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Tesis de Posgrado

Proteínas G asociadas a sistemasProteínas G asociadas a sistemasde fototransducciónde fototransducción

Muschietti, Jorge P.

1991

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Muschietti, Jorge P.. (1991). Proteínas G asociadas a sistemas de fototransducción. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2411_Muschietti.pdf

Cita tipo Chicago:Muschietti, Jorge P.. "Proteínas G asociadas a sistemas de fototransducción". Tesis de Doctor.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1991.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2411_Muschietti.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

PROTEINAS G

ASOCIADAS A SISTEMAS DE FOTOTRANSDUCCION

Autor: JORGE P. MUSCHIETTI

Directora: Dra. MIRTHA M. FLAWIA

Lugar de trabajo:

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN INGENIERIA GENETICA

Y BIOLOGIA MOLECULAR - INGEBI

TESIS PARA OPTAR AL TITULO DE

DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICAS l ¿IA/I

1991

A mi mejor madre

A mis amigos

Es preciso que nos entendamos.Yo hablo de algo seguro y de algo posible.

Seguro es que todos comany vivan dignamentey es posible saber algun diamuchas cosas que hoy ignoramos­Entonces, es necesario que esto cambie.

El carpintero ha hecho esta mesaverdaderamente perfectadonde se inclina la niña doraday el celeste padre rezonga­Unebanista, un albañil,un herrero, un zapatero,también saben lo suyo­

Dadle al hombre todo lo que necesite­Las pesas para pesar,las medidas para medir,el pan ganado altivamente,la flor del aire,el dolor auténtico,la alegria sin una mancha­

No- No se puede ser libre enteramenteni estrictamente digno ahoracuando el chacal está a la puertaesperandoque nuestra carne caiga, podrida­

Subiré al cielo,le pondré gatillo a la lunay desde arriba fusilaré al mundo,suavemente,para que esto cambie de una vez­

Raúl Gonzalez Tuñón (1905-1974)La luna con gatillo

55558?

profesor: " Bueno. Aritmeticemos un poco ­alumna: " Con mucho gusto, señor- "profesor: ' No le molesta decirme ---? "alumna: " De ningún modo, señor, continue­profesor: ' Cuánto son uno más uno “alumna: ' Uno más uno es dos- “profesor: (admirado por la sabiduría de la alumna)

" Oh- Muybién!- Me parece muy adelantadaen sus estudios! Obtendrá fácilmente sudoctorado total, señorita! "

Eugene Ionesco (1912- )La lección

A mi Jefa, Mirtha M. Flawiá; me enseñó lo trascendente de laformación cientifica y a su vez me otorgó total libertad en lalucha diaria. En lo personal le agradezco la infinita pacienciade estos últimos meses.A Héctor N. Torres por haberme permitido realizar este trabajo enel instituto del cual es director y por esas enriquecedoras e in—terminables discusiones experimentales.

A Leonardo Erijman, mi contraparte, lejos en la distancia peromuycerca en los sentimientos.A Patricia Levy Yeyati; ella sabe bien porqué.A mi compadre Horacio Martinetto por los seminarios de lunes porla mañana, por haber sido también mi jefe, y por mil cosas más.A mi amigo y compañero Omar Coso con su humor, negro, tan parti­cular.De manera muy especial quiero compartir este momentocon misamigos Betina Orman, Pablito Rabinowicz, Vivi Bernath, AlejandroSchijman, Belén Elgoyhen y Pablo Visconti y agradecerles todo elcariño recibido durante este último tiempo.Tambiénquiero expresar mi sincero agradecimiento a Rita Ulloa,Fernando Bravo, Sonia Lafon, Andrés Muro, Silvia Cabral, MalalaGomez,Anabella Srebrow, Gustavito Pesce, Mercedes Goin, LilianaHaim, Claudia Ochatt, Ximena Ares, Rosana Celnik, Nora Paños, DanKaplan, Martín Vazquez, Nelson Dusetti, Alfredo Panebra, Floren­cia Rodriguez , Alvaro Estevez, Sandra Ogueta, Gabriela Calaman­te, Daniel Capelutto, Pablo Zaltz; cada uno a su manera hicieronlo plausible para que esta tesis se plasmara.A los pichones del laboratorio, Marisa Farber, Albertito DiazAñel y Diego Fraidenraich para que cuiden todo lo amarrocadodurante estos años.A Lulú para que nadie se entere.

A Alberto Kornblihtt por su gran ayuda en las primeras épocas ypor transmitirme la importancia de la labor docente.A Gerardo Glikin, recordando viejas esperas reflexivas junto a lacafetera.A Maria Teresa Tellez de Iñón por considerarme uno de sussobrinos predilectos.A Alejandro Mentaberry por su sinceridad y simpatía tan carac­terística.A Alejandro Paladini por su ayuda solicita en un sin fin desituaciones.A Luis Jimenez; su apoyo incondicional a la cartelera denovedades fue fundamental.A Tomás Santa Coloma, por haberme dejado adquirir, aunque hayasido inútil, parte de su increible capacidad.

Gran parte de ésta tesis les pertenece a:El satiro de la granizadora, Norberto Malarini y a Adriana Urman,mi idishe mame privada.

A los verdaderos trabajadores del INGEBI:María Julia Alvarez,Tito Contreras, Gabriel Paissan, Leonor Acevedo, Irma Gelmi, Ja­vier Paget, Luis Acosta, Nené Parodi y a mi queridisimo amigo Ma­riano Rodriguez por aquellos seguros y confortables viajes enmoto.A NormaGiusto por enseñarme las técnicas de trituración de ojosvacunos.A Luis Millara por su insuperable trabajo fotográfico.A la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y su gente por elapoyo brindado en estos años.

A los amigos que ya no están entre nosotros: Daniel Altschuler,Javier Cáceres, Marcelo Rubinstein, Erico Grotewold, Laura Mora­tinos, Guillermo Taccioli, Jorge Caamaño,Facundo Batista, Clau­dio Alonso, Ricardo Attar, Graciela Bianchini, Alejandra Mandel,Valentina Carricarte, AnaPastini, Enrique Mesri, Alejandro Gut­man, Gabriel Aisemberg, Juán Pablo Radiccela, Susana Silbersteiny Clarita Rubinstein.A Gabriela por haber sido una parte muy importante de mitesis.Al CONICETpor haberme hecho entender lo que significa vivir conun auténtico sueldo de hambre.A Mariano Levín por facilitarme, en dos oportunidades, la cuba detransferencia de geles.

Deseo agradecer en forma anónima a Ricardo Enrique Bochini, eldueño indiscutible de la gran mayoria de mis domingos.

Finalmente quiero entregar un beso y un fuerte abrazo a Juán,Diego y Carolina Bregman; Mario y Marcela Capra; Fabián, Martha,Javier y María Victoria Garrido; Ernesto Gil Aschiero; AlejandroWaisman; Alejandro y Laura Lucangioli; Ricardo Fracchia; Cora Cy­mering; Luis Hurtado; Alberto y Marcela DellaMorte; Carlos, Gui­llermo, Roberto y Celia Castello; Maria Teresa Cirigliano; IchaMuschietti; Sheila, Benito, Martin, Eugenia y Martina Lopez Nava­rro; Marta y Ricardo Rojo; Beatriz y Carlos Moscoso que ayudarondesde afuera para que todo saliera de la mejor manera posible, ypor supuesto a mi santa madre, imprescindible en la realizaciónde ésta tesis, por ese momentode peligrosa lucidez que tuvo haceaproximadamente unos 30 años.

268+

I NTRODUCCI ON . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-77

BBQIEINAS_G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..3-44

QLASIEIQAQIQN

SUBUNIDADES a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..3

ag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..4

a1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

ao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..7

a, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..9

aPLc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

con: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

un . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..14

Eucariotes inferiores y procaríotes . . . . . . . . . . . . . . . . . ..15SUBUNIDADES ex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..17

SUBEREAMILLA_BAS - . . . . - - - - . . - - . - . - . - - - - - . . . - - . . - - - - . - - . . . - - ..20

Familia Ras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..21

Familia Rho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..25

Familia Rab . . . . . . . . . . . . . _ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..25

ARF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..27

MEQANISMQ_DELAQQIQH_DE_BBQIEINAS_G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..27

l) Estado inactivo. Interacción de a con B. . . . . . . . . . . . . ..322) Intercambio GTP-GDP.Interacción con el receptor . . . . ..323) Estado activo. Interacción con el efector . . . . . . . . . . . ..344) Fin del ciclo. Hidrólieis del GTP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..35

MQDlElQAQIQNES_EQSI:IBADUQQIQNALES

1) ADP-Ribosilación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..37Toxina de Vibm’o cholerae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39

Toxina de Bardetella pertussjs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412) Acilación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..42

BEQEBIQBES_AQQELADQS_A_BRQIEINAS_G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..44-57

Receptores B-adrenérgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..45Receptores a-adrenérgicoe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..46

FOTORECEPTORES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..46

Fitocromo . . . . . . _ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..47

* Regulación de los niveles de fitocromo . . . . . . . . . . . . ..48* Modo de acción del fitocromo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..51* Eventos primarios en la activación del fitocromo....53* Fitocromo y segundos mensajeros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..55* Fitocromo y hormonas vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..56

EEEQIQBES_AQQBLADQS_A_EBQIEINAS_G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..58-77

Adenilil Ciclasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..58

Transducción visual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..64

Células de los bastones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..65

Rodopsina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..70

Etapas del mecanismo1) Estado basal. Oscuridad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..712) Primer paso. Interacción rodopsina-transducina

inducida por luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..71

3) Segundopaso. Activación de la fosfodiesterasade GMPc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..74

