temperatura (degC)
Presioacuten (mbar)
Duracioacuten (min) Accesorio de
secado
Responsable (s) del proceso
Ubicacioacuten
Coacutedigo de la
cepa
Nombre de
la coleccioacuten
Viales
almacenados
Tipo S T Lf Total Sello al vaciacuteo SI NO
Cantidad Sello de Aluminio SI NO
Pruebas de
Viabilidad
Caracterizacioacuten
macroscoacutepica (resumen)
Caracterizacioacuten
microscoacutepica (resumen)
Concentracioacuten celular
(UCF)
Preliofilizacioacuten
Posliofilizacioacuten
Bioquiacutemicas
Otras
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
71
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS
CEPAS
CM-_ _0_ _
Detalles del
Proceso
Fecha Ciudad
Hora Coacutedigo de cepa
Viales a evaluar T S Lf Temperatura (degC)
Viales en mal estado T S Lf Presioacuten (Mbar)
Fecha de liofilizacioacuten Fecha de evaluacioacuten Total tiempo (meses)
Descripcioacuten
de la cepa
Geacutenero-especie del
microorganismo
Nombre de la
Coleccioacuten
Car
acte
riza
cioacuten
Microscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Microscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Observaciones
Viabilidad Concentracioacuten Celular
(UFC) Preliofilizacioacuten
Concentracioacuten Celular
(UFC) Posliofilizacioacuten
Observaciones
Control
de
Calidad
Bioquiacutemicas
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Pruebas
Cristal
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Otras Pruebas Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Observaciones
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
72
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD
DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS
CM-_ _0_ _
Lugar (Ciudad Paiacutes) Fecha
Informacioacuten
del
solicitante
Institucioacuten Organizacioacuten
o Empresa
Solicitante Cargo
Teleacutefono (s) Email
Descripcioacuten
de la cepa
Coacutedigo de
cepa
Geacutenero ndash especie
Microorganismo
Coleccioacuten
Utilizacioacuten de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
73
Anexo 8 Manual de procedimientos de conservacioacuten para el Banco Geneacutetico del Laboratorio
de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (Ver archivo adjunto)
Manual de procedimientos de
conservacioacuten para el Banco
Geneacutetico del Laboratorio de
Microbiologiacutea Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute
de Caldas
Primera Edicioacuten
Editado por
Andreacutes V Castantildeeda R
Manual de procedimientos de conservacioacuten para el
Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Ingenieriacutea Sanitaria
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
Licenciado en Biologiacutea
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales
Niria Pastora Bonza Peacuterez
Docente encargado del Laboratorio de Microbiologiacutea y
coordinador de Ingenieriacutea Sanitaria
Miguel Aacutengel Piragauta Aguilar
Disentildeo y diagramacioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
avicent29gmailcom
Autoriacutea y Edicioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda R
2015
Todos los derechos reservados
TABLA DE CONTENIDO
TIacuteTULO PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
RECEPCIOacuteN DE CEPAS 2
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS 3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES 5
Medios 5
Reactivos 6
Protectores generales 6
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN 7
Indicador uno Viabilidad 7
Conteo directo con caacutemara de neubauer (110mm) 7
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa 10
Indicador dos Estabilidad morfoloacutegica 12
Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) 12
Tincioacuten de gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) 13
Indicador tres Pureza de la cepa 13
RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS 14
Criopreservados (descongelamiento) 14
Liofilizados (rehidratacioacuten o reconstitucioacuten) 14
REFRIGERACIOacuteN 15
CRIOPRESERVACIOacuteN 16
Precriopreservacioacuten 16
Preparacioacuten del inoculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 16
LIOFILIZACIOacuteN 17
Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano 17
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 17
IV
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Posliofilizacioacuten 18
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos 18
ROacuteTULOS 19
Refrigeracioacuten 19
Criopreservacioacuten 19
Liofilizacioacuten 20
TIacuteTULO 2 PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONSERVACIOacuteN Y EN EL LABORATORIO
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN 23
Medios 23
Ambiente 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores 23
Cabina de flujo laminar 23
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 24
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS 24
Desechos no contaminados (no infecciosos) 24
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en
autoclave y reutilizado 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado 25
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa 25
BIOSEGURIDAD 26
Proteccioacuten personal 26
Procedimientos 27
Aacutereas de trabajo 27
Capacitaciones 27
REFERENCIAS 28
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dilucioacuten en serie 7 Figura 2 Conteo directo 8 Figura 3 Conteo en bacterias 8 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky 10 Figura 5 Contador de colonias 11 Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados 19 Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer 19 Figura 8 Roacutetulos para los crioviales 19 Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso 4 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG 5 Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos 5 Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos 6 Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer 9 Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 21
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIacuteMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL
kPa Kilo pascales
min Minutos
s Segundos
microl microlitros
mm miliacutemetros
degC grados Celsius
pv porcentaje peso a volumen
mTorr militorricelli
mbar milibar
g gramos
ml mililitros
UCF Unidades formadoras de colonias
rpm Revoluciones por minuto
vv Porcentaje volumen a volumen
iexclPrecaucioacuten
iexclA tener en cuenta
VI
INTRODUCCIOacuteN
Este manual representa en conjunto el trabajo a traveacutes del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigacioacuten han sentado los pilares para la formacioacuten del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC ) cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservacioacuten y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigacioacuten que permita a la comunidad acadeacutemica de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbioloacutegicos en las aacutereas de biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnoloacutegica para el paiacutes Aquiacute se presentan los tres meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos aplicados en este Banco Geneacutetico Refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten Se hace eacutenfasis en los diferentes procesos materiales equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Geneacutetico
Protocolos para la
conservacioacuten de
microorganismos
2
RECEPCIOacuteN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco geneacutetico debe contar con las siguientes condiciones miacutenimas de recepcioacuten
La cepa se debe encontrar en estado de pureza Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Geneacutetico
biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnologiacutea Debe contar con un responsable entidad o institucioacuten donante que respalde
la(s) cepa(s) entregadas ademaacutes de contar con la informacioacuten de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad
La cepa o coleccioacuten debe contar con toda la informacioacuten que el Banco
geneacutetico requiera para su mantenimiento conservacioacuten y registro en la base de datos
La cepa o coleccioacuten debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles
de Bioseguridad establecidos por la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) siendo el nivel de bioseguridad 2 el maacuteximo permitido por las instalaciones del laboratorio con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo
Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado
investigaciones entre otras) se debe pasar con 15 diacuteas de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS al docente encargado
Una vez recibida la cepa se diligencian los mismos registros en digital se
anexa la informacioacuten a la base de datos asignaacutendole un coacutedigo y se diligencian las fichas de resumen
3
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS El personal encargado del Banco Geneacutetico debe realizar una verificacioacuten de la
pureza de la cepa esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada sobre una o maacutes cajas de Petri con el medio de cultivo el tiempo y temperatura de incubacioacuten especificados por quien hace la donacioacuten Asiacute mismo a partir de este subcultivo se debe realizar la evaluacioacuten de la efica-cia del meacutetodo de conservacioacuten para verificar la informacioacuten dada por el investi-gador donante
Posterior al proceso de recepcioacuten de cepas es importante tener en cuenta
que se debe verificar la fecha de la uacuteltima siembra para determinar si es apro-piado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder despueacutes al proceso de criopreservacioacuten o liofilizacioacuten
Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las
cepas por maacutes de dos meses antes de la criopreservacioacuten o la liofilizacioacuten se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservaacutendola por el meacutetodo de refrigeracioacuten con el fin de evitar que la cepa se pierda
Si se requieren hacer pruebas bioquiacutemicas pruebas cristal u otras pruebas
complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos se tendraacute que pedir la autorizacioacuten del responsable del Banco Ge-neacutetico y del encargado del laboratorio debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposicioacuten de material en el laboratorio
Nota Si alguna cepa llegara a presentar contaminacioacuten se debe informar a la persona responsable del Banco Geneacutetico y posteriormente a la persona entidad o institucioacuten donante
4
EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservacioacuten
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso
Proceso o meacutetodo Equipo Material
Refrigeracioacuten Nevera Thermolab 14-E0107 Tubo de ensayo tapa rosca
Cabina de flujo laminar Asa redonda
Esterilizador de asas
Criopreservacioacuten
Cabina de flujo laminar Crioviales Voacutertex Puntas azules Micropipeta graduable de 100-1000 microl
Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la coleccioacuten
Frascos Schott con tapa para el glicerol
Pipeteador Pipeta de 1ml o 5ml
Liofilizacioacuten
Esterilizador de asas Asa redonda
Voacutertex Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Cabina de flujo laminar Puntas azules y amarillas Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile
Recipiente de poliestireno expandido cerrado
Crimper Sello de aluminio Micropipetas graduables de 100-1000microl y 20-200microl
Pinzas Vial 5mm con tapoacuten de divisioacuten
Evaluacioacuten del
meacutetodo de
conservacioacuten
Caacutemara de Neubauer 110mm Laminilla de cuarzo
Caacutemara AxioCam ICc5 Laminas porta objetos
Microscopio Axio Scope A1 Laminillas cubre objetos
Contador de colonias CC-1 Marcador
Estereoscopio Zeiss Asa redonda
Incubadora de 25degy 37degC Asa de Drigalsky
Micropipeta graduable 100-1000microl 20-200microl y 5-20microl
Puntas azules amarillas y blancas
Voacutertex Goteros
Recuperacioacuten de
los
microorganismos
Micropipeta graduable 100-1000microl y 20-200microl
Puntas azules y amarillas
Tubos de ensayo
Cabina de flujo laminar Cajas de Petri con medio
Plancha de calentamiento Mechero
Demaacutes equipos y materiales utilizados en la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten
Beaker
Termoacutemetro
Cajas de Petri con medio
Tubos de ensayo
-Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiologiacutea
5
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Geneacutetico cuenta con medios reactivos y protectores generales definidos para los meacutetodos de preservacioacuten manutencioacuten y recuperacioacuten de microrganismos Estos se describen a continuacioacuten y se clasifican de acuerdo al meacutetodo de conservacioacuten en la Tabla 4
Medios CALDO SMPG Este medio es empleado para el crecimiento del inoacuteculo inicial y
en la formulacioacuten de la criopreservacioacuten Su composicioacuten se muestra en las Tablas 2 y 3 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG
Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos
SPC (Standard Plate Count) Este medio se utiliza para la teacutecnica de evaluacioacuten
de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Tambieacuten puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas
Agar nutritivo (AN) o medios especiacuteficos Utilizados como medio de
mantenimiento o para pruebas bioquiacutemicas yo fisicoquiacutemicas (si se realizan) en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Buffer agua peptonada Este medio se utiliza en la rehidratacioacuten y en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 76
Microelementos 076
Peptona 1
Glucosa 01
MACROELEMENTOS Cantidad MICROELEMENTOS Cantidad
MgSO4 2 g CuSO4- 5H2O 005 g
NaNO3 2 g H3BO3 01 g
KCl 015 g MnSO4 ndash H2O 01 g
CaCl2 21 g ZnSO4 ndash 7H2O 01 g
Na2HPO4 09 g Agua destilada 1000 ml
FeSO47H2O 001 g
Agua destilada 1000 ml
6
Reactivos Tincioacuten Gram La bateriacutea de reactivos para la Tincioacuten de Gram se utiliza en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Alcohol acetona Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo Agua destilada Se utiliza en todos los procedimientos para la preparacioacuten de
medios la descongelacioacuten y especialmente en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Alcohol Para desinfeccioacuten en todos los procedimientos (70) o para mecheros (95)
Aceite de inmersioacuten Se utiliza para la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten durante las observaciones microscoacutepicas
Nitroacutegeno Liacutequido Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilizacioacuten
Protectores generales Crioprotector Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservacioacuten en
proporcioacuten 67vv respecto al criovial Lioprotector Se utiliza una solucioacuten de Sacarosa 10 pv para las
formulaciones en la liofilizacioacuten bacteriana En hongos se utiliza leche descremada al 12 pv No se tiene detalles de lioprotector oacuteptimo en algas
Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos
Nota Dado que en la refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se realiza la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten se incluyen aquiacute los reactivos implicados en dicha evaluacioacuten
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten Liofilizacioacuten R
eacti
vos
Tincioacuten Gram SI SI SI
Alcohol acetona SI SI SI
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de inmersioacuten
SI SI SI
Nitroacutegeno Liacutequido NO NO SI
Me
dio
s
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios especiacuteficos
OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
Agua peptonada SI SI SI
Pro
tecto
r
Glicerol anhidro NO SI NO
Sacarosa 10pv
NO
NO SI
7
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN
Indicador uno Viabilidad Conteo directo con caacutemara de Neubauer (110mm)
Se parte de un tubo de dilucioacuten (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto el cual tiene por lo general un tiempo de incubacioacuten de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo Figura 1 Dilucioacuten en serie Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser esteacuteriles usando una nueva en cada transferencia El diluyente es agua peptonada al 01 pv
Tome la caacutemara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia
Observe las dos cuadriculas de la caacutemara que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H)
Agite el tubo de dilucioacuten seleccionado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s tomando con una micropipeta una aliacutecuota de 10microl y depositaacutendola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla dejando que se cargue por capilaridad de forma homogeacutenea (Figura 2-A) Posteriormente lleve al microscopio enfocando desde el menor aumento hasta eacutel objetivo 40x al tiempo que ajusta la intensidad lumiacutenica para poder observar las liacuteneas de la caacutemara y las ceacutelulas al tiempo
-Algunos modelos de Voacutertex no poseen un rango de velocidad sino de niveles -Para limpiar la caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo lave primero con agua destilada luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada Deje secar al ambiente -Para una correcta observacioacuten al microscopio utilice el meacutetodo de enfoque de Koumlhler -Procure no limpiar la laminilla con ninguacuten papel o pantildeo lo puede rayar -Este procedimiento debe durar maacuteximo 10min ya que la solucioacuten podriacutea secarse debido a la luz del microscopio
8
Figura 2 Conteo directo A Utilizacioacuten de la caacutemara de Neubauer 1 posicioacuten de la laminilla 2 posicioacuten de la punta para el deposito de la muestra B esquema general de la caacutemara de Neubauer Adaptado de Bastidas (2015) httpwwwceleromicscomesresourcesdocsArticlesFormula-Camara-Neubauer-Concentracionpdf amp Universitat de Barcelona (2015) httpwwwubeduLabFisioimagesstoriesFisAnimalBiologiaSangrecontadorTomapng
El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central Las foacutermulas y los cuadros a contar se determinan seguacuten el tamantildeo del microorganismo
Hongos y microalgas Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes
(cuadros 1 y cuadro central Figura 2-B) de izquierda a derecha Bacterias Cuente en el cuadro central que contiene 25 cuadros secundarios
(Figura 2-B) 5 de ellos (Figura 3-A o B) Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios en estos las ceacutelulas deben contarse en la direccioacuten que se indica en la Figura 3-C Los cuadros terciarios contienen tres liacuteneas en los extremos por ello se deben tener en cuenta las ceacutelulas que esteacuten desde la liacutenea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D
Figura 3 Conteo en bacterias A y B Forma de contar los cuadros terciarios C Direccioacuten de conteo en los cuadros terciarios D Ceacutelulas a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios
9
Es importante resaltar que las bacterias que esteacuten unidas se contaraacuten como una Una vez obtenido el nuacutemero total de ceacutelulas se realizaran los caacutelculos correspondientes a los cuadros utilizados Para obtener el nuacutemero de bacterias se utiliza la ecuacioacuten planteada a partir de Bastidas (2015) Ndeg de bacteriasml=
En el caso de hongos y microalgas se utiliza la siguiente ecuacioacuten a partir de Bastidas (2015) Ndeg de ceacutelulasml= Fd Factor de dilucioacuten = Nota El meacutetodo de conteo en caacutemara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de ceacutelulas en los procedimientos de conservacioacuten de microorganismos Pero si se requiere la utilizacioacuten de otro meacutetodo se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados
Consideremos el siguiente ejemplo Tenemos un tubo con cultivo en medio liacutequido (10ml) de 36 horas este seraacute
nuestra muestra inicial Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con aliacutecuotas de 1ml en 9ml de diluyente Se realiza el procedimiento descrito en las paacuteginas anteriores haciendo un solo conteo Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de aliacutecuota g o ml de aliacutecuota + g o ml de diluyente
Ndeg Total de ceacutelulas contadas times 10000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
-El conteo directo con caacutemara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al meacutetodo de conservacioacuten evaluado
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
10
Aplicando la ecuacioacuten para bacterias anteriormente mostrada tenemos que
Ndeg de bacteriasml=
= 81012 bacteriasml
81012 bacteriasml seraacute la cantidad de bacterias que ldquoexistenrdquo en la muestra inicial Esta en teacuterminos matemaacuteticos de las diluciones equivale a 100
Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas contando en los
cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuacioacuten tenemos que Ndeg de ceacutelulasml= = 321011 ceacutelulasml
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Seleccione tres tubos de la dilucioacuten seriada y de cada uno vierta aliacutecuotas de 100microl (agitando con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) antes de cada extraccioacuten) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio Raacutepidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky esteacuteril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky A La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atraacutes B Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro luego girar 90deg la caja y repetir el proceso
A B
90deg
16 times 250000
10-7 times 5
-Si se quieren datos maacutes fiables se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma aliacutecuota o poner en la caacutemara cinco aliacutecuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras -Al realizar el conteo en la caacutemara de Neubauer obtenemos el total aproximado de ceacutelulas presentes en la dilucioacuten utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado yo las impurezas que pueda contener la muestra por lo cual no es 100 exacto y no indica las ceacutelulas viables
16 times 10000 10-7 times 5
11
Deje secar por miacutenimo 15min y lleve a incubacioacuten en posicioacuten invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja) Seguacuten el tipo de organismo las condiciones de incubacioacuten para la lectura de las cajas son
Bacterias temperatura ambiente 37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento
si se conoce Incubacioacuten de 18-24 horas Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas Casos extremos de crecimiento lento una semana
Hongos temperatura inferior a 25degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten de una siembra de solucioacuten de conidios de 4-8 diacuteas
Algas temperatura entre 25-37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten por maacuteximo 7 diacuteas en organismos descongelados o rehidratados
Luego de la incubacioacuten las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura
5) Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFCml)
Figura 5 Contador de colonias La caja de Petri se coloca en posicioacuten invertida y se marcan las colinas el contador cuenta al tacto
-La siembra por tubo se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador -Generalmente se toman las diluciones 10-5 10-6 y 10-7 Sin embargo si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3 10-4 y 10-5 -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70 flamear esperar a que el alcohol se consuma Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar por uacuteltimo palpe raacutepida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender para enfriar totalmente -Puede usarse una siembra en profundidad u otro meacutetodo para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie Sin embargo los demaacutes meacutetodos de conteo limitan la evaluacioacuten del indicador dos -Si al cabo de 30min las cajas no han secado el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condicioacuten -Con la punta de la micropipeta no toque el medio -Siempre use guantes y desinfeacutectelos constantemente durante los procedimientos
12
En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250 al suponer que cada ceacutelula forma una colonia Para el caacutelculo de UFCml utilizamos una adaptacioacuten de la foacutermula de Valencia Z(2004)
UFCml = times times
Ejemplo 120 X 107 X 10 = 121010 UFCml
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten se calcula a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010) Tasa de supervivencia (BSR )=
Donde DD Despueacutes de la desecacioacuten AD Antes de la desecacioacuten
Indicador dos Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realiza Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas)
Diligenciar el formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas (anexo 1) descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de ldquoconteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Hay que tener en cuenta que
- Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas) de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas deben ser observadas en al menos el 80 de las colonias de la placa seleccionada
Ndeg de colonias (promedio entre las cajas por dilucioacuten)
Inverso del factor de dilucioacuten
Inverso del volumen de aliacutecuota
-La metodologiacutea y los criterios de eleccioacuten de cajas asiacute como el rango son seguidas de Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo todas las placas por dilucioacuten por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -El inverso del volumen de aliacutecuota corresponde a una medida de correccioacuten obligatoria para la siembra en superficie ya que en la praacutectica se aumenta en 110 el factor de dilucioacuten al sembrar 01ml (100microl) del tubo de dilucioacuten seleccionado
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100 Log (Ndeg UFCml AD)
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Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se realice una ldquocoloracioacuten de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005 paacuteg 24) En el caso de hongos realice una coloracioacuten simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado
Por uacuteltimo comparar los resultados con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y
macroscoacutepicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se toma registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio con caacutemara
Indicador tres Pureza de la cepa
Este indicador evaluacutea la pureza de un vialcriovial rehidratadodescongelado ademaacutes permite determinar si existe un cambio geneacutetico durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservacioacuten Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimaacutetica usando una bateriacutea de pruebas bioquiacutemicas o fisicoquiacutemicas diferenciales dependiendo de los requerimientos especiacuteficos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio Se recomienda realizar cada prueba por triplicado Tambieacuten puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales
-Realice una coloracioacuten de Gram estaacutendar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotograacutefico en un lapso no mayor a dos diacuteas -En los hongos es imprescindible el registro fotograacutefico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonoacutemica -El formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas exige un registro fotograacutefico pero alliacute solo se consignan si las fotografiacuteas son de alta calidad de lo contrario solo se dejan en la base de datos como referencia -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos -La estabilidad morfoloacutegica se evaluacutea pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -Para comparar las caracteriacutesticas macroscoacutepicas con la informacioacuten de origen se deben usar los mismos medios El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos
Si se confirma variacioacuten en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen y estas confirman la variacioacuten geneacutetica de la cepa inmediatamente se saca de la coleccioacuten origen se asigna un nuevo coacutedigo de identificacioacuten y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa Puede incluirse en la coleccioacuten Praacutecticas Acadeacutemicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva coleccioacuten
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RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento) Se toma un criovial (Semistock preferiblemente) sometieacutendolo a una
temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente 5min (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Los crioviales se introducen en bantildeo seroloacutegico una vez se llega a la temperatura deseada no antes
Del criovial se toma 1ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex
nivel 7 (asymp2240rpm) por 10s diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
La evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten se realiza al criovial luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubacioacuten (viables poscriopreservacioacuten) Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Geneacutetico
Liofilizados (Rehidratacioacuten o reconstitucioacuten)
Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC los viales a usar tomando el tiempo de rehidratacioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitando con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se toma un 1ml de este vial partiendo de esta aliacutecuota se realiza evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en medio soacutelido El indicador de viabilidad se evaluacutea solo con el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa u otro meacutetodo de conteo de organismos viables
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-dor donante sugiera otros meacutetodos de recuperacioacuten -La solucioacuten de rehidratacioacuten puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solucioacuten lioprotectora de la formulacioacuten -En el momento en que solo quede un criovialvial disponible de la cepa se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservacioacuten a partir de este
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REFRIGERACIOacuteN
Se implementa el meacutetodo de resiembra continua en este el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-Garciacutea et al 2010) cuando es utilizado para su almacenado nuevamente Se debe tener en cuenta los siguientes paraacutemetros
a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las
caracteriacutesticas del microorganismo ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios despueacutes de diacuteas semanas o meses Tambieacuten depende del tipo de medio de mantenimiento
b) El riesgo de contaminacioacuten y de cambios geneacuteticos se incrementa a mayor nuacutemero de transferencias
De acuerdo a esto para el laboratorio se determina
a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo
tapa rosca con Agar inclinado b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo procurando no
realizar maacutes de 4 transferencias c) La temperatura de refrigeracioacuten debe mantenerse en un rango de 4plusmn2degC d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminacioacuten
cruzada teniendo en cuenta la organizacioacuten interna del refrigerador evitando el amontonamiento de las cajas
e) Se utilizaraacute el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
f) Las cepas preservadas por este procedimiento seraacuten utilizadas para requerimientos internos del laboratorio preferiblemente en praacutecticas acadeacutemicas
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CRIOPRESERVACIOacuteN
Precriopreservacioacuten En el interior de la cabina de flujo laminar tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina Posteriormente son llenados con 1200microl de glicerol esteacuteril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados
Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de criopreservacioacuten (Martiacutenez amp Mayorga 2013) se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae una aliacutecuota de 1ml diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02)
Despueacutes agitar el tubo T02 con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s tomando
luego cinco aliacutecuotas de 600microl depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Se rotulan los crioviales y se realiza Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten Inmediatamente despueacutes de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente seguacuten la coleccioacuten a una temperatura de -85degC plusmn 1degC
Por uacuteltimo se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIOacuteN
culminado el proceso
-No use micropipeta para pipetear el glicerol -Todo el material debe ser correctamente esterilizado -Nunca tocar las tapas en el interior -De ser posible se recomienda una concentracioacuten de 10⁸ - 109 celml -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar 20min desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas (si se han determinado celml totales precongelamiento) -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables aumentando el nuacutemero de viables poscongelacioacuten Esto se puede hacer si no se tiene un nuacutemero determinado de ceacutelulas a una temperatura de 4degC plusmn 1degC por 20-30min -Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y poscriopreservacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas
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LIOFILIZACIOacuteN Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano Desde medio soacutelido
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio soacutelido se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general Posteriormente se debe agitar con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Desde medio liacutequido
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra diluyeacutendolo en un tubo con 9ml agua destilada esteacuteril (designado como T04)
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten Desde medio soacutelido
Del tubo T03 como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten y previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 1ml que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Desde medio liacutequido
Del tubo T04 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 100microl depositados en cuatro viales de vidrio En cada vial se adiciona 900microl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapoacuten de divisioacuten
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior de cada vial
sea lo maacutes exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T04 se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparacioacuten
Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado en
tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T04
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Con un volumen total de 1ml cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Los viales (indistintamente si se parte de medio soacutelido o liacutequido) se destapan parcialmente y se congelan en nitroacutegeno liacutequido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ge15min para ser llevados al liofilizador de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
Posliofilizacioacuten Luego del desmonte y sellado al vaciacuteo de los viales cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper posterior al proceso de liofilizacioacuten Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente El tercer vial (Lf) se almacena a 4degC plusmn 1degC en el cepario madre de liofilizados El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 diacuteas realizando evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten para saber si fue o no exitosa la liofilizacioacuten Por uacuteltimo se debe llenar el registro FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN culminado el proceso
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos En cuanto a los hongos el inoacuteculo inicial durante la preliofilizacioacuten se prepara
llenando con 10ml de agua destilada esteacuteril un cultivo soacutelido altamente esporulado del hongo Luego con un asa o espaacutetula esteacuteril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar Esta suspensioacuten es extraiacuteda con una pipeta esteacuteril y depositada en un tubo de ensayo al cual se le agrega 100microl de solucioacuten Tween 80 al 01 esteacuteril para preparar la solucioacuten de esporas Se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 20s y se prosigue de acuerdo a la ejecucioacuten de la liofilizacioacuten desde de un medio liacutequido
-Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y posliofilizacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas -Se debe realizar Voacutertex cada vez que se vaya a extraer una aliacutecuota -Los mejores resultados en la liofilizacioacuten se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas y en caldo SMPG un rango de 24-48h -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir maacutes tiempo del estipulado para su total congelamiento tener este dato de ser posible -El tiempo de liofilizacioacuten variacutea seguacuten la formulacioacuten Para una formulacioacuten con Sacarosa 10 36 horas es lo ideal -Debe usarse el accesorio para liofilizacioacuten Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vaciacuteo y de forma hermeacutetica -Los tapones de divisioacuten deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimacioacuten del agua de lo contrario no seraacute posible la liofilizacioacuten y pueden incluso quebrarse
-Si el raspado contiene rastros grandes de agar se debe realizar un filtrado con gasa esteacuteril aunque esto disminuiraacute el nuacutemero de esporas -Las esporas en solucioacuten pierden viabilidad conforme avanza el tiempo Se sugiere hacer uso de la solucioacuten antes de dos horas de preparada
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ROacuteTULOS
Refrigeracioacuten Dado que la refrigeracioacuten constituye un meacutetodo de corto plazo no se
requieren roacutetulos especiales para este meacutetodo de conservacioacuten Sin embargo es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente informacioacuten con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha
Criopreservacioacuten
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los roacutetulos de coleccioacuten usados en las cajas del Freezer y los roacutetulos para cada cepa criopreservada
Fecha de ingreso__________________________ Medio___________________________________ Cepa____________________________________ Coacutedigo__________________________________
-Es opcional imprimir este roacutetulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta
Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer
Figura 8 Roacutetulos para los crioviales
Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados
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Liofilizacioacuten
Los roacutetulos de la Figura 9 contienen la siguiente informacioacuten Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de
datos el Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo) nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten
de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6) con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada
vial Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
-Los roacutetulos de las cajas del Freezer los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo -Los roacutetulos deben colocarse antes de su almacenamiento especialmente los crioviales ya que una vez congelados el adhesivo no funciona
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Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio (paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
CC en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual moderado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro Existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o indirectamente Normalmente no existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005)
-En la base de datos del Banco Geneacutetico se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos pero el formato y tamantildeo de letra sea igual para todos los roacutetulos -Las etiquetas de liofilizacioacuten y criopreservacioacuten deben imprimirse en papel adhesivo -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos
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Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservacioacuten y en
el laboratorio
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CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121degC y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro meacutetodo de esterilizacioacuten las puntas de micropipetas los viales crioviales y sus respectivas tapas deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas) pueden ser esterilizados en horno a 160degC por 120min
Sin embargo se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de
todo el trabajo desde la preparacioacuten de medios hasta el sellado de viales y crioviales como se describe a continuacioacuten
Medios Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Son indicadores de contaminacioacuten cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios soacutelidos
Ambiente Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto) evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas El periodo de exposicioacuten va de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo Se recomienda que con un nuacutemero superior de cinco colonias en el control se desinfecte el aacuterea de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminacioacuten Cabina de flujo laminar
Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4 horas Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar
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Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70 al inico durante y al final del trabajo con cada cepa
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005) los residuos se pueden clasificar en cinco grupos La eliminacioacuten de residuos en el laboratorio de microbiologiacutea no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas por ello los desechos se dispondraacuten de la siguiente forma
Desechos no contaminados (no infecciosos) Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que
incluso pueden reutilizarse o reciclarse como el papel
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservacioacuten requiere
de material corto-punzante se cuenta con un guardiaacuten para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plaacutesticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestioacuten Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposicioacuten final de este material
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado
Las cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 20 minutos Posterior al proceso de autoclavado se deben someter a un proceso de desinfeccioacuten con hipoclorito al 15 durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jaboacuten neutro
Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas en todo caso deberaacuten tener el mismo proceso de desinfeccioacuten anteriormente mencionado
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Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado todos los desechos producidos en cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 15 minutos posterior a este proceso se descartaraacute el contenido de las cajas de Petri disponieacutendolos en bolsas rojas para residuos peligrosos Por otra parte los desechos liacutequidos deberaacuten ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa
No es directriz del laboratorio ni del Banco Geneacutetico la incineracioacuten de ninguacuten tipo de material o residuo peligroso solo de su disposicioacuten y almacenaje seguacuten lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos
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BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2 es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos estos son
ldquoAgentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente La exposicioacuten en el laboratorio puede provocar una infeccioacuten grave pero existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces y el riesgo de propagacioacuten es limitadordquo (OMS 2005 paacuteg 1)
El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Geneacutetico Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005)
Proteccioacuten personal El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial
Se recomienda el uso de batas blancas manga larga y bien abotonada con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar ensuciar o para prevenir alguacuten accidente
Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas bufandas o gorras
Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupcioacuten
Se debe utilizar proteccioacuten ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos
Debe respetarse la prohibicioacuten de beber comer masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como boliacutegrafos ademaacutes de tocarse los ojos y nariz
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Procedimientos Estaacute estrictamente prohibido pipetear con la boca se deben utilizar
pipeteadores mecaacutenicos Todos los cultivos stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un meacutetodo de descontaminacioacuten aprobado como por ejemplo mediante autoclave
Aacutereas de trabajo Las superficies de trabajo se descontaminan como miacutenimo una vez por diacutea
y luego de todo derrame de material contaminante
En las zonas de trabajo estaraacute prohibido comer beber fumar aplicar cosmeacuteticos manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en aacutereas de trabajo
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ninguacuten momento ropa u objetos personales
Capacitaciones Los encargados del Banco geneacutetico y del laboratorio deberaacuten estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma maacutes eficaz y asiacute reducir riesgos en el proceso
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado asiacute como de las maquinas y elementos del laboratorio
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REFERENCIAS
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Anexos y formatos
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31
32
BANCO DE LIOFILIZADOS
33
CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
34
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
FORMATO PARA CARACTERIacuteSTICAS MACROSCOacutePICAS DE LAS CEPAS
35
FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN
36
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN LIOFILIZACIOacuteN
37
38
39
40
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN CRIOPRESERVACIOacuteN
41
42
43
44
45
DEDICATORIA
ldquoHay hombres que luchan un diacutea y son buenos Hay otros que luchan un antildeo y son mejores Hay
quienes luchan muchos antildeos y son muy buenos Pero hay los que luchan toda la vida esos son
los imprescindiblesrdquo
Bertolt Brech
Este trabajo va dedicado a todas aquellas personas cercanas a miacute que fueron un apoyo constante
durante estos antildeos en la universidad De igual forma esta dedicatoria concierne a aquellas personas
que hicieron difiacutecil mi camino porque demostrarles que si podiacutea cumplir mis objetivos pese a las
adversidades resultoacute ser una motivacioacuten auacuten maacutes fuerte para miacute
Una dedicatoria especial a mi familia y a mi prometida Adriana Calderoacuten una investigadora cuyas
ensentildeanzas y apoyo afectivo estaacuten muy relacionadas con la finalizacioacuten exitosa de este proyecto
AGRADECIMIENTOS
La realizacioacuten de este trabajo fue posible gracias a muacuteltiples personas que de forma directa o
indirecta intervinieron en su realizacioacuten
La Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas por haberme dado una formacioacuten integral como
Licenciado en Biologiacutea a traveacutes de sus docentes y sus espacios
A mi director el docente Miguel Aacute Piragauta MSc por confiar en miacute y en mi trabajo por abrirme
las puertas del laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos
Naturales por su asesoriacutea y direccioacuten
A los laboratoristas Oscar Romero y Aleyda Ariza por su guiacutea sus consejos durante el desarrollo
del trabajo y su apoyo frente a la realizacioacuten del mismo
A los estudiantes Cesar Romero y Diego Castantildeeda quienes aportaron valiosa informacioacuten y
experiencia durante mi estadiacutea en el laboratorio a traveacutes de su proyecto
A la docente Gloria Stella Acosta Pentildealoza MSc quien amablemente dio su apoyo como revisora
y evaluadora de este proyecto y me guio en las encrucijadas con las cuales los cientiacuteficos solemos
enfrascarnos
A Gineth Adriana Calderoacuten por su colaboracioacuten en distintas etapas de este trabajo
He mencionado a grosso modo solo a algunas personas pido por ello disculpas a aquellos que no
mencioneacute pues sus aportes tambieacuten fueron importantes para el eacutexito de este proyecto
CONTENIDO
RESUMEN 10
ABSTRACT 10
1 INTRODUCCIOacuteN 11
2 MARCO REFERENCIAL 13
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS 13
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS 14
221 Conservacioacuten a corto plazo 14
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten 14
223 Conservacioacuten a largo plazo 15
2231 Liofilizacioacuten 15
2232 Control de calidad de un producto liofilizado 20
2233 Equipamiento para liofilizar 21
3 OBJETIVOS 22
31 OBJETIVO GENERAL 22
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 22
4 METODOLOGIacuteA 23
41 FASE INICIAL 23
411 Acervo Microbiano 23
412 Eleccioacuten de los protectores 23
4121 Crioprotectores 23
4122 Lioprotectores 23
42 FASE INTERMEDIA 1 24
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten 24
4211 Viabilidad 24
4212 Estabilidad Morfoloacutegica 25
4213 Pureza 25
422 Recuperacioacuten de los microorganismos 25
423 Criopreservacioacuten 26
4231 Precriopreservacioacuten 26
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 26
424 Liofilizacioacuten Etapa 1 26
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 26
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 26
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje) 27
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2 29
43 FASE INTERMEDIA 2 29
431 Liofilizacioacuten definitiva 29
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 29
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 30
4313 Posliofilizacioacuten 30
4314 Rehidratacioacuten 30
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos 30
4321 Propiedades fiacutesicas generales 30
4322 Contaminacioacuten 30
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten 31
433 Pruebas adicionales 31
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica 31
4332 Prueba de estabilidad acelerada 31
434 Control de esterilidad 32
4341 Medios 32
4342 Ambiente 32
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 32
44 FASE FINAL 32
441 Base de datos 32
442 Fichas de resumen 33
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 33
444 Formatos de control del banco de liofilizados 33
445 Manual de procedimientos 33
5 RESULTADOS 34
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN 34
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE
ESTUDIO 35
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD
NATURAL 38
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general 38
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado 41
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA 41
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN 42
551 Propiedades fiacutesicas generales 42
552 Contaminacioacuten 45
553 Tiempo de redisolucioacuten 45
56 PRUEBAS ADICIONALES 46
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica 46
562 Prueba de estabilidad acelerada 47
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN 47
571 Base de datos 47
572 Fichas de resumen 47
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 47
574 Formatos de control del banco de liofilizados 48
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten 48
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS 49
7 CONCLUSIONES 54
8 RECOMENDACIONES 55
9 REFERENCIAS 56
10 BIBLIOGRAFIacuteA 60
11 ANEXOS 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten 16
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado 17
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua 18
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten 19
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes 21
Figura 6 Metodologiacutea 23
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 28
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelacioacuten 35
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 38
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilizacioacuten definitiva por cepa bacteriana 41
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes 45
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales 46
Figura 17 Organigrama de la base de datos 47
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas 24
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten 27
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 28
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales 29
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada 31
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados 33
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten) 34
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004 36
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006 36
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007 37
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009 37
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010 38
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad 41
Tabla 14 Tabla de convenciones 42
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1 42
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada 44
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado 46
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencioacuten de los microrganismos y dada su importancia se han
creado colecciones bioloacutegicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologiacutea Existe variedad de meacutetodos de preservacioacuten en este trabajo se determinoacute el estado
de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad estandarizando e
implementando ademaacutes el sistema de liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos
evaluaacutendolos frente a tres compuestos protectores Se realizoacute una evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten teniendo como base tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
encontrando que el sistema de criopreservacioacuten implementado en el laboratorio es oacuteptimo y el
glicerol al 67vv funciona para casi todas las cepas por largos periacuteodos de tiempo la sacarosa
10pv resultoacute ser el mejor lioprotector de los tres evaluados designaacutendolo como lioprotector
general para el laboratorio Se creoacute un manual de laboratorio para la conservacioacuten de cepas que
incluye los protocolos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten y de seguridad de los mismos Este
trabajo aporta al campo de la microbiologiacutea de la conservacioacuten y constituye un peldantildeo maacutes para
el registro del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes
PALABRAS CLAVE Criopreservacioacuten liofilizacioacuten lioprotectores conservacioacuten
microorganismos
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and given its importance have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology Exists variety of methods of preservation in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing standardizing and further
implementing the system freeze-drying taking as a starting point to them evaluating them against
three protective compounds An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators
viability morphological stability and purity was performed finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67 vv works for almost all strains for long
periods of time sucrose 10 wv lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory It was created a manual for conservation
laboratory strains including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions
KEYWORDS cryopreservation freeze-drying lyoprotectants conservation microorganisms
11
1 INTRODUCCIOacuteN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible pues como lo menciona
Hurtado (2009) la vida no es posible sin la actividad de estos ya que estaacuten involucrados en todas
las dinaacutemicas ambientales existentes en el planeta Sin embargo su importancia ha ido maacutes allaacute
desde que fueron descubiertos hace unos 300 antildeos por van Leeuwenhoek potencializaacutendose su
investigacioacuten y utilizacioacuten en distintos campos de la ciencia y la tecnologiacutea en los uacuteltimos 100
antildeos iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi amp Mayz 2003)
Debido a esto se han creado colecciones bioloacutegicas como meacutetodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho Las colecciones de cultivos microbianos estaacuten
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt y a nivel internacional por
la Federacioacuten Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) en donde existen actualmente
2acute520200 microorganismos en 711 colecciones de 71 paiacuteses registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM) Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM el CIAT (Rhizobium Collection America) de coacutedigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccioacuten de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de coacutedigo WDCM 857 (WFCC 2015)
No obstante varias universidades del paiacutes instituciones puacuteblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias bioloacutegicas poseen colecciones microbioloacutegicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN) en otros casos las colecciones estaacuten en proceso de registro o en formacioacuten como en la
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) entre otras
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer meacutetodos de conservacioacuten fiables
que entre otras cosas eviten al maacuteximo el riesgo de peacuterdida o de variabilidad geneacutetica de los
individuos Existe variedad de meacutetodos de conservacioacuten seguacuten sea el tiempo que estaraacuten en la
coleccioacuten o el tiempo en que tardaraacuten en ser usados dentro de ellos destacan la criopreservacioacuten y
la liofilizacioacuten meacutetodos utilizados para la coleccioacuten de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo
Martiacutenez amp Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Geneacutetico en el Laboratorio
de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC siglas de la coleccioacuten microbioloacutegica) utilizando
la refrigeracioacuten como meacutetodo primario implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
criopreservacioacuten
En este trabajo se pretendioacute determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos evaluaacutendolos frente a tres compuestos
protectores Para ello en primera estancia se recibioacute una capacitacioacuten sobre manejo y control de
microrganismos preparacioacuten de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados posteriormente se evaluoacute el estado de criopreservacioacuten de las cinco
cepas seleccionadas utilizando teacutecnicas de recuento en placa estaacutendar y se evaluoacute a tres
lioprotectores para la liofilizacioacuten de cepas microbianas del Banco Geneacutetico ademaacutes se realizaron
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacioacuten y se disentildearon los
protocolos para la implementacioacuten del sistema de liofilizacioacuten con las cinco cepas y el lioprotector
que presentoacute mejores resultados en este estudio
Para la realizacioacuten de estos fines el trabajo fue dividido en cuatro fases comenzando por los
criterios de eleccioacuten de los microrganismos y los lioprotectores seguido de la evaluacioacuten de los
meacutetodos de preservacioacuten utilizando tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
posteriormente una tercera fase de ajustes a la liofilizacioacuten para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo utilizando como indicadores las propiedades fiacutesicas generales la
posibilidad de contaminacioacuten en el proceso y el tiempo de redisolucioacuten finalmente una cuarta
fase que corresponde al proceso de documentacioacuten este incluye la revisioacuten y modificacioacuten de la
base de datos la elaboracioacuten de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados asiacute como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccioacuten y finalmente la
elaboracioacuten del manual de procedimientos Con lo anterior se encontroacute que el sistema de
criopreservacioacuten desarrollado por Martiacutenez amp Mayorga (2013) es eficiente y permite porcentajes
de recuperacioacuten bastante altos incluso superiores al 90 luego de dos antildeos sin embargo no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estaacuten expuestas por
este meacutetodo De otro lado se determinoacute la sacarosa al 10 como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caracteriacutesticas propias de cada organismo)
y se estandarizoacute el sistema de liofilizacioacuten
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacioacuten de un nuevo meacutetodo de
conservacioacuten de microorganismos para el Banco Geneacutetico de la Universidad Distrital Francisco
Joseacute de Caldas ademaacutes aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacioacuten en bacterias y ofrece
informacioacuten yo tips sobre el proceso de liofilizacioacuten en general que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso Tambieacuten se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Geneacutetico en la comunidad cientiacutefica a nivel nacional
e internacional
Este documento consta en su orden de un capiacutetulo de introduccioacuten y un marco referencial de los
objetivos tanto general como especiacuteficos alcanzados en este trabajo una metodologiacutea detallada
paso a paso perfectamente reproducible los resultados encontrados asiacute como el anaacutelisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacioacuten
finalmente un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo el campo de la
conservacioacuten microbiana y los capiacutetulos correspondientes a las referencias y bibliografiacutea utilizada
Se incluye tambieacuten un capiacutetulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientiacutefica del presente trabajo
13
2 MARCO REFERENCIAL
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS
La vida en la Tierra no seriacutea posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado 2009) ya que estaacuten involucrados con las dinaacutemicas en los ecosistemas terrestres aeacutereos
y acuaacuteticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta Existen
microorganismos que degradan la materia orgaacutenica hacieacutendola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) evitando que el mundo sea un vertedero
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnoloacutegicos de la humanidad
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea Bacteria y
Eucarya en donde encontramos como primeros representantes a las bacterias las maacutes numerosas
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) muchas pueden
resultar beneacuteficas para ser utilizadas con fines biotecnoloacutegicos agriacutecolas biomeacutedicos ecoloacutegicos
y de biorremediacioacuten (Morales-Garciacutea et al 2010) Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucioacuten en la naturaleza contribuyendo a la descomposicioacuten de la materia orgaacutenica y
participando en los ciclos bioloacutegicos (Pontoacuten Moragues Geneacute Guarro amp Quindoacutes 2002)
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucioacuten de los
graves problemas de la humanidad (Gonzaacuteles de Oca Martiacutenez Riveroacuten amp Nuacutentildeez 2006) en la
agricultura alimentacioacuten salud y en la buacutesqueda de nuevas fuentes de energiacutea y la conservacioacuten
del medio ambiente Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioquiacutemicas para Atlas (citado por Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez
1998) dicha capacidad se basa ldquoen la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones oxidaciones reducciones y precipitacioneshellip y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierrardquo (paacuteg 289)
Los recursos microbioloacutegicos (microorganismos genes e informacioacuten) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologiacutea las ciencias de la vida (Ivshina amp Kuyukina 2013) el
desarrollo de medicamentos farmaceacuteuticos agentes agroquiacutemicos biocontroles cosmeacuteticos y
productos industriales (Ten Kate 1995) Ademaacutes con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el eacutexito de los primeros aislamientos de microorganismos se marcoacute la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacioacuten de toda la biodiversidad microbiana logrando la inclusioacuten de este tema en el
desarrollo de las poliacuteticas ambientales (Gonzaacuteles et al 2006)
El meacutetodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta fuera de sus
ambientes ecosistemas y nichos ha sido la creacioacuten de colecciones bioloacutegicas cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfoloacutegicos fisioloacutegicos o
geneacuteticos (Montes de Oca et al 2008) Las colecciones de cultivos microbianos variacutean en forma
funcioacuten y tamantildeo Pueden ser pequentildeas privadas mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especiacuteficos (Duratildees Sette Pagnocca amp Rodrigues 2013)
14
El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura baacutesica de
investigacioacuten en ciencias de la vida llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg Dedeurwaerdere amp Pascual 2013) de animales y plantas pero se cuentan con
caracteriacutesticas especiacuteficas para los microorganismos En primer lugar los organismos microbianos
tienen una variacioacuten geneacutetica extremadamente alta y altos iacutendices de mutacioacuten en la reproduccioacuten
en las especies por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al 2013) a su lugar de recoleccioacuten En segundo lugar las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacioacuten asegurar los recursos geneacuteticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes para proporcionar biomateriales autenticados
para materiales de investigacioacuten exploracioacuten y produccioacuten asiacute como su uso contemporaacuteneo por
parte de las entidades privadas y puacuteblicas (Stromberg et al 2013)
Los microorganismos al igual que otros seres vivos poseen una uacutenica e irremplazable
secuencia de ADN por lo que su desaparicioacuten implicariacutea la peacuterdida irreversible de un conjunto
uacutenico de informacioacuten (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) de ahiacute la gran importancia en la
creacioacuten de comiteacutes comisiones federaciones y grupos de microbiologiacutea como World Federation
for Culture Collection (WFCC) International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacioacuten
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC 2010b)
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
En las colecciones es necesario establecer meacutetodos de conservacioacuten confiables y especiales
pudiendo realizarse a corto mediano y largo plazo para asegurar la oacuteptima viabilidad
almacenamiento y pureza (WFCC 2010b) de los diferentes microorganismos Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de peacuterdida cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
miacutenimo dos meacutetodos (WFCC 2010b) de conservacioacuten que consideren el tiempo a emplear en la
preservacioacuten inicial manipulacioacuten y control perioacutedico de las cepas asiacute como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemaacuten Diacuteaz Rosa amp Aacutelvarez Molina 2005)
Se debe tener especial cuidado con geacuteneros y especies todaviacutea no conservadas en colecciones
(especies nuevas) contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
oacuteptimos (WFCC 2010a) de conservacioacuten de estos
221 Conservacioacuten a corto plazo
Comuacutenmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestioacuten seraacute utilizado en un corto
periodo de tiempo Suele utilizarse la teacutecnica de resiembra continua en este el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC
donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garciacutea et al 2010)
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten
Este concepto agrupa a las teacutecnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 antildeos (Weng et al 2005) Existen variedad de teacutecnicas como la
desecacioacuten el gel de siacutelice o perlas de vidrio el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al
2005) o la congelacioacuten La inclusioacuten de esta uacuteltima teacutecnica en este grupo es discutida por algunos
autores ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacioacuten como la criopreservacioacuten (o
15
congelacioacuten) son teacutecnicas de conservacioacuten a largo plazo (Perry 1995 Weng et al 2005) y otros
insisten su inclusioacuten en las teacutecnicas de conservacioacuten a mediano plazo (Morales-Garciacutea et al 2010)
La criopreservacioacuten consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas
Esto permite la eliminacioacuten del agua libre disponible y que en el interior de los individuos ldquosoacutelo
una proporcioacuten del total de agua se convierta en hielordquo (Perry 1995 paacuteg 23)
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 deg C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta peacuterdida de la
viabilidad del cultivo (Perry 1995) por parte del laboratorio Este meacutetodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las ceacutelulas a -80degC
(Morales-Garciacutea et al 2010) Heckly (citado por Perry 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas la viabilidad celular es casi independiente del periacuteodo de almacenamiento ademaacutes
se cree que los individuos criopreservados siguen siendo geneacuteticamente estables
Hubaacutelek (2003) menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacioacuten de microorganismos desde las caracteriacutesticas propias del individuo (cepa
especie tamantildeo y forma de celda fase de crecimiento al momento de congelar composicioacuten de las
ceacutelulas etc) asiacute como los factores antes (composicioacuten del medio de crecimiento pH temperatura
de incubacioacutenhellip) durante y posterior al proceso de criopreservacioacuten (densidad poblacional
aditivos temperatura y duracioacuten del almacenamientohellip) e incluso en su descongelacioacuten
ldquoLos aditivos crioprotectores son compuestos quiacutemicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los dantildeos durante el proceso de congelacioacutenrdquo (Gonzaacuteles et al 2006 paacuteg
16) Estos protectores se pueden clasificar seguacuten su peso molecular (bajo o alto) o seguacuten su tasa
yo capacidad de penetracioacuten los penetrantes de bajo peso molecular que desplazan el agua
intracelular evitando la formacioacuten de hielo (por ejemplo el glicerol) y los no penetrantes de alto
peso molecular que promueven la raacutepida deshidratacioacuten de la ceacutelula (por ejemplo los gluacutecidos)
(Hubaacutelek 2003)
223 Conservacioacuten a largo plazo
Este concepto agrupa a las teacutecnicas que ademaacutes de minimizar al maacuteximo el riesgo de cambio
geneacutetico en las ceacutelulas mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 antildeos o maacutes (Weng et al 2005)
La maacutes popular es la liofilizacioacuten
2231 Liofilizacioacuten
La liofilizacioacuten consiste en la eliminacioacuten del agua de una sustancia congelada por
sublimacioacuten del hielo bajo alto vaciacuteo y a presiones muy bajas (Gonzaacuteles et al 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador Si la liofilizacioacuten es exitosa se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacioacuten por varios antildeos de los microorganismos sin embargo dicho eacutexito depende de
muacuteltiples factores entre otros como los mencionados por Hubaacutelek (2003) para la criopreservacioacuten
(puesto que la liofilizacioacuten posee una etapa de congelacioacuten) asiacute mismo el tiempo de liofilizacioacuten
los paraacutemetros de liofilizacioacuten el medio aditivo o lioprotector usado tipo de liofilizador o
accesorio utilizado influyen en el producto final
16
El proceso de conservacioacuten de microorganismos por liofilizacioacuten se puede dividir en muacuteltiples
etapas desde la formulacioacuten del protector hasta el modo en que se recuperaraacuten los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1)
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacioacuten Asiacute mismo se
representa el efecto de cascada en teacuterminos de la viabilidad de las muestras
a) Formulacioacuten
Se entiende como la mezcla de ceacutelulas con cualquier solucioacuten protectora que tras la
eliminacioacuten del disolvente permita obtener un producto (liofilizado) deseado La solucioacuten
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacioacuten Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de gluacutecidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics 2015)
Las soluciones protectoras oacuteptimas contienen principalmente un soluto protector
denominado lioprotector que estabiliza las ceacutelulas cuando se elimina el disolvente (agua)
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despueacutes de la liofilizacioacuten (Figura 2) Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actuacutean como su propia matriz por ejemplo la sacarosa al
10 (Ops Diagnostics 2015)
La formulacioacuten tambieacuten comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse pudiendo variar de si se parte de un cultivo soacutelido en
agar o de un cultivo liacutequido hasta que sean cultivos soacutelidos densos (edad de 1-2 diacuteas) o
liacutequidos en fase estacionaria Cuando se parte de un medio liacutequido y si es posible las
ceacutelulas se centrifugan retirando el medio de cultivo y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucioacuten protectora (Ops Diagnostics 2015) o de lioprotector (Grauer
Grunberg amp Zardo 2015) Para cultivos desde agar suele lavarse la placatubo con 5-10
ml de medio protector posteriormente recogido con una pipeta esteacuteril (Ops Diagnostics
2015) Aunque en esto uacuteltimo se evita la centrifugacioacuten se obtiene un mayor nuacutemero de
ceacutelulas partiendo de cultivos liacutequidos (Grauer et al 2015)
17
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado
Fuente Adaptado de Jennings T A (2008) Lyophilization Introduction and Basic Principles (paacuteg 5)
New York Informa Healthcare USA Inc
b) Congelacioacuten
La congelacioacuten es la primera etapa del meacutetodo de liofilizacioacuten y uno de los maacutes
importantes para el eacutexito de este Su funcioacuten consiste en obtener una matriz en donde esteacute
separado el disolvente de los solutos Cuando se congela la formulacioacuten el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regioacuten intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings 2008) la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regioacuten intersticial a casi 0 ademaacutes proporciona una estructura
con resistencia casi nula al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings
2008)
Disminuir el flujo de agua raacutepidamente es importante para evitar asiacute la excesiva
concentracioacuten de solutos un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracioacuten de solutos evitando el estreacutes osmoacutetico y permitiendo una organizacioacuten
espacial de los componentes de la formulacioacuten en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al 2015)
La temperatura y el tiempo para una congelacioacuten completa de la formulacioacuten
dependen de la naturaleza de la misma Nireesha et al (citado por Grauer et al 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco de ahiacute que una correcta congelacioacuten reduce la
desnaturalizacioacuten teacutermica del liofilizado ldquoinmoviliza componentes de la solucioacuten y evita
la formacioacuten de espuma cuando se aplica el vaciacuteordquo (Adams 2007)
c) Secado primario
Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacioacuten ademaacutes es la de maacutes larga
duracioacuten En este etapa la presioacuten se reduce y la temperatura de la formulacioacuten congelada
es elevada dando lugar a la sublimacioacuten (Figura 3) y migracioacuten de vapor de agua (Grauer
et al 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador Sin embrago dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
euteacutectica de colapso de transicioacuten viacutetrea (Tg) para minimizar el dantildeo de la muestra
(Adams 2007)
18
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua Se indican los requerimientos de presioacuten
y temperatura que hacen posible la sublimacioacuten del agua durante la liofilizacioacuten
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
El tiempo para el secado primario depende de muacuteltiples factores como la
composicioacuten de la solucioacuten protectora la porosidad del congelado la calidad o resistencia
de la matriz la cantidad de muestras asiacute como tambieacuten el volumen de la formulacioacuten entre
otros Respecto al volumen ldquopara las bacterias las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 025 a 05 mlrdquo (Ops Diagnostics 2015) Aunque no existe un
volumen establecido hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de maacutes
tiempo
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) un periacuteodo de secado primario de un diacutea es suficiente
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras teniendo
como guiacutea un tiempo de liofilizacioacuten de una noche
La etapa de secado primario finaliza ldquocuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacioacuten y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congeladardquo (Jennings 2008 paacuteg 6)
d) Secado secundario
Es la tercera y uacuteltima etapa de la liofilizacioacuten Al terminar el secado primario se ha
eliminado el agua moacutevil de la muestra Sin embargo existe agua atrapada dentro del soacutelido
amorfo que es maacutes difiacutecil de eliminar (Fetterolf 2010) La cantidad de agua es discutible
ya que fluctuacutea en funcioacuten de la temperatura y las caracteriacutesticas propias de los
19
constituyentes de la formulacioacuten por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10 ww del producto seco (Jennings 2008) o del 2-4 (Ops Diagnostics 2015)
La reduccioacuten del contenido de humedad en la torta se logra por desorcioacuten (Adams
2007) sin reducir el volumen de la misma (Jennings 2008) Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presioacuten parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario durante el secado secundario
(Ops Diagnostics 2015) Es importante que la temperatura no se incremente velozmente y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicioacuten viacutetrea la cual aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf 2010)
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) esta etapa es relativamente corta con una duracioacuten de
1 a 2 horas aunque Grauer et al (2015) indica que representa entre el 30-40 del tiempo
total del proceso asiacute mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo
con una duracioacuten de hasta varios diacuteas Esto resulta importante puesto que ldquola cantidad de
agua residente luego del secado afecta la tasa de peacuterdida de viabilidad durante el
almacenamientordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 16)
Finalmente al ser removida la humedad residual la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al 2015) obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2) o pastel esponjoso con poca (inferior al 1) o nula humedad
residual (Fetterolf 2010)
Las tres etapas del proceso de liofilizacioacuten en funcioacuten de la temperatura y la presioacuten
y en contraste con el diagrama de fases del agua pueden ser observadas en la Figura 4
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten De 1-3 Congelamiento (1-2 presioacuten
atmosfeacuterica) de 3-4 secado primario de 4-5 Secado secundario
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
20
e) Sellado y almacenamiento
Terminado el proceso de secado secundario se deben sellar los viales al vaciacuteo (de ser
posible) o de forma hermeacutetica tan pronto como sea posible debido a que la torta actuaraacute
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf 2010) aunque
tambieacuten es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams 2007) e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de siacutelice
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Sin embrago aunque
se logre un correcto sellado al vaciacuteo no se puede asegurar una larga vida uacutetil en condiciones
ambientales ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al 2015)
por ello lo mejor es almacenar los liofilizados a 4deg C en la oscuridad (Ops Diagnostics
2015) reduciendo las posibilidades de peacuterdidas aunque haya quedado agua despueacutes del
secado
f) Reactivacioacuten o rehidratacioacuten
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacioacuten original esto
implica la adicioacuten de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings 2008
Grauer et al 2015) La dilucioacuten raacutepida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings 2008) da cuenta de un correcto proceso de liofilizacioacuten
ldquoTiempos de reconstitucioacuten excesivamente largos la peacuterdida de potencia o la formacioacuten
de una solucioacuten turbia son indicios de un proceso de liofilizacioacuten inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacioacutenrdquo (Jennings 2008 paacuteg 11)
La recuperacioacuten de las ceacutelulas sin embrago tambieacuten se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacioacuten) el tipo
de diluyente su temperatura su pH la osmolaridad (Grauer et al 2015) la potencia del
lioprotector (Jennings 2008) entre otras propiedades de la solucioacuten resultante
Grauer et al 2015 sugieren la utilizacioacuten de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacioacuten de los microorganismos con el fin de evitar el estreacutes
osmoacutetico que pueden causar las soluciones diluidas sin embargo algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacioacuten especiacuteficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato
Ops Diagnostics (2015) indican que una tasa de supervivencia superior al 50 se
considera aceptable por muchos laboratorios
2232 Control de calidad de un producto liofilizado
Las propiedades fiacutesicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayoriacutea un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacioacuten entre los
paraacutemetros de la formulacioacuten y el proceso de liofilizacioacuten por ello permiten el seguimiento y la
deteccioacuten de falencias (Jennings 2008)
21
Esta evaluacioacuten permite caracterizar las diferentes propiedades fiacutesicas quiacutemicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre dichas propiedades Jennings (2008) y Ticoacute
G (1987) recogen algunos de las toacutepicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado por ejemplo las propiedades generales fiacutesicas de la torta (color volumen temperatura
de transicioacuten textura porosidad densidad contraccioacuten o colapso estado del vial entre otras que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacioacuten) su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfeacuterica) la velocidad de redisolucioacuten o
reconstitucioacuten la estabilidad (de la torta el microorganismo o el lioprotector evaluada de forma
natural o acelerada) nivel de humedad residual posibles contaminantes entre otras
2233 Equipamiento para liofilizar
Como ya se mencionoacute inicialmente el proceso de liofilizacioacuten requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5) este equipo consta esencialmente de tres partes
a) Un sistema o bomba de vaciacuteo que reduce la presioacuten del ambiente de la caacutemara que contiene
el material a secar Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dantildeen ldquoEl nivel
de vaciacuteo requerido debe ser entre 50 y 100 μbarrdquo (Grauer et al 2015 paacuteg 9) aunque 200
μbar son aceptables
b) Un condensador con circuito de refrigeracioacuten que comunica con la caacutemara de secado y
condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacioacuten sobre una superficie enfriada
inferior a los -40degC
c) Caacutemara o accesorio de secado que es donde se coloca el material a secar Seguacuten Nireesha
et al (2013) puede ser de tres tipos
- Manifold o colector muacuteltiple
- Rotary
- Tray style de bandejas con o sin estante de taponado eacuteste uacuteltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaciacuteo de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes En la imagen el liofilizador usa una
caacutemara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial
Tomado de httpslideplayercombrslide84760 el 15 de Agosto de 2015
22
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad y liofilizacioacuten de las mismas evaluaacutendolas frente a tres compuestos protectores
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas utilizando teacutecnicas de recuento
en placa estaacutendar
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacioacuten de cepas microbianas
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten
Disentildear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacioacuten a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados
23
4 METODOLOGIacuteA
La metodologiacutea general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases como es ilustrado en la
Figura 6
Figura 6 Metodologiacutea Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia loacutegica de eventos
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra
41 FASE INICIAL
411 Acervo Microbiano
De la coleccioacuten de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Geneacutetico del laboratorio de
microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracioacuten de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologiacutea estas corresponden a CR004 CR005 (sustituida posteriormente
por CR009) CR006 CR007 y CR010 seguacuten los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodriacuteguez (2013) Todas estaban conservadas por el meacutetodo de criopreservacioacuten (o
criocongelacioacuten) a una temperatura de -85 degC plusmn 1degC
412 Eleccioacuten de los protectores
4121 Crioprotectores
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99999) (Mallinckrodt Meacutexico) en
proporcioacuten 67 vv seguacuten lo establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
4122 Lioprotectores
Para la eleccioacuten de los agentes protectores y sus concentraciones en pv (Tabla 1) se
tuvieron en cuenta diferentes estudios en contraposicioacuten a Hensel (1994) se tomaron
concentraciones superiores al 9 de Glucosa (Merck Darmstadt) de forma aleatoria En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed amp
Roos (2004) y Palmfeldt Radstroumlm amp Hahn-Haumlgerdal (2003) Para la leche descremada
(Proleche Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al (2003) Dichos estudios
fueron tomados como referencia teoacuterica aunque los microorganismos en ellos especificados no
correspondan con los del presente trabajo
Criterios de eleccioacuten de los
microorganismos asiacute como de
los lioprotectores a evaluar
Evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten (criopreservacioacuten
y liofilizacioacuten)
Ajustes a la liofilizacioacuten
para la generacioacuten de
protocolos
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
24
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracioacuten
pv
10 4 10
117 10 15
27 15 20
42 FASE INTERMEDIA 1
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
En este trabajo se evaluaron dos meacutetodos de conservacioacuten (criopreservacioacuten y liofilizacioacuten)
dicha evaluacioacuten se realizoacute en teacuterminos de tres (3) indicadores valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al meacutetodo en siacute
4211 Viabilidad
Para evaluar este indicador se utilizoacute
a) Conteo directo con caacutemara de Neubauer 110mm (Boeco) siguiendo la metodologiacutea
planteada por Valencia Z (2004) Sin embargo para obtener el nuacutemero de bacterias se
utilizoacute la ecuacioacuten planteada por Bastidas (2015)
No de bacteriasml=
Fd Factor de dilucioacuten =
El conteo directo con caacutemara de Neubauer solo se realizoacute previamente al meacutetodo de conservacioacuten
evaluado
b) Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa seguacuten lo
descrito por Valencia Z (2004) y Camacho et al (2009) Para el caacutelculo de UFCml se
utilizoacute la siguiente foacutermula
UFCml = Ndeg de colonias times times
Los caacutelculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologiacutea planteada por
Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales se utilizoacute los planteamientos del Instituto
de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacioacuten y solo pos a la criopreservacioacuten en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid
England)
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten
fue calculado a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010)
Tasa de supervivencia (BSR ) = DD Despueacutes de la desecacioacuten
AD Antes de la desecacioacuten
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000
Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucioacuten
1
ml de muestra
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100
Log (Ndeg UFCml AD)
25
4212 Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realizoacute
a) Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) Se elaboroacute un formato (anexo 1) con las
caracteriacutesticas macroscoacutepicas descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz
(2009) para las colonias desarrolladas en superficie a partir del procedimiento de ldquoconteo
de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Se utilizoacute un
contador de colonias CC-1 (Boeco)
- Se seleccionoacute solo una de dos placas de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de
UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron observadas en al menos el 80 de las colonias
de la placa seleccionada
b) Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se
realizoacute una ldquocoloracioacuten de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005
paacuteg 24)
Se compararon con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y macroscoacutepicas descritas por
Rodriacuteguez (2013) y la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se tomoacute
registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio (Zeiss)
con caacutemara Canon G9
4213 Pureza
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en
cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante
teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
422 Recuperacioacuten de los microorganismos
Para la recuperacioacuten de los microorganismos se tomoacute un criovial de cada cepa bacteriana
sometido a una temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua
destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente cinco (5) minutos (Martiacutenez amp Mayorga
2013) Los crioviales se introdujeron en bantildeo seroloacutegico una vez se llegoacute a la temperatura deseada
no antes
De cada criovial se tomoacute un (1) ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (asymp2240rpm) por diez (10) segundos diluyeacutendolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
Se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten a cada criovial (Thomas
Scientific 5150636) por cepa luego de preparado el tubo T01 antes de la incubacioacuten Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martiacutenez amp Mayorga
(2013) y Rodriacuteguez (2013)
26
423 Criopreservacioacuten
4231 Precriopreservacioacuten
Pasado el tiempo de incubacioacuten se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten al tubo T01 con el fin de determinar el nuacutemero de ceacutelulas totales y viables de la
muestra El conteo en Caacutemara de Neubauer se realizoacute solo hasta el final de los procedimientos de
preservacioacuten por lo cual una vez preparadas las diluciones estas fueron llevadas a nevera a 4degC plusmn
1degC para evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Se siguioacute el protocolo de criopreservacioacuten establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas con
algunas variaciones
Con pipeta esteacuteril de 5ml se depositaron en cinco (5) crioviales 12ml de glicerol anhidro
esteacuteril
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02)
Posteriormente se tomaron aliacutecuotas desde T02 de 600microl previo Voacutertex nivel 7 por 15s
depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl Se rotularon y se
realizoacute Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten
Inmediatamente despueacutes de la homogenizacioacuten fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick) a una temperatura de -85degC plusmn 1degC en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestioacuten
Este procedimiento se realizoacute en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar veinte (20) minutos (Martiacutenez amp
Mayorga 2013) desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar
la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
424 Liofilizacioacuten Etapa 1
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Se partioacute del tubo T01 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de
liofilizacioacuten Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel
7 (asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml agua destilada esteacuteril (T03)
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
Partiendo del tubo T03 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se
extrajeron aliacutecuotas de cien (100) microl veintisiete (27) veces depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar En cada criovial se adicionaron novecientos (900) microl de lioprotector en tres
crioviales por cada concentracioacuten de lioprotector de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2)
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior del criovial fuera lo maacutes
exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T03 se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacioacuten
27
Donde el volumen inicial y la concentracioacuten inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado en tanto que el volumen final y la concentracioacuten final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T03
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (aliacutecuota maacutes protector) se
agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacioacuten
Posteriormente a los crioviales se les retiraron las tapas plaacutesticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney PM-996) esterilizado realizando seis (6) perforaciones conceacutentricas en la superficie
con aguja hipodeacutermica 21G x 1frac12rdquo Los crioviales fueron congelados en nitroacutegeno liacutequido por
15min aproximadamente depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD Thermo
Scientific) de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45degC usando el colector muacuteltiple (manifold)
Terminado el proceso se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la caacutemara
de flujo laminar para evitar contaminacioacuten de las muestras alliacute se les retiroacute el Parafilm se les tapoacute
con tapas esteacuteriles y se les rotuloacute
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten
Lioprotector Concentracioacuten
(pv)
Serie
A B C
Glucosa
10 1 1 1
117 1 1 1
27 1 1 1
Sacarosa
4 1 1 1
10 1 1 1
15 1 1 1
Leche
descremada
10 1 1 1
15 1 1 1
20 1 1 1
Total crioviales seguacuten Ndeg 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje)
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten utilizando una etiqueta o
roacutetulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacioacuten
Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de datos el
Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten
bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo)
nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3) con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo
bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas
tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada vial
Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional
a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
Posterior al proceso de rotulado los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano a temperatura ambiente y protegido de la luz
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS
CC en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado riesgo
poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entrantildear un riesgo grave para el personal de
laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado
riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro Existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o
indirectamente Normalmente no existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005)
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio
(paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications
biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
29
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2
Se realizoacute una prueba de estabilidad natural en teacuterminos del aspecto fiacutesico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un periacuteodo prolongado de tiempo (Grauer et al 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente Por ello la rehidratacioacuten de los crioviales se realizoacute en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4)
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales
Primera rehidratacioacuten Segunda rehidratacioacuten Tercera rehidratacioacuten
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota Intervalos de tiempo medidos en diacuteas contados desde el diacutea de almacenaje en los cuales se rehidratoacute
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie ver Tabla 2) El aspecto fiacutesico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacioacuten y comparado con su estado antes del almacenaje
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC tomando
el tiempo de reconstitucioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel
2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten El indicador de viabilidad se evaluoacute solo con el meacutetodo de conteo de
microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la maacutes alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa se eligioacute el
lioprotector y la concentracioacuten de eacuteste que permitioacute obtener un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables
posliofilizacioacuten y que ofrecioacute ademaacutes una menor variacioacuten durante la prueba para la liofilizacioacuten
definitiva de las cepas en estudio Dicho lioprotector se establecioacute ademaacutes como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados del Banco
Geneacutetico del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
43 FASE INTERMEDIA 2
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores con el aacutenimo de
generar un protocolo funcional aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partioacute de cultivos puros sobre medios soacutelidos se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacioacuten liofilizacioacuten y posliofilizacioacuten para la
liofilizacioacuten definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados
431 Liofilizacioacuten definitiva
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracioacuten oacuteptima para cada cepa
de estudio se realizoacute la liofilizacioacuten definitiva
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general Posteriormente se agitoacute con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Esto se realizoacute para cada
cepa
30
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
El tubo T04 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten
definitiva se extrajeron cuatro (4) aliacutecuotas de un (1) ml previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass 62113D-2)
posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por
7s para su homogenizacioacuten
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas a una presioacuten
inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
El proceso de destape parcial y congelacioacuten se realizoacute en caacutemara de flujo laminar para evitar
al maacuteximo la contaminacioacuten El transporte de los viales desde la caacutemara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitroacutegeno liacutequido
para evitar contaminacioacuten y descongelacioacuten
4313 Posliofilizacioacuten
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten Dos viales
designados como trabajo (T) y stock (S) fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4degC plusmn 1degC
4314 Rehidratacioacuten
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacioacuten de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio soacutelido
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos
Se llevoacute un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el aacutenimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacioacuten Al identificarlas se decidioacute repetir la
liofilizacioacuten definitiva con los nuevos paraacutemetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio
4321 Propiedades fiacutesicas generales
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento) color textura brillo aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales teniendo como punto de comparacioacuten la formulacioacuten
luego de congelada Esto se realizoacute para
- Crioviales de la fase intermedia 1
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 431)
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 433)
4322 Contaminacioacuten
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad en
buacutesqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio
31
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten
Se midioacute el tiempo de reconstitucioacuten de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y el tiempo de los crioviales que conteniacutean el lioprotector general fue comparado
con el tiempo de reconstitucioacuten de los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada
433 Pruebas adicionales
Para estas pruebas solo se usoacute la formulacioacuten del lioprotector general y la cepa CM-CR010
por su alta tasa de crecimiento respecto a las demaacutes cepas evaluadas
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticoacute G 1987) se
tomaron los pesos con balanza analiacutetica (AND GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos El cuarto vial y criovial se abrieron solo una vez luego
fueron sellados completamente tomando sus pesos de la misma forma ya descrita
Para determinar si existe un tiempo maacuteximo admisible de cerrado se midioacute el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcioacuten del tiempo utilizando la ecuacioacuten
descrita por Garciacutea C (2007)
Wt () es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4332 Prueba de estabilidad acelerada
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa uno fue rehidratado a los cero (0) diacuteas y el otro
luego de siete (7) diacuteas en el interior de la caacutemara de envejecimiento ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5 Adicionalmente se dataron sus propiedades fiacutesicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada
Ndeg vial t ndash Tdeg - HR
1 0 - ambiente - 25
2 7 - 37degC - 100
Nota Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos t= Tiempo en diacuteas
Tdeg=Temperatura HR=Humedad relativa La prueba de estabilidad se realizoacute en una caacutemara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC luego
incubados a 25 degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente
se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten midiendo viabilidad con el meacutetodo
de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
32
434 Control de esterilidad
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121degC y 210Kpa por 20 minutos las puntas de micropipetas los viales
crioviales y sus respectivas tapas fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y
temperatura en un tiempo de 15 minutos Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas) fueron esterilizados en horno Binder a 160degC por 120 minutos
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo desde la
preparacioacuten de medios hasta el sellado de los viales como se describe a continuacioacuten
4341 Medios
Se realizoacute control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid England) (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Se determinoacute como indicador de contaminacioacuten
cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios
soacutelidos
4342 Ambiente
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realizoacute con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas El periodo de exposicioacuten fue de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en
incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo
b) Cabina de flujo laminar
Se realizoacute el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este
caso la caja de control de ambiente se dejoacute abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeriacutean el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4
horas Este control se llevoacute a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolloacute en el interior de la cabina de flujo laminar
se procuroacute mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y
tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70 al iniciar el trabajo con cada cepa
44 FASE FINAL
441 Base de datos
Se realizoacute una revisioacuten a la base de datos del Banco de cepas creado por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) en el programa Access modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccioacuten para la informacioacuten de los organismos liofilizados
33
442 Fichas de resumen
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccioacuten tanto del Freezer
como del banco de liofilizados utilizando el programa Word 2013
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se realizoacute una revisioacuten de la informacioacuten en los roacutetulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos con el aacutenimo de verificar si se habiacutean cumplido los protocolos y la
logiacutestica establecida por Martiacutenez amp Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias
444 Formatos de control del banco de liofilizados
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013 para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) en la seccioacuten
de criopreservacioacuten
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados
Coacutedigo Tipo de registro Ubicacioacuten Uso
FLf-01 Registro de entrada de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccioacuten
FLf-02 Proceso de
liofilizacioacuten
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacioacuten a
una cepa
FLf-03 Registro de control de
calidad
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccioacuten y antes de liofilizar
una cepa para la coleccioacuten
FLf-04 Solicitud salida de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados
Fuente Adaptado de Martiacutenez Beniacutetez H L amp Mayorga Burgos L P (2013) Implementacioacuten de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (Tesis de
pregrado) (paacuteg 44) Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas Bogotaacute Colombia
445 Manual de procedimientos
Se realizoacute una revisioacuten de la cartilla de procedimientos elaborada por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) Se tomoacute la decisioacuten de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013
34
5 RESULTADOS
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN
A raiacutez de la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en cada criovial por cepa
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno En cuanto a CM-CR005 se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer pero no fue posible recuperarla por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009 la sexta mejor respecto al criterio de eleccioacuten de cepas
Con los datos del proceso precriopreservacioacuten de las cepas de intereacutes correspondientes a la
coleccioacuten de colorantes consignados en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) en conjunto con
los datos de viables poscongelacioacuten del presente trabajo se calculoacute la BSR para cada cepa (Tabla
7) Se encontroacute que los porcentajes de BSR son superiores al 70 luego de dos (2) antildeos de estar
en criopreservacioacuten (Figura 8) salvo CM-CR005
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martiacutenez amp Mayorga (2013) (soacutelo se compararon los datos de la cepa CM-CR010 ya que las demaacutes
cepas no figuran en su trabajo) se encontroacute un porcentaje inferior de recuperacioacuten
poscriopreservacioacuten por parte de las autoras por lo cual se revisoacute la metodologiacutea encontrando un
error metodoloacutegico al calcular la BSR en su trabajo Usando los datos de ldquoresultados prueba de
viabilidad poscongelacioacuten tabla 19rdquo (en Martiacutenez amp Mayorga 2013 paacuteg 54) se corrigioacute la BSR
para esta cepa evidenciando ser la cepa maacutes resistente al proceso de criopreservacioacuten entre las
evaluadas con alrededor de 66 de caiacuteda luego de dos antildeos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8)
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten)
Nota Se muestran los resultados al evaluar la conservacioacuten de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por
el meacutetodo de criopreservacioacuten luego de dos (2) antildeos La BSR que Martiacutenez amp Mayorga (2013) presentan
corresponde a un valor poscriopreservacioacuten luego de dos meses de evaluacioacuten Nrd= No registra datos
Cepa Ceacutelulas
totales
Viables precongelacioacuten
(UFCml) de Martiacutenez
amp Mayorga (2013)
viables pos
congelacioacuten
(UFCml)
BSR
real
BSR de Martiacutenez
amp Mayorga
(2013)
BSR
corregido
CM-CR004 12x1012 61 x109 13 x107 725 Nrd Nrd
CM-CR005 11 x1010 11 x1010 0 00 Nrd Nrd
CM-CR006 14x1010 75 x109 27 x107 752 Nrd Nrd
CM-CR007 13x1011 41 x109 31 x108 883 Nrd Nrd
CM-CR009 19 x1010 44 x109 23 x107 763 Nrd Nrd
CM-CR010 17 x1010 46 x109 72 x108 916 673 982
35
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelacioacuten CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperacioacuten (nuacutemero de
ceacutelulas viables)
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO
En las Tablas 8 9 10 11 y 12 se describen las principales caracteriacutesticas macroscoacutepicas
utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfoloacutegica de las cepas utilizadas No fue
posible realizar la comparacioacuten con los datos de Rodriacuteguez (2013) a nivel macroscoacutepico dado que
los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquiacute utilizados sin embargo si se
compararon las caracteriacutesticas microscoacutepicas las cuales fueron coincidentes aunque estas no eran
del todo claras (descripcioacuten inexacta de forma y tamantildeo y sin un registro fotograacutefico comparable)
por lo cual se decidioacute que las caracteriacutesticas macroscoacutepicas observadas desde la primera siembra
posterior a la descongelacioacuten de los crioviales fuesen las de mayor importancia para evaluar la
estabilidad morfoloacutegica y la pureza Estas se mantuvieron sin cambio o variacioacuten a lo largo del
trabajo
Las microfotografiacuteas tomadas a cada cepa usando la coloracioacuten de Gram al igual que las
fotografiacuteas de las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron anexadas a la base de datos del Banco
Geneacutetico
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 725 00 752 883 763 916
Sup
ervi
ven
cia
36
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR004
Descripcioacuten
Borde o Margen
Ondulado Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de
crecimiento
Frente a luz Brillante
Elevacioacuten Umbonada
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Color Beige maacutes intenso en el centro y maacutes clara hacia los extremos en
colonias de 48h o maacutes extremos color blanco hueso
Forma Circular a maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo desarrollar forma
irregular
Grado de
Transparencia Opaca (No transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Ropa huacutemeda
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR006
Descripcioacuten
Borde o Margen Semiondulado A maacutes de 72h es altamente digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas y con medio huacutemedo se irregulariza
Luego de una semana totalmente digitado
Elevacioacuten Plana con bordes elevados (en craacuteter) Colonias de maacutes de 72h
presentan una ligera elevacioacuten en el centro
Color Amarillo
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Escamosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca (NO transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis Si color amarillo
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
37
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR007
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio muy huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular A maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo es irregular
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 48h y distantes unas de otras (pocas
colonias) umbonadas
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Semitransparente en zona externa
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Mentol
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR009
Descripcioacuten
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas se irregulariza
Elevacioacuten En meseta y ligero hundimiento central (craacuteter) En colonias con maacutes
de 72h ligera elevacioacuten del craacuteter
Color Beige Conforme envejece la colonia toma una coloracioacuten blancuzca
de tonalidad cafeacute en el centro
Tamantildeo Pequentildea (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
38
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR010
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio huacutemedo es suavemente ondulado en medio muy
huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular Despueacutes de 48h se irregulariza En medio muy huacutemedo es
estrellado (sin importar edad de la colonia)
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 72h centro marcado y ligeramente
elevado (forma de huevo frito)
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia
Opaca Semitransparente en la zona externa de colonias de maacutes de
48h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Sin olor
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general
Las Figuras 9 10 11 12 y 13 representan los resultados de la evaluacioacuten de la eficacia del
meacutetodo de conservacioacuten realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1 por medio
del indicador de viabilidad
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 6 x108 Se observa que
la leche descremada 15 como mejor protector y leche descremada 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A - - - 5987 - 5301 5958 6812 -
BSR en serie B - - - 3619 3076 4557 5100 5039 3619
BSR en serie C 3076 3619 - 3619 3076 3418 3418 5873 4723
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR004
39
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 73 x108 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 125 x1010 Se observa
a sacarosa 10 como mejor protector y a glucosa 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 4173 4962 5850 6119 6415 5731 5430 4173 4513
BSR en serie B 3046 - - 4173 4743 5051 4773 - -
BSR en serie C - - - 3046 5147 4622 - - -
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR006
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 9149 8664 6549 9712 9677 8735 9026 9166 8648
BSR en serie B 8472 - 6181 - 8474 - 8413 8052 8086
BSR en serie C 8557 7472 6193 - 9272 - 8604 8202 8414
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR007
40
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 115 x109 Se observa
a Sacarosa 15 como mejor protector y la leche descremada 10 como segundo mejor protector
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 65 x109 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 5494 4609 4609 6641 6401 6987 5585 5440 5186
BSR en serie B 4415 - - 6373 6083 6212 4941 4083 -
BSR en serie C - - - - - 7519 4083 - 4083
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR009
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 8205 - 6303 9521 8634 8207 8153 8022 8332
BSR en serie B 6424 - - 7911 8312 8096 7752 6907 7995
BSR en serie C 6697 - - - 8230 7998 7919 8113 7539
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Sup
erviv
enci
a
BSR en CM-CR010
41
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15
CM-CR006 Sacarosa 10
CM-CR007 Sacarosa 10
CM-CR009 Sacarosa 15
CM-CR010 Sacarosa 10
Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural
ofreciera la maacutes alta BSR en la mayoriacutea de cepas (Tabla 13) se determinoacute la sacarosa al 10
como el mejor lioprotector y se designoacute como lioprotector general para las bacterias del banco de
liofilizados Sin embargo se decidioacute para la liofilizacioacuten definitiva utilizar el lioprotector que
mejores resultados confirioacute a cada una de las cinco cepas de estudio
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado
Dado que el principal indicador de evaluacioacuten de la prueba de estabilidad natural en esta
etapa era la viabilidad en cada liofilizado no se tuvo en cuenta los cambios morfoloacutegicos
presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa pero si fueron tenidos en cuenta
para los ajustes teacutecnicos de la liofilizacioacuten en la fase 3
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilizacioacuten definitiva
con su homoacutelogo de la etapa 2 (es decir los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo) se encontraron diferencias significativas de aumento o disminucioacuten de hasta el 22
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad seguacuten el punto de partida de la formulacioacuten
(medio liquido SMPG vs medio soacutelido SPC) como lo muestra la Figura 14
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilizacioacuten
definitiva por cepa bacteriana Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas seguacuten el intervalo
temporal de la Serie A en tanto que CM-CR007 CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron seguacuten la Serie
B (ver Tabla 4)
- 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Punto
s p
orc
entu
ales
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
L Etapa 2 6812 6415 8474 6212 8312
L definitiva 7330 7629 7757 8461 7234
BSR comparativa
42
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN
551 Propiedades fiacutesicas generales
Se dataron las propiedades fiacutesicas de los liofilizados en la fase intermedia 1 asiacute como los
liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 431 (liofilizacioacuten definitiva) y 4332 (viales
usados para la prueba de estabilidad acelerada) en las Tablas 15 y 16 respectivamente la tabla de
convenciones (Tabla 14) permite comprender los siacutembolos de las anteriores tablas
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilizacioacuten y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilizacioacuten
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transicioacuten conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto fiacutesicamente aceptable Sin embargo pese a que a las propiedades fiacutesicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1 con los cuales se realizoacute la evaluacioacuten de la liofilizacioacuten
y la prueba de estabilidad natural no eran los maacutes adecuados se decidioacute proseguir con ellos
apoyado por los resultados de Vemulapalli Bhonsle amp Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratacioacuten (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperacioacuten de microorganismos ademaacutes el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores
Tabla 14 Tabla de convenciones Siacutembolo Significado Siacutembolo Significado
SBE Si en buen estado A Algunos
SME Si en mal estado T Todos
NBE No en buen estado N Ninguno
NME No en mal estado NS No significativo (lt20)
+ Afirmativo S Significativo (201-309)
- Negativo MS Muy significativo (gt40)
NA No aplica I indeterminado
FS Al finalizar el secado AR Antes de reconstituir
Nota Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15 Aunque no tenga estructura de torta el liofilizado
es estable y funcional por ende utilizable No tiene estructura de torta y ademaacutes no es ni estable ni
funcional por ende no es utilizable
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1
Cepa Viales Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto de
torta
Fractura de
vial 1 2 3
CM
-CR
00
4
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I S Traslucido I + NBEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N S Cafeacute claro Porosa - SMEA -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR NS N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
43
CM
-CR
00
6
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR S S MS Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N NS NS Cafeacute claro Porosa - SBEA -
sm2sc AR S S S Cafeacute oscuro Porosa - SMET -
CM
-CR
00
7
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
s1 NA I I I Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR S I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS I S Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
CM
-CR
00
9
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I NS Traslucido I + NBE -
g2sc AR MS S S Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS S I Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sb AR N N NS Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sc AR N S NS Cafeacute oscuro Porosa - NMEA -
CM
-CR
01
0
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I S S Traslucido I + NMEA -
g2sc AR I MS MS Traslucido I + NMEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
44
Nota Datos de las propiedades fiacutesicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad
natural salvo por el encogimiento que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa) los
demaacutes caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual Se subrayan las
anomaliacuteas encontradas a lo largo de la prueba
g Liofilizados con glucosa como protector
s Liofilizados con sacarosa como protector
sm Liofilizados con leche descremada como protector 1 Formulacioacuten congelada 2 Liofilizados almacenados a temperatura ambiente sa Serie A (antes de rehidratar) sb Serie B (antes de rehidratar) sc Serie C (antes de rehidratar)
1 Concentracioacuten uno del lioprotector
2 Concentracioacuten dos del lioprotector
3 Concentracioacuten tres del lioprotector
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la prueba de
estabilidad acelerada
Nota Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquiacute mencionados corresponden solo a aquellos
que contienen sacarosa al 10 (lioprotector general) Se consignan aquiacute los datos generales de los
liofilizados indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas
a Liofilizados de la prueba de estabilidad natural
b Liofilizados de la liofilizacioacuten definitiva
c Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada 1 Formulacioacuten congelada 2 Viales almacenados a temperatura ambiente 3 Vial usado en la caacutemara de envejecimiento
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto
de torta
Fractura
de vial Viales
a1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
a2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
b1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
b2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
c1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
c2 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR NS Blanco Porosa - SBE -
c3 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR S Blanco Porosa - SME -
45
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes De izquierda a derecha
liofilizados de prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva prueba de estabilidad acelerada
552 Contaminacioacuten
Se encontroacute contaminacioacuten durante la rehidratacioacuten de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006 en tanto que las siembras preliofilizacioacuten no presentaban contaminacioacuten alguna por ello
se tomaron tres viales maacutes que iban a ser rehidratados en la serie B encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilizacioacuten de esta cepa
Las demaacutes cepas no presentaron contaminacioacuten en ninguna prueba realizada
553 Tiempo de redisolucioacuten
Al medir el tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten en cada una de las rehidrataciones se
observoacute que la glucosa tardoacute maacutes tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros
lioprotectores llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Voacutertex en los viales
maacutes concentrados para su total redisolucioacuten Ademaacutes se encontroacute en todos los lioprotectores que
conforme la concentracioacuten aumentaba maacutes tiempo se necesitaba para la reconstitucioacuten de la
formulacioacuten es decir que el tiempo es directamente proporcional a la concentracioacuten de
lioprotector
Al comparar el tiempo de reconstitucioacuten de los viales que conteniacutean el lioprotector general
en la prueba de estabilidad natural con los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales de la
prueba de estabilidad acelerada no se encontraron diferencias significativas sin embargo el vial
de la prueba de estabilidad acelerada que duroacute siete (7) diacuteas en caacutemara de envejecimiento se
reconstituyoacute un segundo menos aproximadamente respecto a los otros viales
46
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado
Lioprotector Tiempo (min)
Glucosa 10 1
Glucosa 117 15
Glucosa 27 120
Sacarosa 4 05
Sacarosa 10 05
Sacarosa 15 06
Leche descremada 10 025
Leche descremada 15 033
Leche descremada 20 05
Estabilidad natural 05
Liofilizacioacuten definitiva 025
Estabilidad acelerada 004
Nota El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada
uno liofilizados con el lioprotector general
56 PRUEBAS ADICIONALES
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica
En la Figura 16 se observa un aumento draacutestico del peso de los viales dentro de la ventana
de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados
al vaciacuteo) Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vaciacuteo) no tuvieron un aumento en
peso tan draacutestico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante Al cabo de cincuenta
(50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente No se encontroacute
por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vaciacuteo
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector La ecuacioacuten presentada pertenece a la liacutenea de tendencia logariacutetmica
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinacioacuten Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba
0 10 20 30 40 50 60
vial (518055g) 0 00724 00772 00782 00840 00869 00849
Criovial (19018g) 0 00079 00158 00315 00473 00578 00605
Promedio 0 00401 00465 00549 00656 00724 00727
y = 00365ln(x) + 00058
Rsup2 = 09647
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
01
AU
MEN
TO D
E P
ESO
(W
)
47
562 Prueba de estabilidad acelerada
Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFCml antes de la liofilizacioacuten al
rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 8398 sin embargo al rehidratar el vial 2 luego de su
estadiacutea en la caacutemara de envejecimiento la BSR fue de 0 Las propiedades fiacutesicas generales de
estos viales son presentadas en la Tabla 15
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN
571 Base de datos
Se eliminoacute una tabla sobrante (constituiacutea informacioacuten redundante de las cepas) dentro de la
base de datos correspondiente a la seccioacuten de criopreservacioacuten Adicionalmente se reorganizoacute la
base de datos al introducir la seccioacuten de liofilizacioacuten y la de refrigeracioacuten Este uacuteltimo meacutetodo de
preservacioacuten fue mencionado en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) pero no fue anexado
sin embargo aunque se incluyoacute la seccioacuten en el banco de cepas debe mencionarse que no existen
registros de las cepas que se hallan conservado por este meacutetodo aun asiacute se decidioacute dejar la seccioacuten
para que lo ocupen trabajos posteriores Ademaacutes se encontroacute que en el Freezer existiacutean colecciones
que no figuran en la base de datos no existen registros de ninguacuten tipo ni caracterizacioacuten alguna en
medios digitales La base de datos quedoacute organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5
Figura 17 Organigrama de la base de datos
572 Fichas de resumen
Las fichas de acceso inmediato designadas como ldquofichas de resumenrdquo para cada coleccioacuten
fueron ubicadas seguacuten el sitio de almacenamiento tanto para las cepas criopreservadas como para
las liofilizadas y refrigeradas Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas las fichas
resumen de este meacutetodo fueron dejadas en blanco para futuras colecciones El formato de las fichas
resumen se presenta en el anexo 6
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se encontroacute que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulacioacuten que
permite la faacutecil confusioacuten entre colecciones criopreservadas sin embargo se decidioacute dejar las
etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martiacutenez amp Mayorga (2013) entre
otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener
que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondriacutea una confusioacuten entre nuevas
y viejas colecciones Este problema fue solucionado con la reorganizacioacuten de la base de datos y las
fichas de resumen
Base de datos del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Informacioacuten de los
microorganismos de
cada coleccioacuten
Meacutetodo de conservacioacuten de cepas
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten
Liofilizacioacuten
48
574 Formatos de control del banco de liofilizados
Se decidioacute que los formatos de control para la seccioacuten de liofilizacioacuten del Banco Geneacutetico
fueran similares tanto para la criopreservacioacuten como para la liofilizacioacuten obedeciendo sus
diferencias a las caracteriacutesticas y datos propios de cada meacutetodo Se encontroacute que los formatos de
la seccioacuten criopreservacioacuten no habiacutean sido llenados nunca desde su creacioacuten Estos se muestran en
el anexo 7
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten
Se editoacute la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martiacutenez amp
Mayorga (2013) Partiendo de esta cartilla se elaboroacute un manual maacutes completo (anexo 8)
introduciendo todos los procedimientos para la liofilizacioacuten las diferentes teacutecnicas empleadas en
los procesos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se complementoacute tambieacuten la seccioacuten sobre el
proceso de refrigeracioacuten y se reescribieron algunos conceptos erroacuteneos de la edicioacuten anterior No
se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservacioacuten pero si
se realizaron pequentildeos ajustes de forma o de edicioacuten
49
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
La recuperacioacuten de microrganismos por criopreservacioacuten se realizoacute de acuerdo a los
lineamientos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) durante todas sus etapas sin embargo
la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la
criopreservacioacuten de la cepa o inclusive en la etapa de descongelacioacuten Garciacutea y Uruburuacute (citados
por Aacutengel A 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y
estabilidad de los organismos conservados edad celular velocidad de congelacioacuten y
descongelacioacuten temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores Dado que las cepas
CM-CR004 006 007 010 e incluso la 009 (que remplazoacute a CM-CR005) presentaron muy buenos
niveles de recuperacioacuten (Figura 8) el factor maacutes probable de falla corresponde al crioprotector
utilizado ya que en el caso del Banco Geneacutetico el crioprotector es general para toda la coleccioacuten
de bacterias y la eleccioacuten del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A
2006) puesto que la efectividad de la criopreservacioacuten se puede ver afectada por las caracteriacutesticas
propias de cada cepa (Hubaacutelek 2003) las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector
Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la
viabilidad los organismos conservados por este meacutetodo sobreviven largos periacuteodos por la
reduccioacuten marcada de su ritmo metaboacutelico incluso por maacutes de 30 antildeos (Gonzaacuteles et al 2006) lo
cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector
como elemento de falla en la conservacioacuten de la cepa perdida
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una uacutenica
liacutenea celular por tanto las caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificacioacuten preliminar Sin embargo estos mismos autores
sentildealan que estas caracteriacutesticas no son uacutenicas ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares como sucedioacute con CM-CR007 y 010 por ello fue preciso observar las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas microscoacutepicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquiacutemicas) de las cepas pero dada la simplicidad de las descripciones microscoacutepicas de
Rodriacuteguez (2013) no se tuvo como principal referencia de identidad Aunque la morfologiacutea de la
colonia depende considerablemente de la composicioacuten del medio de cultivo y las condiciones de
incubacioacuten cuando eacutestas son controladas suelen ser invariables teniendo por lo general un valor
diferencial considerable (Diacuteaz 2009) por lo tanto se tomaron estas caracteriacutesticas como las
principales para la evaluacioacuten de los indicadores de estabilidad morfoloacutegica y pureza
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que ldquolos medios soacutelidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamientordquo (paacuteg 2) Sin embargo se observaron
algunas variaciones las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio Esto se
observoacute maacutes en las cepas CM-CR007 y 010 que al revisar los datos de Martiacutenez amp Mayorga (2013)
y Rodriacuteguez (2013) estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio huacutemedo
tendiacutean a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican Loacutepez T amp Torres (2006)
en bacterias moacuteviles en tanto que sin niveles altos de humedad las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en funcioacuten del tiempo (envejecimiento de la colonia) Esto derivoacute en la
observacioacuten y descripcioacuten de caracteriacutesticas macroscoacutepicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad como son descritas en las Tablas 8 9 10 11 y 12 para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) diacuteas que duroacute la prueba de estabilidad
natural se observoacute que en general de los tres lioprotectores los resultados maacutes bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones Esto tiene su explicacioacuten en las propiedades reductoras
que poseen los monosacaacuteridos ya que como lo menciona Cox C S (citado por Hensel 1994) los
efectos letales de la desecacioacuten se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteiacutenas
de la membrana celular y azuacutecares reductores que aumentan conforme avanza la deshidratacioacuten
(glicacioacuten) si las proteiacutenas de membrana integrales o citosoacutelicas se ven dantildeadas de forma
irreversible durante el secado tendriacutea un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al 1995)
impidiendo la reconstitucioacuten de forma adecuada de las bacterias y por ende generando muerte
celular Sin embargo las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta especialmente en la concentracioacuten maacutes baja incluso para CM-CR007 la glucosa al 10 se
erige como el segundo mejor protector Es probable que estas dos cepas presenten una
configuracioacuten diferente de sus proteiacutenas de membrana que impida la reaccioacuten amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra que proteja a las proteiacutenas de membrana o
citosoacutelicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteiacutenas)
Es conocido que en general los disacaacuteridos mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan Herman White amp Vesey
2006) esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13
A diferencia de la glucosa la sacarosa es un azuacutecar no reductor estos pueden proteger las
ceacutelulas al competir por la unioacuten en la membrana con los azucares reductores (Hensel 1994) Se ha
demostrado que la sacarosa mantiene las proteiacutenas secas igual que en sus conformaciones
hidratadas Leslie et al (1995) indican que este fenoacutemeno sucede probablemente ldquomediante la
unioacuten a los dominios hidroacutefilos de las proteiacutenas y la prevencioacuten de enlaces de hidroacutegeno inter e
intra proteiacutenas durante el secado y la reconstitucioacutenrdquo (paacuteg 3596) lo cual contribuye a las altas tasas
de supervivencia al usar este lioprotector
Para que un protector funcione eacuteste debe proteger la bicapa lipiacutedica y para ello debe existir
dentro y fuera de las ceacutelulas (Leslie et al 1995 Palmfeldt et al 2003) el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transicioacuten de
membrana ya que en eacutesta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentracioacuten (Leslie et al 1995) reemplazando el agua intracelular lo cual se conoce como la
hipoacutetesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al 2003) Si esto se cumple la concentracioacuten
intracelular seraacute alta y el tiempo antes de la congelacioacuten y el secado debe ser corto por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequentildeo (Leslie et al 1995) y los productos polares
extracelulares seraacuten miacutenimos
Ademaacutes tanto la glucosa y la sacarosa estaacuten dentro de la categoriacutea de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo este estado viacutetreo ldquoInduce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una ceacutelula para detener la movilidad
molecular a un miacutenimo El vidrio amorfo inerte tambieacuten es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las ceacutelulas dentro de la estructura de vidrio antes de la congelacioacuten lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquiacutemicos irreversibles en la
membrana plasmaacutetica durante el almacenamientordquo (Morgan et al 2006 paacuteg 186)
51
La retencioacuten de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilizacioacuten
como en la criopreservacioacuten
Cabe mencionar que el proceso de deshidratacioacuten y de reemplazo de agua intracelular por
parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un liacutemite ya que como lo
menciona Heckly (citado por Perry 1995) al congelarse el agua del medio las ceacutelulas sufren
deshidratacioacuten reduciendo el punto de congelacioacuten en el interior y evitando la formacioacuten de
cristales de hielo pero al seguir bajando la temperatura las concentraciones de solutos aumentan
Perry (1995) cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelacioacuten estaacuten posiblemente
asociados a estas soluciones excesivamente concentradas puesto que no se han encontrado
evidencias de lesiones mecaacutenicas por hielo extracelular Esto corresponderiacutea con los resultados
obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores como lo fue la glucosa al 27 en casi
todas las cepas (exceptuando CM-CR006 Figura 10) recordando que un protector funciona mejor
en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmoacutetico con el interior de las bacterias (conocer
la concentracioacuten intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilizacioacuten
por parte de eacuteste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo como se muestra en el
trabajo de Palmfeldt et al (2003)
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta un ejemplo claro es la cepa CM-CR004 la cual de hecho ante los
gluacutecidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentoacute resultados aceptables Morgan et al
(2006) mencionan (teniendo como referencia la investigacioacuten de Buitink et al) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteiacutenas presentes en esta sustancia son
maacutes estables y juegan un importante papel en la formacioacuten del estado viacutetreo lo cual induce a pensar
que una oacuteptima mezcla de proteiacutenas y azucares permite una proteccioacuten maacutes eficiente Esta
posibilidad corresponderiacutea a los resultados obtenidos donde la concentracioacuten de los componentes
de la leche descremada seriacutean propicios para la cepa CM-CR004 en tanto que para las demaacutes cepas
seriacutean maacutes bajas o maacutes altas de lo propicio Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de gluacutecidos y proteiacutenas que la componen pero no
establece cuales son estos pudiendo ser positivos o negativos para la liofilizacioacuten
En general los cultivos liacutequidos ofrecen un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables (Ops
Diagnostics 2015) sin embargo la viabilidad depende muacuteltiples factores incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos El medio SMPG estaacute disentildeado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse raacutepidamente la fuente de carbono (glucosa) una bacteria
de raacutepido crecimiento entraraacute en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio una
de lento crecimiento al cabo del mismo tiempo estaraacute en fase log no obstante en el medio SPC
los nutrientes tardan maacutes tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas todas las bacterias
estaraacuten en fase log Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de raacutepido crecimiento mientras que
CM-CR004 006 y 009 son de crecimiento un poco maacutes lento (datos obtenidos del conteo con
caacutemara de Neubauer no incluidos en el presente estudio)
Morgan et al 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisioloacutegicos
en las bacterias relacionado generalmente con la privacioacuten de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles desencadenando una respuesta ante el estreacutes para permitir la
supervivencia de la poblacioacuten celular Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecacioacuten y las temperaturas menos propicias para su crecimiento por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilizacioacuten Sin embargo la
fase de crecimiento oacuteptima para la supervivencia en la desecacioacuten es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al 2006 paacuteg 185) Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14 indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
liacutequido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log asiacute mismo las cepas CM-CR004 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria pudiendo ser mayor o menor
