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ACTAPHYSIOLOGIAE

PLANTARUMVol. 22. No. 1. 2000:3-10

P l a n t r e g e n e r a t i o n f r o m t h e p r o t o p l a s ts o f Solanum tuberosum, S . n igruma n d S . bulbocastanumA n n a 5 2 c z e rb a k o w a . M a r i a B o r ko w s k a * , B e r n a r d W i e lg a tI n s t it u t e o f B i o c h e m i s t r y a n d B i o p h y s i c s , P o l is h A c a d e m y o f S c i e n c e s , 0 2 - 1 0 6 W a r s a w , P a w i f i s k i e g o 5 A , P o l a n d

* W e r e g r e t t o r e p o r t th e d e a t h o f M . S c . M a r i a B o r k o w s k a a f t e r t h e c o m p l e t i o n o f th i s w o r k .

K e y w o r d s : p r o t o p l a s t r e g e n e r a t i o n , S o l a n u m b u l -b o c a s t a m # n , S o l a n u m n i g r u m , S o l a n u m t u b e r o s u m

AbstractThe lnesophyll protoplasts were isolated from the Solanumtuberosum (S. tbr) clones of different ploidy level (4x Bzuracv., 2x H -8105, and 2x Z EL- 1. 136) as well as from the wild spe-cies: S. bulbocastamlm (S. blb, 2x) and two accessions of S.~ligrum (S. ng r, 6x). Additionally, the protoplasts we re isolatedfrom the cell suspensions o f Bzura cv. and H-8105 clone. Th econditions of protoplast isolation as w ell as the media fo r theirculturing and regeneration, were selected and op timized for thestudied gcnotypes. For mesophyll protoplasts, the shootingcalli were produced by all the cultured protoclones except thato f S. bulbocastamm~. The shoots excised from the protoplast-derived calli developed into whole plants in all the studied po-tato clones but on ly in one accession o f S. nigrum, i .e.S, ngrvar. gigar~tea. As for suspension-cell-derived protoplasts, onlyH-8 i05 clone produced the regenerative typ e of calli , thoughnormal shoots could no t be obtained. The regenerative capacityof the protoplasts isolated fro m leaves and cell suspensions i scompared and discussed.

IntroductionI t is w e ll k n o w n t h at t h e re g e n e r a t i v e c a p a c i t y o fd i f fc r e n t g e n o t y p e s v a r i e s s i g n i f ic a n t l y e v e n f o r th ec l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s o r i n d i v i d u a l l i n e s w i t h i n t h e

s a m e s p e c i e s ( e . g . M a s s o n e t aL 1 9 8 7 ) . T h o u g h t h el it e ra t u re o n m e t h o d s o f p l a n t r e g c n c r a t i o n f r o m t h ep r o t o p l a s t s o f p o t a t o a n d w i l d r e p r c s e n t a t i v e s o fS o l a n a c e a e f a m i l y is a b u n d a n t , t h e s e l e c t i o n a n dm o d i f i c a t i o n o f t h e p r o p o s e d t e c h n i q u e s i s n e e d e di n o rd c r t o a p p l y t h e m t o a n y p a r t ic u l a r s p e c i e s o rl i n e .W i l d S o l a n u m s p e c i e s , S . b u l b o c a s t a n u m ( d i p l o i d ,2 x ) a n d S . n i g r u m ( h e x a p l o i d , 6 x ) , b o t h r e s i s ta n t t od i f f er e n t p a t h o g e n s , c o u l d b e u s e d a s d o n o r s o f th er e s i st a n c e b y m e a n s o f s o m a t i c l ~l si on w i t h p o t a t op r o t o p l a s t s ( A u s t i n e t a l . 1 9 9 3 , H o r s m a n e t a l .1 9 9 7) . T h e r e g e n e r a t i o n s y s t e m s f o r m e s o p h y l lp r o t o p l a s t s o f t h o s e s p e c i e s h a v e b e e n d e s c r i b e d( N e h l s 1 9 7 8 , S i h a c h a k r & D u c r e u x 1 9 8 7 ) t h o u g ht h e p r o t o p l a s t s o f S . b u l b o c a s t a n u m u s u a l l y f a i l e dt o r e g e n e r a t e ( A u s t i n e t a l . 1 9 9 3 ) . S i n c e o u r o b j e c -t i v e w a s t o i m p r o v e t h e l a t e b l i g h t r e s i s t a n c e o f d o -m e s t i c p o t a t o c u l t iv a r s b y t h e s o m a t i c h y b r i d i z a t i o nt e c h n i q u e , i t w a s f i r st i n e v i t a b l e t o d e t e r m i n e t h e r e-s p o n s e s t o c u l tu r i n g a n d t h e r e g e n e r a t i v e c a p a c i t yo f t h e ir p r o t o p l a st s . F o r t h a t p u r p o s e w e h a v e s e -l e c t e d t h e p o t a t o l i n e s w i t h d i f f e r e n t p l o i d y l e v e l :t h e t e t r a p l o i d c v . B z u r a , r e l a t i v e l y r e s i s t a n t t o l a t eb l i g h t , a n d t w o d i p l o i d c l o n e s s u s c e p t i b l e t o t h a t

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A. SZCZERBAKOW A, M. BORKOWSKA & B. W1ELGAT

d i s e a s e: H - 8 1 0 5 - a d i h a p l o i d , a n d Z E L - 1 1 3 6 - a ni n t e r s p e c i f i c h y b r i d b e t w e e n S . t u b e r o s u m an d S .c h a c o e n s e . T h e p r o t o p l a s t s o f th o s e p o t a t o l i n e sh a v e n o t b e e n p r e v i o u s l y u s e d i n f u s i o n e x p e r i -m e n t s a n d th e i r c u l t u r e r e q u i r e m e n t s w e r e n o tk n o w n . F o r B z u r a c v . a n d H - 8 1 0 5 c l o n e , t h e r e g e n -e r a t i o n o f b o t h l e a f - a n d s u s p e n s i o n - c e l l - d e r i v e dp r o t o p l a s t s w e r e e x a m i n e d . I n t h e p r e s e n t w o r k w ed e s c r i b e t h e c u l t u r i n g o f p r o t o p l a s ts i s o l a t e d f r o ml e a v e s a n d c e l l s u s p e n s i o n s o f S . t u b e r o s u m , f r o ml e a v e s o f S . n i g r u m an d S . b u l b o c a s t a n u m , a n dc o m p a r e t h e a b i l i t y o f t h e c u l t u r e d p r o t o p l a s t s t o re -g e n e r a t e p l a n t s i n s e l e c t e d c u l t u r e m e d i a .