4) Señal de salida. Cierre de los canales de Na+. . . . ..755) Fin de la cascada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..75

a) Rodopsina quinasa y arrestina . . . . . . . . . . . . . . . ..76b) Transducina; hidrólisis del GTP. . . . . . . . . . . . . ..77

CAPITULO 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..78-121"RECONSTITUCION DE UNA ADENILIL CICLASA DEPENDIENTE DE LUZ"

INIBQMLQQIQN - - - - - - . . - - —- - . - - - - - . - - - - - - . . - . . . - - - - . . - - - . . - - - ..79

QBJEI'DLQ . . . . - - - . . . . . . . . - . . - . . . - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..83

BESHLIAms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..86

Actividad de la adenilil ciclasa en membranascrudasy purificadas de Nbunmuxua crasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..87

* Inactivación de la adenilil ciclasa de ROSpor NEM..88E i l.l .. l l .1 I l. 1 . 1

* Fusión de membranas de N. crassa (cepa salvaje)con ROS (inactivadas con NEM). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..89

* Fusión de membranas de N. crassa (cepa mutante cr-l)con ROS (inactivadas con NEM). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..91Influencia de las toxinas de V. cholerae y B.*

pertussis en la reconstitución heteróloga . . . . . . . . . ..92* Dependencia de la fusión de membranas con la

longitud de onda de la irradiación . . . . . . . . . . . . . . . . ..93Ensayos de reconstitución utilizando membranasde ROScontroles, activadas y reactivadas* Purificación parcial de transducina . . . . . . . . . . . . . . . ..94* Control de viabilidad de transducina. Incubación

con NEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..95

* Fusión de dichas membranasde ROS(controles, inacti­tivadas y reactivadas) con N. crassa (salvaje) . . . . ..96

* Fusión de membranascontroles, en presencia deligandos B-adrenérgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..97

E l l.l ., l l .1 E l. i l, J* Fusión de membranas de N. crassa (cepa salvaje)

con retina de ratón normal adulto(inactivada con NEM). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . __ . . . . ..99

Fusión de membranasde N. crassa (cepa salvaje)*

con retina de ratón enfermo de 8,11 dias yadulto (inactivada con NEM). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .-100

* Mediciónde adenilil ciclasa de retina en ratones(+/+) y (rd/rd) de 8,11 días y adultos . . . . . . . . . . . ..101

* Fusión de membranas en presencia de GppNHp. . . . . . . ..102* Fusión de membranas de ratones normales adultos en

presencia de anticuerpo anti-rodopsina . . . . . . . . . . . ..103WS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .104MEIQDQS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..107

Neurospora crassa* Cepas y condiciones de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .-108* Obtención de fracción microsomal cruda

y purificada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..108Retina bovina

* Obtención de membranas de segmentos externos debastones de retina bovina (ROS). . . . . . . . . . . . . . . . . . ..109

* Extracción y purificación de transducina . . . . . . . . . ..112

* Obtención de membranas de ROSdepletadas detransducina (ROSminactivas) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -.113

* Tratamiento de membranas inactivas de ROScontransducina purificada (membranasreactivadas).....114

* Tratamiento de membranas de ROSy transducinapurificada con NEM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..114

* Tratamiento de membranas de ROScon toxina deVibrio cholerae y Bbrdetella pertussis . . . . . . . . . . . ..115

Retina de ratón* Cepas utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..115* Obtención de retina de ratón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..116

Ensayode reconstitución heteróloga* Fusión de membranasmediada por polietilenglicol

(PEG 6000) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..116

* Dependencia con la calidad dela luz de irradiación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..117

* Influencia de agonistas B-adrenérgicos . . . . . . . . . . . ..117* Incidencia de anticuerpo antiRodopsina . . . . . . . . . . . ..117

Ensayo de unión de [SÜSJGTP-X-S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..118Ensayode actividad de adenilil ciclasa

* Cálculo de la actividad especifica . . . . . . . . . . . . . . . ..118

CAP ITUID 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122-169"PROTEINAS G EN ALFALFA"

INIRQHLCQIQN . . - - - - - . - - - . - . . . . . . . . - - - . . - - - - - - . . - . - - - - . - —. - - .123

Componentes de los caminos metabólicos en plantas . . . . . ..124* Auxinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..124

* Adenilil ciclasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..125* Proteinas G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..126

* Fosfolipasa C y fosfoinosítidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..128* Proteínas Quinasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..128

QBJEEIJLQS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .130

EESULIADQS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..133

Purificación parcial de 1a proteina Gde alfalfa* Cromatografía de intercambio iónico

(DEAE celulosa) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..134

* Cromatografía de exclusión (Ultrogel ACA84) . . . . . ..135Caracterización bioquímica de 1a proteina G dealfalfa

* Variación del binding de [35SJGTP-3—Sconel tiempo y la cantidad de proteinas . . . . . . . . . . . . . .-137

* Análisis de Scatchard . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..138

* Unión en geles de GTP-a[32P] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..139* ADP ribosilación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..140

Caracterización inmunológica de la proteina G dealfalfa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..142

* Detección utilizando antisueros: AS/7. . . . . . . . . . . . ..1430584 y 9193 . . . . . ..144SWl . . . . . . . . . . . . . ..145

Caracterización funcional de la proteina G dealfalfa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..147

* Variación del binding con el tiempo de irradiacióncon luz de 660 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..147

* Variación del binding con el tiempo de incubaciónluego de irradiar con luz de 660 nm. . . . . . . . . . . . . . ..148

* Variación del binding luego de irradiar con luzde 730 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..150

QQNQLHSIQHES . . - . . . . - - - - - - . . - - - - - . . . - - - - - . . - - . - - - - . . - - . - . - ..152

MEIQDQS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..156

Material utilizado: Mbdicagosativa (alfalfa)* Plantas adultas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .-157

* Plantas jóvenes (brotes) . . _. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..157* Preparación de membranas plasmáticas . . . . . . . . . . . . . .-157

Purificación parcial de proteina G* DEAE celulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..158

* Ultrogel AcA 34 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..159* GTP Sefarosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -.160

Electroforesis en gel de poliacrilamida . . . . . . . . . . . . . . . ..160

Ensayos bioquímicos de identificación* Unión específica de [3583GTP3 _. . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..162* ADP ribosilación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..163

* Unión en geles de [32PJGTPa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..164Detección inmunológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..165

* Electrotransferencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..165

* Bloqueo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..166

* Adición de anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..167* Detección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..168

Protoplastos de alfalfa* Obtención . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..168

* Irradiación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..170

(3C)DÍ(31L[JESJIC)DIIEES CEIEIJIEIRJXILJEES . . . . . . . . . . . . . . . . ..171I3JIIBJLJECDCSIQIXIFÏEIK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..174

ABREVIATURAS

ADNc. . . . . . . . ..ácido desoxiribonucleico copiaADP. . . . . . . . . ..adenosina difosfatoAMPc. . . . . . . . ..adenosina 3‘-5‘-monofosfato cíclicoARNm. . . . . . . . ..ácido ribonucleico mensajero (RNAm)ATP. . . . . . . . . ..adenosina trifosfatoBCIP. . . . . . . . ..5-bromo,4-cloro,3-indolil-fosfatoBSA. . . . . . . . . ..sero albúmina bovinaDEAE. . . . . . . . ..dietil amino etilDG. . . . . . . . . . ..diacilglicerolDTT. . . . . . . . . ..ditiotreitolEDTA. . . . . . . . ..ácido etilén diamino tetraacéticoGDP. . . . . . . . . ..guanosina difosfatoGMPc. . . . . . . . ..guanosina 3'-5‘ mono fosfato cíclicoGpp(NH)p. . . . ..5'-guanilil—imidofosfatoGTP-X-S. . . . . ..guanosina 5'-0-(3-tiotrifosfato)GTP. . . . . . . . . ..guanosina trifosfatoHCl. . . . . . . . . ..ácido clorhídricoHepes. . . . . . . ..ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N‘—2—etanosulfónicohs . . . . . . . . . . .-horas

IPs. . . . . . . . . ..inositol 1,4,5-trifosfatoKb. . . . . . . . . . ..KilobasekD. . . . . . . . . . ..KilodaltonesMg2+. . . . . . . . ..catión magnesiomin . . . . . . . . . ..minutosMIX. . . . . . . . . ..isobutil metil xantinaml. . . . . . . . . . ..mililitromM. . . . . . . . . . ..milimolar (milimol por litro)M. . . . . . . . . . . ..molar (mol por litro)Mn2+. . . . . . . . ..catión manganesoNaCl. . . . . . . . ..cloruro de sodio (halita)NAD+. . . . . . . . ..nicotinamida dinucleótido (estado oxidado)NADP. . . . . . . . ..nicotinamida adenina dinucleótido fosfatoNBT. . . . . . . . . ..azul de tetrazolioNEM. . . . . . . . . ..N-etil maleimidaPDE. . . . . . . . . ..fosfodiesterasa

Pi . . . . . . . . . . ..anión fosfatoPIP2. . . . . . . . ..fosfatidil inositol 4,5-difosfatoPLC. . . . . . . . . ..fosfolipasa CPMSF. . . . . . . . ..ácido fluoruro p-metil sulfónicoPPi . . . . . . . . . ..anión pirofosfatoPSA. . . . . . . . . ..persulfato de amonioRIS. . . . . . . . . ..segmento interno de bastones de retinaROS. . . . . . . . . ..segmento externo de bastones de retinaSDS. . . . . . . . . ..dodecil sulfato de sodioTCA. . . . . . . . . ..ácido tricloroacéticoTC. . . . . . . . . . ..toxina de Víbrio choleraeTEMED. . . . . . . ..N,N,N’,N' tetrametil etilendiaminaThy. . . . . . . . . ..timidinaTP. . . . . . . . . . ..toxina de Bbrdetella pertussisTris . . . . . . . . ..2-amino-2-hidroximetil-1-3-propano diolug . . . . . . . . . . ..microgramoul . . . . . . . . . . ..microlitro

GLOSARIO

******

*

Buffér:

Binding:cracking buffer:Splicíng:Mating:Sea urchin egg:Fbot printing:

Siempre son concentraciones finales salvo que se indiquediferente.

