ANTECEDENTES:

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA

PROYECTO DE

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

TEMA:

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACION DE CEPAS SACHAROMYCCES CEREVISIAE TERMOTOLERANTES Y RESISTENTES A

ELEVADAS CONCENTRACIONES DE ALCOHOL PARA LA PRODUCCION DE AGUARDIENTE

INTEGRANTES:

ALVEAR SANDRA

BASANTES FERNANDA

FIENCO ESTEFANÍA

GUEVARA DIANA

HERAS DIANA

1. TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACION DE CEPAS SACHAROMYCCES CEREVISIAE TERMOTOLERANTES Y RESISTENTES A ELEVADAS CONCENTRACIONES DE ALCOHOL PARA LA PRODUCCION DE AGUARDIENTE

2. OBJETIVOS: 2.1. OBJETIVO GENERAL:

Aislar, seleccionar y caracterizar cepas termotolerantes y resistentes a altas concentraciones de alcohol de Saccharomyces cerevisiae para el mejoramiento de la producción de aguardientes, teniendo como materia prima melaza de caña de azúcar y residuos de la etapa de fermentación de caña de azúcar.

2.2. OBEJTIVOS ESPECIFICOS:

Obtener melaza de caña de azúcar mediante la preparación, extracción del jugo, clarificación, evaporación, cristalización y centrifugación

Aislar las cepas de Saccharomyces cerevisiae fermentadoras y de melaza de caña de azúcar en agar malta.

Seleccionar las cepas de Saccharomyces cerevisiae termotolerantes y resistentes a etanol del cultivo aislado de melaza de caña

Obtener cultivos axénicos de Saccharomyces cerevisiae Caracterizar morfológicamente las cepas aisladas de Saccharomyces cerevisiae

3. ANTECEDENTES

Para realizar el presente trabajo nos hemos basados en publicaciones científicas y rendimientos actuales para tener una idea clara de los estudios realizados y por ende poder mejorar la calidad del aguardiente.

Los fenómenos relacionados con la tolerancia térmica y la tolerancia a etanol de los microorganismos han sido investigados exhaustivamente. La temperatura optima de crecimiento especialmente de saccharomyces cereviciae es de 30° a 35 °C, la temperatura afecta el crecimiento de manera notable, principalmente porque los microorganismos de una especie dada solo pueden crecer en un rango restringido de temperatura, según estudios realizados se ha reportado que la tolerancia a el etanol y altas temperaturas son interactivos, porque las concentraciones altas de alcohol disminuyen la temperatura optima de crecimiento y el aumento de la temperatura incrementa el efecto inhibitorio de etanol por lo tanto afecta directamente al rendimiento.

Los efectos tóxicos de la temperatura y el etanol están relacionados con alteraciones de la permeabilidad de las membranas celulares, la desnaturalización de proteínas intracelulares, así como la inhibición del transporte de nutrientes.El mecanismo de respuesta celular al estrés por temperatura y por etanol es esencialmente similar y consiste en cambios en la composición lipídica de las membranas y en síntesis transitoria de proteínas. Entre las estrategias para mejorar la tolerancia térmica se encuentran la selección de cepas, adaptación de cepas mediante incubación a temperaturas crecientes.

Las cepas nativas dan un rendimiento de 0.39 g de etanol por cada gramo de azúcares a 35°C pero a 40°C (cepas termotolerantes) se obtiene0.41g de etanol por cada gramo de azúcares, mejorando así su rendimiento y a la par dando una disminución de tiempo de fermentación.

4. JUSTIFICACION

De acuerdo al reporte de consumo de bebidas alcoholicas Overview 2008, elaborado por Ipsa Group, el 76% de los compradores prefieren consumir agua ardiente sobre otro tipo de bebidas, Quito es la ciudad donde se realiza el mayor número de adquisiciones de este producto, ya que el estudio determina que el 56,9% de los capitalino consume este tipo de bebidas frente al 43,1% de los guayaquileños.

En ecuador el uso de melaza como sustrato para la producción de saccharomyces cerevisiae es utilizado para la obtención de aguardiente, existe alrededor de 78 000 hectáreas cultivadas de caña destinadas a la producción de azúcar. Unas 30 000 hectáreas de caña de azúcar están  destinadas a la producción de aguardiente y otros productos artesanales.

El rendimiento de una fermentación con la utilización de las cepas nativas de saccharomyces cerevisiae se puede ver incrementado con la utilización de cepas termotolerantes, ya que se logra producir mayor cantidad de etanol con menor consumo de azucares, se economisa la materia prima por lo tanto disminuyen costos de producción que generaran un incremento de ingresos de una fabrica productora de agua ardiente.

Tomando en cuenta los datos citados anteriormente, se puede establecer que la elaboración de aguardiente como bebida alcoholica es rentable en nuestro país y aunque no se pretende competir con las grandes fábricas productoras, se sugiere la optimización del proceso, con la utilización de cepas termotolerantes que aumenta la resistencia al etanol, disminuyen el tiempo de fermentación, y aumenta la producción.

5. MARCO TEORICO:

5.1 CAÑA DE AZÚCAR

La caña de azúcar es una gramínea tropical, en cuyo tallo se forma y acumula un jugo rico en sacarosa, compuesto que al ser extraído y cristalizado forma el azúcar.