M a t e r i a l s a n d m e t h o d s

G e n o t y p e sWildS o l a n u m s p e c i e s c o m p l e t e l y r e s i s t a n t t o P h y -t o p h t h o r a i n f es t a n s :- S . n i g r u m L . ( h e x a p l o i d , 2 n = 6 x = 7 2 , n o n - t u b e -r iz ing)- S . n i g r u m var. g i g a n t e a ( h e x a p l o i d , 2 n = 6 x = 7 2 ,n o n - t u b e r i z i n g )- S . b u l b o c a s t a n u m ( P I 2 4 3 5 1 2 , c l o n e 1 1 2 / 2 3 , d i p -l o i d , 2 n = 2 x = 2 4 , t u b e r - b e a r i n g )C ul t i v a t e d po ta to- B zu r a cv . ( t e t r ap lo id , 2 n =4 x =4 8 ) , a l a t e - m a tu r in gc v. b e l o n g i n g t o t h e fa m i l y P G - 2 3 2 a n d e x p r e s s i n gf i e ld r e s i s t an ce to P h . i n f e s t a n s sco r ed 8 in 1 - 9g r ad e sca l e ( 9 = r e s i s t an t i n l ea f l e t t e s t ) ; o r ig in o f t h ef a m i l y : [ ( M P I 5 5 . 9 5 7 . 2 4 x U S D A 9 6 - 5 6 ) x O r a ] xP r o s n a- H - 8 1 0 5 ( d i h a p l o i d , 2 n = 2 x = 2 4 ) , o b t a i n e d fr o mc r o s s e s o f t h e s e c o n d a r y d i h a p l o i d s o f th e p a r e n ta lf o r m s M H - 7 3 - 1 7 - 1 2 - 7 7 x S H - 7 7 - 4 5 - 3 5 b y H e t -t e m a , H o l l a n d ; m i d - e a r l y m a t u r in g , s u s c e p t i b l e toP h . i n f e s t a n s , f i e ld r e s i s t an ce sco r ed 2 in 1 - 9 g r ad es c a l e- Z E L - 1 1 3 6 ( d i p l o i d , 2 n = 2 x = 2 4 ) , o r i g i n a t e d f r o mc r o s s e s b e t w e e n d i h a p l o id s o f S . t b r a n d w i l d s p e -c i e s S . c h a c o e n s e ; Z E L - 1 1 3 6 = H S 1 0 6 x 1 5/ 39 -4 0 ; 6 3 ( H 8 1 0 6 = S . t b r d i h a p l o i d f r o m H o l l a n d ) ;

c l o n e 1 5 / 3 9 - 4 0 i s t h e c l o n e N o . 5 2 f r o m s e l f -f e r ti l iz i n g o f O P S 5 ; o r ig i n o f s e l f - c o m p a t i b l e p a -r e nt a l c l on e O P S 5 : F 1 L I 3 5 6 x ( B 1 6 x G 6 0 9 ) P 1 2 7 ;L I 3 5 6 = c h c C P C - 3 7 8 5 x y u n G L K - s 6 7 . 1 0 7 / 3 R ;B 1 6 , G 6 0 9 - d i h a p l o i d s o f S. tbr o f D u t c h o r i g in ;Z E L - 1 1 3 6 i s s u s c e p t i b l e t o P h . i n f e s t a n s , s c o r e d 2in 1 -9 grade sca le ; y u n = S, y u n g a s e n s eP l a n t m a t e r i a lT h e p l a n t s w e r e p r o p a g a te d i n v i t ro o n h o r m o n e -f r ee M S m e d i u m ( M u r a s h i g e & S k o o g 1 9 6 2) w i t h2 % s u c r o s e a n d 0 . 6 % a g a r . T h e f u l l y e x p a n d e dl e a v e s o f 3 - 4 w e e k - o l d p l a n t s w e r e e x c i s e d a n d p r e -c o n d i t i o n e d a c c o r d i n g t o H a b e r l a c h e t a l . ( 1 9 8 5 ) .C e l l s u s p e n s i o n s o f B z u r a c v . a n d H - 8 1 0 5 c l o n e ,w e r e c u l t u r e d f o r 5 - 7 d a y s in M S m e d i u m e n r i c h e dw i t h G a m b o r g v i t a m i n s l m g / m l , g l y c in e 2 m g /m l ,c a s e in h y d r o l y s a t e 0. 5 m g / m l , N A A 5 m g / m l, B A P0 ,1 m g / m l a n d 3 % s u c r o s e , a t 2 6 C a n d 1 0 0 r p m i nth e d a r k .P r o t o p l a s t i s o l a t i o nS u s p e n s i o n - c u l t u r e d c e l l s a n d t h e p r e c o n d i t i o n e dl e a v e s w e r e d i g e s t e d o v e r n i g h t i n t h e d a r k , i n K 4m e d i u m ( N a g y & M a l i g a 1 9 7 6 ) w i t h 1 . 6 % c d l u -l a s e O n o z u k a R - 1 0 a n d 0 . 6 % m a c e r o z y m e R - 1 0( s u s p e n s i o n c e l l s ) o r 0 . 4 % c e l l u l a s e a n d 0 . 2 %m a c e r o z y m e ( l e a v e s ) , a t 2 8 C ( s u s p e n s i o n c e l ls ) o r2 3 C ( l eav es ) . Fo l lo w in g th e ce l l wa l l d eg r ad a t io n ,th e p r o to p la s t s we r e p o u r ed th r o u g h s t ee l f i l t e r s o f7 4 g m o r 1 0 0 ~ m p o r e s i z e , a n d c e n t r i f u g e d a t 8 0 gf o r 1 5 m i n i n M P W - 3 4 0 c e n t r i f u g e w i t h 1 m l W 5( M e n c z e l e t a l . 1 9 8 1 ) ap p l i ed to th e to p o f su sp en -s i on . P r o t o p l a s t s w e r e c o l l e c t e d f r o m K 4 / W 5 i n t e r-p h a s e a n d s u s p e n d e d i n W 5 m c d i u m .P r o t o p l a s t c u l t u r eThe c o m p o s i t i o n o f t h e m e d i a u s e d i s g iv e n i n th et ab le . L iq u id m ed ia w er e s t e r i l i z ed b y f il t r a ti o nth r o u g h 0 .2 t am f i l t e r . Ag a r m ed ia wer e au to c lav edat 121 C for 15 min . Fi l te r - s ter i l ized v i tamins andh o r m o n e s w e r e a d d e d t o a g a r m e d i a a f t e r a u t o c l a v -i n g . T h e S K M m e d i u m ( H u n t & H e l g e s o n 1 9 8 9 )w a s f o u n d t o b e t he m o s t e f f e c t i v e w h e n u s e d a c -c o r d i n g t o t h e p r o t o c o l o f A u s t i n e t a l . (1993[) .B r i e f ly , t h e p r o t o p I a s ts w e r e c u l t u r e d f o r 3 -5 d a y si n l i q u i d S K M m e d i u m w i t h o u t B S A , w i t h t w o5 0 % d i l u t i o n s w i t h f r e s h S K M m e d i u m o n t h e 1 s t

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REGENERATION OF SOLANUM PROTOPLASTS