En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilizacioacuten definitiva se observoacute puffing
y pitting y si bien Vemulapalli et al (2015) indican que estos cambios no afectan la calidad del
producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada Jennings (2008) advierte que su
presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada y que esta puede
deberse a un sistema con composicioacuten diferente de la formulacioacuten principal y podriacutea conducir a
interacciones tales como la agregacioacuten de proteiacutenas ademaacutes se observoacute (Figura 15 izquierda y
centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulacioacuten inicial de glucosa y
sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16) ldquodebido a una accioacuten combinada de la fusioacuten
(maacutes o menos importante) y de la presioacuten reducida dando lugar al puffingrdquo (Ticoacute G 1987 paacuteg
70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings 2008) seguacuten la cantidad del
material afectado por el puffing Esta caracteriacutestica se asocia con un error en los paraacutemetros de
liofilizacioacuten por ello se revisoacute exhaustivamente el proceso de liofilizacioacuten encontrando que los
liofilizados alcanzaron la temperatura de fusioacuten durante el proceso de secado primario por la
inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador el cual no habiacutea sido descrito en el
proceso piloto de liofilizacioacuten con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del
control de calidad A causa de esto los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los
uacutenicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha)
Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura
a los -32 y -42 degC asiacute como un melting inicial a -32degC y -42degC respectivamente seguacuten lo reporta
Moreira Gutieacuterrez amp Delgado (1994) Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento
del liofilizador
Las Tablas 15 y 16 que resumen las caracteriacutesticas tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados muestran que el color textura brillo y fractura de viales estaacuten dentro de los
paraacutemetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilizacioacuten correcta
con las formulaciones utilizadas no obstante se detectaron variaciones posliofilizacioacuten
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales Inicialmente se pensoacute
en una falla durante el tiempo de almacenamiento dado que los liofilizados maacutes afectados fueron
de las series B y C sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada se determinoacute que la causa de fallo yaciacutea en la
obtencioacuten de humedad por parte del producto liofilizado La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vaciacuteo absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vaciacuteo estos habiacutean absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilizacioacuten esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscoacutepica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad maacutes bajo que la sacarosa) debido a la
53
ldquofacilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidroacutegeno con el aguardquo (Badui
Dergal 2006 paacuteg 73) ldquoPara reducir el nuacutemero de moleacuteculas de agua el proceso de liofilizacioacuten y
el sellado de los viales al vaciacuteo debe haber sido exitoso y asiacute obtener un producto con el contenido
de humedad deseadordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 78) por lo cual se descarta la utilizacioacuten del
instrumento manifold para la liofilizacioacuten cepas en el Banco Geneacutetico
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilizacioacuten siempre deben ser
de vidrio ya que el vapor de agua atmosfeacuterico se puede difundir a traveacutes de los tubos de plaacutestico y
por ende las muestras secas terminariacutean absorbiendo agua Esto se comproboacute con la utilizacioacuten de
crioviales que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vaciacuteo sino que ademaacutes en
la serie C casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dantildeados presentaban
cambios de coloracioacuten (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloracioacuten
oscura como lo muestra la Tabla 15) o una marcada reduccioacuten en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentracioacuten) Esto tambieacuten se ve correlacionado con la peacuterdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008) la
humedad es la principal responsable en la peacuterdida de viabilidad en el producto liofilizado
reduciendo la vida uacutetil de los organismos La obtencioacuten de agua implica un retroceso del proceso
de liofilizacioacuten el dantildeo de la matriz formada el flujo de los residuos extracelulares polares es
decir la reactivacioacuten del organismo ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquiacutemica el metabolismo (Adams 2007) finalmente la muerte celular al agotarse esta
El tiempo de redisolucioacuten y el tipo de reconstituyente tambieacuten es de gran importancia La
Tabla 17 muestra tiempos de redisolucioacuten bastante altos para las formulaciones de glucosa Con
los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisioacuten del proceso de liofilizacioacuten se determinoacute la
retrofusioacuten producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de
redisolucioacuten causando un efecto grave donde la interaccioacuten entre las moleacuteculas es tal que la matriz
del liofilizado es casi insoluble (Jennings 2008) El aumento de la temperatura demasiado raacutepido
en el proceso de la liofilizacioacuten o por encima de Tg resultoacute en el colapso haciendo la
reconstitucioacuten mucho maacutes difiacutecil (Fetterolf 2010) Jennings (2008) indica que un aumento en el
aacuterea superficial por unidad de volumen de la torta tenderaacute a disminuir el tiempo de reconstitucioacuten
lo cual sucedioacute para todos los liofilizados que presentaron melting puffing y pitting ya que su
volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulacioacuten congelada solo los
liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulacioacuten
congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitucioacuten
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed amp Roos (2004) quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo se sugiere en muacuteltiples estudios
ademaacutes el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4degC plusmn 1degC en la
oscuridad (Ops Diagnostics 2015)
Se siguioacute los procedimientos de documentacioacuten establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
para la criopreservacioacuten y la elaboracioacuten de los nuevos protocolos de liofilizacioacuten encontrando
como lo menciona Gonzaacuteles et al (2006) que es necesario contar con sistemas de documentacioacuten
eficiente ademaacutes contar con duplicados de la informacioacuten en medios fiacutesicos y magneacuteticos evitado
la perdida de informacioacuten (Montes de Oca et al 2008) y el raacutepido acceso a la misma
54
7 CONCLUSIONES
En general el estado de criopreservacioacuten de las cepas evaluadas es oacuteptimo obteniendo tasas
de supervivencia satisfactorias Sin embargo el criopreservante no funciona de igual forma para
todas las cepas debido a las caracteriacutesticas propias de cada organismo que limitan la accioacuten del
glicerol
De acuerdo a la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten realizada con los tres indicadores
(viabilidad pureza y estabilidad morfoloacutegica) la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados siendo la concentracioacuten al 10pv la maacutes oacuteptima No obstante su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado hermeacuteticamente y al vaciacuteo El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada aunque no se determinoacute la concentracioacuten maacutes oacuteptima
En cuanto a la glucosa al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo se observa
que pese a no ser un buen lioprotector concentraciones de glucosa entre el 6 y el 10 pv son
funcionales aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50
No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten estos
fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminacioacuten de las muestras y a su
vez evitar la contaminacioacuten por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso
Se creoacute el protocolo para el proceso de liofilizacioacuten en todas sus etapas Este es
metodoloacutegicamente funcional y faacutecilmente reproducible por ello se estandariza para el Banco
Geneacutetico seccioacuten liofilizacioacuten dentro del nuevo manual de procedimientos de conservacioacuten Se
incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservacioacuten dentro de este
manual ajustado a las necesidades especiacuteficas de seguridad de la liofilizacioacuten
Es importante mantener actualizado los diferentes medios fiacutesicos y magneacuteticos donde reposa
la informacioacuten de las colecciones y los microorganismos en ellos dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Geneacutetico y la informacioacuten se puede perder
La falta de la identificacioacuten hasta cepa (al menos hasta geacutenero) de los microorganismos
presentes en el banco geneacutetico limita la informacioacuten para entender los fenoacutemenos relacionados a
los procesos de conservacioacuten y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo
55
8 RECOMENDACIONES
Existen paraacutemetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente como la edad del cultivo la
concentracioacuten celular entre otros Se propone el estudio de los paraacutemetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilizacioacuten con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos por ello se sugiere la creacioacuten
de un modelo matemaacutetico para que sea funcional esta prueba lo cual generariacutea datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo
Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinacioacuten de lioprotectores con formadores
de matrices y estabilizantes siguiendo los protocolos establecidos Mezclas de sacarosa al 10 pv
con leche descremada 10 pv (de la misma marca usada en este estudio) sacarosa al 10 pv con
leche descremada 10 pv y carboacuten activado asiacute como la utilizacioacuten de estas mezclas con trehalosa
en distintas concentraciones son sugeridas
Es necesaria la creacioacuten de una plataforma online del banco geneacutetico una vez este cuente con la
identificacioacuten de los organismos contenidos asiacute mismo es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco geneacutetico distinto a Access preferiblemente que obedezca a una
creacioacuten propia de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Es necesaria la creacioacuten de una pasantiacutea anual para curaduriacutea del Banco Geneacutetico ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepcioacuten de cepas Ademaacutes se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas como aquellas que sean donadas al Banco Geneacutetico en el futuro
56
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62
11 ANEXOS
Anexo 1 Formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-XX00Xa
Descripcioacuten Fotografiacutea
Borde o Margen
Frente a luz Brillanteopaca
Forma
Elevacioacuten
Color
Tamantildeo
Superficie
Consistencia
Grado de
Transparencia
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis
Pigmentos que desprende la colonia
y se observan sobre el medio
Olor
Hemolisis
MedioT(degC)
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen
un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace
la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad
del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos
Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen
Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta
Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
63
Anexo 2 Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados
a) Recubrimiento (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido cartoacuten y autoadhesivo de
emulsioacuten acuosa
b) Bandeja de liofilizados
c) Soporte para bandeja
d) Cojiacuten de siacutelice gel (reemplazo seguacuten el tamantildeo y cantidad de cojines de 2 meses a 1 antildeo)
El banco de liofilizados estaacute dividido en tres secciones
La seccioacuten de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A B y C respectivamente
La seccioacuten de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D E y F respectivamente
La seccioacuten de hongos (color cafeacute) correspondiente a las bandejas G H e I respectivamente
64
Bandeja de liofilizados
Estaacute hecha de poliestireno expandido viene con 100 compartimientos individuales para un maacuteximo
de 100 viales por bandeja
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
10 20
30 40
50 60
70
80
90 100
01
11 21
31
41
51
61 71
81
91
65
Anexo 3 Esquema general del cepario madre de liofilizados
J Hongos
K Bacterias
L Algas
F Fila
Nuacutemeros compartimento correspondiente a cada vial La numeracioacuten va en zigzag
J K L
F1 F1 F1 F2 F2 F2 F3 F3 F3
1
8 8 8
9 9 9 1 1
16 16 16 24 24 24
17 17 17
66
Anexo 4 Caacutemara de envejecimiento artesanal
Esta caacutemara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y
humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra La humedad relativa
puede controlarse seguacuten si se use agua (100) o una concentracioacuten determinada de solucioacuten salina
ver Colmenares R (2015)
Horno de 37degC (caacutemara externa)
Caacutemara
interna
Termoacutemetro
Tapa de sello
hermeacutetico
Malla de
soporte
Viales
Agua o sn salina
67
Anexo 5 Base de datos en Access
Esquema general de la Base de datos del Banco Geneacutetico
Espacio de trabajo con las tablas
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
informacioacuten
maacutes detallada)
68
Anexo 6 Formato de las Fichas Resumen
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FICHA RESUMEN DE LA COLECCIOacuteN
Ubicacioacuten de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Fuente de obtencioacuten
de las cepas
Fecha de
ingreso
Cantidad de cepas Tipo de organismos
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa)
Ubicacioacuten de cepas (seguacuten todos los meacutetodos
de conservacioacuten utilizados para la coleccioacuten)
Autores o donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos y Formatos de control
69
Anexo 7 Formatos de control de la seccioacuten liofilizacioacuten
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
Lugar (Ciudad y Paiacutes) Fecha de ingreso
Origen de
la cepa
Institucioacuten Organizacioacuten o
Empresa donante
Persona que realizoacute el
aislamiento
Cargo Fecha de
aislamiento
Informacioacuten de contacto
Fuente de obtencioacuten
de la cepa
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Identificacioacuten geneacutetica
de la cepa
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Calidad de la
cepa recibida
Restriccioacuten de
distribucioacuten
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Observaciones Nivel de
Bioseguridad
N1 N2 N3 N4
Persona donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
70
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL
FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN
CM-_ _0_ _
Proceso
Fecha Hora
Ciudad Equipo
Lioprotector y
concentracioacuten
Temperatura (degC)
Presioacuten (mbar)
Duracioacuten (min) Accesorio de
secado
Responsable (s) del proceso
Ubicacioacuten
Coacutedigo de la
cepa
Nombre de
la coleccioacuten
Viales
almacenados
Tipo S T Lf Total Sello al vaciacuteo SI NO
Cantidad Sello de Aluminio SI NO
Pruebas de
Viabilidad
Caracterizacioacuten
macroscoacutepica (resumen)
Caracterizacioacuten
microscoacutepica (resumen)
Concentracioacuten celular
(UCF)
Preliofilizacioacuten
Posliofilizacioacuten
Bioquiacutemicas
Otras
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
71
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS
CEPAS
CM-_ _0_ _
Detalles del
Proceso
Fecha Ciudad
Hora Coacutedigo de cepa
Viales a evaluar T S Lf Temperatura (degC)
Viales en mal estado T S Lf Presioacuten (Mbar)
Fecha de liofilizacioacuten Fecha de evaluacioacuten Total tiempo (meses)
Descripcioacuten
de la cepa
Geacutenero-especie del
microorganismo
Nombre de la
Coleccioacuten
Car
acte
riza
cioacuten
Microscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Microscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Observaciones
Viabilidad Concentracioacuten Celular
(UFC) Preliofilizacioacuten
Concentracioacuten Celular
(UFC) Posliofilizacioacuten
Observaciones
Control
de
Calidad
Bioquiacutemicas
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Pruebas
Cristal
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Otras Pruebas Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Observaciones
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
72
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD
DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS
CM-_ _0_ _
Lugar (Ciudad Paiacutes) Fecha
Informacioacuten
del
solicitante
Institucioacuten Organizacioacuten
o Empresa
Solicitante Cargo
Teleacutefono (s) Email
Descripcioacuten
de la cepa
Coacutedigo de
cepa
Geacutenero ndash especie
Microorganismo
Coleccioacuten
Utilizacioacuten de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
73
Anexo 8 Manual de procedimientos de conservacioacuten para el Banco Geneacutetico del Laboratorio
de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (Ver archivo adjunto)
Manual de procedimientos de
conservacioacuten para el Banco
Geneacutetico del Laboratorio de
Microbiologiacutea Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute
de Caldas
Primera Edicioacuten
Editado por
Andreacutes V Castantildeeda R
Manual de procedimientos de conservacioacuten para el
Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Ingenieriacutea Sanitaria
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
Licenciado en Biologiacutea
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales
Niria Pastora Bonza Peacuterez
Docente encargado del Laboratorio de Microbiologiacutea y
coordinador de Ingenieriacutea Sanitaria
Miguel Aacutengel Piragauta Aguilar
Disentildeo y diagramacioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
avicent29gmailcom
Autoriacutea y Edicioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda R
2015
Todos los derechos reservados
TABLA DE CONTENIDO
TIacuteTULO PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
RECEPCIOacuteN DE CEPAS 2
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS 3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES 5
Medios 5
Reactivos 6
Protectores generales 6
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN 7
Indicador uno Viabilidad 7
Conteo directo con caacutemara de neubauer (110mm) 7
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa 10
Indicador dos Estabilidad morfoloacutegica 12
Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) 12
Tincioacuten de gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) 13
Indicador tres Pureza de la cepa 13
RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS 14
Criopreservados (descongelamiento) 14
Liofilizados (rehidratacioacuten o reconstitucioacuten) 14
REFRIGERACIOacuteN 15
CRIOPRESERVACIOacuteN 16
Precriopreservacioacuten 16
Preparacioacuten del inoculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 16
LIOFILIZACIOacuteN 17
Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano 17
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 17
IV
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Posliofilizacioacuten 18
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos 18
ROacuteTULOS 19
Refrigeracioacuten 19
Criopreservacioacuten 19
Liofilizacioacuten 20
TIacuteTULO 2 PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONSERVACIOacuteN Y EN EL LABORATORIO
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN 23
Medios 23
Ambiente 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores 23
Cabina de flujo laminar 23
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 24
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS 24
Desechos no contaminados (no infecciosos) 24
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en
autoclave y reutilizado 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado 25
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa 25
BIOSEGURIDAD 26
Proteccioacuten personal 26
Procedimientos 27
Aacutereas de trabajo 27
Capacitaciones 27
REFERENCIAS 28
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dilucioacuten en serie 7 Figura 2 Conteo directo 8 Figura 3 Conteo en bacterias 8 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky 10 Figura 5 Contador de colonias 11 Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados 19 Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer 19 Figura 8 Roacutetulos para los crioviales 19 Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso 4 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG 5 Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos 5 Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos 6 Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer 9 Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 21
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIacuteMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL
kPa Kilo pascales
min Minutos
s Segundos
microl microlitros
mm miliacutemetros
degC grados Celsius
pv porcentaje peso a volumen
mTorr militorricelli
mbar milibar
g gramos
ml mililitros
UCF Unidades formadoras de colonias
rpm Revoluciones por minuto
vv Porcentaje volumen a volumen
iexclPrecaucioacuten
iexclA tener en cuenta
VI
INTRODUCCIOacuteN
Este manual representa en conjunto el trabajo a traveacutes del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigacioacuten han sentado los pilares para la formacioacuten del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC ) cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservacioacuten y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigacioacuten que permita a la comunidad acadeacutemica de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbioloacutegicos en las aacutereas de biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnoloacutegica para el paiacutes Aquiacute se presentan los tres meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos aplicados en este Banco Geneacutetico Refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten Se hace eacutenfasis en los diferentes procesos materiales equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Geneacutetico
Protocolos para la
conservacioacuten de
microorganismos
2
RECEPCIOacuteN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco geneacutetico debe contar con las siguientes condiciones miacutenimas de recepcioacuten
La cepa se debe encontrar en estado de pureza Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Geneacutetico
biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnologiacutea Debe contar con un responsable entidad o institucioacuten donante que respalde
la(s) cepa(s) entregadas ademaacutes de contar con la informacioacuten de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad
La cepa o coleccioacuten debe contar con toda la informacioacuten que el Banco
geneacutetico requiera para su mantenimiento conservacioacuten y registro en la base de datos
La cepa o coleccioacuten debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles
de Bioseguridad establecidos por la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) siendo el nivel de bioseguridad 2 el maacuteximo permitido por las instalaciones del laboratorio con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo
Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado
investigaciones entre otras) se debe pasar con 15 diacuteas de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS al docente encargado
Una vez recibida la cepa se diligencian los mismos registros en digital se
anexa la informacioacuten a la base de datos asignaacutendole un coacutedigo y se diligencian las fichas de resumen
3
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS El personal encargado del Banco Geneacutetico debe realizar una verificacioacuten de la
pureza de la cepa esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada sobre una o maacutes cajas de Petri con el medio de cultivo el tiempo y temperatura de incubacioacuten especificados por quien hace la donacioacuten Asiacute mismo a partir de este subcultivo se debe realizar la evaluacioacuten de la efica-cia del meacutetodo de conservacioacuten para verificar la informacioacuten dada por el investi-gador donante
Posterior al proceso de recepcioacuten de cepas es importante tener en cuenta
que se debe verificar la fecha de la uacuteltima siembra para determinar si es apro-piado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder despueacutes al proceso de criopreservacioacuten o liofilizacioacuten
Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las
cepas por maacutes de dos meses antes de la criopreservacioacuten o la liofilizacioacuten se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservaacutendola por el meacutetodo de refrigeracioacuten con el fin de evitar que la cepa se pierda
Si se requieren hacer pruebas bioquiacutemicas pruebas cristal u otras pruebas
complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos se tendraacute que pedir la autorizacioacuten del responsable del Banco Ge-neacutetico y del encargado del laboratorio debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposicioacuten de material en el laboratorio
Nota Si alguna cepa llegara a presentar contaminacioacuten se debe informar a la persona responsable del Banco Geneacutetico y posteriormente a la persona entidad o institucioacuten donante
4
EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservacioacuten
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso
Proceso o meacutetodo Equipo Material
Refrigeracioacuten Nevera Thermolab 14-E0107 Tubo de ensayo tapa rosca
Cabina de flujo laminar Asa redonda
Esterilizador de asas
Criopreservacioacuten
Cabina de flujo laminar Crioviales Voacutertex Puntas azules Micropipeta graduable de 100-1000 microl
Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la coleccioacuten
Frascos Schott con tapa para el glicerol
Pipeteador Pipeta de 1ml o 5ml
Liofilizacioacuten
Esterilizador de asas Asa redonda
Voacutertex Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Cabina de flujo laminar Puntas azules y amarillas Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile
Recipiente de poliestireno expandido cerrado
Crimper Sello de aluminio Micropipetas graduables de 100-1000microl y 20-200microl
Pinzas Vial 5mm con tapoacuten de divisioacuten
Evaluacioacuten del
meacutetodo de
conservacioacuten
Caacutemara de Neubauer 110mm Laminilla de cuarzo
Caacutemara AxioCam ICc5 Laminas porta objetos
Microscopio Axio Scope A1 Laminillas cubre objetos
Contador de colonias CC-1 Marcador
Estereoscopio Zeiss Asa redonda
Incubadora de 25degy 37degC Asa de Drigalsky
Micropipeta graduable 100-1000microl 20-200microl y 5-20microl
Puntas azules amarillas y blancas
Voacutertex Goteros
Recuperacioacuten de
los
microorganismos
Micropipeta graduable 100-1000microl y 20-200microl
Puntas azules y amarillas
Tubos de ensayo
Cabina de flujo laminar Cajas de Petri con medio
Plancha de calentamiento Mechero
Demaacutes equipos y materiales utilizados en la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten
Beaker
Termoacutemetro
Cajas de Petri con medio
Tubos de ensayo
-Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiologiacutea
5
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Geneacutetico cuenta con medios reactivos y protectores generales definidos para los meacutetodos de preservacioacuten manutencioacuten y recuperacioacuten de microrganismos Estos se describen a continuacioacuten y se clasifican de acuerdo al meacutetodo de conservacioacuten en la Tabla 4
Medios CALDO SMPG Este medio es empleado para el crecimiento del inoacuteculo inicial y
en la formulacioacuten de la criopreservacioacuten Su composicioacuten se muestra en las Tablas 2 y 3 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG
Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos
SPC (Standard Plate Count) Este medio se utiliza para la teacutecnica de evaluacioacuten
de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Tambieacuten puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas
Agar nutritivo (AN) o medios especiacuteficos Utilizados como medio de
mantenimiento o para pruebas bioquiacutemicas yo fisicoquiacutemicas (si se realizan) en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Buffer agua peptonada Este medio se utiliza en la rehidratacioacuten y en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 76
Microelementos 076
Peptona 1
Glucosa 01
MACROELEMENTOS Cantidad MICROELEMENTOS Cantidad
MgSO4 2 g CuSO4- 5H2O 005 g
NaNO3 2 g H3BO3 01 g
KCl 015 g MnSO4 ndash H2O 01 g
CaCl2 21 g ZnSO4 ndash 7H2O 01 g
Na2HPO4 09 g Agua destilada 1000 ml
FeSO47H2O 001 g
Agua destilada 1000 ml
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Reactivos Tincioacuten Gram La bateriacutea de reactivos para la Tincioacuten de Gram se utiliza en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Alcohol acetona Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo Agua destilada Se utiliza en todos los procedimientos para la preparacioacuten de
medios la descongelacioacuten y especialmente en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Alcohol Para desinfeccioacuten en todos los procedimientos (70) o para mecheros (95)
Aceite de inmersioacuten Se utiliza para la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten durante las observaciones microscoacutepicas
Nitroacutegeno Liacutequido Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilizacioacuten
Protectores generales Crioprotector Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservacioacuten en
proporcioacuten 67vv respecto al criovial Lioprotector Se utiliza una solucioacuten de Sacarosa 10 pv para las
formulaciones en la liofilizacioacuten bacteriana En hongos se utiliza leche descremada al 12 pv No se tiene detalles de lioprotector oacuteptimo en algas
Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos
Nota Dado que en la refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se realiza la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten se incluyen aquiacute los reactivos implicados en dicha evaluacioacuten
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten Liofilizacioacuten R
eacti
vos
Tincioacuten Gram SI SI SI
Alcohol acetona SI SI SI
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de inmersioacuten
SI SI SI
Nitroacutegeno Liacutequido NO NO SI
Me
dio
s
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios especiacuteficos
OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
Agua peptonada SI SI SI
Pro
tecto
r
Glicerol anhidro NO SI NO
Sacarosa 10pv
NO
NO SI
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EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN
Indicador uno Viabilidad Conteo directo con caacutemara de Neubauer (110mm)
Se parte de un tubo de dilucioacuten (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto el cual tiene por lo general un tiempo de incubacioacuten de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo Figura 1 Dilucioacuten en serie Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser esteacuteriles usando una nueva en cada transferencia El diluyente es agua peptonada al 01 pv
Tome la caacutemara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia
Observe las dos cuadriculas de la caacutemara que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H)
Agite el tubo de dilucioacuten seleccionado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s tomando con una micropipeta una aliacutecuota de 10microl y depositaacutendola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla dejando que se cargue por capilaridad de forma homogeacutenea (Figura 2-A) Posteriormente lleve al microscopio enfocando desde el menor aumento hasta eacutel objetivo 40x al tiempo que ajusta la intensidad lumiacutenica para poder observar las liacuteneas de la caacutemara y las ceacutelulas al tiempo
-Algunos modelos de Voacutertex no poseen un rango de velocidad sino de niveles -Para limpiar la caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo lave primero con agua destilada luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada Deje secar al ambiente -Para una correcta observacioacuten al microscopio utilice el meacutetodo de enfoque de Koumlhler -Procure no limpiar la laminilla con ninguacuten papel o pantildeo lo puede rayar -Este procedimiento debe durar maacuteximo 10min ya que la solucioacuten podriacutea secarse debido a la luz del microscopio
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Figura 2 Conteo directo A Utilizacioacuten de la caacutemara de Neubauer 1 posicioacuten de la laminilla 2 posicioacuten de la punta para el deposito de la muestra B esquema general de la caacutemara de Neubauer Adaptado de Bastidas (2015) httpwwwceleromicscomesresourcesdocsArticlesFormula-Camara-Neubauer-Concentracionpdf amp Universitat de Barcelona (2015) httpwwwubeduLabFisioimagesstoriesFisAnimalBiologiaSangrecontadorTomapng
El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central Las foacutermulas y los cuadros a contar se determinan seguacuten el tamantildeo del microorganismo
Hongos y microalgas Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes
(cuadros 1 y cuadro central Figura 2-B) de izquierda a derecha Bacterias Cuente en el cuadro central que contiene 25 cuadros secundarios
(Figura 2-B) 5 de ellos (Figura 3-A o B) Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios en estos las ceacutelulas deben contarse en la direccioacuten que se indica en la Figura 3-C Los cuadros terciarios contienen tres liacuteneas en los extremos por ello se deben tener en cuenta las ceacutelulas que esteacuten desde la liacutenea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D
Figura 3 Conteo en bacterias A y B Forma de contar los cuadros terciarios C Direccioacuten de conteo en los cuadros terciarios D Ceacutelulas a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios
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Es importante resaltar que las bacterias que esteacuten unidas se contaraacuten como una Una vez obtenido el nuacutemero total de ceacutelulas se realizaran los caacutelculos correspondientes a los cuadros utilizados Para obtener el nuacutemero de bacterias se utiliza la ecuacioacuten planteada a partir de Bastidas (2015) Ndeg de bacteriasml=
En el caso de hongos y microalgas se utiliza la siguiente ecuacioacuten a partir de Bastidas (2015) Ndeg de ceacutelulasml= Fd Factor de dilucioacuten = Nota El meacutetodo de conteo en caacutemara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de ceacutelulas en los procedimientos de conservacioacuten de microorganismos Pero si se requiere la utilizacioacuten de otro meacutetodo se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados
Consideremos el siguiente ejemplo Tenemos un tubo con cultivo en medio liacutequido (10ml) de 36 horas este seraacute
nuestra muestra inicial Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con aliacutecuotas de 1ml en 9ml de diluyente Se realiza el procedimiento descrito en las paacuteginas anteriores haciendo un solo conteo Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de aliacutecuota g o ml de aliacutecuota + g o ml de diluyente
Ndeg Total de ceacutelulas contadas times 10000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
-El conteo directo con caacutemara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al meacutetodo de conservacioacuten evaluado
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
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Aplicando la ecuacioacuten para bacterias anteriormente mostrada tenemos que
Ndeg de bacteriasml=
= 81012 bacteriasml
81012 bacteriasml seraacute la cantidad de bacterias que ldquoexistenrdquo en la muestra inicial Esta en teacuterminos matemaacuteticos de las diluciones equivale a 100
Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas contando en los
cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuacioacuten tenemos que Ndeg de ceacutelulasml= = 321011 ceacutelulasml
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Seleccione tres tubos de la dilucioacuten seriada y de cada uno vierta aliacutecuotas de 100microl (agitando con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) antes de cada extraccioacuten) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio Raacutepidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky esteacuteril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky A La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atraacutes B Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro luego girar 90deg la caja y repetir el proceso
A B
90deg
16 times 250000
10-7 times 5
-Si se quieren datos maacutes fiables se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma aliacutecuota o poner en la caacutemara cinco aliacutecuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras -Al realizar el conteo en la caacutemara de Neubauer obtenemos el total aproximado de ceacutelulas presentes en la dilucioacuten utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado yo las impurezas que pueda contener la muestra por lo cual no es 100 exacto y no indica las ceacutelulas viables
16 times 10000 10-7 times 5
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Deje secar por miacutenimo 15min y lleve a incubacioacuten en posicioacuten invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja) Seguacuten el tipo de organismo las condiciones de incubacioacuten para la lectura de las cajas son
Bacterias temperatura ambiente 37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento
si se conoce Incubacioacuten de 18-24 horas Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas Casos extremos de crecimiento lento una semana
Hongos temperatura inferior a 25degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten de una siembra de solucioacuten de conidios de 4-8 diacuteas
Algas temperatura entre 25-37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten por maacuteximo 7 diacuteas en organismos descongelados o rehidratados
Luego de la incubacioacuten las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura
5) Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFCml)
Figura 5 Contador de colonias La caja de Petri se coloca en posicioacuten invertida y se marcan las colinas el contador cuenta al tacto
-La siembra por tubo se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador -Generalmente se toman las diluciones 10-5 10-6 y 10-7 Sin embargo si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3 10-4 y 10-5 -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70 flamear esperar a que el alcohol se consuma Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar por uacuteltimo palpe raacutepida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender para enfriar totalmente -Puede usarse una siembra en profundidad u otro meacutetodo para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie Sin embargo los demaacutes meacutetodos de conteo limitan la evaluacioacuten del indicador dos -Si al cabo de 30min las cajas no han secado el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condicioacuten -Con la punta de la micropipeta no toque el medio -Siempre use guantes y desinfeacutectelos constantemente durante los procedimientos
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En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250 al suponer que cada ceacutelula forma una colonia Para el caacutelculo de UFCml utilizamos una adaptacioacuten de la foacutermula de Valencia Z(2004)
UFCml = times times
Ejemplo 120 X 107 X 10 = 121010 UFCml
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten se calcula a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010) Tasa de supervivencia (BSR )=
Donde DD Despueacutes de la desecacioacuten AD Antes de la desecacioacuten
Indicador dos Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realiza Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas)
Diligenciar el formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas (anexo 1) descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de ldquoconteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Hay que tener en cuenta que
- Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas) de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas deben ser observadas en al menos el 80 de las colonias de la placa seleccionada
Ndeg de colonias (promedio entre las cajas por dilucioacuten)
Inverso del factor de dilucioacuten
Inverso del volumen de aliacutecuota
-La metodologiacutea y los criterios de eleccioacuten de cajas asiacute como el rango son seguidas de Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo todas las placas por dilucioacuten por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -El inverso del volumen de aliacutecuota corresponde a una medida de correccioacuten obligatoria para la siembra en superficie ya que en la praacutectica se aumenta en 110 el factor de dilucioacuten al sembrar 01ml (100microl) del tubo de dilucioacuten seleccionado
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100 Log (Ndeg UFCml AD)
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Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se realice una ldquocoloracioacuten de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005 paacuteg 24) En el caso de hongos realice una coloracioacuten simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado
Por uacuteltimo comparar los resultados con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y
macroscoacutepicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se toma registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio con caacutemara
Indicador tres Pureza de la cepa
Este indicador evaluacutea la pureza de un vialcriovial rehidratadodescongelado ademaacutes permite determinar si existe un cambio geneacutetico durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservacioacuten Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimaacutetica usando una bateriacutea de pruebas bioquiacutemicas o fisicoquiacutemicas diferenciales dependiendo de los requerimientos especiacuteficos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio Se recomienda realizar cada prueba por triplicado Tambieacuten puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales
-Realice una coloracioacuten de Gram estaacutendar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotograacutefico en un lapso no mayor a dos diacuteas -En los hongos es imprescindible el registro fotograacutefico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonoacutemica -El formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas exige un registro fotograacutefico pero alliacute solo se consignan si las fotografiacuteas son de alta calidad de lo contrario solo se dejan en la base de datos como referencia -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos -La estabilidad morfoloacutegica se evaluacutea pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -Para comparar las caracteriacutesticas macroscoacutepicas con la informacioacuten de origen se deben usar los mismos medios El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos
Si se confirma variacioacuten en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen y estas confirman la variacioacuten geneacutetica de la cepa inmediatamente se saca de la coleccioacuten origen se asigna un nuevo coacutedigo de identificacioacuten y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa Puede incluirse en la coleccioacuten Praacutecticas Acadeacutemicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva coleccioacuten
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RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento) Se toma un criovial (Semistock preferiblemente) sometieacutendolo a una
temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente 5min (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Los crioviales se introducen en bantildeo seroloacutegico una vez se llega a la temperatura deseada no antes
Del criovial se toma 1ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex
nivel 7 (asymp2240rpm) por 10s diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
La evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten se realiza al criovial luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubacioacuten (viables poscriopreservacioacuten) Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Geneacutetico
Liofilizados (Rehidratacioacuten o reconstitucioacuten)
Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC los viales a usar tomando el tiempo de rehidratacioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitando con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se toma un 1ml de este vial partiendo de esta aliacutecuota se realiza evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en medio soacutelido El indicador de viabilidad se evaluacutea solo con el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa u otro meacutetodo de conteo de organismos viables
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-dor donante sugiera otros meacutetodos de recuperacioacuten -La solucioacuten de rehidratacioacuten puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solucioacuten lioprotectora de la formulacioacuten -En el momento en que solo quede un criovialvial disponible de la cepa se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservacioacuten a partir de este
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REFRIGERACIOacuteN
Se implementa el meacutetodo de resiembra continua en este el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-Garciacutea et al 2010) cuando es utilizado para su almacenado nuevamente Se debe tener en cuenta los siguientes paraacutemetros
a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las
caracteriacutesticas del microorganismo ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios despueacutes de diacuteas semanas o meses Tambieacuten depende del tipo de medio de mantenimiento
b) El riesgo de contaminacioacuten y de cambios geneacuteticos se incrementa a mayor nuacutemero de transferencias
De acuerdo a esto para el laboratorio se determina
a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo
tapa rosca con Agar inclinado b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo procurando no
realizar maacutes de 4 transferencias c) La temperatura de refrigeracioacuten debe mantenerse en un rango de 4plusmn2degC d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminacioacuten
cruzada teniendo en cuenta la organizacioacuten interna del refrigerador evitando el amontonamiento de las cajas
e) Se utilizaraacute el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
f) Las cepas preservadas por este procedimiento seraacuten utilizadas para requerimientos internos del laboratorio preferiblemente en praacutecticas acadeacutemicas
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CRIOPRESERVACIOacuteN
Precriopreservacioacuten En el interior de la cabina de flujo laminar tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina Posteriormente son llenados con 1200microl de glicerol esteacuteril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados
Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de criopreservacioacuten (Martiacutenez amp Mayorga 2013) se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae una aliacutecuota de 1ml diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02)
Despueacutes agitar el tubo T02 con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s tomando
luego cinco aliacutecuotas de 600microl depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Se rotulan los crioviales y se realiza Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten Inmediatamente despueacutes de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente seguacuten la coleccioacuten a una temperatura de -85degC plusmn 1degC
Por uacuteltimo se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIOacuteN
culminado el proceso
-No use micropipeta para pipetear el glicerol -Todo el material debe ser correctamente esterilizado -Nunca tocar las tapas en el interior -De ser posible se recomienda una concentracioacuten de 10⁸ - 109 celml -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar 20min desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas (si se han determinado celml totales precongelamiento) -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables aumentando el nuacutemero de viables poscongelacioacuten Esto se puede hacer si no se tiene un nuacutemero determinado de ceacutelulas a una temperatura de 4degC plusmn 1degC por 20-30min -Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y poscriopreservacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas
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LIOFILIZACIOacuteN Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano Desde medio soacutelido
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio soacutelido se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general Posteriormente se debe agitar con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Desde medio liacutequido
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra diluyeacutendolo en un tubo con 9ml agua destilada esteacuteril (designado como T04)
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten Desde medio soacutelido
Del tubo T03 como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten y previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 1ml que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Desde medio liacutequido
Del tubo T04 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 100microl depositados en cuatro viales de vidrio En cada vial se adiciona 900microl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapoacuten de divisioacuten
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior de cada vial
sea lo maacutes exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T04 se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparacioacuten
Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado en
tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T04
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Con un volumen total de 1ml cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Los viales (indistintamente si se parte de medio soacutelido o liacutequido) se destapan parcialmente y se congelan en nitroacutegeno liacutequido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ge15min para ser llevados al liofilizador de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
Posliofilizacioacuten Luego del desmonte y sellado al vaciacuteo de los viales cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper posterior al proceso de liofilizacioacuten Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente El tercer vial (Lf) se almacena a 4degC plusmn 1degC en el cepario madre de liofilizados El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 diacuteas realizando evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten para saber si fue o no exitosa la liofilizacioacuten Por uacuteltimo se debe llenar el registro FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN culminado el proceso
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos En cuanto a los hongos el inoacuteculo inicial durante la preliofilizacioacuten se prepara
llenando con 10ml de agua destilada esteacuteril un cultivo soacutelido altamente esporulado del hongo Luego con un asa o espaacutetula esteacuteril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar Esta suspensioacuten es extraiacuteda con una pipeta esteacuteril y depositada en un tubo de ensayo al cual se le agrega 100microl de solucioacuten Tween 80 al 01 esteacuteril para preparar la solucioacuten de esporas Se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 20s y se prosigue de acuerdo a la ejecucioacuten de la liofilizacioacuten desde de un medio liacutequido
-Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y posliofilizacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas -Se debe realizar Voacutertex cada vez que se vaya a extraer una aliacutecuota -Los mejores resultados en la liofilizacioacuten se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas y en caldo SMPG un rango de 24-48h -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir maacutes tiempo del estipulado para su total congelamiento tener este dato de ser posible -El tiempo de liofilizacioacuten variacutea seguacuten la formulacioacuten Para una formulacioacuten con Sacarosa 10 36 horas es lo ideal -Debe usarse el accesorio para liofilizacioacuten Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vaciacuteo y de forma hermeacutetica -Los tapones de divisioacuten deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimacioacuten del agua de lo contrario no seraacute posible la liofilizacioacuten y pueden incluso quebrarse
-Si el raspado contiene rastros grandes de agar se debe realizar un filtrado con gasa esteacuteril aunque esto disminuiraacute el nuacutemero de esporas -Las esporas en solucioacuten pierden viabilidad conforme avanza el tiempo Se sugiere hacer uso de la solucioacuten antes de dos horas de preparada
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ROacuteTULOS
Refrigeracioacuten Dado que la refrigeracioacuten constituye un meacutetodo de corto plazo no se
requieren roacutetulos especiales para este meacutetodo de conservacioacuten Sin embargo es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente informacioacuten con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha
Criopreservacioacuten
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los roacutetulos de coleccioacuten usados en las cajas del Freezer y los roacutetulos para cada cepa criopreservada
Fecha de ingreso__________________________ Medio___________________________________ Cepa____________________________________ Coacutedigo__________________________________
-Es opcional imprimir este roacutetulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta
Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer
Figura 8 Roacutetulos para los crioviales
Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados
20
Liofilizacioacuten
Los roacutetulos de la Figura 9 contienen la siguiente informacioacuten Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de
datos el Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo) nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten
de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6) con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada
vial Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
-Los roacutetulos de las cajas del Freezer los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo -Los roacutetulos deben colocarse antes de su almacenamiento especialmente los crioviales ya que una vez congelados el adhesivo no funciona
21
Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio (paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
CC en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual moderado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro Existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o indirectamente Normalmente no existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005)
-En la base de datos del Banco Geneacutetico se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos pero el formato y tamantildeo de letra sea igual para todos los roacutetulos -Las etiquetas de liofilizacioacuten y criopreservacioacuten deben imprimirse en papel adhesivo -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos
22
Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservacioacuten y en
el laboratorio
23
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121degC y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro meacutetodo de esterilizacioacuten las puntas de micropipetas los viales crioviales y sus respectivas tapas deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas) pueden ser esterilizados en horno a 160degC por 120min
Sin embargo se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de
todo el trabajo desde la preparacioacuten de medios hasta el sellado de viales y crioviales como se describe a continuacioacuten
Medios Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Son indicadores de contaminacioacuten cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios soacutelidos
Ambiente Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto) evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas El periodo de exposicioacuten va de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo Se recomienda que con un nuacutemero superior de cinco colonias en el control se desinfecte el aacuterea de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminacioacuten Cabina de flujo laminar
Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4 horas Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar
24
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70 al inico durante y al final del trabajo con cada cepa
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005) los residuos se pueden clasificar en cinco grupos La eliminacioacuten de residuos en el laboratorio de microbiologiacutea no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas por ello los desechos se dispondraacuten de la siguiente forma
Desechos no contaminados (no infecciosos) Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que
incluso pueden reutilizarse o reciclarse como el papel
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservacioacuten requiere
de material corto-punzante se cuenta con un guardiaacuten para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plaacutesticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestioacuten Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposicioacuten final de este material
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado
Las cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 20 minutos Posterior al proceso de autoclavado se deben someter a un proceso de desinfeccioacuten con hipoclorito al 15 durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jaboacuten neutro
Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas en todo caso deberaacuten tener el mismo proceso de desinfeccioacuten anteriormente mencionado
25
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado todos los desechos producidos en cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 15 minutos posterior a este proceso se descartaraacute el contenido de las cajas de Petri disponieacutendolos en bolsas rojas para residuos peligrosos Por otra parte los desechos liacutequidos deberaacuten ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa
No es directriz del laboratorio ni del Banco Geneacutetico la incineracioacuten de ninguacuten tipo de material o residuo peligroso solo de su disposicioacuten y almacenaje seguacuten lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos
26
BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2 es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos estos son
ldquoAgentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente La exposicioacuten en el laboratorio puede provocar una infeccioacuten grave pero existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces y el riesgo de propagacioacuten es limitadordquo (OMS 2005 paacuteg 1)
El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Geneacutetico Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005)
Proteccioacuten personal El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial
Se recomienda el uso de batas blancas manga larga y bien abotonada con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar ensuciar o para prevenir alguacuten accidente
Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas bufandas o gorras
Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupcioacuten
Se debe utilizar proteccioacuten ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos
Debe respetarse la prohibicioacuten de beber comer masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como boliacutegrafos ademaacutes de tocarse los ojos y nariz
27
Procedimientos Estaacute estrictamente prohibido pipetear con la boca se deben utilizar
pipeteadores mecaacutenicos Todos los cultivos stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un meacutetodo de descontaminacioacuten aprobado como por ejemplo mediante autoclave
Aacutereas de trabajo Las superficies de trabajo se descontaminan como miacutenimo una vez por diacutea
y luego de todo derrame de material contaminante
En las zonas de trabajo estaraacute prohibido comer beber fumar aplicar cosmeacuteticos manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en aacutereas de trabajo
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ninguacuten momento ropa u objetos personales
Capacitaciones Los encargados del Banco geneacutetico y del laboratorio deberaacuten estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma maacutes eficaz y asiacute reducir riesgos en el proceso
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado asiacute como de las maquinas y elementos del laboratorio
28
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REFERENCIAS
29
Anexos y formatos
30
31
32
BANCO DE LIOFILIZADOS
33
CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
34
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
FORMATO PARA CARACTERIacuteSTICAS MACROSCOacutePICAS DE LAS CEPAS
35
FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN
36
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN LIOFILIZACIOacuteN
37
38
39
40
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN CRIOPRESERVACIOacuteN
41
42
43
44
45
AGRADECIMIENTOS
La realizacioacuten de este trabajo fue posible gracias a muacuteltiples personas que de forma directa o
indirecta intervinieron en su realizacioacuten
La Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas por haberme dado una formacioacuten integral como
Licenciado en Biologiacutea a traveacutes de sus docentes y sus espacios
A mi director el docente Miguel Aacute Piragauta MSc por confiar en miacute y en mi trabajo por abrirme
las puertas del laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos
Naturales por su asesoriacutea y direccioacuten
A los laboratoristas Oscar Romero y Aleyda Ariza por su guiacutea sus consejos durante el desarrollo
del trabajo y su apoyo frente a la realizacioacuten del mismo
A los estudiantes Cesar Romero y Diego Castantildeeda quienes aportaron valiosa informacioacuten y
experiencia durante mi estadiacutea en el laboratorio a traveacutes de su proyecto
A la docente Gloria Stella Acosta Pentildealoza MSc quien amablemente dio su apoyo como revisora
y evaluadora de este proyecto y me guio en las encrucijadas con las cuales los cientiacuteficos solemos
enfrascarnos
A Gineth Adriana Calderoacuten por su colaboracioacuten en distintas etapas de este trabajo
He mencionado a grosso modo solo a algunas personas pido por ello disculpas a aquellos que no
mencioneacute pues sus aportes tambieacuten fueron importantes para el eacutexito de este proyecto
CONTENIDO
RESUMEN 10
ABSTRACT 10
1 INTRODUCCIOacuteN 11
2 MARCO REFERENCIAL 13
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS 13
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS 14
221 Conservacioacuten a corto plazo 14
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten 14
223 Conservacioacuten a largo plazo 15
2231 Liofilizacioacuten 15
2232 Control de calidad de un producto liofilizado 20
2233 Equipamiento para liofilizar 21
3 OBJETIVOS 22
31 OBJETIVO GENERAL 22
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 22
4 METODOLOGIacuteA 23
41 FASE INICIAL 23
411 Acervo Microbiano 23
412 Eleccioacuten de los protectores 23
4121 Crioprotectores 23
4122 Lioprotectores 23
42 FASE INTERMEDIA 1 24
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten 24
4211 Viabilidad 24
4212 Estabilidad Morfoloacutegica 25
4213 Pureza 25
422 Recuperacioacuten de los microorganismos 25
423 Criopreservacioacuten 26
4231 Precriopreservacioacuten 26
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 26
424 Liofilizacioacuten Etapa 1 26
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 26
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 26
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje) 27
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2 29
43 FASE INTERMEDIA 2 29
431 Liofilizacioacuten definitiva 29
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 29
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 30
4313 Posliofilizacioacuten 30
4314 Rehidratacioacuten 30
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos 30
4321 Propiedades fiacutesicas generales 30
4322 Contaminacioacuten 30
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten 31
433 Pruebas adicionales 31
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica 31
4332 Prueba de estabilidad acelerada 31
434 Control de esterilidad 32
4341 Medios 32
4342 Ambiente 32
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 32
44 FASE FINAL 32
441 Base de datos 32
442 Fichas de resumen 33
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 33
444 Formatos de control del banco de liofilizados 33
445 Manual de procedimientos 33
5 RESULTADOS 34
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN 34
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE
ESTUDIO 35
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD
NATURAL 38
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general 38
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado 41
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA 41
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN 42
551 Propiedades fiacutesicas generales 42
552 Contaminacioacuten 45
553 Tiempo de redisolucioacuten 45
56 PRUEBAS ADICIONALES 46
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica 46
562 Prueba de estabilidad acelerada 47
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN 47
571 Base de datos 47
572 Fichas de resumen 47
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 47
574 Formatos de control del banco de liofilizados 48
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten 48
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS 49
7 CONCLUSIONES 54
8 RECOMENDACIONES 55
9 REFERENCIAS 56
10 BIBLIOGRAFIacuteA 60
11 ANEXOS 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten 16
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado 17
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua 18
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten 19
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes 21
Figura 6 Metodologiacutea 23
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 28
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelacioacuten 35
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 38
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilizacioacuten definitiva por cepa bacteriana 41
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes 45
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales 46
Figura 17 Organigrama de la base de datos 47
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas 24
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten 27
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 28
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales 29
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada 31
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados 33
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten) 34
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004 36
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006 36
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007 37
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009 37
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010 38
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad 41
Tabla 14 Tabla de convenciones 42
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1 42
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada 44
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado 46
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencioacuten de los microrganismos y dada su importancia se han
creado colecciones bioloacutegicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologiacutea Existe variedad de meacutetodos de preservacioacuten en este trabajo se determinoacute el estado
de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad estandarizando e
implementando ademaacutes el sistema de liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos
evaluaacutendolos frente a tres compuestos protectores Se realizoacute una evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten teniendo como base tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
encontrando que el sistema de criopreservacioacuten implementado en el laboratorio es oacuteptimo y el
glicerol al 67vv funciona para casi todas las cepas por largos periacuteodos de tiempo la sacarosa
10pv resultoacute ser el mejor lioprotector de los tres evaluados designaacutendolo como lioprotector
general para el laboratorio Se creoacute un manual de laboratorio para la conservacioacuten de cepas que
incluye los protocolos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten y de seguridad de los mismos Este
trabajo aporta al campo de la microbiologiacutea de la conservacioacuten y constituye un peldantildeo maacutes para
el registro del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes
PALABRAS CLAVE Criopreservacioacuten liofilizacioacuten lioprotectores conservacioacuten
microorganismos
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and given its importance have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology Exists variety of methods of preservation in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing standardizing and further
implementing the system freeze-drying taking as a starting point to them evaluating them against
three protective compounds An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators
viability morphological stability and purity was performed finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67 vv works for almost all strains for long
periods of time sucrose 10 wv lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory It was created a manual for conservation
laboratory strains including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions
KEYWORDS cryopreservation freeze-drying lyoprotectants conservation microorganisms
11
1 INTRODUCCIOacuteN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible pues como lo menciona
Hurtado (2009) la vida no es posible sin la actividad de estos ya que estaacuten involucrados en todas
las dinaacutemicas ambientales existentes en el planeta Sin embargo su importancia ha ido maacutes allaacute
desde que fueron descubiertos hace unos 300 antildeos por van Leeuwenhoek potencializaacutendose su
investigacioacuten y utilizacioacuten en distintos campos de la ciencia y la tecnologiacutea en los uacuteltimos 100
antildeos iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi amp Mayz 2003)
Debido a esto se han creado colecciones bioloacutegicas como meacutetodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho Las colecciones de cultivos microbianos estaacuten
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt y a nivel internacional por
la Federacioacuten Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) en donde existen actualmente
2acute520200 microorganismos en 711 colecciones de 71 paiacuteses registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM) Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM el CIAT (Rhizobium Collection America) de coacutedigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccioacuten de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de coacutedigo WDCM 857 (WFCC 2015)
No obstante varias universidades del paiacutes instituciones puacuteblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias bioloacutegicas poseen colecciones microbioloacutegicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN) en otros casos las colecciones estaacuten en proceso de registro o en formacioacuten como en la
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) entre otras
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer meacutetodos de conservacioacuten fiables
que entre otras cosas eviten al maacuteximo el riesgo de peacuterdida o de variabilidad geneacutetica de los
individuos Existe variedad de meacutetodos de conservacioacuten seguacuten sea el tiempo que estaraacuten en la
coleccioacuten o el tiempo en que tardaraacuten en ser usados dentro de ellos destacan la criopreservacioacuten y
la liofilizacioacuten meacutetodos utilizados para la coleccioacuten de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo
Martiacutenez amp Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Geneacutetico en el Laboratorio
de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC siglas de la coleccioacuten microbioloacutegica) utilizando
la refrigeracioacuten como meacutetodo primario implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
criopreservacioacuten
En este trabajo se pretendioacute determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos evaluaacutendolos frente a tres compuestos
protectores Para ello en primera estancia se recibioacute una capacitacioacuten sobre manejo y control de
microrganismos preparacioacuten de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados posteriormente se evaluoacute el estado de criopreservacioacuten de las cinco
cepas seleccionadas utilizando teacutecnicas de recuento en placa estaacutendar y se evaluoacute a tres
lioprotectores para la liofilizacioacuten de cepas microbianas del Banco Geneacutetico ademaacutes se realizaron
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacioacuten y se disentildearon los
protocolos para la implementacioacuten del sistema de liofilizacioacuten con las cinco cepas y el lioprotector
que presentoacute mejores resultados en este estudio
Para la realizacioacuten de estos fines el trabajo fue dividido en cuatro fases comenzando por los
criterios de eleccioacuten de los microrganismos y los lioprotectores seguido de la evaluacioacuten de los
meacutetodos de preservacioacuten utilizando tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
posteriormente una tercera fase de ajustes a la liofilizacioacuten para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo utilizando como indicadores las propiedades fiacutesicas generales la
posibilidad de contaminacioacuten en el proceso y el tiempo de redisolucioacuten finalmente una cuarta
fase que corresponde al proceso de documentacioacuten este incluye la revisioacuten y modificacioacuten de la
base de datos la elaboracioacuten de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados asiacute como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccioacuten y finalmente la
elaboracioacuten del manual de procedimientos Con lo anterior se encontroacute que el sistema de
criopreservacioacuten desarrollado por Martiacutenez amp Mayorga (2013) es eficiente y permite porcentajes
de recuperacioacuten bastante altos incluso superiores al 90 luego de dos antildeos sin embargo no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estaacuten expuestas por
este meacutetodo De otro lado se determinoacute la sacarosa al 10 como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caracteriacutesticas propias de cada organismo)
y se estandarizoacute el sistema de liofilizacioacuten
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacioacuten de un nuevo meacutetodo de
conservacioacuten de microorganismos para el Banco Geneacutetico de la Universidad Distrital Francisco
Joseacute de Caldas ademaacutes aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacioacuten en bacterias y ofrece
informacioacuten yo tips sobre el proceso de liofilizacioacuten en general que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso Tambieacuten se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Geneacutetico en la comunidad cientiacutefica a nivel nacional
e internacional
Este documento consta en su orden de un capiacutetulo de introduccioacuten y un marco referencial de los
objetivos tanto general como especiacuteficos alcanzados en este trabajo una metodologiacutea detallada
paso a paso perfectamente reproducible los resultados encontrados asiacute como el anaacutelisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacioacuten
finalmente un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo el campo de la
conservacioacuten microbiana y los capiacutetulos correspondientes a las referencias y bibliografiacutea utilizada
Se incluye tambieacuten un capiacutetulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientiacutefica del presente trabajo
13
2 MARCO REFERENCIAL
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS
La vida en la Tierra no seriacutea posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado 2009) ya que estaacuten involucrados con las dinaacutemicas en los ecosistemas terrestres aeacutereos
y acuaacuteticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta Existen
microorganismos que degradan la materia orgaacutenica hacieacutendola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) evitando que el mundo sea un vertedero
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnoloacutegicos de la humanidad
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea Bacteria y
Eucarya en donde encontramos como primeros representantes a las bacterias las maacutes numerosas
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) muchas pueden
resultar beneacuteficas para ser utilizadas con fines biotecnoloacutegicos agriacutecolas biomeacutedicos ecoloacutegicos
y de biorremediacioacuten (Morales-Garciacutea et al 2010) Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucioacuten en la naturaleza contribuyendo a la descomposicioacuten de la materia orgaacutenica y
participando en los ciclos bioloacutegicos (Pontoacuten Moragues Geneacute Guarro amp Quindoacutes 2002)
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucioacuten de los
graves problemas de la humanidad (Gonzaacuteles de Oca Martiacutenez Riveroacuten amp Nuacutentildeez 2006) en la
agricultura alimentacioacuten salud y en la buacutesqueda de nuevas fuentes de energiacutea y la conservacioacuten
del medio ambiente Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioquiacutemicas para Atlas (citado por Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez
1998) dicha capacidad se basa ldquoen la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones oxidaciones reducciones y precipitacioneshellip y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierrardquo (paacuteg 289)
Los recursos microbioloacutegicos (microorganismos genes e informacioacuten) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologiacutea las ciencias de la vida (Ivshina amp Kuyukina 2013) el
desarrollo de medicamentos farmaceacuteuticos agentes agroquiacutemicos biocontroles cosmeacuteticos y
productos industriales (Ten Kate 1995) Ademaacutes con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el eacutexito de los primeros aislamientos de microorganismos se marcoacute la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacioacuten de toda la biodiversidad microbiana logrando la inclusioacuten de este tema en el
desarrollo de las poliacuteticas ambientales (Gonzaacuteles et al 2006)
El meacutetodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta fuera de sus
ambientes ecosistemas y nichos ha sido la creacioacuten de colecciones bioloacutegicas cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfoloacutegicos fisioloacutegicos o
geneacuteticos (Montes de Oca et al 2008) Las colecciones de cultivos microbianos variacutean en forma
funcioacuten y tamantildeo Pueden ser pequentildeas privadas mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especiacuteficos (Duratildees Sette Pagnocca amp Rodrigues 2013)
14
El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura baacutesica de
investigacioacuten en ciencias de la vida llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg Dedeurwaerdere amp Pascual 2013) de animales y plantas pero se cuentan con
caracteriacutesticas especiacuteficas para los microorganismos En primer lugar los organismos microbianos
tienen una variacioacuten geneacutetica extremadamente alta y altos iacutendices de mutacioacuten en la reproduccioacuten
en las especies por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al 2013) a su lugar de recoleccioacuten En segundo lugar las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacioacuten asegurar los recursos geneacuteticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes para proporcionar biomateriales autenticados
para materiales de investigacioacuten exploracioacuten y produccioacuten asiacute como su uso contemporaacuteneo por
parte de las entidades privadas y puacuteblicas (Stromberg et al 2013)
Los microorganismos al igual que otros seres vivos poseen una uacutenica e irremplazable
secuencia de ADN por lo que su desaparicioacuten implicariacutea la peacuterdida irreversible de un conjunto
uacutenico de informacioacuten (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) de ahiacute la gran importancia en la
creacioacuten de comiteacutes comisiones federaciones y grupos de microbiologiacutea como World Federation
for Culture Collection (WFCC) International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacioacuten
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC 2010b)
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
En las colecciones es necesario establecer meacutetodos de conservacioacuten confiables y especiales
pudiendo realizarse a corto mediano y largo plazo para asegurar la oacuteptima viabilidad
almacenamiento y pureza (WFCC 2010b) de los diferentes microorganismos Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de peacuterdida cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
miacutenimo dos meacutetodos (WFCC 2010b) de conservacioacuten que consideren el tiempo a emplear en la
preservacioacuten inicial manipulacioacuten y control perioacutedico de las cepas asiacute como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemaacuten Diacuteaz Rosa amp Aacutelvarez Molina 2005)
Se debe tener especial cuidado con geacuteneros y especies todaviacutea no conservadas en colecciones
(especies nuevas) contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
oacuteptimos (WFCC 2010a) de conservacioacuten de estos
221 Conservacioacuten a corto plazo
Comuacutenmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestioacuten seraacute utilizado en un corto
periodo de tiempo Suele utilizarse la teacutecnica de resiembra continua en este el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC
donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garciacutea et al 2010)
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten
Este concepto agrupa a las teacutecnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 antildeos (Weng et al 2005) Existen variedad de teacutecnicas como la
desecacioacuten el gel de siacutelice o perlas de vidrio el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al
2005) o la congelacioacuten La inclusioacuten de esta uacuteltima teacutecnica en este grupo es discutida por algunos
autores ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacioacuten como la criopreservacioacuten (o
15
congelacioacuten) son teacutecnicas de conservacioacuten a largo plazo (Perry 1995 Weng et al 2005) y otros
insisten su inclusioacuten en las teacutecnicas de conservacioacuten a mediano plazo (Morales-Garciacutea et al 2010)
La criopreservacioacuten consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas
Esto permite la eliminacioacuten del agua libre disponible y que en el interior de los individuos ldquosoacutelo
una proporcioacuten del total de agua se convierta en hielordquo (Perry 1995 paacuteg 23)
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 deg C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta peacuterdida de la
viabilidad del cultivo (Perry 1995) por parte del laboratorio Este meacutetodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las ceacutelulas a -80degC
(Morales-Garciacutea et al 2010) Heckly (citado por Perry 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas la viabilidad celular es casi independiente del periacuteodo de almacenamiento ademaacutes
se cree que los individuos criopreservados siguen siendo geneacuteticamente estables
Hubaacutelek (2003) menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacioacuten de microorganismos desde las caracteriacutesticas propias del individuo (cepa
especie tamantildeo y forma de celda fase de crecimiento al momento de congelar composicioacuten de las
ceacutelulas etc) asiacute como los factores antes (composicioacuten del medio de crecimiento pH temperatura
de incubacioacutenhellip) durante y posterior al proceso de criopreservacioacuten (densidad poblacional
aditivos temperatura y duracioacuten del almacenamientohellip) e incluso en su descongelacioacuten
ldquoLos aditivos crioprotectores son compuestos quiacutemicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los dantildeos durante el proceso de congelacioacutenrdquo (Gonzaacuteles et al 2006 paacuteg
16) Estos protectores se pueden clasificar seguacuten su peso molecular (bajo o alto) o seguacuten su tasa
yo capacidad de penetracioacuten los penetrantes de bajo peso molecular que desplazan el agua
intracelular evitando la formacioacuten de hielo (por ejemplo el glicerol) y los no penetrantes de alto
peso molecular que promueven la raacutepida deshidratacioacuten de la ceacutelula (por ejemplo los gluacutecidos)
(Hubaacutelek 2003)
223 Conservacioacuten a largo plazo
Este concepto agrupa a las teacutecnicas que ademaacutes de minimizar al maacuteximo el riesgo de cambio
geneacutetico en las ceacutelulas mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 antildeos o maacutes (Weng et al 2005)
La maacutes popular es la liofilizacioacuten
2231 Liofilizacioacuten
La liofilizacioacuten consiste en la eliminacioacuten del agua de una sustancia congelada por
sublimacioacuten del hielo bajo alto vaciacuteo y a presiones muy bajas (Gonzaacuteles et al 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador Si la liofilizacioacuten es exitosa se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacioacuten por varios antildeos de los microorganismos sin embargo dicho eacutexito depende de
muacuteltiples factores entre otros como los mencionados por Hubaacutelek (2003) para la criopreservacioacuten
(puesto que la liofilizacioacuten posee una etapa de congelacioacuten) asiacute mismo el tiempo de liofilizacioacuten
los paraacutemetros de liofilizacioacuten el medio aditivo o lioprotector usado tipo de liofilizador o
accesorio utilizado influyen en el producto final
16
El proceso de conservacioacuten de microorganismos por liofilizacioacuten se puede dividir en muacuteltiples
etapas desde la formulacioacuten del protector hasta el modo en que se recuperaraacuten los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1)
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacioacuten Asiacute mismo se
representa el efecto de cascada en teacuterminos de la viabilidad de las muestras
a) Formulacioacuten
Se entiende como la mezcla de ceacutelulas con cualquier solucioacuten protectora que tras la
eliminacioacuten del disolvente permita obtener un producto (liofilizado) deseado La solucioacuten
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacioacuten Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de gluacutecidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics 2015)
Las soluciones protectoras oacuteptimas contienen principalmente un soluto protector
denominado lioprotector que estabiliza las ceacutelulas cuando se elimina el disolvente (agua)
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despueacutes de la liofilizacioacuten (Figura 2) Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actuacutean como su propia matriz por ejemplo la sacarosa al
10 (Ops Diagnostics 2015)
La formulacioacuten tambieacuten comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse pudiendo variar de si se parte de un cultivo soacutelido en
agar o de un cultivo liacutequido hasta que sean cultivos soacutelidos densos (edad de 1-2 diacuteas) o
liacutequidos en fase estacionaria Cuando se parte de un medio liacutequido y si es posible las
ceacutelulas se centrifugan retirando el medio de cultivo y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucioacuten protectora (Ops Diagnostics 2015) o de lioprotector (Grauer
Grunberg amp Zardo 2015) Para cultivos desde agar suele lavarse la placatubo con 5-10
ml de medio protector posteriormente recogido con una pipeta esteacuteril (Ops Diagnostics
2015) Aunque en esto uacuteltimo se evita la centrifugacioacuten se obtiene un mayor nuacutemero de
ceacutelulas partiendo de cultivos liacutequidos (Grauer et al 2015)
17
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado
Fuente Adaptado de Jennings T A (2008) Lyophilization Introduction and Basic Principles (paacuteg 5)
New York Informa Healthcare USA Inc
b) Congelacioacuten
La congelacioacuten es la primera etapa del meacutetodo de liofilizacioacuten y uno de los maacutes
importantes para el eacutexito de este Su funcioacuten consiste en obtener una matriz en donde esteacute
separado el disolvente de los solutos Cuando se congela la formulacioacuten el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regioacuten intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings 2008) la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regioacuten intersticial a casi 0 ademaacutes proporciona una estructura
con resistencia casi nula al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings
2008)
Disminuir el flujo de agua raacutepidamente es importante para evitar asiacute la excesiva
concentracioacuten de solutos un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracioacuten de solutos evitando el estreacutes osmoacutetico y permitiendo una organizacioacuten
espacial de los componentes de la formulacioacuten en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al 2015)
La temperatura y el tiempo para una congelacioacuten completa de la formulacioacuten
dependen de la naturaleza de la misma Nireesha et al (citado por Grauer et al 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco de ahiacute que una correcta congelacioacuten reduce la
desnaturalizacioacuten teacutermica del liofilizado ldquoinmoviliza componentes de la solucioacuten y evita
la formacioacuten de espuma cuando se aplica el vaciacuteordquo (Adams 2007)
c) Secado primario
Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacioacuten ademaacutes es la de maacutes larga
duracioacuten En este etapa la presioacuten se reduce y la temperatura de la formulacioacuten congelada
es elevada dando lugar a la sublimacioacuten (Figura 3) y migracioacuten de vapor de agua (Grauer
et al 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador Sin embrago dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
euteacutectica de colapso de transicioacuten viacutetrea (Tg) para minimizar el dantildeo de la muestra
(Adams 2007)
18
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua Se indican los requerimientos de presioacuten
y temperatura que hacen posible la sublimacioacuten del agua durante la liofilizacioacuten
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
El tiempo para el secado primario depende de muacuteltiples factores como la
composicioacuten de la solucioacuten protectora la porosidad del congelado la calidad o resistencia
de la matriz la cantidad de muestras asiacute como tambieacuten el volumen de la formulacioacuten entre
otros Respecto al volumen ldquopara las bacterias las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 025 a 05 mlrdquo (Ops Diagnostics 2015) Aunque no existe un
volumen establecido hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de maacutes
tiempo
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) un periacuteodo de secado primario de un diacutea es suficiente
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras teniendo
como guiacutea un tiempo de liofilizacioacuten de una noche
La etapa de secado primario finaliza ldquocuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacioacuten y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congeladardquo (Jennings 2008 paacuteg 6)
d) Secado secundario
Es la tercera y uacuteltima etapa de la liofilizacioacuten Al terminar el secado primario se ha
eliminado el agua moacutevil de la muestra Sin embargo existe agua atrapada dentro del soacutelido
amorfo que es maacutes difiacutecil de eliminar (Fetterolf 2010) La cantidad de agua es discutible
ya que fluctuacutea en funcioacuten de la temperatura y las caracteriacutesticas propias de los
19
constituyentes de la formulacioacuten por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10 ww del producto seco (Jennings 2008) o del 2-4 (Ops Diagnostics 2015)
La reduccioacuten del contenido de humedad en la torta se logra por desorcioacuten (Adams
2007) sin reducir el volumen de la misma (Jennings 2008) Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presioacuten parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario durante el secado secundario
(Ops Diagnostics 2015) Es importante que la temperatura no se incremente velozmente y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicioacuten viacutetrea la cual aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf 2010)
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) esta etapa es relativamente corta con una duracioacuten de
1 a 2 horas aunque Grauer et al (2015) indica que representa entre el 30-40 del tiempo
total del proceso asiacute mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo
con una duracioacuten de hasta varios diacuteas Esto resulta importante puesto que ldquola cantidad de
agua residente luego del secado afecta la tasa de peacuterdida de viabilidad durante el
almacenamientordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 16)
Finalmente al ser removida la humedad residual la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al 2015) obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2) o pastel esponjoso con poca (inferior al 1) o nula humedad
residual (Fetterolf 2010)
Las tres etapas del proceso de liofilizacioacuten en funcioacuten de la temperatura y la presioacuten
y en contraste con el diagrama de fases del agua pueden ser observadas en la Figura 4
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten De 1-3 Congelamiento (1-2 presioacuten
atmosfeacuterica) de 3-4 secado primario de 4-5 Secado secundario
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
20
e) Sellado y almacenamiento
Terminado el proceso de secado secundario se deben sellar los viales al vaciacuteo (de ser
posible) o de forma hermeacutetica tan pronto como sea posible debido a que la torta actuaraacute
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf 2010) aunque
tambieacuten es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams 2007) e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de siacutelice
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Sin embrago aunque
se logre un correcto sellado al vaciacuteo no se puede asegurar una larga vida uacutetil en condiciones
ambientales ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al 2015)
por ello lo mejor es almacenar los liofilizados a 4deg C en la oscuridad (Ops Diagnostics
2015) reduciendo las posibilidades de peacuterdidas aunque haya quedado agua despueacutes del
secado
f) Reactivacioacuten o rehidratacioacuten
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacioacuten original esto
implica la adicioacuten de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings 2008
Grauer et al 2015) La dilucioacuten raacutepida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings 2008) da cuenta de un correcto proceso de liofilizacioacuten
ldquoTiempos de reconstitucioacuten excesivamente largos la peacuterdida de potencia o la formacioacuten
de una solucioacuten turbia son indicios de un proceso de liofilizacioacuten inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacioacutenrdquo (Jennings 2008 paacuteg 11)
La recuperacioacuten de las ceacutelulas sin embrago tambieacuten se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacioacuten) el tipo
de diluyente su temperatura su pH la osmolaridad (Grauer et al 2015) la potencia del
lioprotector (Jennings 2008) entre otras propiedades de la solucioacuten resultante
Grauer et al 2015 sugieren la utilizacioacuten de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacioacuten de los microorganismos con el fin de evitar el estreacutes
osmoacutetico que pueden causar las soluciones diluidas sin embargo algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacioacuten especiacuteficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato
Ops Diagnostics (2015) indican que una tasa de supervivencia superior al 50 se
considera aceptable por muchos laboratorios
2232 Control de calidad de un producto liofilizado
Las propiedades fiacutesicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayoriacutea un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacioacuten entre los
paraacutemetros de la formulacioacuten y el proceso de liofilizacioacuten por ello permiten el seguimiento y la
deteccioacuten de falencias (Jennings 2008)
21
Esta evaluacioacuten permite caracterizar las diferentes propiedades fiacutesicas quiacutemicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre dichas propiedades Jennings (2008) y Ticoacute
G (1987) recogen algunos de las toacutepicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado por ejemplo las propiedades generales fiacutesicas de la torta (color volumen temperatura
de transicioacuten textura porosidad densidad contraccioacuten o colapso estado del vial entre otras que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacioacuten) su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfeacuterica) la velocidad de redisolucioacuten o
reconstitucioacuten la estabilidad (de la torta el microorganismo o el lioprotector evaluada de forma
natural o acelerada) nivel de humedad residual posibles contaminantes entre otras
2233 Equipamiento para liofilizar
Como ya se mencionoacute inicialmente el proceso de liofilizacioacuten requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5) este equipo consta esencialmente de tres partes
a) Un sistema o bomba de vaciacuteo que reduce la presioacuten del ambiente de la caacutemara que contiene
el material a secar Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dantildeen ldquoEl nivel
de vaciacuteo requerido debe ser entre 50 y 100 μbarrdquo (Grauer et al 2015 paacuteg 9) aunque 200
μbar son aceptables
b) Un condensador con circuito de refrigeracioacuten que comunica con la caacutemara de secado y
condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacioacuten sobre una superficie enfriada
inferior a los -40degC
c) Caacutemara o accesorio de secado que es donde se coloca el material a secar Seguacuten Nireesha
et al (2013) puede ser de tres tipos
- Manifold o colector muacuteltiple
- Rotary
- Tray style de bandejas con o sin estante de taponado eacuteste uacuteltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaciacuteo de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes En la imagen el liofilizador usa una
caacutemara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial
Tomado de httpslideplayercombrslide84760 el 15 de Agosto de 2015
22
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad y liofilizacioacuten de las mismas evaluaacutendolas frente a tres compuestos protectores
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas utilizando teacutecnicas de recuento
en placa estaacutendar
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacioacuten de cepas microbianas
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten
Disentildear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacioacuten a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados
23
4 METODOLOGIacuteA
La metodologiacutea general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases como es ilustrado en la
Figura 6
Figura 6 Metodologiacutea Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia loacutegica de eventos
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra
41 FASE INICIAL
411 Acervo Microbiano
De la coleccioacuten de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Geneacutetico del laboratorio de
microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracioacuten de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologiacutea estas corresponden a CR004 CR005 (sustituida posteriormente
por CR009) CR006 CR007 y CR010 seguacuten los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodriacuteguez (2013) Todas estaban conservadas por el meacutetodo de criopreservacioacuten (o
criocongelacioacuten) a una temperatura de -85 degC plusmn 1degC
412 Eleccioacuten de los protectores
4121 Crioprotectores
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99999) (Mallinckrodt Meacutexico) en
proporcioacuten 67 vv seguacuten lo establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
4122 Lioprotectores
Para la eleccioacuten de los agentes protectores y sus concentraciones en pv (Tabla 1) se
tuvieron en cuenta diferentes estudios en contraposicioacuten a Hensel (1994) se tomaron
concentraciones superiores al 9 de Glucosa (Merck Darmstadt) de forma aleatoria En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed amp
Roos (2004) y Palmfeldt Radstroumlm amp Hahn-Haumlgerdal (2003) Para la leche descremada
(Proleche Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al (2003) Dichos estudios
fueron tomados como referencia teoacuterica aunque los microorganismos en ellos especificados no
correspondan con los del presente trabajo
Criterios de eleccioacuten de los
microorganismos asiacute como de
los lioprotectores a evaluar
Evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten (criopreservacioacuten
y liofilizacioacuten)
Ajustes a la liofilizacioacuten
para la generacioacuten de
protocolos
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
24
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracioacuten
pv
10 4 10
117 10 15
27 15 20
42 FASE INTERMEDIA 1
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
En este trabajo se evaluaron dos meacutetodos de conservacioacuten (criopreservacioacuten y liofilizacioacuten)
dicha evaluacioacuten se realizoacute en teacuterminos de tres (3) indicadores valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al meacutetodo en siacute
4211 Viabilidad
Para evaluar este indicador se utilizoacute
a) Conteo directo con caacutemara de Neubauer 110mm (Boeco) siguiendo la metodologiacutea
planteada por Valencia Z (2004) Sin embargo para obtener el nuacutemero de bacterias se
utilizoacute la ecuacioacuten planteada por Bastidas (2015)
No de bacteriasml=
Fd Factor de dilucioacuten =
El conteo directo con caacutemara de Neubauer solo se realizoacute previamente al meacutetodo de conservacioacuten
evaluado
b) Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa seguacuten lo
descrito por Valencia Z (2004) y Camacho et al (2009) Para el caacutelculo de UFCml se
utilizoacute la siguiente foacutermula
UFCml = Ndeg de colonias times times
Los caacutelculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologiacutea planteada por
Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales se utilizoacute los planteamientos del Instituto
de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacioacuten y solo pos a la criopreservacioacuten en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid
England)
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten
fue calculado a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010)
Tasa de supervivencia (BSR ) = DD Despueacutes de la desecacioacuten
AD Antes de la desecacioacuten
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000
Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucioacuten
1
ml de muestra
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100
Log (Ndeg UFCml AD)
25
4212 Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realizoacute
a) Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) Se elaboroacute un formato (anexo 1) con las
caracteriacutesticas macroscoacutepicas descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz
(2009) para las colonias desarrolladas en superficie a partir del procedimiento de ldquoconteo
de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Se utilizoacute un
contador de colonias CC-1 (Boeco)
- Se seleccionoacute solo una de dos placas de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de
UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron observadas en al menos el 80 de las colonias
de la placa seleccionada
b) Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se
realizoacute una ldquocoloracioacuten de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005
paacuteg 24)
Se compararon con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y macroscoacutepicas descritas por
Rodriacuteguez (2013) y la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se tomoacute
registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio (Zeiss)
con caacutemara Canon G9
4213 Pureza
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en
cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante
teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
422 Recuperacioacuten de los microorganismos
Para la recuperacioacuten de los microorganismos se tomoacute un criovial de cada cepa bacteriana
sometido a una temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua
destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente cinco (5) minutos (Martiacutenez amp Mayorga
2013) Los crioviales se introdujeron en bantildeo seroloacutegico una vez se llegoacute a la temperatura deseada
no antes
De cada criovial se tomoacute un (1) ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (asymp2240rpm) por diez (10) segundos diluyeacutendolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
Se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten a cada criovial (Thomas
Scientific 5150636) por cepa luego de preparado el tubo T01 antes de la incubacioacuten Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martiacutenez amp Mayorga
(2013) y Rodriacuteguez (2013)
26
423 Criopreservacioacuten
4231 Precriopreservacioacuten
Pasado el tiempo de incubacioacuten se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten al tubo T01 con el fin de determinar el nuacutemero de ceacutelulas totales y viables de la
muestra El conteo en Caacutemara de Neubauer se realizoacute solo hasta el final de los procedimientos de
preservacioacuten por lo cual una vez preparadas las diluciones estas fueron llevadas a nevera a 4degC plusmn
1degC para evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Se siguioacute el protocolo de criopreservacioacuten establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas con
algunas variaciones
Con pipeta esteacuteril de 5ml se depositaron en cinco (5) crioviales 12ml de glicerol anhidro
esteacuteril
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02)
Posteriormente se tomaron aliacutecuotas desde T02 de 600microl previo Voacutertex nivel 7 por 15s
depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl Se rotularon y se
realizoacute Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten
Inmediatamente despueacutes de la homogenizacioacuten fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick) a una temperatura de -85degC plusmn 1degC en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestioacuten
Este procedimiento se realizoacute en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar veinte (20) minutos (Martiacutenez amp
Mayorga 2013) desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar
la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
424 Liofilizacioacuten Etapa 1
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Se partioacute del tubo T01 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de
liofilizacioacuten Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel
7 (asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml agua destilada esteacuteril (T03)
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
Partiendo del tubo T03 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se
extrajeron aliacutecuotas de cien (100) microl veintisiete (27) veces depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar En cada criovial se adicionaron novecientos (900) microl de lioprotector en tres
crioviales por cada concentracioacuten de lioprotector de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2)
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior del criovial fuera lo maacutes
exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T03 se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacioacuten
27
Donde el volumen inicial y la concentracioacuten inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado en tanto que el volumen final y la concentracioacuten final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T03
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (aliacutecuota maacutes protector) se
agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacioacuten
Posteriormente a los crioviales se les retiraron las tapas plaacutesticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney PM-996) esterilizado realizando seis (6) perforaciones conceacutentricas en la superficie
con aguja hipodeacutermica 21G x 1frac12rdquo Los crioviales fueron congelados en nitroacutegeno liacutequido por
15min aproximadamente depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD Thermo
Scientific) de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45degC usando el colector muacuteltiple (manifold)
Terminado el proceso se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la caacutemara
de flujo laminar para evitar contaminacioacuten de las muestras alliacute se les retiroacute el Parafilm se les tapoacute
con tapas esteacuteriles y se les rotuloacute
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten
Lioprotector Concentracioacuten
(pv)
Serie
A B C
Glucosa
10 1 1 1
117 1 1 1
27 1 1 1
Sacarosa
4 1 1 1
10 1 1 1
15 1 1 1
Leche
descremada
10 1 1 1
15 1 1 1
20 1 1 1
Total crioviales seguacuten Ndeg 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje)
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten utilizando una etiqueta o
roacutetulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacioacuten
Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de datos el
Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten
bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo)
nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3) con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo
bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas
tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada vial
Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional
a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
Posterior al proceso de rotulado los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano a temperatura ambiente y protegido de la luz
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS
CC en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado riesgo
poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entrantildear un riesgo grave para el personal de
laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado
riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro Existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o
indirectamente Normalmente no existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005)
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio
(paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications
biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
29
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2
Se realizoacute una prueba de estabilidad natural en teacuterminos del aspecto fiacutesico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un periacuteodo prolongado de tiempo (Grauer et al 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente Por ello la rehidratacioacuten de los crioviales se realizoacute en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4)
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales
Primera rehidratacioacuten Segunda rehidratacioacuten Tercera rehidratacioacuten
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota Intervalos de tiempo medidos en diacuteas contados desde el diacutea de almacenaje en los cuales se rehidratoacute
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie ver Tabla 2) El aspecto fiacutesico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacioacuten y comparado con su estado antes del almacenaje
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC tomando
el tiempo de reconstitucioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel
2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten El indicador de viabilidad se evaluoacute solo con el meacutetodo de conteo de
microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la maacutes alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa se eligioacute el
lioprotector y la concentracioacuten de eacuteste que permitioacute obtener un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables
posliofilizacioacuten y que ofrecioacute ademaacutes una menor variacioacuten durante la prueba para la liofilizacioacuten
definitiva de las cepas en estudio Dicho lioprotector se establecioacute ademaacutes como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados del Banco
Geneacutetico del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
43 FASE INTERMEDIA 2
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores con el aacutenimo de
generar un protocolo funcional aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partioacute de cultivos puros sobre medios soacutelidos se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacioacuten liofilizacioacuten y posliofilizacioacuten para la
liofilizacioacuten definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados
431 Liofilizacioacuten definitiva
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracioacuten oacuteptima para cada cepa
de estudio se realizoacute la liofilizacioacuten definitiva
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general Posteriormente se agitoacute con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Esto se realizoacute para cada
cepa
30
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
El tubo T04 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten
definitiva se extrajeron cuatro (4) aliacutecuotas de un (1) ml previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass 62113D-2)
posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por
7s para su homogenizacioacuten
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas a una presioacuten
inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
El proceso de destape parcial y congelacioacuten se realizoacute en caacutemara de flujo laminar para evitar
al maacuteximo la contaminacioacuten El transporte de los viales desde la caacutemara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitroacutegeno liacutequido
para evitar contaminacioacuten y descongelacioacuten
4313 Posliofilizacioacuten
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten Dos viales
designados como trabajo (T) y stock (S) fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4degC plusmn 1degC
4314 Rehidratacioacuten
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacioacuten de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio soacutelido
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos
Se llevoacute un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el aacutenimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacioacuten Al identificarlas se decidioacute repetir la
liofilizacioacuten definitiva con los nuevos paraacutemetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio
4321 Propiedades fiacutesicas generales
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento) color textura brillo aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales teniendo como punto de comparacioacuten la formulacioacuten
luego de congelada Esto se realizoacute para
- Crioviales de la fase intermedia 1
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 431)
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 433)
4322 Contaminacioacuten
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad en
buacutesqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio
31
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten
Se midioacute el tiempo de reconstitucioacuten de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y el tiempo de los crioviales que conteniacutean el lioprotector general fue comparado
con el tiempo de reconstitucioacuten de los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada
433 Pruebas adicionales
Para estas pruebas solo se usoacute la formulacioacuten del lioprotector general y la cepa CM-CR010
por su alta tasa de crecimiento respecto a las demaacutes cepas evaluadas
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticoacute G 1987) se
tomaron los pesos con balanza analiacutetica (AND GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos El cuarto vial y criovial se abrieron solo una vez luego
fueron sellados completamente tomando sus pesos de la misma forma ya descrita
Para determinar si existe un tiempo maacuteximo admisible de cerrado se midioacute el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcioacuten del tiempo utilizando la ecuacioacuten
descrita por Garciacutea C (2007)
Wt () es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4332 Prueba de estabilidad acelerada
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa uno fue rehidratado a los cero (0) diacuteas y el otro
luego de siete (7) diacuteas en el interior de la caacutemara de envejecimiento ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5 Adicionalmente se dataron sus propiedades fiacutesicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada
Ndeg vial t ndash Tdeg - HR
1 0 - ambiente - 25
2 7 - 37degC - 100
Nota Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos t= Tiempo en diacuteas
Tdeg=Temperatura HR=Humedad relativa La prueba de estabilidad se realizoacute en una caacutemara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC luego
incubados a 25 degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente
se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten midiendo viabilidad con el meacutetodo
de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
32
434 Control de esterilidad
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121degC y 210Kpa por 20 minutos las puntas de micropipetas los viales
crioviales y sus respectivas tapas fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y
temperatura en un tiempo de 15 minutos Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas) fueron esterilizados en horno Binder a 160degC por 120 minutos
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo desde la
preparacioacuten de medios hasta el sellado de los viales como se describe a continuacioacuten
4341 Medios
Se realizoacute control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid England) (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Se determinoacute como indicador de contaminacioacuten
cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios
soacutelidos
4342 Ambiente
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realizoacute con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas El periodo de exposicioacuten fue de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en
incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo
b) Cabina de flujo laminar
Se realizoacute el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este
caso la caja de control de ambiente se dejoacute abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeriacutean el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4
horas Este control se llevoacute a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolloacute en el interior de la cabina de flujo laminar
se procuroacute mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y
tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70 al iniciar el trabajo con cada cepa
44 FASE FINAL
441 Base de datos
Se realizoacute una revisioacuten a la base de datos del Banco de cepas creado por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) en el programa Access modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccioacuten para la informacioacuten de los organismos liofilizados
33
442 Fichas de resumen
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccioacuten tanto del Freezer
como del banco de liofilizados utilizando el programa Word 2013
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se realizoacute una revisioacuten de la informacioacuten en los roacutetulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos con el aacutenimo de verificar si se habiacutean cumplido los protocolos y la
logiacutestica establecida por Martiacutenez amp Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias
444 Formatos de control del banco de liofilizados
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013 para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) en la seccioacuten
de criopreservacioacuten
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados
Coacutedigo Tipo de registro Ubicacioacuten Uso
FLf-01 Registro de entrada de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccioacuten
FLf-02 Proceso de
liofilizacioacuten
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacioacuten a
una cepa
FLf-03 Registro de control de
calidad
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccioacuten y antes de liofilizar
una cepa para la coleccioacuten
FLf-04 Solicitud salida de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados
Fuente Adaptado de Martiacutenez Beniacutetez H L amp Mayorga Burgos L P (2013) Implementacioacuten de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (Tesis de
pregrado) (paacuteg 44) Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas Bogotaacute Colombia
445 Manual de procedimientos
Se realizoacute una revisioacuten de la cartilla de procedimientos elaborada por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) Se tomoacute la decisioacuten de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013
34
5 RESULTADOS
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN
A raiacutez de la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en cada criovial por cepa
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno En cuanto a CM-CR005 se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer pero no fue posible recuperarla por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009 la sexta mejor respecto al criterio de eleccioacuten de cepas
Con los datos del proceso precriopreservacioacuten de las cepas de intereacutes correspondientes a la
coleccioacuten de colorantes consignados en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) en conjunto con
los datos de viables poscongelacioacuten del presente trabajo se calculoacute la BSR para cada cepa (Tabla
7) Se encontroacute que los porcentajes de BSR son superiores al 70 luego de dos (2) antildeos de estar
en criopreservacioacuten (Figura 8) salvo CM-CR005
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martiacutenez amp Mayorga (2013) (soacutelo se compararon los datos de la cepa CM-CR010 ya que las demaacutes
cepas no figuran en su trabajo) se encontroacute un porcentaje inferior de recuperacioacuten
poscriopreservacioacuten por parte de las autoras por lo cual se revisoacute la metodologiacutea encontrando un
error metodoloacutegico al calcular la BSR en su trabajo Usando los datos de ldquoresultados prueba de
viabilidad poscongelacioacuten tabla 19rdquo (en Martiacutenez amp Mayorga 2013 paacuteg 54) se corrigioacute la BSR
para esta cepa evidenciando ser la cepa maacutes resistente al proceso de criopreservacioacuten entre las
evaluadas con alrededor de 66 de caiacuteda luego de dos antildeos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8)
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten)
Nota Se muestran los resultados al evaluar la conservacioacuten de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por
el meacutetodo de criopreservacioacuten luego de dos (2) antildeos La BSR que Martiacutenez amp Mayorga (2013) presentan
corresponde a un valor poscriopreservacioacuten luego de dos meses de evaluacioacuten Nrd= No registra datos
Cepa Ceacutelulas
totales
Viables precongelacioacuten
(UFCml) de Martiacutenez
amp Mayorga (2013)
viables pos
congelacioacuten
(UFCml)
BSR
real
BSR de Martiacutenez
amp Mayorga
(2013)
BSR
corregido
CM-CR004 12x1012 61 x109 13 x107 725 Nrd Nrd
CM-CR005 11 x1010 11 x1010 0 00 Nrd Nrd
CM-CR006 14x1010 75 x109 27 x107 752 Nrd Nrd
CM-CR007 13x1011 41 x109 31 x108 883 Nrd Nrd
CM-CR009 19 x1010 44 x109 23 x107 763 Nrd Nrd
CM-CR010 17 x1010 46 x109 72 x108 916 673 982
35
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelacioacuten CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperacioacuten (nuacutemero de
ceacutelulas viables)
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO
En las Tablas 8 9 10 11 y 12 se describen las principales caracteriacutesticas macroscoacutepicas
utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfoloacutegica de las cepas utilizadas No fue
posible realizar la comparacioacuten con los datos de Rodriacuteguez (2013) a nivel macroscoacutepico dado que
los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquiacute utilizados sin embargo si se
compararon las caracteriacutesticas microscoacutepicas las cuales fueron coincidentes aunque estas no eran
del todo claras (descripcioacuten inexacta de forma y tamantildeo y sin un registro fotograacutefico comparable)
por lo cual se decidioacute que las caracteriacutesticas macroscoacutepicas observadas desde la primera siembra
posterior a la descongelacioacuten de los crioviales fuesen las de mayor importancia para evaluar la
estabilidad morfoloacutegica y la pureza Estas se mantuvieron sin cambio o variacioacuten a lo largo del
trabajo
Las microfotografiacuteas tomadas a cada cepa usando la coloracioacuten de Gram al igual que las
fotografiacuteas de las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron anexadas a la base de datos del Banco
Geneacutetico
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 725 00 752 883 763 916
Sup
ervi
ven
cia
36
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR004
Descripcioacuten
Borde o Margen
Ondulado Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de
crecimiento
Frente a luz Brillante
Elevacioacuten Umbonada
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Color Beige maacutes intenso en el centro y maacutes clara hacia los extremos en
colonias de 48h o maacutes extremos color blanco hueso
Forma Circular a maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo desarrollar forma
irregular
Grado de
Transparencia Opaca (No transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Ropa huacutemeda
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR006
Descripcioacuten
Borde o Margen Semiondulado A maacutes de 72h es altamente digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas y con medio huacutemedo se irregulariza
Luego de una semana totalmente digitado
Elevacioacuten Plana con bordes elevados (en craacuteter) Colonias de maacutes de 72h
presentan una ligera elevacioacuten en el centro
Color Amarillo
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Escamosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca (NO transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis Si color amarillo
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
37
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR007
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio muy huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular A maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo es irregular
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 48h y distantes unas de otras (pocas
colonias) umbonadas
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Semitransparente en zona externa
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Mentol
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR009
Descripcioacuten
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas se irregulariza
Elevacioacuten En meseta y ligero hundimiento central (craacuteter) En colonias con maacutes
de 72h ligera elevacioacuten del craacuteter
Color Beige Conforme envejece la colonia toma una coloracioacuten blancuzca
de tonalidad cafeacute en el centro
Tamantildeo Pequentildea (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
38
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR010
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio huacutemedo es suavemente ondulado en medio muy
huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular Despueacutes de 48h se irregulariza En medio muy huacutemedo es
estrellado (sin importar edad de la colonia)
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 72h centro marcado y ligeramente
elevado (forma de huevo frito)
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia
Opaca Semitransparente en la zona externa de colonias de maacutes de
48h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Sin olor
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general
Las Figuras 9 10 11 12 y 13 representan los resultados de la evaluacioacuten de la eficacia del
meacutetodo de conservacioacuten realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1 por medio
del indicador de viabilidad
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 6 x108 Se observa que
la leche descremada 15 como mejor protector y leche descremada 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A - - - 5987 - 5301 5958 6812 -
BSR en serie B - - - 3619 3076 4557 5100 5039 3619
BSR en serie C 3076 3619 - 3619 3076 3418 3418 5873 4723
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR004
39
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 73 x108 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 125 x1010 Se observa
a sacarosa 10 como mejor protector y a glucosa 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 4173 4962 5850 6119 6415 5731 5430 4173 4513
BSR en serie B 3046 - - 4173 4743 5051 4773 - -
BSR en serie C - - - 3046 5147 4622 - - -
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR006
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 9149 8664 6549 9712 9677 8735 9026 9166 8648
BSR en serie B 8472 - 6181 - 8474 - 8413 8052 8086
BSR en serie C 8557 7472 6193 - 9272 - 8604 8202 8414
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR007
40
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 115 x109 Se observa
a Sacarosa 15 como mejor protector y la leche descremada 10 como segundo mejor protector
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 65 x109 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 5494 4609 4609 6641 6401 6987 5585 5440 5186
BSR en serie B 4415 - - 6373 6083 6212 4941 4083 -
BSR en serie C - - - - - 7519 4083 - 4083
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR009
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 8205 - 6303 9521 8634 8207 8153 8022 8332
BSR en serie B 6424 - - 7911 8312 8096 7752 6907 7995
BSR en serie C 6697 - - - 8230 7998 7919 8113 7539
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Sup
erviv
enci
a
BSR en CM-CR010
41
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15
CM-CR006 Sacarosa 10
CM-CR007 Sacarosa 10
CM-CR009 Sacarosa 15
CM-CR010 Sacarosa 10
Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural
ofreciera la maacutes alta BSR en la mayoriacutea de cepas (Tabla 13) se determinoacute la sacarosa al 10
como el mejor lioprotector y se designoacute como lioprotector general para las bacterias del banco de
liofilizados Sin embargo se decidioacute para la liofilizacioacuten definitiva utilizar el lioprotector que
mejores resultados confirioacute a cada una de las cinco cepas de estudio
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado
Dado que el principal indicador de evaluacioacuten de la prueba de estabilidad natural en esta
etapa era la viabilidad en cada liofilizado no se tuvo en cuenta los cambios morfoloacutegicos
presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa pero si fueron tenidos en cuenta
para los ajustes teacutecnicos de la liofilizacioacuten en la fase 3
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilizacioacuten definitiva
con su homoacutelogo de la etapa 2 (es decir los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo) se encontraron diferencias significativas de aumento o disminucioacuten de hasta el 22
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad seguacuten el punto de partida de la formulacioacuten
(medio liquido SMPG vs medio soacutelido SPC) como lo muestra la Figura 14
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilizacioacuten
definitiva por cepa bacteriana Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas seguacuten el intervalo
temporal de la Serie A en tanto que CM-CR007 CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron seguacuten la Serie
B (ver Tabla 4)
- 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Punto
s p
orc
entu
ales
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
L Etapa 2 6812 6415 8474 6212 8312
L definitiva 7330 7629 7757 8461 7234
BSR comparativa
42
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN
551 Propiedades fiacutesicas generales
Se dataron las propiedades fiacutesicas de los liofilizados en la fase intermedia 1 asiacute como los
liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 431 (liofilizacioacuten definitiva) y 4332 (viales
usados para la prueba de estabilidad acelerada) en las Tablas 15 y 16 respectivamente la tabla de
convenciones (Tabla 14) permite comprender los siacutembolos de las anteriores tablas
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilizacioacuten y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilizacioacuten
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transicioacuten conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto fiacutesicamente aceptable Sin embargo pese a que a las propiedades fiacutesicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1 con los cuales se realizoacute la evaluacioacuten de la liofilizacioacuten
y la prueba de estabilidad natural no eran los maacutes adecuados se decidioacute proseguir con ellos
apoyado por los resultados de Vemulapalli Bhonsle amp Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratacioacuten (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperacioacuten de microorganismos ademaacutes el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores
Tabla 14 Tabla de convenciones Siacutembolo Significado Siacutembolo Significado
SBE Si en buen estado A Algunos
SME Si en mal estado T Todos
NBE No en buen estado N Ninguno
NME No en mal estado NS No significativo (lt20)
+ Afirmativo S Significativo (201-309)
- Negativo MS Muy significativo (gt40)
NA No aplica I indeterminado
FS Al finalizar el secado AR Antes de reconstituir
Nota Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15 Aunque no tenga estructura de torta el liofilizado
es estable y funcional por ende utilizable No tiene estructura de torta y ademaacutes no es ni estable ni
funcional por ende no es utilizable
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1
Cepa Viales Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto de
torta
Fractura de
vial 1 2 3
CM
-CR
00
4
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I S Traslucido I + NBEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N S Cafeacute claro Porosa - SMEA -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR NS N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
43
CM
-CR
00
6
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR S S MS Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N NS NS Cafeacute claro Porosa - SBEA -
sm2sc AR S S S Cafeacute oscuro Porosa - SMET -
CM
-CR
00
7
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
s1 NA I I I Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR S I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS I S Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
CM
-CR
00
9
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I NS Traslucido I + NBE -
g2sc AR MS S S Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS S I Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sb AR N N NS Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sc AR N S NS Cafeacute oscuro Porosa - NMEA -
CM
-CR
01
0
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I S S Traslucido I + NMEA -
g2sc AR I MS MS Traslucido I + NMEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
44
Nota Datos de las propiedades fiacutesicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad
natural salvo por el encogimiento que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa) los
demaacutes caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual Se subrayan las
anomaliacuteas encontradas a lo largo de la prueba
g Liofilizados con glucosa como protector
s Liofilizados con sacarosa como protector
sm Liofilizados con leche descremada como protector 1 Formulacioacuten congelada 2 Liofilizados almacenados a temperatura ambiente sa Serie A (antes de rehidratar) sb Serie B (antes de rehidratar) sc Serie C (antes de rehidratar)
1 Concentracioacuten uno del lioprotector
2 Concentracioacuten dos del lioprotector
3 Concentracioacuten tres del lioprotector
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la prueba de
estabilidad acelerada
Nota Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquiacute mencionados corresponden solo a aquellos
que contienen sacarosa al 10 (lioprotector general) Se consignan aquiacute los datos generales de los
liofilizados indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas
a Liofilizados de la prueba de estabilidad natural
b Liofilizados de la liofilizacioacuten definitiva
c Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada 1 Formulacioacuten congelada 2 Viales almacenados a temperatura ambiente 3 Vial usado en la caacutemara de envejecimiento
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto
de torta
Fractura
de vial Viales
a1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
a2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
b1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
b2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
c1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
c2 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR NS Blanco Porosa - SBE -
c3 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR S Blanco Porosa - SME -
45
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes De izquierda a derecha
liofilizados de prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva prueba de estabilidad acelerada
552 Contaminacioacuten
Se encontroacute contaminacioacuten durante la rehidratacioacuten de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006 en tanto que las siembras preliofilizacioacuten no presentaban contaminacioacuten alguna por ello
se tomaron tres viales maacutes que iban a ser rehidratados en la serie B encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilizacioacuten de esta cepa
Las demaacutes cepas no presentaron contaminacioacuten en ninguna prueba realizada
553 Tiempo de redisolucioacuten
Al medir el tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten en cada una de las rehidrataciones se
observoacute que la glucosa tardoacute maacutes tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros
lioprotectores llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Voacutertex en los viales
maacutes concentrados para su total redisolucioacuten Ademaacutes se encontroacute en todos los lioprotectores que
conforme la concentracioacuten aumentaba maacutes tiempo se necesitaba para la reconstitucioacuten de la
formulacioacuten es decir que el tiempo es directamente proporcional a la concentracioacuten de
lioprotector
Al comparar el tiempo de reconstitucioacuten de los viales que conteniacutean el lioprotector general
en la prueba de estabilidad natural con los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales de la
prueba de estabilidad acelerada no se encontraron diferencias significativas sin embargo el vial
de la prueba de estabilidad acelerada que duroacute siete (7) diacuteas en caacutemara de envejecimiento se
reconstituyoacute un segundo menos aproximadamente respecto a los otros viales
46
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado
Lioprotector Tiempo (min)
Glucosa 10 1
Glucosa 117 15
Glucosa 27 120
Sacarosa 4 05
Sacarosa 10 05
Sacarosa 15 06
Leche descremada 10 025
Leche descremada 15 033
Leche descremada 20 05
Estabilidad natural 05
Liofilizacioacuten definitiva 025
Estabilidad acelerada 004
Nota El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada
uno liofilizados con el lioprotector general
56 PRUEBAS ADICIONALES
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica
En la Figura 16 se observa un aumento draacutestico del peso de los viales dentro de la ventana
de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados
al vaciacuteo) Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vaciacuteo) no tuvieron un aumento en
peso tan draacutestico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante Al cabo de cincuenta
(50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente No se encontroacute
por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vaciacuteo
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector La ecuacioacuten presentada pertenece a la liacutenea de tendencia logariacutetmica
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinacioacuten Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba
0 10 20 30 40 50 60
vial (518055g) 0 00724 00772 00782 00840 00869 00849
Criovial (19018g) 0 00079 00158 00315 00473 00578 00605
Promedio 0 00401 00465 00549 00656 00724 00727
y = 00365ln(x) + 00058
Rsup2 = 09647
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
01
AU
MEN
TO D
E P
ESO
(W
)
47
562 Prueba de estabilidad acelerada
Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFCml antes de la liofilizacioacuten al
rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 8398 sin embargo al rehidratar el vial 2 luego de su
estadiacutea en la caacutemara de envejecimiento la BSR fue de 0 Las propiedades fiacutesicas generales de
estos viales son presentadas en la Tabla 15
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN
571 Base de datos
Se eliminoacute una tabla sobrante (constituiacutea informacioacuten redundante de las cepas) dentro de la
base de datos correspondiente a la seccioacuten de criopreservacioacuten Adicionalmente se reorganizoacute la
base de datos al introducir la seccioacuten de liofilizacioacuten y la de refrigeracioacuten Este uacuteltimo meacutetodo de
preservacioacuten fue mencionado en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) pero no fue anexado
sin embargo aunque se incluyoacute la seccioacuten en el banco de cepas debe mencionarse que no existen
registros de las cepas que se hallan conservado por este meacutetodo aun asiacute se decidioacute dejar la seccioacuten
para que lo ocupen trabajos posteriores Ademaacutes se encontroacute que en el Freezer existiacutean colecciones
que no figuran en la base de datos no existen registros de ninguacuten tipo ni caracterizacioacuten alguna en
medios digitales La base de datos quedoacute organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5
Figura 17 Organigrama de la base de datos
572 Fichas de resumen
Las fichas de acceso inmediato designadas como ldquofichas de resumenrdquo para cada coleccioacuten
fueron ubicadas seguacuten el sitio de almacenamiento tanto para las cepas criopreservadas como para
las liofilizadas y refrigeradas Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas las fichas