Solución de sustancias químicas que mantienenconstante el pH.Unión específica de un ligando.Buffer de craqueo.Procesamiento de ARNprimario.Aparcamiento.Huevos de erizo de mar.

ADNasa.

Código de una letra para aminoácidos:A

PWHIQ’I'JFJUO

Alanina HCisteína HAspartato HGlutamato uFenil alanina HGlicina HHistidina uIsoleucina H

Z<Hm5UDWZZLisina HLeucina H Y

X Cualquier aminoácido

Ensayo de protección contra la acción de una

algo

MetioninaAsparaginaProlinaGlutaminaArgininaSerinaTreoninaValinaTriptofanoTirosina

INTRODUCCION

INTRODUCCION - 2 ­

Con la irrupción a la célula del primer mensajero (hormonas, neu­rotransmisores, fotones, etc.) se desencadenanvariados y sucesi­vos eventos intracelulares que culminan en la producción de unadeterminada respuesta final. Estas etapas son necesarias para quela información a transmitir sea detectada, decodificada, amplifi­cada, integrada y transformada en una señal bioquímica intracelu­lar. Dentro de esta cadena metabólica, las proteinas G son lasencargadas de transducir la señal desde la proteina receptora delestimulo externo, a las proteinas efectoras que sintetizarán se­gundosmensajeros citoplasmáticos, verdaderos ejecutores de larespuesta celular.

Las evidencias indican que todas las proteinas G llevan a cabo sufunción a través de un mecanismoúnico que se conserva a lo largode toda la familia, y a medida que se avanza en la caracteriza­ción de sistemas de transducción de señales, queda cada vez másclara su creciente participación en la mayoría de dichos sistemascelulares.

Es por ello que esta Introducción, hgx, ya resulta incompleta.

INTRODUCCION - 3 ­

Proteinas G

Las proteínas G son heterotrimeros formados por

subunidad a (39-54 kD)

subunidad B (35-36 kD)

subunidad 3 (8-10 kD) que luego deactivarse se disocian en la subunidad a y en el dímero B X.

Las subunidades a unen e hidrolizan GTP, definen la especificidadde interacción con el receptor y el efector, y difieren de prote­ina G en proteina G. El dimero estructural BFX, que en realidadse lo deberia considerar comomonómero desde el punto de vistafuncional, Jugaría el papel de anclar la proteina G a la membra­na, pero también le han sido asignadas funciones adicionales den­tro de los mecanismos de activación y desactivación, que aún nohan sido completamente elucidadas.

SUBUNIDADES °(

Ya sea por purificación o por clonado molecular, hasta la fechase han reportado 13 subunidades a distintas en vertebrados, y es­te número aumenta dia a día.

Cada subunidad a contiene un sitio de alta afinidad para nucleó­tidos de guanina y posee una actividad GTPásica intrínseca. Tam­bién presenta por lo menos un sitio para cationes divalentes(Mg2+es el ligando fisiológico) y aminoácidos especificos parauna modificación covalente llevada a cabo por toxinas bacterianasque catalizan la transferencia de grupos ADP-ribosaa partir deNAD+(ADPribosilación).

“s

INTRODUCCION - 4 ­

Fue primero definida funcionalmente por su capacidad deactivar la adenilil ciclasa. Dos trabajos del grupo deRodbell (Rodbell et al, 1971a)(Rodbell et al, 1971b) so­bre la necesaria presencia de GTPpara la activación dela adenilil ciclasa por glucagón, fueron el primer indi­cio de la existencia de un transductor de la señal desdeun receptor a un efector (adenilil ciclasa). Luego, sedescubrió que aquella era una mezcla de dos polipéptidosa diferentes (de 45 y 52 kD) con subunidades B y X indis­tinguibles (Northup et al, 1980)(Sternweis et al, 1981).

El grupo de Bray en 1986 aisló 4 cDNAsdiferentes de lasubunidad as de cerebro humanoy caracterizó su estructu­ra (Bray et al, 1986); asi y aga son idénticas, exceptoque a aaa le falta un trayecto de 45 nucleótidos quecoincide con el exón 8; aaz y an4 presentan 3 nucleótidosadicionales del intrón 4 (CAG)que generan un residuoserina con respecto a del y aga. Luego, en 1988, a partirde una biblioteca genómica se aisló el gen de ag humanoque contenía 13 exones y 12 intrones con un largo totalde 20 Kb (Kozasa et al, 1988). Esta información y la com­paración de todas las secuencias de cDNAs aisladassugirió que los 4 tipos de mRNAson generados a partir deun solo gen por splicing alternativo y por la diferenteutilización de un sitio aceptor secundario (Figura 1).

osa-3 (2.1.) GSR-l. (2‘12)

GAlT GAG GAICnAGT GAGAsp Gm Nm Sa-Gw

INTRODUCCION - 5 ­

A pesar de que ambas proteínas (45 y 52 kD) interactúande manerasimilar con la adenilil ciclasa, con las sub­unidades BSy con sus respectivos receptores, la veloci­dad de disociación del GDPde la forma de 52 kD es alre­dedor de 2,5 veces más rápida que la de 45 kD. Esto im­plicaría que la activación de la adenilil ciclasa produ­cida por la proteina de 52 kD (G.1) es más rápida que lallevada a cabo por la de 45 kD (a.4)(Graziano et al,1989). Ambas formas están distribuidas diferencialmenteen los distintos tejidos: mientras cerebro e higado con­tienen ambas formas (52 y 45 kD), en eritrocitos sóloaparece la forma de 43 kD. Tanto a4s como asz pueden serADP-ribosiladas por toxina del cólera, provocando una ac­tivación permanente (Graziano et al, 1987).

La proteína G. también activa canales de Ca2+sensibles adihidropiridina en músculo esquelético y cardíaco (Brownet al, 1988). Luego se comprobó que las 4 especies de dehumanaspueden activar tanto la adenilil ciclasa comodi­chos canales de Ca2+ (Mattera et al, 1989). Esto aportaun nuevo rasgo a los mecanismos de transducción de seña­les:

las proteinas G no sólo interactúan con diferen­tes receptores pasando la información a un solo efector,sino que también activan múltiples efectores ampliando -ycomplicandoa la vez- las posibilidades del traspaso dela información.

Poco se sabe sobre la regulación de la expresión de a.. Anivel de la transcripción hay evidencias de que los glu­cocorticoides incrementan los niveles del mRNAde a.(Chang et al, 1987). Un trabado reciente muestra que lasintesis de a. está bado el control de la hormona tiro­trófica (TSH)en células tiroideas, en una relación de­pendiente de la dosis, lo cual sugiere que la transcrip­ción del mRNAde a. estaria mediada por un proceso depen­diente de CAMPinvolucrando algún elemento en cis en la

INTRODUCCION - 6 ­

zona 5' del gen de a. (Saunier et al, 1990); ulterioresinvestigaciones serán necesarias para corroborar dichasuposición, ya que se esperaría que las proteinas G pre­sentaran, por el tipo de funcion que desempeñan, una ex­presión constitutiva. También, comofue explicado ante­riormente, existe regulación por intermedio del splicingalternativo, que genera distribución especifica de teji­do; de igual manera, aa1 aparecería como la de más expre­sada en diferentes tipos de células.

Originalmente se la conoció estudiando la inhibición dela adenilil ciclasa en una línea celular, S49, que eradeficiente en Ge (Hildebrandt et al, 1983a y b). Luego,se identificó a 61 comoel primer sustrato de la acciónADP-ribosilante de la toxina de Bbrdetella pertussis, yse la caracterizó como un heterotrímero con subunidad aentre 40 y 41 kD (Bokoch et al, 1984).

El nombre G1(correspondiendo la "i" a inhibición de laadenilil ciclasa) es un nombre genérico y mal empleadopues, en realidad, nunca se ha demostrado una acción in­hibitoria sobre los niveles basales de dicha enzima, sinosólo una inhibición de la estimulación de la adenilil ci­clasa producida por Ga.

El clonado molecular reveló la existencia de tres distin­tas proteínas que provienen de tres distintos genes: au.(Nukada et al, 1986), G12 (Itoh et al, 1986), y G13(Jones et al, 1987). Tanto au.como aaa tienen un peso mo­lecular de 41000, mientras que 012, 40000. Los tres cDNAspresentan altísima homologia de aminoácidos entre si(90%). Utilizando antisueros contra secuencias específi­cas que permitan diferenciar los tres subtipos, se encon­tró que au_(46 kD) está distribuida en mayor cantidad encerebro y eritrocitos y que a12 (40 kD) lo está en dife­rentes teJidos de forma homogénea.El significado funcio­

“o

INTRODUCCION - 7 ­

nal de esta distribución no se conoce aún.

La familia de G1 (asi como ao, como luego se verá), escandidata para ser protagonista en sistemas de transduc­ción que son bloqueados por la toxina de B. pertussis.Hasta la fecha sólo se ha reportado (Yatani et al, 1988)que los tres subtipos de G1 son capaces de activar cana­les de K+en músculo atrial, indicando esto su multifun­cionalidad. Por esta razón algunos autores las llaman Gx(Yatani et al, 1987).