Table. Composit ion of the media usedM e d i a c o m p o n e n t s K 4 M S S K M C u l M S R 1 . _ _ M S R 2 _..__Mac(0 elements (m_~/1 final concentra tion) . . . . . . . . . _.KNO~ 2500 1900 1900 1900 1900 1900NHqNOa 250 1650 825 1650CaCI2x2H20 900 440 600 440 44{) 44(}MgSOax7H20 250 370 350 370 370 37(.I(NIG}2SO4 250K HaPO4 170 680 170 170 170NaH2POax]-]20 1~(KCI 3{}0NH4C1 107 . . . . . . ._Micro eleme.nt_s (mg/l final concentration}Na2EDTA 37.3 37,3 37,3 18,64 37,3 37,3FeSOax7H20 27,8 27,8 27,8 13,94 27,8 27,8HaBOa 3 6,2 3 3,1 6,2 6,2KJ 0,75 0.83 0,75 0,42 0.83 0,83MnSO~xH20 10 I6.9 10 8.45 16,9 16.9ZnSO4x7H20 2 8,6 2 4,3 8,6 8,6CuSO4x5H20 0,025 (},{)25 (/,025 (},013 0.{t25 I),(}25NazMoO4x2HzO 0.25 {/,25 0,25 0,13 0.25 0,25C.oCtzx6tt,O . . . . . . . . 0,(}25 0,025 0.025 ~ {},013 0,(.}25 _._ (~,025 . . . . .Qarboh~drates~/1 t~inal concentration}Sucrosc 136,92 30 10 2,5 2,5 10Glucose 10IVlannitol 40 54,7 35Sorbitol 0,25Celh}biosc 0,25Fructose 025Mannose (},25Rhamnose 0,25Ribose 0,25Xylose 0.25 0.25~Wo-Im}sitol . . . . . . . . . . {}_.1. . . . 0,1 . . . . 0.05 0,1 0, Iyitamins~/1 linal concentration)

(},1Pyridoxinc HC1 1 {),5 0,5 1),5Thiamine HCI 10 0,1 2 {},5Nicotinic acid 1 0,5 5 5Folio acid {).5D-Ca-Pantothenate (},5p-Aminobenzo ic acid 0,01Choline chloride 0,5P.iboflavin (), 1Ascorhic acid t 0,5 1Biotil k . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,005 {) ,{)5HpLmp_w.s~/1final concentration)

0,5 0,50,5 0,55 50.5 (}.5

0,05 {},{}5NAA (oc maphthaleneacetic acid} 1 5 1 0. IgAP (6-ben zylamin opurin e) 0.2 0,25 (}.4 0.5 0,5GA~ (gibberellic acid) 0,5IAA (indole-3-acetic acid} 0,1Kinetin (6 furfurylaminop urine) 0.5*rons-Zeatin 1 2_Other 9rgan!c~..(~pg~ fijml c_'5?m~entratkm)........................................................................................Glycine 2 2Casein hydrolysate 50{) 250 100 100L-Glutamine /46,2Adenine sulfate 40 4(} 40Cocon ut water, ml/l 22p H 5,8 5,8 5,6 ~,8 ........................ _5, 8

0~0252

2

10 0146,240

5,8

5

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an d 4 th d a y a f t e r i so l a t io n . O n th e 4 th o r 5 th d ay , t h ec u l t u re s w e r e s o l i d i f i e d w i t h 0. 5 % S e a P l a q u e a g a -r o s e a n d fu r t he r c u l t u re d o n S K M + 1 % B S A + 0 . 8 %a g a r l a y e r f o r a t l e a s t 2 w e e k s a t 2 6 C ( l s t w e e k i nt h e d a rk , 2 n d w e e k i n w e a k l i g h t) . C a l l i o f a b o u tl m m i n d i a m e t e r w e r e t r a n s f e r r e d t o t h e c u l t u r e( C u l ) m e d i u m ( H a b e r l a c h et al. 1 9 8 5 ) f o r g r o w t ha n d g r e e n i n g f o r 2 -3 w e e k s .Plant regenerationT h e g r e e n c a l l i o f 3 - 4 m m i n d ia m e t e r w e r e t r an s -f er re d to M S R 1 m e d i u m ( S A 4 m e d i u m o f A u s t in etal. 1 9 9 3 ) f o r sh o o t i n i t i a t i o n . Af t e r 2 week s , t h ec a l li w e r e t r a n s f e r r e d t o M S R 2 m e d i u m w i t h 2 r ag /1t - zea t in an d 2 m g /1 GA 3 , f o r sh o o t e lo n g a t io n . Th ed i f f e r en t i a t in g ca l l i we r e in cu b a ted a t 2 2 /1 9 Ca n d a 1 6 h / 8 h d a y / n i g h t c y c l e w i t h i l l u m i n a t i o n o f150 btE.m-2.s -l .

Re s u l t s

Protoplast culturingO n a v e r a g e , t h e p r o t o p l a s t y ie l d r a n g e d f r o m 0 . 5 x1 06 to 1 .5 x 1 06 p e r g f r e sh w e ig h t o f l eav es o rsu sp en s io n - cu l tu r ed ce l l s . Af t e r p l a t in g a t an in i t i a ld en s i ty o f ab o u t 1 0 5 p r o to p la s t s .m 1 - 1 an d tw o f eed -i n g 5 0 % d i l u t i o n s w i t h S K M ( - B S A ) m e d i u m ( o nt h e f o l l o w i n g d a y a n d o n t h e 4 t h d a y a f t e r i s o l a -t i o n ) , t h e p r o to p la s t s s t a r t ed to d iv id e in 3 - 4 d ay sa n d i n 8 - 1 0 d a y s t h e m u l t i c e l l u l a r c o l o n i e s w e r ef o r m e d . T h e c o l o n i e s w e r e f o r m e d b o t h i n l i q u i da n d s e m i - s o l i d m e d i u m , t h o u g h i n t h e l a t t e r t h ec e l ls w e r e m o r e u n i f o r m a n d w h i t e . I n f a s t g r o w i n gc u l tu r e s o v e r c r o w d i n g a n d s u c c e s s i v e b r o w n i n g o fc o l o n i e s o c c u r r e d . A p o s i t i v e e f f e c t o f a d d i ti o n a ld i lu t io n a t r a t io s 1 :3 an d 1 :6 im m ed ia t e ly b e f o r e so -l id i f i ca t io n , was f o u n d . Th e d i lu t ed an d so l id i f i edc e l l c l u s t e r s g r e w f a s t e r a n d r e m a i n e d w h i t e w i t ht h e e x c e p t i o n o f S. blb m i c r o c a l l i w h i c h t u r n e d t a n -n i sh o n s o l i d if i e d S K M m e d i u m .Callus growth and shoot productionW h e n t h e le a f p r o t o p l a s t- d e r i v e d m i c r o c a ll i w e r et r a n s f en ' e d t o s o li d m e d i u m f o r s u c c e s s i v e g r o w t h ,th e th r ee Solarium s p e c i e s r e a c t e d d i f f e r e nt l y . M o s to f t h e S. bib c a ll i o n C u l m e d i u m b e c a m e b r o w n a n dc e a s e d g r o w t h . C a l l i t h a t w e r e n o t c o m p l e t e l y