resumen de este meacutetodo fueron dejadas en blanco para futuras colecciones El formato de las fichas
resumen se presenta en el anexo 6
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se encontroacute que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulacioacuten que
permite la faacutecil confusioacuten entre colecciones criopreservadas sin embargo se decidioacute dejar las
etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martiacutenez amp Mayorga (2013) entre
otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener
que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondriacutea una confusioacuten entre nuevas
y viejas colecciones Este problema fue solucionado con la reorganizacioacuten de la base de datos y las
fichas de resumen
Base de datos del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Informacioacuten de los
microorganismos de
cada coleccioacuten
Meacutetodo de conservacioacuten de cepas
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten
Liofilizacioacuten
48
574 Formatos de control del banco de liofilizados
Se decidioacute que los formatos de control para la seccioacuten de liofilizacioacuten del Banco Geneacutetico
fueran similares tanto para la criopreservacioacuten como para la liofilizacioacuten obedeciendo sus
diferencias a las caracteriacutesticas y datos propios de cada meacutetodo Se encontroacute que los formatos de
la seccioacuten criopreservacioacuten no habiacutean sido llenados nunca desde su creacioacuten Estos se muestran en
el anexo 7
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten
Se editoacute la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martiacutenez amp
Mayorga (2013) Partiendo de esta cartilla se elaboroacute un manual maacutes completo (anexo 8)
introduciendo todos los procedimientos para la liofilizacioacuten las diferentes teacutecnicas empleadas en
los procesos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se complementoacute tambieacuten la seccioacuten sobre el
proceso de refrigeracioacuten y se reescribieron algunos conceptos erroacuteneos de la edicioacuten anterior No
se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservacioacuten pero si
se realizaron pequentildeos ajustes de forma o de edicioacuten
49
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
La recuperacioacuten de microrganismos por criopreservacioacuten se realizoacute de acuerdo a los
lineamientos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) durante todas sus etapas sin embargo
la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la
criopreservacioacuten de la cepa o inclusive en la etapa de descongelacioacuten Garciacutea y Uruburuacute (citados
por Aacutengel A 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y
estabilidad de los organismos conservados edad celular velocidad de congelacioacuten y
descongelacioacuten temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores Dado que las cepas
CM-CR004 006 007 010 e incluso la 009 (que remplazoacute a CM-CR005) presentaron muy buenos
niveles de recuperacioacuten (Figura 8) el factor maacutes probable de falla corresponde al crioprotector
utilizado ya que en el caso del Banco Geneacutetico el crioprotector es general para toda la coleccioacuten
de bacterias y la eleccioacuten del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A
2006) puesto que la efectividad de la criopreservacioacuten se puede ver afectada por las caracteriacutesticas
propias de cada cepa (Hubaacutelek 2003) las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector
Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la
viabilidad los organismos conservados por este meacutetodo sobreviven largos periacuteodos por la
reduccioacuten marcada de su ritmo metaboacutelico incluso por maacutes de 30 antildeos (Gonzaacuteles et al 2006) lo
cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector
como elemento de falla en la conservacioacuten de la cepa perdida
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una uacutenica
liacutenea celular por tanto las caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificacioacuten preliminar Sin embargo estos mismos autores
sentildealan que estas caracteriacutesticas no son uacutenicas ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares como sucedioacute con CM-CR007 y 010 por ello fue preciso observar las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas microscoacutepicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquiacutemicas) de las cepas pero dada la simplicidad de las descripciones microscoacutepicas de
Rodriacuteguez (2013) no se tuvo como principal referencia de identidad Aunque la morfologiacutea de la
colonia depende considerablemente de la composicioacuten del medio de cultivo y las condiciones de
incubacioacuten cuando eacutestas son controladas suelen ser invariables teniendo por lo general un valor
diferencial considerable (Diacuteaz 2009) por lo tanto se tomaron estas caracteriacutesticas como las
principales para la evaluacioacuten de los indicadores de estabilidad morfoloacutegica y pureza
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que ldquolos medios soacutelidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamientordquo (paacuteg 2) Sin embargo se observaron
algunas variaciones las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio Esto se
observoacute maacutes en las cepas CM-CR007 y 010 que al revisar los datos de Martiacutenez amp Mayorga (2013)
y Rodriacuteguez (2013) estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio huacutemedo
tendiacutean a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican Loacutepez T amp Torres (2006)
en bacterias moacuteviles en tanto que sin niveles altos de humedad las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en funcioacuten del tiempo (envejecimiento de la colonia) Esto derivoacute en la
observacioacuten y descripcioacuten de caracteriacutesticas macroscoacutepicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad como son descritas en las Tablas 8 9 10 11 y 12 para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) diacuteas que duroacute la prueba de estabilidad
natural se observoacute que en general de los tres lioprotectores los resultados maacutes bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones Esto tiene su explicacioacuten en las propiedades reductoras
que poseen los monosacaacuteridos ya que como lo menciona Cox C S (citado por Hensel 1994) los
efectos letales de la desecacioacuten se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteiacutenas
de la membrana celular y azuacutecares reductores que aumentan conforme avanza la deshidratacioacuten
(glicacioacuten) si las proteiacutenas de membrana integrales o citosoacutelicas se ven dantildeadas de forma
irreversible durante el secado tendriacutea un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al 1995)
impidiendo la reconstitucioacuten de forma adecuada de las bacterias y por ende generando muerte
celular Sin embargo las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta especialmente en la concentracioacuten maacutes baja incluso para CM-CR007 la glucosa al 10 se
erige como el segundo mejor protector Es probable que estas dos cepas presenten una
configuracioacuten diferente de sus proteiacutenas de membrana que impida la reaccioacuten amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra que proteja a las proteiacutenas de membrana o
citosoacutelicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteiacutenas)
Es conocido que en general los disacaacuteridos mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan Herman White amp Vesey
2006) esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13
A diferencia de la glucosa la sacarosa es un azuacutecar no reductor estos pueden proteger las
ceacutelulas al competir por la unioacuten en la membrana con los azucares reductores (Hensel 1994) Se ha
demostrado que la sacarosa mantiene las proteiacutenas secas igual que en sus conformaciones
hidratadas Leslie et al (1995) indican que este fenoacutemeno sucede probablemente ldquomediante la
unioacuten a los dominios hidroacutefilos de las proteiacutenas y la prevencioacuten de enlaces de hidroacutegeno inter e
intra proteiacutenas durante el secado y la reconstitucioacutenrdquo (paacuteg 3596) lo cual contribuye a las altas tasas
de supervivencia al usar este lioprotector
Para que un protector funcione eacuteste debe proteger la bicapa lipiacutedica y para ello debe existir
dentro y fuera de las ceacutelulas (Leslie et al 1995 Palmfeldt et al 2003) el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transicioacuten de
membrana ya que en eacutesta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentracioacuten (Leslie et al 1995) reemplazando el agua intracelular lo cual se conoce como la
hipoacutetesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al 2003) Si esto se cumple la concentracioacuten
intracelular seraacute alta y el tiempo antes de la congelacioacuten y el secado debe ser corto por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequentildeo (Leslie et al 1995) y los productos polares
extracelulares seraacuten miacutenimos
Ademaacutes tanto la glucosa y la sacarosa estaacuten dentro de la categoriacutea de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo este estado viacutetreo ldquoInduce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una ceacutelula para detener la movilidad
molecular a un miacutenimo El vidrio amorfo inerte tambieacuten es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las ceacutelulas dentro de la estructura de vidrio antes de la congelacioacuten lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquiacutemicos irreversibles en la
membrana plasmaacutetica durante el almacenamientordquo (Morgan et al 2006 paacuteg 186)
51
La retencioacuten de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilizacioacuten
como en la criopreservacioacuten
Cabe mencionar que el proceso de deshidratacioacuten y de reemplazo de agua intracelular por
parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un liacutemite ya que como lo
menciona Heckly (citado por Perry 1995) al congelarse el agua del medio las ceacutelulas sufren
deshidratacioacuten reduciendo el punto de congelacioacuten en el interior y evitando la formacioacuten de
cristales de hielo pero al seguir bajando la temperatura las concentraciones de solutos aumentan
Perry (1995) cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelacioacuten estaacuten posiblemente
asociados a estas soluciones excesivamente concentradas puesto que no se han encontrado
evidencias de lesiones mecaacutenicas por hielo extracelular Esto corresponderiacutea con los resultados
obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores como lo fue la glucosa al 27 en casi
todas las cepas (exceptuando CM-CR006 Figura 10) recordando que un protector funciona mejor
en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmoacutetico con el interior de las bacterias (conocer
la concentracioacuten intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilizacioacuten
por parte de eacuteste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo como se muestra en el
trabajo de Palmfeldt et al (2003)
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta un ejemplo claro es la cepa CM-CR004 la cual de hecho ante los
gluacutecidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentoacute resultados aceptables Morgan et al
(2006) mencionan (teniendo como referencia la investigacioacuten de Buitink et al) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteiacutenas presentes en esta sustancia son
maacutes estables y juegan un importante papel en la formacioacuten del estado viacutetreo lo cual induce a pensar
que una oacuteptima mezcla de proteiacutenas y azucares permite una proteccioacuten maacutes eficiente Esta
posibilidad corresponderiacutea a los resultados obtenidos donde la concentracioacuten de los componentes
de la leche descremada seriacutean propicios para la cepa CM-CR004 en tanto que para las demaacutes cepas
seriacutean maacutes bajas o maacutes altas de lo propicio Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de gluacutecidos y proteiacutenas que la componen pero no
establece cuales son estos pudiendo ser positivos o negativos para la liofilizacioacuten
En general los cultivos liacutequidos ofrecen un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables (Ops
Diagnostics 2015) sin embargo la viabilidad depende muacuteltiples factores incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos El medio SMPG estaacute disentildeado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse raacutepidamente la fuente de carbono (glucosa) una bacteria
de raacutepido crecimiento entraraacute en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio una
de lento crecimiento al cabo del mismo tiempo estaraacute en fase log no obstante en el medio SPC
los nutrientes tardan maacutes tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas todas las bacterias
estaraacuten en fase log Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de raacutepido crecimiento mientras que
CM-CR004 006 y 009 son de crecimiento un poco maacutes lento (datos obtenidos del conteo con
caacutemara de Neubauer no incluidos en el presente estudio)
Morgan et al 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisioloacutegicos
en las bacterias relacionado generalmente con la privacioacuten de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles desencadenando una respuesta ante el estreacutes para permitir la
supervivencia de la poblacioacuten celular Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecacioacuten y las temperaturas menos propicias para su crecimiento por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilizacioacuten Sin embargo la
fase de crecimiento oacuteptima para la supervivencia en la desecacioacuten es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al 2006 paacuteg 185) Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14 indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
liacutequido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log asiacute mismo las cepas CM-CR004 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria pudiendo ser mayor o menor
En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilizacioacuten definitiva se observoacute puffing
y pitting y si bien Vemulapalli et al (2015) indican que estos cambios no afectan la calidad del
producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada Jennings (2008) advierte que su
presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada y que esta puede
deberse a un sistema con composicioacuten diferente de la formulacioacuten principal y podriacutea conducir a
interacciones tales como la agregacioacuten de proteiacutenas ademaacutes se observoacute (Figura 15 izquierda y
centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulacioacuten inicial de glucosa y
sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16) ldquodebido a una accioacuten combinada de la fusioacuten
(maacutes o menos importante) y de la presioacuten reducida dando lugar al puffingrdquo (Ticoacute G 1987 paacuteg
70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings 2008) seguacuten la cantidad del
material afectado por el puffing Esta caracteriacutestica se asocia con un error en los paraacutemetros de
liofilizacioacuten por ello se revisoacute exhaustivamente el proceso de liofilizacioacuten encontrando que los
liofilizados alcanzaron la temperatura de fusioacuten durante el proceso de secado primario por la
inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador el cual no habiacutea sido descrito en el
proceso piloto de liofilizacioacuten con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del
control de calidad A causa de esto los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los
uacutenicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha)
Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura
a los -32 y -42 degC asiacute como un melting inicial a -32degC y -42degC respectivamente seguacuten lo reporta
Moreira Gutieacuterrez amp Delgado (1994) Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento
del liofilizador
Las Tablas 15 y 16 que resumen las caracteriacutesticas tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados muestran que el color textura brillo y fractura de viales estaacuten dentro de los
paraacutemetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilizacioacuten correcta
con las formulaciones utilizadas no obstante se detectaron variaciones posliofilizacioacuten
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales Inicialmente se pensoacute
en una falla durante el tiempo de almacenamiento dado que los liofilizados maacutes afectados fueron
de las series B y C sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada se determinoacute que la causa de fallo yaciacutea en la
obtencioacuten de humedad por parte del producto liofilizado La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vaciacuteo absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vaciacuteo estos habiacutean absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilizacioacuten esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscoacutepica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad maacutes bajo que la sacarosa) debido a la
53
ldquofacilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidroacutegeno con el aguardquo (Badui
Dergal 2006 paacuteg 73) ldquoPara reducir el nuacutemero de moleacuteculas de agua el proceso de liofilizacioacuten y
el sellado de los viales al vaciacuteo debe haber sido exitoso y asiacute obtener un producto con el contenido
de humedad deseadordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 78) por lo cual se descarta la utilizacioacuten del
instrumento manifold para la liofilizacioacuten cepas en el Banco Geneacutetico
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilizacioacuten siempre deben ser
de vidrio ya que el vapor de agua atmosfeacuterico se puede difundir a traveacutes de los tubos de plaacutestico y
por ende las muestras secas terminariacutean absorbiendo agua Esto se comproboacute con la utilizacioacuten de
crioviales que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vaciacuteo sino que ademaacutes en
la serie C casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dantildeados presentaban
cambios de coloracioacuten (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloracioacuten
oscura como lo muestra la Tabla 15) o una marcada reduccioacuten en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentracioacuten) Esto tambieacuten se ve correlacionado con la peacuterdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008) la
humedad es la principal responsable en la peacuterdida de viabilidad en el producto liofilizado
reduciendo la vida uacutetil de los organismos La obtencioacuten de agua implica un retroceso del proceso
de liofilizacioacuten el dantildeo de la matriz formada el flujo de los residuos extracelulares polares es
decir la reactivacioacuten del organismo ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquiacutemica el metabolismo (Adams 2007) finalmente la muerte celular al agotarse esta
El tiempo de redisolucioacuten y el tipo de reconstituyente tambieacuten es de gran importancia La
Tabla 17 muestra tiempos de redisolucioacuten bastante altos para las formulaciones de glucosa Con
los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisioacuten del proceso de liofilizacioacuten se determinoacute la
retrofusioacuten producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de
redisolucioacuten causando un efecto grave donde la interaccioacuten entre las moleacuteculas es tal que la matriz
del liofilizado es casi insoluble (Jennings 2008) El aumento de la temperatura demasiado raacutepido
en el proceso de la liofilizacioacuten o por encima de Tg resultoacute en el colapso haciendo la
reconstitucioacuten mucho maacutes difiacutecil (Fetterolf 2010) Jennings (2008) indica que un aumento en el
aacuterea superficial por unidad de volumen de la torta tenderaacute a disminuir el tiempo de reconstitucioacuten
lo cual sucedioacute para todos los liofilizados que presentaron melting puffing y pitting ya que su
volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulacioacuten congelada solo los
liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulacioacuten
congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitucioacuten
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed amp Roos (2004) quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo se sugiere en muacuteltiples estudios
ademaacutes el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4degC plusmn 1degC en la
oscuridad (Ops Diagnostics 2015)
Se siguioacute los procedimientos de documentacioacuten establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
para la criopreservacioacuten y la elaboracioacuten de los nuevos protocolos de liofilizacioacuten encontrando
como lo menciona Gonzaacuteles et al (2006) que es necesario contar con sistemas de documentacioacuten
eficiente ademaacutes contar con duplicados de la informacioacuten en medios fiacutesicos y magneacuteticos evitado
la perdida de informacioacuten (Montes de Oca et al 2008) y el raacutepido acceso a la misma
54
7 CONCLUSIONES
En general el estado de criopreservacioacuten de las cepas evaluadas es oacuteptimo obteniendo tasas
de supervivencia satisfactorias Sin embargo el criopreservante no funciona de igual forma para
todas las cepas debido a las caracteriacutesticas propias de cada organismo que limitan la accioacuten del
glicerol
De acuerdo a la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten realizada con los tres indicadores
(viabilidad pureza y estabilidad morfoloacutegica) la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados siendo la concentracioacuten al 10pv la maacutes oacuteptima No obstante su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado hermeacuteticamente y al vaciacuteo El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada aunque no se determinoacute la concentracioacuten maacutes oacuteptima
En cuanto a la glucosa al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo se observa
que pese a no ser un buen lioprotector concentraciones de glucosa entre el 6 y el 10 pv son
funcionales aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50
No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten estos
fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminacioacuten de las muestras y a su
vez evitar la contaminacioacuten por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso
Se creoacute el protocolo para el proceso de liofilizacioacuten en todas sus etapas Este es
metodoloacutegicamente funcional y faacutecilmente reproducible por ello se estandariza para el Banco
Geneacutetico seccioacuten liofilizacioacuten dentro del nuevo manual de procedimientos de conservacioacuten Se
incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservacioacuten dentro de este
manual ajustado a las necesidades especiacuteficas de seguridad de la liofilizacioacuten
Es importante mantener actualizado los diferentes medios fiacutesicos y magneacuteticos donde reposa
la informacioacuten de las colecciones y los microorganismos en ellos dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Geneacutetico y la informacioacuten se puede perder
La falta de la identificacioacuten hasta cepa (al menos hasta geacutenero) de los microorganismos
presentes en el banco geneacutetico limita la informacioacuten para entender los fenoacutemenos relacionados a
los procesos de conservacioacuten y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo
55
8 RECOMENDACIONES
Existen paraacutemetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente como la edad del cultivo la
concentracioacuten celular entre otros Se propone el estudio de los paraacutemetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilizacioacuten con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos por ello se sugiere la creacioacuten
de un modelo matemaacutetico para que sea funcional esta prueba lo cual generariacutea datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo
Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinacioacuten de lioprotectores con formadores
de matrices y estabilizantes siguiendo los protocolos establecidos Mezclas de sacarosa al 10 pv
con leche descremada 10 pv (de la misma marca usada en este estudio) sacarosa al 10 pv con
leche descremada 10 pv y carboacuten activado asiacute como la utilizacioacuten de estas mezclas con trehalosa
en distintas concentraciones son sugeridas
Es necesaria la creacioacuten de una plataforma online del banco geneacutetico una vez este cuente con la
identificacioacuten de los organismos contenidos asiacute mismo es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco geneacutetico distinto a Access preferiblemente que obedezca a una
creacioacuten propia de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Es necesaria la creacioacuten de una pasantiacutea anual para curaduriacutea del Banco Geneacutetico ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepcioacuten de cepas Ademaacutes se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas como aquellas que sean donadas al Banco Geneacutetico en el futuro
56
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62
11 ANEXOS
Anexo 1 Formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-XX00Xa
Descripcioacuten Fotografiacutea
Borde o Margen
Frente a luz Brillanteopaca
Forma
Elevacioacuten
Color
Tamantildeo
Superficie
Consistencia
Grado de
Transparencia
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis
Pigmentos que desprende la colonia
y se observan sobre el medio
Olor
Hemolisis
MedioT(degC)
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen
un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace
la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad
del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos
Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen
Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta
Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
63
Anexo 2 Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados
a) Recubrimiento (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido cartoacuten y autoadhesivo de
emulsioacuten acuosa
b) Bandeja de liofilizados
c) Soporte para bandeja
d) Cojiacuten de siacutelice gel (reemplazo seguacuten el tamantildeo y cantidad de cojines de 2 meses a 1 antildeo)
El banco de liofilizados estaacute dividido en tres secciones
La seccioacuten de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A B y C respectivamente
La seccioacuten de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D E y F respectivamente
La seccioacuten de hongos (color cafeacute) correspondiente a las bandejas G H e I respectivamente
64
Bandeja de liofilizados
Estaacute hecha de poliestireno expandido viene con 100 compartimientos individuales para un maacuteximo
de 100 viales por bandeja
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
10 20
30 40
50 60
70
80
90 100
01
11 21
31
41
51
61 71
81
91
65
Anexo 3 Esquema general del cepario madre de liofilizados
J Hongos
K Bacterias
L Algas
F Fila
Nuacutemeros compartimento correspondiente a cada vial La numeracioacuten va en zigzag
J K L
F1 F1 F1 F2 F2 F2 F3 F3 F3
1
8 8 8
9 9 9 1 1
16 16 16 24 24 24
17 17 17
66
Anexo 4 Caacutemara de envejecimiento artesanal
Esta caacutemara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y
humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra La humedad relativa
puede controlarse seguacuten si se use agua (100) o una concentracioacuten determinada de solucioacuten salina
ver Colmenares R (2015)
Horno de 37degC (caacutemara externa)
Caacutemara
interna
Termoacutemetro
Tapa de sello
hermeacutetico
Malla de
soporte
Viales
Agua o sn salina
67
Anexo 5 Base de datos en Access
Esquema general de la Base de datos del Banco Geneacutetico
Espacio de trabajo con las tablas
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
informacioacuten
maacutes detallada)
68
Anexo 6 Formato de las Fichas Resumen
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FICHA RESUMEN DE LA COLECCIOacuteN
Ubicacioacuten de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Fuente de obtencioacuten
de las cepas
Fecha de
ingreso
Cantidad de cepas Tipo de organismos
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa)
Ubicacioacuten de cepas (seguacuten todos los meacutetodos
de conservacioacuten utilizados para la coleccioacuten)
Autores o donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos y Formatos de control
69
Anexo 7 Formatos de control de la seccioacuten liofilizacioacuten
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
Lugar (Ciudad y Paiacutes) Fecha de ingreso
Origen de
la cepa
Institucioacuten Organizacioacuten o
Empresa donante
Persona que realizoacute el
aislamiento
Cargo Fecha de
aislamiento
Informacioacuten de contacto
Fuente de obtencioacuten
de la cepa
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Identificacioacuten geneacutetica
de la cepa
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Calidad de la
cepa recibida
Restriccioacuten de
distribucioacuten
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Observaciones Nivel de
Bioseguridad
N1 N2 N3 N4
Persona donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
70
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL
FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN
CM-_ _0_ _
Proceso
Fecha Hora
Ciudad Equipo
Lioprotector y
concentracioacuten
Temperatura (degC)
Presioacuten (mbar)
Duracioacuten (min) Accesorio de
secado
Responsable (s) del proceso
Ubicacioacuten
Coacutedigo de la
cepa
Nombre de
la coleccioacuten
Viales
almacenados
Tipo S T Lf Total Sello al vaciacuteo SI NO
Cantidad Sello de Aluminio SI NO
Pruebas de
Viabilidad
Caracterizacioacuten
macroscoacutepica (resumen)
Caracterizacioacuten
microscoacutepica (resumen)
Concentracioacuten celular
(UCF)
Preliofilizacioacuten
Posliofilizacioacuten
Bioquiacutemicas
Otras
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
71
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS
CEPAS
CM-_ _0_ _
Detalles del
Proceso
Fecha Ciudad
Hora Coacutedigo de cepa
Viales a evaluar T S Lf Temperatura (degC)
Viales en mal estado T S Lf Presioacuten (Mbar)
Fecha de liofilizacioacuten Fecha de evaluacioacuten Total tiempo (meses)
Descripcioacuten
de la cepa
Geacutenero-especie del
microorganismo
Nombre de la
Coleccioacuten
Car
acte
riza
cioacuten
Microscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Microscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Observaciones
Viabilidad Concentracioacuten Celular
(UFC) Preliofilizacioacuten
Concentracioacuten Celular
(UFC) Posliofilizacioacuten
Observaciones
Control
de
Calidad
Bioquiacutemicas
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Pruebas
Cristal
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Otras Pruebas Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Observaciones
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
72
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD
DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS
CM-_ _0_ _
Lugar (Ciudad Paiacutes) Fecha
Informacioacuten
del
solicitante
Institucioacuten Organizacioacuten
o Empresa
Solicitante Cargo
Teleacutefono (s) Email
Descripcioacuten
de la cepa
Coacutedigo de
cepa
Geacutenero ndash especie
Microorganismo
Coleccioacuten
Utilizacioacuten de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
73
Anexo 8 Manual de procedimientos de conservacioacuten para el Banco Geneacutetico del Laboratorio
de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (Ver archivo adjunto)
Manual de procedimientos de
conservacioacuten para el Banco
Geneacutetico del Laboratorio de
Microbiologiacutea Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute
de Caldas
Primera Edicioacuten
Editado por
Andreacutes V Castantildeeda R
Manual de procedimientos de conservacioacuten para el
Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Ingenieriacutea Sanitaria
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
Licenciado en Biologiacutea
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales
Niria Pastora Bonza Peacuterez
Docente encargado del Laboratorio de Microbiologiacutea y
coordinador de Ingenieriacutea Sanitaria
Miguel Aacutengel Piragauta Aguilar
Disentildeo y diagramacioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
avicent29gmailcom
Autoriacutea y Edicioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda R
2015
Todos los derechos reservados
TABLA DE CONTENIDO
TIacuteTULO PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
RECEPCIOacuteN DE CEPAS 2
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS 3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES 5
Medios 5
Reactivos 6
Protectores generales 6
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN 7
Indicador uno Viabilidad 7
Conteo directo con caacutemara de neubauer (110mm) 7
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa 10
Indicador dos Estabilidad morfoloacutegica 12
Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) 12
Tincioacuten de gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) 13
Indicador tres Pureza de la cepa 13
RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS 14
Criopreservados (descongelamiento) 14
Liofilizados (rehidratacioacuten o reconstitucioacuten) 14
REFRIGERACIOacuteN 15
CRIOPRESERVACIOacuteN 16
Precriopreservacioacuten 16
Preparacioacuten del inoculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 16
LIOFILIZACIOacuteN 17
Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano 17
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 17
IV
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Posliofilizacioacuten 18
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos 18
ROacuteTULOS 19
Refrigeracioacuten 19
Criopreservacioacuten 19
Liofilizacioacuten 20
TIacuteTULO 2 PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONSERVACIOacuteN Y EN EL LABORATORIO
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN 23
Medios 23
Ambiente 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores 23
Cabina de flujo laminar 23
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 24
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS 24
Desechos no contaminados (no infecciosos) 24
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en
autoclave y reutilizado 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado 25
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa 25
BIOSEGURIDAD 26
Proteccioacuten personal 26
Procedimientos 27
Aacutereas de trabajo 27
Capacitaciones 27
REFERENCIAS 28
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dilucioacuten en serie 7 Figura 2 Conteo directo 8 Figura 3 Conteo en bacterias 8 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky 10 Figura 5 Contador de colonias 11 Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados 19 Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer 19 Figura 8 Roacutetulos para los crioviales 19 Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso 4 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG 5 Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos 5 Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos 6 Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer 9 Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 21
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIacuteMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL
kPa Kilo pascales
min Minutos
s Segundos
microl microlitros
mm miliacutemetros
degC grados Celsius
pv porcentaje peso a volumen
mTorr militorricelli
mbar milibar
g gramos
ml mililitros
UCF Unidades formadoras de colonias
rpm Revoluciones por minuto
vv Porcentaje volumen a volumen
iexclPrecaucioacuten
iexclA tener en cuenta
VI
INTRODUCCIOacuteN
Este manual representa en conjunto el trabajo a traveacutes del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigacioacuten han sentado los pilares para la formacioacuten del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC ) cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservacioacuten y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigacioacuten que permita a la comunidad acadeacutemica de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbioloacutegicos en las aacutereas de biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnoloacutegica para el paiacutes Aquiacute se presentan los tres meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos aplicados en este Banco Geneacutetico Refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten Se hace eacutenfasis en los diferentes procesos materiales equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Geneacutetico
Protocolos para la
conservacioacuten de
microorganismos
2
RECEPCIOacuteN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco geneacutetico debe contar con las siguientes condiciones miacutenimas de recepcioacuten
La cepa se debe encontrar en estado de pureza Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Geneacutetico
biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnologiacutea Debe contar con un responsable entidad o institucioacuten donante que respalde
la(s) cepa(s) entregadas ademaacutes de contar con la informacioacuten de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad
La cepa o coleccioacuten debe contar con toda la informacioacuten que el Banco
geneacutetico requiera para su mantenimiento conservacioacuten y registro en la base de datos
La cepa o coleccioacuten debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles
de Bioseguridad establecidos por la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) siendo el nivel de bioseguridad 2 el maacuteximo permitido por las instalaciones del laboratorio con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo
Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado
investigaciones entre otras) se debe pasar con 15 diacuteas de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS al docente encargado
Una vez recibida la cepa se diligencian los mismos registros en digital se
anexa la informacioacuten a la base de datos asignaacutendole un coacutedigo y se diligencian las fichas de resumen
3
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS El personal encargado del Banco Geneacutetico debe realizar una verificacioacuten de la
pureza de la cepa esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada sobre una o maacutes cajas de Petri con el medio de cultivo el tiempo y temperatura de incubacioacuten especificados por quien hace la donacioacuten Asiacute mismo a partir de este subcultivo se debe realizar la evaluacioacuten de la efica-cia del meacutetodo de conservacioacuten para verificar la informacioacuten dada por el investi-gador donante
Posterior al proceso de recepcioacuten de cepas es importante tener en cuenta
que se debe verificar la fecha de la uacuteltima siembra para determinar si es apro-piado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder despueacutes al proceso de criopreservacioacuten o liofilizacioacuten
Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las
cepas por maacutes de dos meses antes de la criopreservacioacuten o la liofilizacioacuten se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservaacutendola por el meacutetodo de refrigeracioacuten con el fin de evitar que la cepa se pierda
Si se requieren hacer pruebas bioquiacutemicas pruebas cristal u otras pruebas
complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos se tendraacute que pedir la autorizacioacuten del responsable del Banco Ge-neacutetico y del encargado del laboratorio debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposicioacuten de material en el laboratorio
Nota Si alguna cepa llegara a presentar contaminacioacuten se debe informar a la persona responsable del Banco Geneacutetico y posteriormente a la persona entidad o institucioacuten donante
4
EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservacioacuten
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso
Proceso o meacutetodo Equipo Material
Refrigeracioacuten Nevera Thermolab 14-E0107 Tubo de ensayo tapa rosca
Cabina de flujo laminar Asa redonda
Esterilizador de asas
Criopreservacioacuten
Cabina de flujo laminar Crioviales Voacutertex Puntas azules Micropipeta graduable de 100-1000 microl
Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la coleccioacuten
Frascos Schott con tapa para el glicerol
Pipeteador Pipeta de 1ml o 5ml
Liofilizacioacuten
Esterilizador de asas Asa redonda
Voacutertex Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Cabina de flujo laminar Puntas azules y amarillas Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile
Recipiente de poliestireno expandido cerrado
Crimper Sello de aluminio Micropipetas graduables de 100-1000microl y 20-200microl
Pinzas Vial 5mm con tapoacuten de divisioacuten
Evaluacioacuten del
meacutetodo de
conservacioacuten
Caacutemara de Neubauer 110mm Laminilla de cuarzo
Caacutemara AxioCam ICc5 Laminas porta objetos
Microscopio Axio Scope A1 Laminillas cubre objetos
Contador de colonias CC-1 Marcador
Estereoscopio Zeiss Asa redonda
Incubadora de 25degy 37degC Asa de Drigalsky
Micropipeta graduable 100-1000microl 20-200microl y 5-20microl
Puntas azules amarillas y blancas
Voacutertex Goteros
Recuperacioacuten de
los
microorganismos
Micropipeta graduable 100-1000microl y 20-200microl
Puntas azules y amarillas
Tubos de ensayo
Cabina de flujo laminar Cajas de Petri con medio
Plancha de calentamiento Mechero
Demaacutes equipos y materiales utilizados en la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten
Beaker
Termoacutemetro
Cajas de Petri con medio
Tubos de ensayo
-Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiologiacutea
5
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Geneacutetico cuenta con medios reactivos y protectores generales definidos para los meacutetodos de preservacioacuten manutencioacuten y recuperacioacuten de microrganismos Estos se describen a continuacioacuten y se clasifican de acuerdo al meacutetodo de conservacioacuten en la Tabla 4
Medios CALDO SMPG Este medio es empleado para el crecimiento del inoacuteculo inicial y
en la formulacioacuten de la criopreservacioacuten Su composicioacuten se muestra en las Tablas 2 y 3 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG
Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos
SPC (Standard Plate Count) Este medio se utiliza para la teacutecnica de evaluacioacuten
de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Tambieacuten puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas
Agar nutritivo (AN) o medios especiacuteficos Utilizados como medio de
mantenimiento o para pruebas bioquiacutemicas yo fisicoquiacutemicas (si se realizan) en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Buffer agua peptonada Este medio se utiliza en la rehidratacioacuten y en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 76
Microelementos 076
Peptona 1
Glucosa 01
MACROELEMENTOS Cantidad MICROELEMENTOS Cantidad
MgSO4 2 g CuSO4- 5H2O 005 g
NaNO3 2 g H3BO3 01 g
KCl 015 g MnSO4 ndash H2O 01 g
CaCl2 21 g ZnSO4 ndash 7H2O 01 g
Na2HPO4 09 g Agua destilada 1000 ml
FeSO47H2O 001 g
Agua destilada 1000 ml
6
Reactivos Tincioacuten Gram La bateriacutea de reactivos para la Tincioacuten de Gram se utiliza en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Alcohol acetona Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo Agua destilada Se utiliza en todos los procedimientos para la preparacioacuten de
medios la descongelacioacuten y especialmente en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Alcohol Para desinfeccioacuten en todos los procedimientos (70) o para mecheros (95)
Aceite de inmersioacuten Se utiliza para la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten durante las observaciones microscoacutepicas
Nitroacutegeno Liacutequido Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilizacioacuten
Protectores generales Crioprotector Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservacioacuten en
proporcioacuten 67vv respecto al criovial Lioprotector Se utiliza una solucioacuten de Sacarosa 10 pv para las
formulaciones en la liofilizacioacuten bacteriana En hongos se utiliza leche descremada al 12 pv No se tiene detalles de lioprotector oacuteptimo en algas
Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos
Nota Dado que en la refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se realiza la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten se incluyen aquiacute los reactivos implicados en dicha evaluacioacuten
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten Liofilizacioacuten R
eacti
vos
Tincioacuten Gram SI SI SI
Alcohol acetona SI SI SI
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de inmersioacuten
SI SI SI
Nitroacutegeno Liacutequido NO NO SI
Me
dio
s
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios especiacuteficos
OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
Agua peptonada SI SI SI
Pro
tecto
r
Glicerol anhidro NO SI NO
Sacarosa 10pv
NO
NO SI
7
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN
Indicador uno Viabilidad Conteo directo con caacutemara de Neubauer (110mm)
Se parte de un tubo de dilucioacuten (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto el cual tiene por lo general un tiempo de incubacioacuten de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo Figura 1 Dilucioacuten en serie Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser esteacuteriles usando una nueva en cada transferencia El diluyente es agua peptonada al 01 pv
Tome la caacutemara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia
Observe las dos cuadriculas de la caacutemara que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H)
Agite el tubo de dilucioacuten seleccionado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s tomando con una micropipeta una aliacutecuota de 10microl y depositaacutendola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla dejando que se cargue por capilaridad de forma homogeacutenea (Figura 2-A) Posteriormente lleve al microscopio enfocando desde el menor aumento hasta eacutel objetivo 40x al tiempo que ajusta la intensidad lumiacutenica para poder observar las liacuteneas de la caacutemara y las ceacutelulas al tiempo
-Algunos modelos de Voacutertex no poseen un rango de velocidad sino de niveles -Para limpiar la caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo lave primero con agua destilada luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada Deje secar al ambiente -Para una correcta observacioacuten al microscopio utilice el meacutetodo de enfoque de Koumlhler -Procure no limpiar la laminilla con ninguacuten papel o pantildeo lo puede rayar -Este procedimiento debe durar maacuteximo 10min ya que la solucioacuten podriacutea secarse debido a la luz del microscopio
8
Figura 2 Conteo directo A Utilizacioacuten de la caacutemara de Neubauer 1 posicioacuten de la laminilla 2 posicioacuten de la punta para el deposito de la muestra B esquema general de la caacutemara de Neubauer Adaptado de Bastidas (2015) httpwwwceleromicscomesresourcesdocsArticlesFormula-Camara-Neubauer-Concentracionpdf amp Universitat de Barcelona (2015) httpwwwubeduLabFisioimagesstoriesFisAnimalBiologiaSangrecontadorTomapng
El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central Las foacutermulas y los cuadros a contar se determinan seguacuten el tamantildeo del microorganismo
Hongos y microalgas Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes
(cuadros 1 y cuadro central Figura 2-B) de izquierda a derecha Bacterias Cuente en el cuadro central que contiene 25 cuadros secundarios
(Figura 2-B) 5 de ellos (Figura 3-A o B) Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios en estos las ceacutelulas deben contarse en la direccioacuten que se indica en la Figura 3-C Los cuadros terciarios contienen tres liacuteneas en los extremos por ello se deben tener en cuenta las ceacutelulas que esteacuten desde la liacutenea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D
Figura 3 Conteo en bacterias A y B Forma de contar los cuadros terciarios C Direccioacuten de conteo en los cuadros terciarios D Ceacutelulas a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios
9
Es importante resaltar que las bacterias que esteacuten unidas se contaraacuten como una Una vez obtenido el nuacutemero total de ceacutelulas se realizaran los caacutelculos correspondientes a los cuadros utilizados Para obtener el nuacutemero de bacterias se utiliza la ecuacioacuten planteada a partir de Bastidas (2015) Ndeg de bacteriasml=
En el caso de hongos y microalgas se utiliza la siguiente ecuacioacuten a partir de Bastidas (2015) Ndeg de ceacutelulasml= Fd Factor de dilucioacuten = Nota El meacutetodo de conteo en caacutemara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de ceacutelulas en los procedimientos de conservacioacuten de microorganismos Pero si se requiere la utilizacioacuten de otro meacutetodo se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados
Consideremos el siguiente ejemplo Tenemos un tubo con cultivo en medio liacutequido (10ml) de 36 horas este seraacute
nuestra muestra inicial Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con aliacutecuotas de 1ml en 9ml de diluyente Se realiza el procedimiento descrito en las paacuteginas anteriores haciendo un solo conteo Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de aliacutecuota g o ml de aliacutecuota + g o ml de diluyente
Ndeg Total de ceacutelulas contadas times 10000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
-El conteo directo con caacutemara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al meacutetodo de conservacioacuten evaluado
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
10
Aplicando la ecuacioacuten para bacterias anteriormente mostrada tenemos que
Ndeg de bacteriasml=
= 81012 bacteriasml
81012 bacteriasml seraacute la cantidad de bacterias que ldquoexistenrdquo en la muestra inicial Esta en teacuterminos matemaacuteticos de las diluciones equivale a 100
Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas contando en los
cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuacioacuten tenemos que Ndeg de ceacutelulasml= = 321011 ceacutelulasml
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Seleccione tres tubos de la dilucioacuten seriada y de cada uno vierta aliacutecuotas de 100microl (agitando con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) antes de cada extraccioacuten) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio Raacutepidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky esteacuteril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky A La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atraacutes B Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro luego girar 90deg la caja y repetir el proceso
A B
90deg
16 times 250000
10-7 times 5
-Si se quieren datos maacutes fiables se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma aliacutecuota o poner en la caacutemara cinco aliacutecuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras -Al realizar el conteo en la caacutemara de Neubauer obtenemos el total aproximado de ceacutelulas presentes en la dilucioacuten utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado yo las impurezas que pueda contener la muestra por lo cual no es 100 exacto y no indica las ceacutelulas viables
16 times 10000 10-7 times 5
11
Deje secar por miacutenimo 15min y lleve a incubacioacuten en posicioacuten invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja) Seguacuten el tipo de organismo las condiciones de incubacioacuten para la lectura de las cajas son
Bacterias temperatura ambiente 37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento
si se conoce Incubacioacuten de 18-24 horas Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas Casos extremos de crecimiento lento una semana
Hongos temperatura inferior a 25degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten de una siembra de solucioacuten de conidios de 4-8 diacuteas
Algas temperatura entre 25-37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten por maacuteximo 7 diacuteas en organismos descongelados o rehidratados
Luego de la incubacioacuten las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura
5) Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFCml)
Figura 5 Contador de colonias La caja de Petri se coloca en posicioacuten invertida y se marcan las colinas el contador cuenta al tacto
-La siembra por tubo se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador -Generalmente se toman las diluciones 10-5 10-6 y 10-7 Sin embargo si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3 10-4 y 10-5 -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70 flamear esperar a que el alcohol se consuma Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar por uacuteltimo palpe raacutepida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender para enfriar totalmente -Puede usarse una siembra en profundidad u otro meacutetodo para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie Sin embargo los demaacutes meacutetodos de conteo limitan la evaluacioacuten del indicador dos -Si al cabo de 30min las cajas no han secado el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condicioacuten -Con la punta de la micropipeta no toque el medio -Siempre use guantes y desinfeacutectelos constantemente durante los procedimientos
12
En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250 al suponer que cada ceacutelula forma una colonia Para el caacutelculo de UFCml utilizamos una adaptacioacuten de la foacutermula de Valencia Z(2004)
UFCml = times times
Ejemplo 120 X 107 X 10 = 121010 UFCml
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten se calcula a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010) Tasa de supervivencia (BSR )=
Donde DD Despueacutes de la desecacioacuten AD Antes de la desecacioacuten
Indicador dos Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realiza Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas)
Diligenciar el formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas (anexo 1) descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de ldquoconteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Hay que tener en cuenta que
- Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas) de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas deben ser observadas en al menos el 80 de las colonias de la placa seleccionada
Ndeg de colonias (promedio entre las cajas por dilucioacuten)
Inverso del factor de dilucioacuten
Inverso del volumen de aliacutecuota
-La metodologiacutea y los criterios de eleccioacuten de cajas asiacute como el rango son seguidas de Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo todas las placas por dilucioacuten por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -El inverso del volumen de aliacutecuota corresponde a una medida de correccioacuten obligatoria para la siembra en superficie ya que en la praacutectica se aumenta en 110 el factor de dilucioacuten al sembrar 01ml (100microl) del tubo de dilucioacuten seleccionado
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100 Log (Ndeg UFCml AD)
13
Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se realice una ldquocoloracioacuten de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005 paacuteg 24) En el caso de hongos realice una coloracioacuten simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado
Por uacuteltimo comparar los resultados con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y
macroscoacutepicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se toma registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio con caacutemara
Indicador tres Pureza de la cepa
Este indicador evaluacutea la pureza de un vialcriovial rehidratadodescongelado ademaacutes permite determinar si existe un cambio geneacutetico durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservacioacuten Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimaacutetica usando una bateriacutea de pruebas bioquiacutemicas o fisicoquiacutemicas diferenciales dependiendo de los requerimientos especiacuteficos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio Se recomienda realizar cada prueba por triplicado Tambieacuten puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales
-Realice una coloracioacuten de Gram estaacutendar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotograacutefico en un lapso no mayor a dos diacuteas -En los hongos es imprescindible el registro fotograacutefico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonoacutemica -El formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas exige un registro fotograacutefico pero alliacute solo se consignan si las fotografiacuteas son de alta calidad de lo contrario solo se dejan en la base de datos como referencia -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos -La estabilidad morfoloacutegica se evaluacutea pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -Para comparar las caracteriacutesticas macroscoacutepicas con la informacioacuten de origen se deben usar los mismos medios El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos
Si se confirma variacioacuten en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen y estas confirman la variacioacuten geneacutetica de la cepa inmediatamente se saca de la coleccioacuten origen se asigna un nuevo coacutedigo de identificacioacuten y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa Puede incluirse en la coleccioacuten Praacutecticas Acadeacutemicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva coleccioacuten
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RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento) Se toma un criovial (Semistock preferiblemente) sometieacutendolo a una
temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente 5min (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Los crioviales se introducen en bantildeo seroloacutegico una vez se llega a la temperatura deseada no antes
Del criovial se toma 1ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex
nivel 7 (asymp2240rpm) por 10s diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
La evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten se realiza al criovial luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubacioacuten (viables poscriopreservacioacuten) Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Geneacutetico
Liofilizados (Rehidratacioacuten o reconstitucioacuten)
Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC los viales a usar tomando el tiempo de rehidratacioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitando con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se toma un 1ml de este vial partiendo de esta aliacutecuota se realiza evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en medio soacutelido El indicador de viabilidad se evaluacutea solo con el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa u otro meacutetodo de conteo de organismos viables
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-dor donante sugiera otros meacutetodos de recuperacioacuten -La solucioacuten de rehidratacioacuten puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solucioacuten lioprotectora de la formulacioacuten -En el momento en que solo quede un criovialvial disponible de la cepa se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservacioacuten a partir de este
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REFRIGERACIOacuteN
Se implementa el meacutetodo de resiembra continua en este el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-Garciacutea et al 2010) cuando es utilizado para su almacenado nuevamente Se debe tener en cuenta los siguientes paraacutemetros
a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las
caracteriacutesticas del microorganismo ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios despueacutes de diacuteas semanas o meses Tambieacuten depende del tipo de medio de mantenimiento
b) El riesgo de contaminacioacuten y de cambios geneacuteticos se incrementa a mayor nuacutemero de transferencias
De acuerdo a esto para el laboratorio se determina
a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo
tapa rosca con Agar inclinado b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo procurando no
realizar maacutes de 4 transferencias c) La temperatura de refrigeracioacuten debe mantenerse en un rango de 4plusmn2degC d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminacioacuten
cruzada teniendo en cuenta la organizacioacuten interna del refrigerador evitando el amontonamiento de las cajas
e) Se utilizaraacute el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
f) Las cepas preservadas por este procedimiento seraacuten utilizadas para requerimientos internos del laboratorio preferiblemente en praacutecticas acadeacutemicas
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CRIOPRESERVACIOacuteN
Precriopreservacioacuten En el interior de la cabina de flujo laminar tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina Posteriormente son llenados con 1200microl de glicerol esteacuteril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados
Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de criopreservacioacuten (Martiacutenez amp Mayorga 2013) se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae una aliacutecuota de 1ml diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02)
Despueacutes agitar el tubo T02 con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s tomando
luego cinco aliacutecuotas de 600microl depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Se rotulan los crioviales y se realiza Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten Inmediatamente despueacutes de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente seguacuten la coleccioacuten a una temperatura de -85degC plusmn 1degC
Por uacuteltimo se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIOacuteN
culminado el proceso
-No use micropipeta para pipetear el glicerol -Todo el material debe ser correctamente esterilizado -Nunca tocar las tapas en el interior -De ser posible se recomienda una concentracioacuten de 10⁸ - 109 celml -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar 20min desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas (si se han determinado celml totales precongelamiento) -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables aumentando el nuacutemero de viables poscongelacioacuten Esto se puede hacer si no se tiene un nuacutemero determinado de ceacutelulas a una temperatura de 4degC plusmn 1degC por 20-30min -Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y poscriopreservacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas
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LIOFILIZACIOacuteN Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano Desde medio soacutelido
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio soacutelido se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general Posteriormente se debe agitar con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Desde medio liacutequido
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra diluyeacutendolo en un tubo con 9ml agua destilada esteacuteril (designado como T04)
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten Desde medio soacutelido
Del tubo T03 como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten y previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 1ml que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Desde medio liacutequido
Del tubo T04 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 100microl depositados en cuatro viales de vidrio En cada vial se adiciona 900microl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapoacuten de divisioacuten
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior de cada vial
sea lo maacutes exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T04 se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparacioacuten
Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado en
tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T04
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Con un volumen total de 1ml cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Los viales (indistintamente si se parte de medio soacutelido o liacutequido) se destapan parcialmente y se congelan en nitroacutegeno liacutequido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ge15min para ser llevados al liofilizador de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
Posliofilizacioacuten Luego del desmonte y sellado al vaciacuteo de los viales cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper posterior al proceso de liofilizacioacuten Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente El tercer vial (Lf) se almacena a 4degC plusmn 1degC en el cepario madre de liofilizados El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 diacuteas realizando evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten para saber si fue o no exitosa la liofilizacioacuten Por uacuteltimo se debe llenar el registro FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN culminado el proceso
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos En cuanto a los hongos el inoacuteculo inicial durante la preliofilizacioacuten se prepara
llenando con 10ml de agua destilada esteacuteril un cultivo soacutelido altamente esporulado del hongo Luego con un asa o espaacutetula esteacuteril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar Esta suspensioacuten es extraiacuteda con una pipeta esteacuteril y depositada en un tubo de ensayo al cual se le agrega 100microl de solucioacuten Tween 80 al 01 esteacuteril para preparar la solucioacuten de esporas Se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 20s y se prosigue de acuerdo a la ejecucioacuten de la liofilizacioacuten desde de un medio liacutequido
-Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y posliofilizacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas -Se debe realizar Voacutertex cada vez que se vaya a extraer una aliacutecuota -Los mejores resultados en la liofilizacioacuten se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas y en caldo SMPG un rango de 24-48h -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir maacutes tiempo del estipulado para su total congelamiento tener este dato de ser posible -El tiempo de liofilizacioacuten variacutea seguacuten la formulacioacuten Para una formulacioacuten con Sacarosa 10 36 horas es lo ideal -Debe usarse el accesorio para liofilizacioacuten Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vaciacuteo y de forma hermeacutetica -Los tapones de divisioacuten deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimacioacuten del agua de lo contrario no seraacute posible la liofilizacioacuten y pueden incluso quebrarse
-Si el raspado contiene rastros grandes de agar se debe realizar un filtrado con gasa esteacuteril aunque esto disminuiraacute el nuacutemero de esporas -Las esporas en solucioacuten pierden viabilidad conforme avanza el tiempo Se sugiere hacer uso de la solucioacuten antes de dos horas de preparada
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ROacuteTULOS
Refrigeracioacuten Dado que la refrigeracioacuten constituye un meacutetodo de corto plazo no se
requieren roacutetulos especiales para este meacutetodo de conservacioacuten Sin embargo es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente informacioacuten con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha
Criopreservacioacuten
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los roacutetulos de coleccioacuten usados en las cajas del Freezer y los roacutetulos para cada cepa criopreservada
Fecha de ingreso__________________________ Medio___________________________________ Cepa____________________________________ Coacutedigo__________________________________
-Es opcional imprimir este roacutetulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta
Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer
Figura 8 Roacutetulos para los crioviales
Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados
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Liofilizacioacuten
Los roacutetulos de la Figura 9 contienen la siguiente informacioacuten Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de
datos el Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo) nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten
de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6) con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada
vial Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
-Los roacutetulos de las cajas del Freezer los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo -Los roacutetulos deben colocarse antes de su almacenamiento especialmente los crioviales ya que una vez congelados el adhesivo no funciona
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Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio (paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
CC en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual moderado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro Existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o indirectamente Normalmente no existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005)
-En la base de datos del Banco Geneacutetico se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos pero el formato y tamantildeo de letra sea igual para todos los roacutetulos -Las etiquetas de liofilizacioacuten y criopreservacioacuten deben imprimirse en papel adhesivo -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos
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Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservacioacuten y en
el laboratorio
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CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121degC y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro meacutetodo de esterilizacioacuten las puntas de micropipetas los viales crioviales y sus respectivas tapas deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas) pueden ser esterilizados en horno a 160degC por 120min
Sin embargo se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de
todo el trabajo desde la preparacioacuten de medios hasta el sellado de viales y crioviales como se describe a continuacioacuten
Medios Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Son indicadores de contaminacioacuten cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios soacutelidos
Ambiente Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto) evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas El periodo de exposicioacuten va de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo Se recomienda que con un nuacutemero superior de cinco colonias en el control se desinfecte el aacuterea de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminacioacuten Cabina de flujo laminar
Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4 horas Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar
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Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70 al inico durante y al final del trabajo con cada cepa
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005) los residuos se pueden clasificar en cinco grupos La eliminacioacuten de residuos en el laboratorio de microbiologiacutea no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas por ello los desechos se dispondraacuten de la siguiente forma
Desechos no contaminados (no infecciosos) Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que
incluso pueden reutilizarse o reciclarse como el papel
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservacioacuten requiere
de material corto-punzante se cuenta con un guardiaacuten para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plaacutesticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestioacuten Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposicioacuten final de este material
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado
Las cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 20 minutos Posterior al proceso de autoclavado se deben someter a un proceso de desinfeccioacuten con hipoclorito al 15 durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jaboacuten neutro
Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas en todo caso deberaacuten tener el mismo proceso de desinfeccioacuten anteriormente mencionado
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Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado todos los desechos producidos en cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 15 minutos posterior a este proceso se descartaraacute el contenido de las cajas de Petri disponieacutendolos en bolsas rojas para residuos peligrosos Por otra parte los desechos liacutequidos deberaacuten ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa
No es directriz del laboratorio ni del Banco Geneacutetico la incineracioacuten de ninguacuten tipo de material o residuo peligroso solo de su disposicioacuten y almacenaje seguacuten lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos
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BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2 es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos estos son
ldquoAgentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente La exposicioacuten en el laboratorio puede provocar una infeccioacuten grave pero existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces y el riesgo de propagacioacuten es limitadordquo (OMS 2005 paacuteg 1)
El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Geneacutetico Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005)
Proteccioacuten personal El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial
Se recomienda el uso de batas blancas manga larga y bien abotonada con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar ensuciar o para prevenir alguacuten accidente
Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas bufandas o gorras
Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupcioacuten
Se debe utilizar proteccioacuten ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos
Debe respetarse la prohibicioacuten de beber comer masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como boliacutegrafos ademaacutes de tocarse los ojos y nariz
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Procedimientos Estaacute estrictamente prohibido pipetear con la boca se deben utilizar
pipeteadores mecaacutenicos Todos los cultivos stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un meacutetodo de descontaminacioacuten aprobado como por ejemplo mediante autoclave
Aacutereas de trabajo Las superficies de trabajo se descontaminan como miacutenimo una vez por diacutea
y luego de todo derrame de material contaminante
En las zonas de trabajo estaraacute prohibido comer beber fumar aplicar cosmeacuteticos manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en aacutereas de trabajo
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ninguacuten momento ropa u objetos personales
Capacitaciones Los encargados del Banco geneacutetico y del laboratorio deberaacuten estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma maacutes eficaz y asiacute reducir riesgos en el proceso
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado asiacute como de las maquinas y elementos del laboratorio
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REFERENCIAS
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Anexos y formatos
30
31
32
BANCO DE LIOFILIZADOS
33
CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
34
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
FORMATO PARA CARACTERIacuteSTICAS MACROSCOacutePICAS DE LAS CEPAS
35
FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN
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FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN LIOFILIZACIOacuteN
37
38
39
40
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN CRIOPRESERVACIOacuteN
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42
43
44
45
CONTENIDO
RESUMEN 10
ABSTRACT 10
1 INTRODUCCIOacuteN 11
2 MARCO REFERENCIAL 13
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS 13
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS 14
221 Conservacioacuten a corto plazo 14
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten 14
223 Conservacioacuten a largo plazo 15
2231 Liofilizacioacuten 15
2232 Control de calidad de un producto liofilizado 20
2233 Equipamiento para liofilizar 21
3 OBJETIVOS 22
31 OBJETIVO GENERAL 22
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 22
4 METODOLOGIacuteA 23
41 FASE INICIAL 23
411 Acervo Microbiano 23
412 Eleccioacuten de los protectores 23
4121 Crioprotectores 23
4122 Lioprotectores 23
42 FASE INTERMEDIA 1 24
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten 24
4211 Viabilidad 24
4212 Estabilidad Morfoloacutegica 25
4213 Pureza 25
422 Recuperacioacuten de los microorganismos 25
423 Criopreservacioacuten 26
4231 Precriopreservacioacuten 26
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 26
424 Liofilizacioacuten Etapa 1 26
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 26
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 26
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje) 27
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2 29
43 FASE INTERMEDIA 2 29
431 Liofilizacioacuten definitiva 29
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 29
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 30
4313 Posliofilizacioacuten 30
4314 Rehidratacioacuten 30
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos 30
4321 Propiedades fiacutesicas generales 30
4322 Contaminacioacuten 30
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten 31
433 Pruebas adicionales 31
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica 31
4332 Prueba de estabilidad acelerada 31
434 Control de esterilidad 32
4341 Medios 32
4342 Ambiente 32
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 32
44 FASE FINAL 32
441 Base de datos 32
442 Fichas de resumen 33
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 33
444 Formatos de control del banco de liofilizados 33
445 Manual de procedimientos 33
5 RESULTADOS 34
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN 34
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE
ESTUDIO 35
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD
NATURAL 38
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general 38
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado 41
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA 41
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN 42
551 Propiedades fiacutesicas generales 42
552 Contaminacioacuten 45
553 Tiempo de redisolucioacuten 45
56 PRUEBAS ADICIONALES 46
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica 46
562 Prueba de estabilidad acelerada 47
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN 47
571 Base de datos 47
572 Fichas de resumen 47
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 47
574 Formatos de control del banco de liofilizados 48
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten 48
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS 49
7 CONCLUSIONES 54
8 RECOMENDACIONES 55
9 REFERENCIAS 56
10 BIBLIOGRAFIacuteA 60
11 ANEXOS 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten 16
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado 17
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua 18
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten 19
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes 21
Figura 6 Metodologiacutea 23
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 28
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelacioacuten 35
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 38
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilizacioacuten definitiva por cepa bacteriana 41
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes 45
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales 46
Figura 17 Organigrama de la base de datos 47
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas 24
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten 27
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 28
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales 29
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada 31
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados 33
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten) 34
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004 36
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006 36
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007 37
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009 37
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010 38
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad 41
Tabla 14 Tabla de convenciones 42
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1 42
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada 44
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado 46
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencioacuten de los microrganismos y dada su importancia se han
creado colecciones bioloacutegicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologiacutea Existe variedad de meacutetodos de preservacioacuten en este trabajo se determinoacute el estado
de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad estandarizando e
implementando ademaacutes el sistema de liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos
evaluaacutendolos frente a tres compuestos protectores Se realizoacute una evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten teniendo como base tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
encontrando que el sistema de criopreservacioacuten implementado en el laboratorio es oacuteptimo y el
glicerol al 67vv funciona para casi todas las cepas por largos periacuteodos de tiempo la sacarosa
10pv resultoacute ser el mejor lioprotector de los tres evaluados designaacutendolo como lioprotector
general para el laboratorio Se creoacute un manual de laboratorio para la conservacioacuten de cepas que
incluye los protocolos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten y de seguridad de los mismos Este
trabajo aporta al campo de la microbiologiacutea de la conservacioacuten y constituye un peldantildeo maacutes para
el registro del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes
PALABRAS CLAVE Criopreservacioacuten liofilizacioacuten lioprotectores conservacioacuten
microorganismos
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and given its importance have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology Exists variety of methods of preservation in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing standardizing and further
implementing the system freeze-drying taking as a starting point to them evaluating them against
three protective compounds An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators
viability morphological stability and purity was performed finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67 vv works for almost all strains for long
periods of time sucrose 10 wv lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory It was created a manual for conservation
laboratory strains including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions
KEYWORDS cryopreservation freeze-drying lyoprotectants conservation microorganisms
11
1 INTRODUCCIOacuteN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible pues como lo menciona
Hurtado (2009) la vida no es posible sin la actividad de estos ya que estaacuten involucrados en todas
las dinaacutemicas ambientales existentes en el planeta Sin embargo su importancia ha ido maacutes allaacute
desde que fueron descubiertos hace unos 300 antildeos por van Leeuwenhoek potencializaacutendose su
investigacioacuten y utilizacioacuten en distintos campos de la ciencia y la tecnologiacutea en los uacuteltimos 100
antildeos iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi amp Mayz 2003)
Debido a esto se han creado colecciones bioloacutegicas como meacutetodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho Las colecciones de cultivos microbianos estaacuten
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt y a nivel internacional por
la Federacioacuten Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) en donde existen actualmente
2acute520200 microorganismos en 711 colecciones de 71 paiacuteses registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM) Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM el CIAT (Rhizobium Collection America) de coacutedigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccioacuten de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de coacutedigo WDCM 857 (WFCC 2015)
No obstante varias universidades del paiacutes instituciones puacuteblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias bioloacutegicas poseen colecciones microbioloacutegicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN) en otros casos las colecciones estaacuten en proceso de registro o en formacioacuten como en la
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) entre otras
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer meacutetodos de conservacioacuten fiables
que entre otras cosas eviten al maacuteximo el riesgo de peacuterdida o de variabilidad geneacutetica de los
individuos Existe variedad de meacutetodos de conservacioacuten seguacuten sea el tiempo que estaraacuten en la
coleccioacuten o el tiempo en que tardaraacuten en ser usados dentro de ellos destacan la criopreservacioacuten y
la liofilizacioacuten meacutetodos utilizados para la coleccioacuten de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo
Martiacutenez amp Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Geneacutetico en el Laboratorio
de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC siglas de la coleccioacuten microbioloacutegica) utilizando
la refrigeracioacuten como meacutetodo primario implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
criopreservacioacuten
En este trabajo se pretendioacute determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos evaluaacutendolos frente a tres compuestos
protectores Para ello en primera estancia se recibioacute una capacitacioacuten sobre manejo y control de
microrganismos preparacioacuten de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados posteriormente se evaluoacute el estado de criopreservacioacuten de las cinco
cepas seleccionadas utilizando teacutecnicas de recuento en placa estaacutendar y se evaluoacute a tres
lioprotectores para la liofilizacioacuten de cepas microbianas del Banco Geneacutetico ademaacutes se realizaron
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacioacuten y se disentildearon los
protocolos para la implementacioacuten del sistema de liofilizacioacuten con las cinco cepas y el lioprotector
que presentoacute mejores resultados en este estudio
Para la realizacioacuten de estos fines el trabajo fue dividido en cuatro fases comenzando por los
criterios de eleccioacuten de los microrganismos y los lioprotectores seguido de la evaluacioacuten de los
meacutetodos de preservacioacuten utilizando tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
posteriormente una tercera fase de ajustes a la liofilizacioacuten para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo utilizando como indicadores las propiedades fiacutesicas generales la
posibilidad de contaminacioacuten en el proceso y el tiempo de redisolucioacuten finalmente una cuarta
fase que corresponde al proceso de documentacioacuten este incluye la revisioacuten y modificacioacuten de la
base de datos la elaboracioacuten de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados asiacute como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccioacuten y finalmente la
elaboracioacuten del manual de procedimientos Con lo anterior se encontroacute que el sistema de
criopreservacioacuten desarrollado por Martiacutenez amp Mayorga (2013) es eficiente y permite porcentajes
de recuperacioacuten bastante altos incluso superiores al 90 luego de dos antildeos sin embargo no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estaacuten expuestas por
este meacutetodo De otro lado se determinoacute la sacarosa al 10 como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caracteriacutesticas propias de cada organismo)
y se estandarizoacute el sistema de liofilizacioacuten
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacioacuten de un nuevo meacutetodo de
conservacioacuten de microorganismos para el Banco Geneacutetico de la Universidad Distrital Francisco
Joseacute de Caldas ademaacutes aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacioacuten en bacterias y ofrece
informacioacuten yo tips sobre el proceso de liofilizacioacuten en general que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso Tambieacuten se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Geneacutetico en la comunidad cientiacutefica a nivel nacional
e internacional
Este documento consta en su orden de un capiacutetulo de introduccioacuten y un marco referencial de los
objetivos tanto general como especiacuteficos alcanzados en este trabajo una metodologiacutea detallada
paso a paso perfectamente reproducible los resultados encontrados asiacute como el anaacutelisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacioacuten
finalmente un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo el campo de la
conservacioacuten microbiana y los capiacutetulos correspondientes a las referencias y bibliografiacutea utilizada
Se incluye tambieacuten un capiacutetulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientiacutefica del presente trabajo
13
2 MARCO REFERENCIAL
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS
La vida en la Tierra no seriacutea posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado 2009) ya que estaacuten involucrados con las dinaacutemicas en los ecosistemas terrestres aeacutereos
y acuaacuteticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta Existen
microorganismos que degradan la materia orgaacutenica hacieacutendola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) evitando que el mundo sea un vertedero
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnoloacutegicos de la humanidad
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea Bacteria y
Eucarya en donde encontramos como primeros representantes a las bacterias las maacutes numerosas
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) muchas pueden
resultar beneacuteficas para ser utilizadas con fines biotecnoloacutegicos agriacutecolas biomeacutedicos ecoloacutegicos
y de biorremediacioacuten (Morales-Garciacutea et al 2010) Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucioacuten en la naturaleza contribuyendo a la descomposicioacuten de la materia orgaacutenica y
participando en los ciclos bioloacutegicos (Pontoacuten Moragues Geneacute Guarro amp Quindoacutes 2002)
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucioacuten de los
graves problemas de la humanidad (Gonzaacuteles de Oca Martiacutenez Riveroacuten amp Nuacutentildeez 2006) en la
agricultura alimentacioacuten salud y en la buacutesqueda de nuevas fuentes de energiacutea y la conservacioacuten
del medio ambiente Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioquiacutemicas para Atlas (citado por Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez
1998) dicha capacidad se basa ldquoen la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones oxidaciones reducciones y precipitacioneshellip y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierrardquo (paacuteg 289)
Los recursos microbioloacutegicos (microorganismos genes e informacioacuten) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologiacutea las ciencias de la vida (Ivshina amp Kuyukina 2013) el
desarrollo de medicamentos farmaceacuteuticos agentes agroquiacutemicos biocontroles cosmeacuteticos y
productos industriales (Ten Kate 1995) Ademaacutes con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el eacutexito de los primeros aislamientos de microorganismos se marcoacute la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacioacuten de toda la biodiversidad microbiana logrando la inclusioacuten de este tema en el
desarrollo de las poliacuteticas ambientales (Gonzaacuteles et al 2006)
El meacutetodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta fuera de sus
ambientes ecosistemas y nichos ha sido la creacioacuten de colecciones bioloacutegicas cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfoloacutegicos fisioloacutegicos o
geneacuteticos (Montes de Oca et al 2008) Las colecciones de cultivos microbianos variacutean en forma
funcioacuten y tamantildeo Pueden ser pequentildeas privadas mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especiacuteficos (Duratildees Sette Pagnocca amp Rodrigues 2013)
14
El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura baacutesica de
investigacioacuten en ciencias de la vida llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg Dedeurwaerdere amp Pascual 2013) de animales y plantas pero se cuentan con
caracteriacutesticas especiacuteficas para los microorganismos En primer lugar los organismos microbianos
tienen una variacioacuten geneacutetica extremadamente alta y altos iacutendices de mutacioacuten en la reproduccioacuten
en las especies por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al 2013) a su lugar de recoleccioacuten En segundo lugar las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacioacuten asegurar los recursos geneacuteticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes para proporcionar biomateriales autenticados
para materiales de investigacioacuten exploracioacuten y produccioacuten asiacute como su uso contemporaacuteneo por
parte de las entidades privadas y puacuteblicas (Stromberg et al 2013)
Los microorganismos al igual que otros seres vivos poseen una uacutenica e irremplazable
secuencia de ADN por lo que su desaparicioacuten implicariacutea la peacuterdida irreversible de un conjunto
uacutenico de informacioacuten (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) de ahiacute la gran importancia en la
creacioacuten de comiteacutes comisiones federaciones y grupos de microbiologiacutea como World Federation
for Culture Collection (WFCC) International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacioacuten
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC 2010b)
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
En las colecciones es necesario establecer meacutetodos de conservacioacuten confiables y especiales
pudiendo realizarse a corto mediano y largo plazo para asegurar la oacuteptima viabilidad
almacenamiento y pureza (WFCC 2010b) de los diferentes microorganismos Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de peacuterdida cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
miacutenimo dos meacutetodos (WFCC 2010b) de conservacioacuten que consideren el tiempo a emplear en la
preservacioacuten inicial manipulacioacuten y control perioacutedico de las cepas asiacute como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemaacuten Diacuteaz Rosa amp Aacutelvarez Molina 2005)
Se debe tener especial cuidado con geacuteneros y especies todaviacutea no conservadas en colecciones
(especies nuevas) contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
oacuteptimos (WFCC 2010a) de conservacioacuten de estos
221 Conservacioacuten a corto plazo
Comuacutenmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestioacuten seraacute utilizado en un corto
periodo de tiempo Suele utilizarse la teacutecnica de resiembra continua en este el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC
donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garciacutea et al 2010)
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten
Este concepto agrupa a las teacutecnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 antildeos (Weng et al 2005) Existen variedad de teacutecnicas como la
desecacioacuten el gel de siacutelice o perlas de vidrio el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al
2005) o la congelacioacuten La inclusioacuten de esta uacuteltima teacutecnica en este grupo es discutida por algunos
autores ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacioacuten como la criopreservacioacuten (o
15
congelacioacuten) son teacutecnicas de conservacioacuten a largo plazo (Perry 1995 Weng et al 2005) y otros
insisten su inclusioacuten en las teacutecnicas de conservacioacuten a mediano plazo (Morales-Garciacutea et al 2010)
La criopreservacioacuten consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas
Esto permite la eliminacioacuten del agua libre disponible y que en el interior de los individuos ldquosoacutelo
una proporcioacuten del total de agua se convierta en hielordquo (Perry 1995 paacuteg 23)
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 deg C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta peacuterdida de la
viabilidad del cultivo (Perry 1995) por parte del laboratorio Este meacutetodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las ceacutelulas a -80degC
(Morales-Garciacutea et al 2010) Heckly (citado por Perry 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas la viabilidad celular es casi independiente del periacuteodo de almacenamiento ademaacutes
se cree que los individuos criopreservados siguen siendo geneacuteticamente estables
Hubaacutelek (2003) menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacioacuten de microorganismos desde las caracteriacutesticas propias del individuo (cepa
especie tamantildeo y forma de celda fase de crecimiento al momento de congelar composicioacuten de las
ceacutelulas etc) asiacute como los factores antes (composicioacuten del medio de crecimiento pH temperatura
de incubacioacutenhellip) durante y posterior al proceso de criopreservacioacuten (densidad poblacional
aditivos temperatura y duracioacuten del almacenamientohellip) e incluso en su descongelacioacuten
ldquoLos aditivos crioprotectores son compuestos quiacutemicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los dantildeos durante el proceso de congelacioacutenrdquo (Gonzaacuteles et al 2006 paacuteg
16) Estos protectores se pueden clasificar seguacuten su peso molecular (bajo o alto) o seguacuten su tasa
yo capacidad de penetracioacuten los penetrantes de bajo peso molecular que desplazan el agua
intracelular evitando la formacioacuten de hielo (por ejemplo el glicerol) y los no penetrantes de alto
peso molecular que promueven la raacutepida deshidratacioacuten de la ceacutelula (por ejemplo los gluacutecidos)
(Hubaacutelek 2003)
223 Conservacioacuten a largo plazo
Este concepto agrupa a las teacutecnicas que ademaacutes de minimizar al maacuteximo el riesgo de cambio
geneacutetico en las ceacutelulas mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 antildeos o maacutes (Weng et al 2005)
La maacutes popular es la liofilizacioacuten
2231 Liofilizacioacuten
La liofilizacioacuten consiste en la eliminacioacuten del agua de una sustancia congelada por
sublimacioacuten del hielo bajo alto vaciacuteo y a presiones muy bajas (Gonzaacuteles et al 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador Si la liofilizacioacuten es exitosa se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacioacuten por varios antildeos de los microorganismos sin embargo dicho eacutexito depende de
muacuteltiples factores entre otros como los mencionados por Hubaacutelek (2003) para la criopreservacioacuten
(puesto que la liofilizacioacuten posee una etapa de congelacioacuten) asiacute mismo el tiempo de liofilizacioacuten
los paraacutemetros de liofilizacioacuten el medio aditivo o lioprotector usado tipo de liofilizador o
accesorio utilizado influyen en el producto final
16
El proceso de conservacioacuten de microorganismos por liofilizacioacuten se puede dividir en muacuteltiples
etapas desde la formulacioacuten del protector hasta el modo en que se recuperaraacuten los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1)
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacioacuten Asiacute mismo se
representa el efecto de cascada en teacuterminos de la viabilidad de las muestras
a) Formulacioacuten
Se entiende como la mezcla de ceacutelulas con cualquier solucioacuten protectora que tras la
eliminacioacuten del disolvente permita obtener un producto (liofilizado) deseado La solucioacuten
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacioacuten Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de gluacutecidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics 2015)
Las soluciones protectoras oacuteptimas contienen principalmente un soluto protector
denominado lioprotector que estabiliza las ceacutelulas cuando se elimina el disolvente (agua)
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despueacutes de la liofilizacioacuten (Figura 2) Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actuacutean como su propia matriz por ejemplo la sacarosa al
10 (Ops Diagnostics 2015)
La formulacioacuten tambieacuten comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse pudiendo variar de si se parte de un cultivo soacutelido en
agar o de un cultivo liacutequido hasta que sean cultivos soacutelidos densos (edad de 1-2 diacuteas) o
liacutequidos en fase estacionaria Cuando se parte de un medio liacutequido y si es posible las
ceacutelulas se centrifugan retirando el medio de cultivo y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucioacuten protectora (Ops Diagnostics 2015) o de lioprotector (Grauer
Grunberg amp Zardo 2015) Para cultivos desde agar suele lavarse la placatubo con 5-10
ml de medio protector posteriormente recogido con una pipeta esteacuteril (Ops Diagnostics
2015) Aunque en esto uacuteltimo se evita la centrifugacioacuten se obtiene un mayor nuacutemero de
ceacutelulas partiendo de cultivos liacutequidos (Grauer et al 2015)
17
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado
Fuente Adaptado de Jennings T A (2008) Lyophilization Introduction and Basic Principles (paacuteg 5)
New York Informa Healthcare USA Inc
b) Congelacioacuten
La congelacioacuten es la primera etapa del meacutetodo de liofilizacioacuten y uno de los maacutes
importantes para el eacutexito de este Su funcioacuten consiste en obtener una matriz en donde esteacute
separado el disolvente de los solutos Cuando se congela la formulacioacuten el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regioacuten intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings 2008) la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regioacuten intersticial a casi 0 ademaacutes proporciona una estructura
con resistencia casi nula al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings
2008)
Disminuir el flujo de agua raacutepidamente es importante para evitar asiacute la excesiva
concentracioacuten de solutos un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracioacuten de solutos evitando el estreacutes osmoacutetico y permitiendo una organizacioacuten
espacial de los componentes de la formulacioacuten en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al 2015)
La temperatura y el tiempo para una congelacioacuten completa de la formulacioacuten
dependen de la naturaleza de la misma Nireesha et al (citado por Grauer et al 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco de ahiacute que una correcta congelacioacuten reduce la
desnaturalizacioacuten teacutermica del liofilizado ldquoinmoviliza componentes de la solucioacuten y evita
la formacioacuten de espuma cuando se aplica el vaciacuteordquo (Adams 2007)
c) Secado primario
Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacioacuten ademaacutes es la de maacutes larga
duracioacuten En este etapa la presioacuten se reduce y la temperatura de la formulacioacuten congelada
es elevada dando lugar a la sublimacioacuten (Figura 3) y migracioacuten de vapor de agua (Grauer
et al 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador Sin embrago dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
euteacutectica de colapso de transicioacuten viacutetrea (Tg) para minimizar el dantildeo de la muestra
(Adams 2007)
18
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua Se indican los requerimientos de presioacuten
y temperatura que hacen posible la sublimacioacuten del agua durante la liofilizacioacuten
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
El tiempo para el secado primario depende de muacuteltiples factores como la
composicioacuten de la solucioacuten protectora la porosidad del congelado la calidad o resistencia
de la matriz la cantidad de muestras asiacute como tambieacuten el volumen de la formulacioacuten entre
otros Respecto al volumen ldquopara las bacterias las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 025 a 05 mlrdquo (Ops Diagnostics 2015) Aunque no existe un
volumen establecido hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de maacutes
tiempo
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) un periacuteodo de secado primario de un diacutea es suficiente
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras teniendo
como guiacutea un tiempo de liofilizacioacuten de una noche
La etapa de secado primario finaliza ldquocuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacioacuten y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congeladardquo (Jennings 2008 paacuteg 6)
d) Secado secundario
Es la tercera y uacuteltima etapa de la liofilizacioacuten Al terminar el secado primario se ha
eliminado el agua moacutevil de la muestra Sin embargo existe agua atrapada dentro del soacutelido
amorfo que es maacutes difiacutecil de eliminar (Fetterolf 2010) La cantidad de agua es discutible
ya que fluctuacutea en funcioacuten de la temperatura y las caracteriacutesticas propias de los
19
constituyentes de la formulacioacuten por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10 ww del producto seco (Jennings 2008) o del 2-4 (Ops Diagnostics 2015)
La reduccioacuten del contenido de humedad en la torta se logra por desorcioacuten (Adams
2007) sin reducir el volumen de la misma (Jennings 2008) Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presioacuten parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario durante el secado secundario
(Ops Diagnostics 2015) Es importante que la temperatura no se incremente velozmente y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicioacuten viacutetrea la cual aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf 2010)
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) esta etapa es relativamente corta con una duracioacuten de
1 a 2 horas aunque Grauer et al (2015) indica que representa entre el 30-40 del tiempo
total del proceso asiacute mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo
con una duracioacuten de hasta varios diacuteas Esto resulta importante puesto que ldquola cantidad de
agua residente luego del secado afecta la tasa de peacuterdida de viabilidad durante el
almacenamientordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 16)
Finalmente al ser removida la humedad residual la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al 2015) obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2) o pastel esponjoso con poca (inferior al 1) o nula humedad
residual (Fetterolf 2010)
Las tres etapas del proceso de liofilizacioacuten en funcioacuten de la temperatura y la presioacuten
y en contraste con el diagrama de fases del agua pueden ser observadas en la Figura 4
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten De 1-3 Congelamiento (1-2 presioacuten
atmosfeacuterica) de 3-4 secado primario de 4-5 Secado secundario
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
20
e) Sellado y almacenamiento
Terminado el proceso de secado secundario se deben sellar los viales al vaciacuteo (de ser
posible) o de forma hermeacutetica tan pronto como sea posible debido a que la torta actuaraacute
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf 2010) aunque
tambieacuten es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams 2007) e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de siacutelice
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Sin embrago aunque
se logre un correcto sellado al vaciacuteo no se puede asegurar una larga vida uacutetil en condiciones
ambientales ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al 2015)
por ello lo mejor es almacenar los liofilizados a 4deg C en la oscuridad (Ops Diagnostics
2015) reduciendo las posibilidades de peacuterdidas aunque haya quedado agua despueacutes del
secado
f) Reactivacioacuten o rehidratacioacuten
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacioacuten original esto
implica la adicioacuten de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings 2008
Grauer et al 2015) La dilucioacuten raacutepida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings 2008) da cuenta de un correcto proceso de liofilizacioacuten
ldquoTiempos de reconstitucioacuten excesivamente largos la peacuterdida de potencia o la formacioacuten
de una solucioacuten turbia son indicios de un proceso de liofilizacioacuten inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacioacutenrdquo (Jennings 2008 paacuteg 11)
La recuperacioacuten de las ceacutelulas sin embrago tambieacuten se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacioacuten) el tipo
de diluyente su temperatura su pH la osmolaridad (Grauer et al 2015) la potencia del
lioprotector (Jennings 2008) entre otras propiedades de la solucioacuten resultante
Grauer et al 2015 sugieren la utilizacioacuten de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacioacuten de los microorganismos con el fin de evitar el estreacutes
osmoacutetico que pueden causar las soluciones diluidas sin embargo algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacioacuten especiacuteficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato
Ops Diagnostics (2015) indican que una tasa de supervivencia superior al 50 se
considera aceptable por muchos laboratorios
2232 Control de calidad de un producto liofilizado
Las propiedades fiacutesicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayoriacutea un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacioacuten entre los
paraacutemetros de la formulacioacuten y el proceso de liofilizacioacuten por ello permiten el seguimiento y la
deteccioacuten de falencias (Jennings 2008)
21
Esta evaluacioacuten permite caracterizar las diferentes propiedades fiacutesicas quiacutemicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre dichas propiedades Jennings (2008) y Ticoacute
G (1987) recogen algunos de las toacutepicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado por ejemplo las propiedades generales fiacutesicas de la torta (color volumen temperatura
de transicioacuten textura porosidad densidad contraccioacuten o colapso estado del vial entre otras que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacioacuten) su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfeacuterica) la velocidad de redisolucioacuten o
reconstitucioacuten la estabilidad (de la torta el microorganismo o el lioprotector evaluada de forma
natural o acelerada) nivel de humedad residual posibles contaminantes entre otras
2233 Equipamiento para liofilizar
Como ya se mencionoacute inicialmente el proceso de liofilizacioacuten requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5) este equipo consta esencialmente de tres partes
a) Un sistema o bomba de vaciacuteo que reduce la presioacuten del ambiente de la caacutemara que contiene
el material a secar Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dantildeen ldquoEl nivel
de vaciacuteo requerido debe ser entre 50 y 100 μbarrdquo (Grauer et al 2015 paacuteg 9) aunque 200
μbar son aceptables
b) Un condensador con circuito de refrigeracioacuten que comunica con la caacutemara de secado y
condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacioacuten sobre una superficie enfriada
inferior a los -40degC
c) Caacutemara o accesorio de secado que es donde se coloca el material a secar Seguacuten Nireesha
et al (2013) puede ser de tres tipos
- Manifold o colector muacuteltiple
- Rotary
- Tray style de bandejas con o sin estante de taponado eacuteste uacuteltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaciacuteo de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes En la imagen el liofilizador usa una
caacutemara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial
Tomado de httpslideplayercombrslide84760 el 15 de Agosto de 2015
22
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad y liofilizacioacuten de las mismas evaluaacutendolas frente a tres compuestos protectores
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas utilizando teacutecnicas de recuento
en placa estaacutendar
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacioacuten de cepas microbianas
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten
Disentildear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacioacuten a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados
23
4 METODOLOGIacuteA
La metodologiacutea general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases como es ilustrado en la
Figura 6
Figura 6 Metodologiacutea Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia loacutegica de eventos
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra
41 FASE INICIAL
411 Acervo Microbiano
De la coleccioacuten de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Geneacutetico del laboratorio de
microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracioacuten de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologiacutea estas corresponden a CR004 CR005 (sustituida posteriormente
por CR009) CR006 CR007 y CR010 seguacuten los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodriacuteguez (2013) Todas estaban conservadas por el meacutetodo de criopreservacioacuten (o
criocongelacioacuten) a una temperatura de -85 degC plusmn 1degC
412 Eleccioacuten de los protectores
4121 Crioprotectores
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99999) (Mallinckrodt Meacutexico) en
proporcioacuten 67 vv seguacuten lo establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
4122 Lioprotectores
Para la eleccioacuten de los agentes protectores y sus concentraciones en pv (Tabla 1) se
tuvieron en cuenta diferentes estudios en contraposicioacuten a Hensel (1994) se tomaron
concentraciones superiores al 9 de Glucosa (Merck Darmstadt) de forma aleatoria En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed amp
Roos (2004) y Palmfeldt Radstroumlm amp Hahn-Haumlgerdal (2003) Para la leche descremada
(Proleche Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al (2003) Dichos estudios
fueron tomados como referencia teoacuterica aunque los microorganismos en ellos especificados no
correspondan con los del presente trabajo
Criterios de eleccioacuten de los
microorganismos asiacute como de
los lioprotectores a evaluar
Evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten (criopreservacioacuten
y liofilizacioacuten)
Ajustes a la liofilizacioacuten
para la generacioacuten de
protocolos
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
24
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracioacuten
pv
10 4 10
117 10 15
27 15 20
42 FASE INTERMEDIA 1
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
En este trabajo se evaluaron dos meacutetodos de conservacioacuten (criopreservacioacuten y liofilizacioacuten)
dicha evaluacioacuten se realizoacute en teacuterminos de tres (3) indicadores valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al meacutetodo en siacute
4211 Viabilidad
Para evaluar este indicador se utilizoacute
a) Conteo directo con caacutemara de Neubauer 110mm (Boeco) siguiendo la metodologiacutea
planteada por Valencia Z (2004) Sin embargo para obtener el nuacutemero de bacterias se
utilizoacute la ecuacioacuten planteada por Bastidas (2015)
No de bacteriasml=
Fd Factor de dilucioacuten =
El conteo directo con caacutemara de Neubauer solo se realizoacute previamente al meacutetodo de conservacioacuten
evaluado
b) Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa seguacuten lo
descrito por Valencia Z (2004) y Camacho et al (2009) Para el caacutelculo de UFCml se
utilizoacute la siguiente foacutermula
UFCml = Ndeg de colonias times times
Los caacutelculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologiacutea planteada por
Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales se utilizoacute los planteamientos del Instituto
de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacioacuten y solo pos a la criopreservacioacuten en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid
England)
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten
fue calculado a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010)
Tasa de supervivencia (BSR ) = DD Despueacutes de la desecacioacuten
AD Antes de la desecacioacuten
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000
Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucioacuten
1
ml de muestra
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100
Log (Ndeg UFCml AD)
25
4212 Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realizoacute
a) Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) Se elaboroacute un formato (anexo 1) con las
caracteriacutesticas macroscoacutepicas descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz
(2009) para las colonias desarrolladas en superficie a partir del procedimiento de ldquoconteo
de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Se utilizoacute un
contador de colonias CC-1 (Boeco)
- Se seleccionoacute solo una de dos placas de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de
UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron observadas en al menos el 80 de las colonias
de la placa seleccionada
b) Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se
realizoacute una ldquocoloracioacuten de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005
paacuteg 24)
Se compararon con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y macroscoacutepicas descritas por
Rodriacuteguez (2013) y la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se tomoacute
registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio (Zeiss)
con caacutemara Canon G9
4213 Pureza
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en
cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante
teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
422 Recuperacioacuten de los microorganismos
Para la recuperacioacuten de los microorganismos se tomoacute un criovial de cada cepa bacteriana
sometido a una temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua
destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente cinco (5) minutos (Martiacutenez amp Mayorga
2013) Los crioviales se introdujeron en bantildeo seroloacutegico una vez se llegoacute a la temperatura deseada
no antes
De cada criovial se tomoacute un (1) ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (asymp2240rpm) por diez (10) segundos diluyeacutendolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
Se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten a cada criovial (Thomas
Scientific 5150636) por cepa luego de preparado el tubo T01 antes de la incubacioacuten Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martiacutenez amp Mayorga
(2013) y Rodriacuteguez (2013)
26
423 Criopreservacioacuten
4231 Precriopreservacioacuten
Pasado el tiempo de incubacioacuten se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten al tubo T01 con el fin de determinar el nuacutemero de ceacutelulas totales y viables de la
muestra El conteo en Caacutemara de Neubauer se realizoacute solo hasta el final de los procedimientos de
preservacioacuten por lo cual una vez preparadas las diluciones estas fueron llevadas a nevera a 4degC plusmn
1degC para evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Se siguioacute el protocolo de criopreservacioacuten establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas con
algunas variaciones
Con pipeta esteacuteril de 5ml se depositaron en cinco (5) crioviales 12ml de glicerol anhidro
esteacuteril
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02)
Posteriormente se tomaron aliacutecuotas desde T02 de 600microl previo Voacutertex nivel 7 por 15s
depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl Se rotularon y se
realizoacute Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten
Inmediatamente despueacutes de la homogenizacioacuten fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick) a una temperatura de -85degC plusmn 1degC en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestioacuten
Este procedimiento se realizoacute en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar veinte (20) minutos (Martiacutenez amp
Mayorga 2013) desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar
la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
424 Liofilizacioacuten Etapa 1
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Se partioacute del tubo T01 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de
liofilizacioacuten Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel
7 (asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml agua destilada esteacuteril (T03)
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
Partiendo del tubo T03 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se
extrajeron aliacutecuotas de cien (100) microl veintisiete (27) veces depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar En cada criovial se adicionaron novecientos (900) microl de lioprotector en tres
crioviales por cada concentracioacuten de lioprotector de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2)
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior del criovial fuera lo maacutes
exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T03 se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacioacuten
27
Donde el volumen inicial y la concentracioacuten inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado en tanto que el volumen final y la concentracioacuten final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T03
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (aliacutecuota maacutes protector) se
agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacioacuten
Posteriormente a los crioviales se les retiraron las tapas plaacutesticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney PM-996) esterilizado realizando seis (6) perforaciones conceacutentricas en la superficie
con aguja hipodeacutermica 21G x 1frac12rdquo Los crioviales fueron congelados en nitroacutegeno liacutequido por
15min aproximadamente depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD Thermo
Scientific) de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45degC usando el colector muacuteltiple (manifold)
Terminado el proceso se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la caacutemara
de flujo laminar para evitar contaminacioacuten de las muestras alliacute se les retiroacute el Parafilm se les tapoacute
con tapas esteacuteriles y se les rotuloacute
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten
Lioprotector Concentracioacuten
(pv)
Serie
A B C
Glucosa
10 1 1 1
117 1 1 1
27 1 1 1
Sacarosa
4 1 1 1
10 1 1 1
15 1 1 1
Leche
descremada
10 1 1 1
15 1 1 1
20 1 1 1
Total crioviales seguacuten Ndeg 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje)
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten utilizando una etiqueta o
roacutetulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacioacuten
Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de datos el
Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten
bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo)
nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3) con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo
bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas
tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada vial
Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional
a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
Posterior al proceso de rotulado los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano a temperatura ambiente y protegido de la luz
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS
CC en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado riesgo
poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entrantildear un riesgo grave para el personal de
laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado
riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro Existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o
indirectamente Normalmente no existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005)
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio
(paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications
biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
29
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2
Se realizoacute una prueba de estabilidad natural en teacuterminos del aspecto fiacutesico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un periacuteodo prolongado de tiempo (Grauer et al 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente Por ello la rehidratacioacuten de los crioviales se realizoacute en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4)
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales
Primera rehidratacioacuten Segunda rehidratacioacuten Tercera rehidratacioacuten
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota Intervalos de tiempo medidos en diacuteas contados desde el diacutea de almacenaje en los cuales se rehidratoacute
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie ver Tabla 2) El aspecto fiacutesico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacioacuten y comparado con su estado antes del almacenaje
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC tomando
el tiempo de reconstitucioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel
2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten El indicador de viabilidad se evaluoacute solo con el meacutetodo de conteo de
microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la maacutes alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa se eligioacute el
lioprotector y la concentracioacuten de eacuteste que permitioacute obtener un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables
posliofilizacioacuten y que ofrecioacute ademaacutes una menor variacioacuten durante la prueba para la liofilizacioacuten
definitiva de las cepas en estudio Dicho lioprotector se establecioacute ademaacutes como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados del Banco
Geneacutetico del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
43 FASE INTERMEDIA 2
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores con el aacutenimo de
generar un protocolo funcional aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partioacute de cultivos puros sobre medios soacutelidos se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacioacuten liofilizacioacuten y posliofilizacioacuten para la
liofilizacioacuten definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados
431 Liofilizacioacuten definitiva
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracioacuten oacuteptima para cada cepa
de estudio se realizoacute la liofilizacioacuten definitiva
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general Posteriormente se agitoacute con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Esto se realizoacute para cada
cepa
30
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
El tubo T04 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten
definitiva se extrajeron cuatro (4) aliacutecuotas de un (1) ml previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass 62113D-2)
posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por
7s para su homogenizacioacuten
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas a una presioacuten
inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
El proceso de destape parcial y congelacioacuten se realizoacute en caacutemara de flujo laminar para evitar
al maacuteximo la contaminacioacuten El transporte de los viales desde la caacutemara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitroacutegeno liacutequido
para evitar contaminacioacuten y descongelacioacuten
4313 Posliofilizacioacuten
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten Dos viales
designados como trabajo (T) y stock (S) fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4degC plusmn 1degC
4314 Rehidratacioacuten
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacioacuten de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio soacutelido
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos
Se llevoacute un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el aacutenimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacioacuten Al identificarlas se decidioacute repetir la
liofilizacioacuten definitiva con los nuevos paraacutemetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio
4321 Propiedades fiacutesicas generales
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento) color textura brillo aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales teniendo como punto de comparacioacuten la formulacioacuten
luego de congelada Esto se realizoacute para
- Crioviales de la fase intermedia 1
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 431)
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 433)
4322 Contaminacioacuten
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad en
buacutesqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio
31
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten
Se midioacute el tiempo de reconstitucioacuten de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y el tiempo de los crioviales que conteniacutean el lioprotector general fue comparado
con el tiempo de reconstitucioacuten de los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada
433 Pruebas adicionales
Para estas pruebas solo se usoacute la formulacioacuten del lioprotector general y la cepa CM-CR010
por su alta tasa de crecimiento respecto a las demaacutes cepas evaluadas
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticoacute G 1987) se
tomaron los pesos con balanza analiacutetica (AND GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos El cuarto vial y criovial se abrieron solo una vez luego
fueron sellados completamente tomando sus pesos de la misma forma ya descrita
Para determinar si existe un tiempo maacuteximo admisible de cerrado se midioacute el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcioacuten del tiempo utilizando la ecuacioacuten
descrita por Garciacutea C (2007)
Wt () es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4332 Prueba de estabilidad acelerada
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa uno fue rehidratado a los cero (0) diacuteas y el otro
luego de siete (7) diacuteas en el interior de la caacutemara de envejecimiento ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5 Adicionalmente se dataron sus propiedades fiacutesicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada
Ndeg vial t ndash Tdeg - HR
1 0 - ambiente - 25
2 7 - 37degC - 100
Nota Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos t= Tiempo en diacuteas
Tdeg=Temperatura HR=Humedad relativa La prueba de estabilidad se realizoacute en una caacutemara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC luego
incubados a 25 degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente
se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten midiendo viabilidad con el meacutetodo
de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
32
434 Control de esterilidad
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121degC y 210Kpa por 20 minutos las puntas de micropipetas los viales
crioviales y sus respectivas tapas fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y
temperatura en un tiempo de 15 minutos Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas) fueron esterilizados en horno Binder a 160degC por 120 minutos
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo desde la
preparacioacuten de medios hasta el sellado de los viales como se describe a continuacioacuten
4341 Medios
Se realizoacute control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid England) (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Se determinoacute como indicador de contaminacioacuten
cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios
soacutelidos
4342 Ambiente
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realizoacute con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas El periodo de exposicioacuten fue de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en
incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo
b) Cabina de flujo laminar
Se realizoacute el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este
caso la caja de control de ambiente se dejoacute abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeriacutean el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4
horas Este control se llevoacute a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolloacute en el interior de la cabina de flujo laminar
se procuroacute mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y
tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70 al iniciar el trabajo con cada cepa
44 FASE FINAL
441 Base de datos
Se realizoacute una revisioacuten a la base de datos del Banco de cepas creado por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) en el programa Access modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccioacuten para la informacioacuten de los organismos liofilizados
33
442 Fichas de resumen
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccioacuten tanto del Freezer
como del banco de liofilizados utilizando el programa Word 2013
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se realizoacute una revisioacuten de la informacioacuten en los roacutetulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos con el aacutenimo de verificar si se habiacutean cumplido los protocolos y la
logiacutestica establecida por Martiacutenez amp Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias
444 Formatos de control del banco de liofilizados
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013 para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) en la seccioacuten
de criopreservacioacuten
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados
Coacutedigo Tipo de registro Ubicacioacuten Uso
FLf-01 Registro de entrada de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccioacuten
FLf-02 Proceso de
liofilizacioacuten
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacioacuten a
una cepa
FLf-03 Registro de control de
calidad
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccioacuten y antes de liofilizar
una cepa para la coleccioacuten
FLf-04 Solicitud salida de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados
Fuente Adaptado de Martiacutenez Beniacutetez H L amp Mayorga Burgos L P (2013) Implementacioacuten de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (Tesis de
pregrado) (paacuteg 44) Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas Bogotaacute Colombia
445 Manual de procedimientos
Se realizoacute una revisioacuten de la cartilla de procedimientos elaborada por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) Se tomoacute la decisioacuten de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013
34
5 RESULTADOS
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN
A raiacutez de la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en cada criovial por cepa
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno En cuanto a CM-CR005 se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer pero no fue posible recuperarla por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009 la sexta mejor respecto al criterio de eleccioacuten de cepas
Con los datos del proceso precriopreservacioacuten de las cepas de intereacutes correspondientes a la
coleccioacuten de colorantes consignados en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) en conjunto con
los datos de viables poscongelacioacuten del presente trabajo se calculoacute la BSR para cada cepa (Tabla
7) Se encontroacute que los porcentajes de BSR son superiores al 70 luego de dos (2) antildeos de estar
en criopreservacioacuten (Figura 8) salvo CM-CR005
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martiacutenez amp Mayorga (2013) (soacutelo se compararon los datos de la cepa CM-CR010 ya que las demaacutes
cepas no figuran en su trabajo) se encontroacute un porcentaje inferior de recuperacioacuten
poscriopreservacioacuten por parte de las autoras por lo cual se revisoacute la metodologiacutea encontrando un
error metodoloacutegico al calcular la BSR en su trabajo Usando los datos de ldquoresultados prueba de
viabilidad poscongelacioacuten tabla 19rdquo (en Martiacutenez amp Mayorga 2013 paacuteg 54) se corrigioacute la BSR
para esta cepa evidenciando ser la cepa maacutes resistente al proceso de criopreservacioacuten entre las
evaluadas con alrededor de 66 de caiacuteda luego de dos antildeos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8)
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten)
Nota Se muestran los resultados al evaluar la conservacioacuten de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por
el meacutetodo de criopreservacioacuten luego de dos (2) antildeos La BSR que Martiacutenez amp Mayorga (2013) presentan
corresponde a un valor poscriopreservacioacuten luego de dos meses de evaluacioacuten Nrd= No registra datos
Cepa Ceacutelulas
totales
Viables precongelacioacuten
(UFCml) de Martiacutenez
amp Mayorga (2013)
viables pos
congelacioacuten
(UFCml)
BSR
real
BSR de Martiacutenez
amp Mayorga
(2013)
BSR
corregido
CM-CR004 12x1012 61 x109 13 x107 725 Nrd Nrd
CM-CR005 11 x1010 11 x1010 0 00 Nrd Nrd
CM-CR006 14x1010 75 x109 27 x107 752 Nrd Nrd
CM-CR007 13x1011 41 x109 31 x108 883 Nrd Nrd
CM-CR009 19 x1010 44 x109 23 x107 763 Nrd Nrd
CM-CR010 17 x1010 46 x109 72 x108 916 673 982
35
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelacioacuten CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperacioacuten (nuacutemero de
ceacutelulas viables)
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO
En las Tablas 8 9 10 11 y 12 se describen las principales caracteriacutesticas macroscoacutepicas
utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfoloacutegica de las cepas utilizadas No fue
posible realizar la comparacioacuten con los datos de Rodriacuteguez (2013) a nivel macroscoacutepico dado que
los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquiacute utilizados sin embargo si se
compararon las caracteriacutesticas microscoacutepicas las cuales fueron coincidentes aunque estas no eran
del todo claras (descripcioacuten inexacta de forma y tamantildeo y sin un registro fotograacutefico comparable)
por lo cual se decidioacute que las caracteriacutesticas macroscoacutepicas observadas desde la primera siembra
posterior a la descongelacioacuten de los crioviales fuesen las de mayor importancia para evaluar la
estabilidad morfoloacutegica y la pureza Estas se mantuvieron sin cambio o variacioacuten a lo largo del
trabajo
Las microfotografiacuteas tomadas a cada cepa usando la coloracioacuten de Gram al igual que las
fotografiacuteas de las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron anexadas a la base de datos del Banco
Geneacutetico
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 725 00 752 883 763 916
Sup
ervi
ven
cia
36
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR004
Descripcioacuten
Borde o Margen
Ondulado Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de
crecimiento
Frente a luz Brillante
Elevacioacuten Umbonada
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Color Beige maacutes intenso en el centro y maacutes clara hacia los extremos en
colonias de 48h o maacutes extremos color blanco hueso
Forma Circular a maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo desarrollar forma
irregular
Grado de
Transparencia Opaca (No transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Ropa huacutemeda
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR006
Descripcioacuten
Borde o Margen Semiondulado A maacutes de 72h es altamente digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas y con medio huacutemedo se irregulariza
Luego de una semana totalmente digitado
Elevacioacuten Plana con bordes elevados (en craacuteter) Colonias de maacutes de 72h
presentan una ligera elevacioacuten en el centro
Color Amarillo
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Escamosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca (NO transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis Si color amarillo
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
37
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR007
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio muy huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular A maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo es irregular
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 48h y distantes unas de otras (pocas
colonias) umbonadas
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Semitransparente en zona externa
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Mentol
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR009
Descripcioacuten
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas se irregulariza
Elevacioacuten En meseta y ligero hundimiento central (craacuteter) En colonias con maacutes
de 72h ligera elevacioacuten del craacuteter
Color Beige Conforme envejece la colonia toma una coloracioacuten blancuzca
de tonalidad cafeacute en el centro
Tamantildeo Pequentildea (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
38
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR010
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio huacutemedo es suavemente ondulado en medio muy
huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular Despueacutes de 48h se irregulariza En medio muy huacutemedo es
estrellado (sin importar edad de la colonia)
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 72h centro marcado y ligeramente
elevado (forma de huevo frito)
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia
Opaca Semitransparente en la zona externa de colonias de maacutes de
48h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Sin olor
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general
Las Figuras 9 10 11 12 y 13 representan los resultados de la evaluacioacuten de la eficacia del
meacutetodo de conservacioacuten realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1 por medio
del indicador de viabilidad
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 6 x108 Se observa que
la leche descremada 15 como mejor protector y leche descremada 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A - - - 5987 - 5301 5958 6812 -
BSR en serie B - - - 3619 3076 4557 5100 5039 3619
BSR en serie C 3076 3619 - 3619 3076 3418 3418 5873 4723
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR004
39
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 73 x108 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 125 x1010 Se observa
a sacarosa 10 como mejor protector y a glucosa 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 4173 4962 5850 6119 6415 5731 5430 4173 4513
BSR en serie B 3046 - - 4173 4743 5051 4773 - -
BSR en serie C - - - 3046 5147 4622 - - -
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR006
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 9149 8664 6549 9712 9677 8735 9026 9166 8648
BSR en serie B 8472 - 6181 - 8474 - 8413 8052 8086
BSR en serie C 8557 7472 6193 - 9272 - 8604 8202 8414
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR007
40
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 115 x109 Se observa
a Sacarosa 15 como mejor protector y la leche descremada 10 como segundo mejor protector