Mientras se realizaba el aislamiento de G1en cerebro, seencontró una proteína con las caracteristicas de proteínaG y que también era sustrato de la toxina de B. pertussis(Sternweis et al, 1984)(Neer et al, 1984). Esta "otra"proteina (de ahi su subíndice), tenia un peso molecularde 39000, y era la responsable de la altísima actividadde binding de GTP3[35S]en cerebro, ya que ella solaconstituye el 1%de la proteina de membrana (Asano et al,1987).

A pesar de que su función aún no ha sido totalmente acla­rada, su descubrimiento produjo un gran impacto, ya quesu presencia en cerebro (y no asociada a adenilil cicla­sa, comosí lo estaban las hasta ese momentoconocidas a.y a1), planteaba la posibilidad de un papel muchomás am­plio de la familia de proteinas G.

En 1987, dos grupos reportaron la secuencia completa deao (Van Meurs et a1, 1987)(Jones et a1, 1987), y se ob­servó que presentaba alta homología con la familia de lasa1 (82%con au). Sin embargo, la cinética de binding deGTPdifería con la de a1, siendo la velocidad de inter­cambio GTP-GDPun orden mayor para ao. Evidencias elec­troforéticas y cromatográficas (Goldsmith et al, 1988),mostraban la presencia de otra subunidad a de 39 kD, de

INTRODUCCION - 8 ­

menor abundancia de ao (también de 39 kD), e indistingui­ble desde el punto de vista inmunológico. En ese trabadose especulaba sobre la posibilidad de que fuera otra for­ma de ao, con diferencias en las modificaciones postra­duccionales más que en la secuencia primaria. Luego, en1990 (Hsu et al, 1990), se aclaró el entredicho ya que sereportó el clonado de la nueva variante de ao, producidapor el splicing alternativo de un mensajero primario(Murtagh et a1,1991)

Comose apuntó anteriormente, Go se encuentra altamenteconcentrada en cerebro y está pobremente expresado en te­Jidos periféricos (Asano et al, 1987). Esto sugiere queGo estaria involucrado en funciones que se encuentran al­tamente expresadas en cerebro. Sin embargo, su distribu­ción no es homogénea ya que es más abundante en corteza,hipotálamo y cerebelo. También se lo ha reportado en re­tina (Terashima et al, 1987).

Mediante experimentos de reconstitución heteróloga de ca­minos metabólicos, utilizando perfusión de Go purificadoen células o en liposomas, se ha visto que Goestaria in­volucrada en el enlace bioquímico de:

* receptores quimioatractantes y fosfolipasa C inte­rrumpida por toxina de B. pertussis (Kikuchi et al,1986)

* receptor adrenérgico a2 (Cerione et a1, 1986)

* canales de Ca2+ regulados por opiodes (Hescheler etal, 1987)

* estimulación de 4 canales distintos de K+ (Van Dongenet al, 1988)

* incremento del Ca2+ intracelular luego de la inyec­ción en ovocitos de xenopus laevi activando fosfoli­pasa C (Moriarty et al, 1990).

“z

INTRODUCCION - 9 ­

Todavia resulta poco claro si el efecto de Go sobre loscanales iónicos se debe a una interacción directa o si esmediado por algún segundo mensajero (vgr; fosforilaciónproducida por proteina quinasa A o C).

En 1988, dos grupos aislaron cDNAsde cerebro bovino quecodifican para una única proteína G (subunidad a) quepresentaba dos diferencias fundamentales con la mayoríade las a de cerebro (Fong et al, 1988)(Matsuoka et a1,1988)

* 3 residuos aminoacidicos de la primera porción delsitio principal de binding de GTP(altamente conser­vado) resultaron ser distintos al de todos los demásintegrantes de la familia

LLGSGK do,di,do,a.1:LLGSGK az

* No estaba presente la cisteina en la zona COOHtermi­nal, sitio de ADPribosilación por toxina de B. per­tussis, es decir que G. estaria involucrada en even­tos insensibles a dicha toxina.

a; se expresa primordialmente en cerebro y bazo, y másdébilmente en hígado y presenta una bajísima velocidad deintercambio (0,02 min-1, 40 veces menor que la de ao),una muybaja actividad GTPásica, y no es ADP ribosiladatampocopor toxina del cólera, a pesar de que presenta laarginina blanco (su entorno es bien diferente al de ag)(Casey et al, 1990)(Premont et a1, 1989). Entonces, cual­quier sistema de señales que se encuentre bajo el controlde Ga deberia ser refractario a la disrupción por ambastoxinas. Sistemas candidatos incluyen alguna regulaciónreportada de la fosfolipasa C (Cockcroft, S., 1987a)(Ne­

HL

INTRODUCCION - 10 —

gishi et al, 1987), y la inhibición de canales de K+ in­ducida por sustancia P (Nakajima et al, 1988).

A pesar de la gran importancia del sistema de fosfoinosi­tidos dentro de los procesos de transducción de señalescelulares y de la cantidad de trabajos sobre el tema, aúnqueda poco claro el mecanismo de regulación. Hasta hoydia se conocen dos subformas de fosfolipasa C, la cito­plasmática y la asociada a membranas. La más estudiada hasido la citoplasmática y una gran cantidad de informaciónobtenida a partir de ésta se aplica a la asociada a mem­branas. La relación entre las varias formas de fosfolipa­sas C celulares permaneceaún sin definirse. En contrastecon la citoplasmática, la enzima asociada a membranas esregulada por agonistas especificos (Pfeilschifter et al,1986), es activada por nucleótidos de guanina (Cockcroftet al, 1985), y presenta un pH óptimo de acción más bási­co (Martin et al, 1986). Innumerables datos sugieren quela activación de fosfolipasa C se produciría por un meca­nismo dependiente de GTP:

1) GTPy análogos no hidrolizables reducen la afinidadde receptores acoplados a fosfolipasa C con sus ago­nistas (Goodhardt et al, 1982)(Hwanget al, 1986)

2) dichos receptores estimulan actividad GTPásica(Grandt et al, 1986)

3) agonistas estimulan la fosfolipasa C en membranasaisladas de una manera dependiente de GTP(Smith etal, 1985)

4) análogos no hidrolizables de GTPmimifican el efectodel agonista + GTPde estimular la enzima (Smith etal, 1985)

INTRODUCCION — 11 ­

5) algunos autores reportan inhibición de la estimula­ción de fosfolipasa C por efecto de la toxina de V.cholerae (Imboden et al, 1986)

6) hay datos de inhibición por intermedio de la toxinade B. pertussis en varias líneas celulares (Ohta etal, 1985), aunque en otros tejidos, comohepatocitos,la toxina no afecta la hidrólisis de los fosfoinosí­tidos (Uhing et al, 1986).

La activación de la fosfolipasa C podría entonces ocurrirmediante un mecanismoparalelo al de la adenilil ciclasa,pero dicho esquemarequiere la identificación, aislamien­to y reconstitución de los elementos constituyentes. To­das las observaciones, hasta ahora, sugieren la presenciade una proteína G —llamada Gp o GPLc- que seria la encar­gada de transmitir la señal desde los receptores corres­pondientes hasta la fosfolipasa C. El hallazgo (Moriartyet al, 1988) de que la exposición de la cara citoplasma­tica de la membranaa altas concentraciones de BS bloqueala estimulación por agonista de la fosfolipasa C, es unindicio de que Gch seria un heterotrimero aflS. A pesarde esto, no se conoce su peso molecular, no se lo ha pu­rificado ni caracterizado, y muchosautores dudan de suexistencia (Brass et al, 1988). Toda esta linea de hipó­tesis se basa no sólo en la imposibilidad de haber halla­do una proteína G diferente que regule la fosfolipasa C,sino también en experimentos de reconstitución en loscuales Gao Go pudieron interactuar con la fosfolipasa C(Kikuchi et al, 1986)(0kajima et al, 1985). Pero así comoresulta arriesgado asegurar la presencia de Gch, tambiénhay que tener bastante cuidado con los experimentos ante­riores. Birnbaumer bien aclara que "se ha mostrado que G1y Go acoplan la fosfolipasa C a receptores quimioatrac­tantes, función que uno no esperaría de proteinas G queinteractúan con adenilil ciclasa y con canales de K*,respectivamente, y no con fosfolipasa C. Cuánpuras esta­

c‘oH

INTRODUCCION — 12 ­

ban esas preparaciones?" (Birnbaumer, L., 1987).

En 1988, Brass purificó a homogeneidad la a4; de plaqueta(a1 inhibitoria de la adenilil ciclasa), y demostróqueesa banda única de ADPribosilación en geles de una di­mensión, se resolvia en dos manchas en geles bidimensio­nales (Brass et al, 1988).

Recientemente se purificó y clonó una nueva subunidad a,llamada ag de 42 Kd, que no era reconocida por ninguno delos antisueros contra los demás subtipos de subunidadesa, que no era sustrato de la ADP-ribosilación por toxinade B.Pertussis aunque si presentaba todas las zonas con­senso de Halliday (Pang et al, 1990)(Strathmann et al,1989). Realizando ensayos de actividad de fosfolipasa C(PLC)en vesículas fosfolipidicas con aq pura, el grupode Sternweis encontró que aq era capaz de estimular a di­cha enzima mientras ao, aii, a42 y BKno lo eran (Smrckaet al, 1991). Estos datos sugieren que ag activaria a PLCaunque sería necesaria la presencia de alguna otra prote­ína G para poder explicar los trabajos sobre la hidróli­sis de fosfatidilinositol-4,5,bifosfato (PIP2) en eventosregulados por la toxina de B.pertussis.