b r o w n w e r e s u c c e s s i v e l y t ra n s f e r r e d t o s h o o t in i ti a -t i o n a n d e l o n g a t i o n m e d i a ( M S R 1 a n d M S R 2 , r e -s p e c t i v e l y ) b u t n o g r e e n i n g a n d s h o o t i n it ia t io n w a so b s e r v e d i n m o r e t h a n 3 0 0 c a l l i te s t e d ( F i g, 1 A ). B yco n t r a s t , t h e ca l l i o f p o ta to c lo n es , a s w e l l a s o f S.ngr, c o n t i n u e d t o e n l a r g e i n s e m i - s o l i d S K M m e -d i u m , g r e e n e d o n C u l m e d i u m , p r o d u c e d s h o o tm e r i s t e m s o n s h o o t in i ti a ti o n m e d i u m M S R 1 a n dd i s t in c t s h o o t s i n 3 - 4 w e e k s a f t e r t r an s f e r t o s h o o te l o n g a t i o n m e d i u m M S R 2 ( F i g. 1 B - E ) . S h o o t e l o n -g a t i o n w a s h a m p e r e d o n l y i n S. ngr L. ca l l i (Fig .1 F) , wh i l e a s ig n i f i can t p a r t o f sh o o t s i n a l l t h e p o -t a t o c l o n e s a n d S. ngr vat . gigantea g r e w l o n ge n o u g h t o b e d e t a c h e d f o r r o o t i n g . A n i n c r e a s e i ns h o o t r e g e n e r a t i o n w a s o b t a i n e d w h e n t h e s u c r o s ec o n c e n t ra t i on i n M S R 2 w a s r e d u c e d f r o m 2 % t o1 % . A c c o r d in g t o M a s s o n et al. ( 1 9 8 7 ) , a su c r o seco n c en t r a t io n g r ea t e r t h an 1 0 g -I q en h an ced th ec a l l u s g r o w t h b u t w a s d e t r i m e n t a l t o r e g e n e r a t i o na n d s h o o t f o r m a t i o n .C a l l u s g r o w t h d y n a m i c s a n d s h o o t i n g p o t e n t i a lv a r i e d f o r d i f f e r e n t Solanum g e n o t y p e s . T h en u m b e r o f s h o o t s i n i n d i v i d u a l l e a f p r o to p l a s t-d e r iv ed ca l lu s r an g ed f r o m 1 to m o r e th an 1 0 . Th ew i d e r a n g e o f s h o o t m o r p h o l o g y w a s a l s o o b -F i g . 1 ( A - F ) . M e s o p h y l l p r o t o p l a s t - d e r i v e d c a l l i o n s h o o t e l o n -g a t i o n m e d i u m ( M S R 2 ) . F i r s t s h o o t i n i t ia l s w e r e n o t i c e d i n 1 0w e e k s ( E ) , 1 2 w e e k s ( C , D , F ) a n d 1 6 w e e k s ( B , w i t h o u t s o l id i -f i c a t i o n ) a f t e r p r o t o p l a s t i s o l a t i o n , w h i l e n o s h o o t m o r p h o -g e n e s i s o c c u r r e d i n ( A ) . B a r s = 1 c m .F i g . 2 . S u s p e n s i o n c e l l p r o t o p l a s t - d e r i v e d c a l l i o n s h o o t e l o n -g a t i o n m e d i u m ( M S R 2 ) a f t e r 7 w e e k s ( B z u r a ) a n d 1 1 w e e k s( H - 8 1 0 5 ) o f c u l t u ri n g w i t h ( +s d ) o r w i t h o u t ( - s d) a s o l id i f i c a -t i o n s t e p . T h e p o s i t i v e e f f e c t o f s o l i d i f i c a t i o n o n r e g e n e r a t i o no f B z u r a c a l l i is e v i d e n t . B a r s = I c m .F i g . 3 . P l a n t s r e g e n e r a t e df r o m m e s o p h y l l p r o to -p l a s t s o f B z u r a , H - 8 1 0 5 ,Z E L - 1 1 3 6 a n d S. nigrumva t . gigantea.

Fig . 1A [-F~g. 2

Fig. IB

Fig. 1C Fig. 3

Fig. ID

Fig. 1E

Fig. IF

6

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REGENERATION OF SOLANUM PROTOPLASTS

.........B zura ~

d: ,,~ A

)

S . n g r L . : i !i;i i i!~; i!~:~iilII~ F

~ ~ !i!i~i~iII

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A . S Z C Z E R B A K O W A , M . B O R K O W S K A & B. WIELGAT