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 65 x109 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 5494 4609 4609 6641 6401 6987 5585 5440 5186
BSR en serie B 4415 - - 6373 6083 6212 4941 4083 -
BSR en serie C - - - - - 7519 4083 - 4083
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR009
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 8205 - 6303 9521 8634 8207 8153 8022 8332
BSR en serie B 6424 - - 7911 8312 8096 7752 6907 7995
BSR en serie C 6697 - - - 8230 7998 7919 8113 7539
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Sup
erviv
enci
a
BSR en CM-CR010
41
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15
CM-CR006 Sacarosa 10
CM-CR007 Sacarosa 10
CM-CR009 Sacarosa 15
CM-CR010 Sacarosa 10
Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural
ofreciera la maacutes alta BSR en la mayoriacutea de cepas (Tabla 13) se determinoacute la sacarosa al 10
como el mejor lioprotector y se designoacute como lioprotector general para las bacterias del banco de
liofilizados Sin embargo se decidioacute para la liofilizacioacuten definitiva utilizar el lioprotector que
mejores resultados confirioacute a cada una de las cinco cepas de estudio
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado
Dado que el principal indicador de evaluacioacuten de la prueba de estabilidad natural en esta
etapa era la viabilidad en cada liofilizado no se tuvo en cuenta los cambios morfoloacutegicos
presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa pero si fueron tenidos en cuenta
para los ajustes teacutecnicos de la liofilizacioacuten en la fase 3
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilizacioacuten definitiva
con su homoacutelogo de la etapa 2 (es decir los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo) se encontraron diferencias significativas de aumento o disminucioacuten de hasta el 22
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad seguacuten el punto de partida de la formulacioacuten
(medio liquido SMPG vs medio soacutelido SPC) como lo muestra la Figura 14
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilizacioacuten
definitiva por cepa bacteriana Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas seguacuten el intervalo
temporal de la Serie A en tanto que CM-CR007 CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron seguacuten la Serie
B (ver Tabla 4)
- 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Punto
s p
orc
entu
ales
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
L Etapa 2 6812 6415 8474 6212 8312
L definitiva 7330 7629 7757 8461 7234
BSR comparativa
42
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN
551 Propiedades fiacutesicas generales
Se dataron las propiedades fiacutesicas de los liofilizados en la fase intermedia 1 asiacute como los
liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 431 (liofilizacioacuten definitiva) y 4332 (viales
usados para la prueba de estabilidad acelerada) en las Tablas 15 y 16 respectivamente la tabla de
convenciones (Tabla 14) permite comprender los siacutembolos de las anteriores tablas
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilizacioacuten y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilizacioacuten
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transicioacuten conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto fiacutesicamente aceptable Sin embargo pese a que a las propiedades fiacutesicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1 con los cuales se realizoacute la evaluacioacuten de la liofilizacioacuten
y la prueba de estabilidad natural no eran los maacutes adecuados se decidioacute proseguir con ellos
apoyado por los resultados de Vemulapalli Bhonsle amp Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratacioacuten (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperacioacuten de microorganismos ademaacutes el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores
Tabla 14 Tabla de convenciones Siacutembolo Significado Siacutembolo Significado
SBE Si en buen estado A Algunos
SME Si en mal estado T Todos
NBE No en buen estado N Ninguno
NME No en mal estado NS No significativo (lt20)
+ Afirmativo S Significativo (201-309)
- Negativo MS Muy significativo (gt40)
NA No aplica I indeterminado
FS Al finalizar el secado AR Antes de reconstituir
Nota Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15 Aunque no tenga estructura de torta el liofilizado
es estable y funcional por ende utilizable No tiene estructura de torta y ademaacutes no es ni estable ni
funcional por ende no es utilizable
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1
Cepa Viales Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto de
torta
Fractura de
vial 1 2 3
CM
-CR
00
4
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I S Traslucido I + NBEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N S Cafeacute claro Porosa - SMEA -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR NS N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
43
CM
-CR
00
6
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR S S MS Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N NS NS Cafeacute claro Porosa - SBEA -
sm2sc AR S S S Cafeacute oscuro Porosa - SMET -
CM
-CR
00
7
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
s1 NA I I I Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR S I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS I S Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
CM
-CR
00
9
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I NS Traslucido I + NBE -
g2sc AR MS S S Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS S I Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sb AR N N NS Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sc AR N S NS Cafeacute oscuro Porosa - NMEA -
CM
-CR
01
0
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I S S Traslucido I + NMEA -
g2sc AR I MS MS Traslucido I + NMEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
44
Nota Datos de las propiedades fiacutesicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad
natural salvo por el encogimiento que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa) los
demaacutes caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual Se subrayan las
anomaliacuteas encontradas a lo largo de la prueba
g Liofilizados con glucosa como protector
s Liofilizados con sacarosa como protector
sm Liofilizados con leche descremada como protector 1 Formulacioacuten congelada 2 Liofilizados almacenados a temperatura ambiente sa Serie A (antes de rehidratar) sb Serie B (antes de rehidratar) sc Serie C (antes de rehidratar)
1 Concentracioacuten uno del lioprotector
2 Concentracioacuten dos del lioprotector
3 Concentracioacuten tres del lioprotector
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la prueba de
estabilidad acelerada
Nota Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquiacute mencionados corresponden solo a aquellos
que contienen sacarosa al 10 (lioprotector general) Se consignan aquiacute los datos generales de los
liofilizados indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas
a Liofilizados de la prueba de estabilidad natural
b Liofilizados de la liofilizacioacuten definitiva
c Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada 1 Formulacioacuten congelada 2 Viales almacenados a temperatura ambiente 3 Vial usado en la caacutemara de envejecimiento
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto
de torta
Fractura
de vial Viales
a1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
a2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
b1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
b2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
c1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
c2 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR NS Blanco Porosa - SBE -
c3 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR S Blanco Porosa - SME -
45
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes De izquierda a derecha
liofilizados de prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva prueba de estabilidad acelerada
552 Contaminacioacuten
Se encontroacute contaminacioacuten durante la rehidratacioacuten de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006 en tanto que las siembras preliofilizacioacuten no presentaban contaminacioacuten alguna por ello
se tomaron tres viales maacutes que iban a ser rehidratados en la serie B encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilizacioacuten de esta cepa
Las demaacutes cepas no presentaron contaminacioacuten en ninguna prueba realizada
553 Tiempo de redisolucioacuten
Al medir el tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten en cada una de las rehidrataciones se
observoacute que la glucosa tardoacute maacutes tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros
lioprotectores llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Voacutertex en los viales
maacutes concentrados para su total redisolucioacuten Ademaacutes se encontroacute en todos los lioprotectores que
conforme la concentracioacuten aumentaba maacutes tiempo se necesitaba para la reconstitucioacuten de la
formulacioacuten es decir que el tiempo es directamente proporcional a la concentracioacuten de
lioprotector
Al comparar el tiempo de reconstitucioacuten de los viales que conteniacutean el lioprotector general
en la prueba de estabilidad natural con los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales de la
prueba de estabilidad acelerada no se encontraron diferencias significativas sin embargo el vial
de la prueba de estabilidad acelerada que duroacute siete (7) diacuteas en caacutemara de envejecimiento se
reconstituyoacute un segundo menos aproximadamente respecto a los otros viales
46
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado
Lioprotector Tiempo (min)
Glucosa 10 1
Glucosa 117 15
Glucosa 27 120
Sacarosa 4 05
Sacarosa 10 05
Sacarosa 15 06
Leche descremada 10 025
Leche descremada 15 033
Leche descremada 20 05
Estabilidad natural 05
Liofilizacioacuten definitiva 025
Estabilidad acelerada 004
Nota El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada
uno liofilizados con el lioprotector general
56 PRUEBAS ADICIONALES
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica
En la Figura 16 se observa un aumento draacutestico del peso de los viales dentro de la ventana
de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados
al vaciacuteo) Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vaciacuteo) no tuvieron un aumento en
peso tan draacutestico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante Al cabo de cincuenta
(50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente No se encontroacute
por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vaciacuteo
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector La ecuacioacuten presentada pertenece a la liacutenea de tendencia logariacutetmica
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinacioacuten Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba
0 10 20 30 40 50 60
vial (518055g) 0 00724 00772 00782 00840 00869 00849
Criovial (19018g) 0 00079 00158 00315 00473 00578 00605
Promedio 0 00401 00465 00549 00656 00724 00727
y = 00365ln(x) + 00058
Rsup2 = 09647
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
01
AU
MEN
TO D
E P
ESO
(W
)
47
562 Prueba de estabilidad acelerada
Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFCml antes de la liofilizacioacuten al
rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 8398 sin embargo al rehidratar el vial 2 luego de su
estadiacutea en la caacutemara de envejecimiento la BSR fue de 0 Las propiedades fiacutesicas generales de
estos viales son presentadas en la Tabla 15
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN
571 Base de datos
Se eliminoacute una tabla sobrante (constituiacutea informacioacuten redundante de las cepas) dentro de la
base de datos correspondiente a la seccioacuten de criopreservacioacuten Adicionalmente se reorganizoacute la
base de datos al introducir la seccioacuten de liofilizacioacuten y la de refrigeracioacuten Este uacuteltimo meacutetodo de
preservacioacuten fue mencionado en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) pero no fue anexado
sin embargo aunque se incluyoacute la seccioacuten en el banco de cepas debe mencionarse que no existen
registros de las cepas que se hallan conservado por este meacutetodo aun asiacute se decidioacute dejar la seccioacuten
para que lo ocupen trabajos posteriores Ademaacutes se encontroacute que en el Freezer existiacutean colecciones
que no figuran en la base de datos no existen registros de ninguacuten tipo ni caracterizacioacuten alguna en
medios digitales La base de datos quedoacute organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5
Figura 17 Organigrama de la base de datos
572 Fichas de resumen
Las fichas de acceso inmediato designadas como ldquofichas de resumenrdquo para cada coleccioacuten
fueron ubicadas seguacuten el sitio de almacenamiento tanto para las cepas criopreservadas como para
las liofilizadas y refrigeradas Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas las fichas
resumen de este meacutetodo fueron dejadas en blanco para futuras colecciones El formato de las fichas
resumen se presenta en el anexo 6
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se encontroacute que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulacioacuten que
permite la faacutecil confusioacuten entre colecciones criopreservadas sin embargo se decidioacute dejar las
etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martiacutenez amp Mayorga (2013) entre
otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener
que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondriacutea una confusioacuten entre nuevas
y viejas colecciones Este problema fue solucionado con la reorganizacioacuten de la base de datos y las
fichas de resumen
Base de datos del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Informacioacuten de los
microorganismos de
cada coleccioacuten
Meacutetodo de conservacioacuten de cepas
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten
Liofilizacioacuten
48
574 Formatos de control del banco de liofilizados
Se decidioacute que los formatos de control para la seccioacuten de liofilizacioacuten del Banco Geneacutetico
fueran similares tanto para la criopreservacioacuten como para la liofilizacioacuten obedeciendo sus
diferencias a las caracteriacutesticas y datos propios de cada meacutetodo Se encontroacute que los formatos de
la seccioacuten criopreservacioacuten no habiacutean sido llenados nunca desde su creacioacuten Estos se muestran en
el anexo 7
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten
Se editoacute la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martiacutenez amp
Mayorga (2013) Partiendo de esta cartilla se elaboroacute un manual maacutes completo (anexo 8)
introduciendo todos los procedimientos para la liofilizacioacuten las diferentes teacutecnicas empleadas en
los procesos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se complementoacute tambieacuten la seccioacuten sobre el
proceso de refrigeracioacuten y se reescribieron algunos conceptos erroacuteneos de la edicioacuten anterior No
se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservacioacuten pero si
se realizaron pequentildeos ajustes de forma o de edicioacuten
49
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
La recuperacioacuten de microrganismos por criopreservacioacuten se realizoacute de acuerdo a los
lineamientos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) durante todas sus etapas sin embargo
la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la
criopreservacioacuten de la cepa o inclusive en la etapa de descongelacioacuten Garciacutea y Uruburuacute (citados
por Aacutengel A 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y
estabilidad de los organismos conservados edad celular velocidad de congelacioacuten y
descongelacioacuten temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores Dado que las cepas
CM-CR004 006 007 010 e incluso la 009 (que remplazoacute a CM-CR005) presentaron muy buenos
niveles de recuperacioacuten (Figura 8) el factor maacutes probable de falla corresponde al crioprotector
utilizado ya que en el caso del Banco Geneacutetico el crioprotector es general para toda la coleccioacuten
de bacterias y la eleccioacuten del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A
2006) puesto que la efectividad de la criopreservacioacuten se puede ver afectada por las caracteriacutesticas
propias de cada cepa (Hubaacutelek 2003) las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector
Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la
viabilidad los organismos conservados por este meacutetodo sobreviven largos periacuteodos por la
reduccioacuten marcada de su ritmo metaboacutelico incluso por maacutes de 30 antildeos (Gonzaacuteles et al 2006) lo
cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector
como elemento de falla en la conservacioacuten de la cepa perdida
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una uacutenica
liacutenea celular por tanto las caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificacioacuten preliminar Sin embargo estos mismos autores
sentildealan que estas caracteriacutesticas no son uacutenicas ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares como sucedioacute con CM-CR007 y 010 por ello fue preciso observar las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas microscoacutepicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquiacutemicas) de las cepas pero dada la simplicidad de las descripciones microscoacutepicas de
Rodriacuteguez (2013) no se tuvo como principal referencia de identidad Aunque la morfologiacutea de la
colonia depende considerablemente de la composicioacuten del medio de cultivo y las condiciones de
incubacioacuten cuando eacutestas son controladas suelen ser invariables teniendo por lo general un valor
diferencial considerable (Diacuteaz 2009) por lo tanto se tomaron estas caracteriacutesticas como las
principales para la evaluacioacuten de los indicadores de estabilidad morfoloacutegica y pureza
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que ldquolos medios soacutelidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamientordquo (paacuteg 2) Sin embargo se observaron
algunas variaciones las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio Esto se
observoacute maacutes en las cepas CM-CR007 y 010 que al revisar los datos de Martiacutenez amp Mayorga (2013)
y Rodriacuteguez (2013) estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio huacutemedo
tendiacutean a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican Loacutepez T amp Torres (2006)
en bacterias moacuteviles en tanto que sin niveles altos de humedad las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en funcioacuten del tiempo (envejecimiento de la colonia) Esto derivoacute en la
observacioacuten y descripcioacuten de caracteriacutesticas macroscoacutepicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad como son descritas en las Tablas 8 9 10 11 y 12 para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) diacuteas que duroacute la prueba de estabilidad
natural se observoacute que en general de los tres lioprotectores los resultados maacutes bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones Esto tiene su explicacioacuten en las propiedades reductoras
que poseen los monosacaacuteridos ya que como lo menciona Cox C S (citado por Hensel 1994) los
efectos letales de la desecacioacuten se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteiacutenas
de la membrana celular y azuacutecares reductores que aumentan conforme avanza la deshidratacioacuten
(glicacioacuten) si las proteiacutenas de membrana integrales o citosoacutelicas se ven dantildeadas de forma
irreversible durante el secado tendriacutea un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al 1995)
impidiendo la reconstitucioacuten de forma adecuada de las bacterias y por ende generando muerte
celular Sin embargo las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta especialmente en la concentracioacuten maacutes baja incluso para CM-CR007 la glucosa al 10 se
erige como el segundo mejor protector Es probable que estas dos cepas presenten una
configuracioacuten diferente de sus proteiacutenas de membrana que impida la reaccioacuten amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra que proteja a las proteiacutenas de membrana o
citosoacutelicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteiacutenas)
Es conocido que en general los disacaacuteridos mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan Herman White amp Vesey
2006) esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13
A diferencia de la glucosa la sacarosa es un azuacutecar no reductor estos pueden proteger las
ceacutelulas al competir por la unioacuten en la membrana con los azucares reductores (Hensel 1994) Se ha
demostrado que la sacarosa mantiene las proteiacutenas secas igual que en sus conformaciones
hidratadas Leslie et al (1995) indican que este fenoacutemeno sucede probablemente ldquomediante la
unioacuten a los dominios hidroacutefilos de las proteiacutenas y la prevencioacuten de enlaces de hidroacutegeno inter e
intra proteiacutenas durante el secado y la reconstitucioacutenrdquo (paacuteg 3596) lo cual contribuye a las altas tasas
de supervivencia al usar este lioprotector
Para que un protector funcione eacuteste debe proteger la bicapa lipiacutedica y para ello debe existir
dentro y fuera de las ceacutelulas (Leslie et al 1995 Palmfeldt et al 2003) el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transicioacuten de
membrana ya que en eacutesta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentracioacuten (Leslie et al 1995) reemplazando el agua intracelular lo cual se conoce como la
hipoacutetesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al 2003) Si esto se cumple la concentracioacuten
intracelular seraacute alta y el tiempo antes de la congelacioacuten y el secado debe ser corto por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequentildeo (Leslie et al 1995) y los productos polares
extracelulares seraacuten miacutenimos
Ademaacutes tanto la glucosa y la sacarosa estaacuten dentro de la categoriacutea de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo este estado viacutetreo ldquoInduce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una ceacutelula para detener la movilidad
molecular a un miacutenimo El vidrio amorfo inerte tambieacuten es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las ceacutelulas dentro de la estructura de vidrio antes de la congelacioacuten lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquiacutemicos irreversibles en la
membrana plasmaacutetica durante el almacenamientordquo (Morgan et al 2006 paacuteg 186)
51
La retencioacuten de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilizacioacuten
como en la criopreservacioacuten
Cabe mencionar que el proceso de deshidratacioacuten y de reemplazo de agua intracelular por
parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un liacutemite ya que como lo
menciona Heckly (citado por Perry 1995) al congelarse el agua del medio las ceacutelulas sufren
deshidratacioacuten reduciendo el punto de congelacioacuten en el interior y evitando la formacioacuten de
cristales de hielo pero al seguir bajando la temperatura las concentraciones de solutos aumentan
Perry (1995) cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelacioacuten estaacuten posiblemente
asociados a estas soluciones excesivamente concentradas puesto que no se han encontrado
evidencias de lesiones mecaacutenicas por hielo extracelular Esto corresponderiacutea con los resultados
obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores como lo fue la glucosa al 27 en casi
todas las cepas (exceptuando CM-CR006 Figura 10) recordando que un protector funciona mejor
en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmoacutetico con el interior de las bacterias (conocer
la concentracioacuten intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilizacioacuten
por parte de eacuteste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo como se muestra en el
trabajo de Palmfeldt et al (2003)
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta un ejemplo claro es la cepa CM-CR004 la cual de hecho ante los
gluacutecidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentoacute resultados aceptables Morgan et al
(2006) mencionan (teniendo como referencia la investigacioacuten de Buitink et al) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteiacutenas presentes en esta sustancia son
maacutes estables y juegan un importante papel en la formacioacuten del estado viacutetreo lo cual induce a pensar
que una oacuteptima mezcla de proteiacutenas y azucares permite una proteccioacuten maacutes eficiente Esta
posibilidad corresponderiacutea a los resultados obtenidos donde la concentracioacuten de los componentes
de la leche descremada seriacutean propicios para la cepa CM-CR004 en tanto que para las demaacutes cepas
seriacutean maacutes bajas o maacutes altas de lo propicio Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de gluacutecidos y proteiacutenas que la componen pero no
establece cuales son estos pudiendo ser positivos o negativos para la liofilizacioacuten
En general los cultivos liacutequidos ofrecen un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables (Ops
Diagnostics 2015) sin embargo la viabilidad depende muacuteltiples factores incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos El medio SMPG estaacute disentildeado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse raacutepidamente la fuente de carbono (glucosa) una bacteria
de raacutepido crecimiento entraraacute en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio una
de lento crecimiento al cabo del mismo tiempo estaraacute en fase log no obstante en el medio SPC
los nutrientes tardan maacutes tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas todas las bacterias
estaraacuten en fase log Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de raacutepido crecimiento mientras que
CM-CR004 006 y 009 son de crecimiento un poco maacutes lento (datos obtenidos del conteo con
caacutemara de Neubauer no incluidos en el presente estudio)
Morgan et al 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisioloacutegicos
en las bacterias relacionado generalmente con la privacioacuten de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles desencadenando una respuesta ante el estreacutes para permitir la
supervivencia de la poblacioacuten celular Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecacioacuten y las temperaturas menos propicias para su crecimiento por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilizacioacuten Sin embargo la
fase de crecimiento oacuteptima para la supervivencia en la desecacioacuten es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al 2006 paacuteg 185) Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14 indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
liacutequido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log asiacute mismo las cepas CM-CR004 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria pudiendo ser mayor o menor
En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilizacioacuten definitiva se observoacute puffing
y pitting y si bien Vemulapalli et al (2015) indican que estos cambios no afectan la calidad del
producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada Jennings (2008) advierte que su
presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada y que esta puede
deberse a un sistema con composicioacuten diferente de la formulacioacuten principal y podriacutea conducir a
interacciones tales como la agregacioacuten de proteiacutenas ademaacutes se observoacute (Figura 15 izquierda y
centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulacioacuten inicial de glucosa y
sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16) ldquodebido a una accioacuten combinada de la fusioacuten
(maacutes o menos importante) y de la presioacuten reducida dando lugar al puffingrdquo (Ticoacute G 1987 paacuteg
70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings 2008) seguacuten la cantidad del
material afectado por el puffing Esta caracteriacutestica se asocia con un error en los paraacutemetros de
liofilizacioacuten por ello se revisoacute exhaustivamente el proceso de liofilizacioacuten encontrando que los
liofilizados alcanzaron la temperatura de fusioacuten durante el proceso de secado primario por la
inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador el cual no habiacutea sido descrito en el
proceso piloto de liofilizacioacuten con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del
control de calidad A causa de esto los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los
uacutenicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha)
Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura
a los -32 y -42 degC asiacute como un melting inicial a -32degC y -42degC respectivamente seguacuten lo reporta
Moreira Gutieacuterrez amp Delgado (1994) Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento
del liofilizador
Las Tablas 15 y 16 que resumen las caracteriacutesticas tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados muestran que el color textura brillo y fractura de viales estaacuten dentro de los
paraacutemetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilizacioacuten correcta
con las formulaciones utilizadas no obstante se detectaron variaciones posliofilizacioacuten
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales Inicialmente se pensoacute
en una falla durante el tiempo de almacenamiento dado que los liofilizados maacutes afectados fueron
de las series B y C sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada se determinoacute que la causa de fallo yaciacutea en la
obtencioacuten de humedad por parte del producto liofilizado La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vaciacuteo absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vaciacuteo estos habiacutean absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilizacioacuten esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscoacutepica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad maacutes bajo que la sacarosa) debido a la
53
ldquofacilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidroacutegeno con el aguardquo (Badui
Dergal 2006 paacuteg 73) ldquoPara reducir el nuacutemero de moleacuteculas de agua el proceso de liofilizacioacuten y
el sellado de los viales al vaciacuteo debe haber sido exitoso y asiacute obtener un producto con el contenido
de humedad deseadordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 78) por lo cual se descarta la utilizacioacuten del
instrumento manifold para la liofilizacioacuten cepas en el Banco Geneacutetico
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilizacioacuten siempre deben ser
de vidrio ya que el vapor de agua atmosfeacuterico se puede difundir a traveacutes de los tubos de plaacutestico y
por ende las muestras secas terminariacutean absorbiendo agua Esto se comproboacute con la utilizacioacuten de
crioviales que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vaciacuteo sino que ademaacutes en
la serie C casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dantildeados presentaban
cambios de coloracioacuten (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloracioacuten
oscura como lo muestra la Tabla 15) o una marcada reduccioacuten en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentracioacuten) Esto tambieacuten se ve correlacionado con la peacuterdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008) la
humedad es la principal responsable en la peacuterdida de viabilidad en el producto liofilizado
reduciendo la vida uacutetil de los organismos La obtencioacuten de agua implica un retroceso del proceso
de liofilizacioacuten el dantildeo de la matriz formada el flujo de los residuos extracelulares polares es
decir la reactivacioacuten del organismo ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquiacutemica el metabolismo (Adams 2007) finalmente la muerte celular al agotarse esta
El tiempo de redisolucioacuten y el tipo de reconstituyente tambieacuten es de gran importancia La
Tabla 17 muestra tiempos de redisolucioacuten bastante altos para las formulaciones de glucosa Con
los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisioacuten del proceso de liofilizacioacuten se determinoacute la
retrofusioacuten producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de
redisolucioacuten causando un efecto grave donde la interaccioacuten entre las moleacuteculas es tal que la matriz
del liofilizado es casi insoluble (Jennings 2008) El aumento de la temperatura demasiado raacutepido
en el proceso de la liofilizacioacuten o por encima de Tg resultoacute en el colapso haciendo la
reconstitucioacuten mucho maacutes difiacutecil (Fetterolf 2010) Jennings (2008) indica que un aumento en el
aacuterea superficial por unidad de volumen de la torta tenderaacute a disminuir el tiempo de reconstitucioacuten
lo cual sucedioacute para todos los liofilizados que presentaron melting puffing y pitting ya que su
volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulacioacuten congelada solo los
liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulacioacuten
congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitucioacuten
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed amp Roos (2004) quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo se sugiere en muacuteltiples estudios
ademaacutes el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4degC plusmn 1degC en la
oscuridad (Ops Diagnostics 2015)
Se siguioacute los procedimientos de documentacioacuten establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
para la criopreservacioacuten y la elaboracioacuten de los nuevos protocolos de liofilizacioacuten encontrando
como lo menciona Gonzaacuteles et al (2006) que es necesario contar con sistemas de documentacioacuten
eficiente ademaacutes contar con duplicados de la informacioacuten en medios fiacutesicos y magneacuteticos evitado
la perdida de informacioacuten (Montes de Oca et al 2008) y el raacutepido acceso a la misma
54
7 CONCLUSIONES
En general el estado de criopreservacioacuten de las cepas evaluadas es oacuteptimo obteniendo tasas
de supervivencia satisfactorias Sin embargo el criopreservante no funciona de igual forma para
todas las cepas debido a las caracteriacutesticas propias de cada organismo que limitan la accioacuten del
glicerol
De acuerdo a la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten realizada con los tres indicadores
(viabilidad pureza y estabilidad morfoloacutegica) la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados siendo la concentracioacuten al 10pv la maacutes oacuteptima No obstante su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado hermeacuteticamente y al vaciacuteo El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada aunque no se determinoacute la concentracioacuten maacutes oacuteptima
En cuanto a la glucosa al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo se observa
que pese a no ser un buen lioprotector concentraciones de glucosa entre el 6 y el 10 pv son
funcionales aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50
No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten estos
fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminacioacuten de las muestras y a su
vez evitar la contaminacioacuten por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso
Se creoacute el protocolo para el proceso de liofilizacioacuten en todas sus etapas Este es
metodoloacutegicamente funcional y faacutecilmente reproducible por ello se estandariza para el Banco
Geneacutetico seccioacuten liofilizacioacuten dentro del nuevo manual de procedimientos de conservacioacuten Se
incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservacioacuten dentro de este
manual ajustado a las necesidades especiacuteficas de seguridad de la liofilizacioacuten
Es importante mantener actualizado los diferentes medios fiacutesicos y magneacuteticos donde reposa
la informacioacuten de las colecciones y los microorganismos en ellos dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Geneacutetico y la informacioacuten se puede perder
La falta de la identificacioacuten hasta cepa (al menos hasta geacutenero) de los microorganismos
presentes en el banco geneacutetico limita la informacioacuten para entender los fenoacutemenos relacionados a
los procesos de conservacioacuten y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo
55
8 RECOMENDACIONES
Existen paraacutemetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente como la edad del cultivo la
concentracioacuten celular entre otros Se propone el estudio de los paraacutemetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilizacioacuten con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos por ello se sugiere la creacioacuten
de un modelo matemaacutetico para que sea funcional esta prueba lo cual generariacutea datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo
Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinacioacuten de lioprotectores con formadores
de matrices y estabilizantes siguiendo los protocolos establecidos Mezclas de sacarosa al 10 pv
con leche descremada 10 pv (de la misma marca usada en este estudio) sacarosa al 10 pv con
leche descremada 10 pv y carboacuten activado asiacute como la utilizacioacuten de estas mezclas con trehalosa
en distintas concentraciones son sugeridas
Es necesaria la creacioacuten de una plataforma online del banco geneacutetico una vez este cuente con la
identificacioacuten de los organismos contenidos asiacute mismo es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco geneacutetico distinto a Access preferiblemente que obedezca a una
creacioacuten propia de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Es necesaria la creacioacuten de una pasantiacutea anual para curaduriacutea del Banco Geneacutetico ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepcioacuten de cepas Ademaacutes se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas como aquellas que sean donadas al Banco Geneacutetico en el futuro
56
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62
11 ANEXOS
Anexo 1 Formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-XX00Xa
Descripcioacuten Fotografiacutea
Borde o Margen
Frente a luz Brillanteopaca
Forma
Elevacioacuten
Color
Tamantildeo
Superficie
Consistencia
Grado de
Transparencia
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis
Pigmentos que desprende la colonia
y se observan sobre el medio
Olor
Hemolisis
MedioT(degC)
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen
un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace
la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad
del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos
Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen
Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta
Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
63
Anexo 2 Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados
a) Recubrimiento (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido cartoacuten y autoadhesivo de
emulsioacuten acuosa
b) Bandeja de liofilizados
c) Soporte para bandeja
d) Cojiacuten de siacutelice gel (reemplazo seguacuten el tamantildeo y cantidad de cojines de 2 meses a 1 antildeo)
El banco de liofilizados estaacute dividido en tres secciones
La seccioacuten de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A B y C respectivamente
La seccioacuten de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D E y F respectivamente
La seccioacuten de hongos (color cafeacute) correspondiente a las bandejas G H e I respectivamente
64
Bandeja de liofilizados
Estaacute hecha de poliestireno expandido viene con 100 compartimientos individuales para un maacuteximo
de 100 viales por bandeja
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
10 20
30 40
50 60
70
80
90 100
01
11 21
31
41
51
61 71
81
91
65
Anexo 3 Esquema general del cepario madre de liofilizados
J Hongos
K Bacterias
L Algas
F Fila
Nuacutemeros compartimento correspondiente a cada vial La numeracioacuten va en zigzag
J K L
F1 F1 F1 F2 F2 F2 F3 F3 F3
1
8 8 8
9 9 9 1 1
16 16 16 24 24 24
17 17 17
66
Anexo 4 Caacutemara de envejecimiento artesanal
Esta caacutemara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y
humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra La humedad relativa
puede controlarse seguacuten si se use agua (100) o una concentracioacuten determinada de solucioacuten salina
ver Colmenares R (2015)
Horno de 37degC (caacutemara externa)
Caacutemara
interna
Termoacutemetro
Tapa de sello
hermeacutetico
Malla de
soporte
Viales
Agua o sn salina
67
Anexo 5 Base de datos en Access
Esquema general de la Base de datos del Banco Geneacutetico
Espacio de trabajo con las tablas
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
informacioacuten
maacutes detallada)
68
Anexo 6 Formato de las Fichas Resumen
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FICHA RESUMEN DE LA COLECCIOacuteN
Ubicacioacuten de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Fuente de obtencioacuten
de las cepas
Fecha de
ingreso
Cantidad de cepas Tipo de organismos
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa)
Ubicacioacuten de cepas (seguacuten todos los meacutetodos
de conservacioacuten utilizados para la coleccioacuten)
Autores o donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos y Formatos de control
69
Anexo 7 Formatos de control de la seccioacuten liofilizacioacuten
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
Lugar (Ciudad y Paiacutes) Fecha de ingreso
Origen de
la cepa
Institucioacuten Organizacioacuten o
Empresa donante
Persona que realizoacute el
aislamiento
Cargo Fecha de
aislamiento
Informacioacuten de contacto
Fuente de obtencioacuten
de la cepa
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Identificacioacuten geneacutetica
de la cepa
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Calidad de la
cepa recibida
Restriccioacuten de
distribucioacuten
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Observaciones Nivel de
Bioseguridad
N1 N2 N3 N4
Persona donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
70
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL
FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN
CM-_ _0_ _
Proceso
Fecha Hora
Ciudad Equipo
Lioprotector y
concentracioacuten
Temperatura (degC)
Presioacuten (mbar)
Duracioacuten (min) Accesorio de
secado
Responsable (s) del proceso
Ubicacioacuten
Coacutedigo de la
cepa
Nombre de
la coleccioacuten
Viales
almacenados
Tipo S T Lf Total Sello al vaciacuteo SI NO
Cantidad Sello de Aluminio SI NO
Pruebas de
Viabilidad
Caracterizacioacuten
macroscoacutepica (resumen)
Caracterizacioacuten
microscoacutepica (resumen)
Concentracioacuten celular
(UCF)
Preliofilizacioacuten
Posliofilizacioacuten
Bioquiacutemicas
Otras
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
71
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS
CEPAS
CM-_ _0_ _
Detalles del
Proceso
Fecha Ciudad
Hora Coacutedigo de cepa
Viales a evaluar T S Lf Temperatura (degC)
Viales en mal estado T S Lf Presioacuten (Mbar)
Fecha de liofilizacioacuten Fecha de evaluacioacuten Total tiempo (meses)
Descripcioacuten
de la cepa
Geacutenero-especie del
microorganismo
Nombre de la
Coleccioacuten
Car
acte
riza
cioacuten
Microscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Microscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Observaciones
Viabilidad Concentracioacuten Celular
(UFC) Preliofilizacioacuten
Concentracioacuten Celular
(UFC) Posliofilizacioacuten
Observaciones
Control
de
Calidad
Bioquiacutemicas
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Pruebas
Cristal
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Otras Pruebas Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Observaciones
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
72
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD
DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS
CM-_ _0_ _
Lugar (Ciudad Paiacutes) Fecha
Informacioacuten
del
solicitante
Institucioacuten Organizacioacuten
o Empresa
Solicitante Cargo
Teleacutefono (s) Email
Descripcioacuten
de la cepa
Coacutedigo de
cepa
Geacutenero ndash especie
Microorganismo
Coleccioacuten
Utilizacioacuten de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
73
Anexo 8 Manual de procedimientos de conservacioacuten para el Banco Geneacutetico del Laboratorio
de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (Ver archivo adjunto)
Manual de procedimientos de
conservacioacuten para el Banco
Geneacutetico del Laboratorio de
Microbiologiacutea Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute
de Caldas
Primera Edicioacuten
Editado por
Andreacutes V Castantildeeda R
Manual de procedimientos de conservacioacuten para el
Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Ingenieriacutea Sanitaria
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
Licenciado en Biologiacutea
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales
Niria Pastora Bonza Peacuterez
Docente encargado del Laboratorio de Microbiologiacutea y
coordinador de Ingenieriacutea Sanitaria
Miguel Aacutengel Piragauta Aguilar
Disentildeo y diagramacioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
avicent29gmailcom
Autoriacutea y Edicioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda R
2015
Todos los derechos reservados
TABLA DE CONTENIDO
TIacuteTULO PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
RECEPCIOacuteN DE CEPAS 2
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS 3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES 5
Medios 5
Reactivos 6
Protectores generales 6
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN 7
Indicador uno Viabilidad 7
Conteo directo con caacutemara de neubauer (110mm) 7
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa 10
Indicador dos Estabilidad morfoloacutegica 12
Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) 12
Tincioacuten de gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) 13
Indicador tres Pureza de la cepa 13
RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS 14
Criopreservados (descongelamiento) 14
Liofilizados (rehidratacioacuten o reconstitucioacuten) 14
REFRIGERACIOacuteN 15
CRIOPRESERVACIOacuteN 16
Precriopreservacioacuten 16
Preparacioacuten del inoculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 16
LIOFILIZACIOacuteN 17
Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano 17
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 17
IV
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Posliofilizacioacuten 18
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos 18
ROacuteTULOS 19
Refrigeracioacuten 19
Criopreservacioacuten 19
Liofilizacioacuten 20
TIacuteTULO 2 PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONSERVACIOacuteN Y EN EL LABORATORIO
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN 23
Medios 23
Ambiente 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores 23
Cabina de flujo laminar 23
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 24
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS 24
Desechos no contaminados (no infecciosos) 24
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en
autoclave y reutilizado 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado 25
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa 25
BIOSEGURIDAD 26
Proteccioacuten personal 26
Procedimientos 27
Aacutereas de trabajo 27
Capacitaciones 27
REFERENCIAS 28
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dilucioacuten en serie 7 Figura 2 Conteo directo 8 Figura 3 Conteo en bacterias 8 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky 10 Figura 5 Contador de colonias 11 Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados 19 Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer 19 Figura 8 Roacutetulos para los crioviales 19 Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso 4 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG 5 Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos 5 Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos 6 Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer 9 Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 21
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIacuteMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL
kPa Kilo pascales
min Minutos
s Segundos
microl microlitros
mm miliacutemetros
degC grados Celsius
pv porcentaje peso a volumen
mTorr militorricelli
mbar milibar
g gramos
ml mililitros
UCF Unidades formadoras de colonias
rpm Revoluciones por minuto
vv Porcentaje volumen a volumen
iexclPrecaucioacuten
iexclA tener en cuenta
VI
INTRODUCCIOacuteN
Este manual representa en conjunto el trabajo a traveacutes del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigacioacuten han sentado los pilares para la formacioacuten del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC ) cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservacioacuten y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigacioacuten que permita a la comunidad acadeacutemica de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbioloacutegicos en las aacutereas de biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnoloacutegica para el paiacutes Aquiacute se presentan los tres meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos aplicados en este Banco Geneacutetico Refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten Se hace eacutenfasis en los diferentes procesos materiales equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Geneacutetico
Protocolos para la
conservacioacuten de
microorganismos
2
RECEPCIOacuteN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco geneacutetico debe contar con las siguientes condiciones miacutenimas de recepcioacuten
La cepa se debe encontrar en estado de pureza Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Geneacutetico
biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnologiacutea Debe contar con un responsable entidad o institucioacuten donante que respalde
la(s) cepa(s) entregadas ademaacutes de contar con la informacioacuten de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad
La cepa o coleccioacuten debe contar con toda la informacioacuten que el Banco
geneacutetico requiera para su mantenimiento conservacioacuten y registro en la base de datos
La cepa o coleccioacuten debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles
de Bioseguridad establecidos por la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) siendo el nivel de bioseguridad 2 el maacuteximo permitido por las instalaciones del laboratorio con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo
Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado
investigaciones entre otras) se debe pasar con 15 diacuteas de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS al docente encargado
Una vez recibida la cepa se diligencian los mismos registros en digital se
anexa la informacioacuten a la base de datos asignaacutendole un coacutedigo y se diligencian las fichas de resumen
3
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS El personal encargado del Banco Geneacutetico debe realizar una verificacioacuten de la
pureza de la cepa esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada sobre una o maacutes cajas de Petri con el medio de cultivo el tiempo y temperatura de incubacioacuten especificados por quien hace la donacioacuten Asiacute mismo a partir de este subcultivo se debe realizar la evaluacioacuten de la efica-cia del meacutetodo de conservacioacuten para verificar la informacioacuten dada por el investi-gador donante
Posterior al proceso de recepcioacuten de cepas es importante tener en cuenta
que se debe verificar la fecha de la uacuteltima siembra para determinar si es apro-piado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder despueacutes al proceso de criopreservacioacuten o liofilizacioacuten
Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las
cepas por maacutes de dos meses antes de la criopreservacioacuten o la liofilizacioacuten se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservaacutendola por el meacutetodo de refrigeracioacuten con el fin de evitar que la cepa se pierda
Si se requieren hacer pruebas bioquiacutemicas pruebas cristal u otras pruebas
complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos se tendraacute que pedir la autorizacioacuten del responsable del Banco Ge-neacutetico y del encargado del laboratorio debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposicioacuten de material en el laboratorio
Nota Si alguna cepa llegara a presentar contaminacioacuten se debe informar a la persona responsable del Banco Geneacutetico y posteriormente a la persona entidad o institucioacuten donante
4
EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservacioacuten
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso
Proceso o meacutetodo Equipo Material
Refrigeracioacuten Nevera Thermolab 14-E0107 Tubo de ensayo tapa rosca
Cabina de flujo laminar Asa redonda
Esterilizador de asas
Criopreservacioacuten
Cabina de flujo laminar Crioviales Voacutertex Puntas azules Micropipeta graduable de 100-1000 microl
Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la coleccioacuten
Frascos Schott con tapa para el glicerol
Pipeteador Pipeta de 1ml o 5ml
Liofilizacioacuten
Esterilizador de asas Asa redonda
Voacutertex Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Cabina de flujo laminar Puntas azules y amarillas Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile
Recipiente de poliestireno expandido cerrado
Crimper Sello de aluminio Micropipetas graduables de 100-1000microl y 20-200microl
Pinzas Vial 5mm con tapoacuten de divisioacuten
Evaluacioacuten del
meacutetodo de
conservacioacuten
Caacutemara de Neubauer 110mm Laminilla de cuarzo
Caacutemara AxioCam ICc5 Laminas porta objetos
Microscopio Axio Scope A1 Laminillas cubre objetos
Contador de colonias CC-1 Marcador
Estereoscopio Zeiss Asa redonda
Incubadora de 25degy 37degC Asa de Drigalsky
Micropipeta graduable 100-1000microl 20-200microl y 5-20microl
Puntas azules amarillas y blancas
Voacutertex Goteros
Recuperacioacuten de
los
microorganismos
Micropipeta graduable 100-1000microl y 20-200microl
Puntas azules y amarillas
Tubos de ensayo
Cabina de flujo laminar Cajas de Petri con medio
Plancha de calentamiento Mechero
Demaacutes equipos y materiales utilizados en la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten
Beaker
Termoacutemetro
Cajas de Petri con medio
Tubos de ensayo
-Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiologiacutea
5
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Geneacutetico cuenta con medios reactivos y protectores generales definidos para los meacutetodos de preservacioacuten manutencioacuten y recuperacioacuten de microrganismos Estos se describen a continuacioacuten y se clasifican de acuerdo al meacutetodo de conservacioacuten en la Tabla 4
Medios CALDO SMPG Este medio es empleado para el crecimiento del inoacuteculo inicial y
en la formulacioacuten de la criopreservacioacuten Su composicioacuten se muestra en las Tablas 2 y 3 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG
Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos
SPC (Standard Plate Count) Este medio se utiliza para la teacutecnica de evaluacioacuten
de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Tambieacuten puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas
Agar nutritivo (AN) o medios especiacuteficos Utilizados como medio de
mantenimiento o para pruebas bioquiacutemicas yo fisicoquiacutemicas (si se realizan) en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Buffer agua peptonada Este medio se utiliza en la rehidratacioacuten y en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 76
Microelementos 076
Peptona 1
Glucosa 01
MACROELEMENTOS Cantidad MICROELEMENTOS Cantidad
MgSO4 2 g CuSO4- 5H2O 005 g
NaNO3 2 g H3BO3 01 g
KCl 015 g MnSO4 ndash H2O 01 g
CaCl2 21 g ZnSO4 ndash 7H2O 01 g
Na2HPO4 09 g Agua destilada 1000 ml
FeSO47H2O 001 g
Agua destilada 1000 ml
6
Reactivos Tincioacuten Gram La bateriacutea de reactivos para la Tincioacuten de Gram se utiliza en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Alcohol acetona Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo Agua destilada Se utiliza en todos los procedimientos para la preparacioacuten de
medios la descongelacioacuten y especialmente en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Alcohol Para desinfeccioacuten en todos los procedimientos (70) o para mecheros (95)
Aceite de inmersioacuten Se utiliza para la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten durante las observaciones microscoacutepicas
Nitroacutegeno Liacutequido Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilizacioacuten
Protectores generales Crioprotector Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservacioacuten en
proporcioacuten 67vv respecto al criovial Lioprotector Se utiliza una solucioacuten de Sacarosa 10 pv para las
formulaciones en la liofilizacioacuten bacteriana En hongos se utiliza leche descremada al 12 pv No se tiene detalles de lioprotector oacuteptimo en algas
Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos
Nota Dado que en la refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se realiza la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten se incluyen aquiacute los reactivos implicados en dicha evaluacioacuten
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten Liofilizacioacuten R
eacti
vos
Tincioacuten Gram SI SI SI
Alcohol acetona SI SI SI
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de inmersioacuten
SI SI SI
Nitroacutegeno Liacutequido NO NO SI
Me
dio
s
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios especiacuteficos
OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
Agua peptonada SI SI SI
Pro
tecto
r
Glicerol anhidro NO SI NO
Sacarosa 10pv
NO
NO SI
7
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN
Indicador uno Viabilidad Conteo directo con caacutemara de Neubauer (110mm)
Se parte de un tubo de dilucioacuten (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto el cual tiene por lo general un tiempo de incubacioacuten de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo Figura 1 Dilucioacuten en serie Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser esteacuteriles usando una nueva en cada transferencia El diluyente es agua peptonada al 01 pv
Tome la caacutemara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia
Observe las dos cuadriculas de la caacutemara que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H)
Agite el tubo de dilucioacuten seleccionado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s tomando con una micropipeta una aliacutecuota de 10microl y depositaacutendola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla dejando que se cargue por capilaridad de forma homogeacutenea (Figura 2-A) Posteriormente lleve al microscopio enfocando desde el menor aumento hasta eacutel objetivo 40x al tiempo que ajusta la intensidad lumiacutenica para poder observar las liacuteneas de la caacutemara y las ceacutelulas al tiempo
-Algunos modelos de Voacutertex no poseen un rango de velocidad sino de niveles -Para limpiar la caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo lave primero con agua destilada luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada Deje secar al ambiente -Para una correcta observacioacuten al microscopio utilice el meacutetodo de enfoque de Koumlhler -Procure no limpiar la laminilla con ninguacuten papel o pantildeo lo puede rayar -Este procedimiento debe durar maacuteximo 10min ya que la solucioacuten podriacutea secarse debido a la luz del microscopio
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Figura 2 Conteo directo A Utilizacioacuten de la caacutemara de Neubauer 1 posicioacuten de la laminilla 2 posicioacuten de la punta para el deposito de la muestra B esquema general de la caacutemara de Neubauer Adaptado de Bastidas (2015) httpwwwceleromicscomesresourcesdocsArticlesFormula-Camara-Neubauer-Concentracionpdf amp Universitat de Barcelona (2015) httpwwwubeduLabFisioimagesstoriesFisAnimalBiologiaSangrecontadorTomapng
El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central Las foacutermulas y los cuadros a contar se determinan seguacuten el tamantildeo del microorganismo
Hongos y microalgas Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes
(cuadros 1 y cuadro central Figura 2-B) de izquierda a derecha Bacterias Cuente en el cuadro central que contiene 25 cuadros secundarios
(Figura 2-B) 5 de ellos (Figura 3-A o B) Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios en estos las ceacutelulas deben contarse en la direccioacuten que se indica en la Figura 3-C Los cuadros terciarios contienen tres liacuteneas en los extremos por ello se deben tener en cuenta las ceacutelulas que esteacuten desde la liacutenea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D
Figura 3 Conteo en bacterias A y B Forma de contar los cuadros terciarios C Direccioacuten de conteo en los cuadros terciarios D Ceacutelulas a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios
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Es importante resaltar que las bacterias que esteacuten unidas se contaraacuten como una Una vez obtenido el nuacutemero total de ceacutelulas se realizaran los caacutelculos correspondientes a los cuadros utilizados Para obtener el nuacutemero de bacterias se utiliza la ecuacioacuten planteada a partir de Bastidas (2015) Ndeg de bacteriasml=
En el caso de hongos y microalgas se utiliza la siguiente ecuacioacuten a partir de Bastidas (2015) Ndeg de ceacutelulasml= Fd Factor de dilucioacuten = Nota El meacutetodo de conteo en caacutemara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de ceacutelulas en los procedimientos de conservacioacuten de microorganismos Pero si se requiere la utilizacioacuten de otro meacutetodo se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados
Consideremos el siguiente ejemplo Tenemos un tubo con cultivo en medio liacutequido (10ml) de 36 horas este seraacute
nuestra muestra inicial Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con aliacutecuotas de 1ml en 9ml de diluyente Se realiza el procedimiento descrito en las paacuteginas anteriores haciendo un solo conteo Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de aliacutecuota g o ml de aliacutecuota + g o ml de diluyente
Ndeg Total de ceacutelulas contadas times 10000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
-El conteo directo con caacutemara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al meacutetodo de conservacioacuten evaluado
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
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Aplicando la ecuacioacuten para bacterias anteriormente mostrada tenemos que
Ndeg de bacteriasml=
= 81012 bacteriasml
81012 bacteriasml seraacute la cantidad de bacterias que ldquoexistenrdquo en la muestra inicial Esta en teacuterminos matemaacuteticos de las diluciones equivale a 100
Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas contando en los
cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuacioacuten tenemos que Ndeg de ceacutelulasml= = 321011 ceacutelulasml
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Seleccione tres tubos de la dilucioacuten seriada y de cada uno vierta aliacutecuotas de 100microl (agitando con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) antes de cada extraccioacuten) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio Raacutepidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky esteacuteril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky A La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atraacutes B Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro luego girar 90deg la caja y repetir el proceso
A B
90deg
16 times 250000
10-7 times 5
-Si se quieren datos maacutes fiables se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma aliacutecuota o poner en la caacutemara cinco aliacutecuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras -Al realizar el conteo en la caacutemara de Neubauer obtenemos el total aproximado de ceacutelulas presentes en la dilucioacuten utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado yo las impurezas que pueda contener la muestra por lo cual no es 100 exacto y no indica las ceacutelulas viables
16 times 10000 10-7 times 5
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Deje secar por miacutenimo 15min y lleve a incubacioacuten en posicioacuten invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja) Seguacuten el tipo de organismo las condiciones de incubacioacuten para la lectura de las cajas son
Bacterias temperatura ambiente 37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento
si se conoce Incubacioacuten de 18-24 horas Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas Casos extremos de crecimiento lento una semana
Hongos temperatura inferior a 25degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten de una siembra de solucioacuten de conidios de 4-8 diacuteas
Algas temperatura entre 25-37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten por maacuteximo 7 diacuteas en organismos descongelados o rehidratados
Luego de la incubacioacuten las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura
5) Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFCml)
Figura 5 Contador de colonias La caja de Petri se coloca en posicioacuten invertida y se marcan las colinas el contador cuenta al tacto
-La siembra por tubo se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador -Generalmente se toman las diluciones 10-5 10-6 y 10-7 Sin embargo si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3 10-4 y 10-5 -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70 flamear esperar a que el alcohol se consuma Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar por uacuteltimo palpe raacutepida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender para enfriar totalmente -Puede usarse una siembra en profundidad u otro meacutetodo para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie Sin embargo los demaacutes meacutetodos de conteo limitan la evaluacioacuten del indicador dos -Si al cabo de 30min las cajas no han secado el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condicioacuten -Con la punta de la micropipeta no toque el medio -Siempre use guantes y desinfeacutectelos constantemente durante los procedimientos
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En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250 al suponer que cada ceacutelula forma una colonia Para el caacutelculo de UFCml utilizamos una adaptacioacuten de la foacutermula de Valencia Z(2004)
UFCml = times times
Ejemplo 120 X 107 X 10 = 121010 UFCml
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten se calcula a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010) Tasa de supervivencia (BSR )=
Donde DD Despueacutes de la desecacioacuten AD Antes de la desecacioacuten
Indicador dos Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realiza Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas)
Diligenciar el formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas (anexo 1) descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de ldquoconteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Hay que tener en cuenta que
- Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas) de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas deben ser observadas en al menos el 80 de las colonias de la placa seleccionada
Ndeg de colonias (promedio entre las cajas por dilucioacuten)
Inverso del factor de dilucioacuten
Inverso del volumen de aliacutecuota
-La metodologiacutea y los criterios de eleccioacuten de cajas asiacute como el rango son seguidas de Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo todas las placas por dilucioacuten por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -El inverso del volumen de aliacutecuota corresponde a una medida de correccioacuten obligatoria para la siembra en superficie ya que en la praacutectica se aumenta en 110 el factor de dilucioacuten al sembrar 01ml (100microl) del tubo de dilucioacuten seleccionado
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100 Log (Ndeg UFCml AD)
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Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se realice una ldquocoloracioacuten de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005 paacuteg 24) En el caso de hongos realice una coloracioacuten simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado
Por uacuteltimo comparar los resultados con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y
macroscoacutepicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se toma registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio con caacutemara
Indicador tres Pureza de la cepa
Este indicador evaluacutea la pureza de un vialcriovial rehidratadodescongelado ademaacutes permite determinar si existe un cambio geneacutetico durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservacioacuten Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimaacutetica usando una bateriacutea de pruebas bioquiacutemicas o fisicoquiacutemicas diferenciales dependiendo de los requerimientos especiacuteficos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio Se recomienda realizar cada prueba por triplicado Tambieacuten puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales
-Realice una coloracioacuten de Gram estaacutendar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotograacutefico en un lapso no mayor a dos diacuteas -En los hongos es imprescindible el registro fotograacutefico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonoacutemica -El formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas exige un registro fotograacutefico pero alliacute solo se consignan si las fotografiacuteas son de alta calidad de lo contrario solo se dejan en la base de datos como referencia -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos -La estabilidad morfoloacutegica se evaluacutea pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -Para comparar las caracteriacutesticas macroscoacutepicas con la informacioacuten de origen se deben usar los mismos medios El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos
Si se confirma variacioacuten en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen y estas confirman la variacioacuten geneacutetica de la cepa inmediatamente se saca de la coleccioacuten origen se asigna un nuevo coacutedigo de identificacioacuten y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa Puede incluirse en la coleccioacuten Praacutecticas Acadeacutemicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva coleccioacuten
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RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento) Se toma un criovial (Semistock preferiblemente) sometieacutendolo a una
temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente 5min (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Los crioviales se introducen en bantildeo seroloacutegico una vez se llega a la temperatura deseada no antes
Del criovial se toma 1ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex
nivel 7 (asymp2240rpm) por 10s diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
La evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten se realiza al criovial luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubacioacuten (viables poscriopreservacioacuten) Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Geneacutetico
Liofilizados (Rehidratacioacuten o reconstitucioacuten)
Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC los viales a usar tomando el tiempo de rehidratacioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitando con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se toma un 1ml de este vial partiendo de esta aliacutecuota se realiza evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en medio soacutelido El indicador de viabilidad se evaluacutea solo con el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa u otro meacutetodo de conteo de organismos viables
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-dor donante sugiera otros meacutetodos de recuperacioacuten -La solucioacuten de rehidratacioacuten puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solucioacuten lioprotectora de la formulacioacuten -En el momento en que solo quede un criovialvial disponible de la cepa se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservacioacuten a partir de este
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REFRIGERACIOacuteN
Se implementa el meacutetodo de resiembra continua en este el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-Garciacutea et al 2010) cuando es utilizado para su almacenado nuevamente Se debe tener en cuenta los siguientes paraacutemetros
a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las
caracteriacutesticas del microorganismo ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios despueacutes de diacuteas semanas o meses Tambieacuten depende del tipo de medio de mantenimiento
b) El riesgo de contaminacioacuten y de cambios geneacuteticos se incrementa a mayor nuacutemero de transferencias
De acuerdo a esto para el laboratorio se determina
a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo
tapa rosca con Agar inclinado b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo procurando no
realizar maacutes de 4 transferencias c) La temperatura de refrigeracioacuten debe mantenerse en un rango de 4plusmn2degC d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminacioacuten
cruzada teniendo en cuenta la organizacioacuten interna del refrigerador evitando el amontonamiento de las cajas
e) Se utilizaraacute el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
f) Las cepas preservadas por este procedimiento seraacuten utilizadas para requerimientos internos del laboratorio preferiblemente en praacutecticas acadeacutemicas
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CRIOPRESERVACIOacuteN
Precriopreservacioacuten En el interior de la cabina de flujo laminar tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina Posteriormente son llenados con 1200microl de glicerol esteacuteril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados
Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de criopreservacioacuten (Martiacutenez amp Mayorga 2013) se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae una aliacutecuota de 1ml diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02)
Despueacutes agitar el tubo T02 con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s tomando
luego cinco aliacutecuotas de 600microl depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Se rotulan los crioviales y se realiza Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten Inmediatamente despueacutes de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente seguacuten la coleccioacuten a una temperatura de -85degC plusmn 1degC
Por uacuteltimo se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIOacuteN
culminado el proceso
-No use micropipeta para pipetear el glicerol -Todo el material debe ser correctamente esterilizado -Nunca tocar las tapas en el interior -De ser posible se recomienda una concentracioacuten de 10⁸ - 109 celml -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar 20min desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas (si se han determinado celml totales precongelamiento) -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables aumentando el nuacutemero de viables poscongelacioacuten Esto se puede hacer si no se tiene un nuacutemero determinado de ceacutelulas a una temperatura de 4degC plusmn 1degC por 20-30min -Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y poscriopreservacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas
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LIOFILIZACIOacuteN Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano Desde medio soacutelido
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio soacutelido se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general Posteriormente se debe agitar con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Desde medio liacutequido
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra diluyeacutendolo en un tubo con 9ml agua destilada esteacuteril (designado como T04)
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten Desde medio soacutelido
Del tubo T03 como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten y previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 1ml que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Desde medio liacutequido
Del tubo T04 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 100microl depositados en cuatro viales de vidrio En cada vial se adiciona 900microl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapoacuten de divisioacuten
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior de cada vial
sea lo maacutes exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T04 se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparacioacuten
Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado en
tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T04
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Con un volumen total de 1ml cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Los viales (indistintamente si se parte de medio soacutelido o liacutequido) se destapan parcialmente y se congelan en nitroacutegeno liacutequido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ge15min para ser llevados al liofilizador de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
Posliofilizacioacuten Luego del desmonte y sellado al vaciacuteo de los viales cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper posterior al proceso de liofilizacioacuten Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente El tercer vial (Lf) se almacena a 4degC plusmn 1degC en el cepario madre de liofilizados El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 diacuteas realizando evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten para saber si fue o no exitosa la liofilizacioacuten Por uacuteltimo se debe llenar el registro FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN culminado el proceso
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos En cuanto a los hongos el inoacuteculo inicial durante la preliofilizacioacuten se prepara
llenando con 10ml de agua destilada esteacuteril un cultivo soacutelido altamente esporulado del hongo Luego con un asa o espaacutetula esteacuteril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar Esta suspensioacuten es extraiacuteda con una pipeta esteacuteril y depositada en un tubo de ensayo al cual se le agrega 100microl de solucioacuten Tween 80 al 01 esteacuteril para preparar la solucioacuten de esporas Se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 20s y se prosigue de acuerdo a la ejecucioacuten de la liofilizacioacuten desde de un medio liacutequido
-Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y posliofilizacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas -Se debe realizar Voacutertex cada vez que se vaya a extraer una aliacutecuota -Los mejores resultados en la liofilizacioacuten se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas y en caldo SMPG un rango de 24-48h -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir maacutes tiempo del estipulado para su total congelamiento tener este dato de ser posible -El tiempo de liofilizacioacuten variacutea seguacuten la formulacioacuten Para una formulacioacuten con Sacarosa 10 36 horas es lo ideal -Debe usarse el accesorio para liofilizacioacuten Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vaciacuteo y de forma hermeacutetica -Los tapones de divisioacuten deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimacioacuten del agua de lo contrario no seraacute posible la liofilizacioacuten y pueden incluso quebrarse
-Si el raspado contiene rastros grandes de agar se debe realizar un filtrado con gasa esteacuteril aunque esto disminuiraacute el nuacutemero de esporas -Las esporas en solucioacuten pierden viabilidad conforme avanza el tiempo Se sugiere hacer uso de la solucioacuten antes de dos horas de preparada
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ROacuteTULOS
Refrigeracioacuten Dado que la refrigeracioacuten constituye un meacutetodo de corto plazo no se
requieren roacutetulos especiales para este meacutetodo de conservacioacuten Sin embargo es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente informacioacuten con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha
Criopreservacioacuten
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los roacutetulos de coleccioacuten usados en las cajas del Freezer y los roacutetulos para cada cepa criopreservada
Fecha de ingreso__________________________ Medio___________________________________ Cepa____________________________________ Coacutedigo__________________________________
-Es opcional imprimir este roacutetulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta
Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer
Figura 8 Roacutetulos para los crioviales
Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados
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Liofilizacioacuten
Los roacutetulos de la Figura 9 contienen la siguiente informacioacuten Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de
datos el Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo) nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten
de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6) con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada
vial Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
-Los roacutetulos de las cajas del Freezer los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo -Los roacutetulos deben colocarse antes de su almacenamiento especialmente los crioviales ya que una vez congelados el adhesivo no funciona
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Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio (paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
CC en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual moderado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro Existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o indirectamente Normalmente no existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005)
-En la base de datos del Banco Geneacutetico se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos pero el formato y tamantildeo de letra sea igual para todos los roacutetulos -Las etiquetas de liofilizacioacuten y criopreservacioacuten deben imprimirse en papel adhesivo -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos
22
Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservacioacuten y en
el laboratorio
23
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121degC y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro meacutetodo de esterilizacioacuten las puntas de micropipetas los viales crioviales y sus respectivas tapas deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas) pueden ser esterilizados en horno a 160degC por 120min
Sin embargo se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de
todo el trabajo desde la preparacioacuten de medios hasta el sellado de viales y crioviales como se describe a continuacioacuten
Medios Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Son indicadores de contaminacioacuten cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios soacutelidos
Ambiente Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto) evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas El periodo de exposicioacuten va de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo Se recomienda que con un nuacutemero superior de cinco colonias en el control se desinfecte el aacuterea de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminacioacuten Cabina de flujo laminar
Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4 horas Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar
24
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70 al inico durante y al final del trabajo con cada cepa
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005) los residuos se pueden clasificar en cinco grupos La eliminacioacuten de residuos en el laboratorio de microbiologiacutea no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas por ello los desechos se dispondraacuten de la siguiente forma
Desechos no contaminados (no infecciosos) Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que
incluso pueden reutilizarse o reciclarse como el papel
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservacioacuten requiere
de material corto-punzante se cuenta con un guardiaacuten para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plaacutesticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestioacuten Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposicioacuten final de este material
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado
Las cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 20 minutos Posterior al proceso de autoclavado se deben someter a un proceso de desinfeccioacuten con hipoclorito al 15 durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jaboacuten neutro
Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas en todo caso deberaacuten tener el mismo proceso de desinfeccioacuten anteriormente mencionado
25
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado todos los desechos producidos en cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 15 minutos posterior a este proceso se descartaraacute el contenido de las cajas de Petri disponieacutendolos en bolsas rojas para residuos peligrosos Por otra parte los desechos liacutequidos deberaacuten ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa
No es directriz del laboratorio ni del Banco Geneacutetico la incineracioacuten de ninguacuten tipo de material o residuo peligroso solo de su disposicioacuten y almacenaje seguacuten lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos
26
BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2 es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos estos son
ldquoAgentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente La exposicioacuten en el laboratorio puede provocar una infeccioacuten grave pero existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces y el riesgo de propagacioacuten es limitadordquo (OMS 2005 paacuteg 1)
El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Geneacutetico Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005)
Proteccioacuten personal El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial
Se recomienda el uso de batas blancas manga larga y bien abotonada con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar ensuciar o para prevenir alguacuten accidente
Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas bufandas o gorras
Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupcioacuten
Se debe utilizar proteccioacuten ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos
Debe respetarse la prohibicioacuten de beber comer masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como boliacutegrafos ademaacutes de tocarse los ojos y nariz
27
Procedimientos Estaacute estrictamente prohibido pipetear con la boca se deben utilizar
pipeteadores mecaacutenicos Todos los cultivos stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un meacutetodo de descontaminacioacuten aprobado como por ejemplo mediante autoclave
Aacutereas de trabajo Las superficies de trabajo se descontaminan como miacutenimo una vez por diacutea
y luego de todo derrame de material contaminante
En las zonas de trabajo estaraacute prohibido comer beber fumar aplicar cosmeacuteticos manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en aacutereas de trabajo
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ninguacuten momento ropa u objetos personales
Capacitaciones Los encargados del Banco geneacutetico y del laboratorio deberaacuten estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma maacutes eficaz y asiacute reducir riesgos en el proceso
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado asiacute como de las maquinas y elementos del laboratorio
28
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REFERENCIAS
29
Anexos y formatos
30
31
32
BANCO DE LIOFILIZADOS
33
CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
34
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
FORMATO PARA CARACTERIacuteSTICAS MACROSCOacutePICAS DE LAS CEPAS
35
FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN
36
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN LIOFILIZACIOacuteN
37
38
39
40
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN CRIOPRESERVACIOacuteN
41
42
43
44
45
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje) 27
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2 29
43 FASE INTERMEDIA 2 29
431 Liofilizacioacuten definitiva 29
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano 29
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 30
4313 Posliofilizacioacuten 30
4314 Rehidratacioacuten 30
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos 30
4321 Propiedades fiacutesicas generales 30
4322 Contaminacioacuten 30
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten 31
433 Pruebas adicionales 31
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica 31
4332 Prueba de estabilidad acelerada 31
434 Control de esterilidad 32
4341 Medios 32
4342 Ambiente 32
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 32
44 FASE FINAL 32
441 Base de datos 32
442 Fichas de resumen 33
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 33
444 Formatos de control del banco de liofilizados 33
445 Manual de procedimientos 33
5 RESULTADOS 34
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN 34
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE
ESTUDIO 35
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD
NATURAL 38
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general 38
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado 41
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA 41
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN 42
551 Propiedades fiacutesicas generales 42
552 Contaminacioacuten 45
553 Tiempo de redisolucioacuten 45
56 PRUEBAS ADICIONALES 46
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica 46
562 Prueba de estabilidad acelerada 47
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN 47
571 Base de datos 47
572 Fichas de resumen 47
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 47
574 Formatos de control del banco de liofilizados 48
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten 48
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS 49
7 CONCLUSIONES 54
8 RECOMENDACIONES 55
9 REFERENCIAS 56
10 BIBLIOGRAFIacuteA 60
11 ANEXOS 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten 16
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado 17
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua 18
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten 19
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes 21
Figura 6 Metodologiacutea 23
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 28
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelacioacuten 35
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 38
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilizacioacuten definitiva por cepa bacteriana 41
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes 45
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales 46
Figura 17 Organigrama de la base de datos 47
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas 24
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten 27
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 28
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales 29
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada 31
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados 33
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten) 34
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004 36
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006 36
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007 37
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009 37
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010 38
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad 41
Tabla 14 Tabla de convenciones 42
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1 42
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada 44
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado 46
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencioacuten de los microrganismos y dada su importancia se han
creado colecciones bioloacutegicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologiacutea Existe variedad de meacutetodos de preservacioacuten en este trabajo se determinoacute el estado
de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad estandarizando e
implementando ademaacutes el sistema de liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos
evaluaacutendolos frente a tres compuestos protectores Se realizoacute una evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten teniendo como base tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
encontrando que el sistema de criopreservacioacuten implementado en el laboratorio es oacuteptimo y el
glicerol al 67vv funciona para casi todas las cepas por largos periacuteodos de tiempo la sacarosa
10pv resultoacute ser el mejor lioprotector de los tres evaluados designaacutendolo como lioprotector
general para el laboratorio Se creoacute un manual de laboratorio para la conservacioacuten de cepas que
incluye los protocolos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten y de seguridad de los mismos Este
trabajo aporta al campo de la microbiologiacutea de la conservacioacuten y constituye un peldantildeo maacutes para
el registro del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes
PALABRAS CLAVE Criopreservacioacuten liofilizacioacuten lioprotectores conservacioacuten
microorganismos
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and given its importance have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology Exists variety of methods of preservation in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing standardizing and further
implementing the system freeze-drying taking as a starting point to them evaluating them against
three protective compounds An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators
viability morphological stability and purity was performed finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67 vv works for almost all strains for long
periods of time sucrose 10 wv lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory It was created a manual for conservation
laboratory strains including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions
KEYWORDS cryopreservation freeze-drying lyoprotectants conservation microorganisms
11
1 INTRODUCCIOacuteN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible pues como lo menciona
Hurtado (2009) la vida no es posible sin la actividad de estos ya que estaacuten involucrados en todas
las dinaacutemicas ambientales existentes en el planeta Sin embargo su importancia ha ido maacutes allaacute
desde que fueron descubiertos hace unos 300 antildeos por van Leeuwenhoek potencializaacutendose su
investigacioacuten y utilizacioacuten en distintos campos de la ciencia y la tecnologiacutea en los uacuteltimos 100
antildeos iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi amp Mayz 2003)
Debido a esto se han creado colecciones bioloacutegicas como meacutetodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho Las colecciones de cultivos microbianos estaacuten
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt y a nivel internacional por
la Federacioacuten Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) en donde existen actualmente
2acute520200 microorganismos en 711 colecciones de 71 paiacuteses registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM) Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM el CIAT (Rhizobium Collection America) de coacutedigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccioacuten de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de coacutedigo WDCM 857 (WFCC 2015)
No obstante varias universidades del paiacutes instituciones puacuteblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias bioloacutegicas poseen colecciones microbioloacutegicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN) en otros casos las colecciones estaacuten en proceso de registro o en formacioacuten como en la
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) entre otras
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer meacutetodos de conservacioacuten fiables
que entre otras cosas eviten al maacuteximo el riesgo de peacuterdida o de variabilidad geneacutetica de los
individuos Existe variedad de meacutetodos de conservacioacuten seguacuten sea el tiempo que estaraacuten en la
coleccioacuten o el tiempo en que tardaraacuten en ser usados dentro de ellos destacan la criopreservacioacuten y
la liofilizacioacuten meacutetodos utilizados para la coleccioacuten de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo
Martiacutenez amp Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Geneacutetico en el Laboratorio
de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC siglas de la coleccioacuten microbioloacutegica) utilizando
la refrigeracioacuten como meacutetodo primario implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
criopreservacioacuten
En este trabajo se pretendioacute determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos evaluaacutendolos frente a tres compuestos
protectores Para ello en primera estancia se recibioacute una capacitacioacuten sobre manejo y control de
microrganismos preparacioacuten de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados posteriormente se evaluoacute el estado de criopreservacioacuten de las cinco
cepas seleccionadas utilizando teacutecnicas de recuento en placa estaacutendar y se evaluoacute a tres
lioprotectores para la liofilizacioacuten de cepas microbianas del Banco Geneacutetico ademaacutes se realizaron
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacioacuten y se disentildearon los
protocolos para la implementacioacuten del sistema de liofilizacioacuten con las cinco cepas y el lioprotector
que presentoacute mejores resultados en este estudio
Para la realizacioacuten de estos fines el trabajo fue dividido en cuatro fases comenzando por los
criterios de eleccioacuten de los microrganismos y los lioprotectores seguido de la evaluacioacuten de los
meacutetodos de preservacioacuten utilizando tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
posteriormente una tercera fase de ajustes a la liofilizacioacuten para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo utilizando como indicadores las propiedades fiacutesicas generales la
posibilidad de contaminacioacuten en el proceso y el tiempo de redisolucioacuten finalmente una cuarta
fase que corresponde al proceso de documentacioacuten este incluye la revisioacuten y modificacioacuten de la
base de datos la elaboracioacuten de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados asiacute como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccioacuten y finalmente la
elaboracioacuten del manual de procedimientos Con lo anterior se encontroacute que el sistema de
criopreservacioacuten desarrollado por Martiacutenez amp Mayorga (2013) es eficiente y permite porcentajes
de recuperacioacuten bastante altos incluso superiores al 90 luego de dos antildeos sin embargo no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estaacuten expuestas por
este meacutetodo De otro lado se determinoacute la sacarosa al 10 como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caracteriacutesticas propias de cada organismo)
y se estandarizoacute el sistema de liofilizacioacuten
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacioacuten de un nuevo meacutetodo de
conservacioacuten de microorganismos para el Banco Geneacutetico de la Universidad Distrital Francisco
Joseacute de Caldas ademaacutes aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacioacuten en bacterias y ofrece
informacioacuten yo tips sobre el proceso de liofilizacioacuten en general que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso Tambieacuten se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Geneacutetico en la comunidad cientiacutefica a nivel nacional
e internacional
Este documento consta en su orden de un capiacutetulo de introduccioacuten y un marco referencial de los
objetivos tanto general como especiacuteficos alcanzados en este trabajo una metodologiacutea detallada
paso a paso perfectamente reproducible los resultados encontrados asiacute como el anaacutelisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacioacuten
finalmente un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo el campo de la
conservacioacuten microbiana y los capiacutetulos correspondientes a las referencias y bibliografiacutea utilizada
Se incluye tambieacuten un capiacutetulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientiacutefica del presente trabajo
13
2 MARCO REFERENCIAL
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS
La vida en la Tierra no seriacutea posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado 2009) ya que estaacuten involucrados con las dinaacutemicas en los ecosistemas terrestres aeacutereos
y acuaacuteticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta Existen
microorganismos que degradan la materia orgaacutenica hacieacutendola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) evitando que el mundo sea un vertedero
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnoloacutegicos de la humanidad
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea Bacteria y
Eucarya en donde encontramos como primeros representantes a las bacterias las maacutes numerosas
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) muchas pueden
resultar beneacuteficas para ser utilizadas con fines biotecnoloacutegicos agriacutecolas biomeacutedicos ecoloacutegicos
y de biorremediacioacuten (Morales-Garciacutea et al 2010) Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucioacuten en la naturaleza contribuyendo a la descomposicioacuten de la materia orgaacutenica y
participando en los ciclos bioloacutegicos (Pontoacuten Moragues Geneacute Guarro amp Quindoacutes 2002)
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucioacuten de los
graves problemas de la humanidad (Gonzaacuteles de Oca Martiacutenez Riveroacuten amp Nuacutentildeez 2006) en la
agricultura alimentacioacuten salud y en la buacutesqueda de nuevas fuentes de energiacutea y la conservacioacuten
del medio ambiente Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioquiacutemicas para Atlas (citado por Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez
1998) dicha capacidad se basa ldquoen la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones oxidaciones reducciones y precipitacioneshellip y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierrardquo (paacuteg 289)
Los recursos microbioloacutegicos (microorganismos genes e informacioacuten) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologiacutea las ciencias de la vida (Ivshina amp Kuyukina 2013) el
desarrollo de medicamentos farmaceacuteuticos agentes agroquiacutemicos biocontroles cosmeacuteticos y
productos industriales (Ten Kate 1995) Ademaacutes con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el eacutexito de los primeros aislamientos de microorganismos se marcoacute la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacioacuten de toda la biodiversidad microbiana logrando la inclusioacuten de este tema en el
desarrollo de las poliacuteticas ambientales (Gonzaacuteles et al 2006)
El meacutetodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta fuera de sus
ambientes ecosistemas y nichos ha sido la creacioacuten de colecciones bioloacutegicas cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfoloacutegicos fisioloacutegicos o
geneacuteticos (Montes de Oca et al 2008) Las colecciones de cultivos microbianos variacutean en forma
funcioacuten y tamantildeo Pueden ser pequentildeas privadas mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especiacuteficos (Duratildees Sette Pagnocca amp Rodrigues 2013)
14
El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura baacutesica de
investigacioacuten en ciencias de la vida llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg Dedeurwaerdere amp Pascual 2013) de animales y plantas pero se cuentan con
caracteriacutesticas especiacuteficas para los microorganismos En primer lugar los organismos microbianos
tienen una variacioacuten geneacutetica extremadamente alta y altos iacutendices de mutacioacuten en la reproduccioacuten
en las especies por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al 2013) a su lugar de recoleccioacuten En segundo lugar las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacioacuten asegurar los recursos geneacuteticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes para proporcionar biomateriales autenticados
para materiales de investigacioacuten exploracioacuten y produccioacuten asiacute como su uso contemporaacuteneo por
parte de las entidades privadas y puacuteblicas (Stromberg et al 2013)
Los microorganismos al igual que otros seres vivos poseen una uacutenica e irremplazable
secuencia de ADN por lo que su desaparicioacuten implicariacutea la peacuterdida irreversible de un conjunto
uacutenico de informacioacuten (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) de ahiacute la gran importancia en la
creacioacuten de comiteacutes comisiones federaciones y grupos de microbiologiacutea como World Federation
for Culture Collection (WFCC) International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacioacuten
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC 2010b)
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
En las colecciones es necesario establecer meacutetodos de conservacioacuten confiables y especiales
pudiendo realizarse a corto mediano y largo plazo para asegurar la oacuteptima viabilidad
almacenamiento y pureza (WFCC 2010b) de los diferentes microorganismos Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de peacuterdida cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
miacutenimo dos meacutetodos (WFCC 2010b) de conservacioacuten que consideren el tiempo a emplear en la
preservacioacuten inicial manipulacioacuten y control perioacutedico de las cepas asiacute como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemaacuten Diacuteaz Rosa amp Aacutelvarez Molina 2005)
Se debe tener especial cuidado con geacuteneros y especies todaviacutea no conservadas en colecciones
(especies nuevas) contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
oacuteptimos (WFCC 2010a) de conservacioacuten de estos
221 Conservacioacuten a corto plazo
Comuacutenmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestioacuten seraacute utilizado en un corto
periodo de tiempo Suele utilizarse la teacutecnica de resiembra continua en este el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC
donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garciacutea et al 2010)
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten
Este concepto agrupa a las teacutecnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 antildeos (Weng et al 2005) Existen variedad de teacutecnicas como la
desecacioacuten el gel de siacutelice o perlas de vidrio el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al
2005) o la congelacioacuten La inclusioacuten de esta uacuteltima teacutecnica en este grupo es discutida por algunos
autores ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacioacuten como la criopreservacioacuten (o
15
congelacioacuten) son teacutecnicas de conservacioacuten a largo plazo (Perry 1995 Weng et al 2005) y otros
insisten su inclusioacuten en las teacutecnicas de conservacioacuten a mediano plazo (Morales-Garciacutea et al 2010)
La criopreservacioacuten consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas
Esto permite la eliminacioacuten del agua libre disponible y que en el interior de los individuos ldquosoacutelo
una proporcioacuten del total de agua se convierta en hielordquo (Perry 1995 paacuteg 23)
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 deg C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta peacuterdida de la
viabilidad del cultivo (Perry 1995) por parte del laboratorio Este meacutetodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las ceacutelulas a -80degC
(Morales-Garciacutea et al 2010) Heckly (citado por Perry 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas la viabilidad celular es casi independiente del periacuteodo de almacenamiento ademaacutes
se cree que los individuos criopreservados siguen siendo geneacuteticamente estables
Hubaacutelek (2003) menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacioacuten de microorganismos desde las caracteriacutesticas propias del individuo (cepa
especie tamantildeo y forma de celda fase de crecimiento al momento de congelar composicioacuten de las
ceacutelulas etc) asiacute como los factores antes (composicioacuten del medio de crecimiento pH temperatura
de incubacioacutenhellip) durante y posterior al proceso de criopreservacioacuten (densidad poblacional
aditivos temperatura y duracioacuten del almacenamientohellip) e incluso en su descongelacioacuten
ldquoLos aditivos crioprotectores son compuestos quiacutemicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los dantildeos durante el proceso de congelacioacutenrdquo (Gonzaacuteles et al 2006 paacuteg
16) Estos protectores se pueden clasificar seguacuten su peso molecular (bajo o alto) o seguacuten su tasa
yo capacidad de penetracioacuten los penetrantes de bajo peso molecular que desplazan el agua
intracelular evitando la formacioacuten de hielo (por ejemplo el glicerol) y los no penetrantes de alto
peso molecular que promueven la raacutepida deshidratacioacuten de la ceacutelula (por ejemplo los gluacutecidos)
(Hubaacutelek 2003)
223 Conservacioacuten a largo plazo
Este concepto agrupa a las teacutecnicas que ademaacutes de minimizar al maacuteximo el riesgo de cambio
geneacutetico en las ceacutelulas mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 antildeos o maacutes (Weng et al 2005)
La maacutes popular es la liofilizacioacuten
2231 Liofilizacioacuten
La liofilizacioacuten consiste en la eliminacioacuten del agua de una sustancia congelada por
sublimacioacuten del hielo bajo alto vaciacuteo y a presiones muy bajas (Gonzaacuteles et al 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador Si la liofilizacioacuten es exitosa se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacioacuten por varios antildeos de los microorganismos sin embargo dicho eacutexito depende de
muacuteltiples factores entre otros como los mencionados por Hubaacutelek (2003) para la criopreservacioacuten
(puesto que la liofilizacioacuten posee una etapa de congelacioacuten) asiacute mismo el tiempo de liofilizacioacuten
los paraacutemetros de liofilizacioacuten el medio aditivo o lioprotector usado tipo de liofilizador o
accesorio utilizado influyen en el producto final
16
El proceso de conservacioacuten de microorganismos por liofilizacioacuten se puede dividir en muacuteltiples
etapas desde la formulacioacuten del protector hasta el modo en que se recuperaraacuten los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1)
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacioacuten Asiacute mismo se
representa el efecto de cascada en teacuterminos de la viabilidad de las muestras
a) Formulacioacuten
Se entiende como la mezcla de ceacutelulas con cualquier solucioacuten protectora que tras la
eliminacioacuten del disolvente permita obtener un producto (liofilizado) deseado La solucioacuten
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacioacuten Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de gluacutecidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics 2015)
Las soluciones protectoras oacuteptimas contienen principalmente un soluto protector
denominado lioprotector que estabiliza las ceacutelulas cuando se elimina el disolvente (agua)
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despueacutes de la liofilizacioacuten (Figura 2) Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actuacutean como su propia matriz por ejemplo la sacarosa al
10 (Ops Diagnostics 2015)
La formulacioacuten tambieacuten comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse pudiendo variar de si se parte de un cultivo soacutelido en
agar o de un cultivo liacutequido hasta que sean cultivos soacutelidos densos (edad de 1-2 diacuteas) o
liacutequidos en fase estacionaria Cuando se parte de un medio liacutequido y si es posible las
ceacutelulas se centrifugan retirando el medio de cultivo y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucioacuten protectora (Ops Diagnostics 2015) o de lioprotector (Grauer
Grunberg amp Zardo 2015) Para cultivos desde agar suele lavarse la placatubo con 5-10
ml de medio protector posteriormente recogido con una pipeta esteacuteril (Ops Diagnostics
2015) Aunque en esto uacuteltimo se evita la centrifugacioacuten se obtiene un mayor nuacutemero de
ceacutelulas partiendo de cultivos liacutequidos (Grauer et al 2015)
17
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado
Fuente Adaptado de Jennings T A (2008) Lyophilization Introduction and Basic Principles (paacuteg 5)
New York Informa Healthcare USA Inc
b) Congelacioacuten
La congelacioacuten es la primera etapa del meacutetodo de liofilizacioacuten y uno de los maacutes
importantes para el eacutexito de este Su funcioacuten consiste en obtener una matriz en donde esteacute
separado el disolvente de los solutos Cuando se congela la formulacioacuten el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regioacuten intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings 2008) la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regioacuten intersticial a casi 0 ademaacutes proporciona una estructura
con resistencia casi nula al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings
2008)
Disminuir el flujo de agua raacutepidamente es importante para evitar asiacute la excesiva
concentracioacuten de solutos un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracioacuten de solutos evitando el estreacutes osmoacutetico y permitiendo una organizacioacuten
espacial de los componentes de la formulacioacuten en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al 2015)
La temperatura y el tiempo para una congelacioacuten completa de la formulacioacuten
dependen de la naturaleza de la misma Nireesha et al (citado por Grauer et al 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco de ahiacute que una correcta congelacioacuten reduce la
desnaturalizacioacuten teacutermica del liofilizado ldquoinmoviliza componentes de la solucioacuten y evita
la formacioacuten de espuma cuando se aplica el vaciacuteordquo (Adams 2007)
c) Secado primario
Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacioacuten ademaacutes es la de maacutes larga
duracioacuten En este etapa la presioacuten se reduce y la temperatura de la formulacioacuten congelada
es elevada dando lugar a la sublimacioacuten (Figura 3) y migracioacuten de vapor de agua (Grauer
et al 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador Sin embrago dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
euteacutectica de colapso de transicioacuten viacutetrea (Tg) para minimizar el dantildeo de la muestra
(Adams 2007)
18
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua Se indican los requerimientos de presioacuten
y temperatura que hacen posible la sublimacioacuten del agua durante la liofilizacioacuten
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
El tiempo para el secado primario depende de muacuteltiples factores como la
composicioacuten de la solucioacuten protectora la porosidad del congelado la calidad o resistencia
de la matriz la cantidad de muestras asiacute como tambieacuten el volumen de la formulacioacuten entre
otros Respecto al volumen ldquopara las bacterias las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 025 a 05 mlrdquo (Ops Diagnostics 2015) Aunque no existe un
volumen establecido hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de maacutes
tiempo
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) un periacuteodo de secado primario de un diacutea es suficiente
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras teniendo
como guiacutea un tiempo de liofilizacioacuten de una noche
La etapa de secado primario finaliza ldquocuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacioacuten y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congeladardquo (Jennings 2008 paacuteg 6)
d) Secado secundario
Es la tercera y uacuteltima etapa de la liofilizacioacuten Al terminar el secado primario se ha
eliminado el agua moacutevil de la muestra Sin embargo existe agua atrapada dentro del soacutelido
amorfo que es maacutes difiacutecil de eliminar (Fetterolf 2010) La cantidad de agua es discutible
ya que fluctuacutea en funcioacuten de la temperatura y las caracteriacutesticas propias de los
19
constituyentes de la formulacioacuten por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10 ww del producto seco (Jennings 2008) o del 2-4 (Ops Diagnostics 2015)
La reduccioacuten del contenido de humedad en la torta se logra por desorcioacuten (Adams
2007) sin reducir el volumen de la misma (Jennings 2008) Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presioacuten parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario durante el secado secundario
(Ops Diagnostics 2015) Es importante que la temperatura no se incremente velozmente y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicioacuten viacutetrea la cual aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf 2010)
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) esta etapa es relativamente corta con una duracioacuten de
1 a 2 horas aunque Grauer et al (2015) indica que representa entre el 30-40 del tiempo
total del proceso asiacute mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo
con una duracioacuten de hasta varios diacuteas Esto resulta importante puesto que ldquola cantidad de
agua residente luego del secado afecta la tasa de peacuterdida de viabilidad durante el
almacenamientordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 16)
Finalmente al ser removida la humedad residual la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al 2015) obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2) o pastel esponjoso con poca (inferior al 1) o nula humedad
residual (Fetterolf 2010)
Las tres etapas del proceso de liofilizacioacuten en funcioacuten de la temperatura y la presioacuten
y en contraste con el diagrama de fases del agua pueden ser observadas en la Figura 4
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten De 1-3 Congelamiento (1-2 presioacuten
atmosfeacuterica) de 3-4 secado primario de 4-5 Secado secundario
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
20
e) Sellado y almacenamiento
Terminado el proceso de secado secundario se deben sellar los viales al vaciacuteo (de ser
posible) o de forma hermeacutetica tan pronto como sea posible debido a que la torta actuaraacute
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf 2010) aunque
tambieacuten es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams 2007) e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de siacutelice
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Sin embrago aunque
se logre un correcto sellado al vaciacuteo no se puede asegurar una larga vida uacutetil en condiciones
ambientales ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al 2015)
por ello lo mejor es almacenar los liofilizados a 4deg C en la oscuridad (Ops Diagnostics
2015) reduciendo las posibilidades de peacuterdidas aunque haya quedado agua despueacutes del
secado
f) Reactivacioacuten o rehidratacioacuten
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacioacuten original esto
implica la adicioacuten de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings 2008
Grauer et al 2015) La dilucioacuten raacutepida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings 2008) da cuenta de un correcto proceso de liofilizacioacuten
ldquoTiempos de reconstitucioacuten excesivamente largos la peacuterdida de potencia o la formacioacuten
de una solucioacuten turbia son indicios de un proceso de liofilizacioacuten inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacioacutenrdquo (Jennings 2008 paacuteg 11)
La recuperacioacuten de las ceacutelulas sin embrago tambieacuten se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacioacuten) el tipo
de diluyente su temperatura su pH la osmolaridad (Grauer et al 2015) la potencia del
lioprotector (Jennings 2008) entre otras propiedades de la solucioacuten resultante
Grauer et al 2015 sugieren la utilizacioacuten de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacioacuten de los microorganismos con el fin de evitar el estreacutes
osmoacutetico que pueden causar las soluciones diluidas sin embargo algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacioacuten especiacuteficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato
Ops Diagnostics (2015) indican que una tasa de supervivencia superior al 50 se
considera aceptable por muchos laboratorios
2232 Control de calidad de un producto liofilizado
Las propiedades fiacutesicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayoriacutea un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacioacuten entre los
paraacutemetros de la formulacioacuten y el proceso de liofilizacioacuten por ello permiten el seguimiento y la
deteccioacuten de falencias (Jennings 2008)
21
Esta evaluacioacuten permite caracterizar las diferentes propiedades fiacutesicas quiacutemicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre dichas propiedades Jennings (2008) y Ticoacute
G (1987) recogen algunos de las toacutepicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado por ejemplo las propiedades generales fiacutesicas de la torta (color volumen temperatura
de transicioacuten textura porosidad densidad contraccioacuten o colapso estado del vial entre otras que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacioacuten) su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfeacuterica) la velocidad de redisolucioacuten o
reconstitucioacuten la estabilidad (de la torta el microorganismo o el lioprotector evaluada de forma
natural o acelerada) nivel de humedad residual posibles contaminantes entre otras
2233 Equipamiento para liofilizar
Como ya se mencionoacute inicialmente el proceso de liofilizacioacuten requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5) este equipo consta esencialmente de tres partes
a) Un sistema o bomba de vaciacuteo que reduce la presioacuten del ambiente de la caacutemara que contiene
el material a secar Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dantildeen ldquoEl nivel
de vaciacuteo requerido debe ser entre 50 y 100 μbarrdquo (Grauer et al 2015 paacuteg 9) aunque 200
μbar son aceptables
b) Un condensador con circuito de refrigeracioacuten que comunica con la caacutemara de secado y
condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacioacuten sobre una superficie enfriada
inferior a los -40degC
c) Caacutemara o accesorio de secado que es donde se coloca el material a secar Seguacuten Nireesha
et al (2013) puede ser de tres tipos
- Manifold o colector muacuteltiple
- Rotary
- Tray style de bandejas con o sin estante de taponado eacuteste uacuteltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaciacuteo de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes En la imagen el liofilizador usa una
caacutemara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial
Tomado de httpslideplayercombrslide84760 el 15 de Agosto de 2015
22
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad y liofilizacioacuten de las mismas evaluaacutendolas frente a tres compuestos protectores
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas utilizando teacutecnicas de recuento
en placa estaacutendar
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacioacuten de cepas microbianas
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten
Disentildear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacioacuten a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados
23
4 METODOLOGIacuteA
La metodologiacutea general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases como es ilustrado en la
Figura 6
Figura 6 Metodologiacutea Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia loacutegica de eventos
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra
41 FASE INICIAL
411 Acervo Microbiano
De la coleccioacuten de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Geneacutetico del laboratorio de
microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracioacuten de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologiacutea estas corresponden a CR004 CR005 (sustituida posteriormente
por CR009) CR006 CR007 y CR010 seguacuten los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodriacuteguez (2013) Todas estaban conservadas por el meacutetodo de criopreservacioacuten (o
criocongelacioacuten) a una temperatura de -85 degC plusmn 1degC
412 Eleccioacuten de los protectores
4121 Crioprotectores
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99999) (Mallinckrodt Meacutexico) en
proporcioacuten 67 vv seguacuten lo establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
4122 Lioprotectores
Para la eleccioacuten de los agentes protectores y sus concentraciones en pv (Tabla 1) se
tuvieron en cuenta diferentes estudios en contraposicioacuten a Hensel (1994) se tomaron
concentraciones superiores al 9 de Glucosa (Merck Darmstadt) de forma aleatoria En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed amp
Roos (2004) y Palmfeldt Radstroumlm amp Hahn-Haumlgerdal (2003) Para la leche descremada
(Proleche Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al (2003) Dichos estudios
fueron tomados como referencia teoacuterica aunque los microorganismos en ellos especificados no
correspondan con los del presente trabajo
Criterios de eleccioacuten de los
microorganismos asiacute como de
los lioprotectores a evaluar
Evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten (criopreservacioacuten
y liofilizacioacuten)
Ajustes a la liofilizacioacuten
para la generacioacuten de
protocolos
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
24
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracioacuten
pv
10 4 10
117 10 15
27 15 20
42 FASE INTERMEDIA 1
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
En este trabajo se evaluaron dos meacutetodos de conservacioacuten (criopreservacioacuten y liofilizacioacuten)
dicha evaluacioacuten se realizoacute en teacuterminos de tres (3) indicadores valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al meacutetodo en siacute
4211 Viabilidad
Para evaluar este indicador se utilizoacute
a) Conteo directo con caacutemara de Neubauer 110mm (Boeco) siguiendo la metodologiacutea
planteada por Valencia Z (2004) Sin embargo para obtener el nuacutemero de bacterias se
utilizoacute la ecuacioacuten planteada por Bastidas (2015)
No de bacteriasml=
Fd Factor de dilucioacuten =
El conteo directo con caacutemara de Neubauer solo se realizoacute previamente al meacutetodo de conservacioacuten
evaluado
b) Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa seguacuten lo
descrito por Valencia Z (2004) y Camacho et al (2009) Para el caacutelculo de UFCml se
utilizoacute la siguiente foacutermula
UFCml = Ndeg de colonias times times
Los caacutelculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologiacutea planteada por
Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales se utilizoacute los planteamientos del Instituto
de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacioacuten y solo pos a la criopreservacioacuten en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid
England)
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten
fue calculado a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010)
Tasa de supervivencia (BSR ) = DD Despueacutes de la desecacioacuten
AD Antes de la desecacioacuten
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000
Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucioacuten
1
ml de muestra
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100
Log (Ndeg UFCml AD)
25
4212 Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realizoacute
a) Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) Se elaboroacute un formato (anexo 1) con las
caracteriacutesticas macroscoacutepicas descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz
(2009) para las colonias desarrolladas en superficie a partir del procedimiento de ldquoconteo
de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Se utilizoacute un
contador de colonias CC-1 (Boeco)
- Se seleccionoacute solo una de dos placas de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de
UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron observadas en al menos el 80 de las colonias
de la placa seleccionada
b) Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se
realizoacute una ldquocoloracioacuten de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005
paacuteg 24)
Se compararon con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y macroscoacutepicas descritas por
Rodriacuteguez (2013) y la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se tomoacute
registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio (Zeiss)
con caacutemara Canon G9
4213 Pureza
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en
cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante
teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
422 Recuperacioacuten de los microorganismos
Para la recuperacioacuten de los microorganismos se tomoacute un criovial de cada cepa bacteriana
sometido a una temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua
destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente cinco (5) minutos (Martiacutenez amp Mayorga
2013) Los crioviales se introdujeron en bantildeo seroloacutegico una vez se llegoacute a la temperatura deseada
no antes
De cada criovial se tomoacute un (1) ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (asymp2240rpm) por diez (10) segundos diluyeacutendolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
Se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten a cada criovial (Thomas
Scientific 5150636) por cepa luego de preparado el tubo T01 antes de la incubacioacuten Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martiacutenez amp Mayorga
(2013) y Rodriacuteguez (2013)
26
423 Criopreservacioacuten
4231 Precriopreservacioacuten
Pasado el tiempo de incubacioacuten se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten al tubo T01 con el fin de determinar el nuacutemero de ceacutelulas totales y viables de la
muestra El conteo en Caacutemara de Neubauer se realizoacute solo hasta el final de los procedimientos de
preservacioacuten por lo cual una vez preparadas las diluciones estas fueron llevadas a nevera a 4degC plusmn
1degC para evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Se siguioacute el protocolo de criopreservacioacuten establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas con
algunas variaciones
Con pipeta esteacuteril de 5ml se depositaron en cinco (5) crioviales 12ml de glicerol anhidro
esteacuteril
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02)
Posteriormente se tomaron aliacutecuotas desde T02 de 600microl previo Voacutertex nivel 7 por 15s
depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl Se rotularon y se
realizoacute Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten
Inmediatamente despueacutes de la homogenizacioacuten fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick) a una temperatura de -85degC plusmn 1degC en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestioacuten
Este procedimiento se realizoacute en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar veinte (20) minutos (Martiacutenez amp
Mayorga 2013) desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar
la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
424 Liofilizacioacuten Etapa 1
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Se partioacute del tubo T01 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de
liofilizacioacuten Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel
7 (asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml agua destilada esteacuteril (T03)
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
Partiendo del tubo T03 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se
extrajeron aliacutecuotas de cien (100) microl veintisiete (27) veces depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar En cada criovial se adicionaron novecientos (900) microl de lioprotector en tres
crioviales por cada concentracioacuten de lioprotector de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2)
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior del criovial fuera lo maacutes
exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T03 se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacioacuten
27
Donde el volumen inicial y la concentracioacuten inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado en tanto que el volumen final y la concentracioacuten final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T03
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (aliacutecuota maacutes protector) se
agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacioacuten
Posteriormente a los crioviales se les retiraron las tapas plaacutesticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney PM-996) esterilizado realizando seis (6) perforaciones conceacutentricas en la superficie
con aguja hipodeacutermica 21G x 1frac12rdquo Los crioviales fueron congelados en nitroacutegeno liacutequido por
15min aproximadamente depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD Thermo
Scientific) de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45degC usando el colector muacuteltiple (manifold)
Terminado el proceso se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la caacutemara
de flujo laminar para evitar contaminacioacuten de las muestras alliacute se les retiroacute el Parafilm se les tapoacute
con tapas esteacuteriles y se les rotuloacute
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten
Lioprotector Concentracioacuten
(pv)
Serie
A B C
Glucosa
10 1 1 1
117 1 1 1
27 1 1 1
Sacarosa
4 1 1 1
10 1 1 1
15 1 1 1
Leche
descremada
10 1 1 1
15 1 1 1
20 1 1 1
Total crioviales seguacuten Ndeg 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje)
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten utilizando una etiqueta o
roacutetulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacioacuten
Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de datos el
Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten
bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo)
nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3) con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo
bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas
tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada vial
Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional
a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
Posterior al proceso de rotulado los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano a temperatura ambiente y protegido de la luz
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS
CC en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado riesgo
poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entrantildear un riesgo grave para el personal de
laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado
riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro Existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o
indirectamente Normalmente no existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005)
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio
(paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications
biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
29
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2
Se realizoacute una prueba de estabilidad natural en teacuterminos del aspecto fiacutesico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un periacuteodo prolongado de tiempo (Grauer et al 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente Por ello la rehidratacioacuten de los crioviales se realizoacute en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4)
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales
Primera rehidratacioacuten Segunda rehidratacioacuten Tercera rehidratacioacuten
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota Intervalos de tiempo medidos en diacuteas contados desde el diacutea de almacenaje en los cuales se rehidratoacute
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie ver Tabla 2) El aspecto fiacutesico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacioacuten y comparado con su estado antes del almacenaje
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC tomando
el tiempo de reconstitucioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel
2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten El indicador de viabilidad se evaluoacute solo con el meacutetodo de conteo de
microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la maacutes alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa se eligioacute el
lioprotector y la concentracioacuten de eacuteste que permitioacute obtener un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables
posliofilizacioacuten y que ofrecioacute ademaacutes una menor variacioacuten durante la prueba para la liofilizacioacuten
definitiva de las cepas en estudio Dicho lioprotector se establecioacute ademaacutes como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados del Banco
Geneacutetico del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
43 FASE INTERMEDIA 2
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores con el aacutenimo de
generar un protocolo funcional aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partioacute de cultivos puros sobre medios soacutelidos se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacioacuten liofilizacioacuten y posliofilizacioacuten para la
liofilizacioacuten definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados
431 Liofilizacioacuten definitiva
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracioacuten oacuteptima para cada cepa
de estudio se realizoacute la liofilizacioacuten definitiva
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general Posteriormente se agitoacute con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Esto se realizoacute para cada
cepa
30
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
El tubo T04 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten
definitiva se extrajeron cuatro (4) aliacutecuotas de un (1) ml previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass 62113D-2)
posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por
7s para su homogenizacioacuten
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas a una presioacuten
inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
El proceso de destape parcial y congelacioacuten se realizoacute en caacutemara de flujo laminar para evitar
al maacuteximo la contaminacioacuten El transporte de los viales desde la caacutemara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitroacutegeno liacutequido
para evitar contaminacioacuten y descongelacioacuten
4313 Posliofilizacioacuten
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten Dos viales
designados como trabajo (T) y stock (S) fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4degC plusmn 1degC
4314 Rehidratacioacuten
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacioacuten de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio soacutelido
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos
Se llevoacute un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el aacutenimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacioacuten Al identificarlas se decidioacute repetir la
liofilizacioacuten definitiva con los nuevos paraacutemetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio
4321 Propiedades fiacutesicas generales
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento) color textura brillo aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales teniendo como punto de comparacioacuten la formulacioacuten
luego de congelada Esto se realizoacute para
- Crioviales de la fase intermedia 1
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 431)
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 433)
4322 Contaminacioacuten
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad en
buacutesqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio
31
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten
Se midioacute el tiempo de reconstitucioacuten de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y el tiempo de los crioviales que conteniacutean el lioprotector general fue comparado
con el tiempo de reconstitucioacuten de los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada
433 Pruebas adicionales
Para estas pruebas solo se usoacute la formulacioacuten del lioprotector general y la cepa CM-CR010
por su alta tasa de crecimiento respecto a las demaacutes cepas evaluadas
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticoacute G 1987) se
tomaron los pesos con balanza analiacutetica (AND GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos El cuarto vial y criovial se abrieron solo una vez luego
fueron sellados completamente tomando sus pesos de la misma forma ya descrita
Para determinar si existe un tiempo maacuteximo admisible de cerrado se midioacute el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcioacuten del tiempo utilizando la ecuacioacuten
descrita por Garciacutea C (2007)
Wt () es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4332 Prueba de estabilidad acelerada
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa uno fue rehidratado a los cero (0) diacuteas y el otro
luego de siete (7) diacuteas en el interior de la caacutemara de envejecimiento ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5 Adicionalmente se dataron sus propiedades fiacutesicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada
Ndeg vial t ndash Tdeg - HR
1 0 - ambiente - 25
2 7 - 37degC - 100
Nota Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos t= Tiempo en diacuteas
Tdeg=Temperatura HR=Humedad relativa La prueba de estabilidad se realizoacute en una caacutemara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC luego
incubados a 25 degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente
se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten midiendo viabilidad con el meacutetodo
de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
32
434 Control de esterilidad
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121degC y 210Kpa por 20 minutos las puntas de micropipetas los viales
crioviales y sus respectivas tapas fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y
temperatura en un tiempo de 15 minutos Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas) fueron esterilizados en horno Binder a 160degC por 120 minutos
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo desde la
preparacioacuten de medios hasta el sellado de los viales como se describe a continuacioacuten
4341 Medios
Se realizoacute control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid England) (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Se determinoacute como indicador de contaminacioacuten
cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios
soacutelidos
4342 Ambiente
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realizoacute con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas El periodo de exposicioacuten fue de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en
incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo
b) Cabina de flujo laminar
Se realizoacute el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este
caso la caja de control de ambiente se dejoacute abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeriacutean el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4
horas Este control se llevoacute a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolloacute en el interior de la cabina de flujo laminar
se procuroacute mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y
tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70 al iniciar el trabajo con cada cepa
44 FASE FINAL
441 Base de datos
Se realizoacute una revisioacuten a la base de datos del Banco de cepas creado por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) en el programa Access modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccioacuten para la informacioacuten de los organismos liofilizados
33
442 Fichas de resumen
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccioacuten tanto del Freezer
como del banco de liofilizados utilizando el programa Word 2013
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se realizoacute una revisioacuten de la informacioacuten en los roacutetulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos con el aacutenimo de verificar si se habiacutean cumplido los protocolos y la
logiacutestica establecida por Martiacutenez amp Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias
444 Formatos de control del banco de liofilizados
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013 para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) en la seccioacuten
de criopreservacioacuten
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados
Coacutedigo Tipo de registro Ubicacioacuten Uso
FLf-01 Registro de entrada de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccioacuten
FLf-02 Proceso de
liofilizacioacuten
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacioacuten a
una cepa
FLf-03 Registro de control de
calidad
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccioacuten y antes de liofilizar
una cepa para la coleccioacuten
FLf-04 Solicitud salida de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados
Fuente Adaptado de Martiacutenez Beniacutetez H L amp Mayorga Burgos L P (2013) Implementacioacuten de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (Tesis de
pregrado) (paacuteg 44) Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas Bogotaacute Colombia
445 Manual de procedimientos
Se realizoacute una revisioacuten de la cartilla de procedimientos elaborada por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) Se tomoacute la decisioacuten de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013
34
5 RESULTADOS
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN
A raiacutez de la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en cada criovial por cepa
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno En cuanto a CM-CR005 se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer pero no fue posible recuperarla por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009 la sexta mejor respecto al criterio de eleccioacuten de cepas
Con los datos del proceso precriopreservacioacuten de las cepas de intereacutes correspondientes a la
coleccioacuten de colorantes consignados en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) en conjunto con
los datos de viables poscongelacioacuten del presente trabajo se calculoacute la BSR para cada cepa (Tabla
7) Se encontroacute que los porcentajes de BSR son superiores al 70 luego de dos (2) antildeos de estar
en criopreservacioacuten (Figura 8) salvo CM-CR005
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martiacutenez amp Mayorga (2013) (soacutelo se compararon los datos de la cepa CM-CR010 ya que las demaacutes
cepas no figuran en su trabajo) se encontroacute un porcentaje inferior de recuperacioacuten
poscriopreservacioacuten por parte de las autoras por lo cual se revisoacute la metodologiacutea encontrando un
error metodoloacutegico al calcular la BSR en su trabajo Usando los datos de ldquoresultados prueba de
viabilidad poscongelacioacuten tabla 19rdquo (en Martiacutenez amp Mayorga 2013 paacuteg 54) se corrigioacute la BSR
para esta cepa evidenciando ser la cepa maacutes resistente al proceso de criopreservacioacuten entre las
evaluadas con alrededor de 66 de caiacuteda luego de dos antildeos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8)
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten)
Nota Se muestran los resultados al evaluar la conservacioacuten de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por
el meacutetodo de criopreservacioacuten luego de dos (2) antildeos La BSR que Martiacutenez amp Mayorga (2013) presentan
corresponde a un valor poscriopreservacioacuten luego de dos meses de evaluacioacuten Nrd= No registra datos
Cepa Ceacutelulas
totales
Viables precongelacioacuten
(UFCml) de Martiacutenez
amp Mayorga (2013)
viables pos
congelacioacuten
(UFCml)
BSR
real
BSR de Martiacutenez
amp Mayorga
(2013)
BSR
corregido
CM-CR004 12x1012 61 x109 13 x107 725 Nrd Nrd
CM-CR005 11 x1010 11 x1010 0 00 Nrd Nrd
CM-CR006 14x1010 75 x109 27 x107 752 Nrd Nrd
CM-CR007 13x1011 41 x109 31 x108 883 Nrd Nrd
CM-CR009 19 x1010 44 x109 23 x107 763 Nrd Nrd
CM-CR010 17 x1010 46 x109 72 x108 916 673 982
35
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelacioacuten CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperacioacuten (nuacutemero de
ceacutelulas viables)
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO
En las Tablas 8 9 10 11 y 12 se describen las principales caracteriacutesticas macroscoacutepicas
utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfoloacutegica de las cepas utilizadas No fue
posible realizar la comparacioacuten con los datos de Rodriacuteguez (2013) a nivel macroscoacutepico dado que
los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquiacute utilizados sin embargo si se
compararon las caracteriacutesticas microscoacutepicas las cuales fueron coincidentes aunque estas no eran
del todo claras (descripcioacuten inexacta de forma y tamantildeo y sin un registro fotograacutefico comparable)
por lo cual se decidioacute que las caracteriacutesticas macroscoacutepicas observadas desde la primera siembra
posterior a la descongelacioacuten de los crioviales fuesen las de mayor importancia para evaluar la
estabilidad morfoloacutegica y la pureza Estas se mantuvieron sin cambio o variacioacuten a lo largo del
trabajo
Las microfotografiacuteas tomadas a cada cepa usando la coloracioacuten de Gram al igual que las
fotografiacuteas de las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron anexadas a la base de datos del Banco
Geneacutetico
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 725 00 752 883 763 916
Sup
ervi
ven
cia
36
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR004
Descripcioacuten
Borde o Margen
Ondulado Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de
crecimiento
Frente a luz Brillante
Elevacioacuten Umbonada
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Color Beige maacutes intenso en el centro y maacutes clara hacia los extremos en
colonias de 48h o maacutes extremos color blanco hueso
Forma Circular a maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo desarrollar forma
irregular
Grado de
Transparencia Opaca (No transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Ropa huacutemeda
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR006
Descripcioacuten
Borde o Margen Semiondulado A maacutes de 72h es altamente digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas y con medio huacutemedo se irregulariza
Luego de una semana totalmente digitado
Elevacioacuten Plana con bordes elevados (en craacuteter) Colonias de maacutes de 72h
presentan una ligera elevacioacuten en el centro
Color Amarillo
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Escamosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca (NO transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis Si color amarillo
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
37
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR007
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio muy huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular A maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo es irregular
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 48h y distantes unas de otras (pocas
colonias) umbonadas
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Semitransparente en zona externa
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Mentol
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR009
Descripcioacuten
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas se irregulariza
Elevacioacuten En meseta y ligero hundimiento central (craacuteter) En colonias con maacutes
de 72h ligera elevacioacuten del craacuteter
Color Beige Conforme envejece la colonia toma una coloracioacuten blancuzca
de tonalidad cafeacute en el centro
Tamantildeo Pequentildea (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
38
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR010
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio huacutemedo es suavemente ondulado en medio muy
huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular Despueacutes de 48h se irregulariza En medio muy huacutemedo es
estrellado (sin importar edad de la colonia)
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 72h centro marcado y ligeramente
elevado (forma de huevo frito)
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia
Opaca Semitransparente en la zona externa de colonias de maacutes de
48h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Sin olor
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general
Las Figuras 9 10 11 12 y 13 representan los resultados de la evaluacioacuten de la eficacia del
meacutetodo de conservacioacuten realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1 por medio
del indicador de viabilidad
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 6 x108 Se observa que
la leche descremada 15 como mejor protector y leche descremada 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A - - - 5987 - 5301 5958 6812 -
BSR en serie B - - - 3619 3076 4557 5100 5039 3619
BSR en serie C 3076 3619 - 3619 3076 3418 3418 5873 4723
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR004
39
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 73 x108 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 125 x1010 Se observa
a sacarosa 10 como mejor protector y a glucosa 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 4173 4962 5850 6119 6415 5731 5430 4173 4513
BSR en serie B 3046 - - 4173 4743 5051 4773 - -
BSR en serie C - - - 3046 5147 4622 - - -
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR006
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 9149 8664 6549 9712 9677 8735 9026 9166 8648
BSR en serie B 8472 - 6181 - 8474 - 8413 8052 8086
BSR en serie C 8557 7472 6193 - 9272 - 8604 8202 8414
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR007
40
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 115 x109 Se observa
a Sacarosa 15 como mejor protector y la leche descremada 10 como segundo mejor protector
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 65 x109 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 5494 4609 4609 6641 6401 6987 5585 5440 5186
BSR en serie B 4415 - - 6373 6083 6212 4941 4083 -
BSR en serie C - - - - - 7519 4083 - 4083
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR009
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 8205 - 6303 9521 8634 8207 8153 8022 8332
BSR en serie B 6424 - - 7911 8312 8096 7752 6907 7995
BSR en serie C 6697 - - - 8230 7998 7919 8113 7539
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Sup
erviv
enci
a
BSR en CM-CR010
41
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15
CM-CR006 Sacarosa 10
CM-CR007 Sacarosa 10
CM-CR009 Sacarosa 15
CM-CR010 Sacarosa 10
Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural
ofreciera la maacutes alta BSR en la mayoriacutea de cepas (Tabla 13) se determinoacute la sacarosa al 10
como el mejor lioprotector y se designoacute como lioprotector general para las bacterias del banco de
liofilizados Sin embargo se decidioacute para la liofilizacioacuten definitiva utilizar el lioprotector que
mejores resultados confirioacute a cada una de las cinco cepas de estudio
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado
Dado que el principal indicador de evaluacioacuten de la prueba de estabilidad natural en esta
etapa era la viabilidad en cada liofilizado no se tuvo en cuenta los cambios morfoloacutegicos
presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa pero si fueron tenidos en cuenta
para los ajustes teacutecnicos de la liofilizacioacuten en la fase 3
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilizacioacuten definitiva
con su homoacutelogo de la etapa 2 (es decir los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo) se encontraron diferencias significativas de aumento o disminucioacuten de hasta el 22
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad seguacuten el punto de partida de la formulacioacuten
(medio liquido SMPG vs medio soacutelido SPC) como lo muestra la Figura 14
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilizacioacuten
definitiva por cepa bacteriana Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas seguacuten el intervalo
temporal de la Serie A en tanto que CM-CR007 CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron seguacuten la Serie
B (ver Tabla 4)
- 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Punto
s p
orc
entu
ales
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
L Etapa 2 6812 6415 8474 6212 8312
L definitiva 7330 7629 7757 8461 7234
BSR comparativa
42
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN
551 Propiedades fiacutesicas generales
Se dataron las propiedades fiacutesicas de los liofilizados en la fase intermedia 1 asiacute como los
liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 431 (liofilizacioacuten definitiva) y 4332 (viales
usados para la prueba de estabilidad acelerada) en las Tablas 15 y 16 respectivamente la tabla de
convenciones (Tabla 14) permite comprender los siacutembolos de las anteriores tablas
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilizacioacuten y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilizacioacuten
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transicioacuten conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto fiacutesicamente aceptable Sin embargo pese a que a las propiedades fiacutesicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1 con los cuales se realizoacute la evaluacioacuten de la liofilizacioacuten
y la prueba de estabilidad natural no eran los maacutes adecuados se decidioacute proseguir con ellos
apoyado por los resultados de Vemulapalli Bhonsle amp Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratacioacuten (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperacioacuten de microorganismos ademaacutes el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores
Tabla 14 Tabla de convenciones Siacutembolo Significado Siacutembolo Significado
SBE Si en buen estado A Algunos
SME Si en mal estado T Todos
NBE No en buen estado N Ninguno
NME No en mal estado NS No significativo (lt20)
+ Afirmativo S Significativo (201-309)
- Negativo MS Muy significativo (gt40)
NA No aplica I indeterminado
FS Al finalizar el secado AR Antes de reconstituir
Nota Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15 Aunque no tenga estructura de torta el liofilizado
es estable y funcional por ende utilizable No tiene estructura de torta y ademaacutes no es ni estable ni
funcional por ende no es utilizable
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1
Cepa Viales Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto de
torta
Fractura de
vial 1 2 3
CM
-CR
00
4
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I S Traslucido I + NBEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N S Cafeacute claro Porosa - SMEA -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR NS N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
43
CM
-CR
00
6
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR S S MS Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N NS NS Cafeacute claro Porosa - SBEA -
sm2sc AR S S S Cafeacute oscuro Porosa - SMET -
CM
-CR
00
7
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
s1 NA I I I Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR S I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS I S Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
CM
-CR
00
9
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I NS Traslucido I + NBE -
g2sc AR MS S S Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS S I Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sb AR N N NS Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sc AR N S NS Cafeacute oscuro Porosa - NMEA -
CM
-CR
01
0
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I S S Traslucido I + NMEA -
g2sc AR I MS MS Traslucido I + NMEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
44
Nota Datos de las propiedades fiacutesicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad
natural salvo por el encogimiento que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa) los
demaacutes caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual Se subrayan las
anomaliacuteas encontradas a lo largo de la prueba
g Liofilizados con glucosa como protector
s Liofilizados con sacarosa como protector
sm Liofilizados con leche descremada como protector 1 Formulacioacuten congelada 2 Liofilizados almacenados a temperatura ambiente sa Serie A (antes de rehidratar) sb Serie B (antes de rehidratar) sc Serie C (antes de rehidratar)
1 Concentracioacuten uno del lioprotector
2 Concentracioacuten dos del lioprotector
3 Concentracioacuten tres del lioprotector
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la prueba de
estabilidad acelerada
Nota Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquiacute mencionados corresponden solo a aquellos
que contienen sacarosa al 10 (lioprotector general) Se consignan aquiacute los datos generales de los
liofilizados indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas
a Liofilizados de la prueba de estabilidad natural
b Liofilizados de la liofilizacioacuten definitiva
c Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada 1 Formulacioacuten congelada 2 Viales almacenados a temperatura ambiente 3 Vial usado en la caacutemara de envejecimiento
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto
de torta
Fractura
de vial Viales
a1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
a2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
b1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
b2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
c1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
c2 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR NS Blanco Porosa - SBE -
c3 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR S Blanco Porosa - SME -
45
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes De izquierda a derecha
liofilizados de prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva prueba de estabilidad acelerada
552 Contaminacioacuten
Se encontroacute contaminacioacuten durante la rehidratacioacuten de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006 en tanto que las siembras preliofilizacioacuten no presentaban contaminacioacuten alguna por ello
se tomaron tres viales maacutes que iban a ser rehidratados en la serie B encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilizacioacuten de esta cepa
Las demaacutes cepas no presentaron contaminacioacuten en ninguna prueba realizada
553 Tiempo de redisolucioacuten
Al medir el tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten en cada una de las rehidrataciones se
observoacute que la glucosa tardoacute maacutes tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros
lioprotectores llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Voacutertex en los viales
maacutes concentrados para su total redisolucioacuten Ademaacutes se encontroacute en todos los lioprotectores que
conforme la concentracioacuten aumentaba maacutes tiempo se necesitaba para la reconstitucioacuten de la
formulacioacuten es decir que el tiempo es directamente proporcional a la concentracioacuten de
lioprotector
Al comparar el tiempo de reconstitucioacuten de los viales que conteniacutean el lioprotector general
en la prueba de estabilidad natural con los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales de la
prueba de estabilidad acelerada no se encontraron diferencias significativas sin embargo el vial
de la prueba de estabilidad acelerada que duroacute siete (7) diacuteas en caacutemara de envejecimiento se
reconstituyoacute un segundo menos aproximadamente respecto a los otros viales
46
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado
Lioprotector Tiempo (min)
Glucosa 10 1
Glucosa 117 15
Glucosa 27 120
Sacarosa 4 05
Sacarosa 10 05
Sacarosa 15 06
Leche descremada 10 025
Leche descremada 15 033
Leche descremada 20 05
Estabilidad natural 05
Liofilizacioacuten definitiva 025
Estabilidad acelerada 004
Nota El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada
uno liofilizados con el lioprotector general
56 PRUEBAS ADICIONALES
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica
En la Figura 16 se observa un aumento draacutestico del peso de los viales dentro de la ventana
de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados
al vaciacuteo) Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vaciacuteo) no tuvieron un aumento en
peso tan draacutestico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante Al cabo de cincuenta
(50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente No se encontroacute
por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vaciacuteo
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector La ecuacioacuten presentada pertenece a la liacutenea de tendencia logariacutetmica
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinacioacuten Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba
0 10 20 30 40 50 60
vial (518055g) 0 00724 00772 00782 00840 00869 00849
Criovial (19018g) 0 00079 00158 00315 00473 00578 00605
Promedio 0 00401 00465 00549 00656 00724 00727
y = 00365ln(x) + 00058
Rsup2 = 09647
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
01
AU
MEN
TO D
E P
ESO
(W
)
47
562 Prueba de estabilidad acelerada
Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFCml antes de la liofilizacioacuten al
rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 8398 sin embargo al rehidratar el vial 2 luego de su
estadiacutea en la caacutemara de envejecimiento la BSR fue de 0 Las propiedades fiacutesicas generales de
estos viales son presentadas en la Tabla 15
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN
571 Base de datos
Se eliminoacute una tabla sobrante (constituiacutea informacioacuten redundante de las cepas) dentro de la
base de datos correspondiente a la seccioacuten de criopreservacioacuten Adicionalmente se reorganizoacute la
base de datos al introducir la seccioacuten de liofilizacioacuten y la de refrigeracioacuten Este uacuteltimo meacutetodo de
preservacioacuten fue mencionado en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) pero no fue anexado
sin embargo aunque se incluyoacute la seccioacuten en el banco de cepas debe mencionarse que no existen
registros de las cepas que se hallan conservado por este meacutetodo aun asiacute se decidioacute dejar la seccioacuten
para que lo ocupen trabajos posteriores Ademaacutes se encontroacute que en el Freezer existiacutean colecciones
que no figuran en la base de datos no existen registros de ninguacuten tipo ni caracterizacioacuten alguna en
medios digitales La base de datos quedoacute organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5
Figura 17 Organigrama de la base de datos
572 Fichas de resumen
Las fichas de acceso inmediato designadas como ldquofichas de resumenrdquo para cada coleccioacuten
fueron ubicadas seguacuten el sitio de almacenamiento tanto para las cepas criopreservadas como para
las liofilizadas y refrigeradas Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas las fichas
resumen de este meacutetodo fueron dejadas en blanco para futuras colecciones El formato de las fichas
resumen se presenta en el anexo 6
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se encontroacute que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulacioacuten que
permite la faacutecil confusioacuten entre colecciones criopreservadas sin embargo se decidioacute dejar las
etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martiacutenez amp Mayorga (2013) entre
otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener
que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondriacutea una confusioacuten entre nuevas
y viejas colecciones Este problema fue solucionado con la reorganizacioacuten de la base de datos y las
fichas de resumen
Base de datos del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Informacioacuten de los
microorganismos de
cada coleccioacuten
Meacutetodo de conservacioacuten de cepas
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten
Liofilizacioacuten
48
574 Formatos de control del banco de liofilizados
Se decidioacute que los formatos de control para la seccioacuten de liofilizacioacuten del Banco Geneacutetico
fueran similares tanto para la criopreservacioacuten como para la liofilizacioacuten obedeciendo sus
diferencias a las caracteriacutesticas y datos propios de cada meacutetodo Se encontroacute que los formatos de
la seccioacuten criopreservacioacuten no habiacutean sido llenados nunca desde su creacioacuten Estos se muestran en
el anexo 7
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten
Se editoacute la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martiacutenez amp
Mayorga (2013) Partiendo de esta cartilla se elaboroacute un manual maacutes completo (anexo 8)
introduciendo todos los procedimientos para la liofilizacioacuten las diferentes teacutecnicas empleadas en
los procesos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se complementoacute tambieacuten la seccioacuten sobre el
proceso de refrigeracioacuten y se reescribieron algunos conceptos erroacuteneos de la edicioacuten anterior No
se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservacioacuten pero si
se realizaron pequentildeos ajustes de forma o de edicioacuten
49
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
La recuperacioacuten de microrganismos por criopreservacioacuten se realizoacute de acuerdo a los
lineamientos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) durante todas sus etapas sin embargo
la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la
criopreservacioacuten de la cepa o inclusive en la etapa de descongelacioacuten Garciacutea y Uruburuacute (citados
por Aacutengel A 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y
estabilidad de los organismos conservados edad celular velocidad de congelacioacuten y
descongelacioacuten temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores Dado que las cepas
CM-CR004 006 007 010 e incluso la 009 (que remplazoacute a CM-CR005) presentaron muy buenos
niveles de recuperacioacuten (Figura 8) el factor maacutes probable de falla corresponde al crioprotector
utilizado ya que en el caso del Banco Geneacutetico el crioprotector es general para toda la coleccioacuten
de bacterias y la eleccioacuten del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A
2006) puesto que la efectividad de la criopreservacioacuten se puede ver afectada por las caracteriacutesticas
propias de cada cepa (Hubaacutelek 2003) las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector
Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la
viabilidad los organismos conservados por este meacutetodo sobreviven largos periacuteodos por la
reduccioacuten marcada de su ritmo metaboacutelico incluso por maacutes de 30 antildeos (Gonzaacuteles et al 2006) lo
cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector
como elemento de falla en la conservacioacuten de la cepa perdida
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una uacutenica
liacutenea celular por tanto las caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificacioacuten preliminar Sin embargo estos mismos autores
sentildealan que estas caracteriacutesticas no son uacutenicas ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares como sucedioacute con CM-CR007 y 010 por ello fue preciso observar las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas microscoacutepicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquiacutemicas) de las cepas pero dada la simplicidad de las descripciones microscoacutepicas de
Rodriacuteguez (2013) no se tuvo como principal referencia de identidad Aunque la morfologiacutea de la
colonia depende considerablemente de la composicioacuten del medio de cultivo y las condiciones de
incubacioacuten cuando eacutestas son controladas suelen ser invariables teniendo por lo general un valor
diferencial considerable (Diacuteaz 2009) por lo tanto se tomaron estas caracteriacutesticas como las
principales para la evaluacioacuten de los indicadores de estabilidad morfoloacutegica y pureza
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que ldquolos medios soacutelidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamientordquo (paacuteg 2) Sin embargo se observaron
algunas variaciones las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio Esto se
observoacute maacutes en las cepas CM-CR007 y 010 que al revisar los datos de Martiacutenez amp Mayorga (2013)
y Rodriacuteguez (2013) estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio huacutemedo
tendiacutean a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican Loacutepez T amp Torres (2006)
en bacterias moacuteviles en tanto que sin niveles altos de humedad las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en funcioacuten del tiempo (envejecimiento de la colonia) Esto derivoacute en la
observacioacuten y descripcioacuten de caracteriacutesticas macroscoacutepicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad como son descritas en las Tablas 8 9 10 11 y 12 para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) diacuteas que duroacute la prueba de estabilidad
natural se observoacute que en general de los tres lioprotectores los resultados maacutes bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones Esto tiene su explicacioacuten en las propiedades reductoras
que poseen los monosacaacuteridos ya que como lo menciona Cox C S (citado por Hensel 1994) los
efectos letales de la desecacioacuten se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteiacutenas
de la membrana celular y azuacutecares reductores que aumentan conforme avanza la deshidratacioacuten
(glicacioacuten) si las proteiacutenas de membrana integrales o citosoacutelicas se ven dantildeadas de forma
irreversible durante el secado tendriacutea un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al 1995)
impidiendo la reconstitucioacuten de forma adecuada de las bacterias y por ende generando muerte
celular Sin embargo las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta especialmente en la concentracioacuten maacutes baja incluso para CM-CR007 la glucosa al 10 se
erige como el segundo mejor protector Es probable que estas dos cepas presenten una
configuracioacuten diferente de sus proteiacutenas de membrana que impida la reaccioacuten amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra que proteja a las proteiacutenas de membrana o
citosoacutelicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteiacutenas)
Es conocido que en general los disacaacuteridos mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan Herman White amp Vesey
2006) esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13
A diferencia de la glucosa la sacarosa es un azuacutecar no reductor estos pueden proteger las
ceacutelulas al competir por la unioacuten en la membrana con los azucares reductores (Hensel 1994) Se ha
demostrado que la sacarosa mantiene las proteiacutenas secas igual que en sus conformaciones
hidratadas Leslie et al (1995) indican que este fenoacutemeno sucede probablemente ldquomediante la
unioacuten a los dominios hidroacutefilos de las proteiacutenas y la prevencioacuten de enlaces de hidroacutegeno inter e
intra proteiacutenas durante el secado y la reconstitucioacutenrdquo (paacuteg 3596) lo cual contribuye a las altas tasas
de supervivencia al usar este lioprotector
Para que un protector funcione eacuteste debe proteger la bicapa lipiacutedica y para ello debe existir
dentro y fuera de las ceacutelulas (Leslie et al 1995 Palmfeldt et al 2003) el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transicioacuten de
membrana ya que en eacutesta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentracioacuten (Leslie et al 1995) reemplazando el agua intracelular lo cual se conoce como la
hipoacutetesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al 2003) Si esto se cumple la concentracioacuten
intracelular seraacute alta y el tiempo antes de la congelacioacuten y el secado debe ser corto por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequentildeo (Leslie et al 1995) y los productos polares
extracelulares seraacuten miacutenimos
Ademaacutes tanto la glucosa y la sacarosa estaacuten dentro de la categoriacutea de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo este estado viacutetreo ldquoInduce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una ceacutelula para detener la movilidad
molecular a un miacutenimo El vidrio amorfo inerte tambieacuten es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las ceacutelulas dentro de la estructura de vidrio antes de la congelacioacuten lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquiacutemicos irreversibles en la
membrana plasmaacutetica durante el almacenamientordquo (Morgan et al 2006 paacuteg 186)
51
La retencioacuten de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilizacioacuten
como en la criopreservacioacuten
Cabe mencionar que el proceso de deshidratacioacuten y de reemplazo de agua intracelular por
parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un liacutemite ya que como lo
menciona Heckly (citado por Perry 1995) al congelarse el agua del medio las ceacutelulas sufren
deshidratacioacuten reduciendo el punto de congelacioacuten en el interior y evitando la formacioacuten de
cristales de hielo pero al seguir bajando la temperatura las concentraciones de solutos aumentan
Perry (1995) cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelacioacuten estaacuten posiblemente
asociados a estas soluciones excesivamente concentradas puesto que no se han encontrado
evidencias de lesiones mecaacutenicas por hielo extracelular Esto corresponderiacutea con los resultados
obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores como lo fue la glucosa al 27 en casi
todas las cepas (exceptuando CM-CR006 Figura 10) recordando que un protector funciona mejor
en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmoacutetico con el interior de las bacterias (conocer
la concentracioacuten intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilizacioacuten
por parte de eacuteste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo como se muestra en el
trabajo de Palmfeldt et al (2003)
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta un ejemplo claro es la cepa CM-CR004 la cual de hecho ante los
gluacutecidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentoacute resultados aceptables Morgan et al
(2006) mencionan (teniendo como referencia la investigacioacuten de Buitink et al) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteiacutenas presentes en esta sustancia son
maacutes estables y juegan un importante papel en la formacioacuten del estado viacutetreo lo cual induce a pensar
que una oacuteptima mezcla de proteiacutenas y azucares permite una proteccioacuten maacutes eficiente Esta
posibilidad corresponderiacutea a los resultados obtenidos donde la concentracioacuten de los componentes
de la leche descremada seriacutean propicios para la cepa CM-CR004 en tanto que para las demaacutes cepas
seriacutean maacutes bajas o maacutes altas de lo propicio Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de gluacutecidos y proteiacutenas que la componen pero no
establece cuales son estos pudiendo ser positivos o negativos para la liofilizacioacuten
En general los cultivos liacutequidos ofrecen un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables (Ops
Diagnostics 2015) sin embargo la viabilidad depende muacuteltiples factores incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos El medio SMPG estaacute disentildeado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse raacutepidamente la fuente de carbono (glucosa) una bacteria
de raacutepido crecimiento entraraacute en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio una
de lento crecimiento al cabo del mismo tiempo estaraacute en fase log no obstante en el medio SPC
los nutrientes tardan maacutes tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas todas las bacterias
estaraacuten en fase log Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de raacutepido crecimiento mientras que
CM-CR004 006 y 009 son de crecimiento un poco maacutes lento (datos obtenidos del conteo con
caacutemara de Neubauer no incluidos en el presente estudio)
Morgan et al 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisioloacutegicos
en las bacterias relacionado generalmente con la privacioacuten de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles desencadenando una respuesta ante el estreacutes para permitir la
supervivencia de la poblacioacuten celular Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecacioacuten y las temperaturas menos propicias para su crecimiento por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilizacioacuten Sin embargo la
fase de crecimiento oacuteptima para la supervivencia en la desecacioacuten es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al 2006 paacuteg 185) Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14 indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
liacutequido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log asiacute mismo las cepas CM-CR004 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria pudiendo ser mayor o menor
En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilizacioacuten definitiva se observoacute puffing
y pitting y si bien Vemulapalli et al (2015) indican que estos cambios no afectan la calidad del
producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada Jennings (2008) advierte que su
presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada y que esta puede
deberse a un sistema con composicioacuten diferente de la formulacioacuten principal y podriacutea conducir a
interacciones tales como la agregacioacuten de proteiacutenas ademaacutes se observoacute (Figura 15 izquierda y
centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulacioacuten inicial de glucosa y
sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16) ldquodebido a una accioacuten combinada de la fusioacuten
(maacutes o menos importante) y de la presioacuten reducida dando lugar al puffingrdquo (Ticoacute G 1987 paacuteg
70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings 2008) seguacuten la cantidad del
material afectado por el puffing Esta caracteriacutestica se asocia con un error en los paraacutemetros de
liofilizacioacuten por ello se revisoacute exhaustivamente el proceso de liofilizacioacuten encontrando que los
liofilizados alcanzaron la temperatura de fusioacuten durante el proceso de secado primario por la
inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador el cual no habiacutea sido descrito en el
proceso piloto de liofilizacioacuten con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del
control de calidad A causa de esto los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los
uacutenicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha)
Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura
a los -32 y -42 degC asiacute como un melting inicial a -32degC y -42degC respectivamente seguacuten lo reporta
Moreira Gutieacuterrez amp Delgado (1994) Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento
del liofilizador
Las Tablas 15 y 16 que resumen las caracteriacutesticas tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados muestran que el color textura brillo y fractura de viales estaacuten dentro de los
paraacutemetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilizacioacuten correcta
con las formulaciones utilizadas no obstante se detectaron variaciones posliofilizacioacuten
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales Inicialmente se pensoacute
en una falla durante el tiempo de almacenamiento dado que los liofilizados maacutes afectados fueron
de las series B y C sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada se determinoacute que la causa de fallo yaciacutea en la
obtencioacuten de humedad por parte del producto liofilizado La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vaciacuteo absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vaciacuteo estos habiacutean absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilizacioacuten esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscoacutepica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad maacutes bajo que la sacarosa) debido a la
53
ldquofacilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidroacutegeno con el aguardquo (Badui
Dergal 2006 paacuteg 73) ldquoPara reducir el nuacutemero de moleacuteculas de agua el proceso de liofilizacioacuten y
el sellado de los viales al vaciacuteo debe haber sido exitoso y asiacute obtener un producto con el contenido
de humedad deseadordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 78) por lo cual se descarta la utilizacioacuten del
instrumento manifold para la liofilizacioacuten cepas en el Banco Geneacutetico
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilizacioacuten siempre deben ser
de vidrio ya que el vapor de agua atmosfeacuterico se puede difundir a traveacutes de los tubos de plaacutestico y
por ende las muestras secas terminariacutean absorbiendo agua Esto se comproboacute con la utilizacioacuten de
crioviales que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vaciacuteo sino que ademaacutes en
la serie C casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dantildeados presentaban
cambios de coloracioacuten (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloracioacuten
oscura como lo muestra la Tabla 15) o una marcada reduccioacuten en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentracioacuten) Esto tambieacuten se ve correlacionado con la peacuterdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008) la
humedad es la principal responsable en la peacuterdida de viabilidad en el producto liofilizado
reduciendo la vida uacutetil de los organismos La obtencioacuten de agua implica un retroceso del proceso
de liofilizacioacuten el dantildeo de la matriz formada el flujo de los residuos extracelulares polares es
decir la reactivacioacuten del organismo ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquiacutemica el metabolismo (Adams 2007) finalmente la muerte celular al agotarse esta
El tiempo de redisolucioacuten y el tipo de reconstituyente tambieacuten es de gran importancia La
Tabla 17 muestra tiempos de redisolucioacuten bastante altos para las formulaciones de glucosa Con
los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisioacuten del proceso de liofilizacioacuten se determinoacute la
retrofusioacuten producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de
redisolucioacuten causando un efecto grave donde la interaccioacuten entre las moleacuteculas es tal que la matriz
del liofilizado es casi insoluble (Jennings 2008) El aumento de la temperatura demasiado raacutepido
en el proceso de la liofilizacioacuten o por encima de Tg resultoacute en el colapso haciendo la
reconstitucioacuten mucho maacutes difiacutecil (Fetterolf 2010) Jennings (2008) indica que un aumento en el
aacuterea superficial por unidad de volumen de la torta tenderaacute a disminuir el tiempo de reconstitucioacuten
lo cual sucedioacute para todos los liofilizados que presentaron melting puffing y pitting ya que su
volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulacioacuten congelada solo los
liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulacioacuten
congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitucioacuten
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed amp Roos (2004) quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo se sugiere en muacuteltiples estudios
ademaacutes el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4degC plusmn 1degC en la
oscuridad (Ops Diagnostics 2015)
Se siguioacute los procedimientos de documentacioacuten establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
para la criopreservacioacuten y la elaboracioacuten de los nuevos protocolos de liofilizacioacuten encontrando
como lo menciona Gonzaacuteles et al (2006) que es necesario contar con sistemas de documentacioacuten
eficiente ademaacutes contar con duplicados de la informacioacuten en medios fiacutesicos y magneacuteticos evitado
la perdida de informacioacuten (Montes de Oca et al 2008) y el raacutepido acceso a la misma
54
7 CONCLUSIONES
En general el estado de criopreservacioacuten de las cepas evaluadas es oacuteptimo obteniendo tasas
de supervivencia satisfactorias Sin embargo el criopreservante no funciona de igual forma para
todas las cepas debido a las caracteriacutesticas propias de cada organismo que limitan la accioacuten del
glicerol
De acuerdo a la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten realizada con los tres indicadores
(viabilidad pureza y estabilidad morfoloacutegica) la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados siendo la concentracioacuten al 10pv la maacutes oacuteptima No obstante su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado hermeacuteticamente y al vaciacuteo El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada aunque no se determinoacute la concentracioacuten maacutes oacuteptima
En cuanto a la glucosa al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo se observa
que pese a no ser un buen lioprotector concentraciones de glucosa entre el 6 y el 10 pv son
funcionales aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50
No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten estos
fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminacioacuten de las muestras y a su
vez evitar la contaminacioacuten por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso
Se creoacute el protocolo para el proceso de liofilizacioacuten en todas sus etapas Este es
metodoloacutegicamente funcional y faacutecilmente reproducible por ello se estandariza para el Banco
Geneacutetico seccioacuten liofilizacioacuten dentro del nuevo manual de procedimientos de conservacioacuten Se
incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservacioacuten dentro de este
manual ajustado a las necesidades especiacuteficas de seguridad de la liofilizacioacuten
Es importante mantener actualizado los diferentes medios fiacutesicos y magneacuteticos donde reposa
la informacioacuten de las colecciones y los microorganismos en ellos dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Geneacutetico y la informacioacuten se puede perder
La falta de la identificacioacuten hasta cepa (al menos hasta geacutenero) de los microorganismos
presentes en el banco geneacutetico limita la informacioacuten para entender los fenoacutemenos relacionados a
los procesos de conservacioacuten y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo
55
8 RECOMENDACIONES
Existen paraacutemetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente como la edad del cultivo la
concentracioacuten celular entre otros Se propone el estudio de los paraacutemetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilizacioacuten con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos por ello se sugiere la creacioacuten
de un modelo matemaacutetico para que sea funcional esta prueba lo cual generariacutea datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo
Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinacioacuten de lioprotectores con formadores
de matrices y estabilizantes siguiendo los protocolos establecidos Mezclas de sacarosa al 10 pv
con leche descremada 10 pv (de la misma marca usada en este estudio) sacarosa al 10 pv con
leche descremada 10 pv y carboacuten activado asiacute como la utilizacioacuten de estas mezclas con trehalosa
en distintas concentraciones son sugeridas
Es necesaria la creacioacuten de una plataforma online del banco geneacutetico una vez este cuente con la
identificacioacuten de los organismos contenidos asiacute mismo es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco geneacutetico distinto a Access preferiblemente que obedezca a una
creacioacuten propia de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Es necesaria la creacioacuten de una pasantiacutea anual para curaduriacutea del Banco Geneacutetico ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepcioacuten de cepas Ademaacutes se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas como aquellas que sean donadas al Banco Geneacutetico en el futuro
56
9 REFERENCIAS
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11 ANEXOS
Anexo 1 Formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-XX00Xa
Descripcioacuten Fotografiacutea
Borde o Margen
Frente a luz Brillanteopaca
Forma
Elevacioacuten
Color
Tamantildeo
Superficie
Consistencia
Grado de
Transparencia
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis
Pigmentos que desprende la colonia
y se observan sobre el medio
Olor
Hemolisis
MedioT(degC)
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen
un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace
la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad
del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos
Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen
Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta
Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
63
Anexo 2 Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados
a) Recubrimiento (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido cartoacuten y autoadhesivo de
emulsioacuten acuosa
b) Bandeja de liofilizados
c) Soporte para bandeja
d) Cojiacuten de siacutelice gel (reemplazo seguacuten el tamantildeo y cantidad de cojines de 2 meses a 1 antildeo)
El banco de liofilizados estaacute dividido en tres secciones
La seccioacuten de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A B y C respectivamente
La seccioacuten de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D E y F respectivamente
La seccioacuten de hongos (color cafeacute) correspondiente a las bandejas G H e I respectivamente
64
Bandeja de liofilizados
Estaacute hecha de poliestireno expandido viene con 100 compartimientos individuales para un maacuteximo
de 100 viales por bandeja
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
10 20
30 40
50 60
70
80
90 100
01
11 21
31
41
51
61 71
81
91
65
Anexo 3 Esquema general del cepario madre de liofilizados
J Hongos
K Bacterias
L Algas
F Fila
Nuacutemeros compartimento correspondiente a cada vial La numeracioacuten va en zigzag
J K L
F1 F1 F1 F2 F2 F2 F3 F3 F3
1
8 8 8
9 9 9 1 1
16 16 16 24 24 24
17 17 17
66
Anexo 4 Caacutemara de envejecimiento artesanal
Esta caacutemara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y
humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra La humedad relativa
puede controlarse seguacuten si se use agua (100) o una concentracioacuten determinada de solucioacuten salina
ver Colmenares R (2015)
Horno de 37degC (caacutemara externa)
Caacutemara
interna
Termoacutemetro
Tapa de sello
hermeacutetico
Malla de
soporte
Viales
Agua o sn salina
67
Anexo 5 Base de datos en Access
Esquema general de la Base de datos del Banco Geneacutetico
Espacio de trabajo con las tablas
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
informacioacuten
maacutes detallada)
68
Anexo 6 Formato de las Fichas Resumen
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FICHA RESUMEN DE LA COLECCIOacuteN
Ubicacioacuten de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Fuente de obtencioacuten
de las cepas
Fecha de
ingreso
Cantidad de cepas Tipo de organismos
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa)
Ubicacioacuten de cepas (seguacuten todos los meacutetodos
de conservacioacuten utilizados para la coleccioacuten)
Autores o donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos y Formatos de control
69
Anexo 7 Formatos de control de la seccioacuten liofilizacioacuten
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
Lugar (Ciudad y Paiacutes) Fecha de ingreso
Origen de
la cepa
Institucioacuten Organizacioacuten o
Empresa donante
Persona que realizoacute el
aislamiento
Cargo Fecha de
aislamiento
Informacioacuten de contacto
Fuente de obtencioacuten
de la cepa
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Identificacioacuten geneacutetica
de la cepa
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Calidad de la
cepa recibida
Restriccioacuten de
distribucioacuten
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Observaciones Nivel de
Bioseguridad
N1 N2 N3 N4
Persona donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
70
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL
FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN
CM-_ _0_ _
Proceso
Fecha Hora
Ciudad Equipo
Lioprotector y
concentracioacuten
Temperatura (degC)
Presioacuten (mbar)
Duracioacuten (min) Accesorio de
secado
Responsable (s) del proceso
Ubicacioacuten
Coacutedigo de la
cepa
Nombre de
la coleccioacuten
Viales
almacenados
Tipo S T Lf Total Sello al vaciacuteo SI NO
Cantidad Sello de Aluminio SI NO
Pruebas de
Viabilidad
Caracterizacioacuten
macroscoacutepica (resumen)
Caracterizacioacuten
microscoacutepica (resumen)
Concentracioacuten celular
(UCF)
Preliofilizacioacuten
Posliofilizacioacuten
Bioquiacutemicas
Otras
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
71
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS
CEPAS
CM-_ _0_ _
Detalles del
Proceso
Fecha Ciudad
Hora Coacutedigo de cepa
Viales a evaluar T S Lf Temperatura (degC)
Viales en mal estado T S Lf Presioacuten (Mbar)
Fecha de liofilizacioacuten Fecha de evaluacioacuten Total tiempo (meses)
Descripcioacuten
de la cepa
Geacutenero-especie del
microorganismo
Nombre de la
Coleccioacuten
Car
acte
riza
cioacuten
Microscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Microscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Observaciones
Viabilidad Concentracioacuten Celular
(UFC) Preliofilizacioacuten
Concentracioacuten Celular
(UFC) Posliofilizacioacuten
Observaciones
Control
de
Calidad
Bioquiacutemicas
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Pruebas
Cristal
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Otras Pruebas Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Observaciones
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
72
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD
DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS
CM-_ _0_ _
Lugar (Ciudad Paiacutes) Fecha
Informacioacuten
del
solicitante
Institucioacuten Organizacioacuten
o Empresa
Solicitante Cargo
Teleacutefono (s) Email
Descripcioacuten
de la cepa
Coacutedigo de
cepa
Geacutenero ndash especie
Microorganismo
Coleccioacuten
Utilizacioacuten de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
73
Anexo 8 Manual de procedimientos de conservacioacuten para el Banco Geneacutetico del Laboratorio
de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (Ver archivo adjunto)
Manual de procedimientos de
conservacioacuten para el Banco
Geneacutetico del Laboratorio de
Microbiologiacutea Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute
de Caldas
Primera Edicioacuten
Editado por
Andreacutes V Castantildeeda R
Manual de procedimientos de conservacioacuten para el
Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Ingenieriacutea Sanitaria
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
Licenciado en Biologiacutea
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales
Niria Pastora Bonza Peacuterez
Docente encargado del Laboratorio de Microbiologiacutea y
coordinador de Ingenieriacutea Sanitaria
Miguel Aacutengel Piragauta Aguilar
Disentildeo y diagramacioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
avicent29gmailcom
Autoriacutea y Edicioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda R
2015
Todos los derechos reservados
TABLA DE CONTENIDO
TIacuteTULO PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
RECEPCIOacuteN DE CEPAS 2
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS 3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES 5
Medios 5
Reactivos 6
Protectores generales 6
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN 7
Indicador uno Viabilidad 7
Conteo directo con caacutemara de neubauer (110mm) 7
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa 10
Indicador dos Estabilidad morfoloacutegica 12
Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) 12
Tincioacuten de gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) 13
Indicador tres Pureza de la cepa 13
RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS 14
Criopreservados (descongelamiento) 14
Liofilizados (rehidratacioacuten o reconstitucioacuten) 14
REFRIGERACIOacuteN 15
CRIOPRESERVACIOacuteN 16
Precriopreservacioacuten 16
Preparacioacuten del inoculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 16
LIOFILIZACIOacuteN 17
Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano 17
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 17
IV
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Posliofilizacioacuten 18
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos 18
ROacuteTULOS 19
Refrigeracioacuten 19
Criopreservacioacuten 19
Liofilizacioacuten 20
TIacuteTULO 2 PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONSERVACIOacuteN Y EN EL LABORATORIO
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN 23
Medios 23
Ambiente 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores 23
Cabina de flujo laminar 23
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 24
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS 24
Desechos no contaminados (no infecciosos) 24
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en
autoclave y reutilizado 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado 25
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa 25
BIOSEGURIDAD 26
Proteccioacuten personal 26
Procedimientos 27
Aacutereas de trabajo 27
Capacitaciones 27
REFERENCIAS 28
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dilucioacuten en serie 7 Figura 2 Conteo directo 8 Figura 3 Conteo en bacterias 8 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky 10 Figura 5 Contador de colonias 11 Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados 19 Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer 19 Figura 8 Roacutetulos para los crioviales 19 Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso 4 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG 5 Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos 5 Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos 6 Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer 9 Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 21
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIacuteMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL
kPa Kilo pascales
min Minutos
s Segundos
microl microlitros
mm miliacutemetros
degC grados Celsius
pv porcentaje peso a volumen
mTorr militorricelli
mbar milibar
g gramos
ml mililitros
UCF Unidades formadoras de colonias
rpm Revoluciones por minuto
vv Porcentaje volumen a volumen
iexclPrecaucioacuten
iexclA tener en cuenta
VI
INTRODUCCIOacuteN
Este manual representa en conjunto el trabajo a traveacutes del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigacioacuten han sentado los pilares para la formacioacuten del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC ) cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservacioacuten y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigacioacuten que permita a la comunidad acadeacutemica de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbioloacutegicos en las aacutereas de biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnoloacutegica para el paiacutes Aquiacute se presentan los tres meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos aplicados en este Banco Geneacutetico Refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten Se hace eacutenfasis en los diferentes procesos materiales equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Geneacutetico
Protocolos para la
conservacioacuten de
microorganismos
2
RECEPCIOacuteN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco geneacutetico debe contar con las siguientes condiciones miacutenimas de recepcioacuten
La cepa se debe encontrar en estado de pureza Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Geneacutetico
biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnologiacutea Debe contar con un responsable entidad o institucioacuten donante que respalde
la(s) cepa(s) entregadas ademaacutes de contar con la informacioacuten de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad
La cepa o coleccioacuten debe contar con toda la informacioacuten que el Banco
geneacutetico requiera para su mantenimiento conservacioacuten y registro en la base de datos
La cepa o coleccioacuten debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles
de Bioseguridad establecidos por la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) siendo el nivel de bioseguridad 2 el maacuteximo permitido por las instalaciones del laboratorio con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo
Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado
investigaciones entre otras) se debe pasar con 15 diacuteas de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS al docente encargado
Una vez recibida la cepa se diligencian los mismos registros en digital se
anexa la informacioacuten a la base de datos asignaacutendole un coacutedigo y se diligencian las fichas de resumen
3
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS El personal encargado del Banco Geneacutetico debe realizar una verificacioacuten de la
pureza de la cepa esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada sobre una o maacutes cajas de Petri con el medio de cultivo el tiempo y temperatura de incubacioacuten especificados por quien hace la donacioacuten Asiacute mismo a partir de este subcultivo se debe realizar la evaluacioacuten de la efica-cia del meacutetodo de conservacioacuten para verificar la informacioacuten dada por el investi-gador donante
Posterior al proceso de recepcioacuten de cepas es importante tener en cuenta
que se debe verificar la fecha de la uacuteltima siembra para determinar si es apro-piado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder despueacutes al proceso de criopreservacioacuten o liofilizacioacuten
Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las
cepas por maacutes de dos meses antes de la criopreservacioacuten o la liofilizacioacuten se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservaacutendola por el meacutetodo de refrigeracioacuten con el fin de evitar que la cepa se pierda
Si se requieren hacer pruebas bioquiacutemicas pruebas cristal u otras pruebas
complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos se tendraacute que pedir la autorizacioacuten del responsable del Banco Ge-neacutetico y del encargado del laboratorio debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposicioacuten de material en el laboratorio
Nota Si alguna cepa llegara a presentar contaminacioacuten se debe informar a la persona responsable del Banco Geneacutetico y posteriormente a la persona entidad o institucioacuten donante
4
EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservacioacuten
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso
Proceso o meacutetodo Equipo Material
Refrigeracioacuten Nevera Thermolab 14-E0107 Tubo de ensayo tapa rosca
Cabina de flujo laminar Asa redonda
Esterilizador de asas
Criopreservacioacuten
Cabina de flujo laminar Crioviales Voacutertex Puntas azules Micropipeta graduable de 100-1000 microl
Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la coleccioacuten
Frascos Schott con tapa para el glicerol
Pipeteador Pipeta de 1ml o 5ml
Liofilizacioacuten
Esterilizador de asas Asa redonda
Voacutertex Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Cabina de flujo laminar Puntas azules y amarillas Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile
Recipiente de poliestireno expandido cerrado
Crimper Sello de aluminio Micropipetas graduables de 100-1000microl y 20-200microl
Pinzas Vial 5mm con tapoacuten de divisioacuten
Evaluacioacuten del
meacutetodo de
conservacioacuten
Caacutemara de Neubauer 110mm Laminilla de cuarzo
Caacutemara AxioCam ICc5 Laminas porta objetos
Microscopio Axio Scope A1 Laminillas cubre objetos
Contador de colonias CC-1 Marcador
Estereoscopio Zeiss Asa redonda
Incubadora de 25degy 37degC Asa de Drigalsky
Micropipeta graduable 100-1000microl 20-200microl y 5-20microl
Puntas azules amarillas y blancas
Voacutertex Goteros
Recuperacioacuten de
los
microorganismos
Micropipeta graduable 100-1000microl y 20-200microl
Puntas azules y amarillas
Tubos de ensayo
Cabina de flujo laminar Cajas de Petri con medio
Plancha de calentamiento Mechero
Demaacutes equipos y materiales utilizados en la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten
Beaker
Termoacutemetro
Cajas de Petri con medio
Tubos de ensayo
-Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiologiacutea
5
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Geneacutetico cuenta con medios reactivos y protectores generales definidos para los meacutetodos de preservacioacuten manutencioacuten y recuperacioacuten de microrganismos Estos se describen a continuacioacuten y se clasifican de acuerdo al meacutetodo de conservacioacuten en la Tabla 4
Medios CALDO SMPG Este medio es empleado para el crecimiento del inoacuteculo inicial y
en la formulacioacuten de la criopreservacioacuten Su composicioacuten se muestra en las Tablas 2 y 3 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG
Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos
SPC (Standard Plate Count) Este medio se utiliza para la teacutecnica de evaluacioacuten
de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Tambieacuten puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas
Agar nutritivo (AN) o medios especiacuteficos Utilizados como medio de
mantenimiento o para pruebas bioquiacutemicas yo fisicoquiacutemicas (si se realizan) en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Buffer agua peptonada Este medio se utiliza en la rehidratacioacuten y en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 76
Microelementos 076
Peptona 1
Glucosa 01
MACROELEMENTOS Cantidad MICROELEMENTOS Cantidad
MgSO4 2 g CuSO4- 5H2O 005 g
NaNO3 2 g H3BO3 01 g
KCl 015 g MnSO4 ndash H2O 01 g
CaCl2 21 g ZnSO4 ndash 7H2O 01 g
Na2HPO4 09 g Agua destilada 1000 ml
FeSO47H2O 001 g
Agua destilada 1000 ml
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Reactivos Tincioacuten Gram La bateriacutea de reactivos para la Tincioacuten de Gram se utiliza en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Alcohol acetona Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo Agua destilada Se utiliza en todos los procedimientos para la preparacioacuten de
medios la descongelacioacuten y especialmente en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Alcohol Para desinfeccioacuten en todos los procedimientos (70) o para mecheros (95)
Aceite de inmersioacuten Se utiliza para la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten durante las observaciones microscoacutepicas
Nitroacutegeno Liacutequido Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilizacioacuten
Protectores generales Crioprotector Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservacioacuten en
proporcioacuten 67vv respecto al criovial Lioprotector Se utiliza una solucioacuten de Sacarosa 10 pv para las
formulaciones en la liofilizacioacuten bacteriana En hongos se utiliza leche descremada al 12 pv No se tiene detalles de lioprotector oacuteptimo en algas
Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos
Nota Dado que en la refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se realiza la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten se incluyen aquiacute los reactivos implicados en dicha evaluacioacuten
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten Liofilizacioacuten R
eacti
vos
Tincioacuten Gram SI SI SI
Alcohol acetona SI SI SI
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de inmersioacuten
SI SI SI
Nitroacutegeno Liacutequido NO NO SI
Me
dio
s
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios especiacuteficos
OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
Agua peptonada SI SI SI
Pro
tecto
r
Glicerol anhidro NO SI NO
Sacarosa 10pv
NO
NO SI
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EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN
Indicador uno Viabilidad Conteo directo con caacutemara de Neubauer (110mm)
Se parte de un tubo de dilucioacuten (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto el cual tiene por lo general un tiempo de incubacioacuten de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo Figura 1 Dilucioacuten en serie Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser esteacuteriles usando una nueva en cada transferencia El diluyente es agua peptonada al 01 pv
Tome la caacutemara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia
Observe las dos cuadriculas de la caacutemara que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H)
Agite el tubo de dilucioacuten seleccionado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s tomando con una micropipeta una aliacutecuota de 10microl y depositaacutendola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla dejando que se cargue por capilaridad de forma homogeacutenea (Figura 2-A) Posteriormente lleve al microscopio enfocando desde el menor aumento hasta eacutel objetivo 40x al tiempo que ajusta la intensidad lumiacutenica para poder observar las liacuteneas de la caacutemara y las ceacutelulas al tiempo
-Algunos modelos de Voacutertex no poseen un rango de velocidad sino de niveles -Para limpiar la caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo lave primero con agua destilada luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada Deje secar al ambiente -Para una correcta observacioacuten al microscopio utilice el meacutetodo de enfoque de Koumlhler -Procure no limpiar la laminilla con ninguacuten papel o pantildeo lo puede rayar -Este procedimiento debe durar maacuteximo 10min ya que la solucioacuten podriacutea secarse debido a la luz del microscopio
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Figura 2 Conteo directo A Utilizacioacuten de la caacutemara de Neubauer 1 posicioacuten de la laminilla 2 posicioacuten de la punta para el deposito de la muestra B esquema general de la caacutemara de Neubauer Adaptado de Bastidas (2015) httpwwwceleromicscomesresourcesdocsArticlesFormula-Camara-Neubauer-Concentracionpdf amp Universitat de Barcelona (2015) httpwwwubeduLabFisioimagesstoriesFisAnimalBiologiaSangrecontadorTomapng
El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central Las foacutermulas y los cuadros a contar se determinan seguacuten el tamantildeo del microorganismo
Hongos y microalgas Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes
(cuadros 1 y cuadro central Figura 2-B) de izquierda a derecha Bacterias Cuente en el cuadro central que contiene 25 cuadros secundarios
(Figura 2-B) 5 de ellos (Figura 3-A o B) Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios en estos las ceacutelulas deben contarse en la direccioacuten que se indica en la Figura 3-C Los cuadros terciarios contienen tres liacuteneas en los extremos por ello se deben tener en cuenta las ceacutelulas que esteacuten desde la liacutenea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D
Figura 3 Conteo en bacterias A y B Forma de contar los cuadros terciarios C Direccioacuten de conteo en los cuadros terciarios D Ceacutelulas a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios
9
Es importante resaltar que las bacterias que esteacuten unidas se contaraacuten como una Una vez obtenido el nuacutemero total de ceacutelulas se realizaran los caacutelculos correspondientes a los cuadros utilizados Para obtener el nuacutemero de bacterias se utiliza la ecuacioacuten planteada a partir de Bastidas (2015) Ndeg de bacteriasml=
En el caso de hongos y microalgas se utiliza la siguiente ecuacioacuten a partir de Bastidas (2015) Ndeg de ceacutelulasml= Fd Factor de dilucioacuten = Nota El meacutetodo de conteo en caacutemara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de ceacutelulas en los procedimientos de conservacioacuten de microorganismos Pero si se requiere la utilizacioacuten de otro meacutetodo se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados
Consideremos el siguiente ejemplo Tenemos un tubo con cultivo en medio liacutequido (10ml) de 36 horas este seraacute
nuestra muestra inicial Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con aliacutecuotas de 1ml en 9ml de diluyente Se realiza el procedimiento descrito en las paacuteginas anteriores haciendo un solo conteo Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de aliacutecuota g o ml de aliacutecuota + g o ml de diluyente
Ndeg Total de ceacutelulas contadas times 10000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
-El conteo directo con caacutemara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al meacutetodo de conservacioacuten evaluado
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
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Aplicando la ecuacioacuten para bacterias anteriormente mostrada tenemos que
Ndeg de bacteriasml=
= 81012 bacteriasml
81012 bacteriasml seraacute la cantidad de bacterias que ldquoexistenrdquo en la muestra inicial Esta en teacuterminos matemaacuteticos de las diluciones equivale a 100
Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas contando en los
cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuacioacuten tenemos que Ndeg de ceacutelulasml= = 321011 ceacutelulasml
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Seleccione tres tubos de la dilucioacuten seriada y de cada uno vierta aliacutecuotas de 100microl (agitando con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) antes de cada extraccioacuten) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio Raacutepidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky esteacuteril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky A La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atraacutes B Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro luego girar 90deg la caja y repetir el proceso
A B
90deg
16 times 250000
10-7 times 5
-Si se quieren datos maacutes fiables se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma aliacutecuota o poner en la caacutemara cinco aliacutecuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras -Al realizar el conteo en la caacutemara de Neubauer obtenemos el total aproximado de ceacutelulas presentes en la dilucioacuten utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado yo las impurezas que pueda contener la muestra por lo cual no es 100 exacto y no indica las ceacutelulas viables
16 times 10000 10-7 times 5
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Deje secar por miacutenimo 15min y lleve a incubacioacuten en posicioacuten invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja) Seguacuten el tipo de organismo las condiciones de incubacioacuten para la lectura de las cajas son
Bacterias temperatura ambiente 37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento
si se conoce Incubacioacuten de 18-24 horas Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas Casos extremos de crecimiento lento una semana
Hongos temperatura inferior a 25degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten de una siembra de solucioacuten de conidios de 4-8 diacuteas
Algas temperatura entre 25-37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten por maacuteximo 7 diacuteas en organismos descongelados o rehidratados
Luego de la incubacioacuten las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura
5) Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFCml)
Figura 5 Contador de colonias La caja de Petri se coloca en posicioacuten invertida y se marcan las colinas el contador cuenta al tacto
-La siembra por tubo se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador -Generalmente se toman las diluciones 10-5 10-6 y 10-7 Sin embargo si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3 10-4 y 10-5 -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70 flamear esperar a que el alcohol se consuma Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar por uacuteltimo palpe raacutepida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender para enfriar totalmente -Puede usarse una siembra en profundidad u otro meacutetodo para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie Sin embargo los demaacutes meacutetodos de conteo limitan la evaluacioacuten del indicador dos -Si al cabo de 30min las cajas no han secado el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condicioacuten -Con la punta de la micropipeta no toque el medio -Siempre use guantes y desinfeacutectelos constantemente durante los procedimientos
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En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250 al suponer que cada ceacutelula forma una colonia Para el caacutelculo de UFCml utilizamos una adaptacioacuten de la foacutermula de Valencia Z(2004)
UFCml = times times
Ejemplo 120 X 107 X 10 = 121010 UFCml
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten se calcula a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010) Tasa de supervivencia (BSR )=
Donde DD Despueacutes de la desecacioacuten AD Antes de la desecacioacuten
Indicador dos Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realiza Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas)
Diligenciar el formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas (anexo 1) descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de ldquoconteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Hay que tener en cuenta que
- Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas) de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas deben ser observadas en al menos el 80 de las colonias de la placa seleccionada
Ndeg de colonias (promedio entre las cajas por dilucioacuten)
Inverso del factor de dilucioacuten
Inverso del volumen de aliacutecuota
-La metodologiacutea y los criterios de eleccioacuten de cajas asiacute como el rango son seguidas de Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo todas las placas por dilucioacuten por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -El inverso del volumen de aliacutecuota corresponde a una medida de correccioacuten obligatoria para la siembra en superficie ya que en la praacutectica se aumenta en 110 el factor de dilucioacuten al sembrar 01ml (100microl) del tubo de dilucioacuten seleccionado
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100 Log (Ndeg UFCml AD)
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Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se realice una ldquocoloracioacuten de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005 paacuteg 24) En el caso de hongos realice una coloracioacuten simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado
Por uacuteltimo comparar los resultados con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y
macroscoacutepicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se toma registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio con caacutemara
Indicador tres Pureza de la cepa
Este indicador evaluacutea la pureza de un vialcriovial rehidratadodescongelado ademaacutes permite determinar si existe un cambio geneacutetico durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservacioacuten Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimaacutetica usando una bateriacutea de pruebas bioquiacutemicas o fisicoquiacutemicas diferenciales dependiendo de los requerimientos especiacuteficos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio Se recomienda realizar cada prueba por triplicado Tambieacuten puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales
-Realice una coloracioacuten de Gram estaacutendar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotograacutefico en un lapso no mayor a dos diacuteas -En los hongos es imprescindible el registro fotograacutefico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonoacutemica -El formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas exige un registro fotograacutefico pero alliacute solo se consignan si las fotografiacuteas son de alta calidad de lo contrario solo se dejan en la base de datos como referencia -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos -La estabilidad morfoloacutegica se evaluacutea pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -Para comparar las caracteriacutesticas macroscoacutepicas con la informacioacuten de origen se deben usar los mismos medios El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos
Si se confirma variacioacuten en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen y estas confirman la variacioacuten geneacutetica de la cepa inmediatamente se saca de la coleccioacuten origen se asigna un nuevo coacutedigo de identificacioacuten y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa Puede incluirse en la coleccioacuten Praacutecticas Acadeacutemicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva coleccioacuten
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RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento) Se toma un criovial (Semistock preferiblemente) sometieacutendolo a una
temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente 5min (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Los crioviales se introducen en bantildeo seroloacutegico una vez se llega a la temperatura deseada no antes
Del criovial se toma 1ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex
nivel 7 (asymp2240rpm) por 10s diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
La evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten se realiza al criovial luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubacioacuten (viables poscriopreservacioacuten) Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Geneacutetico
Liofilizados (Rehidratacioacuten o reconstitucioacuten)
Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC los viales a usar tomando el tiempo de rehidratacioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitando con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se toma un 1ml de este vial partiendo de esta aliacutecuota se realiza evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en medio soacutelido El indicador de viabilidad se evaluacutea solo con el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa u otro meacutetodo de conteo de organismos viables
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-dor donante sugiera otros meacutetodos de recuperacioacuten -La solucioacuten de rehidratacioacuten puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solucioacuten lioprotectora de la formulacioacuten -En el momento en que solo quede un criovialvial disponible de la cepa se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservacioacuten a partir de este
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REFRIGERACIOacuteN
Se implementa el meacutetodo de resiembra continua en este el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-Garciacutea et al 2010) cuando es utilizado para su almacenado nuevamente Se debe tener en cuenta los siguientes paraacutemetros
a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las
caracteriacutesticas del microorganismo ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios despueacutes de diacuteas semanas o meses Tambieacuten depende del tipo de medio de mantenimiento
b) El riesgo de contaminacioacuten y de cambios geneacuteticos se incrementa a mayor nuacutemero de transferencias
De acuerdo a esto para el laboratorio se determina
a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo
tapa rosca con Agar inclinado b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo procurando no
realizar maacutes de 4 transferencias c) La temperatura de refrigeracioacuten debe mantenerse en un rango de 4plusmn2degC d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminacioacuten
cruzada teniendo en cuenta la organizacioacuten interna del refrigerador evitando el amontonamiento de las cajas
e) Se utilizaraacute el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
f) Las cepas preservadas por este procedimiento seraacuten utilizadas para requerimientos internos del laboratorio preferiblemente en praacutecticas acadeacutemicas
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CRIOPRESERVACIOacuteN
Precriopreservacioacuten En el interior de la cabina de flujo laminar tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina Posteriormente son llenados con 1200microl de glicerol esteacuteril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados
Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de criopreservacioacuten (Martiacutenez amp Mayorga 2013) se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae una aliacutecuota de 1ml diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02)
Despueacutes agitar el tubo T02 con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s tomando
luego cinco aliacutecuotas de 600microl depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Se rotulan los crioviales y se realiza Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten Inmediatamente despueacutes de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente seguacuten la coleccioacuten a una temperatura de -85degC plusmn 1degC
Por uacuteltimo se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIOacuteN
culminado el proceso
-No use micropipeta para pipetear el glicerol -Todo el material debe ser correctamente esterilizado -Nunca tocar las tapas en el interior -De ser posible se recomienda una concentracioacuten de 10⁸ - 109 celml -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar 20min desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas (si se han determinado celml totales precongelamiento) -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables aumentando el nuacutemero de viables poscongelacioacuten Esto se puede hacer si no se tiene un nuacutemero determinado de ceacutelulas a una temperatura de 4degC plusmn 1degC por 20-30min -Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y poscriopreservacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas
17
LIOFILIZACIOacuteN Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano Desde medio soacutelido
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio soacutelido se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general Posteriormente se debe agitar con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Desde medio liacutequido
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra diluyeacutendolo en un tubo con 9ml agua destilada esteacuteril (designado como T04)
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten Desde medio soacutelido
Del tubo T03 como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten y previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 1ml que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Desde medio liacutequido
Del tubo T04 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 100microl depositados en cuatro viales de vidrio En cada vial se adiciona 900microl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapoacuten de divisioacuten
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior de cada vial
sea lo maacutes exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T04 se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparacioacuten
Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado en
tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T04
18
Con un volumen total de 1ml cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Los viales (indistintamente si se parte de medio soacutelido o liacutequido) se destapan parcialmente y se congelan en nitroacutegeno liacutequido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ge15min para ser llevados al liofilizador de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
Posliofilizacioacuten Luego del desmonte y sellado al vaciacuteo de los viales cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper posterior al proceso de liofilizacioacuten Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente El tercer vial (Lf) se almacena a 4degC plusmn 1degC en el cepario madre de liofilizados El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 diacuteas realizando evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten para saber si fue o no exitosa la liofilizacioacuten Por uacuteltimo se debe llenar el registro FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN culminado el proceso
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos En cuanto a los hongos el inoacuteculo inicial durante la preliofilizacioacuten se prepara
llenando con 10ml de agua destilada esteacuteril un cultivo soacutelido altamente esporulado del hongo Luego con un asa o espaacutetula esteacuteril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar Esta suspensioacuten es extraiacuteda con una pipeta esteacuteril y depositada en un tubo de ensayo al cual se le agrega 100microl de solucioacuten Tween 80 al 01 esteacuteril para preparar la solucioacuten de esporas Se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 20s y se prosigue de acuerdo a la ejecucioacuten de la liofilizacioacuten desde de un medio liacutequido
-Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y posliofilizacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas -Se debe realizar Voacutertex cada vez que se vaya a extraer una aliacutecuota -Los mejores resultados en la liofilizacioacuten se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas y en caldo SMPG un rango de 24-48h -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir maacutes tiempo del estipulado para su total congelamiento tener este dato de ser posible -El tiempo de liofilizacioacuten variacutea seguacuten la formulacioacuten Para una formulacioacuten con Sacarosa 10 36 horas es lo ideal -Debe usarse el accesorio para liofilizacioacuten Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vaciacuteo y de forma hermeacutetica -Los tapones de divisioacuten deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimacioacuten del agua de lo contrario no seraacute posible la liofilizacioacuten y pueden incluso quebrarse
-Si el raspado contiene rastros grandes de agar se debe realizar un filtrado con gasa esteacuteril aunque esto disminuiraacute el nuacutemero de esporas -Las esporas en solucioacuten pierden viabilidad conforme avanza el tiempo Se sugiere hacer uso de la solucioacuten antes de dos horas de preparada
19
ROacuteTULOS
Refrigeracioacuten Dado que la refrigeracioacuten constituye un meacutetodo de corto plazo no se
requieren roacutetulos especiales para este meacutetodo de conservacioacuten Sin embargo es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente informacioacuten con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha
Criopreservacioacuten
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los roacutetulos de coleccioacuten usados en las cajas del Freezer y los roacutetulos para cada cepa criopreservada
Fecha de ingreso__________________________ Medio___________________________________ Cepa____________________________________ Coacutedigo__________________________________
-Es opcional imprimir este roacutetulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta
Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer
Figura 8 Roacutetulos para los crioviales
Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados
20
Liofilizacioacuten
Los roacutetulos de la Figura 9 contienen la siguiente informacioacuten Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de
datos el Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo) nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten
de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6) con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada
vial Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
-Los roacutetulos de las cajas del Freezer los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo -Los roacutetulos deben colocarse antes de su almacenamiento especialmente los crioviales ya que una vez congelados el adhesivo no funciona
21
Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio (paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
CC en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual moderado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro Existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o indirectamente Normalmente no existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005)
-En la base de datos del Banco Geneacutetico se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos pero el formato y tamantildeo de letra sea igual para todos los roacutetulos -Las etiquetas de liofilizacioacuten y criopreservacioacuten deben imprimirse en papel adhesivo -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos
22
Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservacioacuten y en
el laboratorio
23
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121degC y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro meacutetodo de esterilizacioacuten las puntas de micropipetas los viales crioviales y sus respectivas tapas deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas) pueden ser esterilizados en horno a 160degC por 120min
Sin embargo se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de
todo el trabajo desde la preparacioacuten de medios hasta el sellado de viales y crioviales como se describe a continuacioacuten
Medios Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Son indicadores de contaminacioacuten cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios soacutelidos
Ambiente Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto) evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas El periodo de exposicioacuten va de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo Se recomienda que con un nuacutemero superior de cinco colonias en el control se desinfecte el aacuterea de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminacioacuten Cabina de flujo laminar
Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4 horas Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar
24
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70 al inico durante y al final del trabajo con cada cepa
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005) los residuos se pueden clasificar en cinco grupos La eliminacioacuten de residuos en el laboratorio de microbiologiacutea no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas por ello los desechos se dispondraacuten de la siguiente forma
Desechos no contaminados (no infecciosos) Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que
incluso pueden reutilizarse o reciclarse como el papel
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservacioacuten requiere
de material corto-punzante se cuenta con un guardiaacuten para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plaacutesticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestioacuten Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposicioacuten final de este material
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado
Las cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 20 minutos Posterior al proceso de autoclavado se deben someter a un proceso de desinfeccioacuten con hipoclorito al 15 durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jaboacuten neutro
Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas en todo caso deberaacuten tener el mismo proceso de desinfeccioacuten anteriormente mencionado
25
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado todos los desechos producidos en cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 15 minutos posterior a este proceso se descartaraacute el contenido de las cajas de Petri disponieacutendolos en bolsas rojas para residuos peligrosos Por otra parte los desechos liacutequidos deberaacuten ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa
No es directriz del laboratorio ni del Banco Geneacutetico la incineracioacuten de ninguacuten tipo de material o residuo peligroso solo de su disposicioacuten y almacenaje seguacuten lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos
26
BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2 es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos estos son
ldquoAgentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente La exposicioacuten en el laboratorio puede provocar una infeccioacuten grave pero existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces y el riesgo de propagacioacuten es limitadordquo (OMS 2005 paacuteg 1)
El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Geneacutetico Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005)
Proteccioacuten personal El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial
Se recomienda el uso de batas blancas manga larga y bien abotonada con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar ensuciar o para prevenir alguacuten accidente
Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas bufandas o gorras
Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupcioacuten
Se debe utilizar proteccioacuten ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos
Debe respetarse la prohibicioacuten de beber comer masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como boliacutegrafos ademaacutes de tocarse los ojos y nariz
27
Procedimientos Estaacute estrictamente prohibido pipetear con la boca se deben utilizar
pipeteadores mecaacutenicos Todos los cultivos stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un meacutetodo de descontaminacioacuten aprobado como por ejemplo mediante autoclave
Aacutereas de trabajo Las superficies de trabajo se descontaminan como miacutenimo una vez por diacutea
y luego de todo derrame de material contaminante
En las zonas de trabajo estaraacute prohibido comer beber fumar aplicar cosmeacuteticos manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en aacutereas de trabajo
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ninguacuten momento ropa u objetos personales
Capacitaciones Los encargados del Banco geneacutetico y del laboratorio deberaacuten estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma maacutes eficaz y asiacute reducir riesgos en el proceso
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado asiacute como de las maquinas y elementos del laboratorio
28
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REFERENCIAS
29
Anexos y formatos
30
31
32
BANCO DE LIOFILIZADOS
33
CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
34
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
FORMATO PARA CARACTERIacuteSTICAS MACROSCOacutePICAS DE LAS CEPAS
35
FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN
36
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN LIOFILIZACIOacuteN
37
38
39
40
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN CRIOPRESERVACIOacuteN
41
42
43
44
45
553 Tiempo de redisolucioacuten 45
56 PRUEBAS ADICIONALES 46
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica 46
562 Prueba de estabilidad acelerada 47
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN 47
571 Base de datos 47
572 Fichas de resumen 47
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer 47
574 Formatos de control del banco de liofilizados 48
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten 48
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS 49
7 CONCLUSIONES 54
8 RECOMENDACIONES 55
9 REFERENCIAS 56
10 BIBLIOGRAFIacuteA 60
11 ANEXOS 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten 16
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado 17
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua 18
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten 19
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes 21
Figura 6 Metodologiacutea 23
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 28
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelacioacuten 35
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 38
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilizacioacuten definitiva por cepa bacteriana 41
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes 45
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales 46
Figura 17 Organigrama de la base de datos 47
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas 24
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten 27
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 28
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales 29
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada 31
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados 33
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten) 34
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004 36
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006 36
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007 37
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009 37
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010 38
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad 41
Tabla 14 Tabla de convenciones 42
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1 42
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada 44
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado 46
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencioacuten de los microrganismos y dada su importancia se han
creado colecciones bioloacutegicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologiacutea Existe variedad de meacutetodos de preservacioacuten en este trabajo se determinoacute el estado
de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad estandarizando e
implementando ademaacutes el sistema de liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos
evaluaacutendolos frente a tres compuestos protectores Se realizoacute una evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten teniendo como base tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
encontrando que el sistema de criopreservacioacuten implementado en el laboratorio es oacuteptimo y el
glicerol al 67vv funciona para casi todas las cepas por largos periacuteodos de tiempo la sacarosa
10pv resultoacute ser el mejor lioprotector de los tres evaluados designaacutendolo como lioprotector
general para el laboratorio Se creoacute un manual de laboratorio para la conservacioacuten de cepas que
incluye los protocolos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten y de seguridad de los mismos Este
trabajo aporta al campo de la microbiologiacutea de la conservacioacuten y constituye un peldantildeo maacutes para
el registro del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes
PALABRAS CLAVE Criopreservacioacuten liofilizacioacuten lioprotectores conservacioacuten
microorganismos
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and given its importance have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology Exists variety of methods of preservation in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing standardizing and further
implementing the system freeze-drying taking as a starting point to them evaluating them against
three protective compounds An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators
viability morphological stability and purity was performed finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67 vv works for almost all strains for long
periods of time sucrose 10 wv lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory It was created a manual for conservation
laboratory strains including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions
KEYWORDS cryopreservation freeze-drying lyoprotectants conservation microorganisms
11
1 INTRODUCCIOacuteN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible pues como lo menciona
Hurtado (2009) la vida no es posible sin la actividad de estos ya que estaacuten involucrados en todas
las dinaacutemicas ambientales existentes en el planeta Sin embargo su importancia ha ido maacutes allaacute
desde que fueron descubiertos hace unos 300 antildeos por van Leeuwenhoek potencializaacutendose su
investigacioacuten y utilizacioacuten en distintos campos de la ciencia y la tecnologiacutea en los uacuteltimos 100
antildeos iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi amp Mayz 2003)
Debido a esto se han creado colecciones bioloacutegicas como meacutetodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho Las colecciones de cultivos microbianos estaacuten
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt y a nivel internacional por
la Federacioacuten Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) en donde existen actualmente
2acute520200 microorganismos en 711 colecciones de 71 paiacuteses registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM) Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM el CIAT (Rhizobium Collection America) de coacutedigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccioacuten de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de coacutedigo WDCM 857 (WFCC 2015)
No obstante varias universidades del paiacutes instituciones puacuteblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias bioloacutegicas poseen colecciones microbioloacutegicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN) en otros casos las colecciones estaacuten en proceso de registro o en formacioacuten como en la
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) entre otras
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer meacutetodos de conservacioacuten fiables
que entre otras cosas eviten al maacuteximo el riesgo de peacuterdida o de variabilidad geneacutetica de los
individuos Existe variedad de meacutetodos de conservacioacuten seguacuten sea el tiempo que estaraacuten en la
coleccioacuten o el tiempo en que tardaraacuten en ser usados dentro de ellos destacan la criopreservacioacuten y
la liofilizacioacuten meacutetodos utilizados para la coleccioacuten de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo
Martiacutenez amp Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Geneacutetico en el Laboratorio
de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC siglas de la coleccioacuten microbioloacutegica) utilizando
la refrigeracioacuten como meacutetodo primario implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
criopreservacioacuten
En este trabajo se pretendioacute determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos evaluaacutendolos frente a tres compuestos
protectores Para ello en primera estancia se recibioacute una capacitacioacuten sobre manejo y control de
microrganismos preparacioacuten de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados posteriormente se evaluoacute el estado de criopreservacioacuten de las cinco
cepas seleccionadas utilizando teacutecnicas de recuento en placa estaacutendar y se evaluoacute a tres
lioprotectores para la liofilizacioacuten de cepas microbianas del Banco Geneacutetico ademaacutes se realizaron
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacioacuten y se disentildearon los
protocolos para la implementacioacuten del sistema de liofilizacioacuten con las cinco cepas y el lioprotector
que presentoacute mejores resultados en este estudio
Para la realizacioacuten de estos fines el trabajo fue dividido en cuatro fases comenzando por los
criterios de eleccioacuten de los microrganismos y los lioprotectores seguido de la evaluacioacuten de los
meacutetodos de preservacioacuten utilizando tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
posteriormente una tercera fase de ajustes a la liofilizacioacuten para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo utilizando como indicadores las propiedades fiacutesicas generales la
posibilidad de contaminacioacuten en el proceso y el tiempo de redisolucioacuten finalmente una cuarta
fase que corresponde al proceso de documentacioacuten este incluye la revisioacuten y modificacioacuten de la
base de datos la elaboracioacuten de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados asiacute como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccioacuten y finalmente la
elaboracioacuten del manual de procedimientos Con lo anterior se encontroacute que el sistema de
criopreservacioacuten desarrollado por Martiacutenez amp Mayorga (2013) es eficiente y permite porcentajes
de recuperacioacuten bastante altos incluso superiores al 90 luego de dos antildeos sin embargo no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estaacuten expuestas por
este meacutetodo De otro lado se determinoacute la sacarosa al 10 como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caracteriacutesticas propias de cada organismo)
y se estandarizoacute el sistema de liofilizacioacuten
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacioacuten de un nuevo meacutetodo de
conservacioacuten de microorganismos para el Banco Geneacutetico de la Universidad Distrital Francisco
Joseacute de Caldas ademaacutes aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacioacuten en bacterias y ofrece
informacioacuten yo tips sobre el proceso de liofilizacioacuten en general que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso Tambieacuten se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Geneacutetico en la comunidad cientiacutefica a nivel nacional
e internacional
Este documento consta en su orden de un capiacutetulo de introduccioacuten y un marco referencial de los
objetivos tanto general como especiacuteficos alcanzados en este trabajo una metodologiacutea detallada
paso a paso perfectamente reproducible los resultados encontrados asiacute como el anaacutelisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacioacuten
finalmente un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo el campo de la
conservacioacuten microbiana y los capiacutetulos correspondientes a las referencias y bibliografiacutea utilizada
Se incluye tambieacuten un capiacutetulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientiacutefica del presente trabajo
13
2 MARCO REFERENCIAL
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS
La vida en la Tierra no seriacutea posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado 2009) ya que estaacuten involucrados con las dinaacutemicas en los ecosistemas terrestres aeacutereos
y acuaacuteticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta Existen
microorganismos que degradan la materia orgaacutenica hacieacutendola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) evitando que el mundo sea un vertedero
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnoloacutegicos de la humanidad
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea Bacteria y
Eucarya en donde encontramos como primeros representantes a las bacterias las maacutes numerosas
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) muchas pueden
resultar beneacuteficas para ser utilizadas con fines biotecnoloacutegicos agriacutecolas biomeacutedicos ecoloacutegicos
y de biorremediacioacuten (Morales-Garciacutea et al 2010) Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucioacuten en la naturaleza contribuyendo a la descomposicioacuten de la materia orgaacutenica y
participando en los ciclos bioloacutegicos (Pontoacuten Moragues Geneacute Guarro amp Quindoacutes 2002)
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucioacuten de los
graves problemas de la humanidad (Gonzaacuteles de Oca Martiacutenez Riveroacuten amp Nuacutentildeez 2006) en la
agricultura alimentacioacuten salud y en la buacutesqueda de nuevas fuentes de energiacutea y la conservacioacuten
del medio ambiente Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioquiacutemicas para Atlas (citado por Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez
1998) dicha capacidad se basa ldquoen la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones oxidaciones reducciones y precipitacioneshellip y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierrardquo (paacuteg 289)
Los recursos microbioloacutegicos (microorganismos genes e informacioacuten) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologiacutea las ciencias de la vida (Ivshina amp Kuyukina 2013) el
desarrollo de medicamentos farmaceacuteuticos agentes agroquiacutemicos biocontroles cosmeacuteticos y
productos industriales (Ten Kate 1995) Ademaacutes con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el eacutexito de los primeros aislamientos de microorganismos se marcoacute la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacioacuten de toda la biodiversidad microbiana logrando la inclusioacuten de este tema en el
desarrollo de las poliacuteticas ambientales (Gonzaacuteles et al 2006)
El meacutetodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta fuera de sus
ambientes ecosistemas y nichos ha sido la creacioacuten de colecciones bioloacutegicas cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfoloacutegicos fisioloacutegicos o
geneacuteticos (Montes de Oca et al 2008) Las colecciones de cultivos microbianos variacutean en forma
funcioacuten y tamantildeo Pueden ser pequentildeas privadas mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especiacuteficos (Duratildees Sette Pagnocca amp Rodrigues 2013)
14
El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura baacutesica de
investigacioacuten en ciencias de la vida llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg Dedeurwaerdere amp Pascual 2013) de animales y plantas pero se cuentan con
caracteriacutesticas especiacuteficas para los microorganismos En primer lugar los organismos microbianos
tienen una variacioacuten geneacutetica extremadamente alta y altos iacutendices de mutacioacuten en la reproduccioacuten
en las especies por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al 2013) a su lugar de recoleccioacuten En segundo lugar las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacioacuten asegurar los recursos geneacuteticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes para proporcionar biomateriales autenticados
para materiales de investigacioacuten exploracioacuten y produccioacuten asiacute como su uso contemporaacuteneo por
parte de las entidades privadas y puacuteblicas (Stromberg et al 2013)
Los microorganismos al igual que otros seres vivos poseen una uacutenica e irremplazable
secuencia de ADN por lo que su desaparicioacuten implicariacutea la peacuterdida irreversible de un conjunto
uacutenico de informacioacuten (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) de ahiacute la gran importancia en la
creacioacuten de comiteacutes comisiones federaciones y grupos de microbiologiacutea como World Federation
for Culture Collection (WFCC) International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacioacuten
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC 2010b)
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
En las colecciones es necesario establecer meacutetodos de conservacioacuten confiables y especiales
pudiendo realizarse a corto mediano y largo plazo para asegurar la oacuteptima viabilidad
almacenamiento y pureza (WFCC 2010b) de los diferentes microorganismos Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de peacuterdida cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
miacutenimo dos meacutetodos (WFCC 2010b) de conservacioacuten que consideren el tiempo a emplear en la
preservacioacuten inicial manipulacioacuten y control perioacutedico de las cepas asiacute como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemaacuten Diacuteaz Rosa amp Aacutelvarez Molina 2005)
Se debe tener especial cuidado con geacuteneros y especies todaviacutea no conservadas en colecciones
(especies nuevas) contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
oacuteptimos (WFCC 2010a) de conservacioacuten de estos
221 Conservacioacuten a corto plazo
Comuacutenmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestioacuten seraacute utilizado en un corto
periodo de tiempo Suele utilizarse la teacutecnica de resiembra continua en este el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC
donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garciacutea et al 2010)
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten
Este concepto agrupa a las teacutecnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 antildeos (Weng et al 2005) Existen variedad de teacutecnicas como la
desecacioacuten el gel de siacutelice o perlas de vidrio el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al
2005) o la congelacioacuten La inclusioacuten de esta uacuteltima teacutecnica en este grupo es discutida por algunos
autores ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacioacuten como la criopreservacioacuten (o
15
congelacioacuten) son teacutecnicas de conservacioacuten a largo plazo (Perry 1995 Weng et al 2005) y otros
insisten su inclusioacuten en las teacutecnicas de conservacioacuten a mediano plazo (Morales-Garciacutea et al 2010)
La criopreservacioacuten consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas
Esto permite la eliminacioacuten del agua libre disponible y que en el interior de los individuos ldquosoacutelo
una proporcioacuten del total de agua se convierta en hielordquo (Perry 1995 paacuteg 23)
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 deg C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta peacuterdida de la
viabilidad del cultivo (Perry 1995) por parte del laboratorio Este meacutetodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las ceacutelulas a -80degC
(Morales-Garciacutea et al 2010) Heckly (citado por Perry 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas la viabilidad celular es casi independiente del periacuteodo de almacenamiento ademaacutes
se cree que los individuos criopreservados siguen siendo geneacuteticamente estables
Hubaacutelek (2003) menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacioacuten de microorganismos desde las caracteriacutesticas propias del individuo (cepa
especie tamantildeo y forma de celda fase de crecimiento al momento de congelar composicioacuten de las
ceacutelulas etc) asiacute como los factores antes (composicioacuten del medio de crecimiento pH temperatura
de incubacioacutenhellip) durante y posterior al proceso de criopreservacioacuten (densidad poblacional
aditivos temperatura y duracioacuten del almacenamientohellip) e incluso en su descongelacioacuten
ldquoLos aditivos crioprotectores son compuestos quiacutemicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los dantildeos durante el proceso de congelacioacutenrdquo (Gonzaacuteles et al 2006 paacuteg
16) Estos protectores se pueden clasificar seguacuten su peso molecular (bajo o alto) o seguacuten su tasa
yo capacidad de penetracioacuten los penetrantes de bajo peso molecular que desplazan el agua
intracelular evitando la formacioacuten de hielo (por ejemplo el glicerol) y los no penetrantes de alto
peso molecular que promueven la raacutepida deshidratacioacuten de la ceacutelula (por ejemplo los gluacutecidos)
(Hubaacutelek 2003)
223 Conservacioacuten a largo plazo
Este concepto agrupa a las teacutecnicas que ademaacutes de minimizar al maacuteximo el riesgo de cambio
geneacutetico en las ceacutelulas mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 antildeos o maacutes (Weng et al 2005)
La maacutes popular es la liofilizacioacuten
2231 Liofilizacioacuten
La liofilizacioacuten consiste en la eliminacioacuten del agua de una sustancia congelada por
sublimacioacuten del hielo bajo alto vaciacuteo y a presiones muy bajas (Gonzaacuteles et al 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador Si la liofilizacioacuten es exitosa se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacioacuten por varios antildeos de los microorganismos sin embargo dicho eacutexito depende de
muacuteltiples factores entre otros como los mencionados por Hubaacutelek (2003) para la criopreservacioacuten
(puesto que la liofilizacioacuten posee una etapa de congelacioacuten) asiacute mismo el tiempo de liofilizacioacuten
los paraacutemetros de liofilizacioacuten el medio aditivo o lioprotector usado tipo de liofilizador o
accesorio utilizado influyen en el producto final
16
El proceso de conservacioacuten de microorganismos por liofilizacioacuten se puede dividir en muacuteltiples
etapas desde la formulacioacuten del protector hasta el modo en que se recuperaraacuten los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1)
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacioacuten Asiacute mismo se
representa el efecto de cascada en teacuterminos de la viabilidad de las muestras
a) Formulacioacuten
Se entiende como la mezcla de ceacutelulas con cualquier solucioacuten protectora que tras la
eliminacioacuten del disolvente permita obtener un producto (liofilizado) deseado La solucioacuten
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacioacuten Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de gluacutecidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics 2015)
Las soluciones protectoras oacuteptimas contienen principalmente un soluto protector
denominado lioprotector que estabiliza las ceacutelulas cuando se elimina el disolvente (agua)
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despueacutes de la liofilizacioacuten (Figura 2) Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actuacutean como su propia matriz por ejemplo la sacarosa al
10 (Ops Diagnostics 2015)
La formulacioacuten tambieacuten comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse pudiendo variar de si se parte de un cultivo soacutelido en
agar o de un cultivo liacutequido hasta que sean cultivos soacutelidos densos (edad de 1-2 diacuteas) o
liacutequidos en fase estacionaria Cuando se parte de un medio liacutequido y si es posible las
ceacutelulas se centrifugan retirando el medio de cultivo y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucioacuten protectora (Ops Diagnostics 2015) o de lioprotector (Grauer
Grunberg amp Zardo 2015) Para cultivos desde agar suele lavarse la placatubo con 5-10
ml de medio protector posteriormente recogido con una pipeta esteacuteril (Ops Diagnostics
2015) Aunque en esto uacuteltimo se evita la centrifugacioacuten se obtiene un mayor nuacutemero de
ceacutelulas partiendo de cultivos liacutequidos (Grauer et al 2015)
17
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado
Fuente Adaptado de Jennings T A (2008) Lyophilization Introduction and Basic Principles (paacuteg 5)
New York Informa Healthcare USA Inc
b) Congelacioacuten
La congelacioacuten es la primera etapa del meacutetodo de liofilizacioacuten y uno de los maacutes
importantes para el eacutexito de este Su funcioacuten consiste en obtener una matriz en donde esteacute
separado el disolvente de los solutos Cuando se congela la formulacioacuten el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regioacuten intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings 2008) la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regioacuten intersticial a casi 0 ademaacutes proporciona una estructura
con resistencia casi nula al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings
2008)
Disminuir el flujo de agua raacutepidamente es importante para evitar asiacute la excesiva
concentracioacuten de solutos un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracioacuten de solutos evitando el estreacutes osmoacutetico y permitiendo una organizacioacuten
espacial de los componentes de la formulacioacuten en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al 2015)
La temperatura y el tiempo para una congelacioacuten completa de la formulacioacuten
dependen de la naturaleza de la misma Nireesha et al (citado por Grauer et al 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco de ahiacute que una correcta congelacioacuten reduce la
desnaturalizacioacuten teacutermica del liofilizado ldquoinmoviliza componentes de la solucioacuten y evita
la formacioacuten de espuma cuando se aplica el vaciacuteordquo (Adams 2007)
c) Secado primario
Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacioacuten ademaacutes es la de maacutes larga
duracioacuten En este etapa la presioacuten se reduce y la temperatura de la formulacioacuten congelada
es elevada dando lugar a la sublimacioacuten (Figura 3) y migracioacuten de vapor de agua (Grauer
et al 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador Sin embrago dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
euteacutectica de colapso de transicioacuten viacutetrea (Tg) para minimizar el dantildeo de la muestra
(Adams 2007)
18
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua Se indican los requerimientos de presioacuten
y temperatura que hacen posible la sublimacioacuten del agua durante la liofilizacioacuten
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
El tiempo para el secado primario depende de muacuteltiples factores como la
composicioacuten de la solucioacuten protectora la porosidad del congelado la calidad o resistencia
de la matriz la cantidad de muestras asiacute como tambieacuten el volumen de la formulacioacuten entre
otros Respecto al volumen ldquopara las bacterias las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 025 a 05 mlrdquo (Ops Diagnostics 2015) Aunque no existe un
volumen establecido hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de maacutes
tiempo
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) un periacuteodo de secado primario de un diacutea es suficiente
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras teniendo
como guiacutea un tiempo de liofilizacioacuten de una noche
La etapa de secado primario finaliza ldquocuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacioacuten y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congeladardquo (Jennings 2008 paacuteg 6)
d) Secado secundario
Es la tercera y uacuteltima etapa de la liofilizacioacuten Al terminar el secado primario se ha
eliminado el agua moacutevil de la muestra Sin embargo existe agua atrapada dentro del soacutelido
amorfo que es maacutes difiacutecil de eliminar (Fetterolf 2010) La cantidad de agua es discutible
ya que fluctuacutea en funcioacuten de la temperatura y las caracteriacutesticas propias de los
19
constituyentes de la formulacioacuten por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10 ww del producto seco (Jennings 2008) o del 2-4 (Ops Diagnostics 2015)
La reduccioacuten del contenido de humedad en la torta se logra por desorcioacuten (Adams
2007) sin reducir el volumen de la misma (Jennings 2008) Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presioacuten parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario durante el secado secundario
(Ops Diagnostics 2015) Es importante que la temperatura no se incremente velozmente y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicioacuten viacutetrea la cual aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf 2010)
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) esta etapa es relativamente corta con una duracioacuten de
1 a 2 horas aunque Grauer et al (2015) indica que representa entre el 30-40 del tiempo
total del proceso asiacute mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo
con una duracioacuten de hasta varios diacuteas Esto resulta importante puesto que ldquola cantidad de
agua residente luego del secado afecta la tasa de peacuterdida de viabilidad durante el
almacenamientordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 16)
Finalmente al ser removida la humedad residual la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al 2015) obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2) o pastel esponjoso con poca (inferior al 1) o nula humedad
residual (Fetterolf 2010)
Las tres etapas del proceso de liofilizacioacuten en funcioacuten de la temperatura y la presioacuten
y en contraste con el diagrama de fases del agua pueden ser observadas en la Figura 4
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten De 1-3 Congelamiento (1-2 presioacuten
atmosfeacuterica) de 3-4 secado primario de 4-5 Secado secundario
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
20
e) Sellado y almacenamiento
Terminado el proceso de secado secundario se deben sellar los viales al vaciacuteo (de ser
posible) o de forma hermeacutetica tan pronto como sea posible debido a que la torta actuaraacute
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf 2010) aunque
tambieacuten es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams 2007) e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de siacutelice
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Sin embrago aunque
se logre un correcto sellado al vaciacuteo no se puede asegurar una larga vida uacutetil en condiciones
ambientales ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al 2015)
por ello lo mejor es almacenar los liofilizados a 4deg C en la oscuridad (Ops Diagnostics
2015) reduciendo las posibilidades de peacuterdidas aunque haya quedado agua despueacutes del
secado
f) Reactivacioacuten o rehidratacioacuten
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacioacuten original esto
implica la adicioacuten de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings 2008
Grauer et al 2015) La dilucioacuten raacutepida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings 2008) da cuenta de un correcto proceso de liofilizacioacuten
ldquoTiempos de reconstitucioacuten excesivamente largos la peacuterdida de potencia o la formacioacuten
de una solucioacuten turbia son indicios de un proceso de liofilizacioacuten inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacioacutenrdquo (Jennings 2008 paacuteg 11)
La recuperacioacuten de las ceacutelulas sin embrago tambieacuten se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacioacuten) el tipo
de diluyente su temperatura su pH la osmolaridad (Grauer et al 2015) la potencia del
lioprotector (Jennings 2008) entre otras propiedades de la solucioacuten resultante
Grauer et al 2015 sugieren la utilizacioacuten de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacioacuten de los microorganismos con el fin de evitar el estreacutes
osmoacutetico que pueden causar las soluciones diluidas sin embargo algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacioacuten especiacuteficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato
Ops Diagnostics (2015) indican que una tasa de supervivencia superior al 50 se
considera aceptable por muchos laboratorios
2232 Control de calidad de un producto liofilizado
Las propiedades fiacutesicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayoriacutea un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacioacuten entre los
paraacutemetros de la formulacioacuten y el proceso de liofilizacioacuten por ello permiten el seguimiento y la
deteccioacuten de falencias (Jennings 2008)
21
Esta evaluacioacuten permite caracterizar las diferentes propiedades fiacutesicas quiacutemicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre dichas propiedades Jennings (2008) y Ticoacute
G (1987) recogen algunos de las toacutepicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado por ejemplo las propiedades generales fiacutesicas de la torta (color volumen temperatura
de transicioacuten textura porosidad densidad contraccioacuten o colapso estado del vial entre otras que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacioacuten) su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfeacuterica) la velocidad de redisolucioacuten o
reconstitucioacuten la estabilidad (de la torta el microorganismo o el lioprotector evaluada de forma
natural o acelerada) nivel de humedad residual posibles contaminantes entre otras
2233 Equipamiento para liofilizar
Como ya se mencionoacute inicialmente el proceso de liofilizacioacuten requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5) este equipo consta esencialmente de tres partes
a) Un sistema o bomba de vaciacuteo que reduce la presioacuten del ambiente de la caacutemara que contiene
el material a secar Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dantildeen ldquoEl nivel
de vaciacuteo requerido debe ser entre 50 y 100 μbarrdquo (Grauer et al 2015 paacuteg 9) aunque 200
μbar son aceptables
b) Un condensador con circuito de refrigeracioacuten que comunica con la caacutemara de secado y
condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacioacuten sobre una superficie enfriada
inferior a los -40degC
c) Caacutemara o accesorio de secado que es donde se coloca el material a secar Seguacuten Nireesha
et al (2013) puede ser de tres tipos
- Manifold o colector muacuteltiple
- Rotary
- Tray style de bandejas con o sin estante de taponado eacuteste uacuteltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaciacuteo de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes En la imagen el liofilizador usa una
caacutemara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial
Tomado de httpslideplayercombrslide84760 el 15 de Agosto de 2015
22
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad y liofilizacioacuten de las mismas evaluaacutendolas frente a tres compuestos protectores
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas utilizando teacutecnicas de recuento
en placa estaacutendar
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacioacuten de cepas microbianas
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten
Disentildear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacioacuten a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados
23
4 METODOLOGIacuteA
La metodologiacutea general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases como es ilustrado en la
Figura 6
Figura 6 Metodologiacutea Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia loacutegica de eventos
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra
41 FASE INICIAL
411 Acervo Microbiano
De la coleccioacuten de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Geneacutetico del laboratorio de
microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracioacuten de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologiacutea estas corresponden a CR004 CR005 (sustituida posteriormente
por CR009) CR006 CR007 y CR010 seguacuten los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodriacuteguez (2013) Todas estaban conservadas por el meacutetodo de criopreservacioacuten (o
criocongelacioacuten) a una temperatura de -85 degC plusmn 1degC
412 Eleccioacuten de los protectores
4121 Crioprotectores
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99999) (Mallinckrodt Meacutexico) en
proporcioacuten 67 vv seguacuten lo establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
4122 Lioprotectores
Para la eleccioacuten de los agentes protectores y sus concentraciones en pv (Tabla 1) se
tuvieron en cuenta diferentes estudios en contraposicioacuten a Hensel (1994) se tomaron
concentraciones superiores al 9 de Glucosa (Merck Darmstadt) de forma aleatoria En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed amp
Roos (2004) y Palmfeldt Radstroumlm amp Hahn-Haumlgerdal (2003) Para la leche descremada
(Proleche Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al (2003) Dichos estudios
fueron tomados como referencia teoacuterica aunque los microorganismos en ellos especificados no
correspondan con los del presente trabajo
Criterios de eleccioacuten de los
microorganismos asiacute como de
los lioprotectores a evaluar
Evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten (criopreservacioacuten
y liofilizacioacuten)
Ajustes a la liofilizacioacuten
para la generacioacuten de
protocolos
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
24
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracioacuten
pv
10 4 10
117 10 15
27 15 20
42 FASE INTERMEDIA 1
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
En este trabajo se evaluaron dos meacutetodos de conservacioacuten (criopreservacioacuten y liofilizacioacuten)
dicha evaluacioacuten se realizoacute en teacuterminos de tres (3) indicadores valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al meacutetodo en siacute
4211 Viabilidad
Para evaluar este indicador se utilizoacute
a) Conteo directo con caacutemara de Neubauer 110mm (Boeco) siguiendo la metodologiacutea
planteada por Valencia Z (2004) Sin embargo para obtener el nuacutemero de bacterias se
utilizoacute la ecuacioacuten planteada por Bastidas (2015)
No de bacteriasml=
Fd Factor de dilucioacuten =
El conteo directo con caacutemara de Neubauer solo se realizoacute previamente al meacutetodo de conservacioacuten
evaluado
b) Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa seguacuten lo
descrito por Valencia Z (2004) y Camacho et al (2009) Para el caacutelculo de UFCml se
utilizoacute la siguiente foacutermula
UFCml = Ndeg de colonias times times
Los caacutelculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologiacutea planteada por
Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales se utilizoacute los planteamientos del Instituto
de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacioacuten y solo pos a la criopreservacioacuten en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid
England)
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten
fue calculado a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010)
Tasa de supervivencia (BSR ) = DD Despueacutes de la desecacioacuten
AD Antes de la desecacioacuten
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000
Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucioacuten
1
ml de muestra
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100
Log (Ndeg UFCml AD)
25
4212 Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realizoacute
a) Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) Se elaboroacute un formato (anexo 1) con las
caracteriacutesticas macroscoacutepicas descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz
(2009) para las colonias desarrolladas en superficie a partir del procedimiento de ldquoconteo
de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Se utilizoacute un
contador de colonias CC-1 (Boeco)
- Se seleccionoacute solo una de dos placas de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de
UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron observadas en al menos el 80 de las colonias
de la placa seleccionada
b) Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se
realizoacute una ldquocoloracioacuten de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005
paacuteg 24)
Se compararon con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y macroscoacutepicas descritas por
Rodriacuteguez (2013) y la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se tomoacute
registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio (Zeiss)
con caacutemara Canon G9
4213 Pureza
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en
cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante
teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
422 Recuperacioacuten de los microorganismos
Para la recuperacioacuten de los microorganismos se tomoacute un criovial de cada cepa bacteriana
sometido a una temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua
destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente cinco (5) minutos (Martiacutenez amp Mayorga
2013) Los crioviales se introdujeron en bantildeo seroloacutegico una vez se llegoacute a la temperatura deseada
no antes
De cada criovial se tomoacute un (1) ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (asymp2240rpm) por diez (10) segundos diluyeacutendolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
Se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten a cada criovial (Thomas
Scientific 5150636) por cepa luego de preparado el tubo T01 antes de la incubacioacuten Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martiacutenez amp Mayorga
(2013) y Rodriacuteguez (2013)
26
423 Criopreservacioacuten
4231 Precriopreservacioacuten
Pasado el tiempo de incubacioacuten se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten al tubo T01 con el fin de determinar el nuacutemero de ceacutelulas totales y viables de la
muestra El conteo en Caacutemara de Neubauer se realizoacute solo hasta el final de los procedimientos de
preservacioacuten por lo cual una vez preparadas las diluciones estas fueron llevadas a nevera a 4degC plusmn
1degC para evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Se siguioacute el protocolo de criopreservacioacuten establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas con
algunas variaciones
Con pipeta esteacuteril de 5ml se depositaron en cinco (5) crioviales 12ml de glicerol anhidro
esteacuteril
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02)
Posteriormente se tomaron aliacutecuotas desde T02 de 600microl previo Voacutertex nivel 7 por 15s
depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl Se rotularon y se
realizoacute Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten
Inmediatamente despueacutes de la homogenizacioacuten fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick) a una temperatura de -85degC plusmn 1degC en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestioacuten
Este procedimiento se realizoacute en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar veinte (20) minutos (Martiacutenez amp
Mayorga 2013) desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar
la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
424 Liofilizacioacuten Etapa 1
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Se partioacute del tubo T01 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de
liofilizacioacuten Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel
7 (asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml agua destilada esteacuteril (T03)
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
Partiendo del tubo T03 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se
extrajeron aliacutecuotas de cien (100) microl veintisiete (27) veces depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar En cada criovial se adicionaron novecientos (900) microl de lioprotector en tres
crioviales por cada concentracioacuten de lioprotector de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2)
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior del criovial fuera lo maacutes
exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T03 se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacioacuten
27
Donde el volumen inicial y la concentracioacuten inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado en tanto que el volumen final y la concentracioacuten final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T03
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (aliacutecuota maacutes protector) se
agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacioacuten
Posteriormente a los crioviales se les retiraron las tapas plaacutesticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney PM-996) esterilizado realizando seis (6) perforaciones conceacutentricas en la superficie
con aguja hipodeacutermica 21G x 1frac12rdquo Los crioviales fueron congelados en nitroacutegeno liacutequido por
15min aproximadamente depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD Thermo
Scientific) de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45degC usando el colector muacuteltiple (manifold)
Terminado el proceso se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la caacutemara
de flujo laminar para evitar contaminacioacuten de las muestras alliacute se les retiroacute el Parafilm se les tapoacute
con tapas esteacuteriles y se les rotuloacute
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten
Lioprotector Concentracioacuten
(pv)
Serie
A B C
Glucosa
10 1 1 1
117 1 1 1
27 1 1 1
Sacarosa
4 1 1 1
10 1 1 1
15 1 1 1
Leche
descremada
10 1 1 1
15 1 1 1
20 1 1 1
Total crioviales seguacuten Ndeg 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje)
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten utilizando una etiqueta o
roacutetulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacioacuten
Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de datos el
Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten
bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo)
nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3) con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo
bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas
tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada vial
Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional
a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
Posterior al proceso de rotulado los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano a temperatura ambiente y protegido de la luz
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS
CC en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado riesgo
poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entrantildear un riesgo grave para el personal de
laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado
riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro Existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o
indirectamente Normalmente no existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005)
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio
(paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications
biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
29
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2
Se realizoacute una prueba de estabilidad natural en teacuterminos del aspecto fiacutesico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un periacuteodo prolongado de tiempo (Grauer et al 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente Por ello la rehidratacioacuten de los crioviales se realizoacute en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4)
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales
Primera rehidratacioacuten Segunda rehidratacioacuten Tercera rehidratacioacuten
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota Intervalos de tiempo medidos en diacuteas contados desde el diacutea de almacenaje en los cuales se rehidratoacute
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie ver Tabla 2) El aspecto fiacutesico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacioacuten y comparado con su estado antes del almacenaje
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC tomando
el tiempo de reconstitucioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel
2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten El indicador de viabilidad se evaluoacute solo con el meacutetodo de conteo de
microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la maacutes alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa se eligioacute el
lioprotector y la concentracioacuten de eacuteste que permitioacute obtener un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables
posliofilizacioacuten y que ofrecioacute ademaacutes una menor variacioacuten durante la prueba para la liofilizacioacuten
definitiva de las cepas en estudio Dicho lioprotector se establecioacute ademaacutes como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados del Banco
Geneacutetico del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
43 FASE INTERMEDIA 2
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores con el aacutenimo de
generar un protocolo funcional aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partioacute de cultivos puros sobre medios soacutelidos se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacioacuten liofilizacioacuten y posliofilizacioacuten para la
liofilizacioacuten definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados
431 Liofilizacioacuten definitiva
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracioacuten oacuteptima para cada cepa
de estudio se realizoacute la liofilizacioacuten definitiva
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general Posteriormente se agitoacute con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Esto se realizoacute para cada
cepa
30
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
El tubo T04 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten
definitiva se extrajeron cuatro (4) aliacutecuotas de un (1) ml previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass 62113D-2)
posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por
7s para su homogenizacioacuten
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas a una presioacuten
inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
El proceso de destape parcial y congelacioacuten se realizoacute en caacutemara de flujo laminar para evitar
al maacuteximo la contaminacioacuten El transporte de los viales desde la caacutemara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitroacutegeno liacutequido
para evitar contaminacioacuten y descongelacioacuten
4313 Posliofilizacioacuten
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten Dos viales
designados como trabajo (T) y stock (S) fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4degC plusmn 1degC
4314 Rehidratacioacuten
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacioacuten de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio soacutelido
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos
Se llevoacute un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el aacutenimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacioacuten Al identificarlas se decidioacute repetir la
liofilizacioacuten definitiva con los nuevos paraacutemetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio
4321 Propiedades fiacutesicas generales
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento) color textura brillo aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales teniendo como punto de comparacioacuten la formulacioacuten
luego de congelada Esto se realizoacute para
- Crioviales de la fase intermedia 1
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 431)
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 433)
4322 Contaminacioacuten
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad en
buacutesqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio
31
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten
Se midioacute el tiempo de reconstitucioacuten de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y el tiempo de los crioviales que conteniacutean el lioprotector general fue comparado
con el tiempo de reconstitucioacuten de los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada
433 Pruebas adicionales
Para estas pruebas solo se usoacute la formulacioacuten del lioprotector general y la cepa CM-CR010
por su alta tasa de crecimiento respecto a las demaacutes cepas evaluadas
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticoacute G 1987) se
tomaron los pesos con balanza analiacutetica (AND GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos El cuarto vial y criovial se abrieron solo una vez luego
fueron sellados completamente tomando sus pesos de la misma forma ya descrita
Para determinar si existe un tiempo maacuteximo admisible de cerrado se midioacute el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcioacuten del tiempo utilizando la ecuacioacuten
descrita por Garciacutea C (2007)
Wt () es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4332 Prueba de estabilidad acelerada
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa uno fue rehidratado a los cero (0) diacuteas y el otro
luego de siete (7) diacuteas en el interior de la caacutemara de envejecimiento ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5 Adicionalmente se dataron sus propiedades fiacutesicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada
Ndeg vial t ndash Tdeg - HR
1 0 - ambiente - 25
2 7 - 37degC - 100
Nota Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos t= Tiempo en diacuteas
Tdeg=Temperatura HR=Humedad relativa La prueba de estabilidad se realizoacute en una caacutemara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC luego
incubados a 25 degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente
se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten midiendo viabilidad con el meacutetodo
de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
32
434 Control de esterilidad
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121degC y 210Kpa por 20 minutos las puntas de micropipetas los viales
crioviales y sus respectivas tapas fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y
temperatura en un tiempo de 15 minutos Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas) fueron esterilizados en horno Binder a 160degC por 120 minutos
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo desde la
preparacioacuten de medios hasta el sellado de los viales como se describe a continuacioacuten
4341 Medios
Se realizoacute control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid England) (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Se determinoacute como indicador de contaminacioacuten
cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios
soacutelidos
4342 Ambiente
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realizoacute con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas El periodo de exposicioacuten fue de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en
incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo
b) Cabina de flujo laminar
Se realizoacute el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este
caso la caja de control de ambiente se dejoacute abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeriacutean el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4
horas Este control se llevoacute a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolloacute en el interior de la cabina de flujo laminar
se procuroacute mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y
tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70 al iniciar el trabajo con cada cepa
44 FASE FINAL
441 Base de datos
Se realizoacute una revisioacuten a la base de datos del Banco de cepas creado por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) en el programa Access modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccioacuten para la informacioacuten de los organismos liofilizados
33
442 Fichas de resumen
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccioacuten tanto del Freezer
como del banco de liofilizados utilizando el programa Word 2013
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se realizoacute una revisioacuten de la informacioacuten en los roacutetulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos con el aacutenimo de verificar si se habiacutean cumplido los protocolos y la
logiacutestica establecida por Martiacutenez amp Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias
444 Formatos de control del banco de liofilizados
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013 para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) en la seccioacuten
de criopreservacioacuten
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados
Coacutedigo Tipo de registro Ubicacioacuten Uso
FLf-01 Registro de entrada de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccioacuten
FLf-02 Proceso de
liofilizacioacuten
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacioacuten a
una cepa
FLf-03 Registro de control de
calidad
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccioacuten y antes de liofilizar
una cepa para la coleccioacuten
FLf-04 Solicitud salida de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados
Fuente Adaptado de Martiacutenez Beniacutetez H L amp Mayorga Burgos L P (2013) Implementacioacuten de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (Tesis de
pregrado) (paacuteg 44) Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas Bogotaacute Colombia
445 Manual de procedimientos
Se realizoacute una revisioacuten de la cartilla de procedimientos elaborada por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) Se tomoacute la decisioacuten de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013
34
5 RESULTADOS
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN
A raiacutez de la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en cada criovial por cepa
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno En cuanto a CM-CR005 se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer pero no fue posible recuperarla por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009 la sexta mejor respecto al criterio de eleccioacuten de cepas
Con los datos del proceso precriopreservacioacuten de las cepas de intereacutes correspondientes a la
coleccioacuten de colorantes consignados en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) en conjunto con
los datos de viables poscongelacioacuten del presente trabajo se calculoacute la BSR para cada cepa (Tabla
7) Se encontroacute que los porcentajes de BSR son superiores al 70 luego de dos (2) antildeos de estar
en criopreservacioacuten (Figura 8) salvo CM-CR005
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martiacutenez amp Mayorga (2013) (soacutelo se compararon los datos de la cepa CM-CR010 ya que las demaacutes
cepas no figuran en su trabajo) se encontroacute un porcentaje inferior de recuperacioacuten
poscriopreservacioacuten por parte de las autoras por lo cual se revisoacute la metodologiacutea encontrando un
error metodoloacutegico al calcular la BSR en su trabajo Usando los datos de ldquoresultados prueba de
viabilidad poscongelacioacuten tabla 19rdquo (en Martiacutenez amp Mayorga 2013 paacuteg 54) se corrigioacute la BSR
para esta cepa evidenciando ser la cepa maacutes resistente al proceso de criopreservacioacuten entre las
evaluadas con alrededor de 66 de caiacuteda luego de dos antildeos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8)
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten)
Nota Se muestran los resultados al evaluar la conservacioacuten de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por
el meacutetodo de criopreservacioacuten luego de dos (2) antildeos La BSR que Martiacutenez amp Mayorga (2013) presentan
corresponde a un valor poscriopreservacioacuten luego de dos meses de evaluacioacuten Nrd= No registra datos
Cepa Ceacutelulas
totales
Viables precongelacioacuten
(UFCml) de Martiacutenez
amp Mayorga (2013)
viables pos
congelacioacuten
(UFCml)
BSR
real
BSR de Martiacutenez
amp Mayorga
(2013)
BSR
corregido
CM-CR004 12x1012 61 x109 13 x107 725 Nrd Nrd
CM-CR005 11 x1010 11 x1010 0 00 Nrd Nrd
CM-CR006 14x1010 75 x109 27 x107 752 Nrd Nrd
CM-CR007 13x1011 41 x109 31 x108 883 Nrd Nrd
CM-CR009 19 x1010 44 x109 23 x107 763 Nrd Nrd
CM-CR010 17 x1010 46 x109 72 x108 916 673 982
35
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelacioacuten CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperacioacuten (nuacutemero de
ceacutelulas viables)
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO
En las Tablas 8 9 10 11 y 12 se describen las principales caracteriacutesticas macroscoacutepicas
utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfoloacutegica de las cepas utilizadas No fue
posible realizar la comparacioacuten con los datos de Rodriacuteguez (2013) a nivel macroscoacutepico dado que
los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquiacute utilizados sin embargo si se
compararon las caracteriacutesticas microscoacutepicas las cuales fueron coincidentes aunque estas no eran
del todo claras (descripcioacuten inexacta de forma y tamantildeo y sin un registro fotograacutefico comparable)
por lo cual se decidioacute que las caracteriacutesticas macroscoacutepicas observadas desde la primera siembra
posterior a la descongelacioacuten de los crioviales fuesen las de mayor importancia para evaluar la
estabilidad morfoloacutegica y la pureza Estas se mantuvieron sin cambio o variacioacuten a lo largo del
trabajo
Las microfotografiacuteas tomadas a cada cepa usando la coloracioacuten de Gram al igual que las
fotografiacuteas de las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron anexadas a la base de datos del Banco
Geneacutetico
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 725 00 752 883 763 916
Sup
ervi
ven
cia
36
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR004
Descripcioacuten
Borde o Margen
Ondulado Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de
crecimiento
Frente a luz Brillante
Elevacioacuten Umbonada
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Color Beige maacutes intenso en el centro y maacutes clara hacia los extremos en
colonias de 48h o maacutes extremos color blanco hueso
Forma Circular a maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo desarrollar forma
irregular
Grado de
Transparencia Opaca (No transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Ropa huacutemeda
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR006
Descripcioacuten
Borde o Margen Semiondulado A maacutes de 72h es altamente digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas y con medio huacutemedo se irregulariza
Luego de una semana totalmente digitado
Elevacioacuten Plana con bordes elevados (en craacuteter) Colonias de maacutes de 72h
presentan una ligera elevacioacuten en el centro
Color Amarillo
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Escamosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca (NO transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis Si color amarillo
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
37
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR007
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio muy huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular A maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo es irregular
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 48h y distantes unas de otras (pocas
colonias) umbonadas
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Semitransparente en zona externa
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Mentol
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR009
Descripcioacuten
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas se irregulariza
Elevacioacuten En meseta y ligero hundimiento central (craacuteter) En colonias con maacutes
de 72h ligera elevacioacuten del craacuteter
Color Beige Conforme envejece la colonia toma una coloracioacuten blancuzca
de tonalidad cafeacute en el centro
Tamantildeo Pequentildea (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
38
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR010
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio huacutemedo es suavemente ondulado en medio muy
huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular Despueacutes de 48h se irregulariza En medio muy huacutemedo es
estrellado (sin importar edad de la colonia)
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 72h centro marcado y ligeramente
elevado (forma de huevo frito)
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia
Opaca Semitransparente en la zona externa de colonias de maacutes de
48h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Sin olor
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general
Las Figuras 9 10 11 12 y 13 representan los resultados de la evaluacioacuten de la eficacia del
meacutetodo de conservacioacuten realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1 por medio
del indicador de viabilidad
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 6 x108 Se observa que
la leche descremada 15 como mejor protector y leche descremada 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A - - - 5987 - 5301 5958 6812 -
BSR en serie B - - - 3619 3076 4557 5100 5039 3619
BSR en serie C 3076 3619 - 3619 3076 3418 3418 5873 4723
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR004
39
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 73 x108 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 125 x1010 Se observa
a sacarosa 10 como mejor protector y a glucosa 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 4173 4962 5850 6119 6415 5731 5430 4173 4513
BSR en serie B 3046 - - 4173 4743 5051 4773 - -
BSR en serie C - - - 3046 5147 4622 - - -
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR006
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 9149 8664 6549 9712 9677 8735 9026 9166 8648
BSR en serie B 8472 - 6181 - 8474 - 8413 8052 8086
BSR en serie C 8557 7472 6193 - 9272 - 8604 8202 8414
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR007
40
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 115 x109 Se observa
a Sacarosa 15 como mejor protector y la leche descremada 10 como segundo mejor protector
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 65 x109 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 5494 4609 4609 6641 6401 6987 5585 5440 5186
BSR en serie B 4415 - - 6373 6083 6212 4941 4083 -
BSR en serie C - - - - - 7519 4083 - 4083
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR009
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 8205 - 6303 9521 8634 8207 8153 8022 8332
BSR en serie B 6424 - - 7911 8312 8096 7752 6907 7995
BSR en serie C 6697 - - - 8230 7998 7919 8113 7539
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Sup
erviv
enci
a
BSR en CM-CR010
41
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15
CM-CR006 Sacarosa 10
CM-CR007 Sacarosa 10
CM-CR009 Sacarosa 15
CM-CR010 Sacarosa 10
Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural
ofreciera la maacutes alta BSR en la mayoriacutea de cepas (Tabla 13) se determinoacute la sacarosa al 10
como el mejor lioprotector y se designoacute como lioprotector general para las bacterias del banco de
liofilizados Sin embargo se decidioacute para la liofilizacioacuten definitiva utilizar el lioprotector que
mejores resultados confirioacute a cada una de las cinco cepas de estudio
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado
Dado que el principal indicador de evaluacioacuten de la prueba de estabilidad natural en esta
etapa era la viabilidad en cada liofilizado no se tuvo en cuenta los cambios morfoloacutegicos
presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa pero si fueron tenidos en cuenta
para los ajustes teacutecnicos de la liofilizacioacuten en la fase 3
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilizacioacuten definitiva
con su homoacutelogo de la etapa 2 (es decir los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo) se encontraron diferencias significativas de aumento o disminucioacuten de hasta el 22
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad seguacuten el punto de partida de la formulacioacuten
(medio liquido SMPG vs medio soacutelido SPC) como lo muestra la Figura 14
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilizacioacuten
definitiva por cepa bacteriana Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas seguacuten el intervalo
temporal de la Serie A en tanto que CM-CR007 CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron seguacuten la Serie
B (ver Tabla 4)
- 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Punto
s p
orc
entu
ales
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
L Etapa 2 6812 6415 8474 6212 8312
L definitiva 7330 7629 7757 8461 7234
BSR comparativa
42
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN
551 Propiedades fiacutesicas generales
Se dataron las propiedades fiacutesicas de los liofilizados en la fase intermedia 1 asiacute como los
liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 431 (liofilizacioacuten definitiva) y 4332 (viales
usados para la prueba de estabilidad acelerada) en las Tablas 15 y 16 respectivamente la tabla de
convenciones (Tabla 14) permite comprender los siacutembolos de las anteriores tablas
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilizacioacuten y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilizacioacuten
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transicioacuten conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto fiacutesicamente aceptable Sin embargo pese a que a las propiedades fiacutesicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1 con los cuales se realizoacute la evaluacioacuten de la liofilizacioacuten
y la prueba de estabilidad natural no eran los maacutes adecuados se decidioacute proseguir con ellos
apoyado por los resultados de Vemulapalli Bhonsle amp Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratacioacuten (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperacioacuten de microorganismos ademaacutes el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores
Tabla 14 Tabla de convenciones Siacutembolo Significado Siacutembolo Significado
SBE Si en buen estado A Algunos
SME Si en mal estado T Todos
NBE No en buen estado N Ninguno
NME No en mal estado NS No significativo (lt20)
+ Afirmativo S Significativo (201-309)
- Negativo MS Muy significativo (gt40)
NA No aplica I indeterminado
FS Al finalizar el secado AR Antes de reconstituir
Nota Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15 Aunque no tenga estructura de torta el liofilizado
es estable y funcional por ende utilizable No tiene estructura de torta y ademaacutes no es ni estable ni
funcional por ende no es utilizable
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1
Cepa Viales Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto de
torta
Fractura de
vial 1 2 3
CM
-CR
00
4
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I S Traslucido I + NBEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N S Cafeacute claro Porosa - SMEA -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR NS N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
43
CM
-CR
00
6
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR S S MS Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N NS NS Cafeacute claro Porosa - SBEA -
sm2sc AR S S S Cafeacute oscuro Porosa - SMET -
CM
-CR
00
7
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
s1 NA I I I Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR S I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS I S Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
CM
-CR
00
9
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I NS Traslucido I + NBE -
g2sc AR MS S S Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS S I Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sb AR N N NS Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sc AR N S NS Cafeacute oscuro Porosa - NMEA -
CM
-CR
01
0
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I S S Traslucido I + NMEA -
g2sc AR I MS MS Traslucido I + NMEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
44
Nota Datos de las propiedades fiacutesicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad
natural salvo por el encogimiento que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa) los
demaacutes caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual Se subrayan las
anomaliacuteas encontradas a lo largo de la prueba
g Liofilizados con glucosa como protector
s Liofilizados con sacarosa como protector
sm Liofilizados con leche descremada como protector 1 Formulacioacuten congelada 2 Liofilizados almacenados a temperatura ambiente sa Serie A (antes de rehidratar) sb Serie B (antes de rehidratar) sc Serie C (antes de rehidratar)
1 Concentracioacuten uno del lioprotector
2 Concentracioacuten dos del lioprotector
3 Concentracioacuten tres del lioprotector
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la prueba de
estabilidad acelerada
Nota Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquiacute mencionados corresponden solo a aquellos
que contienen sacarosa al 10 (lioprotector general) Se consignan aquiacute los datos generales de los
liofilizados indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas
a Liofilizados de la prueba de estabilidad natural
b Liofilizados de la liofilizacioacuten definitiva
c Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada 1 Formulacioacuten congelada 2 Viales almacenados a temperatura ambiente 3 Vial usado en la caacutemara de envejecimiento
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto
de torta
Fractura
de vial Viales
a1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
a2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
b1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
b2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
c1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
c2 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR NS Blanco Porosa - SBE -
c3 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR S Blanco Porosa - SME -
45
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes De izquierda a derecha
liofilizados de prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva prueba de estabilidad acelerada
552 Contaminacioacuten
Se encontroacute contaminacioacuten durante la rehidratacioacuten de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006 en tanto que las siembras preliofilizacioacuten no presentaban contaminacioacuten alguna por ello
se tomaron tres viales maacutes que iban a ser rehidratados en la serie B encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilizacioacuten de esta cepa
Las demaacutes cepas no presentaron contaminacioacuten en ninguna prueba realizada
553 Tiempo de redisolucioacuten
Al medir el tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten en cada una de las rehidrataciones se
observoacute que la glucosa tardoacute maacutes tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros
lioprotectores llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Voacutertex en los viales
maacutes concentrados para su total redisolucioacuten Ademaacutes se encontroacute en todos los lioprotectores que
conforme la concentracioacuten aumentaba maacutes tiempo se necesitaba para la reconstitucioacuten de la
formulacioacuten es decir que el tiempo es directamente proporcional a la concentracioacuten de
lioprotector
Al comparar el tiempo de reconstitucioacuten de los viales que conteniacutean el lioprotector general
en la prueba de estabilidad natural con los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales de la
prueba de estabilidad acelerada no se encontraron diferencias significativas sin embargo el vial
de la prueba de estabilidad acelerada que duroacute siete (7) diacuteas en caacutemara de envejecimiento se
reconstituyoacute un segundo menos aproximadamente respecto a los otros viales
46
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado
Lioprotector Tiempo (min)
Glucosa 10 1
Glucosa 117 15
Glucosa 27 120
Sacarosa 4 05
Sacarosa 10 05
Sacarosa 15 06
Leche descremada 10 025
Leche descremada 15 033
Leche descremada 20 05
Estabilidad natural 05
Liofilizacioacuten definitiva 025
Estabilidad acelerada 004
Nota El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada
uno liofilizados con el lioprotector general
56 PRUEBAS ADICIONALES
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica
En la Figura 16 se observa un aumento draacutestico del peso de los viales dentro de la ventana
de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados
al vaciacuteo) Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vaciacuteo) no tuvieron un aumento en
peso tan draacutestico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante Al cabo de cincuenta
(50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente No se encontroacute
por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vaciacuteo
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector La ecuacioacuten presentada pertenece a la liacutenea de tendencia logariacutetmica
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinacioacuten Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba
0 10 20 30 40 50 60
vial (518055g) 0 00724 00772 00782 00840 00869 00849
Criovial (19018g) 0 00079 00158 00315 00473 00578 00605
Promedio 0 00401 00465 00549 00656 00724 00727
y = 00365ln(x) + 00058
Rsup2 = 09647
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
01
AU
MEN
TO D
E P
ESO
(W
)
47
562 Prueba de estabilidad acelerada
Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFCml antes de la liofilizacioacuten al
rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 8398 sin embargo al rehidratar el vial 2 luego de su
estadiacutea en la caacutemara de envejecimiento la BSR fue de 0 Las propiedades fiacutesicas generales de
estos viales son presentadas en la Tabla 15
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN
571 Base de datos
Se eliminoacute una tabla sobrante (constituiacutea informacioacuten redundante de las cepas) dentro de la
base de datos correspondiente a la seccioacuten de criopreservacioacuten Adicionalmente se reorganizoacute la
base de datos al introducir la seccioacuten de liofilizacioacuten y la de refrigeracioacuten Este uacuteltimo meacutetodo de
preservacioacuten fue mencionado en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) pero no fue anexado
sin embargo aunque se incluyoacute la seccioacuten en el banco de cepas debe mencionarse que no existen
registros de las cepas que se hallan conservado por este meacutetodo aun asiacute se decidioacute dejar la seccioacuten
para que lo ocupen trabajos posteriores Ademaacutes se encontroacute que en el Freezer existiacutean colecciones
que no figuran en la base de datos no existen registros de ninguacuten tipo ni caracterizacioacuten alguna en
medios digitales La base de datos quedoacute organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5
Figura 17 Organigrama de la base de datos
572 Fichas de resumen
Las fichas de acceso inmediato designadas como ldquofichas de resumenrdquo para cada coleccioacuten
fueron ubicadas seguacuten el sitio de almacenamiento tanto para las cepas criopreservadas como para
las liofilizadas y refrigeradas Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas las fichas
resumen de este meacutetodo fueron dejadas en blanco para futuras colecciones El formato de las fichas
resumen se presenta en el anexo 6
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se encontroacute que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulacioacuten que
permite la faacutecil confusioacuten entre colecciones criopreservadas sin embargo se decidioacute dejar las
etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martiacutenez amp Mayorga (2013) entre
otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener
que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondriacutea una confusioacuten entre nuevas
y viejas colecciones Este problema fue solucionado con la reorganizacioacuten de la base de datos y las
fichas de resumen
Base de datos del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Informacioacuten de los
microorganismos de
cada coleccioacuten
Meacutetodo de conservacioacuten de cepas
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten
Liofilizacioacuten
48
574 Formatos de control del banco de liofilizados
Se decidioacute que los formatos de control para la seccioacuten de liofilizacioacuten del Banco Geneacutetico
fueran similares tanto para la criopreservacioacuten como para la liofilizacioacuten obedeciendo sus
diferencias a las caracteriacutesticas y datos propios de cada meacutetodo Se encontroacute que los formatos de
la seccioacuten criopreservacioacuten no habiacutean sido llenados nunca desde su creacioacuten Estos se muestran en
el anexo 7
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten
Se editoacute la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martiacutenez amp
Mayorga (2013) Partiendo de esta cartilla se elaboroacute un manual maacutes completo (anexo 8)
introduciendo todos los procedimientos para la liofilizacioacuten las diferentes teacutecnicas empleadas en
los procesos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se complementoacute tambieacuten la seccioacuten sobre el
proceso de refrigeracioacuten y se reescribieron algunos conceptos erroacuteneos de la edicioacuten anterior No
se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservacioacuten pero si
se realizaron pequentildeos ajustes de forma o de edicioacuten
49
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
La recuperacioacuten de microrganismos por criopreservacioacuten se realizoacute de acuerdo a los
lineamientos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) durante todas sus etapas sin embargo
la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la
criopreservacioacuten de la cepa o inclusive en la etapa de descongelacioacuten Garciacutea y Uruburuacute (citados
por Aacutengel A 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y
estabilidad de los organismos conservados edad celular velocidad de congelacioacuten y
descongelacioacuten temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores Dado que las cepas
CM-CR004 006 007 010 e incluso la 009 (que remplazoacute a CM-CR005) presentaron muy buenos
niveles de recuperacioacuten (Figura 8) el factor maacutes probable de falla corresponde al crioprotector
utilizado ya que en el caso del Banco Geneacutetico el crioprotector es general para toda la coleccioacuten
de bacterias y la eleccioacuten del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A
2006) puesto que la efectividad de la criopreservacioacuten se puede ver afectada por las caracteriacutesticas
propias de cada cepa (Hubaacutelek 2003) las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector
Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la
viabilidad los organismos conservados por este meacutetodo sobreviven largos periacuteodos por la
reduccioacuten marcada de su ritmo metaboacutelico incluso por maacutes de 30 antildeos (Gonzaacuteles et al 2006) lo
cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector
como elemento de falla en la conservacioacuten de la cepa perdida
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una uacutenica
liacutenea celular por tanto las caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificacioacuten preliminar Sin embargo estos mismos autores
sentildealan que estas caracteriacutesticas no son uacutenicas ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares como sucedioacute con CM-CR007 y 010 por ello fue preciso observar las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas microscoacutepicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquiacutemicas) de las cepas pero dada la simplicidad de las descripciones microscoacutepicas de
Rodriacuteguez (2013) no se tuvo como principal referencia de identidad Aunque la morfologiacutea de la
colonia depende considerablemente de la composicioacuten del medio de cultivo y las condiciones de
incubacioacuten cuando eacutestas son controladas suelen ser invariables teniendo por lo general un valor
diferencial considerable (Diacuteaz 2009) por lo tanto se tomaron estas caracteriacutesticas como las
principales para la evaluacioacuten de los indicadores de estabilidad morfoloacutegica y pureza
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que ldquolos medios soacutelidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamientordquo (paacuteg 2) Sin embargo se observaron
algunas variaciones las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio Esto se
observoacute maacutes en las cepas CM-CR007 y 010 que al revisar los datos de Martiacutenez amp Mayorga (2013)
y Rodriacuteguez (2013) estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio huacutemedo
tendiacutean a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican Loacutepez T amp Torres (2006)
en bacterias moacuteviles en tanto que sin niveles altos de humedad las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en funcioacuten del tiempo (envejecimiento de la colonia) Esto derivoacute en la
observacioacuten y descripcioacuten de caracteriacutesticas macroscoacutepicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad como son descritas en las Tablas 8 9 10 11 y 12 para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) diacuteas que duroacute la prueba de estabilidad
natural se observoacute que en general de los tres lioprotectores los resultados maacutes bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones Esto tiene su explicacioacuten en las propiedades reductoras
que poseen los monosacaacuteridos ya que como lo menciona Cox C S (citado por Hensel 1994) los
efectos letales de la desecacioacuten se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteiacutenas
de la membrana celular y azuacutecares reductores que aumentan conforme avanza la deshidratacioacuten
(glicacioacuten) si las proteiacutenas de membrana integrales o citosoacutelicas se ven dantildeadas de forma
irreversible durante el secado tendriacutea un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al 1995)
impidiendo la reconstitucioacuten de forma adecuada de las bacterias y por ende generando muerte
celular Sin embargo las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta especialmente en la concentracioacuten maacutes baja incluso para CM-CR007 la glucosa al 10 se
erige como el segundo mejor protector Es probable que estas dos cepas presenten una
configuracioacuten diferente de sus proteiacutenas de membrana que impida la reaccioacuten amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra que proteja a las proteiacutenas de membrana o
citosoacutelicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteiacutenas)
Es conocido que en general los disacaacuteridos mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan Herman White amp Vesey
2006) esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13
A diferencia de la glucosa la sacarosa es un azuacutecar no reductor estos pueden proteger las
ceacutelulas al competir por la unioacuten en la membrana con los azucares reductores (Hensel 1994) Se ha
demostrado que la sacarosa mantiene las proteiacutenas secas igual que en sus conformaciones
hidratadas Leslie et al (1995) indican que este fenoacutemeno sucede probablemente ldquomediante la
unioacuten a los dominios hidroacutefilos de las proteiacutenas y la prevencioacuten de enlaces de hidroacutegeno inter e
intra proteiacutenas durante el secado y la reconstitucioacutenrdquo (paacuteg 3596) lo cual contribuye a las altas tasas
de supervivencia al usar este lioprotector
Para que un protector funcione eacuteste debe proteger la bicapa lipiacutedica y para ello debe existir
dentro y fuera de las ceacutelulas (Leslie et al 1995 Palmfeldt et al 2003) el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transicioacuten de
membrana ya que en eacutesta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentracioacuten (Leslie et al 1995) reemplazando el agua intracelular lo cual se conoce como la
hipoacutetesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al 2003) Si esto se cumple la concentracioacuten
intracelular seraacute alta y el tiempo antes de la congelacioacuten y el secado debe ser corto por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequentildeo (Leslie et al 1995) y los productos polares
extracelulares seraacuten miacutenimos
Ademaacutes tanto la glucosa y la sacarosa estaacuten dentro de la categoriacutea de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo este estado viacutetreo ldquoInduce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una ceacutelula para detener la movilidad
molecular a un miacutenimo El vidrio amorfo inerte tambieacuten es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las ceacutelulas dentro de la estructura de vidrio antes de la congelacioacuten lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquiacutemicos irreversibles en la
membrana plasmaacutetica durante el almacenamientordquo (Morgan et al 2006 paacuteg 186)
51
La retencioacuten de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilizacioacuten
como en la criopreservacioacuten
Cabe mencionar que el proceso de deshidratacioacuten y de reemplazo de agua intracelular por
parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un liacutemite ya que como lo
menciona Heckly (citado por Perry 1995) al congelarse el agua del medio las ceacutelulas sufren
deshidratacioacuten reduciendo el punto de congelacioacuten en el interior y evitando la formacioacuten de
cristales de hielo pero al seguir bajando la temperatura las concentraciones de solutos aumentan
Perry (1995) cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelacioacuten estaacuten posiblemente
asociados a estas soluciones excesivamente concentradas puesto que no se han encontrado
evidencias de lesiones mecaacutenicas por hielo extracelular Esto corresponderiacutea con los resultados
obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores como lo fue la glucosa al 27 en casi
todas las cepas (exceptuando CM-CR006 Figura 10) recordando que un protector funciona mejor
en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmoacutetico con el interior de las bacterias (conocer
la concentracioacuten intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilizacioacuten
por parte de eacuteste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo como se muestra en el
trabajo de Palmfeldt et al (2003)
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta un ejemplo claro es la cepa CM-CR004 la cual de hecho ante los
gluacutecidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentoacute resultados aceptables Morgan et al
(2006) mencionan (teniendo como referencia la investigacioacuten de Buitink et al) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteiacutenas presentes en esta sustancia son
maacutes estables y juegan un importante papel en la formacioacuten del estado viacutetreo lo cual induce a pensar
que una oacuteptima mezcla de proteiacutenas y azucares permite una proteccioacuten maacutes eficiente Esta
posibilidad corresponderiacutea a los resultados obtenidos donde la concentracioacuten de los componentes
de la leche descremada seriacutean propicios para la cepa CM-CR004 en tanto que para las demaacutes cepas
seriacutean maacutes bajas o maacutes altas de lo propicio Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de gluacutecidos y proteiacutenas que la componen pero no
establece cuales son estos pudiendo ser positivos o negativos para la liofilizacioacuten
En general los cultivos liacutequidos ofrecen un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables (Ops
Diagnostics 2015) sin embargo la viabilidad depende muacuteltiples factores incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos El medio SMPG estaacute disentildeado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse raacutepidamente la fuente de carbono (glucosa) una bacteria
de raacutepido crecimiento entraraacute en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio una
de lento crecimiento al cabo del mismo tiempo estaraacute en fase log no obstante en el medio SPC
los nutrientes tardan maacutes tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas todas las bacterias
estaraacuten en fase log Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de raacutepido crecimiento mientras que
CM-CR004 006 y 009 son de crecimiento un poco maacutes lento (datos obtenidos del conteo con
caacutemara de Neubauer no incluidos en el presente estudio)
Morgan et al 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisioloacutegicos
en las bacterias relacionado generalmente con la privacioacuten de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles desencadenando una respuesta ante el estreacutes para permitir la
supervivencia de la poblacioacuten celular Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecacioacuten y las temperaturas menos propicias para su crecimiento por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilizacioacuten Sin embargo la
fase de crecimiento oacuteptima para la supervivencia en la desecacioacuten es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al 2006 paacuteg 185) Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14 indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
liacutequido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log asiacute mismo las cepas CM-CR004 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria pudiendo ser mayor o menor
En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilizacioacuten definitiva se observoacute puffing
y pitting y si bien Vemulapalli et al (2015) indican que estos cambios no afectan la calidad del
producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada Jennings (2008) advierte que su
presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada y que esta puede
deberse a un sistema con composicioacuten diferente de la formulacioacuten principal y podriacutea conducir a
interacciones tales como la agregacioacuten de proteiacutenas ademaacutes se observoacute (Figura 15 izquierda y
centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulacioacuten inicial de glucosa y
sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16) ldquodebido a una accioacuten combinada de la fusioacuten
(maacutes o menos importante) y de la presioacuten reducida dando lugar al puffingrdquo (Ticoacute G 1987 paacuteg
70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings 2008) seguacuten la cantidad del
material afectado por el puffing Esta caracteriacutestica se asocia con un error en los paraacutemetros de
liofilizacioacuten por ello se revisoacute exhaustivamente el proceso de liofilizacioacuten encontrando que los
liofilizados alcanzaron la temperatura de fusioacuten durante el proceso de secado primario por la
inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador el cual no habiacutea sido descrito en el
proceso piloto de liofilizacioacuten con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del
control de calidad A causa de esto los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los
uacutenicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha)
Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura
a los -32 y -42 degC asiacute como un melting inicial a -32degC y -42degC respectivamente seguacuten lo reporta
Moreira Gutieacuterrez amp Delgado (1994) Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento
del liofilizador
Las Tablas 15 y 16 que resumen las caracteriacutesticas tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados muestran que el color textura brillo y fractura de viales estaacuten dentro de los
paraacutemetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilizacioacuten correcta
con las formulaciones utilizadas no obstante se detectaron variaciones posliofilizacioacuten
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales Inicialmente se pensoacute
en una falla durante el tiempo de almacenamiento dado que los liofilizados maacutes afectados fueron
de las series B y C sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada se determinoacute que la causa de fallo yaciacutea en la
obtencioacuten de humedad por parte del producto liofilizado La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vaciacuteo absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vaciacuteo estos habiacutean absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilizacioacuten esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscoacutepica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad maacutes bajo que la sacarosa) debido a la
53
ldquofacilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidroacutegeno con el aguardquo (Badui
Dergal 2006 paacuteg 73) ldquoPara reducir el nuacutemero de moleacuteculas de agua el proceso de liofilizacioacuten y
el sellado de los viales al vaciacuteo debe haber sido exitoso y asiacute obtener un producto con el contenido
de humedad deseadordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 78) por lo cual se descarta la utilizacioacuten del
instrumento manifold para la liofilizacioacuten cepas en el Banco Geneacutetico
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilizacioacuten siempre deben ser
de vidrio ya que el vapor de agua atmosfeacuterico se puede difundir a traveacutes de los tubos de plaacutestico y
por ende las muestras secas terminariacutean absorbiendo agua Esto se comproboacute con la utilizacioacuten de
crioviales que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vaciacuteo sino que ademaacutes en
la serie C casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dantildeados presentaban
cambios de coloracioacuten (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloracioacuten
oscura como lo muestra la Tabla 15) o una marcada reduccioacuten en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentracioacuten) Esto tambieacuten se ve correlacionado con la peacuterdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008) la
humedad es la principal responsable en la peacuterdida de viabilidad en el producto liofilizado
reduciendo la vida uacutetil de los organismos La obtencioacuten de agua implica un retroceso del proceso
de liofilizacioacuten el dantildeo de la matriz formada el flujo de los residuos extracelulares polares es
decir la reactivacioacuten del organismo ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquiacutemica el metabolismo (Adams 2007) finalmente la muerte celular al agotarse esta
El tiempo de redisolucioacuten y el tipo de reconstituyente tambieacuten es de gran importancia La
Tabla 17 muestra tiempos de redisolucioacuten bastante altos para las formulaciones de glucosa Con
los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisioacuten del proceso de liofilizacioacuten se determinoacute la
retrofusioacuten producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de
redisolucioacuten causando un efecto grave donde la interaccioacuten entre las moleacuteculas es tal que la matriz
del liofilizado es casi insoluble (Jennings 2008) El aumento de la temperatura demasiado raacutepido
en el proceso de la liofilizacioacuten o por encima de Tg resultoacute en el colapso haciendo la
reconstitucioacuten mucho maacutes difiacutecil (Fetterolf 2010) Jennings (2008) indica que un aumento en el
aacuterea superficial por unidad de volumen de la torta tenderaacute a disminuir el tiempo de reconstitucioacuten
lo cual sucedioacute para todos los liofilizados que presentaron melting puffing y pitting ya que su
volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulacioacuten congelada solo los
liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulacioacuten
congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitucioacuten
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed amp Roos (2004) quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo se sugiere en muacuteltiples estudios
ademaacutes el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4degC plusmn 1degC en la
oscuridad (Ops Diagnostics 2015)
Se siguioacute los procedimientos de documentacioacuten establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
para la criopreservacioacuten y la elaboracioacuten de los nuevos protocolos de liofilizacioacuten encontrando
como lo menciona Gonzaacuteles et al (2006) que es necesario contar con sistemas de documentacioacuten
eficiente ademaacutes contar con duplicados de la informacioacuten en medios fiacutesicos y magneacuteticos evitado
la perdida de informacioacuten (Montes de Oca et al 2008) y el raacutepido acceso a la misma
54
7 CONCLUSIONES
En general el estado de criopreservacioacuten de las cepas evaluadas es oacuteptimo obteniendo tasas
de supervivencia satisfactorias Sin embargo el criopreservante no funciona de igual forma para
todas las cepas debido a las caracteriacutesticas propias de cada organismo que limitan la accioacuten del
glicerol
De acuerdo a la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten realizada con los tres indicadores
(viabilidad pureza y estabilidad morfoloacutegica) la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados siendo la concentracioacuten al 10pv la maacutes oacuteptima No obstante su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado hermeacuteticamente y al vaciacuteo El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada aunque no se determinoacute la concentracioacuten maacutes oacuteptima
En cuanto a la glucosa al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo se observa
que pese a no ser un buen lioprotector concentraciones de glucosa entre el 6 y el 10 pv son
funcionales aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50
No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten estos
fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminacioacuten de las muestras y a su
vez evitar la contaminacioacuten por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso
Se creoacute el protocolo para el proceso de liofilizacioacuten en todas sus etapas Este es
metodoloacutegicamente funcional y faacutecilmente reproducible por ello se estandariza para el Banco
Geneacutetico seccioacuten liofilizacioacuten dentro del nuevo manual de procedimientos de conservacioacuten Se
incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservacioacuten dentro de este
manual ajustado a las necesidades especiacuteficas de seguridad de la liofilizacioacuten
Es importante mantener actualizado los diferentes medios fiacutesicos y magneacuteticos donde reposa
la informacioacuten de las colecciones y los microorganismos en ellos dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Geneacutetico y la informacioacuten se puede perder
La falta de la identificacioacuten hasta cepa (al menos hasta geacutenero) de los microorganismos
presentes en el banco geneacutetico limita la informacioacuten para entender los fenoacutemenos relacionados a
los procesos de conservacioacuten y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo
55
8 RECOMENDACIONES
Existen paraacutemetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente como la edad del cultivo la
concentracioacuten celular entre otros Se propone el estudio de los paraacutemetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilizacioacuten con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos por ello se sugiere la creacioacuten
de un modelo matemaacutetico para que sea funcional esta prueba lo cual generariacutea datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo
Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinacioacuten de lioprotectores con formadores
de matrices y estabilizantes siguiendo los protocolos establecidos Mezclas de sacarosa al 10 pv
con leche descremada 10 pv (de la misma marca usada en este estudio) sacarosa al 10 pv con
leche descremada 10 pv y carboacuten activado asiacute como la utilizacioacuten de estas mezclas con trehalosa
en distintas concentraciones son sugeridas
Es necesaria la creacioacuten de una plataforma online del banco geneacutetico una vez este cuente con la
identificacioacuten de los organismos contenidos asiacute mismo es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco geneacutetico distinto a Access preferiblemente que obedezca a una
creacioacuten propia de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Es necesaria la creacioacuten de una pasantiacutea anual para curaduriacutea del Banco Geneacutetico ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepcioacuten de cepas Ademaacutes se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas como aquellas que sean donadas al Banco Geneacutetico en el futuro
56
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62
11 ANEXOS
Anexo 1 Formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-XX00Xa
Descripcioacuten Fotografiacutea
Borde o Margen
Frente a luz Brillanteopaca
Forma
Elevacioacuten
Color
Tamantildeo
Superficie
Consistencia
Grado de
Transparencia
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis
Pigmentos que desprende la colonia
y se observan sobre el medio
Olor
Hemolisis
MedioT(degC)
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen
un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace
la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad
del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos
Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen
Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta
Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
63
Anexo 2 Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados
a) Recubrimiento (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido cartoacuten y autoadhesivo de
emulsioacuten acuosa
b) Bandeja de liofilizados
c) Soporte para bandeja
d) Cojiacuten de siacutelice gel (reemplazo seguacuten el tamantildeo y cantidad de cojines de 2 meses a 1 antildeo)
El banco de liofilizados estaacute dividido en tres secciones
La seccioacuten de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A B y C respectivamente
La seccioacuten de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D E y F respectivamente
La seccioacuten de hongos (color cafeacute) correspondiente a las bandejas G H e I respectivamente
64
Bandeja de liofilizados
Estaacute hecha de poliestireno expandido viene con 100 compartimientos individuales para un maacuteximo
de 100 viales por bandeja
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
10 20
30 40
50 60
70
80
90 100
01
11 21
31
41
51
61 71
81
91
65
Anexo 3 Esquema general del cepario madre de liofilizados
J Hongos
K Bacterias
L Algas
F Fila
Nuacutemeros compartimento correspondiente a cada vial La numeracioacuten va en zigzag
J K L
F1 F1 F1 F2 F2 F2 F3 F3 F3
1
8 8 8
9 9 9 1 1
16 16 16 24 24 24
17 17 17
66
Anexo 4 Caacutemara de envejecimiento artesanal
Esta caacutemara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y
humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra La humedad relativa
puede controlarse seguacuten si se use agua (100) o una concentracioacuten determinada de solucioacuten salina
ver Colmenares R (2015)
Horno de 37degC (caacutemara externa)
Caacutemara
interna
Termoacutemetro
Tapa de sello
hermeacutetico
Malla de
soporte
Viales
Agua o sn salina
67
Anexo 5 Base de datos en Access
Esquema general de la Base de datos del Banco Geneacutetico
Espacio de trabajo con las tablas
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
informacioacuten
maacutes detallada)
68
Anexo 6 Formato de las Fichas Resumen
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FICHA RESUMEN DE LA COLECCIOacuteN
Ubicacioacuten de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Fuente de obtencioacuten
de las cepas
Fecha de
ingreso
Cantidad de cepas Tipo de organismos
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa)
Ubicacioacuten de cepas (seguacuten todos los meacutetodos
de conservacioacuten utilizados para la coleccioacuten)
Autores o donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos y Formatos de control
69
Anexo 7 Formatos de control de la seccioacuten liofilizacioacuten
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
Lugar (Ciudad y Paiacutes) Fecha de ingreso
Origen de
la cepa
Institucioacuten Organizacioacuten o
Empresa donante
Persona que realizoacute el
aislamiento
Cargo Fecha de
aislamiento
Informacioacuten de contacto
Fuente de obtencioacuten
de la cepa
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Identificacioacuten geneacutetica
de la cepa
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Calidad de la
cepa recibida
Restriccioacuten de
distribucioacuten
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Observaciones Nivel de
Bioseguridad
N1 N2 N3 N4
Persona donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
70
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL
FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN
CM-_ _0_ _
Proceso
Fecha Hora
Ciudad Equipo
Lioprotector y
concentracioacuten
Temperatura (degC)
Presioacuten (mbar)
Duracioacuten (min) Accesorio de
secado
Responsable (s) del proceso
Ubicacioacuten
Coacutedigo de la
cepa
Nombre de
la coleccioacuten
Viales
almacenados
Tipo S T Lf Total Sello al vaciacuteo SI NO
Cantidad Sello de Aluminio SI NO
Pruebas de
Viabilidad
Caracterizacioacuten
macroscoacutepica (resumen)
Caracterizacioacuten
microscoacutepica (resumen)
Concentracioacuten celular
(UCF)
Preliofilizacioacuten
Posliofilizacioacuten
Bioquiacutemicas
Otras
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
71
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS
CEPAS
CM-_ _0_ _
Detalles del
Proceso
Fecha Ciudad
Hora Coacutedigo de cepa
Viales a evaluar T S Lf Temperatura (degC)
Viales en mal estado T S Lf Presioacuten (Mbar)
Fecha de liofilizacioacuten Fecha de evaluacioacuten Total tiempo (meses)
Descripcioacuten
de la cepa
Geacutenero-especie del
microorganismo
Nombre de la
Coleccioacuten
Car
acte
riza
cioacuten
Microscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Microscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Observaciones
Viabilidad Concentracioacuten Celular
(UFC) Preliofilizacioacuten
Concentracioacuten Celular
(UFC) Posliofilizacioacuten
Observaciones
Control
de
Calidad
Bioquiacutemicas
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Pruebas
Cristal
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Otras Pruebas Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Observaciones
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
72
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD
DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS
CM-_ _0_ _
Lugar (Ciudad Paiacutes) Fecha
Informacioacuten
del
solicitante
Institucioacuten Organizacioacuten
o Empresa
Solicitante Cargo
Teleacutefono (s) Email
Descripcioacuten
de la cepa
Coacutedigo de
cepa
Geacutenero ndash especie
Microorganismo
Coleccioacuten
Utilizacioacuten de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
73
Anexo 8 Manual de procedimientos de conservacioacuten para el Banco Geneacutetico del Laboratorio
de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (Ver archivo adjunto)
Manual de procedimientos de
conservacioacuten para el Banco
Geneacutetico del Laboratorio de
Microbiologiacutea Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute
de Caldas
Primera Edicioacuten
Editado por
Andreacutes V Castantildeeda R
Manual de procedimientos de conservacioacuten para el
Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Ingenieriacutea Sanitaria
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
Licenciado en Biologiacutea
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales
Niria Pastora Bonza Peacuterez
Docente encargado del Laboratorio de Microbiologiacutea y
coordinador de Ingenieriacutea Sanitaria
Miguel Aacutengel Piragauta Aguilar
Disentildeo y diagramacioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
avicent29gmailcom
Autoriacutea y Edicioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda R
2015
Todos los derechos reservados
TABLA DE CONTENIDO
TIacuteTULO PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
RECEPCIOacuteN DE CEPAS 2
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS 3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES 5
Medios 5
Reactivos 6
Protectores generales 6
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN 7
Indicador uno Viabilidad 7
Conteo directo con caacutemara de neubauer (110mm) 7
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa 10
Indicador dos Estabilidad morfoloacutegica 12
Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) 12
Tincioacuten de gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) 13
Indicador tres Pureza de la cepa 13
RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS 14
Criopreservados (descongelamiento) 14
Liofilizados (rehidratacioacuten o reconstitucioacuten) 14
REFRIGERACIOacuteN 15
CRIOPRESERVACIOacuteN 16
Precriopreservacioacuten 16
Preparacioacuten del inoculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 16
LIOFILIZACIOacuteN 17
Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano 17
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 17
IV
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Posliofilizacioacuten 18
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos 18
ROacuteTULOS 19
Refrigeracioacuten 19
Criopreservacioacuten 19
Liofilizacioacuten 20
TIacuteTULO 2 PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONSERVACIOacuteN Y EN EL LABORATORIO
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN 23
Medios 23
Ambiente 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores 23
Cabina de flujo laminar 23
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 24
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS 24
Desechos no contaminados (no infecciosos) 24
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en
autoclave y reutilizado 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado 25
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa 25
BIOSEGURIDAD 26
Proteccioacuten personal 26
Procedimientos 27
Aacutereas de trabajo 27
Capacitaciones 27
REFERENCIAS 28
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dilucioacuten en serie 7 Figura 2 Conteo directo 8 Figura 3 Conteo en bacterias 8 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky 10 Figura 5 Contador de colonias 11 Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados 19 Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer 19 Figura 8 Roacutetulos para los crioviales 19 Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso 4 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG 5 Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos 5 Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos 6 Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer 9 Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 21
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIacuteMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL
kPa Kilo pascales
min Minutos
s Segundos
microl microlitros
mm miliacutemetros
degC grados Celsius
pv porcentaje peso a volumen
mTorr militorricelli
mbar milibar
g gramos
ml mililitros
UCF Unidades formadoras de colonias
rpm Revoluciones por minuto
vv Porcentaje volumen a volumen
iexclPrecaucioacuten
iexclA tener en cuenta
VI
INTRODUCCIOacuteN
Este manual representa en conjunto el trabajo a traveacutes del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigacioacuten han sentado los pilares para la formacioacuten del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC ) cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservacioacuten y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigacioacuten que permita a la comunidad acadeacutemica de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbioloacutegicos en las aacutereas de biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnoloacutegica para el paiacutes Aquiacute se presentan los tres meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos aplicados en este Banco Geneacutetico Refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten Se hace eacutenfasis en los diferentes procesos materiales equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Geneacutetico
Protocolos para la
conservacioacuten de
microorganismos
2
RECEPCIOacuteN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco geneacutetico debe contar con las siguientes condiciones miacutenimas de recepcioacuten
La cepa se debe encontrar en estado de pureza Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Geneacutetico
biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnologiacutea Debe contar con un responsable entidad o institucioacuten donante que respalde
la(s) cepa(s) entregadas ademaacutes de contar con la informacioacuten de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad
La cepa o coleccioacuten debe contar con toda la informacioacuten que el Banco
geneacutetico requiera para su mantenimiento conservacioacuten y registro en la base de datos
La cepa o coleccioacuten debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles
de Bioseguridad establecidos por la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) siendo el nivel de bioseguridad 2 el maacuteximo permitido por las instalaciones del laboratorio con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo
Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado
investigaciones entre otras) se debe pasar con 15 diacuteas de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS al docente encargado
Una vez recibida la cepa se diligencian los mismos registros en digital se
anexa la informacioacuten a la base de datos asignaacutendole un coacutedigo y se diligencian las fichas de resumen
3
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS El personal encargado del Banco Geneacutetico debe realizar una verificacioacuten de la
pureza de la cepa esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada sobre una o maacutes cajas de Petri con el medio de cultivo el tiempo y temperatura de incubacioacuten especificados por quien hace la donacioacuten Asiacute mismo a partir de este subcultivo se debe realizar la evaluacioacuten de la efica-cia del meacutetodo de conservacioacuten para verificar la informacioacuten dada por el investi-gador donante
Posterior al proceso de recepcioacuten de cepas es importante tener en cuenta
que se debe verificar la fecha de la uacuteltima siembra para determinar si es apro-piado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder despueacutes al proceso de criopreservacioacuten o liofilizacioacuten
Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las
cepas por maacutes de dos meses antes de la criopreservacioacuten o la liofilizacioacuten se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservaacutendola por el meacutetodo de refrigeracioacuten con el fin de evitar que la cepa se pierda
Si se requieren hacer pruebas bioquiacutemicas pruebas cristal u otras pruebas
complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos se tendraacute que pedir la autorizacioacuten del responsable del Banco Ge-neacutetico y del encargado del laboratorio debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposicioacuten de material en el laboratorio
Nota Si alguna cepa llegara a presentar contaminacioacuten se debe informar a la persona responsable del Banco Geneacutetico y posteriormente a la persona entidad o institucioacuten donante
4
EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservacioacuten
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso
Proceso o meacutetodo Equipo Material
Refrigeracioacuten Nevera Thermolab 14-E0107 Tubo de ensayo tapa rosca
Cabina de flujo laminar Asa redonda
Esterilizador de asas
Criopreservacioacuten
Cabina de flujo laminar Crioviales Voacutertex Puntas azules Micropipeta graduable de 100-1000 microl
Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la coleccioacuten
Frascos Schott con tapa para el glicerol
Pipeteador Pipeta de 1ml o 5ml
Liofilizacioacuten
Esterilizador de asas Asa redonda
Voacutertex Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Cabina de flujo laminar Puntas azules y amarillas Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile
Recipiente de poliestireno expandido cerrado
Crimper Sello de aluminio Micropipetas graduables de 100-1000microl y 20-200microl
Pinzas Vial 5mm con tapoacuten de divisioacuten
Evaluacioacuten del
meacutetodo de
conservacioacuten
Caacutemara de Neubauer 110mm Laminilla de cuarzo
Caacutemara AxioCam ICc5 Laminas porta objetos
Microscopio Axio Scope A1 Laminillas cubre objetos
Contador de colonias CC-1 Marcador
Estereoscopio Zeiss Asa redonda
Incubadora de 25degy 37degC Asa de Drigalsky
Micropipeta graduable 100-1000microl 20-200microl y 5-20microl
Puntas azules amarillas y blancas
Voacutertex Goteros
Recuperacioacuten de
los
microorganismos
Micropipeta graduable 100-1000microl y 20-200microl
Puntas azules y amarillas
Tubos de ensayo
Cabina de flujo laminar Cajas de Petri con medio
Plancha de calentamiento Mechero
Demaacutes equipos y materiales utilizados en la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten
Beaker
Termoacutemetro
Cajas de Petri con medio
Tubos de ensayo
-Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiologiacutea
5
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Geneacutetico cuenta con medios reactivos y protectores generales definidos para los meacutetodos de preservacioacuten manutencioacuten y recuperacioacuten de microrganismos Estos se describen a continuacioacuten y se clasifican de acuerdo al meacutetodo de conservacioacuten en la Tabla 4
Medios CALDO SMPG Este medio es empleado para el crecimiento del inoacuteculo inicial y
en la formulacioacuten de la criopreservacioacuten Su composicioacuten se muestra en las Tablas 2 y 3 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG
Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos
SPC (Standard Plate Count) Este medio se utiliza para la teacutecnica de evaluacioacuten
de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Tambieacuten puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas
Agar nutritivo (AN) o medios especiacuteficos Utilizados como medio de
mantenimiento o para pruebas bioquiacutemicas yo fisicoquiacutemicas (si se realizan) en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Buffer agua peptonada Este medio se utiliza en la rehidratacioacuten y en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 76
Microelementos 076
Peptona 1
Glucosa 01
MACROELEMENTOS Cantidad MICROELEMENTOS Cantidad
MgSO4 2 g CuSO4- 5H2O 005 g
NaNO3 2 g H3BO3 01 g
KCl 015 g MnSO4 ndash H2O 01 g
CaCl2 21 g ZnSO4 ndash 7H2O 01 g
Na2HPO4 09 g Agua destilada 1000 ml
FeSO47H2O 001 g
Agua destilada 1000 ml
6
Reactivos Tincioacuten Gram La bateriacutea de reactivos para la Tincioacuten de Gram se utiliza en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Alcohol acetona Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo Agua destilada Se utiliza en todos los procedimientos para la preparacioacuten de
medios la descongelacioacuten y especialmente en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Alcohol Para desinfeccioacuten en todos los procedimientos (70) o para mecheros (95)
Aceite de inmersioacuten Se utiliza para la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten durante las observaciones microscoacutepicas
Nitroacutegeno Liacutequido Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilizacioacuten
Protectores generales Crioprotector Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservacioacuten en
proporcioacuten 67vv respecto al criovial Lioprotector Se utiliza una solucioacuten de Sacarosa 10 pv para las
formulaciones en la liofilizacioacuten bacteriana En hongos se utiliza leche descremada al 12 pv No se tiene detalles de lioprotector oacuteptimo en algas
Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos
Nota Dado que en la refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se realiza la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten se incluyen aquiacute los reactivos implicados en dicha evaluacioacuten
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten Liofilizacioacuten R
eacti
vos
Tincioacuten Gram SI SI SI
Alcohol acetona SI SI SI
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de inmersioacuten
SI SI SI
Nitroacutegeno Liacutequido NO NO SI
Me
dio
s
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios especiacuteficos
OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
Agua peptonada SI SI SI
Pro
tecto
r
Glicerol anhidro NO SI NO
Sacarosa 10pv
NO
NO SI
7
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN
Indicador uno Viabilidad Conteo directo con caacutemara de Neubauer (110mm)
Se parte de un tubo de dilucioacuten (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto el cual tiene por lo general un tiempo de incubacioacuten de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo Figura 1 Dilucioacuten en serie Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser esteacuteriles usando una nueva en cada transferencia El diluyente es agua peptonada al 01 pv
Tome la caacutemara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia
Observe las dos cuadriculas de la caacutemara que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H)
Agite el tubo de dilucioacuten seleccionado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s tomando con una micropipeta una aliacutecuota de 10microl y depositaacutendola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla dejando que se cargue por capilaridad de forma homogeacutenea (Figura 2-A) Posteriormente lleve al microscopio enfocando desde el menor aumento hasta eacutel objetivo 40x al tiempo que ajusta la intensidad lumiacutenica para poder observar las liacuteneas de la caacutemara y las ceacutelulas al tiempo
-Algunos modelos de Voacutertex no poseen un rango de velocidad sino de niveles -Para limpiar la caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo lave primero con agua destilada luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada Deje secar al ambiente -Para una correcta observacioacuten al microscopio utilice el meacutetodo de enfoque de Koumlhler -Procure no limpiar la laminilla con ninguacuten papel o pantildeo lo puede rayar -Este procedimiento debe durar maacuteximo 10min ya que la solucioacuten podriacutea secarse debido a la luz del microscopio
8
Figura 2 Conteo directo A Utilizacioacuten de la caacutemara de Neubauer 1 posicioacuten de la laminilla 2 posicioacuten de la punta para el deposito de la muestra B esquema general de la caacutemara de Neubauer Adaptado de Bastidas (2015) httpwwwceleromicscomesresourcesdocsArticlesFormula-Camara-Neubauer-Concentracionpdf amp Universitat de Barcelona (2015) httpwwwubeduLabFisioimagesstoriesFisAnimalBiologiaSangrecontadorTomapng
El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central Las foacutermulas y los cuadros a contar se determinan seguacuten el tamantildeo del microorganismo
Hongos y microalgas Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes
(cuadros 1 y cuadro central Figura 2-B) de izquierda a derecha Bacterias Cuente en el cuadro central que contiene 25 cuadros secundarios
(Figura 2-B) 5 de ellos (Figura 3-A o B) Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios en estos las ceacutelulas deben contarse en la direccioacuten que se indica en la Figura 3-C Los cuadros terciarios contienen tres liacuteneas en los extremos por ello se deben tener en cuenta las ceacutelulas que esteacuten desde la liacutenea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D
Figura 3 Conteo en bacterias A y B Forma de contar los cuadros terciarios C Direccioacuten de conteo en los cuadros terciarios D Ceacutelulas a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios
9
Es importante resaltar que las bacterias que esteacuten unidas se contaraacuten como una Una vez obtenido el nuacutemero total de ceacutelulas se realizaran los caacutelculos correspondientes a los cuadros utilizados Para obtener el nuacutemero de bacterias se utiliza la ecuacioacuten planteada a partir de Bastidas (2015) Ndeg de bacteriasml=
En el caso de hongos y microalgas se utiliza la siguiente ecuacioacuten a partir de Bastidas (2015) Ndeg de ceacutelulasml= Fd Factor de dilucioacuten = Nota El meacutetodo de conteo en caacutemara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de ceacutelulas en los procedimientos de conservacioacuten de microorganismos Pero si se requiere la utilizacioacuten de otro meacutetodo se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados
Consideremos el siguiente ejemplo Tenemos un tubo con cultivo en medio liacutequido (10ml) de 36 horas este seraacute
nuestra muestra inicial Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con aliacutecuotas de 1ml en 9ml de diluyente Se realiza el procedimiento descrito en las paacuteginas anteriores haciendo un solo conteo Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de aliacutecuota g o ml de aliacutecuota + g o ml de diluyente
Ndeg Total de ceacutelulas contadas times 10000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
-El conteo directo con caacutemara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al meacutetodo de conservacioacuten evaluado
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
10
Aplicando la ecuacioacuten para bacterias anteriormente mostrada tenemos que
Ndeg de bacteriasml=
= 81012 bacteriasml
81012 bacteriasml seraacute la cantidad de bacterias que ldquoexistenrdquo en la muestra inicial Esta en teacuterminos matemaacuteticos de las diluciones equivale a 100
Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas contando en los
cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuacioacuten tenemos que Ndeg de ceacutelulasml= = 321011 ceacutelulasml
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Seleccione tres tubos de la dilucioacuten seriada y de cada uno vierta aliacutecuotas de 100microl (agitando con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) antes de cada extraccioacuten) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio Raacutepidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky esteacuteril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky A La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atraacutes B Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro luego girar 90deg la caja y repetir el proceso
A B
90deg
16 times 250000
10-7 times 5
-Si se quieren datos maacutes fiables se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma aliacutecuota o poner en la caacutemara cinco aliacutecuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras -Al realizar el conteo en la caacutemara de Neubauer obtenemos el total aproximado de ceacutelulas presentes en la dilucioacuten utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado yo las impurezas que pueda contener la muestra por lo cual no es 100 exacto y no indica las ceacutelulas viables
16 times 10000 10-7 times 5
11
Deje secar por miacutenimo 15min y lleve a incubacioacuten en posicioacuten invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja) Seguacuten el tipo de organismo las condiciones de incubacioacuten para la lectura de las cajas son
Bacterias temperatura ambiente 37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento
si se conoce Incubacioacuten de 18-24 horas Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas Casos extremos de crecimiento lento una semana
Hongos temperatura inferior a 25degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten de una siembra de solucioacuten de conidios de 4-8 diacuteas
Algas temperatura entre 25-37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten por maacuteximo 7 diacuteas en organismos descongelados o rehidratados
Luego de la incubacioacuten las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura
5) Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFCml)
Figura 5 Contador de colonias La caja de Petri se coloca en posicioacuten invertida y se marcan las colinas el contador cuenta al tacto
-La siembra por tubo se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador -Generalmente se toman las diluciones 10-5 10-6 y 10-7 Sin embargo si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3 10-4 y 10-5 -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70 flamear esperar a que el alcohol se consuma Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar por uacuteltimo palpe raacutepida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender para enfriar totalmente -Puede usarse una siembra en profundidad u otro meacutetodo para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie Sin embargo los demaacutes meacutetodos de conteo limitan la evaluacioacuten del indicador dos -Si al cabo de 30min las cajas no han secado el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condicioacuten -Con la punta de la micropipeta no toque el medio -Siempre use guantes y desinfeacutectelos constantemente durante los procedimientos
12
En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250 al suponer que cada ceacutelula forma una colonia Para el caacutelculo de UFCml utilizamos una adaptacioacuten de la foacutermula de Valencia Z(2004)
UFCml = times times
Ejemplo 120 X 107 X 10 = 121010 UFCml
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten se calcula a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010) Tasa de supervivencia (BSR )=
Donde DD Despueacutes de la desecacioacuten AD Antes de la desecacioacuten
Indicador dos Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realiza Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas)
Diligenciar el formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas (anexo 1) descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de ldquoconteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Hay que tener en cuenta que
- Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas) de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas deben ser observadas en al menos el 80 de las colonias de la placa seleccionada
Ndeg de colonias (promedio entre las cajas por dilucioacuten)
Inverso del factor de dilucioacuten
Inverso del volumen de aliacutecuota
-La metodologiacutea y los criterios de eleccioacuten de cajas asiacute como el rango son seguidas de Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo todas las placas por dilucioacuten por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -El inverso del volumen de aliacutecuota corresponde a una medida de correccioacuten obligatoria para la siembra en superficie ya que en la praacutectica se aumenta en 110 el factor de dilucioacuten al sembrar 01ml (100microl) del tubo de dilucioacuten seleccionado
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100 Log (Ndeg UFCml AD)
13
Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se realice una ldquocoloracioacuten de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005 paacuteg 24) En el caso de hongos realice una coloracioacuten simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado
Por uacuteltimo comparar los resultados con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y
macroscoacutepicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se toma registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio con caacutemara
Indicador tres Pureza de la cepa
Este indicador evaluacutea la pureza de un vialcriovial rehidratadodescongelado ademaacutes permite determinar si existe un cambio geneacutetico durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservacioacuten Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimaacutetica usando una bateriacutea de pruebas bioquiacutemicas o fisicoquiacutemicas diferenciales dependiendo de los requerimientos especiacuteficos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio Se recomienda realizar cada prueba por triplicado Tambieacuten puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales
-Realice una coloracioacuten de Gram estaacutendar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotograacutefico en un lapso no mayor a dos diacuteas -En los hongos es imprescindible el registro fotograacutefico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonoacutemica -El formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas exige un registro fotograacutefico pero alliacute solo se consignan si las fotografiacuteas son de alta calidad de lo contrario solo se dejan en la base de datos como referencia -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos -La estabilidad morfoloacutegica se evaluacutea pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -Para comparar las caracteriacutesticas macroscoacutepicas con la informacioacuten de origen se deben usar los mismos medios El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos
Si se confirma variacioacuten en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen y estas confirman la variacioacuten geneacutetica de la cepa inmediatamente se saca de la coleccioacuten origen se asigna un nuevo coacutedigo de identificacioacuten y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa Puede incluirse en la coleccioacuten Praacutecticas Acadeacutemicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva coleccioacuten
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RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento) Se toma un criovial (Semistock preferiblemente) sometieacutendolo a una
temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente 5min (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Los crioviales se introducen en bantildeo seroloacutegico una vez se llega a la temperatura deseada no antes
Del criovial se toma 1ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex
nivel 7 (asymp2240rpm) por 10s diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
La evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten se realiza al criovial luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubacioacuten (viables poscriopreservacioacuten) Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Geneacutetico
Liofilizados (Rehidratacioacuten o reconstitucioacuten)
Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC los viales a usar tomando el tiempo de rehidratacioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitando con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se toma un 1ml de este vial partiendo de esta aliacutecuota se realiza evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en medio soacutelido El indicador de viabilidad se evaluacutea solo con el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa u otro meacutetodo de conteo de organismos viables
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-dor donante sugiera otros meacutetodos de recuperacioacuten -La solucioacuten de rehidratacioacuten puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solucioacuten lioprotectora de la formulacioacuten -En el momento en que solo quede un criovialvial disponible de la cepa se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservacioacuten a partir de este
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REFRIGERACIOacuteN
Se implementa el meacutetodo de resiembra continua en este el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-Garciacutea et al 2010) cuando es utilizado para su almacenado nuevamente Se debe tener en cuenta los siguientes paraacutemetros
a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las
caracteriacutesticas del microorganismo ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios despueacutes de diacuteas semanas o meses Tambieacuten depende del tipo de medio de mantenimiento
b) El riesgo de contaminacioacuten y de cambios geneacuteticos se incrementa a mayor nuacutemero de transferencias
De acuerdo a esto para el laboratorio se determina
a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo
tapa rosca con Agar inclinado b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo procurando no
realizar maacutes de 4 transferencias c) La temperatura de refrigeracioacuten debe mantenerse en un rango de 4plusmn2degC d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminacioacuten
cruzada teniendo en cuenta la organizacioacuten interna del refrigerador evitando el amontonamiento de las cajas
e) Se utilizaraacute el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
f) Las cepas preservadas por este procedimiento seraacuten utilizadas para requerimientos internos del laboratorio preferiblemente en praacutecticas acadeacutemicas
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CRIOPRESERVACIOacuteN
Precriopreservacioacuten En el interior de la cabina de flujo laminar tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina Posteriormente son llenados con 1200microl de glicerol esteacuteril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados
Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de criopreservacioacuten (Martiacutenez amp Mayorga 2013) se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae una aliacutecuota de 1ml diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02)
Despueacutes agitar el tubo T02 con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s tomando
luego cinco aliacutecuotas de 600microl depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Se rotulan los crioviales y se realiza Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten Inmediatamente despueacutes de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente seguacuten la coleccioacuten a una temperatura de -85degC plusmn 1degC
Por uacuteltimo se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIOacuteN
culminado el proceso
-No use micropipeta para pipetear el glicerol -Todo el material debe ser correctamente esterilizado -Nunca tocar las tapas en el interior -De ser posible se recomienda una concentracioacuten de 10⁸ - 109 celml -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar 20min desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas (si se han determinado celml totales precongelamiento) -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables aumentando el nuacutemero de viables poscongelacioacuten Esto se puede hacer si no se tiene un nuacutemero determinado de ceacutelulas a una temperatura de 4degC plusmn 1degC por 20-30min -Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y poscriopreservacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas
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LIOFILIZACIOacuteN Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano Desde medio soacutelido
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio soacutelido se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general Posteriormente se debe agitar con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Desde medio liacutequido
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra diluyeacutendolo en un tubo con 9ml agua destilada esteacuteril (designado como T04)
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten Desde medio soacutelido
Del tubo T03 como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten y previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 1ml que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Desde medio liacutequido
Del tubo T04 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 100microl depositados en cuatro viales de vidrio En cada vial se adiciona 900microl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapoacuten de divisioacuten
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior de cada vial
sea lo maacutes exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T04 se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparacioacuten
Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado en
tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T04
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Con un volumen total de 1ml cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Los viales (indistintamente si se parte de medio soacutelido o liacutequido) se destapan parcialmente y se congelan en nitroacutegeno liacutequido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ge15min para ser llevados al liofilizador de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
Posliofilizacioacuten Luego del desmonte y sellado al vaciacuteo de los viales cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper posterior al proceso de liofilizacioacuten Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente El tercer vial (Lf) se almacena a 4degC plusmn 1degC en el cepario madre de liofilizados El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 diacuteas realizando evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten para saber si fue o no exitosa la liofilizacioacuten Por uacuteltimo se debe llenar el registro FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN culminado el proceso
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos En cuanto a los hongos el inoacuteculo inicial durante la preliofilizacioacuten se prepara
llenando con 10ml de agua destilada esteacuteril un cultivo soacutelido altamente esporulado del hongo Luego con un asa o espaacutetula esteacuteril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar Esta suspensioacuten es extraiacuteda con una pipeta esteacuteril y depositada en un tubo de ensayo al cual se le agrega 100microl de solucioacuten Tween 80 al 01 esteacuteril para preparar la solucioacuten de esporas Se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 20s y se prosigue de acuerdo a la ejecucioacuten de la liofilizacioacuten desde de un medio liacutequido
-Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y posliofilizacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas -Se debe realizar Voacutertex cada vez que se vaya a extraer una aliacutecuota -Los mejores resultados en la liofilizacioacuten se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas y en caldo SMPG un rango de 24-48h -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir maacutes tiempo del estipulado para su total congelamiento tener este dato de ser posible -El tiempo de liofilizacioacuten variacutea seguacuten la formulacioacuten Para una formulacioacuten con Sacarosa 10 36 horas es lo ideal -Debe usarse el accesorio para liofilizacioacuten Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vaciacuteo y de forma hermeacutetica -Los tapones de divisioacuten deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimacioacuten del agua de lo contrario no seraacute posible la liofilizacioacuten y pueden incluso quebrarse
-Si el raspado contiene rastros grandes de agar se debe realizar un filtrado con gasa esteacuteril aunque esto disminuiraacute el nuacutemero de esporas -Las esporas en solucioacuten pierden viabilidad conforme avanza el tiempo Se sugiere hacer uso de la solucioacuten antes de dos horas de preparada
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ROacuteTULOS
Refrigeracioacuten Dado que la refrigeracioacuten constituye un meacutetodo de corto plazo no se
requieren roacutetulos especiales para este meacutetodo de conservacioacuten Sin embargo es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente informacioacuten con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha
Criopreservacioacuten
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los roacutetulos de coleccioacuten usados en las cajas del Freezer y los roacutetulos para cada cepa criopreservada
Fecha de ingreso__________________________ Medio___________________________________ Cepa____________________________________ Coacutedigo__________________________________
-Es opcional imprimir este roacutetulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta
Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer
Figura 8 Roacutetulos para los crioviales
Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados
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Liofilizacioacuten
Los roacutetulos de la Figura 9 contienen la siguiente informacioacuten Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de
datos el Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo) nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten
de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6) con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada
vial Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
-Los roacutetulos de las cajas del Freezer los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo -Los roacutetulos deben colocarse antes de su almacenamiento especialmente los crioviales ya que una vez congelados el adhesivo no funciona
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Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio (paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
CC en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual moderado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro Existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o indirectamente Normalmente no existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005)
-En la base de datos del Banco Geneacutetico se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos pero el formato y tamantildeo de letra sea igual para todos los roacutetulos -Las etiquetas de liofilizacioacuten y criopreservacioacuten deben imprimirse en papel adhesivo -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos
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Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservacioacuten y en
el laboratorio
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CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121degC y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro meacutetodo de esterilizacioacuten las puntas de micropipetas los viales crioviales y sus respectivas tapas deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas) pueden ser esterilizados en horno a 160degC por 120min
Sin embargo se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de
todo el trabajo desde la preparacioacuten de medios hasta el sellado de viales y crioviales como se describe a continuacioacuten
Medios Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Son indicadores de contaminacioacuten cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios soacutelidos
Ambiente Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto) evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas El periodo de exposicioacuten va de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo Se recomienda que con un nuacutemero superior de cinco colonias en el control se desinfecte el aacuterea de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminacioacuten Cabina de flujo laminar
Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4 horas Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar
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Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70 al inico durante y al final del trabajo con cada cepa
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005) los residuos se pueden clasificar en cinco grupos La eliminacioacuten de residuos en el laboratorio de microbiologiacutea no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas por ello los desechos se dispondraacuten de la siguiente forma
Desechos no contaminados (no infecciosos) Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que
incluso pueden reutilizarse o reciclarse como el papel
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservacioacuten requiere
de material corto-punzante se cuenta con un guardiaacuten para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plaacutesticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestioacuten Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposicioacuten final de este material
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado
Las cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 20 minutos Posterior al proceso de autoclavado se deben someter a un proceso de desinfeccioacuten con hipoclorito al 15 durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jaboacuten neutro
Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas en todo caso deberaacuten tener el mismo proceso de desinfeccioacuten anteriormente mencionado
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Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado todos los desechos producidos en cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 15 minutos posterior a este proceso se descartaraacute el contenido de las cajas de Petri disponieacutendolos en bolsas rojas para residuos peligrosos Por otra parte los desechos liacutequidos deberaacuten ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa
No es directriz del laboratorio ni del Banco Geneacutetico la incineracioacuten de ninguacuten tipo de material o residuo peligroso solo de su disposicioacuten y almacenaje seguacuten lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos
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BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2 es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos estos son
ldquoAgentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente La exposicioacuten en el laboratorio puede provocar una infeccioacuten grave pero existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces y el riesgo de propagacioacuten es limitadordquo (OMS 2005 paacuteg 1)
El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Geneacutetico Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005)
Proteccioacuten personal El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial
Se recomienda el uso de batas blancas manga larga y bien abotonada con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar ensuciar o para prevenir alguacuten accidente
Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas bufandas o gorras
Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupcioacuten
Se debe utilizar proteccioacuten ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos
Debe respetarse la prohibicioacuten de beber comer masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como boliacutegrafos ademaacutes de tocarse los ojos y nariz
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Procedimientos Estaacute estrictamente prohibido pipetear con la boca se deben utilizar
pipeteadores mecaacutenicos Todos los cultivos stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un meacutetodo de descontaminacioacuten aprobado como por ejemplo mediante autoclave
Aacutereas de trabajo Las superficies de trabajo se descontaminan como miacutenimo una vez por diacutea
y luego de todo derrame de material contaminante
En las zonas de trabajo estaraacute prohibido comer beber fumar aplicar cosmeacuteticos manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en aacutereas de trabajo
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ninguacuten momento ropa u objetos personales
Capacitaciones Los encargados del Banco geneacutetico y del laboratorio deberaacuten estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma maacutes eficaz y asiacute reducir riesgos en el proceso
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado asiacute como de las maquinas y elementos del laboratorio
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REFERENCIAS
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Anexos y formatos
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32
BANCO DE LIOFILIZADOS
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CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
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En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
FORMATO PARA CARACTERIacuteSTICAS MACROSCOacutePICAS DE LAS CEPAS
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FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN
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FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN LIOFILIZACIOacuteN
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FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN CRIOPRESERVACIOacuteN
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten 16
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado 17
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua 18
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten 19
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes 21
Figura 6 Metodologiacutea 23
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 28
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelacioacuten 35
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 38
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 39
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados 40
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilizacioacuten definitiva por cepa bacteriana 41
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes 45
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales 46
Figura 17 Organigrama de la base de datos 47
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas 24
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten 27
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 28
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales 29
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada 31
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados 33
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten) 34
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004 36
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006 36
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007 37
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009 37
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010 38
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad 41
Tabla 14 Tabla de convenciones 42
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1 42
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada 44
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado 46
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencioacuten de los microrganismos y dada su importancia se han
creado colecciones bioloacutegicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologiacutea Existe variedad de meacutetodos de preservacioacuten en este trabajo se determinoacute el estado
de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad estandarizando e
implementando ademaacutes el sistema de liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos
evaluaacutendolos frente a tres compuestos protectores Se realizoacute una evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten teniendo como base tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
encontrando que el sistema de criopreservacioacuten implementado en el laboratorio es oacuteptimo y el
glicerol al 67vv funciona para casi todas las cepas por largos periacuteodos de tiempo la sacarosa
10pv resultoacute ser el mejor lioprotector de los tres evaluados designaacutendolo como lioprotector
general para el laboratorio Se creoacute un manual de laboratorio para la conservacioacuten de cepas que
incluye los protocolos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten y de seguridad de los mismos Este
trabajo aporta al campo de la microbiologiacutea de la conservacioacuten y constituye un peldantildeo maacutes para
el registro del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes
PALABRAS CLAVE Criopreservacioacuten liofilizacioacuten lioprotectores conservacioacuten
microorganismos
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and given its importance have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology Exists variety of methods of preservation in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing standardizing and further
implementing the system freeze-drying taking as a starting point to them evaluating them against
three protective compounds An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators
viability morphological stability and purity was performed finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67 vv works for almost all strains for long
periods of time sucrose 10 wv lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory It was created a manual for conservation
laboratory strains including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions
KEYWORDS cryopreservation freeze-drying lyoprotectants conservation microorganisms
11
1 INTRODUCCIOacuteN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible pues como lo menciona
Hurtado (2009) la vida no es posible sin la actividad de estos ya que estaacuten involucrados en todas
las dinaacutemicas ambientales existentes en el planeta Sin embargo su importancia ha ido maacutes allaacute
desde que fueron descubiertos hace unos 300 antildeos por van Leeuwenhoek potencializaacutendose su
investigacioacuten y utilizacioacuten en distintos campos de la ciencia y la tecnologiacutea en los uacuteltimos 100
antildeos iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi amp Mayz 2003)
Debido a esto se han creado colecciones bioloacutegicas como meacutetodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho Las colecciones de cultivos microbianos estaacuten
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt y a nivel internacional por
la Federacioacuten Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) en donde existen actualmente
2acute520200 microorganismos en 711 colecciones de 71 paiacuteses registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM) Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM el CIAT (Rhizobium Collection America) de coacutedigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccioacuten de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de coacutedigo WDCM 857 (WFCC 2015)
No obstante varias universidades del paiacutes instituciones puacuteblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias bioloacutegicas poseen colecciones microbioloacutegicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN) en otros casos las colecciones estaacuten en proceso de registro o en formacioacuten como en la
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) entre otras
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer meacutetodos de conservacioacuten fiables
que entre otras cosas eviten al maacuteximo el riesgo de peacuterdida o de variabilidad geneacutetica de los
individuos Existe variedad de meacutetodos de conservacioacuten seguacuten sea el tiempo que estaraacuten en la
coleccioacuten o el tiempo en que tardaraacuten en ser usados dentro de ellos destacan la criopreservacioacuten y
la liofilizacioacuten meacutetodos utilizados para la coleccioacuten de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo
Martiacutenez amp Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Geneacutetico en el Laboratorio
de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC siglas de la coleccioacuten microbioloacutegica) utilizando
la refrigeracioacuten como meacutetodo primario implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
criopreservacioacuten
En este trabajo se pretendioacute determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos evaluaacutendolos frente a tres compuestos
protectores Para ello en primera estancia se recibioacute una capacitacioacuten sobre manejo y control de
microrganismos preparacioacuten de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados posteriormente se evaluoacute el estado de criopreservacioacuten de las cinco
cepas seleccionadas utilizando teacutecnicas de recuento en placa estaacutendar y se evaluoacute a tres
lioprotectores para la liofilizacioacuten de cepas microbianas del Banco Geneacutetico ademaacutes se realizaron
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacioacuten y se disentildearon los
protocolos para la implementacioacuten del sistema de liofilizacioacuten con las cinco cepas y el lioprotector
que presentoacute mejores resultados en este estudio
Para la realizacioacuten de estos fines el trabajo fue dividido en cuatro fases comenzando por los
criterios de eleccioacuten de los microrganismos y los lioprotectores seguido de la evaluacioacuten de los
meacutetodos de preservacioacuten utilizando tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
posteriormente una tercera fase de ajustes a la liofilizacioacuten para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo utilizando como indicadores las propiedades fiacutesicas generales la
posibilidad de contaminacioacuten en el proceso y el tiempo de redisolucioacuten finalmente una cuarta
fase que corresponde al proceso de documentacioacuten este incluye la revisioacuten y modificacioacuten de la
base de datos la elaboracioacuten de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados asiacute como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccioacuten y finalmente la
elaboracioacuten del manual de procedimientos Con lo anterior se encontroacute que el sistema de
criopreservacioacuten desarrollado por Martiacutenez amp Mayorga (2013) es eficiente y permite porcentajes
de recuperacioacuten bastante altos incluso superiores al 90 luego de dos antildeos sin embargo no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estaacuten expuestas por
este meacutetodo De otro lado se determinoacute la sacarosa al 10 como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caracteriacutesticas propias de cada organismo)
y se estandarizoacute el sistema de liofilizacioacuten
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacioacuten de un nuevo meacutetodo de
conservacioacuten de microorganismos para el Banco Geneacutetico de la Universidad Distrital Francisco
Joseacute de Caldas ademaacutes aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacioacuten en bacterias y ofrece
informacioacuten yo tips sobre el proceso de liofilizacioacuten en general que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso Tambieacuten se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Geneacutetico en la comunidad cientiacutefica a nivel nacional
e internacional
Este documento consta en su orden de un capiacutetulo de introduccioacuten y un marco referencial de los
objetivos tanto general como especiacuteficos alcanzados en este trabajo una metodologiacutea detallada
paso a paso perfectamente reproducible los resultados encontrados asiacute como el anaacutelisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacioacuten
finalmente un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo el campo de la
conservacioacuten microbiana y los capiacutetulos correspondientes a las referencias y bibliografiacutea utilizada
Se incluye tambieacuten un capiacutetulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientiacutefica del presente trabajo
13
2 MARCO REFERENCIAL
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS
La vida en la Tierra no seriacutea posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado 2009) ya que estaacuten involucrados con las dinaacutemicas en los ecosistemas terrestres aeacutereos
y acuaacuteticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta Existen
microorganismos que degradan la materia orgaacutenica hacieacutendola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) evitando que el mundo sea un vertedero
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnoloacutegicos de la humanidad
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea Bacteria y
Eucarya en donde encontramos como primeros representantes a las bacterias las maacutes numerosas
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) muchas pueden
resultar beneacuteficas para ser utilizadas con fines biotecnoloacutegicos agriacutecolas biomeacutedicos ecoloacutegicos
y de biorremediacioacuten (Morales-Garciacutea et al 2010) Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucioacuten en la naturaleza contribuyendo a la descomposicioacuten de la materia orgaacutenica y
participando en los ciclos bioloacutegicos (Pontoacuten Moragues Geneacute Guarro amp Quindoacutes 2002)
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucioacuten de los
graves problemas de la humanidad (Gonzaacuteles de Oca Martiacutenez Riveroacuten amp Nuacutentildeez 2006) en la
agricultura alimentacioacuten salud y en la buacutesqueda de nuevas fuentes de energiacutea y la conservacioacuten
del medio ambiente Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioquiacutemicas para Atlas (citado por Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez
1998) dicha capacidad se basa ldquoen la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones oxidaciones reducciones y precipitacioneshellip y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierrardquo (paacuteg 289)
Los recursos microbioloacutegicos (microorganismos genes e informacioacuten) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologiacutea las ciencias de la vida (Ivshina amp Kuyukina 2013) el
desarrollo de medicamentos farmaceacuteuticos agentes agroquiacutemicos biocontroles cosmeacuteticos y
productos industriales (Ten Kate 1995) Ademaacutes con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el eacutexito de los primeros aislamientos de microorganismos se marcoacute la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacioacuten de toda la biodiversidad microbiana logrando la inclusioacuten de este tema en el
desarrollo de las poliacuteticas ambientales (Gonzaacuteles et al 2006)
El meacutetodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta fuera de sus
ambientes ecosistemas y nichos ha sido la creacioacuten de colecciones bioloacutegicas cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfoloacutegicos fisioloacutegicos o
geneacuteticos (Montes de Oca et al 2008) Las colecciones de cultivos microbianos variacutean en forma
funcioacuten y tamantildeo Pueden ser pequentildeas privadas mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especiacuteficos (Duratildees Sette Pagnocca amp Rodrigues 2013)
14
El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura baacutesica de
investigacioacuten en ciencias de la vida llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg Dedeurwaerdere amp Pascual 2013) de animales y plantas pero se cuentan con
caracteriacutesticas especiacuteficas para los microorganismos En primer lugar los organismos microbianos
tienen una variacioacuten geneacutetica extremadamente alta y altos iacutendices de mutacioacuten en la reproduccioacuten
en las especies por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al 2013) a su lugar de recoleccioacuten En segundo lugar las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacioacuten asegurar los recursos geneacuteticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes para proporcionar biomateriales autenticados
para materiales de investigacioacuten exploracioacuten y produccioacuten asiacute como su uso contemporaacuteneo por
parte de las entidades privadas y puacuteblicas (Stromberg et al 2013)
Los microorganismos al igual que otros seres vivos poseen una uacutenica e irremplazable
secuencia de ADN por lo que su desaparicioacuten implicariacutea la peacuterdida irreversible de un conjunto
uacutenico de informacioacuten (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) de ahiacute la gran importancia en la
creacioacuten de comiteacutes comisiones federaciones y grupos de microbiologiacutea como World Federation
for Culture Collection (WFCC) International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacioacuten
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC 2010b)
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
En las colecciones es necesario establecer meacutetodos de conservacioacuten confiables y especiales
pudiendo realizarse a corto mediano y largo plazo para asegurar la oacuteptima viabilidad
almacenamiento y pureza (WFCC 2010b) de los diferentes microorganismos Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de peacuterdida cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
miacutenimo dos meacutetodos (WFCC 2010b) de conservacioacuten que consideren el tiempo a emplear en la
preservacioacuten inicial manipulacioacuten y control perioacutedico de las cepas asiacute como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemaacuten Diacuteaz Rosa amp Aacutelvarez Molina 2005)
Se debe tener especial cuidado con geacuteneros y especies todaviacutea no conservadas en colecciones
(especies nuevas) contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
oacuteptimos (WFCC 2010a) de conservacioacuten de estos
221 Conservacioacuten a corto plazo
Comuacutenmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestioacuten seraacute utilizado en un corto
periodo de tiempo Suele utilizarse la teacutecnica de resiembra continua en este el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC
donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garciacutea et al 2010)
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten
Este concepto agrupa a las teacutecnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 antildeos (Weng et al 2005) Existen variedad de teacutecnicas como la
desecacioacuten el gel de siacutelice o perlas de vidrio el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al
2005) o la congelacioacuten La inclusioacuten de esta uacuteltima teacutecnica en este grupo es discutida por algunos
autores ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacioacuten como la criopreservacioacuten (o
15
congelacioacuten) son teacutecnicas de conservacioacuten a largo plazo (Perry 1995 Weng et al 2005) y otros
insisten su inclusioacuten en las teacutecnicas de conservacioacuten a mediano plazo (Morales-Garciacutea et al 2010)
La criopreservacioacuten consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas
Esto permite la eliminacioacuten del agua libre disponible y que en el interior de los individuos ldquosoacutelo
una proporcioacuten del total de agua se convierta en hielordquo (Perry 1995 paacuteg 23)
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 deg C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta peacuterdida de la
viabilidad del cultivo (Perry 1995) por parte del laboratorio Este meacutetodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las ceacutelulas a -80degC
(Morales-Garciacutea et al 2010) Heckly (citado por Perry 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas la viabilidad celular es casi independiente del periacuteodo de almacenamiento ademaacutes
se cree que los individuos criopreservados siguen siendo geneacuteticamente estables
Hubaacutelek (2003) menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacioacuten de microorganismos desde las caracteriacutesticas propias del individuo (cepa
especie tamantildeo y forma de celda fase de crecimiento al momento de congelar composicioacuten de las
ceacutelulas etc) asiacute como los factores antes (composicioacuten del medio de crecimiento pH temperatura
de incubacioacutenhellip) durante y posterior al proceso de criopreservacioacuten (densidad poblacional
aditivos temperatura y duracioacuten del almacenamientohellip) e incluso en su descongelacioacuten
ldquoLos aditivos crioprotectores son compuestos quiacutemicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los dantildeos durante el proceso de congelacioacutenrdquo (Gonzaacuteles et al 2006 paacuteg
16) Estos protectores se pueden clasificar seguacuten su peso molecular (bajo o alto) o seguacuten su tasa
yo capacidad de penetracioacuten los penetrantes de bajo peso molecular que desplazan el agua
intracelular evitando la formacioacuten de hielo (por ejemplo el glicerol) y los no penetrantes de alto
peso molecular que promueven la raacutepida deshidratacioacuten de la ceacutelula (por ejemplo los gluacutecidos)
(Hubaacutelek 2003)
223 Conservacioacuten a largo plazo
Este concepto agrupa a las teacutecnicas que ademaacutes de minimizar al maacuteximo el riesgo de cambio
geneacutetico en las ceacutelulas mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 antildeos o maacutes (Weng et al 2005)
La maacutes popular es la liofilizacioacuten
2231 Liofilizacioacuten
La liofilizacioacuten consiste en la eliminacioacuten del agua de una sustancia congelada por
sublimacioacuten del hielo bajo alto vaciacuteo y a presiones muy bajas (Gonzaacuteles et al 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador Si la liofilizacioacuten es exitosa se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacioacuten por varios antildeos de los microorganismos sin embargo dicho eacutexito depende de
muacuteltiples factores entre otros como los mencionados por Hubaacutelek (2003) para la criopreservacioacuten
(puesto que la liofilizacioacuten posee una etapa de congelacioacuten) asiacute mismo el tiempo de liofilizacioacuten
los paraacutemetros de liofilizacioacuten el medio aditivo o lioprotector usado tipo de liofilizador o
accesorio utilizado influyen en el producto final
16
El proceso de conservacioacuten de microorganismos por liofilizacioacuten se puede dividir en muacuteltiples
etapas desde la formulacioacuten del protector hasta el modo en que se recuperaraacuten los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1)
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacioacuten Asiacute mismo se
representa el efecto de cascada en teacuterminos de la viabilidad de las muestras
a) Formulacioacuten
Se entiende como la mezcla de ceacutelulas con cualquier solucioacuten protectora que tras la
eliminacioacuten del disolvente permita obtener un producto (liofilizado) deseado La solucioacuten
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacioacuten Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de gluacutecidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics 2015)
Las soluciones protectoras oacuteptimas contienen principalmente un soluto protector
denominado lioprotector que estabiliza las ceacutelulas cuando se elimina el disolvente (agua)
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despueacutes de la liofilizacioacuten (Figura 2) Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actuacutean como su propia matriz por ejemplo la sacarosa al
10 (Ops Diagnostics 2015)
La formulacioacuten tambieacuten comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse pudiendo variar de si se parte de un cultivo soacutelido en
agar o de un cultivo liacutequido hasta que sean cultivos soacutelidos densos (edad de 1-2 diacuteas) o
liacutequidos en fase estacionaria Cuando se parte de un medio liacutequido y si es posible las
ceacutelulas se centrifugan retirando el medio de cultivo y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucioacuten protectora (Ops Diagnostics 2015) o de lioprotector (Grauer
Grunberg amp Zardo 2015) Para cultivos desde agar suele lavarse la placatubo con 5-10
ml de medio protector posteriormente recogido con una pipeta esteacuteril (Ops Diagnostics
2015) Aunque en esto uacuteltimo se evita la centrifugacioacuten se obtiene un mayor nuacutemero de
ceacutelulas partiendo de cultivos liacutequidos (Grauer et al 2015)
17
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado
Fuente Adaptado de Jennings T A (2008) Lyophilization Introduction and Basic Principles (paacuteg 5)
New York Informa Healthcare USA Inc
b) Congelacioacuten
La congelacioacuten es la primera etapa del meacutetodo de liofilizacioacuten y uno de los maacutes
importantes para el eacutexito de este Su funcioacuten consiste en obtener una matriz en donde esteacute
separado el disolvente de los solutos Cuando se congela la formulacioacuten el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regioacuten intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings 2008) la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regioacuten intersticial a casi 0 ademaacutes proporciona una estructura
con resistencia casi nula al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings
2008)
Disminuir el flujo de agua raacutepidamente es importante para evitar asiacute la excesiva
concentracioacuten de solutos un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracioacuten de solutos evitando el estreacutes osmoacutetico y permitiendo una organizacioacuten
espacial de los componentes de la formulacioacuten en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al 2015)
La temperatura y el tiempo para una congelacioacuten completa de la formulacioacuten
dependen de la naturaleza de la misma Nireesha et al (citado por Grauer et al 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco de ahiacute que una correcta congelacioacuten reduce la
desnaturalizacioacuten teacutermica del liofilizado ldquoinmoviliza componentes de la solucioacuten y evita
la formacioacuten de espuma cuando se aplica el vaciacuteordquo (Adams 2007)
c) Secado primario
Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacioacuten ademaacutes es la de maacutes larga
duracioacuten En este etapa la presioacuten se reduce y la temperatura de la formulacioacuten congelada
es elevada dando lugar a la sublimacioacuten (Figura 3) y migracioacuten de vapor de agua (Grauer
et al 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador Sin embrago dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
euteacutectica de colapso de transicioacuten viacutetrea (Tg) para minimizar el dantildeo de la muestra
(Adams 2007)
18
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua Se indican los requerimientos de presioacuten
y temperatura que hacen posible la sublimacioacuten del agua durante la liofilizacioacuten
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
El tiempo para el secado primario depende de muacuteltiples factores como la
composicioacuten de la solucioacuten protectora la porosidad del congelado la calidad o resistencia
de la matriz la cantidad de muestras asiacute como tambieacuten el volumen de la formulacioacuten entre
otros Respecto al volumen ldquopara las bacterias las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 025 a 05 mlrdquo (Ops Diagnostics 2015) Aunque no existe un
volumen establecido hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de maacutes
tiempo
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) un periacuteodo de secado primario de un diacutea es suficiente
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras teniendo
como guiacutea un tiempo de liofilizacioacuten de una noche
La etapa de secado primario finaliza ldquocuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacioacuten y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congeladardquo (Jennings 2008 paacuteg 6)
d) Secado secundario
Es la tercera y uacuteltima etapa de la liofilizacioacuten Al terminar el secado primario se ha
eliminado el agua moacutevil de la muestra Sin embargo existe agua atrapada dentro del soacutelido
amorfo que es maacutes difiacutecil de eliminar (Fetterolf 2010) La cantidad de agua es discutible
ya que fluctuacutea en funcioacuten de la temperatura y las caracteriacutesticas propias de los
19
constituyentes de la formulacioacuten por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10 ww del producto seco (Jennings 2008) o del 2-4 (Ops Diagnostics 2015)
La reduccioacuten del contenido de humedad en la torta se logra por desorcioacuten (Adams
2007) sin reducir el volumen de la misma (Jennings 2008) Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presioacuten parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario durante el secado secundario
(Ops Diagnostics 2015) Es importante que la temperatura no se incremente velozmente y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicioacuten viacutetrea la cual aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf 2010)
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) esta etapa es relativamente corta con una duracioacuten de
1 a 2 horas aunque Grauer et al (2015) indica que representa entre el 30-40 del tiempo
total del proceso asiacute mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo
con una duracioacuten de hasta varios diacuteas Esto resulta importante puesto que ldquola cantidad de
agua residente luego del secado afecta la tasa de peacuterdida de viabilidad durante el
almacenamientordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 16)
Finalmente al ser removida la humedad residual la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al 2015) obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2) o pastel esponjoso con poca (inferior al 1) o nula humedad
residual (Fetterolf 2010)
Las tres etapas del proceso de liofilizacioacuten en funcioacuten de la temperatura y la presioacuten
y en contraste con el diagrama de fases del agua pueden ser observadas en la Figura 4
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten De 1-3 Congelamiento (1-2 presioacuten
atmosfeacuterica) de 3-4 secado primario de 4-5 Secado secundario
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
20
e) Sellado y almacenamiento
Terminado el proceso de secado secundario se deben sellar los viales al vaciacuteo (de ser
posible) o de forma hermeacutetica tan pronto como sea posible debido a que la torta actuaraacute
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf 2010) aunque
tambieacuten es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams 2007) e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de siacutelice
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Sin embrago aunque
se logre un correcto sellado al vaciacuteo no se puede asegurar una larga vida uacutetil en condiciones
ambientales ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al 2015)
por ello lo mejor es almacenar los liofilizados a 4deg C en la oscuridad (Ops Diagnostics
2015) reduciendo las posibilidades de peacuterdidas aunque haya quedado agua despueacutes del
secado
f) Reactivacioacuten o rehidratacioacuten
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacioacuten original esto
implica la adicioacuten de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings 2008
Grauer et al 2015) La dilucioacuten raacutepida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings 2008) da cuenta de un correcto proceso de liofilizacioacuten
ldquoTiempos de reconstitucioacuten excesivamente largos la peacuterdida de potencia o la formacioacuten
de una solucioacuten turbia son indicios de un proceso de liofilizacioacuten inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacioacutenrdquo (Jennings 2008 paacuteg 11)
La recuperacioacuten de las ceacutelulas sin embrago tambieacuten se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacioacuten) el tipo
de diluyente su temperatura su pH la osmolaridad (Grauer et al 2015) la potencia del
lioprotector (Jennings 2008) entre otras propiedades de la solucioacuten resultante
Grauer et al 2015 sugieren la utilizacioacuten de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacioacuten de los microorganismos con el fin de evitar el estreacutes
osmoacutetico que pueden causar las soluciones diluidas sin embargo algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacioacuten especiacuteficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato
Ops Diagnostics (2015) indican que una tasa de supervivencia superior al 50 se
considera aceptable por muchos laboratorios
2232 Control de calidad de un producto liofilizado
Las propiedades fiacutesicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayoriacutea un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacioacuten entre los
paraacutemetros de la formulacioacuten y el proceso de liofilizacioacuten por ello permiten el seguimiento y la
deteccioacuten de falencias (Jennings 2008)
21
Esta evaluacioacuten permite caracterizar las diferentes propiedades fiacutesicas quiacutemicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre dichas propiedades Jennings (2008) y Ticoacute
G (1987) recogen algunos de las toacutepicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado por ejemplo las propiedades generales fiacutesicas de la torta (color volumen temperatura
de transicioacuten textura porosidad densidad contraccioacuten o colapso estado del vial entre otras que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacioacuten) su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfeacuterica) la velocidad de redisolucioacuten o
reconstitucioacuten la estabilidad (de la torta el microorganismo o el lioprotector evaluada de forma
natural o acelerada) nivel de humedad residual posibles contaminantes entre otras
2233 Equipamiento para liofilizar
Como ya se mencionoacute inicialmente el proceso de liofilizacioacuten requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5) este equipo consta esencialmente de tres partes
a) Un sistema o bomba de vaciacuteo que reduce la presioacuten del ambiente de la caacutemara que contiene
el material a secar Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dantildeen ldquoEl nivel
de vaciacuteo requerido debe ser entre 50 y 100 μbarrdquo (Grauer et al 2015 paacuteg 9) aunque 200
μbar son aceptables
b) Un condensador con circuito de refrigeracioacuten que comunica con la caacutemara de secado y
condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacioacuten sobre una superficie enfriada
inferior a los -40degC
c) Caacutemara o accesorio de secado que es donde se coloca el material a secar Seguacuten Nireesha
et al (2013) puede ser de tres tipos
- Manifold o colector muacuteltiple
- Rotary
- Tray style de bandejas con o sin estante de taponado eacuteste uacuteltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaciacuteo de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes En la imagen el liofilizador usa una