Por eso, hasta el día de hoy, hay una gran falta de in­formación y muchaconfusión referida a la identidad ypresencia de una proteina G acoplada a la fosfolipasa C.

Estudios electrofisiológicos y bioquímicos sugerian laposibilidad de que los odorantes induJeran respuesta enneuronas sensoras olfatorias mediante la activación de laadenilil ciclasa acoplada a una proteina G (Pace et al,1986)(Sklar et al, 1986). En 1989 se clonó un cDNAde unaproteína G involucrada en el olfato (Jones et al, 1989).El mRNAque se expresa en neuroepitelio olfatorio pero noen cerebro, higado, riñón, intestino y corazón codifica

e"E

INTRODUCCION - 13 ­

para una proteína (noxe) de 44 kD con una identidad deaminoácidos del 88%con G.3; aouzno parece ser un pro­ducto del gen ag, aunque su expresión en linfoma S49 res­taura la estimulación de la adenilil ciclasa por agonis­tas B-adrenérgicos.

La distribución exclusiva de Gor: implica que Jugaría unpapel especializado en transducción olfatoria, análogo alde la transducina en transducción visual.

Recientemente se ha reportado el clonado de una familiade genes que codifican para receptores de odorantes queserían los encargados de interaccionar con Golf y activarfinalmente a la adenilil ciclasa, desencadenandola señaleléctrica hacia el cerebro (Barinaga, M., 1991).

Hasta la fecha sigue siendo un misterio el hecho de queuna proteína G (llamada GEpor exocitosis) esté involu­crada en el control de la exocitosis. La existencia deesta subforma diferente fue propuesta en 1986 por el gru­po de Gomperts. Anteriormente se había sugerido que unmodo de acción del GTP en la secuencia de eventos de laexocitosis podria ser la activación de la fosfolipasa C através de la potencial Gp (Cockcroft et al, 1985)(Smithet al, 1985). Pero luego, se vio en neutrófilos que lasecreción de B-glucuronidasa de los gránulos lisozomalespodia ser estimulada tanto por Ca2* como por GTP, y susefectos eran aditivos (Barrowman et al, 1986). A partirde estos datos se postuló que el GTPpodría actuar a tra­vés de otro mecanismoindependiente de fosfolipasa C,produciendo un segundo mensajero desconocido que contro­laría la exocitosis (Figura 2).

INTRODUCCION - 14 ­

‘ G Iplp!PIP2 ->DG— v‘ ‘>©

Transducína (oq)

R R'

mp1 \ xInsP3/

®\* Can2+

lSECRECION

En mastocitos también se postula la presencia de GEen lasecreción de histamina, a través de un mecanismoindepen­diente de fosfolipasa C —proteína quinasa C. Se viopara la liberación de histamina no había requerimiento deATPy también que la presencia de neomicina (inhibidor de

que

la fosfolipasa C) no afectaba el proceso de exocitosis(Cockcroft et al, 1987b).

Sin embargo, en una célula secretoria comosea urchinegg, análogos de GTPno estimulan la exocitosis.

Sólo posteriores experimentos decidirán si en realidadhay una proteína G involucrada en el proceso de exocito­sis.

Es el mayor componente proteico de los discos de los seg­los bastones de la retina. Su fácil

con GTP sin el uso dementoS exte rnos depurificación (se extrae detergen­tes)(Kühn H., 1980) y su alta concentración, hicieron de

INTRODUCCION - 15 ­

esta proteína el mejor modelo para el estudio del meca­nismo de acción de las proteinas G. Gracias al uso de in­numerable cantidad de anticuerpos especificos y al cono­cimiento de su secuencia aminoacidica (Hurley et al,1984), pudo ser clonada la subunidad a en varios labora­torios a la vez (Lochrie et al, 1985)(Medynskiet al,1985)(Tanabe et al, 1985)(Yatsunami et al, 1985a y b).Dos tipos de ac han sido clonados: uno expresado en bas­tones at-r y el otro en conos at—c. Presentan 80%de ho­mología entre ambos, un peso molecular de 39000, y poseensitio de ADPribosilación para toxina de V. cholerae y B.pertussis, aunque la demostración bioquímica de la fun­cionalidad de esos residuos fue demostrada sólo para ac­r.

Eucariotes inferiores y procariotes

El reciente descubrimiento de proteinas G en eucariotesinferiores indica que dichas proteinas han sido conserva­das a lo largo de la evolución.

En Shocharomyces cerevisiae han sido identificadas dossubunidades a: SCGmque codifica para una proteina homó­loga a la a de vertebrados (Dietzel et al, 1987) con unpeso molecular de 54000, con altísima identidad en zonasconsenso y que estaria involucrada en el camino metabóli­co de respuesta a feromonas, esenciales para el mating delevaduras. Pocas evidencias surgen acerca del papel quejugaría el producto del segundo gen clonado, SCG2,aunquese sugiere que podria regular los niveles de CAMP.

En [fictyostellium discoideum han sido clonados dos genesa : G01 y Gaz, de 30000 kD con 45% de homología total conotras subunidades a, pero con 100%de homologia en zonasconsenso. Nopresentan la cisteina blanco para la ADPri­bosilación por toxina de B. pertussís. Datos aportados

INTRODUCCION - 16 ­

sugieren que Gaz acopla receptores quimiotácticos confosfolipasa C, y que la sobreexpresión de G01afecta as­pectos del ciclo celular (Kumagaiet al, 1989).

Tambiénha sido caracterizada bioquímica e inmunológica­mente la presencia de por lo menosuna proteína del tipoG en ïTypanosomacruzi (Eisenschlos et al,1986b)(Coso etal, 1991 comunicación personal).

La aparición de proteínas G en eucariotes inferiores yplantas (tal como se presenta en esta tesis) al mostraruna similaridad funcional y en algunos casos (S. cerevi­siae, D. discoideum) alta homologia de secuencia con loseucariotes superiores, refleja la presencia de una impor­tante presión evolutiva para mantener la función fisioló­gica especifica de cada una de las proteínas G (Figura 3)

GsxSCGISCGZGúxGúxGHxDd1GoxGzGHK

Gt2«l l 1 l l 1444

¿o 50 60 70 80 90 100

°/. de Homologl'a (aa)

INTRODUCCION - 17 ­

SUBUNIDADES M

A pesar de que las subunidades B y X no se encuentran unidas co­valentemente, ambas conforman una sola unidad funcional. Origi­nalmente se pensaba que la diversidad en las proteínas G proveníaexclusivamente de la subunidad a, pero se ha visto que existenmúltiples formas de B y 3.

Hasta la fecha se han reportado dos genes que codifican para sub­unidades B: Bas y Bas (Fong et al, 1987)(Gao et al, 1987), con un90%de homología entre ambas. En la mayoria de los tejidos espredominante Bas (Woolkalis et al, 1987), pero en placenta es alrevés (Evans et al, 1987). En retina sólo existe la forma Bas yes idéntica a la de hepatocitos (Codina et al, 1986). A pesar dela alta homologiade secuencia hay reportes de anticuerpos dife­renciales para ambas subformas (Roof et al, 1985).

Las dos proteinas B provienen de genes separados (Amatruda III etal, 1988) que están localizados en diferentes cromosonas (Bee enel cromosoma 1 y Bas en el 7)(Lochrie et al, 1988).

Poco se sabe con respecto a la subunidad 3 ya que su detección sevio dificultada por su baja tinción y su dificil localización engeles (Hildebrandt et al, 1984a).

Existen evidencias inmunológicas, bioquímicas y de secuencia, so­bre la diferencia entre la 3 de retina y la de los demástejidos(Roof et al, 1985)(Hildebrandt et a1, 1985). Hasta 1989 se pensa­ba que la retina contenía una sola X, que había sido clonada ysecuenciada (VanDopet al, 1984c)(Yatsunami et al, 1985a), con unpeso molecular de 8700. Pero en 1989 se purificaron y caracteri­zaron dos subunidades X distintas de retina: Bai, con un peso mo­lecular de 8000 y 3:2 de 6000 D. También se observó que el com­plejo 632 aumenta el binding de GTPa at en presencia de rodopsi­na, unas 30 veces más que 681. Esto indica que 3:2 es esencialpara el binding de GTPa transducina, mientras que aún no se sa­be el papel de Zu; (Fukada et al, 1989). Asimismo se encontró queac, en su forma GDP, presenta mucha más afinidad por 882 que por

INTRODUCCION - 18 ­

Büi en ausencia de membranas (Ohguro et al, 1990), y que mientras682 es proclive a ser modificada en una cisteina en su extremoCOOH,por un grupo farnesilo, 631 no (Fukada et a1, 1990). Estoindica que el grupo farnesilo unido covalentemente a la subunidadX es indispensable para la actividad de binding de GTPde latransducina.

Otros tejidos presentan hasta tres posibles subunidadesX distin­tas resueltas en geles (Giulian et al, 1988) y en 1989 se aislóun clon de X en cerebro bovino que presentaba una identidad sólodel 55%con la de retina (Gautam et al, 1989), dato que corroborala importante diferencia entre las dos subunidades.

Unade las diferencias encontradas entre BS de retina y de otrostejidos, es la asociación a membranas: mientras Ext pueden ex­traerse de la membranade los discos de los bastones de retinasólo con GTPsin necesidad de sal y de detergente (KühnH.,1980),para extraer las BKde los demás tejidos se debe añadir imperio­samente una solución de detergente iónico.

Estudios previos demostraron que los complejos 68 de G1o Gt eranintercambiables para interactuar con a1 o at en un sistema re­constituido de estimulación por rodopsina de la actividad GTPási­ca (Kanaho et al, 1984).