s e r v e d . G e n e r a l l y , t h e s h o o t s f r o m d i h a p l o i dp r o t o p l a s t - d e r i v e d c a l l i w e r e l e s s v i g o r o u s t h a nt h o s e f r o m t e t ra p l o i d o r h e x a p l o i d p r o t o p l a s t -d e r i v e d c a l l i . N a m e l y , t h e s h o o t s o n H - 8 1 0 5 c a l l iw e r e m u l t i p l e b u t m o s t l y a b n o r m a l ( t h i n a n d l e a f -l e s s) . T h e c a l li o f Z E L - 1 13 6 , b r i g h t g r e e n i n c o l o rw i t h f u r t h e r b l e a c h i n g , w e r e t h e o n l y o n e s t h a t c o n -t in u e d t h ei r e n l a r g em e n t o n M S R 2 m e d i u m , t u rn e de x t r e m e l y s o f t a n d f r ia b l e , a n d p r o d u c e d s h o o t s a tr a t h e r l o w f r e q u e n c y . I n o t h e r w o r d s , Z E L - 1 1 3 6c a l li h a d a t e n d e n c y t o g r o w w i t h o u t r e d i f f er e n t i a -t io n . T h e l a r g e s t c a ll i o f Z E L - 1 1 3 6 a c h i e v e d c a .3 c m i n d i a m e t e r a n d d i d n o t r e g e n e r a t e . O n t h ec o n t r a r y , p r a c t i c a l l y a l l t h e B z u r a c a l l i p r o d u c e da b u n d a n t s h o o t s w i t h h e a v y p u r p l e p i g m e n t a t i o n ,l o n g i n t e r n o d e s , a n d p o o r l e a f d e v e l o p m e n t , a s c a nb e s e e n in F ig . l B . T h e m o s t v i g o r o u s c a l l i o f S . n g rvat . g i g a n t e a p r o d u c e d m a n y s h o o t s w i t h t h ic k e n e ds t e m s , s h o r t in t e r n o d e s , a n d w r i n k l e d , d a r k g r e en ,b r o a d l e a v e s ( F i g. 1 E ). T y p i c a l a b n o r m a l i t i e s o f S .n g r s h o o t s i n c l u d e d t h e l a c k o f c l e a r m a i n s t e m , d i s -to r t ed l eav es , an d , m o r e r a r e ly , a lb in i sm .I t w a s f o u n d t o b e u n t r u e t h a t l a r g e r c a l l i w o u l dy i e l d m o r e s h o o t s , a n d , m o r e o v e r , i n t h e c a s e o fZ E L - 1 1 3 6 t h e o p p o s it e e f f e c t w a s n o t i c e d . O n t h eo th e r h an d , t h e r e su r e ly w as a c r i t ic a l s i ze o f t h e ca l-l u s (n o t le s s t h a n 2 m m i n d i a m e t e r a f t e r t w o w e e k so f cu l t u r in g o n C u l m e d i u m ) t h a t s e e m e d t o b eo b l i g a t o r y f o r f u r t h e r s h o o t o r g a n o g e n e s i s . T o os m a l l , u n s u f f i c i e n t l y d e v e l o p e d c a l l i d i e d i n e v i t a -b l y a f te r t r a n s fe r f r o m C u l t o M S R 1 m e d i u m .A s f o r s u s p e n s i o n c e l l - d e ri v e d p r o t o p la s t s o fB z u r a , t h e s p r e a d i n g t r a n s l u c e n t c a l l i w e r e m o s t l yf o r m e d t h a t f a i l e d t o g r e e n o n C u l m e d i u m a n dt u rn e d b r o w n o n M S R 1 a n d M S R 2 m e d i a ( F ig . 2 A ,r i gh t p a r t) . T h o s e w e r e o u r f i r s t e x p e r i m e n t s o n p r o -t o p l a s t r e g e n e r a t i o n w h e n t h e p r o t o p l a s t c u l t u r e sw e r e n o t y e t s o l id i f i e d w i t h S e a P l a q u e a g a r o s e .W h e n a s o l id i f i c a t i o n s t e p w a s i n c l u d e d o n t h e4th-5th d a y a f t e r p r o t o p l a s t i s o l a t i o n , a f e w g r e e n ,g r a n u la r c a ll i w e r e p r o d u c e d o n M S R 1 / M S R 2 m e -d i a , t h o u g h n o s h o o t s w e r e d e v e l o p e d ( F i g. 1 A , l e f tp a r t ) . T h e s u s p e n s i o n c e l l - d e r i v e d p r o t o p l a s t s o fH - 8 1 0 5 f o r m e d t h e r e g e n er a t i v e t y p e o f c al li m o r ef r e q u e n t l y b u t t h e l a s t o n e s w e r e a l s o w i t h o u tsh o o t s ( F ig . 2 B ) .

R o o t i n gT h e t b r m a t i o n o f r o ot s w a s r o u t i n e l y in d u c e d b yp l a t i n g s h o o t c u t t i n g s o n h o r m o n e - f r e e m e d i u mwi th 0 .6 % ag a r ( N eh l s 1 9 7 8 ) . Fo r b e t t e r r o o t in g ,t h e p e r c e n t a g e o f s u c r o s e w a s a g a i n i n c r e a se d u p t o2 % . T h e t e m p e r a t u r e o f 2 5 C w a s f o u n d t o b e o p ti -m a l f o r r o o t in g , wh i l e a t 2 2 /1 8 C cy c le t h e r o o tf o r m a t i o n w a s i n h i b i t e d . M o r p h o l o g i c a l l y n o r m a ls h o o t s ~ b r m e d r o o t s i n 2 -3 w e e k s ( F i g . 3 ) , b u t s o m es h o o t s f o r m e d c a l l i i n s t e a d o f r o o t s , o r f o rm e d b o t h .I n s u c h c a s e s , t h e s h o o t s w e r e o n c e m o r e d e t a c h e da n d r e r o o t e d , o f t e n w i t h s u c c e s s . S h o o t s w i t hg r o s s l y a b n o r m a l a p p e a r a n c e u s u a l l y f a i l ed to r o o t( s e e a l s o A u s t i n e t a l . 1 9 8 6 ). T h o s e a b e r ra n t f o r m so f r e g e n e r a t e d p l a n t s t h a t s u c c e d e d i n ro o t in g , o f t e nr e c o v e r e d a n o r m a l h a b i t a t a f t e r f u r t h e r p a s s a g e s( s i m i l ar l y t o o b s e r v a t i o n s o f S i h a c h a k r & D u c r e u x1987) .

DiscussionT h e m e d i a f o r p r o t o p l a s t c u l t u ri n g a n d r e g e n e ra -t i o n a re u s u a l l y b a s e d o n c o m p o s i t i o n s p r o p o s e d b yK a o a n d M i c h a y l u k ( 1 9 7 5 ) t h o u g h m a n y v a r i o u sm o d i f i c a t i o n s w e r e l a t e r in t r o d u c e d b y d i f fe r e n t r c -s e a r c h g r o u p s . O u r o w n e x p e r i e n c e c o n f i r m e d t h en e c e s s i t y o f t h e f o l l o w i n g s t e p s i n t h e p ro t o c o l f o rs u c c e s s f u l p r o t o p l a s t r e g e n e r a t i o n o f th e s t u d ie dg e n o t y p e s . ( 1 ) T h e p r e c o n d i t i o n i n g o f i n v i t r og r o w n l e a v e s a c co r d i n g t o H a b e r l a c h e t a I. ( 1 985 )was e ssen t i a l f o r v i ab i l i t y o f i so l a t ed p r o to p la s t s .( 2) T h e c o n d i t i o n s o f p r o t o p l a s t i s o la t i o n ( e n z y m ec o n c e n t r a t i o n , t e m p e r a t u r e , a n d d u r a ti o n o f d i g e s -t i on ) s h o u l d b e s e l e c t e d i n d i v i d u a l l y f o r e a c h u s e dl in e o r sp ec ie s . ( 3 ) Th e in i ti a l d e n s i ty o f 1 0 5 p r o to -p l a s t s p e r m l p r o m o t e d t h e o n s e t o f ce l l d i v i si o n s ,wh i l e t h e f eed in g d i lu t io n s u p to th e f in a l d en s i ty o f1 0 4 p r o to p la s t s p e r m l h e lp ed to av o id th e f u r th e rb r o w n i n g o f c e ll c o l o n i e s c a u s e d b y t h e ir o v e r -c r o w d i n g . S u c h a d il u t io n b e f o r e p l a t in g c o u l d ,h o w e v e r , b e d e t r i m e n t a l i n t h e c a s e o f p r ot o p l a st sw i t h l o w p l a t in g e f f i c i e n c y ( i .e . l o w d i v i s i o n c a p a c -i t y) . ( 4 ) T h e g r o w i n g o f c e l l a g g r e g a t e s i n s o l i d i fi e d( s o f t ) m e d i u m w a s c r u c i a l f o r m i c r o c a l l i f o r m a t io n .A s i n a s t u d y o f B o k e l m a n n & R o e s t ( 1 9 8 3 ), t h e c e lla g g r e g a t e s d i d n o t s u r v i v e i f t h e y w e r e t r a n s fe r r e dd i r e c t l y f r o m t h e l i q u i d c u l t u r e m e d i u m ( e i t h e rK M - 8 p o r S K M ) t o s o li d M S m e d i u m . S e m i - so l id