caacutemara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial
Tomado de httpslideplayercombrslide84760 el 15 de Agosto de 2015
22
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad y liofilizacioacuten de las mismas evaluaacutendolas frente a tres compuestos protectores
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas utilizando teacutecnicas de recuento
en placa estaacutendar
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacioacuten de cepas microbianas
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten
Disentildear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacioacuten a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados
23
4 METODOLOGIacuteA
La metodologiacutea general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases como es ilustrado en la
Figura 6
Figura 6 Metodologiacutea Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia loacutegica de eventos
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra
41 FASE INICIAL
411 Acervo Microbiano
De la coleccioacuten de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Geneacutetico del laboratorio de
microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracioacuten de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologiacutea estas corresponden a CR004 CR005 (sustituida posteriormente
por CR009) CR006 CR007 y CR010 seguacuten los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodriacuteguez (2013) Todas estaban conservadas por el meacutetodo de criopreservacioacuten (o
criocongelacioacuten) a una temperatura de -85 degC plusmn 1degC
412 Eleccioacuten de los protectores
4121 Crioprotectores
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99999) (Mallinckrodt Meacutexico) en
proporcioacuten 67 vv seguacuten lo establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
4122 Lioprotectores
Para la eleccioacuten de los agentes protectores y sus concentraciones en pv (Tabla 1) se
tuvieron en cuenta diferentes estudios en contraposicioacuten a Hensel (1994) se tomaron
concentraciones superiores al 9 de Glucosa (Merck Darmstadt) de forma aleatoria En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed amp
Roos (2004) y Palmfeldt Radstroumlm amp Hahn-Haumlgerdal (2003) Para la leche descremada
(Proleche Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al (2003) Dichos estudios
fueron tomados como referencia teoacuterica aunque los microorganismos en ellos especificados no
correspondan con los del presente trabajo
Criterios de eleccioacuten de los
microorganismos asiacute como de
los lioprotectores a evaluar
Evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten (criopreservacioacuten
y liofilizacioacuten)
Ajustes a la liofilizacioacuten
para la generacioacuten de
protocolos
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
24
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracioacuten
pv
10 4 10
117 10 15
27 15 20
42 FASE INTERMEDIA 1
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
En este trabajo se evaluaron dos meacutetodos de conservacioacuten (criopreservacioacuten y liofilizacioacuten)
dicha evaluacioacuten se realizoacute en teacuterminos de tres (3) indicadores valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al meacutetodo en siacute
4211 Viabilidad
Para evaluar este indicador se utilizoacute
a) Conteo directo con caacutemara de Neubauer 110mm (Boeco) siguiendo la metodologiacutea
planteada por Valencia Z (2004) Sin embargo para obtener el nuacutemero de bacterias se
utilizoacute la ecuacioacuten planteada por Bastidas (2015)
No de bacteriasml=
Fd Factor de dilucioacuten =
El conteo directo con caacutemara de Neubauer solo se realizoacute previamente al meacutetodo de conservacioacuten
evaluado
b) Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa seguacuten lo
descrito por Valencia Z (2004) y Camacho et al (2009) Para el caacutelculo de UFCml se
utilizoacute la siguiente foacutermula
UFCml = Ndeg de colonias times times
Los caacutelculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologiacutea planteada por
Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales se utilizoacute los planteamientos del Instituto
de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacioacuten y solo pos a la criopreservacioacuten en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid
England)
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten
fue calculado a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010)
Tasa de supervivencia (BSR ) = DD Despueacutes de la desecacioacuten
AD Antes de la desecacioacuten
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000
Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucioacuten
1
ml de muestra
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100
Log (Ndeg UFCml AD)
25
4212 Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realizoacute
a) Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) Se elaboroacute un formato (anexo 1) con las
caracteriacutesticas macroscoacutepicas descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz
(2009) para las colonias desarrolladas en superficie a partir del procedimiento de ldquoconteo
de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Se utilizoacute un
contador de colonias CC-1 (Boeco)
- Se seleccionoacute solo una de dos placas de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de
UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron observadas en al menos el 80 de las colonias
de la placa seleccionada
b) Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se
realizoacute una ldquocoloracioacuten de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005
paacuteg 24)
Se compararon con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y macroscoacutepicas descritas por
Rodriacuteguez (2013) y la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se tomoacute
registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio (Zeiss)
con caacutemara Canon G9
4213 Pureza
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en
cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante
teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
422 Recuperacioacuten de los microorganismos
Para la recuperacioacuten de los microorganismos se tomoacute un criovial de cada cepa bacteriana
sometido a una temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua
destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente cinco (5) minutos (Martiacutenez amp Mayorga
2013) Los crioviales se introdujeron en bantildeo seroloacutegico una vez se llegoacute a la temperatura deseada
no antes
De cada criovial se tomoacute un (1) ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (asymp2240rpm) por diez (10) segundos diluyeacutendolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
Se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten a cada criovial (Thomas
Scientific 5150636) por cepa luego de preparado el tubo T01 antes de la incubacioacuten Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martiacutenez amp Mayorga
(2013) y Rodriacuteguez (2013)
26
423 Criopreservacioacuten
4231 Precriopreservacioacuten
Pasado el tiempo de incubacioacuten se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten al tubo T01 con el fin de determinar el nuacutemero de ceacutelulas totales y viables de la
muestra El conteo en Caacutemara de Neubauer se realizoacute solo hasta el final de los procedimientos de
preservacioacuten por lo cual una vez preparadas las diluciones estas fueron llevadas a nevera a 4degC plusmn
1degC para evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Se siguioacute el protocolo de criopreservacioacuten establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas con
algunas variaciones
Con pipeta esteacuteril de 5ml se depositaron en cinco (5) crioviales 12ml de glicerol anhidro
esteacuteril
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02)
Posteriormente se tomaron aliacutecuotas desde T02 de 600microl previo Voacutertex nivel 7 por 15s
depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl Se rotularon y se
realizoacute Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten
Inmediatamente despueacutes de la homogenizacioacuten fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick) a una temperatura de -85degC plusmn 1degC en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestioacuten
Este procedimiento se realizoacute en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar veinte (20) minutos (Martiacutenez amp
Mayorga 2013) desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar
la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
424 Liofilizacioacuten Etapa 1
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Se partioacute del tubo T01 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de
liofilizacioacuten Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel
7 (asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml agua destilada esteacuteril (T03)
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
Partiendo del tubo T03 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se
extrajeron aliacutecuotas de cien (100) microl veintisiete (27) veces depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar En cada criovial se adicionaron novecientos (900) microl de lioprotector en tres
crioviales por cada concentracioacuten de lioprotector de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2)
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior del criovial fuera lo maacutes
exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T03 se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacioacuten
27
Donde el volumen inicial y la concentracioacuten inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado en tanto que el volumen final y la concentracioacuten final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T03
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (aliacutecuota maacutes protector) se
agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacioacuten
Posteriormente a los crioviales se les retiraron las tapas plaacutesticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney PM-996) esterilizado realizando seis (6) perforaciones conceacutentricas en la superficie
con aguja hipodeacutermica 21G x 1frac12rdquo Los crioviales fueron congelados en nitroacutegeno liacutequido por
15min aproximadamente depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD Thermo
Scientific) de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45degC usando el colector muacuteltiple (manifold)
Terminado el proceso se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la caacutemara
de flujo laminar para evitar contaminacioacuten de las muestras alliacute se les retiroacute el Parafilm se les tapoacute
con tapas esteacuteriles y se les rotuloacute
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten
Lioprotector Concentracioacuten
(pv)
Serie
A B C
Glucosa
10 1 1 1
117 1 1 1
27 1 1 1
Sacarosa
4 1 1 1
10 1 1 1
15 1 1 1
Leche
descremada
10 1 1 1
15 1 1 1
20 1 1 1
Total crioviales seguacuten Ndeg 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje)
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten utilizando una etiqueta o
roacutetulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacioacuten
Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de datos el
Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten
bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo)
nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3) con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo
bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas
tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada vial
Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional
a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
Posterior al proceso de rotulado los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano a temperatura ambiente y protegido de la luz
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS
CC en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado riesgo
poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entrantildear un riesgo grave para el personal de
laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado
riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro Existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o
indirectamente Normalmente no existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005)
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio
(paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications
biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
29
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2
Se realizoacute una prueba de estabilidad natural en teacuterminos del aspecto fiacutesico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un periacuteodo prolongado de tiempo (Grauer et al 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente Por ello la rehidratacioacuten de los crioviales se realizoacute en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4)
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales
Primera rehidratacioacuten Segunda rehidratacioacuten Tercera rehidratacioacuten
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota Intervalos de tiempo medidos en diacuteas contados desde el diacutea de almacenaje en los cuales se rehidratoacute
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie ver Tabla 2) El aspecto fiacutesico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacioacuten y comparado con su estado antes del almacenaje
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC tomando
el tiempo de reconstitucioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel
2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten El indicador de viabilidad se evaluoacute solo con el meacutetodo de conteo de
microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la maacutes alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa se eligioacute el
lioprotector y la concentracioacuten de eacuteste que permitioacute obtener un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables
posliofilizacioacuten y que ofrecioacute ademaacutes una menor variacioacuten durante la prueba para la liofilizacioacuten
definitiva de las cepas en estudio Dicho lioprotector se establecioacute ademaacutes como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados del Banco
Geneacutetico del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
43 FASE INTERMEDIA 2
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores con el aacutenimo de
generar un protocolo funcional aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partioacute de cultivos puros sobre medios soacutelidos se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacioacuten liofilizacioacuten y posliofilizacioacuten para la
liofilizacioacuten definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados
431 Liofilizacioacuten definitiva
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracioacuten oacuteptima para cada cepa
de estudio se realizoacute la liofilizacioacuten definitiva
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general Posteriormente se agitoacute con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Esto se realizoacute para cada
cepa
30
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
El tubo T04 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten
definitiva se extrajeron cuatro (4) aliacutecuotas de un (1) ml previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass 62113D-2)
posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por
7s para su homogenizacioacuten
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas a una presioacuten
inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
El proceso de destape parcial y congelacioacuten se realizoacute en caacutemara de flujo laminar para evitar
al maacuteximo la contaminacioacuten El transporte de los viales desde la caacutemara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitroacutegeno liacutequido
para evitar contaminacioacuten y descongelacioacuten
4313 Posliofilizacioacuten
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten Dos viales
designados como trabajo (T) y stock (S) fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4degC plusmn 1degC
4314 Rehidratacioacuten
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacioacuten de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio soacutelido
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos
Se llevoacute un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el aacutenimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacioacuten Al identificarlas se decidioacute repetir la
liofilizacioacuten definitiva con los nuevos paraacutemetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio
4321 Propiedades fiacutesicas generales
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento) color textura brillo aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales teniendo como punto de comparacioacuten la formulacioacuten
luego de congelada Esto se realizoacute para
- Crioviales de la fase intermedia 1
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 431)
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 433)
4322 Contaminacioacuten
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad en
buacutesqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio
31
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten
Se midioacute el tiempo de reconstitucioacuten de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y el tiempo de los crioviales que conteniacutean el lioprotector general fue comparado
con el tiempo de reconstitucioacuten de los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada
433 Pruebas adicionales
Para estas pruebas solo se usoacute la formulacioacuten del lioprotector general y la cepa CM-CR010
por su alta tasa de crecimiento respecto a las demaacutes cepas evaluadas
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticoacute G 1987) se
tomaron los pesos con balanza analiacutetica (AND GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos El cuarto vial y criovial se abrieron solo una vez luego
fueron sellados completamente tomando sus pesos de la misma forma ya descrita
Para determinar si existe un tiempo maacuteximo admisible de cerrado se midioacute el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcioacuten del tiempo utilizando la ecuacioacuten
descrita por Garciacutea C (2007)
Wt () es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4332 Prueba de estabilidad acelerada
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa uno fue rehidratado a los cero (0) diacuteas y el otro
luego de siete (7) diacuteas en el interior de la caacutemara de envejecimiento ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5 Adicionalmente se dataron sus propiedades fiacutesicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada
Ndeg vial t ndash Tdeg - HR
1 0 - ambiente - 25
2 7 - 37degC - 100
Nota Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos t= Tiempo en diacuteas
Tdeg=Temperatura HR=Humedad relativa La prueba de estabilidad se realizoacute en una caacutemara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC luego
incubados a 25 degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente
se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten midiendo viabilidad con el meacutetodo
de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
32
434 Control de esterilidad
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121degC y 210Kpa por 20 minutos las puntas de micropipetas los viales
crioviales y sus respectivas tapas fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y
temperatura en un tiempo de 15 minutos Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas) fueron esterilizados en horno Binder a 160degC por 120 minutos
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo desde la
preparacioacuten de medios hasta el sellado de los viales como se describe a continuacioacuten
4341 Medios
Se realizoacute control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid England) (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Se determinoacute como indicador de contaminacioacuten
cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios
soacutelidos
4342 Ambiente
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realizoacute con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas El periodo de exposicioacuten fue de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en
incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo
b) Cabina de flujo laminar
Se realizoacute el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este
caso la caja de control de ambiente se dejoacute abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeriacutean el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4
horas Este control se llevoacute a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolloacute en el interior de la cabina de flujo laminar
se procuroacute mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y
tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70 al iniciar el trabajo con cada cepa
44 FASE FINAL
441 Base de datos
Se realizoacute una revisioacuten a la base de datos del Banco de cepas creado por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) en el programa Access modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccioacuten para la informacioacuten de los organismos liofilizados
33
442 Fichas de resumen
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccioacuten tanto del Freezer
como del banco de liofilizados utilizando el programa Word 2013
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se realizoacute una revisioacuten de la informacioacuten en los roacutetulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos con el aacutenimo de verificar si se habiacutean cumplido los protocolos y la
logiacutestica establecida por Martiacutenez amp Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias
444 Formatos de control del banco de liofilizados
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013 para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) en la seccioacuten
de criopreservacioacuten
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados
Coacutedigo Tipo de registro Ubicacioacuten Uso
FLf-01 Registro de entrada de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccioacuten
FLf-02 Proceso de
liofilizacioacuten
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacioacuten a
una cepa
FLf-03 Registro de control de
calidad
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccioacuten y antes de liofilizar
una cepa para la coleccioacuten
FLf-04 Solicitud salida de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados
Fuente Adaptado de Martiacutenez Beniacutetez H L amp Mayorga Burgos L P (2013) Implementacioacuten de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (Tesis de
pregrado) (paacuteg 44) Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas Bogotaacute Colombia
445 Manual de procedimientos
Se realizoacute una revisioacuten de la cartilla de procedimientos elaborada por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) Se tomoacute la decisioacuten de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013
34
5 RESULTADOS
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN
A raiacutez de la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en cada criovial por cepa
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno En cuanto a CM-CR005 se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer pero no fue posible recuperarla por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009 la sexta mejor respecto al criterio de eleccioacuten de cepas
Con los datos del proceso precriopreservacioacuten de las cepas de intereacutes correspondientes a la
coleccioacuten de colorantes consignados en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) en conjunto con
los datos de viables poscongelacioacuten del presente trabajo se calculoacute la BSR para cada cepa (Tabla
7) Se encontroacute que los porcentajes de BSR son superiores al 70 luego de dos (2) antildeos de estar
en criopreservacioacuten (Figura 8) salvo CM-CR005
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martiacutenez amp Mayorga (2013) (soacutelo se compararon los datos de la cepa CM-CR010 ya que las demaacutes
cepas no figuran en su trabajo) se encontroacute un porcentaje inferior de recuperacioacuten
poscriopreservacioacuten por parte de las autoras por lo cual se revisoacute la metodologiacutea encontrando un
error metodoloacutegico al calcular la BSR en su trabajo Usando los datos de ldquoresultados prueba de
viabilidad poscongelacioacuten tabla 19rdquo (en Martiacutenez amp Mayorga 2013 paacuteg 54) se corrigioacute la BSR
para esta cepa evidenciando ser la cepa maacutes resistente al proceso de criopreservacioacuten entre las
evaluadas con alrededor de 66 de caiacuteda luego de dos antildeos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8)
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten)
Nota Se muestran los resultados al evaluar la conservacioacuten de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por
el meacutetodo de criopreservacioacuten luego de dos (2) antildeos La BSR que Martiacutenez amp Mayorga (2013) presentan
corresponde a un valor poscriopreservacioacuten luego de dos meses de evaluacioacuten Nrd= No registra datos
Cepa Ceacutelulas
totales
Viables precongelacioacuten
(UFCml) de Martiacutenez
amp Mayorga (2013)
viables pos
congelacioacuten
(UFCml)
BSR
real
BSR de Martiacutenez
amp Mayorga
(2013)
BSR
corregido
CM-CR004 12x1012 61 x109 13 x107 725 Nrd Nrd
CM-CR005 11 x1010 11 x1010 0 00 Nrd Nrd
CM-CR006 14x1010 75 x109 27 x107 752 Nrd Nrd
CM-CR007 13x1011 41 x109 31 x108 883 Nrd Nrd
CM-CR009 19 x1010 44 x109 23 x107 763 Nrd Nrd
CM-CR010 17 x1010 46 x109 72 x108 916 673 982
35
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelacioacuten CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperacioacuten (nuacutemero de
ceacutelulas viables)
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO
En las Tablas 8 9 10 11 y 12 se describen las principales caracteriacutesticas macroscoacutepicas
utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfoloacutegica de las cepas utilizadas No fue
posible realizar la comparacioacuten con los datos de Rodriacuteguez (2013) a nivel macroscoacutepico dado que
los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquiacute utilizados sin embargo si se
compararon las caracteriacutesticas microscoacutepicas las cuales fueron coincidentes aunque estas no eran
del todo claras (descripcioacuten inexacta de forma y tamantildeo y sin un registro fotograacutefico comparable)
por lo cual se decidioacute que las caracteriacutesticas macroscoacutepicas observadas desde la primera siembra
posterior a la descongelacioacuten de los crioviales fuesen las de mayor importancia para evaluar la
estabilidad morfoloacutegica y la pureza Estas se mantuvieron sin cambio o variacioacuten a lo largo del
trabajo
Las microfotografiacuteas tomadas a cada cepa usando la coloracioacuten de Gram al igual que las
fotografiacuteas de las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron anexadas a la base de datos del Banco
Geneacutetico
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 725 00 752 883 763 916
Sup
ervi
ven
cia
36
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR004
Descripcioacuten
Borde o Margen
Ondulado Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de
crecimiento
Frente a luz Brillante
Elevacioacuten Umbonada
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Color Beige maacutes intenso en el centro y maacutes clara hacia los extremos en
colonias de 48h o maacutes extremos color blanco hueso
Forma Circular a maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo desarrollar forma
irregular
Grado de
Transparencia Opaca (No transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Ropa huacutemeda
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR006
Descripcioacuten
Borde o Margen Semiondulado A maacutes de 72h es altamente digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas y con medio huacutemedo se irregulariza
Luego de una semana totalmente digitado
Elevacioacuten Plana con bordes elevados (en craacuteter) Colonias de maacutes de 72h
presentan una ligera elevacioacuten en el centro
Color Amarillo
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Escamosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca (NO transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis Si color amarillo
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
37
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR007
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio muy huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular A maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo es irregular
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 48h y distantes unas de otras (pocas
colonias) umbonadas
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Semitransparente en zona externa
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Mentol
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR009
Descripcioacuten
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas se irregulariza
Elevacioacuten En meseta y ligero hundimiento central (craacuteter) En colonias con maacutes
de 72h ligera elevacioacuten del craacuteter
Color Beige Conforme envejece la colonia toma una coloracioacuten blancuzca
de tonalidad cafeacute en el centro
Tamantildeo Pequentildea (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
38
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR010
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio huacutemedo es suavemente ondulado en medio muy
huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular Despueacutes de 48h se irregulariza En medio muy huacutemedo es
estrellado (sin importar edad de la colonia)
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 72h centro marcado y ligeramente
elevado (forma de huevo frito)
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia
Opaca Semitransparente en la zona externa de colonias de maacutes de
48h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Sin olor
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general
Las Figuras 9 10 11 12 y 13 representan los resultados de la evaluacioacuten de la eficacia del
meacutetodo de conservacioacuten realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1 por medio
del indicador de viabilidad
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 6 x108 Se observa que
la leche descremada 15 como mejor protector y leche descremada 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A - - - 5987 - 5301 5958 6812 -
BSR en serie B - - - 3619 3076 4557 5100 5039 3619
BSR en serie C 3076 3619 - 3619 3076 3418 3418 5873 4723
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR004
39
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 73 x108 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 125 x1010 Se observa
a sacarosa 10 como mejor protector y a glucosa 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 4173 4962 5850 6119 6415 5731 5430 4173 4513
BSR en serie B 3046 - - 4173 4743 5051 4773 - -
BSR en serie C - - - 3046 5147 4622 - - -
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR006
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 9149 8664 6549 9712 9677 8735 9026 9166 8648
BSR en serie B 8472 - 6181 - 8474 - 8413 8052 8086
BSR en serie C 8557 7472 6193 - 9272 - 8604 8202 8414
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR007
40
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 115 x109 Se observa
a Sacarosa 15 como mejor protector y la leche descremada 10 como segundo mejor protector
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 65 x109 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 5494 4609 4609 6641 6401 6987 5585 5440 5186
BSR en serie B 4415 - - 6373 6083 6212 4941 4083 -
BSR en serie C - - - - - 7519 4083 - 4083
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR009
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 8205 - 6303 9521 8634 8207 8153 8022 8332
BSR en serie B 6424 - - 7911 8312 8096 7752 6907 7995
BSR en serie C 6697 - - - 8230 7998 7919 8113 7539
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Sup
erviv
enci
a
BSR en CM-CR010
41
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15
CM-CR006 Sacarosa 10
CM-CR007 Sacarosa 10
CM-CR009 Sacarosa 15
CM-CR010 Sacarosa 10
Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural
ofreciera la maacutes alta BSR en la mayoriacutea de cepas (Tabla 13) se determinoacute la sacarosa al 10
como el mejor lioprotector y se designoacute como lioprotector general para las bacterias del banco de
liofilizados Sin embargo se decidioacute para la liofilizacioacuten definitiva utilizar el lioprotector que
mejores resultados confirioacute a cada una de las cinco cepas de estudio
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado
Dado que el principal indicador de evaluacioacuten de la prueba de estabilidad natural en esta
etapa era la viabilidad en cada liofilizado no se tuvo en cuenta los cambios morfoloacutegicos
presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa pero si fueron tenidos en cuenta
para los ajustes teacutecnicos de la liofilizacioacuten en la fase 3
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilizacioacuten definitiva
con su homoacutelogo de la etapa 2 (es decir los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo) se encontraron diferencias significativas de aumento o disminucioacuten de hasta el 22
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad seguacuten el punto de partida de la formulacioacuten
(medio liquido SMPG vs medio soacutelido SPC) como lo muestra la Figura 14
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilizacioacuten
definitiva por cepa bacteriana Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas seguacuten el intervalo
temporal de la Serie A en tanto que CM-CR007 CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron seguacuten la Serie
B (ver Tabla 4)
- 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Punto
s p
orc
entu
ales
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
L Etapa 2 6812 6415 8474 6212 8312
L definitiva 7330 7629 7757 8461 7234
BSR comparativa
42
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN
551 Propiedades fiacutesicas generales
Se dataron las propiedades fiacutesicas de los liofilizados en la fase intermedia 1 asiacute como los
liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 431 (liofilizacioacuten definitiva) y 4332 (viales
usados para la prueba de estabilidad acelerada) en las Tablas 15 y 16 respectivamente la tabla de
convenciones (Tabla 14) permite comprender los siacutembolos de las anteriores tablas
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilizacioacuten y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilizacioacuten
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transicioacuten conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto fiacutesicamente aceptable Sin embargo pese a que a las propiedades fiacutesicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1 con los cuales se realizoacute la evaluacioacuten de la liofilizacioacuten
y la prueba de estabilidad natural no eran los maacutes adecuados se decidioacute proseguir con ellos
apoyado por los resultados de Vemulapalli Bhonsle amp Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratacioacuten (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperacioacuten de microorganismos ademaacutes el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores
Tabla 14 Tabla de convenciones Siacutembolo Significado Siacutembolo Significado
SBE Si en buen estado A Algunos
SME Si en mal estado T Todos
NBE No en buen estado N Ninguno
NME No en mal estado NS No significativo (lt20)
+ Afirmativo S Significativo (201-309)
- Negativo MS Muy significativo (gt40)
NA No aplica I indeterminado
FS Al finalizar el secado AR Antes de reconstituir
Nota Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15 Aunque no tenga estructura de torta el liofilizado
es estable y funcional por ende utilizable No tiene estructura de torta y ademaacutes no es ni estable ni
funcional por ende no es utilizable
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1
Cepa Viales Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto de
torta
Fractura de
vial 1 2 3
CM
-CR
00
4
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I S Traslucido I + NBEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N S Cafeacute claro Porosa - SMEA -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR NS N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
43
CM
-CR
00
6
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR S S MS Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N NS NS Cafeacute claro Porosa - SBEA -
sm2sc AR S S S Cafeacute oscuro Porosa - SMET -
CM
-CR
00
7
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
s1 NA I I I Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR S I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS I S Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
CM
-CR
00
9
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I NS Traslucido I + NBE -
g2sc AR MS S S Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS S I Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sb AR N N NS Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sc AR N S NS Cafeacute oscuro Porosa - NMEA -
CM
-CR
01
0
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I S S Traslucido I + NMEA -
g2sc AR I MS MS Traslucido I + NMEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
44
Nota Datos de las propiedades fiacutesicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad
natural salvo por el encogimiento que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa) los
demaacutes caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual Se subrayan las
anomaliacuteas encontradas a lo largo de la prueba
g Liofilizados con glucosa como protector
s Liofilizados con sacarosa como protector
sm Liofilizados con leche descremada como protector 1 Formulacioacuten congelada 2 Liofilizados almacenados a temperatura ambiente sa Serie A (antes de rehidratar) sb Serie B (antes de rehidratar) sc Serie C (antes de rehidratar)
1 Concentracioacuten uno del lioprotector
2 Concentracioacuten dos del lioprotector
3 Concentracioacuten tres del lioprotector
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la prueba de
estabilidad acelerada
Nota Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquiacute mencionados corresponden solo a aquellos
que contienen sacarosa al 10 (lioprotector general) Se consignan aquiacute los datos generales de los
liofilizados indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas
a Liofilizados de la prueba de estabilidad natural
b Liofilizados de la liofilizacioacuten definitiva
c Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada 1 Formulacioacuten congelada 2 Viales almacenados a temperatura ambiente 3 Vial usado en la caacutemara de envejecimiento
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto
de torta
Fractura
de vial Viales
a1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
a2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
b1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
b2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
c1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
c2 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR NS Blanco Porosa - SBE -
c3 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR S Blanco Porosa - SME -
45
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes De izquierda a derecha
liofilizados de prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva prueba de estabilidad acelerada
552 Contaminacioacuten
Se encontroacute contaminacioacuten durante la rehidratacioacuten de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006 en tanto que las siembras preliofilizacioacuten no presentaban contaminacioacuten alguna por ello
se tomaron tres viales maacutes que iban a ser rehidratados en la serie B encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilizacioacuten de esta cepa
Las demaacutes cepas no presentaron contaminacioacuten en ninguna prueba realizada
553 Tiempo de redisolucioacuten
Al medir el tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten en cada una de las rehidrataciones se
observoacute que la glucosa tardoacute maacutes tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros
lioprotectores llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Voacutertex en los viales
maacutes concentrados para su total redisolucioacuten Ademaacutes se encontroacute en todos los lioprotectores que
conforme la concentracioacuten aumentaba maacutes tiempo se necesitaba para la reconstitucioacuten de la
formulacioacuten es decir que el tiempo es directamente proporcional a la concentracioacuten de
lioprotector
Al comparar el tiempo de reconstitucioacuten de los viales que conteniacutean el lioprotector general
en la prueba de estabilidad natural con los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales de la
prueba de estabilidad acelerada no se encontraron diferencias significativas sin embargo el vial
de la prueba de estabilidad acelerada que duroacute siete (7) diacuteas en caacutemara de envejecimiento se
reconstituyoacute un segundo menos aproximadamente respecto a los otros viales
46
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado
Lioprotector Tiempo (min)
Glucosa 10 1
Glucosa 117 15
Glucosa 27 120
Sacarosa 4 05
Sacarosa 10 05
Sacarosa 15 06
Leche descremada 10 025
Leche descremada 15 033
Leche descremada 20 05
Estabilidad natural 05
Liofilizacioacuten definitiva 025
Estabilidad acelerada 004
Nota El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada
uno liofilizados con el lioprotector general
56 PRUEBAS ADICIONALES
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica
En la Figura 16 se observa un aumento draacutestico del peso de los viales dentro de la ventana
de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados
al vaciacuteo) Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vaciacuteo) no tuvieron un aumento en
peso tan draacutestico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante Al cabo de cincuenta
(50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente No se encontroacute
por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vaciacuteo
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector La ecuacioacuten presentada pertenece a la liacutenea de tendencia logariacutetmica
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinacioacuten Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba
0 10 20 30 40 50 60
vial (518055g) 0 00724 00772 00782 00840 00869 00849
Criovial (19018g) 0 00079 00158 00315 00473 00578 00605
Promedio 0 00401 00465 00549 00656 00724 00727
y = 00365ln(x) + 00058
Rsup2 = 09647
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
01
AU
MEN
TO D
E P
ESO
(W
)
47
562 Prueba de estabilidad acelerada
Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFCml antes de la liofilizacioacuten al
rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 8398 sin embargo al rehidratar el vial 2 luego de su
estadiacutea en la caacutemara de envejecimiento la BSR fue de 0 Las propiedades fiacutesicas generales de
estos viales son presentadas en la Tabla 15
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN
571 Base de datos
Se eliminoacute una tabla sobrante (constituiacutea informacioacuten redundante de las cepas) dentro de la
base de datos correspondiente a la seccioacuten de criopreservacioacuten Adicionalmente se reorganizoacute la
base de datos al introducir la seccioacuten de liofilizacioacuten y la de refrigeracioacuten Este uacuteltimo meacutetodo de
preservacioacuten fue mencionado en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) pero no fue anexado
sin embargo aunque se incluyoacute la seccioacuten en el banco de cepas debe mencionarse que no existen
registros de las cepas que se hallan conservado por este meacutetodo aun asiacute se decidioacute dejar la seccioacuten
para que lo ocupen trabajos posteriores Ademaacutes se encontroacute que en el Freezer existiacutean colecciones
que no figuran en la base de datos no existen registros de ninguacuten tipo ni caracterizacioacuten alguna en
medios digitales La base de datos quedoacute organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5
Figura 17 Organigrama de la base de datos
572 Fichas de resumen
Las fichas de acceso inmediato designadas como ldquofichas de resumenrdquo para cada coleccioacuten
fueron ubicadas seguacuten el sitio de almacenamiento tanto para las cepas criopreservadas como para
las liofilizadas y refrigeradas Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas las fichas
resumen de este meacutetodo fueron dejadas en blanco para futuras colecciones El formato de las fichas
resumen se presenta en el anexo 6
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se encontroacute que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulacioacuten que
permite la faacutecil confusioacuten entre colecciones criopreservadas sin embargo se decidioacute dejar las
etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martiacutenez amp Mayorga (2013) entre
otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener
que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondriacutea una confusioacuten entre nuevas
y viejas colecciones Este problema fue solucionado con la reorganizacioacuten de la base de datos y las
fichas de resumen
Base de datos del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Informacioacuten de los
microorganismos de
cada coleccioacuten
Meacutetodo de conservacioacuten de cepas
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten
Liofilizacioacuten
48
574 Formatos de control del banco de liofilizados
Se decidioacute que los formatos de control para la seccioacuten de liofilizacioacuten del Banco Geneacutetico
fueran similares tanto para la criopreservacioacuten como para la liofilizacioacuten obedeciendo sus
diferencias a las caracteriacutesticas y datos propios de cada meacutetodo Se encontroacute que los formatos de
la seccioacuten criopreservacioacuten no habiacutean sido llenados nunca desde su creacioacuten Estos se muestran en
el anexo 7
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten
Se editoacute la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martiacutenez amp
Mayorga (2013) Partiendo de esta cartilla se elaboroacute un manual maacutes completo (anexo 8)
introduciendo todos los procedimientos para la liofilizacioacuten las diferentes teacutecnicas empleadas en
los procesos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se complementoacute tambieacuten la seccioacuten sobre el
proceso de refrigeracioacuten y se reescribieron algunos conceptos erroacuteneos de la edicioacuten anterior No
se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservacioacuten pero si
se realizaron pequentildeos ajustes de forma o de edicioacuten
49
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
La recuperacioacuten de microrganismos por criopreservacioacuten se realizoacute de acuerdo a los
lineamientos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) durante todas sus etapas sin embargo
la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la
criopreservacioacuten de la cepa o inclusive en la etapa de descongelacioacuten Garciacutea y Uruburuacute (citados
por Aacutengel A 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y
estabilidad de los organismos conservados edad celular velocidad de congelacioacuten y
descongelacioacuten temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores Dado que las cepas
CM-CR004 006 007 010 e incluso la 009 (que remplazoacute a CM-CR005) presentaron muy buenos
niveles de recuperacioacuten (Figura 8) el factor maacutes probable de falla corresponde al crioprotector
utilizado ya que en el caso del Banco Geneacutetico el crioprotector es general para toda la coleccioacuten
de bacterias y la eleccioacuten del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A
2006) puesto que la efectividad de la criopreservacioacuten se puede ver afectada por las caracteriacutesticas
propias de cada cepa (Hubaacutelek 2003) las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector
Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la
viabilidad los organismos conservados por este meacutetodo sobreviven largos periacuteodos por la
reduccioacuten marcada de su ritmo metaboacutelico incluso por maacutes de 30 antildeos (Gonzaacuteles et al 2006) lo
cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector
como elemento de falla en la conservacioacuten de la cepa perdida
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una uacutenica
liacutenea celular por tanto las caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificacioacuten preliminar Sin embargo estos mismos autores
sentildealan que estas caracteriacutesticas no son uacutenicas ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares como sucedioacute con CM-CR007 y 010 por ello fue preciso observar las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas microscoacutepicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquiacutemicas) de las cepas pero dada la simplicidad de las descripciones microscoacutepicas de
Rodriacuteguez (2013) no se tuvo como principal referencia de identidad Aunque la morfologiacutea de la
colonia depende considerablemente de la composicioacuten del medio de cultivo y las condiciones de
incubacioacuten cuando eacutestas son controladas suelen ser invariables teniendo por lo general un valor
diferencial considerable (Diacuteaz 2009) por lo tanto se tomaron estas caracteriacutesticas como las
principales para la evaluacioacuten de los indicadores de estabilidad morfoloacutegica y pureza
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que ldquolos medios soacutelidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamientordquo (paacuteg 2) Sin embargo se observaron
algunas variaciones las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio Esto se
observoacute maacutes en las cepas CM-CR007 y 010 que al revisar los datos de Martiacutenez amp Mayorga (2013)
y Rodriacuteguez (2013) estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio huacutemedo
tendiacutean a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican Loacutepez T amp Torres (2006)
en bacterias moacuteviles en tanto que sin niveles altos de humedad las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en funcioacuten del tiempo (envejecimiento de la colonia) Esto derivoacute en la
observacioacuten y descripcioacuten de caracteriacutesticas macroscoacutepicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad como son descritas en las Tablas 8 9 10 11 y 12 para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) diacuteas que duroacute la prueba de estabilidad
natural se observoacute que en general de los tres lioprotectores los resultados maacutes bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones Esto tiene su explicacioacuten en las propiedades reductoras
que poseen los monosacaacuteridos ya que como lo menciona Cox C S (citado por Hensel 1994) los
efectos letales de la desecacioacuten se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteiacutenas
de la membrana celular y azuacutecares reductores que aumentan conforme avanza la deshidratacioacuten
(glicacioacuten) si las proteiacutenas de membrana integrales o citosoacutelicas se ven dantildeadas de forma
irreversible durante el secado tendriacutea un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al 1995)
impidiendo la reconstitucioacuten de forma adecuada de las bacterias y por ende generando muerte
celular Sin embargo las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta especialmente en la concentracioacuten maacutes baja incluso para CM-CR007 la glucosa al 10 se
erige como el segundo mejor protector Es probable que estas dos cepas presenten una
configuracioacuten diferente de sus proteiacutenas de membrana que impida la reaccioacuten amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra que proteja a las proteiacutenas de membrana o
citosoacutelicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteiacutenas)
Es conocido que en general los disacaacuteridos mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan Herman White amp Vesey
2006) esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13
A diferencia de la glucosa la sacarosa es un azuacutecar no reductor estos pueden proteger las
ceacutelulas al competir por la unioacuten en la membrana con los azucares reductores (Hensel 1994) Se ha
demostrado que la sacarosa mantiene las proteiacutenas secas igual que en sus conformaciones
hidratadas Leslie et al (1995) indican que este fenoacutemeno sucede probablemente ldquomediante la
unioacuten a los dominios hidroacutefilos de las proteiacutenas y la prevencioacuten de enlaces de hidroacutegeno inter e
intra proteiacutenas durante el secado y la reconstitucioacutenrdquo (paacuteg 3596) lo cual contribuye a las altas tasas
de supervivencia al usar este lioprotector
Para que un protector funcione eacuteste debe proteger la bicapa lipiacutedica y para ello debe existir
dentro y fuera de las ceacutelulas (Leslie et al 1995 Palmfeldt et al 2003) el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transicioacuten de
membrana ya que en eacutesta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentracioacuten (Leslie et al 1995) reemplazando el agua intracelular lo cual se conoce como la
hipoacutetesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al 2003) Si esto se cumple la concentracioacuten
intracelular seraacute alta y el tiempo antes de la congelacioacuten y el secado debe ser corto por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequentildeo (Leslie et al 1995) y los productos polares
extracelulares seraacuten miacutenimos
Ademaacutes tanto la glucosa y la sacarosa estaacuten dentro de la categoriacutea de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo este estado viacutetreo ldquoInduce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una ceacutelula para detener la movilidad
molecular a un miacutenimo El vidrio amorfo inerte tambieacuten es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las ceacutelulas dentro de la estructura de vidrio antes de la congelacioacuten lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquiacutemicos irreversibles en la
membrana plasmaacutetica durante el almacenamientordquo (Morgan et al 2006 paacuteg 186)
51
La retencioacuten de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilizacioacuten
como en la criopreservacioacuten
Cabe mencionar que el proceso de deshidratacioacuten y de reemplazo de agua intracelular por
parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un liacutemite ya que como lo
menciona Heckly (citado por Perry 1995) al congelarse el agua del medio las ceacutelulas sufren
deshidratacioacuten reduciendo el punto de congelacioacuten en el interior y evitando la formacioacuten de
cristales de hielo pero al seguir bajando la temperatura las concentraciones de solutos aumentan
Perry (1995) cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelacioacuten estaacuten posiblemente
asociados a estas soluciones excesivamente concentradas puesto que no se han encontrado
evidencias de lesiones mecaacutenicas por hielo extracelular Esto corresponderiacutea con los resultados
obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores como lo fue la glucosa al 27 en casi
todas las cepas (exceptuando CM-CR006 Figura 10) recordando que un protector funciona mejor
en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmoacutetico con el interior de las bacterias (conocer
la concentracioacuten intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilizacioacuten
por parte de eacuteste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo como se muestra en el
trabajo de Palmfeldt et al (2003)
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta un ejemplo claro es la cepa CM-CR004 la cual de hecho ante los
gluacutecidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentoacute resultados aceptables Morgan et al
(2006) mencionan (teniendo como referencia la investigacioacuten de Buitink et al) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteiacutenas presentes en esta sustancia son
maacutes estables y juegan un importante papel en la formacioacuten del estado viacutetreo lo cual induce a pensar
que una oacuteptima mezcla de proteiacutenas y azucares permite una proteccioacuten maacutes eficiente Esta
posibilidad corresponderiacutea a los resultados obtenidos donde la concentracioacuten de los componentes
de la leche descremada seriacutean propicios para la cepa CM-CR004 en tanto que para las demaacutes cepas
seriacutean maacutes bajas o maacutes altas de lo propicio Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de gluacutecidos y proteiacutenas que la componen pero no
establece cuales son estos pudiendo ser positivos o negativos para la liofilizacioacuten
En general los cultivos liacutequidos ofrecen un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables (Ops
Diagnostics 2015) sin embargo la viabilidad depende muacuteltiples factores incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos El medio SMPG estaacute disentildeado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse raacutepidamente la fuente de carbono (glucosa) una bacteria
de raacutepido crecimiento entraraacute en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio una
de lento crecimiento al cabo del mismo tiempo estaraacute en fase log no obstante en el medio SPC
los nutrientes tardan maacutes tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas todas las bacterias
estaraacuten en fase log Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de raacutepido crecimiento mientras que
CM-CR004 006 y 009 son de crecimiento un poco maacutes lento (datos obtenidos del conteo con
caacutemara de Neubauer no incluidos en el presente estudio)
Morgan et al 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisioloacutegicos
en las bacterias relacionado generalmente con la privacioacuten de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles desencadenando una respuesta ante el estreacutes para permitir la
supervivencia de la poblacioacuten celular Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecacioacuten y las temperaturas menos propicias para su crecimiento por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilizacioacuten Sin embargo la
fase de crecimiento oacuteptima para la supervivencia en la desecacioacuten es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al 2006 paacuteg 185) Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14 indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
liacutequido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log asiacute mismo las cepas CM-CR004 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria pudiendo ser mayor o menor
En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilizacioacuten definitiva se observoacute puffing
y pitting y si bien Vemulapalli et al (2015) indican que estos cambios no afectan la calidad del
producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada Jennings (2008) advierte que su
presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada y que esta puede
deberse a un sistema con composicioacuten diferente de la formulacioacuten principal y podriacutea conducir a
interacciones tales como la agregacioacuten de proteiacutenas ademaacutes se observoacute (Figura 15 izquierda y
centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulacioacuten inicial de glucosa y
sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16) ldquodebido a una accioacuten combinada de la fusioacuten
(maacutes o menos importante) y de la presioacuten reducida dando lugar al puffingrdquo (Ticoacute G 1987 paacuteg
70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings 2008) seguacuten la cantidad del
material afectado por el puffing Esta caracteriacutestica se asocia con un error en los paraacutemetros de
liofilizacioacuten por ello se revisoacute exhaustivamente el proceso de liofilizacioacuten encontrando que los
liofilizados alcanzaron la temperatura de fusioacuten durante el proceso de secado primario por la
inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador el cual no habiacutea sido descrito en el
proceso piloto de liofilizacioacuten con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del
control de calidad A causa de esto los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los
uacutenicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha)
Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura
a los -32 y -42 degC asiacute como un melting inicial a -32degC y -42degC respectivamente seguacuten lo reporta
Moreira Gutieacuterrez amp Delgado (1994) Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento
del liofilizador
Las Tablas 15 y 16 que resumen las caracteriacutesticas tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados muestran que el color textura brillo y fractura de viales estaacuten dentro de los
paraacutemetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilizacioacuten correcta
con las formulaciones utilizadas no obstante se detectaron variaciones posliofilizacioacuten
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales Inicialmente se pensoacute
en una falla durante el tiempo de almacenamiento dado que los liofilizados maacutes afectados fueron
de las series B y C sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada se determinoacute que la causa de fallo yaciacutea en la
obtencioacuten de humedad por parte del producto liofilizado La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vaciacuteo absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vaciacuteo estos habiacutean absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilizacioacuten esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscoacutepica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad maacutes bajo que la sacarosa) debido a la
53
ldquofacilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidroacutegeno con el aguardquo (Badui
Dergal 2006 paacuteg 73) ldquoPara reducir el nuacutemero de moleacuteculas de agua el proceso de liofilizacioacuten y
el sellado de los viales al vaciacuteo debe haber sido exitoso y asiacute obtener un producto con el contenido
de humedad deseadordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 78) por lo cual se descarta la utilizacioacuten del
instrumento manifold para la liofilizacioacuten cepas en el Banco Geneacutetico
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilizacioacuten siempre deben ser
de vidrio ya que el vapor de agua atmosfeacuterico se puede difundir a traveacutes de los tubos de plaacutestico y
por ende las muestras secas terminariacutean absorbiendo agua Esto se comproboacute con la utilizacioacuten de
crioviales que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vaciacuteo sino que ademaacutes en
la serie C casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dantildeados presentaban
cambios de coloracioacuten (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloracioacuten
oscura como lo muestra la Tabla 15) o una marcada reduccioacuten en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentracioacuten) Esto tambieacuten se ve correlacionado con la peacuterdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008) la
humedad es la principal responsable en la peacuterdida de viabilidad en el producto liofilizado
reduciendo la vida uacutetil de los organismos La obtencioacuten de agua implica un retroceso del proceso
de liofilizacioacuten el dantildeo de la matriz formada el flujo de los residuos extracelulares polares es
decir la reactivacioacuten del organismo ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquiacutemica el metabolismo (Adams 2007) finalmente la muerte celular al agotarse esta
El tiempo de redisolucioacuten y el tipo de reconstituyente tambieacuten es de gran importancia La
Tabla 17 muestra tiempos de redisolucioacuten bastante altos para las formulaciones de glucosa Con
los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisioacuten del proceso de liofilizacioacuten se determinoacute la
retrofusioacuten producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de
redisolucioacuten causando un efecto grave donde la interaccioacuten entre las moleacuteculas es tal que la matriz
del liofilizado es casi insoluble (Jennings 2008) El aumento de la temperatura demasiado raacutepido
en el proceso de la liofilizacioacuten o por encima de Tg resultoacute en el colapso haciendo la
reconstitucioacuten mucho maacutes difiacutecil (Fetterolf 2010) Jennings (2008) indica que un aumento en el
aacuterea superficial por unidad de volumen de la torta tenderaacute a disminuir el tiempo de reconstitucioacuten
lo cual sucedioacute para todos los liofilizados que presentaron melting puffing y pitting ya que su
volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulacioacuten congelada solo los
liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulacioacuten
congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitucioacuten
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed amp Roos (2004) quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo se sugiere en muacuteltiples estudios
ademaacutes el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4degC plusmn 1degC en la
oscuridad (Ops Diagnostics 2015)
Se siguioacute los procedimientos de documentacioacuten establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
para la criopreservacioacuten y la elaboracioacuten de los nuevos protocolos de liofilizacioacuten encontrando
como lo menciona Gonzaacuteles et al (2006) que es necesario contar con sistemas de documentacioacuten
eficiente ademaacutes contar con duplicados de la informacioacuten en medios fiacutesicos y magneacuteticos evitado
la perdida de informacioacuten (Montes de Oca et al 2008) y el raacutepido acceso a la misma
54
7 CONCLUSIONES
En general el estado de criopreservacioacuten de las cepas evaluadas es oacuteptimo obteniendo tasas
de supervivencia satisfactorias Sin embargo el criopreservante no funciona de igual forma para
todas las cepas debido a las caracteriacutesticas propias de cada organismo que limitan la accioacuten del
glicerol
De acuerdo a la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten realizada con los tres indicadores
(viabilidad pureza y estabilidad morfoloacutegica) la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados siendo la concentracioacuten al 10pv la maacutes oacuteptima No obstante su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado hermeacuteticamente y al vaciacuteo El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada aunque no se determinoacute la concentracioacuten maacutes oacuteptima
En cuanto a la glucosa al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo se observa
que pese a no ser un buen lioprotector concentraciones de glucosa entre el 6 y el 10 pv son
funcionales aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50
No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten estos
fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminacioacuten de las muestras y a su
vez evitar la contaminacioacuten por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso
Se creoacute el protocolo para el proceso de liofilizacioacuten en todas sus etapas Este es
metodoloacutegicamente funcional y faacutecilmente reproducible por ello se estandariza para el Banco
Geneacutetico seccioacuten liofilizacioacuten dentro del nuevo manual de procedimientos de conservacioacuten Se
incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservacioacuten dentro de este
manual ajustado a las necesidades especiacuteficas de seguridad de la liofilizacioacuten
Es importante mantener actualizado los diferentes medios fiacutesicos y magneacuteticos donde reposa
la informacioacuten de las colecciones y los microorganismos en ellos dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Geneacutetico y la informacioacuten se puede perder
La falta de la identificacioacuten hasta cepa (al menos hasta geacutenero) de los microorganismos
presentes en el banco geneacutetico limita la informacioacuten para entender los fenoacutemenos relacionados a
los procesos de conservacioacuten y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo
55
8 RECOMENDACIONES
Existen paraacutemetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente como la edad del cultivo la
concentracioacuten celular entre otros Se propone el estudio de los paraacutemetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilizacioacuten con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos por ello se sugiere la creacioacuten
de un modelo matemaacutetico para que sea funcional esta prueba lo cual generariacutea datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo
Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinacioacuten de lioprotectores con formadores
de matrices y estabilizantes siguiendo los protocolos establecidos Mezclas de sacarosa al 10 pv
con leche descremada 10 pv (de la misma marca usada en este estudio) sacarosa al 10 pv con
leche descremada 10 pv y carboacuten activado asiacute como la utilizacioacuten de estas mezclas con trehalosa
en distintas concentraciones son sugeridas
Es necesaria la creacioacuten de una plataforma online del banco geneacutetico una vez este cuente con la
identificacioacuten de los organismos contenidos asiacute mismo es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco geneacutetico distinto a Access preferiblemente que obedezca a una
creacioacuten propia de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Es necesaria la creacioacuten de una pasantiacutea anual para curaduriacutea del Banco Geneacutetico ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepcioacuten de cepas Ademaacutes se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas como aquellas que sean donadas al Banco Geneacutetico en el futuro
56
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11 ANEXOS
Anexo 1 Formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-XX00Xa
Descripcioacuten Fotografiacutea
Borde o Margen
Frente a luz Brillanteopaca
Forma
Elevacioacuten
Color
Tamantildeo
Superficie
Consistencia
Grado de
Transparencia
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis
Pigmentos que desprende la colonia
y se observan sobre el medio
Olor
Hemolisis
MedioT(degC)
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen
un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace
la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad
del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos
Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen
Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta
Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
63
Anexo 2 Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados
a) Recubrimiento (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido cartoacuten y autoadhesivo de
emulsioacuten acuosa
b) Bandeja de liofilizados
c) Soporte para bandeja
d) Cojiacuten de siacutelice gel (reemplazo seguacuten el tamantildeo y cantidad de cojines de 2 meses a 1 antildeo)
El banco de liofilizados estaacute dividido en tres secciones
La seccioacuten de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A B y C respectivamente
La seccioacuten de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D E y F respectivamente
La seccioacuten de hongos (color cafeacute) correspondiente a las bandejas G H e I respectivamente
64
Bandeja de liofilizados
Estaacute hecha de poliestireno expandido viene con 100 compartimientos individuales para un maacuteximo
de 100 viales por bandeja
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
10 20
30 40
50 60
70
80
90 100
01
11 21
31
41
51
61 71
81
91
65
Anexo 3 Esquema general del cepario madre de liofilizados
J Hongos
K Bacterias
L Algas
F Fila
Nuacutemeros compartimento correspondiente a cada vial La numeracioacuten va en zigzag
J K L
F1 F1 F1 F2 F2 F2 F3 F3 F3
1
8 8 8
9 9 9 1 1
16 16 16 24 24 24
17 17 17
66
Anexo 4 Caacutemara de envejecimiento artesanal
Esta caacutemara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y
humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra La humedad relativa
puede controlarse seguacuten si se use agua (100) o una concentracioacuten determinada de solucioacuten salina
ver Colmenares R (2015)
Horno de 37degC (caacutemara externa)
Caacutemara
interna
Termoacutemetro
Tapa de sello
hermeacutetico
Malla de
soporte
Viales
Agua o sn salina
67
Anexo 5 Base de datos en Access
Esquema general de la Base de datos del Banco Geneacutetico
Espacio de trabajo con las tablas
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
informacioacuten
maacutes detallada)
68
Anexo 6 Formato de las Fichas Resumen
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FICHA RESUMEN DE LA COLECCIOacuteN
Ubicacioacuten de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Fuente de obtencioacuten
de las cepas
Fecha de
ingreso
Cantidad de cepas Tipo de organismos
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa)
Ubicacioacuten de cepas (seguacuten todos los meacutetodos
de conservacioacuten utilizados para la coleccioacuten)
Autores o donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos y Formatos de control
69
Anexo 7 Formatos de control de la seccioacuten liofilizacioacuten
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
Lugar (Ciudad y Paiacutes) Fecha de ingreso
Origen de
la cepa
Institucioacuten Organizacioacuten o
Empresa donante
Persona que realizoacute el
aislamiento
Cargo Fecha de
aislamiento
Informacioacuten de contacto
Fuente de obtencioacuten
de la cepa
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Identificacioacuten geneacutetica
de la cepa
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Calidad de la
cepa recibida
Restriccioacuten de
distribucioacuten
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Observaciones Nivel de
Bioseguridad
N1 N2 N3 N4
Persona donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
70
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL
FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN
CM-_ _0_ _
Proceso
Fecha Hora
Ciudad Equipo
Lioprotector y
concentracioacuten
Temperatura (degC)
Presioacuten (mbar)
Duracioacuten (min) Accesorio de
secado
Responsable (s) del proceso
Ubicacioacuten
Coacutedigo de la
cepa
Nombre de
la coleccioacuten
Viales
almacenados
Tipo S T Lf Total Sello al vaciacuteo SI NO
Cantidad Sello de Aluminio SI NO
Pruebas de
Viabilidad
Caracterizacioacuten
macroscoacutepica (resumen)
Caracterizacioacuten
microscoacutepica (resumen)
Concentracioacuten celular
(UCF)
Preliofilizacioacuten
Posliofilizacioacuten
Bioquiacutemicas
Otras
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
71
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS
CEPAS
CM-_ _0_ _
Detalles del
Proceso
Fecha Ciudad
Hora Coacutedigo de cepa
Viales a evaluar T S Lf Temperatura (degC)
Viales en mal estado T S Lf Presioacuten (Mbar)
Fecha de liofilizacioacuten Fecha de evaluacioacuten Total tiempo (meses)
Descripcioacuten
de la cepa
Geacutenero-especie del
microorganismo
Nombre de la
Coleccioacuten
Car
acte
riza
cioacuten
Microscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Microscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Observaciones
Viabilidad Concentracioacuten Celular
(UFC) Preliofilizacioacuten
Concentracioacuten Celular
(UFC) Posliofilizacioacuten
Observaciones
Control
de
Calidad
Bioquiacutemicas
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Pruebas
Cristal
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Otras Pruebas Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Observaciones
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
72
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD
DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS
CM-_ _0_ _
Lugar (Ciudad Paiacutes) Fecha
Informacioacuten
del
solicitante
Institucioacuten Organizacioacuten
o Empresa
Solicitante Cargo
Teleacutefono (s) Email
Descripcioacuten
de la cepa
Coacutedigo de
cepa
Geacutenero ndash especie
Microorganismo
Coleccioacuten
Utilizacioacuten de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
73
Anexo 8 Manual de procedimientos de conservacioacuten para el Banco Geneacutetico del Laboratorio
de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (Ver archivo adjunto)
Manual de procedimientos de
conservacioacuten para el Banco
Geneacutetico del Laboratorio de
Microbiologiacutea Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute
de Caldas
Primera Edicioacuten
Editado por
Andreacutes V Castantildeeda R
Manual de procedimientos de conservacioacuten para el
Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Ingenieriacutea Sanitaria
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
Licenciado en Biologiacutea
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales
Niria Pastora Bonza Peacuterez
Docente encargado del Laboratorio de Microbiologiacutea y
coordinador de Ingenieriacutea Sanitaria
Miguel Aacutengel Piragauta Aguilar
Disentildeo y diagramacioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
avicent29gmailcom
Autoriacutea y Edicioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda R
2015
Todos los derechos reservados
TABLA DE CONTENIDO
TIacuteTULO PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
RECEPCIOacuteN DE CEPAS 2
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS 3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES 5
Medios 5
Reactivos 6
Protectores generales 6
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN 7
Indicador uno Viabilidad 7
Conteo directo con caacutemara de neubauer (110mm) 7
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa 10
Indicador dos Estabilidad morfoloacutegica 12
Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) 12
Tincioacuten de gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) 13
Indicador tres Pureza de la cepa 13
RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS 14
Criopreservados (descongelamiento) 14
Liofilizados (rehidratacioacuten o reconstitucioacuten) 14
REFRIGERACIOacuteN 15
CRIOPRESERVACIOacuteN 16
Precriopreservacioacuten 16
Preparacioacuten del inoculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 16
LIOFILIZACIOacuteN 17
Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano 17
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 17
IV
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Posliofilizacioacuten 18
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos 18
ROacuteTULOS 19
Refrigeracioacuten 19
Criopreservacioacuten 19
Liofilizacioacuten 20
TIacuteTULO 2 PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONSERVACIOacuteN Y EN EL LABORATORIO
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN 23
Medios 23
Ambiente 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores 23
Cabina de flujo laminar 23
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 24
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS 24
Desechos no contaminados (no infecciosos) 24
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en
autoclave y reutilizado 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado 25
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa 25
BIOSEGURIDAD 26
Proteccioacuten personal 26
Procedimientos 27
Aacutereas de trabajo 27
Capacitaciones 27
REFERENCIAS 28
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dilucioacuten en serie 7 Figura 2 Conteo directo 8 Figura 3 Conteo en bacterias 8 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky 10 Figura 5 Contador de colonias 11 Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados 19 Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer 19 Figura 8 Roacutetulos para los crioviales 19 Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso 4 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG 5 Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos 5 Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos 6 Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer 9 Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 21
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIacuteMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL
kPa Kilo pascales
min Minutos
s Segundos
microl microlitros
mm miliacutemetros
degC grados Celsius
pv porcentaje peso a volumen
mTorr militorricelli
mbar milibar
g gramos
ml mililitros
UCF Unidades formadoras de colonias
rpm Revoluciones por minuto
vv Porcentaje volumen a volumen
iexclPrecaucioacuten
iexclA tener en cuenta
VI
INTRODUCCIOacuteN
Este manual representa en conjunto el trabajo a traveacutes del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigacioacuten han sentado los pilares para la formacioacuten del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC ) cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservacioacuten y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigacioacuten que permita a la comunidad acadeacutemica de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbioloacutegicos en las aacutereas de biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnoloacutegica para el paiacutes Aquiacute se presentan los tres meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos aplicados en este Banco Geneacutetico Refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten Se hace eacutenfasis en los diferentes procesos materiales equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Geneacutetico
Protocolos para la
conservacioacuten de
microorganismos
2
RECEPCIOacuteN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco geneacutetico debe contar con las siguientes condiciones miacutenimas de recepcioacuten
La cepa se debe encontrar en estado de pureza Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Geneacutetico
biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnologiacutea Debe contar con un responsable entidad o institucioacuten donante que respalde
la(s) cepa(s) entregadas ademaacutes de contar con la informacioacuten de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad
La cepa o coleccioacuten debe contar con toda la informacioacuten que el Banco
geneacutetico requiera para su mantenimiento conservacioacuten y registro en la base de datos
La cepa o coleccioacuten debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles
de Bioseguridad establecidos por la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) siendo el nivel de bioseguridad 2 el maacuteximo permitido por las instalaciones del laboratorio con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo
Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado
investigaciones entre otras) se debe pasar con 15 diacuteas de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS al docente encargado
Una vez recibida la cepa se diligencian los mismos registros en digital se
anexa la informacioacuten a la base de datos asignaacutendole un coacutedigo y se diligencian las fichas de resumen
3
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS El personal encargado del Banco Geneacutetico debe realizar una verificacioacuten de la
pureza de la cepa esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada sobre una o maacutes cajas de Petri con el medio de cultivo el tiempo y temperatura de incubacioacuten especificados por quien hace la donacioacuten Asiacute mismo a partir de este subcultivo se debe realizar la evaluacioacuten de la efica-cia del meacutetodo de conservacioacuten para verificar la informacioacuten dada por el investi-gador donante
Posterior al proceso de recepcioacuten de cepas es importante tener en cuenta
que se debe verificar la fecha de la uacuteltima siembra para determinar si es apro-piado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder despueacutes al proceso de criopreservacioacuten o liofilizacioacuten
Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las
cepas por maacutes de dos meses antes de la criopreservacioacuten o la liofilizacioacuten se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservaacutendola por el meacutetodo de refrigeracioacuten con el fin de evitar que la cepa se pierda
Si se requieren hacer pruebas bioquiacutemicas pruebas cristal u otras pruebas
complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos se tendraacute que pedir la autorizacioacuten del responsable del Banco Ge-neacutetico y del encargado del laboratorio debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposicioacuten de material en el laboratorio
Nota Si alguna cepa llegara a presentar contaminacioacuten se debe informar a la persona responsable del Banco Geneacutetico y posteriormente a la persona entidad o institucioacuten donante
4
EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservacioacuten
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso
Proceso o meacutetodo Equipo Material
Refrigeracioacuten Nevera Thermolab 14-E0107 Tubo de ensayo tapa rosca
Cabina de flujo laminar Asa redonda
Esterilizador de asas
Criopreservacioacuten
Cabina de flujo laminar Crioviales Voacutertex Puntas azules Micropipeta graduable de 100-1000 microl
Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la coleccioacuten
Frascos Schott con tapa para el glicerol
Pipeteador Pipeta de 1ml o 5ml
Liofilizacioacuten
Esterilizador de asas Asa redonda
Voacutertex Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Cabina de flujo laminar Puntas azules y amarillas Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile
Recipiente de poliestireno expandido cerrado
Crimper Sello de aluminio Micropipetas graduables de 100-1000microl y 20-200microl
Pinzas Vial 5mm con tapoacuten de divisioacuten
Evaluacioacuten del
meacutetodo de
conservacioacuten
Caacutemara de Neubauer 110mm Laminilla de cuarzo
Caacutemara AxioCam ICc5 Laminas porta objetos
Microscopio Axio Scope A1 Laminillas cubre objetos
Contador de colonias CC-1 Marcador
Estereoscopio Zeiss Asa redonda
Incubadora de 25degy 37degC Asa de Drigalsky
Micropipeta graduable 100-1000microl 20-200microl y 5-20microl
Puntas azules amarillas y blancas
Voacutertex Goteros
Recuperacioacuten de
los
microorganismos
Micropipeta graduable 100-1000microl y 20-200microl
Puntas azules y amarillas
Tubos de ensayo
Cabina de flujo laminar Cajas de Petri con medio
Plancha de calentamiento Mechero
Demaacutes equipos y materiales utilizados en la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten
Beaker
Termoacutemetro
Cajas de Petri con medio
Tubos de ensayo
-Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiologiacutea
5
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Geneacutetico cuenta con medios reactivos y protectores generales definidos para los meacutetodos de preservacioacuten manutencioacuten y recuperacioacuten de microrganismos Estos se describen a continuacioacuten y se clasifican de acuerdo al meacutetodo de conservacioacuten en la Tabla 4
Medios CALDO SMPG Este medio es empleado para el crecimiento del inoacuteculo inicial y
en la formulacioacuten de la criopreservacioacuten Su composicioacuten se muestra en las Tablas 2 y 3 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG
Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos
SPC (Standard Plate Count) Este medio se utiliza para la teacutecnica de evaluacioacuten
de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Tambieacuten puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas
Agar nutritivo (AN) o medios especiacuteficos Utilizados como medio de
mantenimiento o para pruebas bioquiacutemicas yo fisicoquiacutemicas (si se realizan) en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Buffer agua peptonada Este medio se utiliza en la rehidratacioacuten y en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 76
Microelementos 076
Peptona 1
Glucosa 01
MACROELEMENTOS Cantidad MICROELEMENTOS Cantidad
MgSO4 2 g CuSO4- 5H2O 005 g
NaNO3 2 g H3BO3 01 g
KCl 015 g MnSO4 ndash H2O 01 g
CaCl2 21 g ZnSO4 ndash 7H2O 01 g
Na2HPO4 09 g Agua destilada 1000 ml
FeSO47H2O 001 g
Agua destilada 1000 ml
6
Reactivos Tincioacuten Gram La bateriacutea de reactivos para la Tincioacuten de Gram se utiliza en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Alcohol acetona Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo Agua destilada Se utiliza en todos los procedimientos para la preparacioacuten de
medios la descongelacioacuten y especialmente en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Alcohol Para desinfeccioacuten en todos los procedimientos (70) o para mecheros (95)
Aceite de inmersioacuten Se utiliza para la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten durante las observaciones microscoacutepicas
Nitroacutegeno Liacutequido Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilizacioacuten
Protectores generales Crioprotector Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservacioacuten en
proporcioacuten 67vv respecto al criovial Lioprotector Se utiliza una solucioacuten de Sacarosa 10 pv para las
formulaciones en la liofilizacioacuten bacteriana En hongos se utiliza leche descremada al 12 pv No se tiene detalles de lioprotector oacuteptimo en algas
Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos
Nota Dado que en la refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se realiza la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten se incluyen aquiacute los reactivos implicados en dicha evaluacioacuten
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten Liofilizacioacuten R
eacti
vos
Tincioacuten Gram SI SI SI
Alcohol acetona SI SI SI
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de inmersioacuten
SI SI SI
Nitroacutegeno Liacutequido NO NO SI
Me
dio
s
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios especiacuteficos
OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
Agua peptonada SI SI SI
Pro
tecto
r
Glicerol anhidro NO SI NO
Sacarosa 10pv
NO
NO SI
7
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN
Indicador uno Viabilidad Conteo directo con caacutemara de Neubauer (110mm)
Se parte de un tubo de dilucioacuten (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto el cual tiene por lo general un tiempo de incubacioacuten de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo Figura 1 Dilucioacuten en serie Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser esteacuteriles usando una nueva en cada transferencia El diluyente es agua peptonada al 01 pv
Tome la caacutemara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia
Observe las dos cuadriculas de la caacutemara que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H)
Agite el tubo de dilucioacuten seleccionado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s tomando con una micropipeta una aliacutecuota de 10microl y depositaacutendola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla dejando que se cargue por capilaridad de forma homogeacutenea (Figura 2-A) Posteriormente lleve al microscopio enfocando desde el menor aumento hasta eacutel objetivo 40x al tiempo que ajusta la intensidad lumiacutenica para poder observar las liacuteneas de la caacutemara y las ceacutelulas al tiempo
-Algunos modelos de Voacutertex no poseen un rango de velocidad sino de niveles -Para limpiar la caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo lave primero con agua destilada luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada Deje secar al ambiente -Para una correcta observacioacuten al microscopio utilice el meacutetodo de enfoque de Koumlhler -Procure no limpiar la laminilla con ninguacuten papel o pantildeo lo puede rayar -Este procedimiento debe durar maacuteximo 10min ya que la solucioacuten podriacutea secarse debido a la luz del microscopio
8
Figura 2 Conteo directo A Utilizacioacuten de la caacutemara de Neubauer 1 posicioacuten de la laminilla 2 posicioacuten de la punta para el deposito de la muestra B esquema general de la caacutemara de Neubauer Adaptado de Bastidas (2015) httpwwwceleromicscomesresourcesdocsArticlesFormula-Camara-Neubauer-Concentracionpdf amp Universitat de Barcelona (2015) httpwwwubeduLabFisioimagesstoriesFisAnimalBiologiaSangrecontadorTomapng
El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central Las foacutermulas y los cuadros a contar se determinan seguacuten el tamantildeo del microorganismo
Hongos y microalgas Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes
(cuadros 1 y cuadro central Figura 2-B) de izquierda a derecha Bacterias Cuente en el cuadro central que contiene 25 cuadros secundarios
(Figura 2-B) 5 de ellos (Figura 3-A o B) Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios en estos las ceacutelulas deben contarse en la direccioacuten que se indica en la Figura 3-C Los cuadros terciarios contienen tres liacuteneas en los extremos por ello se deben tener en cuenta las ceacutelulas que esteacuten desde la liacutenea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D
Figura 3 Conteo en bacterias A y B Forma de contar los cuadros terciarios C Direccioacuten de conteo en los cuadros terciarios D Ceacutelulas a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios
9
Es importante resaltar que las bacterias que esteacuten unidas se contaraacuten como una Una vez obtenido el nuacutemero total de ceacutelulas se realizaran los caacutelculos correspondientes a los cuadros utilizados Para obtener el nuacutemero de bacterias se utiliza la ecuacioacuten planteada a partir de Bastidas (2015) Ndeg de bacteriasml=
En el caso de hongos y microalgas se utiliza la siguiente ecuacioacuten a partir de Bastidas (2015) Ndeg de ceacutelulasml= Fd Factor de dilucioacuten = Nota El meacutetodo de conteo en caacutemara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de ceacutelulas en los procedimientos de conservacioacuten de microorganismos Pero si se requiere la utilizacioacuten de otro meacutetodo se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados
Consideremos el siguiente ejemplo Tenemos un tubo con cultivo en medio liacutequido (10ml) de 36 horas este seraacute
nuestra muestra inicial Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con aliacutecuotas de 1ml en 9ml de diluyente Se realiza el procedimiento descrito en las paacuteginas anteriores haciendo un solo conteo Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de aliacutecuota g o ml de aliacutecuota + g o ml de diluyente
Ndeg Total de ceacutelulas contadas times 10000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
-El conteo directo con caacutemara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al meacutetodo de conservacioacuten evaluado
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
10
Aplicando la ecuacioacuten para bacterias anteriormente mostrada tenemos que
Ndeg de bacteriasml=
= 81012 bacteriasml
81012 bacteriasml seraacute la cantidad de bacterias que ldquoexistenrdquo en la muestra inicial Esta en teacuterminos matemaacuteticos de las diluciones equivale a 100
Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas contando en los
cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuacioacuten tenemos que Ndeg de ceacutelulasml= = 321011 ceacutelulasml
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Seleccione tres tubos de la dilucioacuten seriada y de cada uno vierta aliacutecuotas de 100microl (agitando con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) antes de cada extraccioacuten) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio Raacutepidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky esteacuteril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky A La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atraacutes B Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro luego girar 90deg la caja y repetir el proceso
A B
90deg
16 times 250000
10-7 times 5
-Si se quieren datos maacutes fiables se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma aliacutecuota o poner en la caacutemara cinco aliacutecuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras -Al realizar el conteo en la caacutemara de Neubauer obtenemos el total aproximado de ceacutelulas presentes en la dilucioacuten utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado yo las impurezas que pueda contener la muestra por lo cual no es 100 exacto y no indica las ceacutelulas viables
16 times 10000 10-7 times 5
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Deje secar por miacutenimo 15min y lleve a incubacioacuten en posicioacuten invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja) Seguacuten el tipo de organismo las condiciones de incubacioacuten para la lectura de las cajas son
Bacterias temperatura ambiente 37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento
si se conoce Incubacioacuten de 18-24 horas Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas Casos extremos de crecimiento lento una semana
Hongos temperatura inferior a 25degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten de una siembra de solucioacuten de conidios de 4-8 diacuteas
Algas temperatura entre 25-37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten por maacuteximo 7 diacuteas en organismos descongelados o rehidratados
Luego de la incubacioacuten las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura
5) Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFCml)
Figura 5 Contador de colonias La caja de Petri se coloca en posicioacuten invertida y se marcan las colinas el contador cuenta al tacto
-La siembra por tubo se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador -Generalmente se toman las diluciones 10-5 10-6 y 10-7 Sin embargo si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3 10-4 y 10-5 -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70 flamear esperar a que el alcohol se consuma Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar por uacuteltimo palpe raacutepida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender para enfriar totalmente -Puede usarse una siembra en profundidad u otro meacutetodo para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie Sin embargo los demaacutes meacutetodos de conteo limitan la evaluacioacuten del indicador dos -Si al cabo de 30min las cajas no han secado el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condicioacuten -Con la punta de la micropipeta no toque el medio -Siempre use guantes y desinfeacutectelos constantemente durante los procedimientos
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En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250 al suponer que cada ceacutelula forma una colonia Para el caacutelculo de UFCml utilizamos una adaptacioacuten de la foacutermula de Valencia Z(2004)
UFCml = times times
Ejemplo 120 X 107 X 10 = 121010 UFCml
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten se calcula a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010) Tasa de supervivencia (BSR )=
Donde DD Despueacutes de la desecacioacuten AD Antes de la desecacioacuten
Indicador dos Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realiza Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas)
Diligenciar el formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas (anexo 1) descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de ldquoconteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Hay que tener en cuenta que
- Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas) de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas deben ser observadas en al menos el 80 de las colonias de la placa seleccionada
Ndeg de colonias (promedio entre las cajas por dilucioacuten)
Inverso del factor de dilucioacuten
Inverso del volumen de aliacutecuota
-La metodologiacutea y los criterios de eleccioacuten de cajas asiacute como el rango son seguidas de Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo todas las placas por dilucioacuten por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -El inverso del volumen de aliacutecuota corresponde a una medida de correccioacuten obligatoria para la siembra en superficie ya que en la praacutectica se aumenta en 110 el factor de dilucioacuten al sembrar 01ml (100microl) del tubo de dilucioacuten seleccionado
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100 Log (Ndeg UFCml AD)
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Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se realice una ldquocoloracioacuten de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005 paacuteg 24) En el caso de hongos realice una coloracioacuten simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado
Por uacuteltimo comparar los resultados con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y
macroscoacutepicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se toma registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio con caacutemara
Indicador tres Pureza de la cepa
Este indicador evaluacutea la pureza de un vialcriovial rehidratadodescongelado ademaacutes permite determinar si existe un cambio geneacutetico durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservacioacuten Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimaacutetica usando una bateriacutea de pruebas bioquiacutemicas o fisicoquiacutemicas diferenciales dependiendo de los requerimientos especiacuteficos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio Se recomienda realizar cada prueba por triplicado Tambieacuten puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales
-Realice una coloracioacuten de Gram estaacutendar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotograacutefico en un lapso no mayor a dos diacuteas -En los hongos es imprescindible el registro fotograacutefico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonoacutemica -El formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas exige un registro fotograacutefico pero alliacute solo se consignan si las fotografiacuteas son de alta calidad de lo contrario solo se dejan en la base de datos como referencia -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos -La estabilidad morfoloacutegica se evaluacutea pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -Para comparar las caracteriacutesticas macroscoacutepicas con la informacioacuten de origen se deben usar los mismos medios El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos
Si se confirma variacioacuten en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen y estas confirman la variacioacuten geneacutetica de la cepa inmediatamente se saca de la coleccioacuten origen se asigna un nuevo coacutedigo de identificacioacuten y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa Puede incluirse en la coleccioacuten Praacutecticas Acadeacutemicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva coleccioacuten
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RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento) Se toma un criovial (Semistock preferiblemente) sometieacutendolo a una
temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente 5min (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Los crioviales se introducen en bantildeo seroloacutegico una vez se llega a la temperatura deseada no antes
Del criovial se toma 1ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex
nivel 7 (asymp2240rpm) por 10s diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
La evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten se realiza al criovial luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubacioacuten (viables poscriopreservacioacuten) Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Geneacutetico
Liofilizados (Rehidratacioacuten o reconstitucioacuten)
Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC los viales a usar tomando el tiempo de rehidratacioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitando con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se toma un 1ml de este vial partiendo de esta aliacutecuota se realiza evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en medio soacutelido El indicador de viabilidad se evaluacutea solo con el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa u otro meacutetodo de conteo de organismos viables
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-dor donante sugiera otros meacutetodos de recuperacioacuten -La solucioacuten de rehidratacioacuten puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solucioacuten lioprotectora de la formulacioacuten -En el momento en que solo quede un criovialvial disponible de la cepa se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservacioacuten a partir de este
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REFRIGERACIOacuteN
Se implementa el meacutetodo de resiembra continua en este el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-Garciacutea et al 2010) cuando es utilizado para su almacenado nuevamente Se debe tener en cuenta los siguientes paraacutemetros
a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las
caracteriacutesticas del microorganismo ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios despueacutes de diacuteas semanas o meses Tambieacuten depende del tipo de medio de mantenimiento
b) El riesgo de contaminacioacuten y de cambios geneacuteticos se incrementa a mayor nuacutemero de transferencias
De acuerdo a esto para el laboratorio se determina
a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo
tapa rosca con Agar inclinado b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo procurando no
realizar maacutes de 4 transferencias c) La temperatura de refrigeracioacuten debe mantenerse en un rango de 4plusmn2degC d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminacioacuten
cruzada teniendo en cuenta la organizacioacuten interna del refrigerador evitando el amontonamiento de las cajas
e) Se utilizaraacute el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
f) Las cepas preservadas por este procedimiento seraacuten utilizadas para requerimientos internos del laboratorio preferiblemente en praacutecticas acadeacutemicas
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CRIOPRESERVACIOacuteN
Precriopreservacioacuten En el interior de la cabina de flujo laminar tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina Posteriormente son llenados con 1200microl de glicerol esteacuteril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados
Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de criopreservacioacuten (Martiacutenez amp Mayorga 2013) se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae una aliacutecuota de 1ml diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02)
Despueacutes agitar el tubo T02 con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s tomando
luego cinco aliacutecuotas de 600microl depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Se rotulan los crioviales y se realiza Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten Inmediatamente despueacutes de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente seguacuten la coleccioacuten a una temperatura de -85degC plusmn 1degC
Por uacuteltimo se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIOacuteN
culminado el proceso
-No use micropipeta para pipetear el glicerol -Todo el material debe ser correctamente esterilizado -Nunca tocar las tapas en el interior -De ser posible se recomienda una concentracioacuten de 10⁸ - 109 celml -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar 20min desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas (si se han determinado celml totales precongelamiento) -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables aumentando el nuacutemero de viables poscongelacioacuten Esto se puede hacer si no se tiene un nuacutemero determinado de ceacutelulas a una temperatura de 4degC plusmn 1degC por 20-30min -Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y poscriopreservacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas
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LIOFILIZACIOacuteN Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano Desde medio soacutelido
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio soacutelido se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general Posteriormente se debe agitar con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Desde medio liacutequido
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra diluyeacutendolo en un tubo con 9ml agua destilada esteacuteril (designado como T04)
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten Desde medio soacutelido
Del tubo T03 como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten y previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 1ml que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Desde medio liacutequido
Del tubo T04 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 100microl depositados en cuatro viales de vidrio En cada vial se adiciona 900microl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapoacuten de divisioacuten
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior de cada vial
sea lo maacutes exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T04 se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparacioacuten
Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado en
tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T04
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Con un volumen total de 1ml cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Los viales (indistintamente si se parte de medio soacutelido o liacutequido) se destapan parcialmente y se congelan en nitroacutegeno liacutequido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ge15min para ser llevados al liofilizador de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
Posliofilizacioacuten Luego del desmonte y sellado al vaciacuteo de los viales cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper posterior al proceso de liofilizacioacuten Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente El tercer vial (Lf) se almacena a 4degC plusmn 1degC en el cepario madre de liofilizados El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 diacuteas realizando evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten para saber si fue o no exitosa la liofilizacioacuten Por uacuteltimo se debe llenar el registro FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN culminado el proceso
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos En cuanto a los hongos el inoacuteculo inicial durante la preliofilizacioacuten se prepara
llenando con 10ml de agua destilada esteacuteril un cultivo soacutelido altamente esporulado del hongo Luego con un asa o espaacutetula esteacuteril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar Esta suspensioacuten es extraiacuteda con una pipeta esteacuteril y depositada en un tubo de ensayo al cual se le agrega 100microl de solucioacuten Tween 80 al 01 esteacuteril para preparar la solucioacuten de esporas Se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 20s y se prosigue de acuerdo a la ejecucioacuten de la liofilizacioacuten desde de un medio liacutequido
-Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y posliofilizacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas -Se debe realizar Voacutertex cada vez que se vaya a extraer una aliacutecuota -Los mejores resultados en la liofilizacioacuten se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas y en caldo SMPG un rango de 24-48h -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir maacutes tiempo del estipulado para su total congelamiento tener este dato de ser posible -El tiempo de liofilizacioacuten variacutea seguacuten la formulacioacuten Para una formulacioacuten con Sacarosa 10 36 horas es lo ideal -Debe usarse el accesorio para liofilizacioacuten Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vaciacuteo y de forma hermeacutetica -Los tapones de divisioacuten deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimacioacuten del agua de lo contrario no seraacute posible la liofilizacioacuten y pueden incluso quebrarse
-Si el raspado contiene rastros grandes de agar se debe realizar un filtrado con gasa esteacuteril aunque esto disminuiraacute el nuacutemero de esporas -Las esporas en solucioacuten pierden viabilidad conforme avanza el tiempo Se sugiere hacer uso de la solucioacuten antes de dos horas de preparada
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ROacuteTULOS
Refrigeracioacuten Dado que la refrigeracioacuten constituye un meacutetodo de corto plazo no se
requieren roacutetulos especiales para este meacutetodo de conservacioacuten Sin embargo es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente informacioacuten con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha
Criopreservacioacuten
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los roacutetulos de coleccioacuten usados en las cajas del Freezer y los roacutetulos para cada cepa criopreservada
Fecha de ingreso__________________________ Medio___________________________________ Cepa____________________________________ Coacutedigo__________________________________
-Es opcional imprimir este roacutetulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta
Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer
Figura 8 Roacutetulos para los crioviales
Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados
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Liofilizacioacuten
Los roacutetulos de la Figura 9 contienen la siguiente informacioacuten Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de
datos el Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo) nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten
de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6) con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada
vial Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
-Los roacutetulos de las cajas del Freezer los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo -Los roacutetulos deben colocarse antes de su almacenamiento especialmente los crioviales ya que una vez congelados el adhesivo no funciona
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Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio (paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
CC en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual moderado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro Existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o indirectamente Normalmente no existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005)
-En la base de datos del Banco Geneacutetico se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos pero el formato y tamantildeo de letra sea igual para todos los roacutetulos -Las etiquetas de liofilizacioacuten y criopreservacioacuten deben imprimirse en papel adhesivo -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos
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Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservacioacuten y en
el laboratorio
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CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121degC y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro meacutetodo de esterilizacioacuten las puntas de micropipetas los viales crioviales y sus respectivas tapas deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas) pueden ser esterilizados en horno a 160degC por 120min
Sin embargo se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de
todo el trabajo desde la preparacioacuten de medios hasta el sellado de viales y crioviales como se describe a continuacioacuten
Medios Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Son indicadores de contaminacioacuten cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios soacutelidos
Ambiente Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto) evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas El periodo de exposicioacuten va de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo Se recomienda que con un nuacutemero superior de cinco colonias en el control se desinfecte el aacuterea de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminacioacuten Cabina de flujo laminar
Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4 horas Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar
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Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70 al inico durante y al final del trabajo con cada cepa
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005) los residuos se pueden clasificar en cinco grupos La eliminacioacuten de residuos en el laboratorio de microbiologiacutea no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas por ello los desechos se dispondraacuten de la siguiente forma
Desechos no contaminados (no infecciosos) Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que
incluso pueden reutilizarse o reciclarse como el papel
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservacioacuten requiere
de material corto-punzante se cuenta con un guardiaacuten para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plaacutesticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestioacuten Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposicioacuten final de este material
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado
Las cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 20 minutos Posterior al proceso de autoclavado se deben someter a un proceso de desinfeccioacuten con hipoclorito al 15 durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jaboacuten neutro
Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas en todo caso deberaacuten tener el mismo proceso de desinfeccioacuten anteriormente mencionado
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Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado todos los desechos producidos en cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 15 minutos posterior a este proceso se descartaraacute el contenido de las cajas de Petri disponieacutendolos en bolsas rojas para residuos peligrosos Por otra parte los desechos liacutequidos deberaacuten ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa
No es directriz del laboratorio ni del Banco Geneacutetico la incineracioacuten de ninguacuten tipo de material o residuo peligroso solo de su disposicioacuten y almacenaje seguacuten lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos
26
BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2 es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos estos son
ldquoAgentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente La exposicioacuten en el laboratorio puede provocar una infeccioacuten grave pero existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces y el riesgo de propagacioacuten es limitadordquo (OMS 2005 paacuteg 1)
El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Geneacutetico Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005)
Proteccioacuten personal El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial
Se recomienda el uso de batas blancas manga larga y bien abotonada con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar ensuciar o para prevenir alguacuten accidente
Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas bufandas o gorras
Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupcioacuten
Se debe utilizar proteccioacuten ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos
Debe respetarse la prohibicioacuten de beber comer masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como boliacutegrafos ademaacutes de tocarse los ojos y nariz
27
Procedimientos Estaacute estrictamente prohibido pipetear con la boca se deben utilizar
pipeteadores mecaacutenicos Todos los cultivos stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un meacutetodo de descontaminacioacuten aprobado como por ejemplo mediante autoclave
Aacutereas de trabajo Las superficies de trabajo se descontaminan como miacutenimo una vez por diacutea
y luego de todo derrame de material contaminante
En las zonas de trabajo estaraacute prohibido comer beber fumar aplicar cosmeacuteticos manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en aacutereas de trabajo
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ninguacuten momento ropa u objetos personales
Capacitaciones Los encargados del Banco geneacutetico y del laboratorio deberaacuten estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma maacutes eficaz y asiacute reducir riesgos en el proceso
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado asiacute como de las maquinas y elementos del laboratorio
28
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REFERENCIAS
29
Anexos y formatos
30
31
32
BANCO DE LIOFILIZADOS
33
CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
34
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
FORMATO PARA CARACTERIacuteSTICAS MACROSCOacutePICAS DE LAS CEPAS
35
FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN
36
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN LIOFILIZACIOacuteN
37
38
39
40
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN CRIOPRESERVACIOacuteN
41
42
43
44
45
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas 24
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten 27
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 28
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales 29
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada 31
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados 33
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten) 34
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004 36
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006 36
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007 37
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009 37
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010 38
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad 41
Tabla 14 Tabla de convenciones 42
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1 42
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada 44
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado 46
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencioacuten de los microrganismos y dada su importancia se han
creado colecciones bioloacutegicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologiacutea Existe variedad de meacutetodos de preservacioacuten en este trabajo se determinoacute el estado
de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad estandarizando e
implementando ademaacutes el sistema de liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos
evaluaacutendolos frente a tres compuestos protectores Se realizoacute una evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten teniendo como base tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
encontrando que el sistema de criopreservacioacuten implementado en el laboratorio es oacuteptimo y el
glicerol al 67vv funciona para casi todas las cepas por largos periacuteodos de tiempo la sacarosa
10pv resultoacute ser el mejor lioprotector de los tres evaluados designaacutendolo como lioprotector
general para el laboratorio Se creoacute un manual de laboratorio para la conservacioacuten de cepas que
incluye los protocolos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten y de seguridad de los mismos Este
trabajo aporta al campo de la microbiologiacutea de la conservacioacuten y constituye un peldantildeo maacutes para
el registro del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes
PALABRAS CLAVE Criopreservacioacuten liofilizacioacuten lioprotectores conservacioacuten
microorganismos
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and given its importance have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology Exists variety of methods of preservation in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing standardizing and further
implementing the system freeze-drying taking as a starting point to them evaluating them against
three protective compounds An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators
viability morphological stability and purity was performed finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67 vv works for almost all strains for long
periods of time sucrose 10 wv lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory It was created a manual for conservation
laboratory strains including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions
KEYWORDS cryopreservation freeze-drying lyoprotectants conservation microorganisms
11
1 INTRODUCCIOacuteN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible pues como lo menciona
Hurtado (2009) la vida no es posible sin la actividad de estos ya que estaacuten involucrados en todas
las dinaacutemicas ambientales existentes en el planeta Sin embargo su importancia ha ido maacutes allaacute
desde que fueron descubiertos hace unos 300 antildeos por van Leeuwenhoek potencializaacutendose su
investigacioacuten y utilizacioacuten en distintos campos de la ciencia y la tecnologiacutea en los uacuteltimos 100
antildeos iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi amp Mayz 2003)
Debido a esto se han creado colecciones bioloacutegicas como meacutetodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho Las colecciones de cultivos microbianos estaacuten
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt y a nivel internacional por
la Federacioacuten Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) en donde existen actualmente
2acute520200 microorganismos en 711 colecciones de 71 paiacuteses registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM) Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM el CIAT (Rhizobium Collection America) de coacutedigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccioacuten de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de coacutedigo WDCM 857 (WFCC 2015)
No obstante varias universidades del paiacutes instituciones puacuteblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias bioloacutegicas poseen colecciones microbioloacutegicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN) en otros casos las colecciones estaacuten en proceso de registro o en formacioacuten como en la
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) entre otras
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer meacutetodos de conservacioacuten fiables
que entre otras cosas eviten al maacuteximo el riesgo de peacuterdida o de variabilidad geneacutetica de los
individuos Existe variedad de meacutetodos de conservacioacuten seguacuten sea el tiempo que estaraacuten en la
coleccioacuten o el tiempo en que tardaraacuten en ser usados dentro de ellos destacan la criopreservacioacuten y
la liofilizacioacuten meacutetodos utilizados para la coleccioacuten de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo
Martiacutenez amp Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Geneacutetico en el Laboratorio
de Microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC siglas de la coleccioacuten microbioloacutegica) utilizando
la refrigeracioacuten como meacutetodo primario implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
criopreservacioacuten
En este trabajo se pretendioacute determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad implementando y estandarizando ademaacutes el sistema de
liofilizacioacuten teniendo como punto de partida a los mismos evaluaacutendolos frente a tres compuestos
protectores Para ello en primera estancia se recibioacute una capacitacioacuten sobre manejo y control de
microrganismos preparacioacuten de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados posteriormente se evaluoacute el estado de criopreservacioacuten de las cinco
cepas seleccionadas utilizando teacutecnicas de recuento en placa estaacutendar y se evaluoacute a tres
lioprotectores para la liofilizacioacuten de cepas microbianas del Banco Geneacutetico ademaacutes se realizaron
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacioacuten y se disentildearon los
protocolos para la implementacioacuten del sistema de liofilizacioacuten con las cinco cepas y el lioprotector
que presentoacute mejores resultados en este estudio
Para la realizacioacuten de estos fines el trabajo fue dividido en cuatro fases comenzando por los
criterios de eleccioacuten de los microrganismos y los lioprotectores seguido de la evaluacioacuten de los
meacutetodos de preservacioacuten utilizando tres indicadores viabilidad estabilidad morfoloacutegica y pureza
posteriormente una tercera fase de ajustes a la liofilizacioacuten para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo utilizando como indicadores las propiedades fiacutesicas generales la
posibilidad de contaminacioacuten en el proceso y el tiempo de redisolucioacuten finalmente una cuarta
fase que corresponde al proceso de documentacioacuten este incluye la revisioacuten y modificacioacuten de la
base de datos la elaboracioacuten de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados asiacute como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccioacuten y finalmente la
elaboracioacuten del manual de procedimientos Con lo anterior se encontroacute que el sistema de
criopreservacioacuten desarrollado por Martiacutenez amp Mayorga (2013) es eficiente y permite porcentajes
de recuperacioacuten bastante altos incluso superiores al 90 luego de dos antildeos sin embargo no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estaacuten expuestas por
este meacutetodo De otro lado se determinoacute la sacarosa al 10 como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caracteriacutesticas propias de cada organismo)
y se estandarizoacute el sistema de liofilizacioacuten
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacioacuten de un nuevo meacutetodo de
conservacioacuten de microorganismos para el Banco Geneacutetico de la Universidad Distrital Francisco
Joseacute de Caldas ademaacutes aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacioacuten en bacterias y ofrece
informacioacuten yo tips sobre el proceso de liofilizacioacuten en general que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso Tambieacuten se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Geneacutetico en la comunidad cientiacutefica a nivel nacional
e internacional
Este documento consta en su orden de un capiacutetulo de introduccioacuten y un marco referencial de los
objetivos tanto general como especiacuteficos alcanzados en este trabajo una metodologiacutea detallada
paso a paso perfectamente reproducible los resultados encontrados asiacute como el anaacutelisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacioacuten
finalmente un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo el campo de la
conservacioacuten microbiana y los capiacutetulos correspondientes a las referencias y bibliografiacutea utilizada
Se incluye tambieacuten un capiacutetulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientiacutefica del presente trabajo
13
2 MARCO REFERENCIAL
21 IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLOacuteGICAS
La vida en la Tierra no seriacutea posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado 2009) ya que estaacuten involucrados con las dinaacutemicas en los ecosistemas terrestres aeacutereos
y acuaacuteticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta Existen
microorganismos que degradan la materia orgaacutenica hacieacutendola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) evitando que el mundo sea un vertedero
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnoloacutegicos de la humanidad
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea Bacteria y
Eucarya en donde encontramos como primeros representantes a las bacterias las maacutes numerosas
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) muchas pueden
resultar beneacuteficas para ser utilizadas con fines biotecnoloacutegicos agriacutecolas biomeacutedicos ecoloacutegicos
y de biorremediacioacuten (Morales-Garciacutea et al 2010) Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucioacuten en la naturaleza contribuyendo a la descomposicioacuten de la materia orgaacutenica y
participando en los ciclos bioloacutegicos (Pontoacuten Moragues Geneacute Guarro amp Quindoacutes 2002)
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucioacuten de los
graves problemas de la humanidad (Gonzaacuteles de Oca Martiacutenez Riveroacuten amp Nuacutentildeez 2006) en la
agricultura alimentacioacuten salud y en la buacutesqueda de nuevas fuentes de energiacutea y la conservacioacuten
del medio ambiente Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioquiacutemicas para Atlas (citado por Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez
1998) dicha capacidad se basa ldquoen la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones oxidaciones reducciones y precipitacioneshellip y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierrardquo (paacuteg 289)
Los recursos microbioloacutegicos (microorganismos genes e informacioacuten) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologiacutea las ciencias de la vida (Ivshina amp Kuyukina 2013) el
desarrollo de medicamentos farmaceacuteuticos agentes agroquiacutemicos biocontroles cosmeacuteticos y
productos industriales (Ten Kate 1995) Ademaacutes con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el eacutexito de los primeros aislamientos de microorganismos se marcoacute la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacioacuten de toda la biodiversidad microbiana logrando la inclusioacuten de este tema en el
desarrollo de las poliacuteticas ambientales (Gonzaacuteles et al 2006)
El meacutetodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta fuera de sus
ambientes ecosistemas y nichos ha sido la creacioacuten de colecciones bioloacutegicas cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfoloacutegicos fisioloacutegicos o
geneacuteticos (Montes de Oca et al 2008) Las colecciones de cultivos microbianos variacutean en forma
funcioacuten y tamantildeo Pueden ser pequentildeas privadas mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especiacuteficos (Duratildees Sette Pagnocca amp Rodrigues 2013)
14
El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura baacutesica de
investigacioacuten en ciencias de la vida llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg Dedeurwaerdere amp Pascual 2013) de animales y plantas pero se cuentan con
caracteriacutesticas especiacuteficas para los microorganismos En primer lugar los organismos microbianos
tienen una variacioacuten geneacutetica extremadamente alta y altos iacutendices de mutacioacuten en la reproduccioacuten
en las especies por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al 2013) a su lugar de recoleccioacuten En segundo lugar las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacioacuten asegurar los recursos geneacuteticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes para proporcionar biomateriales autenticados
para materiales de investigacioacuten exploracioacuten y produccioacuten asiacute como su uso contemporaacuteneo por
parte de las entidades privadas y puacuteblicas (Stromberg et al 2013)
Los microorganismos al igual que otros seres vivos poseen una uacutenica e irremplazable
secuencia de ADN por lo que su desaparicioacuten implicariacutea la peacuterdida irreversible de un conjunto
uacutenico de informacioacuten (Olalde Portugal amp Aguilera Goacutemez 1998) de ahiacute la gran importancia en la
creacioacuten de comiteacutes comisiones federaciones y grupos de microbiologiacutea como World Federation
for Culture Collection (WFCC) International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacioacuten
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC 2010b)
22 CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
En las colecciones es necesario establecer meacutetodos de conservacioacuten confiables y especiales
pudiendo realizarse a corto mediano y largo plazo para asegurar la oacuteptima viabilidad
almacenamiento y pureza (WFCC 2010b) de los diferentes microorganismos Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de peacuterdida cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
miacutenimo dos meacutetodos (WFCC 2010b) de conservacioacuten que consideren el tiempo a emplear en la
preservacioacuten inicial manipulacioacuten y control perioacutedico de las cepas asiacute como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemaacuten Diacuteaz Rosa amp Aacutelvarez Molina 2005)
Se debe tener especial cuidado con geacuteneros y especies todaviacutea no conservadas en colecciones
(especies nuevas) contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
oacuteptimos (WFCC 2010a) de conservacioacuten de estos
221 Conservacioacuten a corto plazo
Comuacutenmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestioacuten seraacute utilizado en un corto
periodo de tiempo Suele utilizarse la teacutecnica de resiembra continua en este el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC
donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garciacutea et al 2010)
222 Conservacioacuten a mediano plazo Criopreservacioacuten
Este concepto agrupa a las teacutecnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 antildeos (Weng et al 2005) Existen variedad de teacutecnicas como la
desecacioacuten el gel de siacutelice o perlas de vidrio el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al
2005) o la congelacioacuten La inclusioacuten de esta uacuteltima teacutecnica en este grupo es discutida por algunos
autores ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacioacuten como la criopreservacioacuten (o
15
congelacioacuten) son teacutecnicas de conservacioacuten a largo plazo (Perry 1995 Weng et al 2005) y otros
insisten su inclusioacuten en las teacutecnicas de conservacioacuten a mediano plazo (Morales-Garciacutea et al 2010)
La criopreservacioacuten consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas
Esto permite la eliminacioacuten del agua libre disponible y que en el interior de los individuos ldquosoacutelo
una proporcioacuten del total de agua se convierta en hielordquo (Perry 1995 paacuteg 23)
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 deg C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta peacuterdida de la
viabilidad del cultivo (Perry 1995) por parte del laboratorio Este meacutetodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las ceacutelulas a -80degC
(Morales-Garciacutea et al 2010) Heckly (citado por Perry 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas la viabilidad celular es casi independiente del periacuteodo de almacenamiento ademaacutes
se cree que los individuos criopreservados siguen siendo geneacuteticamente estables
Hubaacutelek (2003) menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacioacuten de microorganismos desde las caracteriacutesticas propias del individuo (cepa
especie tamantildeo y forma de celda fase de crecimiento al momento de congelar composicioacuten de las
ceacutelulas etc) asiacute como los factores antes (composicioacuten del medio de crecimiento pH temperatura
de incubacioacutenhellip) durante y posterior al proceso de criopreservacioacuten (densidad poblacional
aditivos temperatura y duracioacuten del almacenamientohellip) e incluso en su descongelacioacuten
ldquoLos aditivos crioprotectores son compuestos quiacutemicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los dantildeos durante el proceso de congelacioacutenrdquo (Gonzaacuteles et al 2006 paacuteg
16) Estos protectores se pueden clasificar seguacuten su peso molecular (bajo o alto) o seguacuten su tasa
yo capacidad de penetracioacuten los penetrantes de bajo peso molecular que desplazan el agua
intracelular evitando la formacioacuten de hielo (por ejemplo el glicerol) y los no penetrantes de alto
peso molecular que promueven la raacutepida deshidratacioacuten de la ceacutelula (por ejemplo los gluacutecidos)
(Hubaacutelek 2003)
223 Conservacioacuten a largo plazo
Este concepto agrupa a las teacutecnicas que ademaacutes de minimizar al maacuteximo el riesgo de cambio
geneacutetico en las ceacutelulas mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 antildeos o maacutes (Weng et al 2005)
La maacutes popular es la liofilizacioacuten
2231 Liofilizacioacuten
La liofilizacioacuten consiste en la eliminacioacuten del agua de una sustancia congelada por
sublimacioacuten del hielo bajo alto vaciacuteo y a presiones muy bajas (Gonzaacuteles et al 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador Si la liofilizacioacuten es exitosa se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacioacuten por varios antildeos de los microorganismos sin embargo dicho eacutexito depende de
muacuteltiples factores entre otros como los mencionados por Hubaacutelek (2003) para la criopreservacioacuten
(puesto que la liofilizacioacuten posee una etapa de congelacioacuten) asiacute mismo el tiempo de liofilizacioacuten
los paraacutemetros de liofilizacioacuten el medio aditivo o lioprotector usado tipo de liofilizador o
accesorio utilizado influyen en el producto final
16
El proceso de conservacioacuten de microorganismos por liofilizacioacuten se puede dividir en muacuteltiples
etapas desde la formulacioacuten del protector hasta el modo en que se recuperaraacuten los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1)
Figura 1 Esquema general de la conservacioacuten de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacioacuten Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacioacuten Asiacute mismo se
representa el efecto de cascada en teacuterminos de la viabilidad de las muestras
a) Formulacioacuten
Se entiende como la mezcla de ceacutelulas con cualquier solucioacuten protectora que tras la
eliminacioacuten del disolvente permita obtener un producto (liofilizado) deseado La solucioacuten
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacioacuten Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de gluacutecidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics 2015)
Las soluciones protectoras oacuteptimas contienen principalmente un soluto protector
denominado lioprotector que estabiliza las ceacutelulas cuando se elimina el disolvente (agua)
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despueacutes de la liofilizacioacuten (Figura 2) Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actuacutean como su propia matriz por ejemplo la sacarosa al
10 (Ops Diagnostics 2015)
La formulacioacuten tambieacuten comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse pudiendo variar de si se parte de un cultivo soacutelido en
agar o de un cultivo liacutequido hasta que sean cultivos soacutelidos densos (edad de 1-2 diacuteas) o
liacutequidos en fase estacionaria Cuando se parte de un medio liacutequido y si es posible las
ceacutelulas se centrifugan retirando el medio de cultivo y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucioacuten protectora (Ops Diagnostics 2015) o de lioprotector (Grauer
Grunberg amp Zardo 2015) Para cultivos desde agar suele lavarse la placatubo con 5-10
ml de medio protector posteriormente recogido con una pipeta esteacuteril (Ops Diagnostics
2015) Aunque en esto uacuteltimo se evita la centrifugacioacuten se obtiene un mayor nuacutemero de
ceacutelulas partiendo de cultivos liacutequidos (Grauer et al 2015)
17
Figura 2 Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado
Fuente Adaptado de Jennings T A (2008) Lyophilization Introduction and Basic Principles (paacuteg 5)
New York Informa Healthcare USA Inc
b) Congelacioacuten
La congelacioacuten es la primera etapa del meacutetodo de liofilizacioacuten y uno de los maacutes
importantes para el eacutexito de este Su funcioacuten consiste en obtener una matriz en donde esteacute
separado el disolvente de los solutos Cuando se congela la formulacioacuten el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regioacuten intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings 2008) la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regioacuten intersticial a casi 0 ademaacutes proporciona una estructura
con resistencia casi nula al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings
2008)
Disminuir el flujo de agua raacutepidamente es importante para evitar asiacute la excesiva
concentracioacuten de solutos un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracioacuten de solutos evitando el estreacutes osmoacutetico y permitiendo una organizacioacuten
espacial de los componentes de la formulacioacuten en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al 2015)