Pero luego se descubrió que el complejo Ext era mucho menos efec­tivo, unas 25 veces, que el BBde cerebro, para inhibir la adeni­lil ciclasa estimulada por Gg-fluoruro (Casey et al, 1989a) o porGppNHp-G.(Cerione et al, 1987). Las diferencias funcionales en­tre las dos BKpodrían ser el reflejo de las diferencias estruc­turales en sus subunidades 3, sugiriendo esto un posible papel delas 3, diferente al de las subunidades a, en la especificidadfuncional de las proteinas G.

La secuencia aminoacidica de la 8 de cerebro bovino presenta unahomologia del 45%en la región NH2terminal (20 aminoácidos) conlas proteinas ras. En esta región se encuentra también la mayordivergencia entre 3 de retina y 8 de cerebro. Esto podria impli­

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car que la zona NH2terminal de las 3 interactuaria con un efec­tor o con un receptor que también estuviera asociado con proteí­nas ras. También ambas subunidades 3 presentan en su extremo COOHterminal el tipico tracto C-A-A-X,siendo A un aminoácido alifá­tico y X cualquier aminoácido, tipico de las proteinas ras yesencial para el anclado a membranas (Gautam et al, 1989).

Poco es lo que se puede aportar, en forma clara y precisa, sobrela función de 63 en los mecanismos de transducción de señales,aunquesobran los datos y las controversias entre los distintoslaboratorios.

El grupo de Gilman proponía que el descenso de los niveles de aadebido a su reasociación con la BBproveniente de G1era el meca­nismo a través del cual G1inhibia la adenilil ciclasa (Katada etal, 1984 a y b). Mientras tanto, el grupo de Birnbaumer proponíauna interacción directa de a1 con la adenilil ciclasa (Hilde­brandt et al, 1984b)(Codina et al, 1984).

Hoy dia, se ha demostrado que ambos mecanismos más la interaccióndirecta de BS con el componentecatalitico, ocurren de igual ma­nera en el proceso de inhibición (Katada et a1, 1986).

En 1987, Eva Neer postuló que, concentraciones nanomolares de BKde cerebro bovino activan canales de K+regulados por receptormuscarinico en corazón de pollo (Logothetis et al, 1987), mien­tras que al mismotiempo se reportó que, concentraciones picomo­lares de ak, 2229 ng BK, abren los mismos canales en corazón decuis (Codina et al, 1987).

Paralelamente fue reportada la activación de fosfolipasa A2 enretina bovina por las subunidades fiat, mientras que at inhibiadicha estimulación (Jelsema et al, 1987).

En 1987, Bourne niega la doctrina que todos los receptores aco­plados a proteinas G actúen con el efector vía ag, "doctrina pro­clamada sobre la base de débiles evidencias” (Bourne, H., 1987).Esas débiles evidencias, según Birnbaumer, sólo se adecuan al he­cho de que a. no interactúa en la inhibición de la adenilil ci­

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clasa y en los canales de K+, mientras que 83 si. Luego aclara:“Mediante el razonamiento, mi gato es negro, Pedro es negro, en­tonces Pedro es un gato, las subunidades 63 fueron declaradas me­diadoras de la acción de algunos receptores“ (Birnbaumer, L.,1987).

Unhallazgo interesante que aportó nuevos datos a esta controver­sia fue el hecho de que, en Shccharomyces cerevisiae, como se ex­plicó con anterioridad, se descubrió una proteina G, heterotrime­ro con subunidades a, B y 3, que estaba involucrada en el meca­nismo de mating.

Análisis genéticos demostraron que deleciones en el gen de B(STE4) o de 3 (STE15), abolía la capacidad de la levadura a res­ponder a la feromona, no ocurriendo lo mismo cuando se mutaba elgen a (SCGl)(Whiteway et al, 1989).

Estos datos sugerian que la unión de la feromona al receptor(STE2)produce la disociación de la subunidad a de las subunida­des BK, y que las subunidades BKlibres inician la respuesta ce­lular a la feromona. Acota Henry Bourne, refiriéndose a estostrabajos en levadura: "Los chauvinistas de las cadenas a han re­cibido un gran golpe proveniente de un área inesperada” (Bourne,H., 1989).

Aúnhoy, la controversia continúa.

SUPERFAMILIA Ras

E - l . SIR

En los últimos años hubo un gran avance en la caracterización deproteínas monoméricas (22-30 kD) que unen GTPy que muestran ho­mología con la familia de proteinas ras. Alrededor de 30 protei­nas distintas de mamíferoshan sido estudiadas, y diferentes sub­familias han sido definidas de acuerdo a su secuencia primaria.

INTRODUCCION - 21 —

Todas las proteinas de esta superfamilia se diferencian de lasubunidad a de las proteinas G en que:

* no son sustratos de ADP-ribosilación, ni por toxina de V. cho­lerae o B. pertussis

* no interaccionan con las subunidades BK

* las secuencias aminoacidicas divergen con respecto a la de lassubunidades a y presentan diferentes tamaños (20-23 kD frentea 39-54 kD)

La tabla A muestra los miembros conocidos de la Superfamilia deras agrupados en familias y subfamilias.

SUPERFAMILIA RAS

FAMILIA Ras FAMILIA Rho FAMILIA Rab

Ha-ras (p21) rhoA rablA-lBKi-ras (p21) rhoB rab2N-ras (p21) rhoC rabGA-BBC-ras (p21) rab4raplA-lB racl rab5

racZ rab6rap2 rab7R-ras (p23) G25KralA YPTlralB SEC4

Los primeros integrantes descubiertos fueron los productos de losoncogenes de dos virus: sarcoma de rata de Harvey (Harvey, J.

INTRODUCCION — 22 ­

1964) y de Kirstein (Kirstein et al, 1967). Estas proteínas, lla­madas pZIV‘Ha-ras Y p21V-31-r85, eran las responsables de la capa­cidad transformante de dichos virus. Luego, a partir de una líneacelular de neuroblastoma, fue aislada pZPFTflfl, también con capa­cidad transformante pero no transducida por un retrovirus (Shimi­zu et al, 1983). La proteína normal celular, p21c-r‘9 (el produc­to del proto-oncogen) une GTPy, luego de desencadenar la señal,lo hidroliza a GDPpermaneciendo en la forma inactiva. Esta es ladiferencia con los productos oncogénicos, que por causa de muta­ciones específicas en el sitio de unión con los fosfatos fix delnucleótido, presentan una actividad GTPásica muyreducida, perma­neciendo siempre en forma activa y desencadenando la transforma­ción.

Control celular de p21r89

La figura 4 muestra uno de los últimos modelos tentativos sobreel modo de acción de 1321139.

F ÑSEÑAL?—-> fi <>__SEÑAL?<9 o

GDS

Efector ACTIVA

(GAP?)

lEFECTOS CELULARES

t

INTRODUCCION - 23 ­

La forma GDP de p21 es la inactiva e interacciona con alguna“proteína activadora del intercambio de nucleótido” (GDS); asilibera GDPy une GTPconvirtiéndose en p21 activa. Luego se pro­duce la interacción con la molécula efectora que finalmentetransmite la señal. La activación finaliza cuando GAP (“GTPasaActivating PTotein”) reacciona con p21rafly la obliga a hidroli­zar el GTP, pasando nuevamente a su estado basal inactivo.

La proteína GAP, fue descubierta en 1987 (Trahey et al, 1987),presenta un peso molecular de 120000 e interacciona con leI1mcon baja afinidad, estimulando alrededor de 100 veces la activi­dad GTPásica de p21 normal. Aunque interacciona con p21 transfor­mante, falla en su actividad estimulatoria, comoera de esperar(McCormick et al, 1989).

A pesar de que se considera a GAPsimplemente como un reguladornegativo de pZF‘S, existen algunas evidencias que le asignan elpapel de verdadero efector de la acción de ras:

* GAPinteractúa con p21 en el sitio definido como"sitio efec­tor“. Mutaciones en dicho sitio que bloquean su capacidadtransformante también inhiben la interacción con GAP(Calés etal, 1988)

* GAPinteractúa con todos los tipos conocidos de p21 indicandoque se trata de un regulador posterior a la acción de ras

* El complejo (¡Elr83—GAP)bloquea la apertura de canales de K+en células atriales, sin interferir con la acción de Gx (Yata­ni et al, 1990)

* La proteína raplA interacciona con GAP con una mayor afinidadque pZIPCB;sin embargo, GAPno puede estimular la actividadGTPásica de rapLA(Hata et al, 1990). Si GAPno fuera efectory sólo un regulador negativo, el secuestro por parte de rapUkproduciría una activación permanente de p21'i9, y posteriortransformación celular. En cambio, se ha reportado que rapU\es capaz de revertir células transformadas por pZPuFr‘Ba unfenotipo normal (Kitayama et al, 1989). Ninguna de estas ase­

INTRODUCCION - 24 ­

veraciones constituye una prueba de que GAP sea efector deras. Es más bien como se pregunta Alan Hall: "GAPcontrola aras o ras controla a GAP? La respuesta parece ser: Si" (Hall,A., 1990).

Otro dato que complica el panorama y a la vez lo abre, es que elreceptor para factor de crecimiento derivado de plaquetas[(PDGF)-R] fosforila en un residuo tirosina a GAP, formando pos­teriormente un complejo Junto a otras proteinas fosfolipasa C­X,3‘fosfatidil inositol quinasa y proteina Ref-1. Sin embargo, encélulas transformadas por p21c-Hn-ri', que son defectivas paraciertas respuestas a PDGF,GAPno es fosforilada ni interaccionacon el receptor (Kaplan et al, 1990).