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R E G E NE R A T I O N O F S O L A NU M P R O T O P LA S TS

m e d i u m p r o b a b l y f i x es t h e l o c a t i o n o f c el l a g g re -g a t e s t h u s a f fec t i n g t h e i r fu tu re d i f fe ren t i a t i o n . Ino u r e x p e r i m e n t s o n l y S . n g r var. g i g a n t e a cal l i re -g e n e r a t e d a f t e r d i re c t t r a n s f e r f r o m l i q u id K 3 m e -d i u m ( N a g y & M a l i g a 1 9 7 6 ) t o s o li d r e g e n e r a t i o nm e d i u m . ( 5 ) T h e m i c r o c a l l i tr a n s f e r r e d t o C u l m e -d i u m c o u l d g r o w a n d g r e e n a t c o n t i n u o u s w e a kl i g h t an d t em p era tu re 2 5 C , b u t fu ll t r an s fo rm a t io nin to reg en e ra t i v e t y p e o f ca l l u s an d sh o o t i n i t ia t i o no n M S R 1 m e d i u m o c c u r r e d o n ly a f te r lo w e r i n g t het em p era tu r e t o 22 '7 1 8 C d ay /n ig h t cy c l e , Bo th v i -t a l it y an d s i ze o f t h e ca l l i we re im p o r t an t fac to rs fo rs u c c e s s f u l r e g e n e r a t i o n ( s e e a l s o B o e h m e r e t a l .1 9 9 5 , / ' o r p ro to p l a s t -d e r i v ed p ea ca l l u s ) . Th e ca l l is m a l l e r t h a n l m m ( a s m o s t o f S . b l b cal l i ) fa i led tod e v e l o p f u r t h e r o n C u l m e d i u m , t u rn e d b r o w n , a n ddied .T h e w i l d p r o to c l o n e s u s e d i n f u s io n c o m b i n a t i o n sb y o t h e r a u t h o r s u s u a l l y d i d n o t r e g e n e r a t e t h e m -s e l v e s u n d c r c u l t u r e c o n d i t i o n s . A u s t i n e t a l . (19861)o b s e r v e d o n l y t h r e e s h o o t i n g c a l li o f S . b l b p e r s e v -c ra l t h o u san d s cu l t u red . Th e p ro to p l a s t s o f S . p i n -n a t i s e c t u m ( S. p n t ) f a i le d e v e n t o d i v i d e s u s t a i n a b ly( S i d o r o v e t a l . 1 9 8 7 ) . A l s o H u n t & H e l g e s o n(1 9 8 9 ) a s we l l as M en k e e t a l . ( 1 9 9 6 ) f o u n d S . p n t tob e a reca l c i t ran t sp ec i e s i n re sp ec t to p ro to p l a s t cu l -t u re a n d p l a n t r e g e n e r a t i o n . T h e s a m e w a s t r u e f o rS . b r e v i d e n s Ph i l . (Ro k k a e t a l . 1994) and for a d i -h a p l o id c l o n e o f S . a c a u l e , a Pe ru v i an sp ec i c s (Ya-m a d a e t a l . 1 99 7) . Th e p ro to c lo n e s o f S . p n t an d S .t b r ( d i h a p lo i d s ) d i d n o t r e g e n e r a t e e v e n a f t e r s c lf f u -s i o n (Ward e t a l . 1 9 9 4 ). Th e S. tbr p a ren t s se l ec t edfo r h y b r id i za t i o n a l so d id n o t reg en e ra t e i n t h es t ud y o f R o k k a e t a l . (1 9 9 4 ) . O n t h e o th e r h an d , t h ein ab i l it y o f t h e p a ren t a l p ro to p l a s t s t o p ro d u ce ca l l ian d t o reg en e ra t e , u su a l l y fav o u red t h e i n i ti a l s e l ec -t i o n o f th e i r so ma t i c h y b r id s .A s f o r p r o t o p l a s t s i s o l a t e d f r o m t h e c e l l s u s p e n -s io n s , t h e i r p l a t i n g e f f i c i en cy ( i . e . d iv i s i o n f re -q u e n c y ) c o u l d b e h i g h e r t h a n t h e p l a ti n g e f f i c i e n c yo f m e s o p h y l l p r o t o p la s t s, d u e t o th e p r e v i o u s a d a p -t a t i o n t o c u l t u r e c o n d i t i o n s , a s s h o w n b y A n j u m(1 9 9 8 ) fo r two p o t a to cu l t i v a rs . Nev e r th e l e s s , t h eca l li d e r i v ed f i ' o m m eso p h y l l p ro to p l a s ts d i f fe ren t i -a t e d t w o w e e k s e a r l i e r t h a n t h o s e f r o m s u s p e n s i o nce l l p ro to p l a s t s , a s sh o wn b y t h e sam e au th o r . In o u rcase , t h e su sp en s io n ce l l -d e r i v ed p ro to p l a s t s o fb o th d ih ap lo id H-8 1 0 5 c lo n e an d t e t rap lo id Bzu ra