La temperatura y el tiempo para una congelacioacuten completa de la formulacioacuten
dependen de la naturaleza de la misma Nireesha et al (citado por Grauer et al 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco de ahiacute que una correcta congelacioacuten reduce la
desnaturalizacioacuten teacutermica del liofilizado ldquoinmoviliza componentes de la solucioacuten y evita
la formacioacuten de espuma cuando se aplica el vaciacuteordquo (Adams 2007)
c) Secado primario
Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacioacuten ademaacutes es la de maacutes larga
duracioacuten En este etapa la presioacuten se reduce y la temperatura de la formulacioacuten congelada
es elevada dando lugar a la sublimacioacuten (Figura 3) y migracioacuten de vapor de agua (Grauer
et al 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador Sin embrago dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
euteacutectica de colapso de transicioacuten viacutetrea (Tg) para minimizar el dantildeo de la muestra
(Adams 2007)
18
Figura 3 Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua Se indican los requerimientos de presioacuten
y temperatura que hacen posible la sublimacioacuten del agua durante la liofilizacioacuten
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
El tiempo para el secado primario depende de muacuteltiples factores como la
composicioacuten de la solucioacuten protectora la porosidad del congelado la calidad o resistencia
de la matriz la cantidad de muestras asiacute como tambieacuten el volumen de la formulacioacuten entre
otros Respecto al volumen ldquopara las bacterias las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 025 a 05 mlrdquo (Ops Diagnostics 2015) Aunque no existe un
volumen establecido hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de maacutes
tiempo
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) un periacuteodo de secado primario de un diacutea es suficiente
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras teniendo
como guiacutea un tiempo de liofilizacioacuten de una noche
La etapa de secado primario finaliza ldquocuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacioacuten y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congeladardquo (Jennings 2008 paacuteg 6)
d) Secado secundario
Es la tercera y uacuteltima etapa de la liofilizacioacuten Al terminar el secado primario se ha
eliminado el agua moacutevil de la muestra Sin embargo existe agua atrapada dentro del soacutelido
amorfo que es maacutes difiacutecil de eliminar (Fetterolf 2010) La cantidad de agua es discutible
ya que fluctuacutea en funcioacuten de la temperatura y las caracteriacutesticas propias de los
19
constituyentes de la formulacioacuten por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10 ww del producto seco (Jennings 2008) o del 2-4 (Ops Diagnostics 2015)
La reduccioacuten del contenido de humedad en la torta se logra por desorcioacuten (Adams
2007) sin reducir el volumen de la misma (Jennings 2008) Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presioacuten parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario durante el secado secundario
(Ops Diagnostics 2015) Es importante que la temperatura no se incremente velozmente y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicioacuten viacutetrea la cual aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf 2010)
Seguacuten Ops Diagnostics (2015) esta etapa es relativamente corta con una duracioacuten de
1 a 2 horas aunque Grauer et al (2015) indica que representa entre el 30-40 del tiempo
total del proceso asiacute mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo
con una duracioacuten de hasta varios diacuteas Esto resulta importante puesto que ldquola cantidad de
agua residente luego del secado afecta la tasa de peacuterdida de viabilidad durante el
almacenamientordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 16)
Finalmente al ser removida la humedad residual la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al 2015) obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2) o pastel esponjoso con poca (inferior al 1) o nula humedad
residual (Fetterolf 2010)
Las tres etapas del proceso de liofilizacioacuten en funcioacuten de la temperatura y la presioacuten
y en contraste con el diagrama de fases del agua pueden ser observadas en la Figura 4
Figura 4 Descripcioacuten global del proceso de liofilizacioacuten De 1-3 Congelamiento (1-2 presioacuten
atmosfeacuterica) de 3-4 secado primario de 4-5 Secado secundario
Fuente Fetterolf D M (2010) Lyophilization (paacuteg 19) Journal of Validation Technology 18-23
20
e) Sellado y almacenamiento
Terminado el proceso de secado secundario se deben sellar los viales al vaciacuteo (de ser
posible) o de forma hermeacutetica tan pronto como sea posible debido a que la torta actuaraacute
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf 2010) aunque
tambieacuten es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams 2007) e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de siacutelice
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente Sin embrago aunque
se logre un correcto sellado al vaciacuteo no se puede asegurar una larga vida uacutetil en condiciones
ambientales ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al 2015)
por ello lo mejor es almacenar los liofilizados a 4deg C en la oscuridad (Ops Diagnostics
2015) reduciendo las posibilidades de peacuterdidas aunque haya quedado agua despueacutes del
secado
f) Reactivacioacuten o rehidratacioacuten
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacioacuten original esto
implica la adicioacuten de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings 2008
Grauer et al 2015) La dilucioacuten raacutepida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings 2008) da cuenta de un correcto proceso de liofilizacioacuten
ldquoTiempos de reconstitucioacuten excesivamente largos la peacuterdida de potencia o la formacioacuten
de una solucioacuten turbia son indicios de un proceso de liofilizacioacuten inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacioacutenrdquo (Jennings 2008 paacuteg 11)
La recuperacioacuten de las ceacutelulas sin embrago tambieacuten se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacioacuten) el tipo
de diluyente su temperatura su pH la osmolaridad (Grauer et al 2015) la potencia del
lioprotector (Jennings 2008) entre otras propiedades de la solucioacuten resultante
Grauer et al 2015 sugieren la utilizacioacuten de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacioacuten de los microorganismos con el fin de evitar el estreacutes
osmoacutetico que pueden causar las soluciones diluidas sin embargo algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacioacuten especiacuteficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato
Ops Diagnostics (2015) indican que una tasa de supervivencia superior al 50 se
considera aceptable por muchos laboratorios
2232 Control de calidad de un producto liofilizado
Las propiedades fiacutesicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayoriacutea un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacioacuten entre los
paraacutemetros de la formulacioacuten y el proceso de liofilizacioacuten por ello permiten el seguimiento y la
deteccioacuten de falencias (Jennings 2008)
21
Esta evaluacioacuten permite caracterizar las diferentes propiedades fiacutesicas quiacutemicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendraacuten sobre dichas propiedades Jennings (2008) y Ticoacute
G (1987) recogen algunos de las toacutepicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado por ejemplo las propiedades generales fiacutesicas de la torta (color volumen temperatura
de transicioacuten textura porosidad densidad contraccioacuten o colapso estado del vial entre otras que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacioacuten) su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfeacuterica) la velocidad de redisolucioacuten o
reconstitucioacuten la estabilidad (de la torta el microorganismo o el lioprotector evaluada de forma
natural o acelerada) nivel de humedad residual posibles contaminantes entre otras
2233 Equipamiento para liofilizar
Como ya se mencionoacute inicialmente el proceso de liofilizacioacuten requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5) este equipo consta esencialmente de tres partes
a) Un sistema o bomba de vaciacuteo que reduce la presioacuten del ambiente de la caacutemara que contiene
el material a secar Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo dantildeen ldquoEl nivel
de vaciacuteo requerido debe ser entre 50 y 100 μbarrdquo (Grauer et al 2015 paacuteg 9) aunque 200
μbar son aceptables
b) Un condensador con circuito de refrigeracioacuten que comunica con la caacutemara de secado y
condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacioacuten sobre una superficie enfriada
inferior a los -40degC
c) Caacutemara o accesorio de secado que es donde se coloca el material a secar Seguacuten Nireesha
et al (2013) puede ser de tres tipos
- Manifold o colector muacuteltiple
- Rotary
- Tray style de bandejas con o sin estante de taponado eacuteste uacuteltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaciacuteo de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas
Figura 5 Esquema general de un liofilizador y sus componentes En la imagen el liofilizador usa una
caacutemara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial
Tomado de httpslideplayercombrslide84760 el 15 de Agosto de 2015
22
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad y liofilizacioacuten de las mismas evaluaacutendolas frente a tres compuestos protectores
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacioacuten de cinco cepas bacterianas utilizando teacutecnicas de recuento
en placa estaacutendar
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacioacuten de cepas microbianas
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten
Disentildear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacioacuten a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados
23
4 METODOLOGIacuteA
La metodologiacutea general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases como es ilustrado en la
Figura 6
Figura 6 Metodologiacutea Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia loacutegica de eventos
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra
41 FASE INICIAL
411 Acervo Microbiano
De la coleccioacuten de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Geneacutetico del laboratorio de
microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC) se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracioacuten de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologiacutea estas corresponden a CR004 CR005 (sustituida posteriormente
por CR009) CR006 CR007 y CR010 seguacuten los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodriacuteguez (2013) Todas estaban conservadas por el meacutetodo de criopreservacioacuten (o
criocongelacioacuten) a una temperatura de -85 degC plusmn 1degC
412 Eleccioacuten de los protectores
4121 Crioprotectores
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99999) (Mallinckrodt Meacutexico) en
proporcioacuten 67 vv seguacuten lo establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
4122 Lioprotectores
Para la eleccioacuten de los agentes protectores y sus concentraciones en pv (Tabla 1) se
tuvieron en cuenta diferentes estudios en contraposicioacuten a Hensel (1994) se tomaron
concentraciones superiores al 9 de Glucosa (Merck Darmstadt) de forma aleatoria En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed amp
Roos (2004) y Palmfeldt Radstroumlm amp Hahn-Haumlgerdal (2003) Para la leche descremada
(Proleche Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al (2003) Dichos estudios
fueron tomados como referencia teoacuterica aunque los microorganismos en ellos especificados no
correspondan con los del presente trabajo
Criterios de eleccioacuten de los
microorganismos asiacute como de
los lioprotectores a evaluar
Evaluacioacuten de los meacutetodos de
conservacioacuten (criopreservacioacuten
y liofilizacioacuten)
Ajustes a la liofilizacioacuten
para la generacioacuten de
protocolos
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
24
Tabla 1 Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracioacuten
pv
10 4 10
117 10 15
27 15 20
42 FASE INTERMEDIA 1
421 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
En este trabajo se evaluaron dos meacutetodos de conservacioacuten (criopreservacioacuten y liofilizacioacuten)
dicha evaluacioacuten se realizoacute en teacuterminos de tres (3) indicadores valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al meacutetodo en siacute
4211 Viabilidad
Para evaluar este indicador se utilizoacute
a) Conteo directo con caacutemara de Neubauer 110mm (Boeco) siguiendo la metodologiacutea
planteada por Valencia Z (2004) Sin embargo para obtener el nuacutemero de bacterias se
utilizoacute la ecuacioacuten planteada por Bastidas (2015)
No de bacteriasml=
Fd Factor de dilucioacuten =
El conteo directo con caacutemara de Neubauer solo se realizoacute previamente al meacutetodo de conservacioacuten
evaluado
b) Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa seguacuten lo
descrito por Valencia Z (2004) y Camacho et al (2009) Para el caacutelculo de UFCml se
utilizoacute la siguiente foacutermula
UFCml = Ndeg de colonias times times
Los caacutelculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologiacutea planteada por
Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales se utilizoacute los planteamientos del Instituto
de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacioacuten y solo pos a la criopreservacioacuten en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid
England)
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten
fue calculado a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010)
Tasa de supervivencia (BSR ) = DD Despueacutes de la desecacioacuten
AD Antes de la desecacioacuten
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000
Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucioacuten
1
ml de muestra
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100
Log (Ndeg UFCml AD)
25
4212 Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realizoacute
a) Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) Se elaboroacute un formato (anexo 1) con las
caracteriacutesticas macroscoacutepicas descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz
(2009) para las colonias desarrolladas en superficie a partir del procedimiento de ldquoconteo
de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Se utilizoacute un
contador de colonias CC-1 (Boeco)
- Se seleccionoacute solo una de dos placas de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de
UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron observadas en al menos el 80 de las colonias
de la placa seleccionada
b) Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se
realizoacute una ldquocoloracioacuten de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005
paacuteg 24)
Se compararon con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y macroscoacutepicas descritas por
Rodriacuteguez (2013) y la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se tomoacute
registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio (Zeiss)
con caacutemara Canon G9
4213 Pureza
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en
cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante
teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
422 Recuperacioacuten de los microorganismos
Para la recuperacioacuten de los microorganismos se tomoacute un criovial de cada cepa bacteriana
sometido a una temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua
destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente cinco (5) minutos (Martiacutenez amp Mayorga
2013) Los crioviales se introdujeron en bantildeo seroloacutegico una vez se llegoacute a la temperatura deseada
no antes
De cada criovial se tomoacute un (1) ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (asymp2240rpm) por diez (10) segundos diluyeacutendolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
Se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten a cada criovial (Thomas
Scientific 5150636) por cepa luego de preparado el tubo T01 antes de la incubacioacuten Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martiacutenez amp Mayorga
(2013) y Rodriacuteguez (2013)
26
423 Criopreservacioacuten
4231 Precriopreservacioacuten
Pasado el tiempo de incubacioacuten se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten al tubo T01 con el fin de determinar el nuacutemero de ceacutelulas totales y viables de la
muestra El conteo en Caacutemara de Neubauer se realizoacute solo hasta el final de los procedimientos de
preservacioacuten por lo cual una vez preparadas las diluciones estas fueron llevadas a nevera a 4degC plusmn
1degC para evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
4232 Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Se siguioacute el protocolo de criopreservacioacuten establecido por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas con
algunas variaciones
Con pipeta esteacuteril de 5ml se depositaron en cinco (5) crioviales 12ml de glicerol anhidro
esteacuteril
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02)
Posteriormente se tomaron aliacutecuotas desde T02 de 600microl previo Voacutertex nivel 7 por 15s
depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl Se rotularon y se
realizoacute Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten
Inmediatamente despueacutes de la homogenizacioacuten fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick) a una temperatura de -85degC plusmn 1degC en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestioacuten
Este procedimiento se realizoacute en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar veinte (20) minutos (Martiacutenez amp
Mayorga 2013) desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar
la generacioacuten de nuevas ceacutelulas
424 Liofilizacioacuten Etapa 1
4241 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Se partioacute del tubo T01 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de
liofilizacioacuten Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01 previamente agitado con Voacutertex nivel
7 (asymp2240rpm) por 15s diluyeacutendolo en nueve (9) ml agua destilada esteacuteril (T03)
4242 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
Partiendo del tubo T03 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se
extrajeron aliacutecuotas de cien (100) microl veintisiete (27) veces depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar En cada criovial se adicionaron novecientos (900) microl de lioprotector en tres
crioviales por cada concentracioacuten de lioprotector de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2)
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior del criovial fuera lo maacutes
exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T03 se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacioacuten
27
Donde el volumen inicial y la concentracioacuten inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado en tanto que el volumen final y la concentracioacuten final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T03
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (aliacutecuota maacutes protector) se
agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacioacuten
Posteriormente a los crioviales se les retiraron las tapas plaacutesticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney PM-996) esterilizado realizando seis (6) perforaciones conceacutentricas en la superficie
con aguja hipodeacutermica 21G x 1frac12rdquo Los crioviales fueron congelados en nitroacutegeno liacutequido por
15min aproximadamente depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD Thermo
Scientific) de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45degC usando el colector muacuteltiple (manifold)
Terminado el proceso se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la caacutemara
de flujo laminar para evitar contaminacioacuten de las muestras alliacute se les retiroacute el Parafilm se les tapoacute
con tapas esteacuteriles y se les rotuloacute
Tabla 2 Nuacutemero de repeticiones (y tubos) seguacuten lioprotector y concentracioacuten
Lioprotector Concentracioacuten
(pv)
Serie
A B C
Glucosa
10 1 1 1
117 1 1 1
27 1 1 1
Sacarosa
4 1 1 1
10 1 1 1
15 1 1 1
Leche
descremada
10 1 1 1
15 1 1 1
20 1 1 1
Total crioviales seguacuten Ndeg 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4243 Posliofilizacioacuten (Rotulado y almacenaje)
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten utilizando una etiqueta o
roacutetulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacioacuten
Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de datos el
Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten
bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo)
nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3) con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo
bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas
tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada vial
Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional
a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 7 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
Posterior al proceso de rotulado los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano a temperatura ambiente y protegido de la luz
Tabla 3 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS
CC en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado riesgo
poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entrantildear un riesgo grave para el personal de
laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado
riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro Existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o
indirectamente Normalmente no existen medidas
preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005)
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio
(paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications
biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
29
425 Rehidratacioacuten o Reconstitucioacuten Etapa 2
Se realizoacute una prueba de estabilidad natural en teacuterminos del aspecto fiacutesico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un periacuteodo prolongado de tiempo (Grauer et al 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente Por ello la rehidratacioacuten de los crioviales se realizoacute en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4)
Tabla 4 Rehidratacioacuten de los crioviales
Primera rehidratacioacuten Segunda rehidratacioacuten Tercera rehidratacioacuten
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota Intervalos de tiempo medidos en diacuteas contados desde el diacutea de almacenaje en los cuales se rehidratoacute
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie ver Tabla 2) El aspecto fiacutesico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacioacuten y comparado con su estado antes del almacenaje
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC tomando
el tiempo de reconstitucioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel
2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de
conservacioacuten El indicador de viabilidad se evaluoacute solo con el meacutetodo de conteo de
microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la maacutes alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa se eligioacute el
lioprotector y la concentracioacuten de eacuteste que permitioacute obtener un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables
posliofilizacioacuten y que ofrecioacute ademaacutes una menor variacioacuten durante la prueba para la liofilizacioacuten
definitiva de las cepas en estudio Dicho lioprotector se establecioacute ademaacutes como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados del Banco
Geneacutetico del laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC)
43 FASE INTERMEDIA 2
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores con el aacutenimo de
generar un protocolo funcional aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partioacute de cultivos puros sobre medios soacutelidos se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacioacuten liofilizacioacuten y posliofilizacioacuten para la
liofilizacioacuten definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados
431 Liofilizacioacuten definitiva
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracioacuten oacuteptima para cada cepa
de estudio se realizoacute la liofilizacioacuten definitiva
4311 Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general Posteriormente se agitoacute con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Esto se realizoacute para cada
cepa
30
4312 Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten
El tubo T04 de cada cepa bacteriana como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten
definitiva se extrajeron cuatro (4) aliacutecuotas de un (1) ml previamente agitado con Voacutertex nivel 7
(asymp2240rpm) por 15s que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass 62113D-2)
posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agitoacute con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por
7s para su homogenizacioacuten
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitroacutegeno liacutequido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas a una presioacuten
inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
El proceso de destape parcial y congelacioacuten se realizoacute en caacutemara de flujo laminar para evitar
al maacuteximo la contaminacioacuten El transporte de los viales desde la caacutemara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitroacutegeno liacutequido
para evitar contaminacioacuten y descongelacioacuten
4313 Posliofilizacioacuten
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacioacuten Dos viales
designados como trabajo (T) y stock (S) fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4degC plusmn 1degC
4314 Rehidratacioacuten
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacioacuten de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio soacutelido
432 Control de calidad de la liofilizacioacuten y ajustes teacutecnicos
Se llevoacute un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el aacutenimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacioacuten Al identificarlas se decidioacute repetir la
liofilizacioacuten definitiva con los nuevos paraacutemetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio
4321 Propiedades fiacutesicas generales
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento) color textura brillo aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales teniendo como punto de comparacioacuten la formulacioacuten
luego de congelada Esto se realizoacute para
- Crioviales de la fase intermedia 1
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 431)
- Viales de la fase intermedia 2 (numeral 433)
4322 Contaminacioacuten
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad en
buacutesqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio
31
4323 Tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten
Se midioacute el tiempo de reconstitucioacuten de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y el tiempo de los crioviales que conteniacutean el lioprotector general fue comparado
con el tiempo de reconstitucioacuten de los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada
433 Pruebas adicionales
Para estas pruebas solo se usoacute la formulacioacuten del lioprotector general y la cepa CM-CR010
por su alta tasa de crecimiento respecto a las demaacutes cepas evaluadas
4331 Prueba de higroscopicidad maacutesica
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Ticoacute G 1987) se
tomaron los pesos con balanza analiacutetica (AND GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos El cuarto vial y criovial se abrieron solo una vez luego
fueron sellados completamente tomando sus pesos de la misma forma ya descrita
Para determinar si existe un tiempo maacuteximo admisible de cerrado se midioacute el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcioacuten del tiempo utilizando la ecuacioacuten
descrita por Garciacutea C (2007)
Wt () es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4332 Prueba de estabilidad acelerada
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa uno fue rehidratado a los cero (0) diacuteas y el otro
luego de siete (7) diacuteas en el interior de la caacutemara de envejecimiento ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5 Adicionalmente se dataron sus propiedades fiacutesicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar
Tabla 5 Prueba de estabilidad acelerada
Ndeg vial t ndash Tdeg - HR
1 0 - ambiente - 25
2 7 - 37degC - 100
Nota Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos t= Tiempo en diacuteas
Tdeg=Temperatura HR=Humedad relativa La prueba de estabilidad se realizoacute en una caacutemara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC luego
incubados a 25 degC plusmn 1degC por 30min y agitada con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente
se realizoacute evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten midiendo viabilidad con el meacutetodo
de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
32
434 Control de esterilidad
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121degC y 210Kpa por 20 minutos las puntas de micropipetas los viales
crioviales y sus respectivas tapas fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y
temperatura en un tiempo de 15 minutos Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas) fueron esterilizados en horno Binder a 160degC por 120 minutos
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo desde la
preparacioacuten de medios hasta el sellado de los viales como se describe a continuacioacuten
4341 Medios
Se realizoacute control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid England) (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Se determinoacute como indicador de contaminacioacuten
cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios
soacutelidos
4342 Ambiente
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realizoacute con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas El periodo de exposicioacuten fue de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en
incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo
b) Cabina de flujo laminar
Se realizoacute el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este
caso la caja de control de ambiente se dejoacute abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeriacutean el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4
horas Este control se llevoacute a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar
4343 Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolloacute en el interior de la cabina de flujo laminar
se procuroacute mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y
tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70 al iniciar el trabajo con cada cepa
44 FASE FINAL
441 Base de datos
Se realizoacute una revisioacuten a la base de datos del Banco de cepas creado por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) en el programa Access modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccioacuten para la informacioacuten de los organismos liofilizados
33
442 Fichas de resumen
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccioacuten tanto del Freezer
como del banco de liofilizados utilizando el programa Word 2013
443 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se realizoacute una revisioacuten de la informacioacuten en los roacutetulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos con el aacutenimo de verificar si se habiacutean cumplido los protocolos y la
logiacutestica establecida por Martiacutenez amp Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias
444 Formatos de control del banco de liofilizados
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013 para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) en la seccioacuten
de criopreservacioacuten
Tabla 6 Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados
Coacutedigo Tipo de registro Ubicacioacuten Uso
FLf-01 Registro de entrada de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccioacuten
FLf-02 Proceso de
liofilizacioacuten
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacioacuten a
una cepa
FLf-03 Registro de control de
calidad
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccioacuten y antes de liofilizar
una cepa para la coleccioacuten
FLf-04 Solicitud salida de
cepas
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados
Fuente Adaptado de Martiacutenez Beniacutetez H L amp Mayorga Burgos L P (2013) Implementacioacuten de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (Tesis de
pregrado) (paacuteg 44) Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas Bogotaacute Colombia
445 Manual de procedimientos
Se realizoacute una revisioacuten de la cartilla de procedimientos elaborada por Martiacutenez amp Mayorga
(2013) Se tomoacute la decisioacuten de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013
34
5 RESULTADOS
51 RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIOacuteN DE LA
CRIOPRESERVACIOacuteN
A raiacutez de la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en cada criovial por cepa
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno En cuanto a CM-CR005 se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer pero no fue posible recuperarla por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009 la sexta mejor respecto al criterio de eleccioacuten de cepas
Con los datos del proceso precriopreservacioacuten de las cepas de intereacutes correspondientes a la
coleccioacuten de colorantes consignados en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) en conjunto con
los datos de viables poscongelacioacuten del presente trabajo se calculoacute la BSR para cada cepa (Tabla
7) Se encontroacute que los porcentajes de BSR son superiores al 70 luego de dos (2) antildeos de estar
en criopreservacioacuten (Figura 8) salvo CM-CR005
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martiacutenez amp Mayorga (2013) (soacutelo se compararon los datos de la cepa CM-CR010 ya que las demaacutes
cepas no figuran en su trabajo) se encontroacute un porcentaje inferior de recuperacioacuten
poscriopreservacioacuten por parte de las autoras por lo cual se revisoacute la metodologiacutea encontrando un
error metodoloacutegico al calcular la BSR en su trabajo Usando los datos de ldquoresultados prueba de
viabilidad poscongelacioacuten tabla 19rdquo (en Martiacutenez amp Mayorga 2013 paacuteg 54) se corrigioacute la BSR
para esta cepa evidenciando ser la cepa maacutes resistente al proceso de criopreservacioacuten entre las
evaluadas con alrededor de 66 de caiacuteda luego de dos antildeos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8)
Tabla 7 Evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten (criopreservacioacuten)
Nota Se muestran los resultados al evaluar la conservacioacuten de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio por
el meacutetodo de criopreservacioacuten luego de dos (2) antildeos La BSR que Martiacutenez amp Mayorga (2013) presentan
corresponde a un valor poscriopreservacioacuten luego de dos meses de evaluacioacuten Nrd= No registra datos
Cepa Ceacutelulas
totales
Viables precongelacioacuten
(UFCml) de Martiacutenez
amp Mayorga (2013)
viables pos
congelacioacuten
(UFCml)
BSR
real
BSR de Martiacutenez
amp Mayorga
(2013)
BSR
corregido
CM-CR004 12x1012 61 x109 13 x107 725 Nrd Nrd
CM-CR005 11 x1010 11 x1010 0 00 Nrd Nrd
CM-CR006 14x1010 75 x109 27 x107 752 Nrd Nrd
CM-CR007 13x1011 41 x109 31 x108 883 Nrd Nrd
CM-CR009 19 x1010 44 x109 23 x107 763 Nrd Nrd
CM-CR010 17 x1010 46 x109 72 x108 916 673 982
35
Figura 8 Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelacioacuten CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperacioacuten (nuacutemero de
ceacutelulas viables)
52 CARACTERIacuteSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE ESTUDIO
En las Tablas 8 9 10 11 y 12 se describen las principales caracteriacutesticas macroscoacutepicas
utilizadas para evaluar el indicador de estabilidad morfoloacutegica de las cepas utilizadas No fue
posible realizar la comparacioacuten con los datos de Rodriacuteguez (2013) a nivel macroscoacutepico dado que
los medios usados en su trabajo no fueron los mismos que los aquiacute utilizados sin embargo si se
compararon las caracteriacutesticas microscoacutepicas las cuales fueron coincidentes aunque estas no eran
del todo claras (descripcioacuten inexacta de forma y tamantildeo y sin un registro fotograacutefico comparable)
por lo cual se decidioacute que las caracteriacutesticas macroscoacutepicas observadas desde la primera siembra
posterior a la descongelacioacuten de los crioviales fuesen las de mayor importancia para evaluar la
estabilidad morfoloacutegica y la pureza Estas se mantuvieron sin cambio o variacioacuten a lo largo del
trabajo
Las microfotografiacuteas tomadas a cada cepa usando la coloracioacuten de Gram al igual que las
fotografiacuteas de las caracteriacutesticas macroscoacutepicas fueron anexadas a la base de datos del Banco
Geneacutetico
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 725 00 752 883 763 916
Sup
ervi
ven
cia
36
Tabla 8 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR004
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR004
Descripcioacuten
Borde o Margen
Ondulado Ondas aumentan con la humedad y el tiempo de
crecimiento
Frente a luz Brillante
Elevacioacuten Umbonada
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Color Beige maacutes intenso en el centro y maacutes clara hacia los extremos en
colonias de 48h o maacutes extremos color blanco hueso
Forma Circular a maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo desarrollar forma
irregular
Grado de
Transparencia Opaca (No transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Ropa huacutemeda
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 9 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR006
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR006
Descripcioacuten
Borde o Margen Semiondulado A maacutes de 72h es altamente digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas y con medio huacutemedo se irregulariza
Luego de una semana totalmente digitado
Elevacioacuten Plana con bordes elevados (en craacuteter) Colonias de maacutes de 72h
presentan una ligera elevacioacuten en el centro
Color Amarillo
Tamantildeo Mediano (18-24h)
Superficie Escamosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca (NO transparente)
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis Si color amarillo
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
37
Tabla 10 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR007
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR007
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio muy huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular A maacutes de 48 horas y con medio huacutemedo es irregular
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 48h y distantes unas de otras (pocas
colonias) umbonadas
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Semitransparente en zona externa
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Mentol
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
Tabla 11 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR009
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR009
Descripcioacuten
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular a maacutes de 72 horas se irregulariza
Elevacioacuten En meseta y ligero hundimiento central (craacuteter) En colonias con maacutes
de 72h ligera elevacioacuten del craacuteter
Color Beige Conforme envejece la colonia toma una coloracioacuten blancuzca
de tonalidad cafeacute en el centro
Tamantildeo Pequentildea (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia Opaca Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor No registra
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
38
Tabla 12 Caracteriacutesticas macroscoacutepicas de la cepa CM-CR010
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-CR010
Descripcioacuten
Borde o Margen Entero En medio huacutemedo es suavemente ondulado en medio muy
huacutemedo es digitado
Frente a luz Brillante
Forma Circular Despueacutes de 48h se irregulariza En medio muy huacutemedo es
estrellado (sin importar edad de la colonia)
Elevacioacuten Convexa Colonias con maacutes de 72h centro marcado y ligeramente
elevado (forma de huevo frito)
Color Blanco
Tamantildeo Pequentildeo (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Transparencia
Opaca Semitransparente en la zona externa de colonias de maacutes de
48h
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis No
Olor Sin olor
Hemolisis No registra
MedioT(degC) SPC25degC
53 EVALUACIOacuteN DE LA LIOFILIZACIOacuteN PRUEBA DE ESTABILIDAD NATURAL
531 Viabilidad y seleccioacuten del lioprotector general
Las Figuras 9 10 11 12 y 13 representan los resultados de la evaluacioacuten de la eficacia del
meacutetodo de conservacioacuten realizadas para cada cepa en la etapa 2 de la fase intermedia 1 por medio
del indicador de viabilidad
Figura 9 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 6 x108 Se observa que
la leche descremada 15 como mejor protector y leche descremada 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A - - - 5987 - 5301 5958 6812 -
BSR en serie B - - - 3619 3076 4557 5100 5039 3619
BSR en serie C 3076 3619 - 3619 3076 3418 3418 5873 4723
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR004
39
Figura 10 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 73 x108 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Figura 11 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 125 x1010 Se observa
a sacarosa 10 como mejor protector y a glucosa 10 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 4173 4962 5850 6119 6415 5731 5430 4173 4513
BSR en serie B 3046 - - 4173 4743 5051 4773 - -
BSR en serie C - - - 3046 5147 4622 - - -
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR006
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 9149 8664 6549 9712 9677 8735 9026 9166 8648
BSR en serie B 8472 - 6181 - 8474 - 8413 8052 8086
BSR en serie C 8557 7472 6193 - 9272 - 8604 8202 8414
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Super
viv
enci
a
BSR en CM-CR007
40
Figura 12 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 115 x109 Se observa
a Sacarosa 15 como mejor protector y la leche descremada 10 como segundo mejor protector
Figura 13 Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados El nuacutemero de UFCml antes de la desecacioacuten fue de 65 x109 Se observa a
Sacarosa 10 como mejor protector y a Sacarosa 15 como segundo mejor protector
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 5494 4609 4609 6641 6401 6987 5585 5440 5186
BSR en serie B 4415 - - 6373 6083 6212 4941 4083 -
BSR en serie C - - - - - 7519 4083 - 4083
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Su
per
viv
enci
a BSR en CM-CR009
Glucosa
10
Glucosa
117
Glucosa
27
Sacarosa
4
Sacarosa
10
Sacarosa
15
Leche
descremada
10
Leche
descremada
15
Leche
descremada
20
BSR en serie A 8205 - 6303 9521 8634 8207 8153 8022 8332
BSR en serie B 6424 - - 7911 8312 8096 7752 6907 7995
BSR en serie C 6697 - - - 8230 7998 7919 8113 7539
-
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Sup
erviv
enci
a
BSR en CM-CR010
41
Tabla 13 Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15
CM-CR006 Sacarosa 10
CM-CR007 Sacarosa 10
CM-CR009 Sacarosa 15
CM-CR010 Sacarosa 10
Teniendo como criterio el lioprotector que al finalizar la prueba de estabilidad natural
ofreciera la maacutes alta BSR en la mayoriacutea de cepas (Tabla 13) se determinoacute la sacarosa al 10
como el mejor lioprotector y se designoacute como lioprotector general para las bacterias del banco de
liofilizados Sin embargo se decidioacute para la liofilizacioacuten definitiva utilizar el lioprotector que
mejores resultados confirioacute a cada una de las cinco cepas de estudio
532 Aspecto fiacutesico del liofilizado
Dado que el principal indicador de evaluacioacuten de la prueba de estabilidad natural en esta
etapa era la viabilidad en cada liofilizado no se tuvo en cuenta los cambios morfoloacutegicos
presentados por los liofilizados a lo largo del tiempo en esta etapa pero si fueron tenidos en cuenta
para los ajustes teacutecnicos de la liofilizacioacuten en la fase 3
54 LIOFILIZACIOacuteN DEFINITIVA
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilizacioacuten definitiva
con su homoacutelogo de la etapa 2 (es decir los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo) se encontraron diferencias significativas de aumento o disminucioacuten de hasta el 22
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad seguacuten el punto de partida de la formulacioacuten
(medio liquido SMPG vs medio soacutelido SPC) como lo muestra la Figura 14
Figura 14 Comparacioacuten entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilizacioacuten
definitiva por cepa bacteriana Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas seguacuten el intervalo
temporal de la Serie A en tanto que CM-CR007 CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron seguacuten la Serie
B (ver Tabla 4)
- 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
10000
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Punto
s p
orc
entu
ales
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
L Etapa 2 6812 6415 8474 6212 8312
L definitiva 7330 7629 7757 8461 7234
BSR comparativa
42
55 CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIOacuteN
551 Propiedades fiacutesicas generales
Se dataron las propiedades fiacutesicas de los liofilizados en la fase intermedia 1 asiacute como los
liofilizados de la fase intermedia 2 en los numerales 431 (liofilizacioacuten definitiva) y 4332 (viales
usados para la prueba de estabilidad acelerada) en las Tablas 15 y 16 respectivamente la tabla de
convenciones (Tabla 14) permite comprender los siacutembolos de las anteriores tablas
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilizacioacuten y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilizacioacuten
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transicioacuten conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto fiacutesicamente aceptable Sin embargo pese a que a las propiedades fiacutesicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1 con los cuales se realizoacute la evaluacioacuten de la liofilizacioacuten
y la prueba de estabilidad natural no eran los maacutes adecuados se decidioacute proseguir con ellos
apoyado por los resultados de Vemulapalli Bhonsle amp Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratacioacuten (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperacioacuten de microorganismos ademaacutes el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores
Tabla 14 Tabla de convenciones Siacutembolo Significado Siacutembolo Significado
SBE Si en buen estado A Algunos
SME Si en mal estado T Todos
NBE No en buen estado N Ninguno
NME No en mal estado NS No significativo (lt20)
+ Afirmativo S Significativo (201-309)
- Negativo MS Muy significativo (gt40)
NA No aplica I indeterminado
FS Al finalizar el secado AR Antes de reconstituir
Nota Convenciones utilizadas para las Tablas 14 y 15 Aunque no tenga estructura de torta el liofilizado
es estable y funcional por ende utilizable No tiene estructura de torta y ademaacutes no es ni estable ni
funcional por ende no es utilizable
Tabla 15 Liofilizados en la fase intermedia 1
Cepa Viales Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto de
torta
Fractura de
vial 1 2 3
CM
-CR
00
4
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I S Traslucido I + NBEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N S Cafeacute claro Porosa - SMEA -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR NS N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
43
CM
-CR
00
6
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR S S MS Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N NS NS Cafeacute claro Porosa - SBEA -
sm2sc AR S S S Cafeacute oscuro Porosa - SMET -
CM
-CR
00
7
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
s1 NA I I I Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR S I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS I S Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
CM
-CR
00
9
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I I NS Traslucido I + NBE -
g2sc AR MS S S Traslucido I + NMET -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sc AR MS S I Traslucido I + NMEA -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sb AR N N NS Cafeacute claro Porosa - NBE -
sm2sc AR N S NS Cafeacute oscuro Porosa - NMEA -
CM
-CR
01
0
g1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
g2 FS I I I Traslucido I + NBE -
g2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
g2sb AR I S S Traslucido I + NMEA -
g2sc AR I MS MS Traslucido I + NMEA -
s1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
s2 FS I I I Traslucido I + NBE -
s2sa AR I I I Traslucido I + NBE -
s2sb AR I I I Traslucido I + NBE -
44
Nota Datos de las propiedades fiacutesicas generales de los liofilizados usados en la prueba de estabilidad
natural salvo por el encogimiento que fue datado de forma individual (los 27 liofilizados por cepa) los
demaacutes caracteres fueron datados en un sondeo general por serie y no de forma individual Se subrayan las
anomaliacuteas encontradas a lo largo de la prueba
g Liofilizados con glucosa como protector
s Liofilizados con sacarosa como protector
sm Liofilizados con leche descremada como protector 1 Formulacioacuten congelada 2 Liofilizados almacenados a temperatura ambiente sa Serie A (antes de rehidratar) sb Serie B (antes de rehidratar) sc Serie C (antes de rehidratar)
1 Concentracioacuten uno del lioprotector
2 Concentracioacuten dos del lioprotector
3 Concentracioacuten tres del lioprotector
Tabla 16 Liofilizados de la prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva y de la prueba de
estabilidad acelerada
Nota Los liofilizados de la prueba de estabilidad natural aquiacute mencionados corresponden solo a aquellos
que contienen sacarosa al 10 (lioprotector general) Se consignan aquiacute los datos generales de los
liofilizados indistintamente de la cantidad de muestras liofilizadas
a Liofilizados de la prueba de estabilidad natural
b Liofilizados de la liofilizacioacuten definitiva
c Liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada 1 Formulacioacuten congelada 2 Viales almacenados a temperatura ambiente 3 Vial usado en la caacutemara de envejecimiento
s2sc AR I I I Traslucido I + NBE -
sm1 NA NA Cafeacute claro Lisa + SBE -
sm2 FS N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sa AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sb AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
sm2sc AR N N N Cafeacute claro Porosa - SBE -
Encogimiento Color Textura Brillo Aspecto
de torta
Fractura
de vial Viales
a1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
a2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
b1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
b2 FS I Traslucido I + NBE -
AR I Traslucido I + NBE -
c1 NA NA Blanco Lisa + SBE -
c2 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR NS Blanco Porosa - SBE -
c3 FS N Blanco Porosa - SBE -
AR S Blanco Porosa - SME -
45
Figura 15 Transicioacuten fiacutesica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes De izquierda a derecha
liofilizados de prueba de estabilidad natural liofilizacioacuten definitiva prueba de estabilidad acelerada
552 Contaminacioacuten
Se encontroacute contaminacioacuten durante la rehidratacioacuten de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006 en tanto que las siembras preliofilizacioacuten no presentaban contaminacioacuten alguna por ello
se tomaron tres viales maacutes que iban a ser rehidratados en la serie B encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilizacioacuten de esta cepa
Las demaacutes cepas no presentaron contaminacioacuten en ninguna prueba realizada
553 Tiempo de redisolucioacuten
Al medir el tiempo de redisolucioacuten o reconstitucioacuten en cada una de las rehidrataciones se
observoacute que la glucosa tardoacute maacutes tiempo en reconstituirse que las formulaciones con los otros
lioprotectores llegando a necesitar tiempos de hasta dos horas con ayuda de Voacutertex en los viales
maacutes concentrados para su total redisolucioacuten Ademaacutes se encontroacute en todos los lioprotectores que
conforme la concentracioacuten aumentaba maacutes tiempo se necesitaba para la reconstitucioacuten de la
formulacioacuten es decir que el tiempo es directamente proporcional a la concentracioacuten de
lioprotector
Al comparar el tiempo de reconstitucioacuten de los viales que conteniacutean el lioprotector general
en la prueba de estabilidad natural con los viales de la liofilizacioacuten definitiva y los viales de la
prueba de estabilidad acelerada no se encontraron diferencias significativas sin embargo el vial
de la prueba de estabilidad acelerada que duroacute siete (7) diacuteas en caacutemara de envejecimiento se
reconstituyoacute un segundo menos aproximadamente respecto a los otros viales
46
Tabla 17 Tiempo de redisolucioacuten de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado
Lioprotector Tiempo (min)
Glucosa 10 1
Glucosa 117 15
Glucosa 27 120
Sacarosa 4 05
Sacarosa 10 05
Sacarosa 15 06
Leche descremada 10 025
Leche descremada 15 033
Leche descremada 20 05
Estabilidad natural 05
Liofilizacioacuten definitiva 025
Estabilidad acelerada 004
Nota El tiempo dado para cada lioprotector corresponde al promedio de liofilizados rehidratados en cada
uno liofilizados con el lioprotector general
56 PRUEBAS ADICIONALES
561 Prueba de higroscopicidad maacutesica
En la Figura 16 se observa un aumento draacutestico del peso de los viales dentro de la ventana
de los primeros diez (10) minutos una vez destapados los liofilizados (estos se encontraban cerrados
al vaciacuteo) Los crioviales por el contrario (no estaban cerrados al vaciacuteo) no tuvieron un aumento en
peso tan draacutestico y continuaron aumentando de peso de forma casi constante Al cabo de cincuenta
(50) minutos tanto viales como crioviales comenzaron a estabilizarse lentamente No se encontroacute
por tanto un tiempo admisible de cerrado para crioviales o viales que no se puedan sellar al vaciacuteo
Figura 16 Contenido de agua absorbida () en funcioacuten del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector La ecuacioacuten presentada pertenece a la liacutenea de tendencia logariacutetmica
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinacioacuten Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba
0 10 20 30 40 50 60
vial (518055g) 0 00724 00772 00782 00840 00869 00849
Criovial (19018g) 0 00079 00158 00315 00473 00578 00605
Promedio 0 00401 00465 00549 00656 00724 00727
y = 00365ln(x) + 00058
Rsup2 = 09647
0
001
002
003
004
005
006
007
008
009
01
AU
MEN
TO D
E P
ESO
(W
)
47
562 Prueba de estabilidad acelerada
Teniendo como punto de partida un numero de 3 x108 UFCml antes de la liofilizacioacuten al
rehidratar el vial 1 se obtuvo una BSR de 8398 sin embargo al rehidratar el vial 2 luego de su
estadiacutea en la caacutemara de envejecimiento la BSR fue de 0 Las propiedades fiacutesicas generales de
estos viales son presentadas en la Tabla 15
57 PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIOacuteN
571 Base de datos
Se eliminoacute una tabla sobrante (constituiacutea informacioacuten redundante de las cepas) dentro de la
base de datos correspondiente a la seccioacuten de criopreservacioacuten Adicionalmente se reorganizoacute la
base de datos al introducir la seccioacuten de liofilizacioacuten y la de refrigeracioacuten Este uacuteltimo meacutetodo de
preservacioacuten fue mencionado en el trabajo de Martiacutenez amp Mayorga (2013) pero no fue anexado
sin embargo aunque se incluyoacute la seccioacuten en el banco de cepas debe mencionarse que no existen
registros de las cepas que se hallan conservado por este meacutetodo aun asiacute se decidioacute dejar la seccioacuten
para que lo ocupen trabajos posteriores Ademaacutes se encontroacute que en el Freezer existiacutean colecciones
que no figuran en la base de datos no existen registros de ninguacuten tipo ni caracterizacioacuten alguna en
medios digitales La base de datos quedoacute organizada como lo muestra la Figura 17 y el anexo 5
Figura 17 Organigrama de la base de datos
572 Fichas de resumen
Las fichas de acceso inmediato designadas como ldquofichas de resumenrdquo para cada coleccioacuten
fueron ubicadas seguacuten el sitio de almacenamiento tanto para las cepas criopreservadas como para
las liofilizadas y refrigeradas Dado que no existen datos de las cepas refrigeradas las fichas
resumen de este meacutetodo fueron dejadas en blanco para futuras colecciones El formato de las fichas
resumen se presenta en el anexo 6
573 Revisioacuten de etiquetas y logiacutestica del banco de cepas en el Freezer
Se encontroacute que las cepas del cepario madre en el Freezer presentan una rotulacioacuten que
permite la faacutecil confusioacuten entre colecciones criopreservadas sin embargo se decidioacute dejar las
etiquetas de los crioviales en el Freezer tal y como los crearon Martiacutenez amp Mayorga (2013) entre
otras cosas porque no es posible colocar nuevas etiquetas a los crioviales ya congelados (sin tener
que descongelarlos) y por ende cambiar a un nuevo formato supondriacutea una confusioacuten entre nuevas
y viejas colecciones Este problema fue solucionado con la reorganizacioacuten de la base de datos y las
fichas de resumen
Base de datos del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Informacioacuten de los
microorganismos de
cada coleccioacuten
Meacutetodo de conservacioacuten de cepas
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten
Liofilizacioacuten
48
574 Formatos de control del banco de liofilizados
Se decidioacute que los formatos de control para la seccioacuten de liofilizacioacuten del Banco Geneacutetico
fueran similares tanto para la criopreservacioacuten como para la liofilizacioacuten obedeciendo sus
diferencias a las caracteriacutesticas y datos propios de cada meacutetodo Se encontroacute que los formatos de
la seccioacuten criopreservacioacuten no habiacutean sido llenados nunca desde su creacioacuten Estos se muestran en
el anexo 7
575 Manual de procedimientos de conservacioacuten
Se editoacute la cartilla correspondiente al manual de procedimientos creado por Martiacutenez amp
Mayorga (2013) Partiendo de esta cartilla se elaboroacute un manual maacutes completo (anexo 8)
introduciendo todos los procedimientos para la liofilizacioacuten las diferentes teacutecnicas empleadas en
los procesos de criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se complementoacute tambieacuten la seccioacuten sobre el
proceso de refrigeracioacuten y se reescribieron algunos conceptos erroacuteneos de la edicioacuten anterior No
se hicieron cambios procedimentales ni de contenido concernientes a la criopreservacioacuten pero si
se realizaron pequentildeos ajustes de forma o de edicioacuten
49
6 ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
La recuperacioacuten de microrganismos por criopreservacioacuten se realizoacute de acuerdo a los
lineamientos establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013) durante todas sus etapas sin embargo
la perdida de la cepa CM-CR005 deja ver una posible falla en el proceso antes o durante la
criopreservacioacuten de la cepa o inclusive en la etapa de descongelacioacuten Garciacutea y Uruburuacute (citados
por Aacutengel A 2006) mencionan cuatro factores principales relacionados a la variabilidad y
estabilidad de los organismos conservados edad celular velocidad de congelacioacuten y
descongelacioacuten temperatura de almacenamiento y los agentes crioprotectores Dado que las cepas
CM-CR004 006 007 010 e incluso la 009 (que remplazoacute a CM-CR005) presentaron muy buenos
niveles de recuperacioacuten (Figura 8) el factor maacutes probable de falla corresponde al crioprotector
utilizado ya que en el caso del Banco Geneacutetico el crioprotector es general para toda la coleccioacuten
de bacterias y la eleccioacuten del crioprotector depende del tipo de organismos a conservar (Angel A
2006) puesto que la efectividad de la criopreservacioacuten se puede ver afectada por las caracteriacutesticas
propias de cada cepa (Hubaacutelek 2003) las cuales condicionan la funcionalidad del crioprotector
Aunque el tiempo en almacenamiento se ha descrito como otro factor condicionante en la
viabilidad los organismos conservados por este meacutetodo sobreviven largos periacuteodos por la
reduccioacuten marcada de su ritmo metaboacutelico incluso por maacutes de 30 antildeos (Gonzaacuteles et al 2006) lo
cual apoya los datos de viabilidad (Tabla 7 y Figura 8) y a su vez respalda la idea del crioprotector
como elemento de falla en la conservacioacuten de la cepa perdida
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una uacutenica
liacutenea celular por tanto las caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificacioacuten preliminar Sin embargo estos mismos autores
sentildealan que estas caracteriacutesticas no son uacutenicas ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares como sucedioacute con CM-CR007 y 010 por ello fue preciso observar las caracteriacutesticas
morfoloacutegicas microscoacutepicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquiacutemicas) de las cepas pero dada la simplicidad de las descripciones microscoacutepicas de
Rodriacuteguez (2013) no se tuvo como principal referencia de identidad Aunque la morfologiacutea de la
colonia depende considerablemente de la composicioacuten del medio de cultivo y las condiciones de
incubacioacuten cuando eacutestas son controladas suelen ser invariables teniendo por lo general un valor
diferencial considerable (Diacuteaz 2009) por lo tanto se tomaron estas caracteriacutesticas como las
principales para la evaluacioacuten de los indicadores de estabilidad morfoloacutegica y pureza
Loacutepez T amp Torres (2006) indican que ldquolos medios soacutelidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamientordquo (paacuteg 2) Sin embargo se observaron
algunas variaciones las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio Esto se
observoacute maacutes en las cepas CM-CR007 y 010 que al revisar los datos de Martiacutenez amp Mayorga (2013)
y Rodriacuteguez (2013) estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio huacutemedo
tendiacutean a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican Loacutepez T amp Torres (2006)
en bacterias moacuteviles en tanto que sin niveles altos de humedad las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en funcioacuten del tiempo (envejecimiento de la colonia) Esto derivoacute en la
observacioacuten y descripcioacuten de caracteriacutesticas macroscoacutepicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad como son descritas en las Tablas 8 9 10 11 y 12 para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) diacuteas que duroacute la prueba de estabilidad
natural se observoacute que en general de los tres lioprotectores los resultados maacutes bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones Esto tiene su explicacioacuten en las propiedades reductoras
que poseen los monosacaacuteridos ya que como lo menciona Cox C S (citado por Hensel 1994) los
efectos letales de la desecacioacuten se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteiacutenas
de la membrana celular y azuacutecares reductores que aumentan conforme avanza la deshidratacioacuten
(glicacioacuten) si las proteiacutenas de membrana integrales o citosoacutelicas se ven dantildeadas de forma
irreversible durante el secado tendriacutea un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al 1995)
impidiendo la reconstitucioacuten de forma adecuada de las bacterias y por ende generando muerte
celular Sin embargo las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta especialmente en la concentracioacuten maacutes baja incluso para CM-CR007 la glucosa al 10 se
erige como el segundo mejor protector Es probable que estas dos cepas presenten una
configuracioacuten diferente de sus proteiacutenas de membrana que impida la reaccioacuten amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra que proteja a las proteiacutenas de membrana o
citosoacutelicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteiacutenas)
Es conocido que en general los disacaacuteridos mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan Herman White amp Vesey
2006) esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13
A diferencia de la glucosa la sacarosa es un azuacutecar no reductor estos pueden proteger las
ceacutelulas al competir por la unioacuten en la membrana con los azucares reductores (Hensel 1994) Se ha
demostrado que la sacarosa mantiene las proteiacutenas secas igual que en sus conformaciones
hidratadas Leslie et al (1995) indican que este fenoacutemeno sucede probablemente ldquomediante la
unioacuten a los dominios hidroacutefilos de las proteiacutenas y la prevencioacuten de enlaces de hidroacutegeno inter e
intra proteiacutenas durante el secado y la reconstitucioacutenrdquo (paacuteg 3596) lo cual contribuye a las altas tasas
de supervivencia al usar este lioprotector
Para que un protector funcione eacuteste debe proteger la bicapa lipiacutedica y para ello debe existir
dentro y fuera de las ceacutelulas (Leslie et al 1995 Palmfeldt et al 2003) el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transicioacuten de
membrana ya que en eacutesta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentracioacuten (Leslie et al 1995) reemplazando el agua intracelular lo cual se conoce como la
hipoacutetesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al 2003) Si esto se cumple la concentracioacuten
intracelular seraacute alta y el tiempo antes de la congelacioacuten y el secado debe ser corto por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequentildeo (Leslie et al 1995) y los productos polares
extracelulares seraacuten miacutenimos
Ademaacutes tanto la glucosa y la sacarosa estaacuten dentro de la categoriacutea de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo este estado viacutetreo ldquoInduce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una ceacutelula para detener la movilidad
molecular a un miacutenimo El vidrio amorfo inerte tambieacuten es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las ceacutelulas dentro de la estructura de vidrio antes de la congelacioacuten lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquiacutemicos irreversibles en la
membrana plasmaacutetica durante el almacenamientordquo (Morgan et al 2006 paacuteg 186)
51
La retencioacuten de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilizacioacuten
como en la criopreservacioacuten
Cabe mencionar que el proceso de deshidratacioacuten y de reemplazo de agua intracelular por
parte de las bacterias comienza en la fase de congelamiento y tiene un liacutemite ya que como lo
menciona Heckly (citado por Perry 1995) al congelarse el agua del medio las ceacutelulas sufren
deshidratacioacuten reduciendo el punto de congelacioacuten en el interior y evitando la formacioacuten de
cristales de hielo pero al seguir bajando la temperatura las concentraciones de solutos aumentan
Perry (1995) cree que los efectos perjudiciales en la fase de congelacioacuten estaacuten posiblemente
asociados a estas soluciones excesivamente concentradas puesto que no se han encontrado
evidencias de lesiones mecaacutenicas por hielo extracelular Esto corresponderiacutea con los resultados
obtenidos en concentraciones muy altas de lioprotectores como lo fue la glucosa al 27 en casi
todas las cepas (exceptuando CM-CR006 Figura 10) recordando que un protector funciona mejor
en concentraciones que posibiliten un equilibrio osmoacutetico con el interior de las bacterias (conocer
la concentracioacuten intracelular normal del protector en este sentido es importante) y la no utilizacioacuten
por parte de eacuteste como fuente importante (de carbono) en su metabolismo como se muestra en el
trabajo de Palmfeldt et al (2003)
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta un ejemplo claro es la cepa CM-CR004 la cual de hecho ante los
gluacutecidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentoacute resultados aceptables Morgan et al
(2006) mencionan (teniendo como referencia la investigacioacuten de Buitink et al) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteiacutenas presentes en esta sustancia son
maacutes estables y juegan un importante papel en la formacioacuten del estado viacutetreo lo cual induce a pensar
que una oacuteptima mezcla de proteiacutenas y azucares permite una proteccioacuten maacutes eficiente Esta
posibilidad corresponderiacutea a los resultados obtenidos donde la concentracioacuten de los componentes
de la leche descremada seriacutean propicios para la cepa CM-CR004 en tanto que para las demaacutes cepas
seriacutean maacutes bajas o maacutes altas de lo propicio Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de gluacutecidos y proteiacutenas que la componen pero no
establece cuales son estos pudiendo ser positivos o negativos para la liofilizacioacuten
En general los cultivos liacutequidos ofrecen un mayor nuacutemero de ceacutelulas viables (Ops
Diagnostics 2015) sin embargo la viabilidad depende muacuteltiples factores incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos El medio SMPG estaacute disentildeado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse raacutepidamente la fuente de carbono (glucosa) una bacteria
de raacutepido crecimiento entraraacute en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio una
de lento crecimiento al cabo del mismo tiempo estaraacute en fase log no obstante en el medio SPC
los nutrientes tardan maacutes tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas todas las bacterias
estaraacuten en fase log Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de raacutepido crecimiento mientras que
CM-CR004 006 y 009 son de crecimiento un poco maacutes lento (datos obtenidos del conteo con
caacutemara de Neubauer no incluidos en el presente estudio)
Morgan et al 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisioloacutegicos
en las bacterias relacionado generalmente con la privacioacuten de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles desencadenando una respuesta ante el estreacutes para permitir la
supervivencia de la poblacioacuten celular Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecacioacuten y las temperaturas menos propicias para su crecimiento por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilizacioacuten Sin embargo la
fase de crecimiento oacuteptima para la supervivencia en la desecacioacuten es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al 2006 paacuteg 185) Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14 indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
liacutequido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log asiacute mismo las cepas CM-CR004 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria pudiendo ser mayor o menor
En liofilizados de la fase intermedia 1 (Tabla 15) y liofilizacioacuten definitiva se observoacute puffing
y pitting y si bien Vemulapalli et al (2015) indican que estos cambios no afectan la calidad del
producto ni del producto en condiciones de estabilidad acelerada Jennings (2008) advierte que su
presencia no infunde el mismo grado de confianza que una matriz bien formada y que esta puede
deberse a un sistema con composicioacuten diferente de la formulacioacuten principal y podriacutea conducir a
interacciones tales como la agregacioacuten de proteiacutenas ademaacutes se observoacute (Figura 15 izquierda y
centro) un aumento de volumen indeterminado respecto a la formulacioacuten inicial de glucosa y
sacarosa en todas sus concentraciones (Tabla 15 y 16) ldquodebido a una accioacuten combinada de la fusioacuten
(maacutes o menos importante) y de la presioacuten reducida dando lugar al puffingrdquo (Ticoacute G 1987 paacuteg
70) esto indica un proceso de meltback parcial o total (Jennings 2008) seguacuten la cantidad del
material afectado por el puffing Esta caracteriacutestica se asocia con un error en los paraacutemetros de
liofilizacioacuten por ello se revisoacute exhaustivamente el proceso de liofilizacioacuten encontrando que los
liofilizados alcanzaron la temperatura de fusioacuten durante el proceso de secado primario por la
inexistencia de un incorrecto pre-enfriamiento del liofilizador el cual no habiacutea sido descrito en el
proceso piloto de liofilizacioacuten con el cual contaba el laboratorio y el cual fue seguido antes del
control de calidad A causa de esto los liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada son los
uacutenicos que cuentan con la estructura de torta recomendada (Figura 15 derecha)
Las soluciones de sacarosa y glucosa alcanzan una temperatura de hundimiento de estructura
a los -32 y -42 degC asiacute como un melting inicial a -32degC y -42degC respectivamente seguacuten lo reporta
Moreira Gutieacuterrez amp Delgado (1994) Esto contribuye a la idea del fallo en el pre-enfriamiento
del liofilizador
Las Tablas 15 y 16 que resumen las caracteriacutesticas tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados muestran que el color textura brillo y fractura de viales estaacuten dentro de los
paraacutemetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilizacioacuten correcta
con las formulaciones utilizadas no obstante se detectaron variaciones posliofilizacioacuten
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales Inicialmente se pensoacute
en una falla durante el tiempo de almacenamiento dado que los liofilizados maacutes afectados fueron
de las series B y C sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada se determinoacute que la causa de fallo yaciacutea en la
obtencioacuten de humedad por parte del producto liofilizado La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vaciacuteo absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vaciacuteo estos habiacutean absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilizacioacuten esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscoacutepica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad maacutes bajo que la sacarosa) debido a la
53
ldquofacilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidroacutegeno con el aguardquo (Badui
Dergal 2006 paacuteg 73) ldquoPara reducir el nuacutemero de moleacuteculas de agua el proceso de liofilizacioacuten y
el sellado de los viales al vaciacuteo debe haber sido exitoso y asiacute obtener un producto con el contenido
de humedad deseadordquo (Grauer et al 2015 paacuteg 78) por lo cual se descarta la utilizacioacuten del
instrumento manifold para la liofilizacioacuten cepas en el Banco Geneacutetico
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilizacioacuten siempre deben ser
de vidrio ya que el vapor de agua atmosfeacuterico se puede difundir a traveacutes de los tubos de plaacutestico y
por ende las muestras secas terminariacutean absorbiendo agua Esto se comproboacute con la utilizacioacuten de
crioviales que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vaciacuteo sino que ademaacutes en
la serie C casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dantildeados presentaban
cambios de coloracioacuten (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloracioacuten
oscura como lo muestra la Tabla 15) o una marcada reduccioacuten en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentracioacuten) Esto tambieacuten se ve correlacionado con la peacuterdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008) la
humedad es la principal responsable en la peacuterdida de viabilidad en el producto liofilizado
reduciendo la vida uacutetil de los organismos La obtencioacuten de agua implica un retroceso del proceso
de liofilizacioacuten el dantildeo de la matriz formada el flujo de los residuos extracelulares polares es
decir la reactivacioacuten del organismo ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquiacutemica el metabolismo (Adams 2007) finalmente la muerte celular al agotarse esta
El tiempo de redisolucioacuten y el tipo de reconstituyente tambieacuten es de gran importancia La
Tabla 17 muestra tiempos de redisolucioacuten bastante altos para las formulaciones de glucosa Con
los datos de la Tabla 17 en conjunto con una revisioacuten del proceso de liofilizacioacuten se determinoacute la
retrofusioacuten producida en el secado primario como la causa del aumento en el tiempo de
redisolucioacuten causando un efecto grave donde la interaccioacuten entre las moleacuteculas es tal que la matriz
del liofilizado es casi insoluble (Jennings 2008) El aumento de la temperatura demasiado raacutepido
en el proceso de la liofilizacioacuten o por encima de Tg resultoacute en el colapso haciendo la
reconstitucioacuten mucho maacutes difiacutecil (Fetterolf 2010) Jennings (2008) indica que un aumento en el
aacuterea superficial por unidad de volumen de la torta tenderaacute a disminuir el tiempo de reconstitucioacuten
lo cual sucedioacute para todos los liofilizados que presentaron melting puffing y pitting ya que su
volumen (aunque indeterminado) fue superior al volumen de la formulacioacuten congelada solo los
liofilizados de la prueba de estabilidad acelerada conservaron el volumen de la formulacioacuten
congelada y son los que muestran un menor tiempo de reconstitucioacuten
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed amp Roos (2004) quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo se sugiere en muacuteltiples estudios
ademaacutes el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4degC plusmn 1degC en la
oscuridad (Ops Diagnostics 2015)
Se siguioacute los procedimientos de documentacioacuten establecidos por Martiacutenez amp Mayorga (2013)
para la criopreservacioacuten y la elaboracioacuten de los nuevos protocolos de liofilizacioacuten encontrando
como lo menciona Gonzaacuteles et al (2006) que es necesario contar con sistemas de documentacioacuten
eficiente ademaacutes contar con duplicados de la informacioacuten en medios fiacutesicos y magneacuteticos evitado
la perdida de informacioacuten (Montes de Oca et al 2008) y el raacutepido acceso a la misma
54
7 CONCLUSIONES
En general el estado de criopreservacioacuten de las cepas evaluadas es oacuteptimo obteniendo tasas
de supervivencia satisfactorias Sin embargo el criopreservante no funciona de igual forma para
todas las cepas debido a las caracteriacutesticas propias de cada organismo que limitan la accioacuten del
glicerol
De acuerdo a la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten realizada con los tres indicadores
(viabilidad pureza y estabilidad morfoloacutegica) la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados siendo la concentracioacuten al 10pv la maacutes oacuteptima No obstante su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado hermeacuteticamente y al vaciacuteo El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada aunque no se determinoacute la concentracioacuten maacutes oacuteptima
En cuanto a la glucosa al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo se observa
que pese a no ser un buen lioprotector concentraciones de glucosa entre el 6 y el 10 pv son
funcionales aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50
No es necesario ajustar los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacioacuten estos
fueron seguidos y demostraron ser suficientes para evitar la contaminacioacuten de las muestras y a su
vez evitar la contaminacioacuten por parte de los microorganismos a los operadores en el proceso
Se creoacute el protocolo para el proceso de liofilizacioacuten en todas sus etapas Este es
metodoloacutegicamente funcional y faacutecilmente reproducible por ello se estandariza para el Banco
Geneacutetico seccioacuten liofilizacioacuten dentro del nuevo manual de procedimientos de conservacioacuten Se
incluyen variaciones en los protocolos de seguridad respecto a la criopreservacioacuten dentro de este
manual ajustado a las necesidades especiacuteficas de seguridad de la liofilizacioacuten
Es importante mantener actualizado los diferentes medios fiacutesicos y magneacuteticos donde reposa
la informacioacuten de las colecciones y los microorganismos en ellos dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Geneacutetico y la informacioacuten se puede perder
La falta de la identificacioacuten hasta cepa (al menos hasta geacutenero) de los microorganismos
presentes en el banco geneacutetico limita la informacioacuten para entender los fenoacutemenos relacionados a
los procesos de conservacioacuten y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo
55
8 RECOMENDACIONES
Existen paraacutemetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente como la edad del cultivo la
concentracioacuten celular entre otros Se propone el estudio de los paraacutemetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilizacioacuten con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos por ello se sugiere la creacioacuten
de un modelo matemaacutetico para que sea funcional esta prueba lo cual generariacutea datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo
Se sugieren trabajos para evaluar la eficacia de la combinacioacuten de lioprotectores con formadores
de matrices y estabilizantes siguiendo los protocolos establecidos Mezclas de sacarosa al 10 pv
con leche descremada 10 pv (de la misma marca usada en este estudio) sacarosa al 10 pv con
leche descremada 10 pv y carboacuten activado asiacute como la utilizacioacuten de estas mezclas con trehalosa
en distintas concentraciones son sugeridas
Es necesaria la creacioacuten de una plataforma online del banco geneacutetico una vez este cuente con la
identificacioacuten de los organismos contenidos asiacute mismo es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco geneacutetico distinto a Access preferiblemente que obedezca a una
creacioacuten propia de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Es necesaria la creacioacuten de una pasantiacutea anual para curaduriacutea del Banco Geneacutetico ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepcioacuten de cepas Ademaacutes se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas como aquellas que sean donadas al Banco Geneacutetico en el futuro
56
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62
11 ANEXOS
Anexo 1 Formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas
Cepa
Caracteriacutesticas
CM-XX00Xa
Descripcioacuten Fotografiacutea
Borde o Margen
Frente a luz Brillanteopaca
Forma
Elevacioacuten
Color
Tamantildeo
Superficie
Consistencia
Grado de
Transparencia
Pigmentacioacuten o
cromogeacutenesis
Pigmentos que desprende la colonia
y se observan sobre el medio
Olor
Hemolisis
MedioT(degC)
En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen
un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace
la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad
del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos
Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen
Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta
Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
63
Anexo 2 Esquema general del banco de liofilizados y la bandeja de liofilizados
a) Recubrimiento (De adentro hacia afuera) poliestireno expandido cartoacuten y autoadhesivo de
emulsioacuten acuosa
b) Bandeja de liofilizados
c) Soporte para bandeja
d) Cojiacuten de siacutelice gel (reemplazo seguacuten el tamantildeo y cantidad de cojines de 2 meses a 1 antildeo)
El banco de liofilizados estaacute dividido en tres secciones
La seccioacuten de bacterias (color rojo) correspondiente a las bandejas A B y C respectivamente
La seccioacuten de algas (color verde) correspondiente a las bandejas D E y F respectivamente
La seccioacuten de hongos (color cafeacute) correspondiente a las bandejas G H e I respectivamente
64
Bandeja de liofilizados
Estaacute hecha de poliestireno expandido viene con 100 compartimientos individuales para un maacuteximo
de 100 viales por bandeja
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
10 20
30 40
50 60
70
80
90 100
01
11 21
31
41
51
61 71
81
91
65
Anexo 3 Esquema general del cepario madre de liofilizados
J Hongos
K Bacterias
L Algas
F Fila
Nuacutemeros compartimento correspondiente a cada vial La numeracioacuten va en zigzag
J K L
F1 F1 F1 F2 F2 F2 F3 F3 F3
1
8 8 8
9 9 9 1 1
16 16 16 24 24 24
17 17 17
66
Anexo 4 Caacutemara de envejecimiento artesanal
Esta caacutemara de envejecimiento artesanal permite controlar las condiciones de temperatura y
humedad relativa para las pruebas de estabilidad acelerada de una muestra La humedad relativa
puede controlarse seguacuten si se use agua (100) o una concentracioacuten determinada de solucioacuten salina
ver Colmenares R (2015)
Horno de 37degC (caacutemara externa)
Caacutemara
interna
Termoacutemetro
Tapa de sello
hermeacutetico
Malla de
soporte
Viales
Agua o sn salina
67
Anexo 5 Base de datos en Access
Esquema general de la Base de datos del Banco Geneacutetico
Espacio de trabajo con las tablas
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
informacioacuten
maacutes detallada)
68
Anexo 6 Formato de las Fichas Resumen
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FICHA RESUMEN DE LA COLECCIOacuteN
Ubicacioacuten de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Fuente de obtencioacuten
de las cepas
Fecha de
ingreso
Cantidad de cepas Tipo de organismos
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Nivel de Bioseguridad de las cepas (describa)
Ubicacioacuten de cepas (seguacuten todos los meacutetodos
de conservacioacuten utilizados para la coleccioacuten)
Autores o donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos y Formatos de control
69
Anexo 7 Formatos de control de la seccioacuten liofilizacioacuten
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
Lugar (Ciudad y Paiacutes) Fecha de ingreso
Origen de
la cepa
Institucioacuten Organizacioacuten o
Empresa donante
Persona que realizoacute el
aislamiento
Cargo Fecha de
aislamiento
Informacioacuten de contacto
Fuente de obtencioacuten
de la cepa
Coacutedigo asignado a
coleccioacuten
Identificacioacuten geneacutetica
de la cepa
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Calidad de la
cepa recibida
Restriccioacuten de
distribucioacuten
Caracterizacioacuten
microscoacutepica
SI NO
Observaciones Nivel de
Bioseguridad
N1 N2 N3 N4
Persona donante Quien recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
70
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL
FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN
CM-_ _0_ _
Proceso
Fecha Hora
Ciudad Equipo
Lioprotector y
concentracioacuten
Temperatura (degC)
Presioacuten (mbar)
Duracioacuten (min) Accesorio de
secado
Responsable (s) del proceso
Ubicacioacuten
Coacutedigo de la
cepa
Nombre de
la coleccioacuten
Viales
almacenados
Tipo S T Lf Total Sello al vaciacuteo SI NO
Cantidad Sello de Aluminio SI NO
Pruebas de
Viabilidad
Caracterizacioacuten
macroscoacutepica (resumen)
Caracterizacioacuten
microscoacutepica (resumen)
Concentracioacuten celular
(UCF)
Preliofilizacioacuten
Posliofilizacioacuten
Bioquiacutemicas
Otras
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
71
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-03 REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS
CEPAS
CM-_ _0_ _
Detalles del
Proceso
Fecha Ciudad
Hora Coacutedigo de cepa
Viales a evaluar T S Lf Temperatura (degC)
Viales en mal estado T S Lf Presioacuten (Mbar)
Fecha de liofilizacioacuten Fecha de evaluacioacuten Total tiempo (meses)
Descripcioacuten
de la cepa
Geacutenero-especie del
microorganismo
Nombre de la
Coleccioacuten
Car
acte
riza
cioacuten
Microscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Microscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Preliofilizacioacuten
Macroscoacutepica
Posliofilizacioacuten
Observaciones
Viabilidad Concentracioacuten Celular
(UFC) Preliofilizacioacuten
Concentracioacuten Celular
(UFC) Posliofilizacioacuten
Observaciones
Control
de
Calidad
Bioquiacutemicas
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Pruebas
Cristal
Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Otras Pruebas Preliofilizacioacuten Posliofilizacioacuten
Observaciones
Responsable del proceso Autoriza
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
72
BANCO GENEacuteTICO DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIacuteA DE LA FACULTAD DEL MEDIO
AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD
DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
FLf-04 SOLICITUD SALIDA DE CEPAS
CM-_ _0_ _
Lugar (Ciudad Paiacutes) Fecha
Informacioacuten
del
solicitante
Institucioacuten Organizacioacuten
o Empresa
Solicitante Cargo
Teleacutefono (s) Email
Descripcioacuten
de la cepa
Coacutedigo de
cepa
Geacutenero ndash especie
Microorganismo
Coleccioacuten
Utilizacioacuten de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre
Firma
CC
Nombre
Firma
CC
Firma
CC
Nota Registro fotograacutefico y demaacutes informacioacuten en la base de datos
73
Anexo 8 Manual de procedimientos de conservacioacuten para el Banco Geneacutetico del Laboratorio
de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital
Francisco Joseacute de Caldas (Ver archivo adjunto)
Manual de procedimientos de
conservacioacuten para el Banco
Geneacutetico del Laboratorio de
Microbiologiacutea Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute
de Caldas
Primera Edicioacuten
Editado por
Andreacutes V Castantildeeda R
Manual de procedimientos de conservacioacuten para el
Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSEacute DE CALDAS
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
Ingenieriacutea Sanitaria
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
Licenciado en Biologiacutea
Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas
Decana Facultad Medio Ambiente y Recursos Naturales
Niria Pastora Bonza Peacuterez
Docente encargado del Laboratorio de Microbiologiacutea y
coordinador de Ingenieriacutea Sanitaria
Miguel Aacutengel Piragauta Aguilar
Disentildeo y diagramacioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda Rangel
avicent29gmailcom
Autoriacutea y Edicioacuten
Andreacutes Vicente Castantildeeda R
2015
Todos los derechos reservados
TABLA DE CONTENIDO
TIacuteTULO PROTOCOLOS PARA LA CONSERVACIOacuteN DE MICROORGANISMOS
RECEPCIOacuteN DE CEPAS 2
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS 3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL 4
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES 5
Medios 5
Reactivos 6
Protectores generales 6
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN 7
Indicador uno Viabilidad 7
Conteo directo con caacutemara de neubauer (110mm) 7
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa 10
Indicador dos Estabilidad morfoloacutegica 12
Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas) 12
Tincioacuten de gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) 13
Indicador tres Pureza de la cepa 13
RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS 14
Criopreservados (descongelamiento) 14
Liofilizados (rehidratacioacuten o reconstitucioacuten) 14
REFRIGERACIOacuteN 15
CRIOPRESERVACIOacuteN 16
Precriopreservacioacuten 16
Preparacioacuten del inoculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten 16
LIOFILIZACIOacuteN 17
Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano 17
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten 17
IV
Desde medio soacutelido 17
Desde medio liacutequido 17
Posliofilizacioacuten 18
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos 18
ROacuteTULOS 19
Refrigeracioacuten 19
Criopreservacioacuten 19
Liofilizacioacuten 20
TIacuteTULO 2 PROTOCOLOS DE SEGURIDAD EN LOS PROCEDIMIENTOS DE
CONSERVACIOacuteN Y EN EL LABORATORIO
CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN 23
Medios 23
Ambiente 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores 23
Cabina de flujo laminar 23
Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos 24
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS 24
Desechos no contaminados (no infecciosos) 24
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en
autoclave y reutilizado 24
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado 25
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa 25
BIOSEGURIDAD 26
Proteccioacuten personal 26
Procedimientos 27
Aacutereas de trabajo 27
Capacitaciones 27
REFERENCIAS 28
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dilucioacuten en serie 7 Figura 2 Conteo directo 8 Figura 3 Conteo en bacterias 8 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky 10 Figura 5 Contador de colonias 11 Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados 19 Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer 19 Figura 8 Roacutetulos para los crioviales 19 Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso 4 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG 5 Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos 5 Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos 6 Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer 9 Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS 21
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIacuteMBOLOS USADOS EN ESTE MANUAL
kPa Kilo pascales
min Minutos
s Segundos
microl microlitros
mm miliacutemetros
degC grados Celsius
pv porcentaje peso a volumen
mTorr militorricelli
mbar milibar
g gramos
ml mililitros
UCF Unidades formadoras de colonias
rpm Revoluciones por minuto
vv Porcentaje volumen a volumen
iexclPrecaucioacuten
iexclA tener en cuenta
VI
INTRODUCCIOacuteN
Este manual representa en conjunto el trabajo a traveacutes del tiempo de distintos investigadores que con sus proyectos de investigacioacuten han sentado los pilares para la formacioacuten del Banco Geneacutetico del Laboratorio de Microbiologiacutea Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas (CM-UDFJC ) cuyo objetivo consiste en generar un espacio dedicado a la conservacioacuten y suministro asequible de microorganismos para docencia e investigacioacuten que permita a la comunidad acadeacutemica de la Universidad Distrital Francisco Joseacute de Caldas fortalecer y generar mayores aportes en conocimientos microbioloacutegicos en las aacutereas de biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnoloacutegica para el paiacutes Aquiacute se presentan los tres meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos aplicados en este Banco Geneacutetico Refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten Se hace eacutenfasis en los diferentes procesos materiales equipos y registros a utilizar para el adecuado funcionamiento del Banco Geneacutetico
Protocolos para la
conservacioacuten de
microorganismos
2
RECEPCIOacuteN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco geneacutetico debe contar con las siguientes condiciones miacutenimas de recepcioacuten
La cepa se debe encontrar en estado de pureza Debe corresponder a los lineamientos principales del Banco Geneacutetico
biorremediacioacuten biodegradacioacuten y biotecnologiacutea Debe contar con un responsable entidad o institucioacuten donante que respalde
la(s) cepa(s) entregadas ademaacutes de contar con la informacioacuten de contacto en caso de presentarse alguna eventualidad
La cepa o coleccioacuten debe contar con toda la informacioacuten que el Banco
geneacutetico requiera para su mantenimiento conservacioacuten y registro en la base de datos
La cepa o coleccioacuten debe estar categorizada dentro de alguno de las niveles
de Bioseguridad establecidos por la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) siendo el nivel de bioseguridad 2 el maacuteximo permitido por las instalaciones del laboratorio con el fin de brindar seguridad y control de cepas que representen un alto riesgo
Para ingreso de cepas a nivel interno de la universidad (trabajos de grado
investigaciones entre otras) se debe pasar con 15 diacuteas de anterioridad el formato LM-01 y FLf-01 correspondiente al REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS al docente encargado
Una vez recibida la cepa se diligencian los mismos registros en digital se
anexa la informacioacuten a la base de datos asignaacutendole un coacutedigo y se diligencian las fichas de resumen
3
VERIFICACIOacuteN DE CEPAS El personal encargado del Banco Geneacutetico debe realizar una verificacioacuten de la
pureza de la cepa esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del cultivo de entrada sobre una o maacutes cajas de Petri con el medio de cultivo el tiempo y temperatura de incubacioacuten especificados por quien hace la donacioacuten Asiacute mismo a partir de este subcultivo se debe realizar la evaluacioacuten de la efica-cia del meacutetodo de conservacioacuten para verificar la informacioacuten dada por el investi-gador donante
Posterior al proceso de recepcioacuten de cepas es importante tener en cuenta
que se debe verificar la fecha de la uacuteltima siembra para determinar si es apro-piado hacer una resiembra del cultivo inicial y proceder despueacutes al proceso de criopreservacioacuten o liofilizacioacuten
Si se llegara a presentar alguna eventualidad donde se requiera mantener las
cepas por maacutes de dos meses antes de la criopreservacioacuten o la liofilizacioacuten se debe hacer una resiembra de la cepa cada mes conservaacutendola por el meacutetodo de refrigeracioacuten con el fin de evitar que la cepa se pierda
Si se requieren hacer pruebas bioquiacutemicas pruebas cristal u otras pruebas
complejas que requieren gran cantidad de material para verificar la autenticidad de los datos se tendraacute que pedir la autorizacioacuten del responsable del Banco Ge-neacutetico y del encargado del laboratorio debido a que estas pruebas deben estar sujetas a la disposicioacuten de material en el laboratorio
Nota Si alguna cepa llegara a presentar contaminacioacuten se debe informar a la persona responsable del Banco Geneacutetico y posteriormente a la persona entidad o institucioacuten donante
4
EQUIPOS E INSTRUMENTAL Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservacioacuten
Tabla 1 Equipos y material a usar seguacuten proceso
Proceso o meacutetodo Equipo Material
Refrigeracioacuten Nevera Thermolab 14-E0107 Tubo de ensayo tapa rosca
Cabina de flujo laminar Asa redonda
Esterilizador de asas
Criopreservacioacuten
Cabina de flujo laminar Crioviales Voacutertex Puntas azules Micropipeta graduable de 100-1000 microl
Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Freezer Premium U570 con caja y gradilla para la coleccioacuten
Frascos Schott con tapa para el glicerol
Pipeteador Pipeta de 1ml o 5ml
Liofilizacioacuten
Esterilizador de asas Asa redonda
Voacutertex Tubo de ensayo boca ancha o vial de 9mm
Cabina de flujo laminar Puntas azules y amarillas Liofilizador ModulyoD con accesorio Try Stile
Recipiente de poliestireno expandido cerrado
Crimper Sello de aluminio Micropipetas graduables de 100-1000microl y 20-200microl
Pinzas Vial 5mm con tapoacuten de divisioacuten
Evaluacioacuten del
meacutetodo de
conservacioacuten
Caacutemara de Neubauer 110mm Laminilla de cuarzo
Caacutemara AxioCam ICc5 Laminas porta objetos
Microscopio Axio Scope A1 Laminillas cubre objetos
Contador de colonias CC-1 Marcador
Estereoscopio Zeiss Asa redonda
Incubadora de 25degy 37degC Asa de Drigalsky
Micropipeta graduable 100-1000microl 20-200microl y 5-20microl
Puntas azules amarillas y blancas
Voacutertex Goteros
Recuperacioacuten de
los
microorganismos
Micropipeta graduable 100-1000microl y 20-200microl
Puntas azules y amarillas
Tubos de ensayo
Cabina de flujo laminar Cajas de Petri con medio
Plancha de calentamiento Mechero
Demaacutes equipos y materiales utilizados en la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten
Beaker
Termoacutemetro
Cajas de Petri con medio
Tubos de ensayo
-Se deben seguir los protocolos de manejo de equipos establecidos por el laboratorio de microbiologiacutea
5
MEDIOS REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Geneacutetico cuenta con medios reactivos y protectores generales definidos para los meacutetodos de preservacioacuten manutencioacuten y recuperacioacuten de microrganismos Estos se describen a continuacioacuten y se clasifican de acuerdo al meacutetodo de conservacioacuten en la Tabla 4
Medios CALDO SMPG Este medio es empleado para el crecimiento del inoacuteculo inicial y
en la formulacioacuten de la criopreservacioacuten Su composicioacuten se muestra en las Tablas 2 y 3 Tabla 2 Composicioacuten medio SMPG
Tabla 3 Compuestos de macroelementos y microelementos
SPC (Standard Plate Count) Este medio se utiliza para la teacutecnica de evaluacioacuten
de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Tambieacuten puede ser utilizado para el mantenimiento de las cepas
Agar nutritivo (AN) o medios especiacuteficos Utilizados como medio de
mantenimiento o para pruebas bioquiacutemicas yo fisicoquiacutemicas (si se realizan) en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Buffer agua peptonada Este medio se utiliza en la rehidratacioacuten y en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 76
Microelementos 076
Peptona 1
Glucosa 01
MACROELEMENTOS Cantidad MICROELEMENTOS Cantidad
MgSO4 2 g CuSO4- 5H2O 005 g
NaNO3 2 g H3BO3 01 g
KCl 015 g MnSO4 ndash H2O 01 g
CaCl2 21 g ZnSO4 ndash 7H2O 01 g
Na2HPO4 09 g Agua destilada 1000 ml
FeSO47H2O 001 g
Agua destilada 1000 ml
6
Reactivos Tincioacuten Gram La bateriacutea de reactivos para la Tincioacuten de Gram se utiliza en la
evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten Alcohol acetona Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo Agua destilada Se utiliza en todos los procedimientos para la preparacioacuten de
medios la descongelacioacuten y especialmente en la evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten
Alcohol Para desinfeccioacuten en todos los procedimientos (70) o para mecheros (95)
Aceite de inmersioacuten Se utiliza para la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten durante las observaciones microscoacutepicas
Nitroacutegeno Liacutequido Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilizacioacuten
Protectores generales Crioprotector Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservacioacuten en
proporcioacuten 67vv respecto al criovial Lioprotector Se utiliza una solucioacuten de Sacarosa 10 pv para las
formulaciones en la liofilizacioacuten bacteriana En hongos se utiliza leche descremada al 12 pv No se tiene detalles de lioprotector oacuteptimo en algas
Tabla 4 Reactivos medios y protectores usados en los diferentes meacutetodos de conservacioacuten de microorganismos
Nota Dado que en la refrigeracioacuten criopreservacioacuten y liofilizacioacuten se realiza la evaluacioacuten del meacutetodo de conservacioacuten se incluyen aquiacute los reactivos implicados en dicha evaluacioacuten
Refrigeracioacuten Criopreservacioacuten Liofilizacioacuten R
eacti
vos
Tincioacuten Gram SI SI SI
Alcohol acetona SI SI SI
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de inmersioacuten
SI SI SI
Nitroacutegeno Liacutequido NO NO SI
Me
dio
s
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios especiacuteficos
OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
Agua peptonada SI SI SI
Pro
tecto
r
Glicerol anhidro NO SI NO
Sacarosa 10pv
NO
NO SI
7
EVALUACIOacuteN DE LA EFICACIA DEL MEacuteTODO DE CONSERVACIOacuteN
Indicador uno Viabilidad Conteo directo con caacutemara de Neubauer (110mm)
Se parte de un tubo de dilucioacuten (Figura 1) cuando la carga microbiana del cultivo inicial es muy alto el cual tiene por lo general un tiempo de incubacioacuten de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo Figura 1 Dilucioacuten en serie Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser esteacuteriles usando una nueva en cada transferencia El diluyente es agua peptonada al 01 pv
Tome la caacutemara y fije sobre esta la laminilla de cuarzo perfectamente limpia
Observe las dos cuadriculas de la caacutemara que se encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H)
Agite el tubo de dilucioacuten seleccionado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s tomando con una micropipeta una aliacutecuota de 10microl y depositaacutendola suavemente (en vertical) al borde de la laminilla dejando que se cargue por capilaridad de forma homogeacutenea (Figura 2-A) Posteriormente lleve al microscopio enfocando desde el menor aumento hasta eacutel objetivo 40x al tiempo que ajusta la intensidad lumiacutenica para poder observar las liacuteneas de la caacutemara y las ceacutelulas al tiempo
-Algunos modelos de Voacutertex no poseen un rango de velocidad sino de niveles -Para limpiar la caacutemara de Neubauer y la laminilla de cuarzo lave primero con agua destilada luego alcohol acetona por 15s y nuevamente con agua destilada Deje secar al ambiente -Para una correcta observacioacuten al microscopio utilice el meacutetodo de enfoque de Koumlhler -Procure no limpiar la laminilla con ninguacuten papel o pantildeo lo puede rayar -Este procedimiento debe durar maacuteximo 10min ya que la solucioacuten podriacutea secarse debido a la luz del microscopio
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Figura 2 Conteo directo A Utilizacioacuten de la caacutemara de Neubauer 1 posicioacuten de la laminilla 2 posicioacuten de la punta para el deposito de la muestra B esquema general de la caacutemara de Neubauer Adaptado de Bastidas (2015) httpwwwceleromicscomesresourcesdocsArticlesFormula-Camara-Neubauer-Concentracionpdf amp Universitat de Barcelona (2015) httpwwwubeduLabFisioimagesstoriesFisAnimalBiologiaSangrecontadorTomapng
El conteo de los microorganismos se realiza en cuadros esquineros y el central Las foacutermulas y los cuadros a contar se determinan seguacuten el tamantildeo del microorganismo
Hongos y microalgas Se cuentan las esporas en los 5 recuadros grandes
(cuadros 1 y cuadro central Figura 2-B) de izquierda a derecha Bacterias Cuente en el cuadro central que contiene 25 cuadros secundarios
(Figura 2-B) 5 de ellos (Figura 3-A o B) Los cuadros secundarios contienen a su vez 16 cuadros terciarios en estos las ceacutelulas deben contarse en la direccioacuten que se indica en la Figura 3-C Los cuadros terciarios contienen tres liacuteneas en los extremos por ello se deben tener en cuenta las ceacutelulas que esteacuten desde la liacutenea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral izquierdo como se indica en la Figura 3-D
Figura 3 Conteo en bacterias A y B Forma de contar los cuadros terciarios C Direccioacuten de conteo en los cuadros terciarios D Ceacutelulas a tener en cuenta durante el conteo en los cuadros terciarios
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Es importante resaltar que las bacterias que esteacuten unidas se contaraacuten como una Una vez obtenido el nuacutemero total de ceacutelulas se realizaran los caacutelculos correspondientes a los cuadros utilizados Para obtener el nuacutemero de bacterias se utiliza la ecuacioacuten planteada a partir de Bastidas (2015) Ndeg de bacteriasml=
En el caso de hongos y microalgas se utiliza la siguiente ecuacioacuten a partir de Bastidas (2015) Ndeg de ceacutelulasml= Fd Factor de dilucioacuten = Nota El meacutetodo de conteo en caacutemara de Neubauer anteriormente expuesto ha sido estandarizado para el conteo directo de ceacutelulas en los procedimientos de conservacioacuten de microorganismos Pero si se requiere la utilizacioacuten de otro meacutetodo se puede emplear siempre y cuando se garantice confiabilidad de los resultados
Consideremos el siguiente ejemplo Tenemos un tubo con cultivo en medio liacutequido (10ml) de 36 horas este seraacute
nuestra muestra inicial Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo por lo cual se hacen diluciones seriadas hasta 10-8 con aliacutecuotas de 1ml en 9ml de diluyente Se realiza el procedimiento descrito en las paacuteginas anteriores haciendo un solo conteo Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que Tabla 5 Matriz para el conteo en Caacutemara de Neubauer
Ndeg Total de bacterias contadas times 250000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
g o ml de aliacutecuota g o ml de aliacutecuota + g o ml de diluyente
Ndeg Total de ceacutelulas contadas times 10000 Fd times Ndeg de cuadrados contados
-El conteo directo con caacutemara de Neubauer por lo general solo se realiza previamente al meacutetodo de conservacioacuten evaluado
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
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Aplicando la ecuacioacuten para bacterias anteriormente mostrada tenemos que
Ndeg de bacteriasml=
= 81012 bacteriasml
81012 bacteriasml seraacute la cantidad de bacterias que ldquoexistenrdquo en la muestra inicial Esta en teacuterminos matemaacuteticos de las diluciones equivale a 100
Si aplicamos el mismo ejemplo para hongos o microalgas contando en los
cinco cuadros correspondientes a estos organismos y con la respectiva ecuacioacuten tenemos que Ndeg de ceacutelulasml= = 321011 ceacutelulasml
Conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa
Seleccione tres tubos de la dilucioacuten seriada y de cada uno vierta aliacutecuotas de 100microl (agitando con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) antes de cada extraccioacuten) sobre cajas de Petri con medio SPC hacia el centro y cerca al medio Raacutepidamente extienda la muestra con el asa de Drigalsky esteacuteril sobre la superficie del medio como lo indica la Figura 4 Figura 4 Extensioacuten de la muestra con el asa de Drigaslky A La muestra se extiende de arriba hacia abajo mientras se va hacia el frente y hacia atraacutes B Se termina de extender la muestra en diagonal de un lado al otro luego girar 90deg la caja y repetir el proceso
A B
90deg
16 times 250000
10-7 times 5
-Si se quieren datos maacutes fiables se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma aliacutecuota o poner en la caacutemara cinco aliacutecuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar las cifras -Al realizar el conteo en la caacutemara de Neubauer obtenemos el total aproximado de ceacutelulas presentes en la dilucioacuten utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al diferenciar entre el microorganismo esperado yo las impurezas que pueda contener la muestra por lo cual no es 100 exacto y no indica las ceacutelulas viables
16 times 10000 10-7 times 5
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Deje secar por miacutenimo 15min y lleve a incubacioacuten en posicioacuten invertida (excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja) Seguacuten el tipo de organismo las condiciones de incubacioacuten para la lectura de las cajas son
Bacterias temperatura ambiente 37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento
si se conoce Incubacioacuten de 18-24 horas Cuando se trata de organismos rehidratados el tiempo sugerido es de 24-48 horas Casos extremos de crecimiento lento una semana
Hongos temperatura inferior a 25degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten de una siembra de solucioacuten de conidios de 4-8 diacuteas
Algas temperatura entre 25-37degC o temperatura oacuteptima de crecimiento si se conoce Incubacioacuten por maacuteximo 7 diacuteas en organismos descongelados o rehidratados
Luego de la incubacioacuten las cajas son llevadas al contador de colonias (Figura
5) Las colonias se marcan con marcador permanente y se registran como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFCml)
Figura 5 Contador de colonias La caja de Petri se coloca en posicioacuten invertida y se marcan las colinas el contador cuenta al tacto
-La siembra por tubo se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador -Generalmente se toman las diluciones 10-5 10-6 y 10-7 Sin embargo si se trata de cepas descongeladas tome las diluciones 10-4 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3 10-4 y 10-5 -Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70 flamear esperar a que el alcohol se consuma Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar por uacuteltimo palpe raacutepida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por cada lado) antes de empezar a extender para enfriar totalmente -Puede usarse una siembra en profundidad u otro meacutetodo para el conteo de viables en lugar de la siembra en superficie Sin embargo los demaacutes meacutetodos de conteo limitan la evaluacioacuten del indicador dos -Si al cabo de 30min las cajas no han secado el medio tiene un exceso de humedad y debe repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condicioacuten -Con la punta de la micropipeta no toque el medio -Siempre use guantes y desinfeacutectelos constantemente durante los procedimientos
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En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250 al suponer que cada ceacutelula forma una colonia Para el caacutelculo de UFCml utilizamos una adaptacioacuten de la foacutermula de Valencia Z(2004)
UFCml = times times
Ejemplo 120 X 107 X 10 = 121010 UFCml
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre yo pos al proceso de conservacioacuten se calcula a traveacutes de la ecuacioacuten propuesta por Morales-Garciacutea et al (2010) Tasa de supervivencia (BSR )=
Donde DD Despueacutes de la desecacioacuten AD Antes de la desecacioacuten
Indicador dos Estabilidad Morfoloacutegica
Para evaluar este indicador se realiza Conteo en placa (caracteriacutesticas macroscoacutepicas)
Diligenciar el formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas (anexo 1) descritas por Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) para las colonias desarrolladas en superficie luego del procedimiento de ldquoconteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placardquo Hay que tener en cuenta que
- Se puede seleccionar una de dos placas (en siembras duplicadas) de una dilucioacuten conteniendo siempre un nuacutemero de UFC representativas seguacuten el rango estipulado por Camacho et al (2009)
- Las caracteriacutesticas macroscoacutepicas deben ser observadas en al menos el 80 de las colonias de la placa seleccionada
Ndeg de colonias (promedio entre las cajas por dilucioacuten)
Inverso del factor de dilucioacuten
Inverso del volumen de aliacutecuota
-La metodologiacutea y los criterios de eleccioacuten de cajas asiacute como el rango son seguidas de Camacho et al (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo todas las placas por dilucioacuten por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Puacuteblica del Gobierno de Chile (2008) -Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -El inverso del volumen de aliacutecuota corresponde a una medida de correccioacuten obligatoria para la siembra en superficie ya que en la praacutectica se aumenta en 110 el factor de dilucioacuten al sembrar 01ml (100microl) del tubo de dilucioacuten seleccionado
Log (1 + Ndeg UFCml DD) x 100 Log (Ndeg UFCml AD)
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Tincioacuten de Gram (caracteriacutesticas microscoacutepicas) Posterior al procedimiento anterior se realice una ldquocoloracioacuten de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfoloacutegica con el microorganismo esperadordquo (Saacutenchez amp Corrales 2005 paacuteg 24) En el caso de hongos realice una coloracioacuten simple con azul de metileno o coloraciones diferenciales indicando el reactivo usado
Por uacuteltimo comparar los resultados con las caracteriacutesticas microscoacutepicas y
macroscoacutepicas descritas por los investigadores donadores de las cepas en sus trabajos o con la informacioacuten de la base de datos para cada cepa De igual forma se toma registro fotograacutefico para la base de datos a traveacutes del microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con caacutemara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue y un estereoscopio con caacutemara
Indicador tres Pureza de la cepa
Este indicador evaluacutea la pureza de un vialcriovial rehidratadodescongelado ademaacutes permite determinar si existe un cambio geneacutetico durante el almacenamiento de las cepas o durante los procedimientos de preservacioacuten Para evaluar este indicador se tiene en cuenta los resultados de la estabilidad morfoloacutegica en cada conteo de ceacutelulas viables realizado por el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa Adicionalmente (de ser posible) se utilizan pruebas de actividad enzimaacutetica usando una bateriacutea de pruebas bioquiacutemicas o fisicoquiacutemicas diferenciales dependiendo de los requerimientos especiacuteficos acorde a las cepas y teniendo en cuenta los recursos del laboratorio Se recomienda realizar cada prueba por triplicado Tambieacuten puede usarse pruebas cristal u otras diferenciales
-Realice una coloracioacuten de Gram estaacutendar con cultivos no mayor a 48 horas y tome el registro fotograacutefico en un lapso no mayor a dos diacuteas -En los hongos es imprescindible el registro fotograacutefico de las esporas y otras estructuras de importancia taxonoacutemica -El formato para caracteriacutesticas macroscoacutepicas de las cepas exige un registro fotograacutefico pero alliacute solo se consignan si las fotografiacuteas son de alta calidad de lo contrario solo se dejan en la base de datos como referencia -Los procedimientos descritos aplican para todos los microorganismos -La estabilidad morfoloacutegica se evaluacutea pre y pos tanto en la liofilizacioacuten como en la criopreservacioacuten -Para comparar las caracteriacutesticas macroscoacutepicas con la informacioacuten de origen se deben usar los mismos medios El medio SPC por lo general se usa solo para los conteos
Si se confirma variacioacuten en las evaluaciones especialmente del indicador tres respecto a los datos de origen y estas confirman la variacioacuten geneacutetica de la cepa inmediatamente se saca de la coleccioacuten origen se asigna un nuevo coacutedigo de identificacioacuten y se realizan todos los procedimientos al tratarse de una nueva cepa Puede incluirse en la coleccioacuten Praacutecticas Acadeacutemicas (CM-PA0_ _) o crear una nueva coleccioacuten
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RECUPERACIOacuteN DE LOS MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento) Se toma un criovial (Semistock preferiblemente) sometieacutendolo a una
temperatura de 37degC (Arcos Ossa amp Diacuteaz 2004) en bantildeo seroloacutegico con agua destilada hasta su descongelacioacuten por aproximadamente 5min (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Los crioviales se introducen en bantildeo seroloacutegico una vez se llega a la temperatura deseada no antes
Del criovial se toma 1ml con micropipeta previamente agitado con Voacutertex
nivel 7 (asymp2240rpm) por 10s diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Dicho tubo se designa como T01 (primer subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 degC plusmn 1degC de 18-24 horas
La evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten se realiza al criovial luego de preparado el tubo T01 y antes de la incubacioacuten (viables poscriopreservacioacuten) Se compara los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacioacuten consignados en la base de datos y los trabajos de los autores que han donado los organismos al Banco Geneacutetico
Liofilizados (Rehidratacioacuten o reconstitucioacuten)
Rehidratar con 1ml de Buffer agua peptonada 01 a 37degC los viales a usar tomando el tiempo de rehidratacioacuten luego incubados a 25degC plusmn 1degC por 30min y agitando con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s Posteriormente se toma un 1ml de este vial partiendo de esta aliacutecuota se realiza evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten en medio soacutelido El indicador de viabilidad se evaluacutea solo con el meacutetodo de conteo de microorganismos mediante teacutecnica de extensioacuten superficial en placa u otro meacutetodo de conteo de organismos viables
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-dor donante sugiera otros meacutetodos de recuperacioacuten -La solucioacuten de rehidratacioacuten puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o la mismo solucioacuten lioprotectora de la formulacioacuten -En el momento en que solo quede un criovialvial disponible de la cepa se debe recuperar la cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservacioacuten a partir de este
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REFRIGERACIOacuteN
Se implementa el meacutetodo de resiembra continua en este el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento es almacenado a 4degC donde se mantiene para su uso resembraacutendolo en un lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-Garciacutea et al 2010) cuando es utilizado para su almacenado nuevamente Se debe tener en cuenta los siguientes paraacutemetros
a) Los intervalos de resiembra (de mantenimiento) dependen de las
caracteriacutesticas del microorganismo ya que algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios despueacutes de diacuteas semanas o meses Tambieacuten depende del tipo de medio de mantenimiento
b) El riesgo de contaminacioacuten y de cambios geneacuteticos se incrementa a mayor nuacutemero de transferencias
De acuerdo a esto para el laboratorio se determina
a) Las transferencias se deben realizar a medios frescos en tubos de ensayo
tapa rosca con Agar inclinado b) Se deben hacer transferencias por periodos largos de tiempo procurando no
realizar maacutes de 4 transferencias c) La temperatura de refrigeracioacuten debe mantenerse en un rango de 4plusmn2degC d) Se deben mantener las medidas necesarias para evitar la contaminacioacuten
cruzada teniendo en cuenta la organizacioacuten interna del refrigerador evitando el amontonamiento de las cajas
e) Se utilizaraacute el medio de mantenimiento de acuerdo a lo registrado en el formato LM-01 y FLf-01 REGISTRO DE ENTRADA DE CEPAS
f) Las cepas preservadas por este procedimiento seraacuten utilizadas para requerimientos internos del laboratorio preferiblemente en praacutecticas acadeacutemicas
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CRIOPRESERVACIOacuteN
Precriopreservacioacuten En el interior de la cabina de flujo laminar tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina Posteriormente son llenados con 1200microl de glicerol esteacuteril anhidro usando una pipeta y nuevamente son cerrados
Preparacioacuten del inoacuteculo bacteriano y ejecucioacuten de la criopreservacioacuten
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de criopreservacioacuten (Martiacutenez amp Mayorga 2013) se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae una aliacutecuota de 1ml diluyeacutendolo en un tubo con 9ml de medio SMPG nuevo (tubo designado como T02)
Despueacutes agitar el tubo T02 con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s tomando
luego cinco aliacutecuotas de 600microl depositadas en cada criovial para aforar un volumen final de 1800microl (Martiacutenez amp Mayorga 2013) Se rotulan los crioviales y se realiza Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 5s para su homogenizacioacuten Inmediatamente despueacutes de este proceso se almacenan los crioviales en el rack correspondiente seguacuten la coleccioacuten a una temperatura de -85degC plusmn 1degC
Por uacuteltimo se debe llenar el registro LM-03 PROCESO DE CRIOPRESERVACIOacuteN
culminado el proceso
-No use micropipeta para pipetear el glicerol -Todo el material debe ser correctamente esterilizado -Nunca tocar las tapas en el interior -De ser posible se recomienda una concentracioacuten de 10⁸ - 109 celml -Este procedimiento se realiza en cabina de flujo laminar para evitar la contaminacioacuten del medio procurando ademaacutes no sobrepasar 20min desde la extraccioacuten de la aliacutecuota de T01 y la congelacioacuten esto con el fin de evitar la generacioacuten de nuevas ceacutelulas (si se han determinado celml totales precongelamiento) -Algunos autores sugieren un pre-enfriamiento antes del congelamiento para activar la respuesta celular ante condiciones ambientales desfavorables aumentando el nuacutemero de viables poscongelacioacuten Esto se puede hacer si no se tiene un nuacutemero determinado de ceacutelulas a una temperatura de 4degC plusmn 1degC por 20-30min -Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y poscriopreservacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas
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LIOFILIZACIOacuteN Preliofilizacioacuten y preparacioacuten del inoculo bacteriano Desde medio soacutelido
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio soacutelido se toman 4 asadas con abundante crecimiento microbiano inoculando un tubo (designado como T03) con 10ml de lioprotector general Posteriormente se debe agitar con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 45s Desde medio liacutequido
Partiendo de un cultivo en medio liacutequido (o el tubo T01 en caso de cepas descongeladas) como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s y se extrae 1ml de muestra diluyeacutendolo en un tubo con 9ml agua destilada esteacuteril (designado como T04)
Ejecucioacuten de la liofilizacioacuten Desde medio soacutelido
Del tubo T03 como inoacuteculo inicial para el proceso de liofilizacioacuten y previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 1ml que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente tapados con tapoacuten de divisioacuten Cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Desde medio liacutequido
Del tubo T04 previamente agitado con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 15s se extraen cuatro aliacutecuotas de 100microl depositados en cuatro viales de vidrio En cada vial se adiciona 900microl de lioprotector general y posteriormente son tapados con tapoacuten de divisioacuten
Con el fin de que la concentracioacuten de lioprotector en el interior de cada vial
sea lo maacutes exacta posible al adicionarle la aliacutecuota del tubo T04 se aconseja utilizar las siguientes ecuaciones para su preparacioacuten
Donde V1 y C1 corresponden al protector al momento de ser preparado en
tanto que V2 Y C2 corresponden al protector luego de agregada la aliacutecuota del tubo T04
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Con un volumen total de 1ml cada vial se agita con Voacutertex nivel 2 (asymp640rpm) por 7s para su homogenizacioacuten evitando el contacto con el tapoacuten Los viales (indistintamente si se parte de medio soacutelido o liacutequido) se destapan parcialmente y se congelan en nitroacutegeno liacutequido en recipiente de poliestireno expandido cerrado por ge15min para ser llevados al liofilizador de 24-48 horas a una presioacuten inferior a 0266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45degC
Posliofilizacioacuten Luego del desmonte y sellado al vaciacuteo de los viales cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper posterior al proceso de liofilizacioacuten Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de liofilizados a temperatura ambiente El tercer vial (Lf) se almacena a 4degC plusmn 1degC en el cepario madre de liofilizados El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0 horas a 5 diacuteas realizando evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten para saber si fue o no exitosa la liofilizacioacuten Por uacuteltimo se debe llenar el registro FLf-02 PROCESO DE LIOFILIZACIOacuteN culminado el proceso
Variaciones de la liofilizacioacuten en hongos En cuanto a los hongos el inoacuteculo inicial durante la preliofilizacioacuten se prepara
llenando con 10ml de agua destilada esteacuteril un cultivo soacutelido altamente esporulado del hongo Luego con un asa o espaacutetula esteacuteril se raspa suavemente procurando no desprender trozos de agar Esta suspensioacuten es extraiacuteda con una pipeta esteacuteril y depositada en un tubo de ensayo al cual se le agrega 100microl de solucioacuten Tween 80 al 01 esteacuteril para preparar la solucioacuten de esporas Se agita con Voacutertex nivel 7 (asymp2240rpm) por 20s y se prosigue de acuerdo a la ejecucioacuten de la liofilizacioacuten desde de un medio liacutequido
-Recuerde realizar evaluacioacuten de la eficacia del meacutetodo de conservacioacuten pre y posliofilizacioacuten Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas -Se debe realizar Voacutertex cada vez que se vaya a extraer una aliacutecuota -Los mejores resultados en la liofilizacioacuten se han obtenido con microrganismos en fase estacionaria Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase se recomienda en agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas y en caldo SMPG un rango de 24-48h -Algunos microorganismos como hongos suelen requerir maacutes tiempo del estipulado para su total congelamiento tener este dato de ser posible -El tiempo de liofilizacioacuten variacutea seguacuten la formulacioacuten Para una formulacioacuten con Sacarosa 10 36 horas es lo ideal -Debe usarse el accesorio para liofilizacioacuten Tray style con estante de taponado para sellar los viales al vaciacuteo y de forma hermeacutetica -Los tapones de divisioacuten deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimacioacuten del agua de lo contrario no seraacute posible la liofilizacioacuten y pueden incluso quebrarse
-Si el raspado contiene rastros grandes de agar se debe realizar un filtrado con gasa esteacuteril aunque esto disminuiraacute el nuacutemero de esporas -Las esporas en solucioacuten pierden viabilidad conforme avanza el tiempo Se sugiere hacer uso de la solucioacuten antes de dos horas de preparada
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ROacuteTULOS
Refrigeracioacuten Dado que la refrigeracioacuten constituye un meacutetodo de corto plazo no se
requieren roacutetulos especiales para este meacutetodo de conservacioacuten Sin embargo es imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente informacioacuten con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha
Criopreservacioacuten
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los roacutetulos de coleccioacuten usados en las cajas del Freezer y los roacutetulos para cada cepa criopreservada
Fecha de ingreso__________________________ Medio___________________________________ Cepa____________________________________ Coacutedigo__________________________________
-Es opcional imprimir este roacutetulo en papel adhesivo o simplemente imprimir en papel normal y pegarlo con cinta
Figura 7 Roacutetulos para las cajas del Freezer
Figura 8 Roacutetulos para los crioviales
Figura 6 Roacutetulo opcional para tubos inclinados
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Liofilizacioacuten
Los roacutetulos de la Figura 9 contienen la siguiente informacioacuten Coacutedigo de la cepa Coacutedigo asignado para cada microorganismo en la base de
datos el Freezer y el banco de liofilizados Corresponde a la descripcioacuten del tipo de coleccioacuten bioloacutegica (coleccioacuten microbioloacutegica ldquoCMrdquo) siglas de la coleccioacuten (Colorantes ldquoCRrdquo) nuacutemero de la cepa en la coleccioacuten (004) y el tipo de vial (Trabajo ldquoTrdquo)
Nivel de riesgo Bioloacutegico Se utilizoacute una escala de colores para la clasificacioacuten
de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 6) con base al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005) ldquoEsta clasificacioacuten por grupos de riesgo es exclusivamente para el trabajo de laboratoriordquo (OMS 2005 paacuteg 1) El grupo de riesgo bioloacutegico solo aparece en las muestras liofilizadas no en las criopreservadas ya que eacutestas tienen roacutetulos distintos
Ubicacioacuten en el banco de liofilizados Muestra la ubicacioacuten exacta de cada
vial Corresponde a la bandeja (BAN A) la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1) Adicional a ello se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracioacuten en este vial
Fecha Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccioacuten
Figura 9 Roacutetulos creados para los viales liofilizados
-Los roacutetulos de las cajas del Freezer los crioviales y los viales deben ser impresos en papel adhesivo -Los roacutetulos deben colocarse antes de su almacenamiento especialmente los crioviales ya que una vez congelados el adhesivo no funciona
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Tabla 6 Coacutedigo de colores propuesto seguacuten la clasificacioacuten de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS
Nota Coacutedigo de Color Fuente Adaptado de OMS (2005) Manual de bioseguridad en el laboratorio (paacuteg 1) Ginebra Ediciones de la OMS Recuperado de httpwwwwhointcsrresourcespublications biosafetyCDS_CSR_LYO_2004_11SPpdf
CC en CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcioacuten
Grupo de riesgo 1 Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual moderado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente
Grupo de riesgo 3 Riesgo individual elevado riesgo poblacional bajo
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro Existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo 4 Riesgo individual y
poblacional elevado
Agentes patoacutegenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten faacutecilmente de un individuo a otro directa o indirectamente Normalmente no existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos Para su manipulacioacuten referirse al manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005)
-En la base de datos del Banco Geneacutetico se encuentran los formatos en el programa WORD de forma tal que solo se modifique los datos pero el formato y tamantildeo de letra sea igual para todos los roacutetulos -Las etiquetas de liofilizacioacuten y criopreservacioacuten deben imprimirse en papel adhesivo -Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos
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Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservacioacuten y en
el laboratorio
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CONTROLES DE ESTERILIZACIOacuteN
Todos los medios reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser esterilizados en autoclave a 121degC y 210kPa por 20min a menos que las especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro meacutetodo de esterilizacioacuten las puntas de micropipetas los viales crioviales y sus respectivas tapas deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presioacuten y temperatura mencionadas en un tiempo de 15min Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas) pueden ser esterilizados en horno a 160degC por 120min
Sin embargo se deben realizar controles constantes durante el desarrollo de
todo el trabajo desde la preparacioacuten de medios hasta el sellado de viales y crioviales como se describe a continuacioacuten
Medios Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solucioacuten de
rehidratacioacuten y para las diluciones seriadas) al caldo SMPG al medio SPC a las soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro dejaacutendolos en incubacioacuten en las mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacioacuten Son indicadores de contaminacioacuten cambios oacutepticos (turbidez u opacidad) en los medios liacutequidos y presencia de colonias en medios soacutelidos
Ambiente Nevera de almacenamiento de los medios y protectores
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto) evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas El periodo de exposicioacuten va de 15 a 30 minutos dejaacutendolos en incubacioacuten de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacioacuten de las cepas de trabajo Se recomienda que con un nuacutemero superior de cinco colonias en el control se desinfecte el aacuterea de almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminacioacuten Cabina de flujo laminar
Se realiza el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento pero en este caso la caja de control de ambiente se deja abierta desde el inicio hasta el final de los procesos que requieren el uso de la cabina esto es tiempos de exposicioacuten de hasta 3 o 4 horas Este control se lleva a cabo cada vez que se usa la cabina de flujo laminar
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Teacutecnicas de siembra y manipulacioacuten de elementos Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina sino ademaacutes un riguroso uso de elementos de proteccioacuten como guantes y tapabocas Los guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente con alcohol 70 al inico durante y al final del trabajo con cada cepa
ELIMINACIOacuteN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005) los residuos se pueden clasificar en cinco grupos La eliminacioacuten de residuos en el laboratorio de microbiologiacutea no es ajeno a las normas nacionales e internacionales estipuladas por ello los desechos se dispondraacuten de la siguiente forma
Desechos no contaminados (no infecciosos) Se dispone de una caneca para residuos ordinarios no contaminantes que
incluso pueden reutilizarse o reciclarse como el papel
Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos) Aunque en general ninguno de los procedimientos de conservacioacuten requiere
de material corto-punzante se cuenta con un guardiaacuten para este tipo de objetos como cuchillas o jeringuillas Puede presentarse rotura de material de vidrio contaminado o sin contaminar por lo cual el laboratorio cuenta con dos recipientes plaacutesticos otorgados por el PIGA (Plan Institucional de Gestioacuten Ambiental) que funcionan como guardianes para el almacenamiento y disposicioacuten final de este material
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser tratado en autoclave y reutilizado
Las cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados entre otros reutilizables deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 20 minutos Posterior al proceso de autoclavado se deben someter a un proceso de desinfeccioacuten con hipoclorito al 15 durante al menos 30 minutos y luego se debe proceder al lavado de estas con jaboacuten neutro
Las puntas de micropipetas y las pipetas de vidrio pueden o no ser autoclavadas en todo caso deberaacuten tener el mismo proceso de desinfeccioacuten anteriormente mencionado
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Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado todos los desechos producidos en cajas de Petri tubos de ensayo frascos Schott crioviales y viales inoculados deben ser desactivados mediante autoclave a 121degC y 210Kpa por 15 minutos posterior a este proceso se descartaraacute el contenido de las cajas de Petri disponieacutendolos en bolsas rojas para residuos peligrosos Por otra parte los desechos liacutequidos deberaacuten ser dispuestos en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo facilitados por el PIGA
Material contaminado destinado a la incineracioacuten directa
No es directriz del laboratorio ni del Banco Geneacutetico la incineracioacuten de ninguacuten tipo de material o residuo peligroso solo de su disposicioacuten y almacenaje seguacuten lo estipulado desde el PIGA con base en las normas nacionales para residuos peligrosos e infecciosos
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BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiologiacutea de la Facultad del Medio Ambiente se encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2 es decir que puede albergar microorganismos del grupo de riesgo dos estos son
ldquoAgentes patoacutegenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrantildear un riesgo grave para el personal de laboratorio la poblacioacuten el ganado o el medio ambiente La exposicioacuten en el laboratorio puede provocar una infeccioacuten grave pero existen medidas preventivas y terapeacuteuticas eficaces y el riesgo de propagacioacuten es limitadordquo (OMS 2005 paacuteg 1)
El laboratorio debe contar con medidas de seguridad que reduzcan o eliminen este tipo de riesgos tanto para los estudiantes como para el personal que trabaja en el laboratorio y en especial con el Banco Geneacutetico Las siguientes normas de bioseguridad para el laboratorio son tomadas en concordancia con algunas de las directrices de la OMS (2005)
Proteccioacuten personal El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
El personal que usan lentes de contacto en laboratorios deben utilizar un protector facial
Se recomienda el uso de batas blancas manga larga y bien abotonada con el fin de evitar que la ropa se pueda contaminar ensuciar o para prevenir alguacuten accidente
Se debe recoger el cabello y quitarse elementos como joyas bufandas o gorras
Se debe usar guantes si existen heridas en las manos o si la piel presenta alguna erupcioacuten
Se debe utilizar proteccioacuten ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos
Debe respetarse la prohibicioacuten de beber comer masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca objetos como boliacutegrafos ademaacutes de tocarse los ojos y nariz
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Procedimientos Estaacute estrictamente prohibido pipetear con la boca se deben utilizar
pipeteadores mecaacutenicos Todos los cultivos stocks y otros residuos se descontaminan antes de ser
desechados mediante un meacutetodo de descontaminacioacuten aprobado como por ejemplo mediante autoclave
Aacutereas de trabajo Las superficies de trabajo se descontaminan como miacutenimo una vez por diacutea
y luego de todo derrame de material contaminante
En las zonas de trabajo estaraacute prohibido comer beber fumar aplicar cosmeacuteticos manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en aacutereas de trabajo
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ninguacuten momento ropa u objetos personales
Capacitaciones Los encargados del Banco geneacutetico y del laboratorio deberaacuten estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma maacutes eficaz y asiacute reducir riesgos en el proceso
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente manual incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para asegurar su uso adecuado asiacute como de las maquinas y elementos del laboratorio
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REFERENCIAS
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Anexos y formatos
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BANCO DE LIOFILIZADOS
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CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
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En conjunto las publicaciones de Valencia Z (2004) Piacuterez amp Mota (2006) y Diacuteaz (2009) ofrecen un amplia gama de caracteriacutesticas macroscoacutepicas para bacterias y hongos Este formato puede ser adaptado para algas de igual forma Es importante siempre sentildealar las condiciones en que se hace la descripcioacuten pues las caracteriacutesticas pueden variar en funcioacuten de la edad del cultivo la humedad del medio la temperatura de crecimiento el pHhellip a Coacutedigo asignado para la cepa en la coleccioacuten y la base de datos Borde superficie y forma son caracteriacutesticas diferentes aunque algunos autores las combinen Esta tabla no debe sobrepasar el tamantildeo de una hoja tamantildeo carta Solo se debe poner fotografiacuteas de las caracteriacutesticas mencionadas en los formatos si son de muy buena calidad de lo contrario es mejor prescindir de ellas Aun asiacute pueden ser anexadas a la base de datos del Banco Geneacutetico (funcionan como referencia)
FORMATO PARA CARACTERIacuteSTICAS MACROSCOacutePICAS DE LAS CEPAS
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FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN
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FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN LIOFILIZACIOacuteN
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FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIOacuteN CRIOPRESERVACIOacuteN
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