Comose puede observar, el control del crecimiento celular en ma­míferos se presenta comouna compleja red de entidades proteicascon iguales caracteristicas pero diferente acción funcional.

También ha sido reportado el clonado de un nuevo miembro de lasproteínas ras en Néurospora crassa (Altschuler et a1, 1990) y lacaracterización inmunológicade otro integrante en procariotes,Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes (Martinettoet al, 1991 comunicación personal).

Aparte de las proteinas ras, otras tres subfamilias coexistendentro de la famflia ras:

* subfamilia rap

* subfamilia pZSR-r.­

* subfamilia ral; ninguna de ellas tiene ca­pacidad transformante.

Comose ha dicho anteriormente, raplA (también conocida comoKrev-l o smgp21), seria la contraparte de las acciones transfor­mantes de ras. A pesar de que GAPno estimula la actividad GTP­ásica de rapLA,éste seria un inhibidor competitivo de la uniónp21ri° con GAP.Ha sido identificada una proteina distinta de

INTRODUCCION — 25 ­

(ras)-GAPque si estimula la hidrólisis de GTP de raplA (Hata etal, 1990), llamada üÉEÚ-GAP,complicando aún más los modelos deacción.

La función de las otras dos proteinas, p233-ras y ral, aún no seconoce (Downward, J., 1990).

Familia Rho

Las proteinas Rho son una serie de proteinas de peso molecularentre 20000 y 25000 que, Junto a las rac, son sustratos de ADP­ribosilación de la exoenzima C3 de Clostridium botulinum que mo­difica una asparragina en la zona efectora.

Algunos resultados sugieren que las proteinas RhoJugarian un pa­pel importante en el control de la organización celular del cito­esqueleto (Rubin et al, 1988), mientras que las rac estarían in­volucradas en procesos secretorios (Didsbury et al, 1989). Algu­nas proteinas que influencian las actividades de Rhohan sido ca­racterizadas:

* uüuv-GAP, activador de la GTPasa de Rho

* aúna-GDS, estimulador del intercambio GTP-GDPde Rho

* (rhoy4flfl, inhibidor del intercambio GTP-GDPde Rho(Fukumoto et al, 1990)

Familia rab

Las primeras proteinas caracterizadas de esta familia, fueronYPTly SEC4de S. cerevisiae (Gibbs et al, 1989), que intervienenen procesos secretorios. Utilizando sondas de YPTl, fueron clona­dos los genes correspondientes a la subfamilia rab y, por su ho­mologia con las parientes de levadura, se piensa que actúan tam­bién en mecanismos de secreción. Ademas se descubrió un Üïflfl-GDI

INTRODUCCION - 26 —

que regularía de manera inhibitoria el intercambio GTP-GDPde lasproteinas rab.

Comopuede apreciarse en esta pequeña pero densa lista, para cadaproteina de la superfamilia ras ha sido identificada, o está envías de serlo, (Figura 5)

una proteina activadora de la actividad GTPásica GAP

una proteina estimuladora del intercambio GTP-GDP GDS

una proteina inhibidora del intercambio GTP-GDP GDI

Euna proteína efectora\ /EFECTOR

(GAPH

a pesar de que dia a dia selas

De acuerdo con los datos aportados,diversifica la cantidad de procesos en los que intervendrian

superfamilia ras (proliferación celular, arqui­transporte intracelular), el modelode traspaso

proteínas de latectura celular,de la información sigue siendo el mismoen todos los casos.

INTRODUCCION — 27 ­

ARF(Factor de ADP-ribosilación)

ARFes una proteina de 21 kD, que une GTPy que es un cofactornecesario para la reacción de ADP-ribosilación por la toxina deV. cholerae. Está localizada abundantemente en citoplasma aunquedesarrolla su acción en la cara citoplasmática de la membrana.

Ha sido purificada (Kahn et al, 1984) y clonada de cerebro bovinoy levadura (Price et al, 1988)(Sewell et al, 1988), muestra homo­logía con p21c-HR-ras en las zonas involucradas en la unión deGTP,y presenta un residuo aspártico en la posición 26 correspon­diente a la glicina 12 de p21, reemplazo que resulta en una dis­minución de la actividad GTPásica (McCormicket al, 1985) en lap21ri9. Este “cambio”es consistente con la nula actividad de hi­drólisis de GTPobservada en ARF(Kahn et al, 1986). Tampoco sedetectó hidrólisis cuando se incluye G. en el ensayo. Este resul­tado sugiere que ARF tiene una actividad latente que se expresacomoresultado de alguna interacción con otra proteína no carac­terizada hasta el momento, una posible (ARE-GAP.

Las condiciones de binding de GTPpara ARFson totalmente dife­rentes a las requeridas por las subunidades a y pZIPlB. ARFnece­sita alta fuerza iónica (vgr 0.8 Men NaCl) y un entorno hidrofó­bico (dimiristoil fosfatidil colina 3 mM).Los mecanismoscelula­res de activación y desactivación de ARFserían distintos de losmodelos propuestos para la regulación de otras proteínas que unenGTP.

MECANISMO DE ACCION DE PROTEINAS G

Las proteinas G utilizan un único mecanismomolecular de acciónindependientemente de la diversidad de señales recibidas y de losmensajes intracelulares generados. Este mecanismode acción pre­senta dos caracteristicas: direccionalidad y amplificación.

La direccionalidad es obra de la actividad GTPásica, instrumentoexclusivo de las proteinas G, que impide que la información re­

INTRODUCCION — 28 ­

grese hacia el receptor. En este caso, la inactivación de la se­ñal, producto de la hidrólisis del GTP,es irreversible y paravolver a activarse es necesario que la proteína G se una al re­ceptor. Es decir, la activación y la inactivación ocurren por ca­minos y mecanismosmoleculares distintos, a diferencia del alos­terismo.

La amplificación, caracteristica imprescindible para una trans­ducción de señal eficiente e inmediata, ocurre a dos niveles(Figura 6):

GK o GDP o GW¡lsll

g E

SEÑAL __, 2

EXTERNA G“ . GTP

GM——+

E)€

RESPUESTA CELULAR

Í 1 1 102-103 102-103 105- mi]

FACTOR DEAMPUFmAGON

El primero consiste en la activación de gran cantidad de protei­nas G a partir de una sola molécula de receptor activada. En elcaso del proceso de visión, la amplificación es máxima, ya que

INTRODUCCION — 29 —

una sola molécula de rodopsina activada por un fotón interactúacon unas 500 a 1000 moléculas de transducina (Fung et al, 1980)(Lynch et a1, 1986). El segundo nivel en la amplificación de laseñal ocurre en la interacción transductor-efector y es indepen­diente del primer evento de amplificación. La proteína efectora,al interaccionar con la proteina G activada, produce gran canti­dad de segundos mensajeros antes de que la actividad GTPásicaapague la señal

La figura 7 muestra el mecanismogeneral de acción de las protei­nas G, descripto hasta hoy.

e A .¿- m¿5-337

El heterotrímero a-(GDP)BZ(forma inactiva) se une al receptorque ha sido previamente activado (R*); dicha interacción cataliza

INTRODUCCION — 30 ­

el intercambio de GTPpor GDP, pues acelera la disociación delGDPdel sitio de unión al nucleótido. La entrada de GTP producela separación de a-(GTP)BX de R* que se encuentra listo paraunirse a otra proteina G inactiva. El complejo a-(GTP)BX tienevida corta, y rápidamente se disocia en a-(GTP) (forma activa) yB3; a-(GTP) se une a la molécula efectora (E) y la activa (E*),generando asi el segundo mensajero correspondiente (A-vB). Laactividad GTPásicaintrínseca apaga la activación del efector,pues el complejo a-(GDP) se disocia del mismo. Finalmente, a­(GDP)se une a BKlibre y se encuentra el heterotrimero formado,nuevamentelisto para otro ciclo de activación-desactivación.

ESTRUCTURA DE LA SUBUNIDAD a

Las estructuras cristalinas de la pZIPRBy del factor bacterianode traducción EF-Tu (Jurnak et al, 1985)(Pai et al, 1990), sonmuysimilares. Ya anteriormente se habia visto que alineando lasecuencia aminoacidica de estas dos proteinas y la de la subuni­dad a aparecia un arreglo característico con cuatro zonas alta­mente conservadas (Halliday, K., 1984). Estas cuatro regiones,designadas A, C, E y G juegan un papel preponderante en las ac­ciones que son comunes a todas las proteinas G, como se ha com­probado mediante la cristalografia de rayos X, mientras que lassecuencias no conservadas son las que les otorgan especificidadde acción a los distintos integrantes de la familia. En 1986 Mas­ters y Bourne,(Figura 8), mediante predicción de secuencia, to­

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mandola estructura cristalográfica de Ef-Tu, realizaron una ver­sión esquemática de una subunidad a (Masters et al, 1986). Allise puede ver la molécula de GTPinsertada en su sitio de unión ylas cuatro zonas a las cuales se refería Halliday.

La región A constituye un rulo en donde se forman los enlaces en­tre la proteina y los fosfatos a y B del nucleótido (Pai et al,1989). Esta zona estaría involucrada en la regulación de la hi­drólisis del GTP. La secuencia aminoacidica GXXGXGKS(GAGESGKSpara las subunidades a, con excepción de aa) está presente sinvariaciones en proteínas transductoras de señales (proteínas G,superfamilia Ras y factores de traducción) y con mínimos cambiosen enzimas que unen GTPcomopor ejemplo, adenilil y guanilil ci­clasas (Green, M., 1989), replicasas virales (Hodgman,T., 1988),etc. La mutación en la glicina 12 en p21ri° produce una proteínacon una alta actividad transformante (Tong et al, 1989) y con ba­ja capacidad de hidrólisis de GTP(Barbacid et al, 1987).