cv . a l so seemed t o s t a r t d iv i s i o n ea r l i e r an d wi thh i g h e r f r e q u e n c y t h a n t h e m e s o p h y l l p r o t o p l a s t s .B u t o n l y t h e H - 8 1 0 5 p r o t o c t o n e p r o d u c e d s i g n if i -c a n t n u m b e r o f c a l l i o f r e g e n e r a t i v e t y p e : g r e e n ,t i g h t , wi th sh o o t i n i t i a l s , wh ich , h o wev e r , d id n o td e v e l o p i n t o n o r m a l s h o o t s . T h e c a p a c i t y f o r o r -g a n o g e n e s i s w a s c e r t a i n l y r e d u c e d d u r i n g p r o -l o n g e d c u l t u r i n g o f t h e c e l l s i n l i q u i d m e d i u m ,t h o u g h i t was s t i l l ex p resse d a t lea s t i n H-8 1 0 5 p ro -t o c l o n e t o a c o n s i d e r a b l e e x t e n t . T h e e l o n g a t c ds h o o t s c o u l d p r o b a b l y b e o b s e r v e d i f l a r g e r p o p u l a -t i o n o f H - 8 1 0 5 c a l l i w a s s c r e e n e d . A s f o r B z u r a c v .,t h e d o m i n a t i n g s p r e a d i n g , a m o r p h o u s , t r a n s l u c e n tca l l i d e r i v ed f ro m i t s su sp en s io n -ce l l p ro to p l a s t s ,re s t r i c t ed t h e p o ss ib i l it y o f u sag e o f th i s p ro to c lo n ea s a r e c i p ie n t o f w i l d p a r t n e r ' s g e n o m e i n f u s i o n e x -p e r i m e n t s . C o n c u r r e n t l y , t h e a d v a n c e d r e g e n e r a -t i o n o f H-8 1 0 5 su sp en s io n ce l l p ro to p l a s t s i n d i -c a t e d t h e i r p o s s ib l e u s e f u l n e s s l b r s o m a t i c h y b r i d i -z a t io n , s i n c e t h e y w o u l d e n a b l e t h e e a r l y s e l e c t i o no f i n t e r s p e c i f ic f u s a n t s w i t h m e s o p h y l l p r o t o p l as t so f w i l d s p e c i e s b y t h e i r i n t e r m e d i a t e m o r p h o l o g y .T h e e v i d e n t d i f f c r e n c e i n v i g o u r w a s o b s e r v e d b e -t w e e n t h e r e g e n e r a n t s f r o m t h e m e s o p h y l l p r o t o -p l a s t s o f d ih ap lo id p o t a to l i n e s an d t h e i r co u n t e r -p a r ts f r o m i n v i t r o cu l t u re s : t h e p ro to p l a s t -d e r i v edp l a n ts w e r e w e a k e r a n d t h e i r r o o t i n g la s t e d lo n g e r( a b o u t t w o w e e k s i n s t e a d o f o n e f o r n o r m a l l yp r o p a g a t e d p l a n ts ) . T h o s e d i f f c r e n c e s w e r e n o t s on o t i c e a b l e i n B z u r a p r o t o p l a s t - d e r i v e d p l a n t s ,w h i l e t h e p r o t o p l a s t - d e r i v e d r e g c n e r a n t s o f S . n i g -r u m w e r e a s v i g o r o u s a s i n v i t ro cu l t u re d p lan t s an dr o o t e d r a p i d l y ( i n a w e e k ) o n c o n d i t i o n t h a t th e e x -c i s e d s h o o t s h a d n o r m a l m o r p h o l o g y . S h o o t s w i t hg r o s s l y a b n o r m a l a p p e a r a n c e u s u a l l y f a il e d to r o o t( see a l so Au s t i n e t a l . 1 9 86 ) . T h e a b e r r a n t f o r m s o fr e g e n e r a t e d p la n t s t h a t s u c c e e d e d i n r o o ti n g , o f t e nr e c o v e r e d a n o r m a l h a b it a t ( S i h a c h a k r & D u c r e u x ,1 9 87 } . We a l so n o t i ced t h e s t ab i l i za t i o n o f t h e n o r -m a l s h o o t p h e n o t y p e s a f t e r s e v e r a l p r o p a g a t i o n s .Th u s , t h e te t rap lo id p o t a to l i n e an d h ex ap lo id wi lds p e c i e s d i d n o t l o s e t h e c a p a c i t y f o r o r g a n o g e n e s i sd u r in g p ro to p l a s t i so l a t i o n an d cu l t u r i n g , wh i l e t h isc a p a c i t y w a s r e d u c e d a n d e v e n c o m p l e t e l y l o s t i ncase o f t h e s tu d i ed d ih ap lo id p o t a to l i n e s an d wi ldS. b lb sp ec i e s , r e sp ec t i v e ly .T h e d e m o n s t r a t e d d i f f e r e nc e s in r e g e n e r a t io n o fp r o t o p la s t s i s o l a te d b o t h f r o m l e a f m e s o p h y l l a n d

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8/7/2019 protoplasti cartof

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A . S Z C Z E R B A K O W A . M . B O R K O W S K A & B . W I E L G A T:: :: ~:. ~. :: : =======================================================. ,

s u s p e n s i o n c e l l s o f t h r e e p o t a t o l i n e s a n d t w o r e -l a t e d w i l d S o l a n u m s p e c i e s , S . b i b a n d S . ngr , c o u l db e c r i t ic a l f o r s u c c e s s i n i n t e r s p e c i f i c h y b r i d i z a t i o nb e t w e e n t h e m . W e c o n s i d e r t h e p r e s e n t e d d a t a a s ab a s e l i n e f o r f u r t h e r s t u d y o f t h e v a l u e o f t h o s e l in e sa s p a r t n e r s in p r o t o p l a s t - f u s i o n e x p e r i m e n t s ,

A c k n o w l e d g e m e n t sThe authors are grateful to Prof. J. Jakubiec and M. Sc. AnnaPawetczak (Warsaw Agricultural University) fo r the axenicshoot cultures of S . bu l bocas t am an , H-8105 and ZEL-1136clones of S. tuberosum, as well as the seeds of S. nigrum L., toBonin and Mtoch6w Research Centers (IHAR, Poland) forBzura cv. and the seeds of S. nigrum var. gigantea. We alsothank M. Sc. L. Laskowski for the photographic plates andProf. L.D. Wasilewska for the critical reading of the manu-script. This work was supported in part by a grant from theState Committee for Scientific Research (KBN) No. 6 PO4B021 12.

R e f e r e n c e sA n j u m M . A . 1 9 9 8 . E f f e c t o f p r o t o p l a st s o u r c e a n d m e -d i a o n g r o w t h a n d r e g e n e r a b i l i t y o f p r o t o p l a s t - d e r i v e dc a l l u s e s o f S o l a n u m t u b e r o s u m L. Acta Phys io l . P lan t . ,20 : 129-133.A u s t i n S . , E h l e n f e l d t M . K . , B a e r M . A . , H e l g e s o nJ . P . 1 9 8 6. S o m a t i c h y b r i d s p r o d u c e d b y p r o t o p l a s t f u -s i o n b e t w e e n S . t u b e r o s u m an d S . b r e v i d e n s : p h e n o t y p i cv a r i a t i o n u n d e r f i e l d c o n d i t i o n s . T h e o r . A p p l . G e n e t . ,71 : 682-690.A u s t i n S ., P o h l m a n J . D . , B r o w n C . R . , M o j t a h e d i H . ,S a n t o G . S . , D o u c h e s D . S . , H e l g e s o n J . P . 1993. In te r -s p e c i f i c s o m a t i c h y b r i d i z a t i o n b e t w e e n S o l a n u m t u b e ro -s u m L. . and S . b u l b o c a s t a n u m D u n . a s a m e a n s o f t r an s -f e r r in g n e m a t o d e r e s i s t a n c e . A m . P o t a t o J ., 7 0 : 4 8 5 - 4 9 5 .B o e h m e r P . , M e y e r B . , J a c o b s e n H . -J . 1 9 9 5 .T h i d i a z u r o n - in d u c e d h i g h f r e q u e n c y o f s h o o t i n d u c ti o na n d p l a n t r e g e n e r a t i o n i n p r o t o p l a s t d e r i v e d p e a c a l l u s .P lan t Ce l l Rep. , 15 : 26-29 .B o k e l m a n n G . S . , R o e s t S . 1 9 8 3 . P l a n t r e g e n e r a t i o nf r o m p r o t o p l a s t s o f p o t a t o ( S o l a n u m t u b e r o s u mcv .B in t j e ) . Z . P f l anzenphys io l . , 109: 259-265.H a b e r l a c h G . T . , C o h e n B . A . , B a e r M . A . , T o w i l l L . E .H e l g e s o n J . P . 1 9 8 5 . I s o l a t i o n , c u lt u r e a n d r e g e n e r a t i o no f p r o t o p l a s t s f r o m p o t a t o a n d s e v e r a l r e l a te d S o l a n u mspec ies . P lan t Sc i . , 39 : 67-74 .H o r s m a n K . , B e r g e r v o e t J . E . M . , J a c o b s e n E . 1 9 9 7 .S o m a t i c h y b r i d i z a t io n b e t w e e n S o l a n u m t u b e r o s u m an ds p e c i e s o f t h e S . n i g r u m c o m p l e x : S e l e c t i o n o f v i g o r -o u s l y g r o w i n g a n d f l o w e r i n g p l a n t s . E u p h y t i c a , 9 6 :345 -352.