5.2 MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR

Las melazas, mieles finales o melazas “blackstrap”, suelen ser definidas, por muchos autores como los residuos de la cristalización final del azúcar, de los cuales no se puede obtener más azúcar por los medios físicos.La melaza es una mezcla compleja que contiene sacarosa, azúcar invertido, sales y otros compuestos solubles en álcali que normalmente están presentes en el jugo de la caña localizado, así como los formados durante el proceso de manufactura del azúcar. Además de la sacarosa, glucosa, fructosa y rafinosa los cuales son fermentables, las melazas también contienen sustancias reductoras no fermentables.Estos compuestos no fermentables reductores del cobre, con principalmente caramelos libres de nitrógeno producidos por el calentamiento requerido por el proceso y las melaniodinas que si contienen nitrógeno derivadas a partir de productos de condensación de azúcar y aminocompuestos.

5.2.1 COMPOSICIÓN QUÍMICA (%) DE LA MELAZA DE LA CAÑA DE AZÚCAR

COMPONENTES CONSTITUYENTES CONTENIDO (p/p)

COMPONENTES MAYORES

Materia seca 78%Proteínas 3%sacarosa 60-63%

Azúcares reductores 3-5%Sustancias disueltas

(azúcares diferentes)4-8%

Agua 16%grasas 0.40%

Cenizas 9%

CONTENIDO DE MINERALES

Calcio 0.74%magnesio 0.35%

fósforo 0.08%potasio 3.67%

SALES Orgánicas 3.0-3.4%inorgánicas 1.5-4.5%

COMPONENTES MENORESÁcidos orgánicos 1-3%

Aminoácidos 1.5-5.5%Almidones 0.001-0.050%

Las melazas se obtienen como un subproducto final en la elaboración de la caña de azúcar.

5.3 MICROORGANISMOS DE LA MELAZA

Mediante ensayos adecuados con soluciones diluidas de malazas, se ha demostrado que estas, a pesar de su bajo contenido de fósforo, constituyen un buen medio de cultivo para muchos microorganismos, tales como levaduras hongos y bacterias.

Se considera importante la presencia de microorganismos mesófilos termófilos dentro de la melaza. Los organismos mesófilos se desarrollan bien durante la dilución de las melazas.

5.3.1 SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Es la especie de levaduras utilizada por excelencia para la obtención de etanol a nivel industrial debido a que es un microorganismo de fácil manipulación y recuperación, no es exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto costo, tolera altas concentraciones de etanol, en la fermentación produce bajos niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones de azucares.

Las levaduras, son organismos eucarióticos unicelulares, por lo tanto sus estructuras se encuentran formadas por pared celular, núcleo diferenciado y organelos con ribosomas y mitocondrias.

Saccharomyces Cerevisiae es una levadura cuya colonia es de color crema o blanco, apariencia húmeda y brillante, de bordes irregulares.

La temperatura óptima de crecimiento es de 25 a 300C. Puede producir ascosporas cuando hay requerimientos nutricionales adecuados

6. MARCO METODOLOGICO:

6.1 PROCESO DE OBTENCIÓN DE MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR

6.2 AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

6.2.1 AISLAMIENTO

FASE DE ENRIQUECIMIENTO

1. Inocular alícuotas de 1 ml de crema de levadura en un erlenmeyer de 150 ml contenidas en 50 ml de caldo de mata reforzado

2. Incubar a 45°C con agitación (120rpm) durante 15 a 20 horas hasta que la turbidez indique evidencia de crecimiento celular

3. Tomar muestras de los matraces con resultados de crecimiento positivo y realizar diluciones seriadas hasta 10-5 con suero fisiológico (9 g/L de NaCl)

6.2.2 FASE DE SELECCION

1. A partir de los cultivos diluidos efectuar siembras por estriado sobre agar malta.2. Incubar las cajas a 35°C por 48 horas

6.2.3 FASE DE PURIFICACIÓN

1. Realizar una resiembra por estriado en agar malta enriquecido con ampicilina (300mg/L) para inhibir la flora competitiva que aun puede persistir.

2. Incubar las cajas a 35°C por 48 horas.

6.2.4 FASE DE CONSERVACIÓN

1. Del cultivo puro obtenido en la fase anterior seleccionar las mejores colonias y aplicar el método de perlas para conservación

2. Colocar en los crioviales de 10 a 20 perlas las cuales serán conservadas.3. La temperatura adecuada para la conservación de la cepa es de 4°C

DIAGRAMA DE FLUJO DEL AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Figura N°1

Crema de levaduras residual

Incubación en caldo malta reforzado a 45°C de 15 a 20

horas

Diluciones

Crecimiento

SI NO

Siembra en placa

Incubación a 35°C por 48 horas

Colonias aisladas

Colonias aisladas

Resiembra en placas

7. HIPOTESIS NULA

Las cepas de saccharomyces cerevisiae aisladas e identificadas no son tolerantes a estrés de la producción (T=40°C, altas concentraciones de etanol)

7.1 HIPOTESIS ALTERNATIVA

Las cepas de saccharomyces cerevisiae aisladas e identificadas son tolerantes a estrés de la producción (T=40°C, altas concentraciones de etanol)

8. FACTIBILIDAD

Medios y Reactivos

Cantidad de Referencia

Cantidad Ncesaria

Precio

mL g mL 500g Cantidad a utilizar

Agar Maltosa 983 38 450 62 0.70

Caldo Maltosa

1000 37 50 47 0.27

Suero Fisiológico

1000 9 50 12 0.06

MATERIAL CANT UNITARIO TOTALTubos 5 5 0.10 0.50

Cajas 15 15 0.15 2.25Crioviales 5 5 1.50 7.50

Pipetas LABORATORIOBiorreactor

TOTAL 11.28

Incubación a 35°C por 48 horas

Cultivo puro

Método de perlas

Selección de perlas y colocación en crioviales

Crioconservación a 4°C (T sugerida)