H u n t G . J ., H e l g e s o n J . P . 1 9 8 9 . A m e d i u m a n d si ln p l i-f l e d p r o c e d u r e f o r g r o w i n g s i n g l e c e l l s f r o m S o l a r i u ms p e c i es . P l a n t S ci . , 6 0 : 2 5 1 - 2 5 7 .K a o K . N . , M i c h a y l u k M . R . 1 9 7 5 . N u t r i t i o n a l r e q u i r e -m e n t s f o r g r o w t h o f V i c i a h a j a s t a n a ce l l s and pro to-p l a s t s a t a v e r y l o w p o p u l a t i o n d e n s i t y i n l iq u i d m e d i a .P lanta , 126: 105-110.M a s s o n J . , L e c e r f M . , R o u s s e l l e P . , P e r e n n e c P . , P e l -let ier G , 1 9 8 7 . P l a n t r e g e n e r a t i o n f r o m p r o t o p l a s ts o fd i p l o i d p o t a t o d e r i v e d f r o m c r o s s e s o f S o l a n u m t u b e r o -s u m w i t h w i l d S o l a n u m spec ies . Plant Sci . , 53: 167-176.M e n c z e l L . , N a g y F . , K i ss Z . R . , M a l i g a P . 1981. Strep-t o l n y c i n r e s is t a n t a n d s e n s i t i v e s o m a t i c h y b r i d s o f N i c o -t i a n a ta b a c u m + N i c o t i a n a k n i g h t i a n a : Corre la t ion of re -s i s t ance to N . t a b a c u m plas t ids . Theo r . App l . Gene t . , 59 :191-195.M e n k e U . , S c h i l d e - R e n t s c h l e r L . , R u o s s B . , Z a n k eC . , H e m l e b e n V . , N i n n e m a n n H . 1 9 9 6 . S o m a t i c h y -b r i d s b e t w e e n t h e c u l t i v a t e d p o t a t o S o l a n u m t u b e r o su mL . a n d t h e 1 E B N w i l d s p e c i e s S o l a n u m p i n n a t i s e c t u mD u n . : m o r p h o l o g i c a l a n d m o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n .T h e o r . A p p l . G e n e t . , 9 2 : 6 1 7 - 6 2 6 .M u r a s h i g e T . , S k o o g F . 1 9 6 2 . A r e v i s e d m e d i u m f o rr a p i d g r o w t h a n d b i o a s s a y s w i t h t o b a c c o t i s su e c u lt u r e .Phys io l . P lan t . , 15 : 473-497.N a g y J . I . , M a l i g a P. 1976. Ca l lus induc t ion and p lan tr e g e n e r a t i o n f r o m m e s o p h y l l p r o t o p l a s t s o f N i c o t i a n as y l v e s t r i s . Z . P f l a n z e n p h y s i o l . , 7 8 : 4 5 3 - 4 5 5 .N e h l s R . 1 9 7 8 . I s o l a t i o n a n d r e g e n e r a t i o n o f p r o t o p l a s t sf r o m S o l a n u m n i g r u m L. P lant Sc i . L e t t . , 12: 183-187.R o k k a V . M . , X u Y . S . , K a n k i l a J . , K u u s e l a A . , P u l l iS . , P e h u E . 1 9 9 4 . I d e n t i f i c a t io n o f s o m a t i c h y b r id s o ddihaplo id S o l a n u m t u b e r o s u m l i nes and S . b r e v i d e n s b ys p e c i e s s p e c i f i c R A P D p a t t e r n s a n d a s s e s s m e n t o f d e -s e a s e r e s is t a n c e o f t h e h y b r i d s . E u p h y t i c a , 8 0 : 2 0 7 - 2 1 7 .S i d o r o v V .A . , Z u b k o M . K . , K u c h k o A . A . , K o m a r n i t-s k y I . K . , G l e b a Y . Y . 1 9 8 7 . S o m a t i c h y b r i d i z a ti o n in p o -t a to : use of y- i r rad ia ted p ro top las t s of S o l a n u m p i n n a t i -s e c t u m i n g e n e t i c r e c o n s t r u c t i o n . T h e o r . A p p l . G e n e t .74: 364-368.S i h a c h a k r D . , D u c r e u x G . 1 9 8 7 V a r i a t i o n s o l " m o r p h o -g e n e t i c b e h a v i o r a n d p l a n t r e g e n e r a t i o n i n cu l tu r e d p r o -toplas t s of S o l a n u m n i g r u m . P l a n t S c i. , 5 2 : 1 1 7 - 1 2 6 .W a r d A . C . , P h e l p s t e a d J . . S t - J . , G l e a d l e A . E . , B l a c k -h a l l N . W . , C o o p e r - B l a n d S . , K u m a r A . , P o w e l l W . ,P o w e r J . B . , D a v e y M . R . 1 9 9 4 . I n t e r s p e c if i c s o m a t i ch y b r i d s b e t w e e n d i h a p l o i d S o l a n u m t u b e r o s u m L. andthe wi ld spec ies , S . p i n n a t i s e c t u m Dun . J . Exp. Bot . , 45 :1 4 3 3 - 1 4 4 0 .Y a m a d a T . , M i s o o S . , I s h i i T . , I t o Y . , T a k a o k a K . ,K a m i j i m a O . 1 9 9 7 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f s o m a t i c h y b r id sb e t w e e n t e t r a p l o id S o l a n u m t u b e r o s u m L. and d ihaplo idS . a c a u l e . B r e e d i n g S c i . , 4 7 : 2 2 9 - 2 3 6 .

Received July 06, 1999; accepted O ctober 26, 1999

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