La región C (DXXG)está conservada en todas las proteínas con ac­tividad GTPásica. El residuo aspartato (D) se uniría, medianteuna molécula de agua, al Mg2+(catalizador)(Pai et al, 1990),mientras que el protón de la glicina (G) formaría un enlace puen­te de hidrógeno con el fosfato X del GTP. Comoera de esperar, laconformación de esta zona, a diferencia de la región A, difierenotablemente en sus dos formas posibles (unida a GTPo a GDP).

La región E, que contiene aminoácidos hidrofóbicos (FXAAL),Juntoa la zona G (NKXD)forman un “bolsillo hidrofóbico” para la uniónde la base (especificidad de nucleótido). Los oxígenos del carbo­no del aspartato (D) formarian enlaces puentes de hidrógeno conla base y los protones de la asparragina (N) y lisina (K) estabi­lizarian la unión. Mutacionesen el aspartato reducen la especi­ficidad, no pudiendo discriminar entre GDP e IDP (Sigal et al,1986).

Otros grupos (Lochrie et al, 1988)(Bourne et al, 1991) consideranotra región (I para subunidad a y G5para pZF“) que estaría in­volucrada en la unión del nucleótido, estabilizando la región G.

INTRODUCCION - 32 ­

MECANISMO MOLECULAR DE ACCION DE LAS PROTEINAS G

1) Estado inactivo. Interacción de a con BK

La forma a-(GDP) debe unirse a las subunidades BS antes de hacer­lo con el receptor, ya que éste presenta mayor afinidad con elheterotrímero que con las partes separadas (Florio et al, 1989).De igual manera, BE "prefiere unirse" a a-GDPque a a-GTP, produ­ciendo una reducción (alrededor de 100 veces) en la disociacióndel GDPde la subunidad a. Esto incrementa la eficiencia de laseñal ya que el intercambio GTP-GDPsólo se dará cuando se una alreceptor y no de manera espontánea. Hay evidencias que sugierenque la zona NHz-terminal de a es necesaria para la interaccióncon BS. La remoción proteolitica de los primeros 20 aminoácidosde la transducina anulan la unión con HS (Navon et al, 1987),aunquela alta variabilidad en esta región y su alta hidrofilici­dad no ayudan en nada a afianzar esta teoría. Quizás sea más im­portante para dicha interacción la estructura secundaria (a héli­ce) que la secuencia primaria. Es posible también, que las sub­unidades 8 sean las que proporcionan la especificidad de esta in­teracción.

2) Intercambio GTP-GDP.Interacción con el receptor

Los receptores de membranapara hormonas, luz u otro tipo de es­tímulos encargados de formar el estado activo [a-(GTP)], presen­tan secuencia primaria conservada y similar topología, como severá luego (Lefkowitz et al, 1988).

Existen variadas evidencias sobre la participación de la zonaCOOH-terminalde las subunidades a en la interacción con el re­ceptor:

* La ADP-ribosilación por toxina de B. pertussis de una cisteinalocalizada a 4 residuos del extremo COHH-terminal de a1, ao yaz, bloquea la respuesta de estas proteinas G a sus respecti­vos receptores (Ui et al, 1984)(Van Dop et al, 1984a).

El modelo de dicha interacción sugiere que la unión dela la zona COOH-terminalrelajaría las uniones entre la base y losaminoácidos de las zonascientemente (Osawa et al,ca ag/a42 (figura 10) se activó constitutivamente a la adenilil

ciclasa, aún en ausencia de agonista,estuviera activando el intercambio,tución de esos 33 aminoácidos finales no pueden suprimir la libe­

INTRODUCCION - 33 ­

La mutación UNCen ag provoca los mismos cambios, el desacoplede Ga con los receptores que estimulan la adenilil ciclasa(Haga et al, 1977).

Anticuerpos dirigidos contra la zona COOH-terminalde at blo­quean su interacción con la rodopsina (Cerione et al, 1988).

La arrestina que compite con la transducina en su unión con larodopsina (ver mecanismode visión), desactivando el sistema,presenta alta homología con at en la zona GOGH-terminal(Wistow et al, 1986).

La proteína quimérica aL/aa (figura 9) produce en células S49(deficientes en de) una respuesta estimulatoria de la adenililciclasa a hormonasB-adrenérgicas (Masters et a1, 1988).

receptor

G e I, liberando el GDPal medio. Re­1990) utilizando otra proteína quiméri­

NH2 COOH

J kl

1 356 397

comosi el receptor siemprelo cual sugiere que la susti­

INTRODUCCION — 34 ­

ración de GDP,propia de la ag cuando ésta no interactúa con elreceptor.

3) Estado activo- Interacción con el efector

La localización de la región de interacción de a con el efectorno es precisa.

Se había propuesto que dicha zona se hallaba entre la zona A y Cde Halliday, pero experimentos de 1988 en los que se utilizaronproteinas quiméricas descartaron dicha suposición (Masters et al,1988). Actualmente se especula que es la zona GOGH-terminal, laencargada de transmitir la señal al efector, aunque experimentoscon otro gen quimérico demostraron que 36 residuos del extremoCOOH-terminal de ag no llevan dicha información (Woonet al,1989).

El grupo de Johnson en 1990, utilizando también la estrategia dequimera de genes, concluye que la zona de unión a la adenilil ci­clasa comprendeun tracto de 130 aminoácidos dentro del cual es­tán las zonas E y G. También proponen que la secuencia NH2-termi­nal regularia la velocidad de la activación por GTP independien­temente de la actividad GTPásica, es decir, actuaria comoun ate­nuador y sugieren un modelo de los dominios reguladores de lasubunidad a (Osawaet al, 1990)(Figura 11 ; aclaración: TC: toxi­na de Víbrío cholerae ; TP: toxina de Bbrdetella pertussis ).

ZONAS DE A c G I

HALLIDAY t hP Interaccion ln eraccnonAtenuador Efector Receptor

NH2

INTRODUCCION - 35 ­

4) Fin del ciclo. Hidrólisis del GTP

Luego de que el complejo activado a-(GTP) interacciona con muchasmoléculas de efectores, se produce la hidrólisis del GTPpor me­dio de la actividad GTPásica, intrínseca en el caso de las sub­

en el caso de la superfamilia Ras. Para queunidades a o por GAP,el complejo activado debeaquel paso de amplificación ocurra,

permanecer comotal durante un considerable periodo temporal[hasta algunos segundos en el caso de transducina (Navon et al,1984)]. Esto se supone claro para el caso de las proteínas de la

para hidrolizar el GTP, la apa­superfamilia Ras pues necesitan,pero aún es un verdadero mis­rición de una nueva proteina (GAP),

terio cómocontrolan ese “tiempo” las subunidades a.

La zona de actividad GTPásica en las subunidades a estaria loca­lizada entre las zonas A y C, y se propone, comose ve en la fi­gura 12, un dominio parecido a GAPdentro de la proteina a.

REGIONES Í Í (Í l

COOH

Corroborando este dato se descubrieron mutaciones oncogénicas engenes a que reemplazan la arginina 201 por otros aminoácidos,produciendo la inhibición de la actividad GTPásica (Landis et al,1989)(Lyons et al, 1990).

Comose ha visto hasta ahora, alteraciones en las proteinas G (enlas subunidades a) producen desequilibros metabólicos que deri­van, en algunos casos, en proliferación de células anómalas.

Han sido bien definidas, por ejemplo, las mutaciones en genes

INTRODUCCION - 36 ­

Ras, las mutaciones cyc- en el linfoma S49 (Salomon et al, 1981),y la mutación UNCque desacopla el sistema de transducción de se­ñal. Asimismo, se descubrió que:

* pacientes con pseudo hipoparatiroidismo del tipo I asociadocon la enfermedad hereditaria de osteodistrofia de Albrighttienen una deficiencia genética en el gen de, no producida pordeleción ni rearreglos (Levine et al, 1988).

* la proteína F del virus HIVdel SIDAes una fosfoproteina queune GTPcon comportamiento similar a p21r8° (Guy et al, 1987).

* la diabetes tipo I está acoplada con una pérdida de la expre­sión de G1en higado de rata (Spiegel et al, 1985).

* tumores pituitarios (no todos) llevan una mutación somática(gsp) que inhibe la actividad GTPásica de ag, activando cons­titutivamente a la adenilil ciclasa, sin necesidad de la hor­monadel crecimiento (GH)(Landis et al, 1989). Luego, testean­do genes para otras subunidades a en dichos tumores encontra­ron mutaciones en el gen de 012 (gipZ) que provoca la inhibi­ción de la acumulación de AMPciclico (Lyons et a1 , 1990)(Wonget al, 1991).Ambosoncogenes, gip2 y gsp, serian los responsables de dichostumores.

Estos resultados, y especialmente este último, inducirian a con­siderar a las proteinas G comoproductos proteicos de protoonco­genes, de tal manera que mutaciones que alteren su funcionamientodesencadenarian una respuesta tumorigénica. Pero es peligroso ge­neralizar, pues bien lo dice Henry Bourne: "Es importante consi­derar que los efectos transformantes de a. postulados pueden serllevados a cabo sólo en un pequeño conjunto de células diferen­ciadas, programadaspara proliferar en respuesta a altos nivelesde AMPC,tales comoovario, corteza adrenal, tiroide y algunascélulas de la hipófisis”.

Estas afirmaciones son bastante criteriosas y correctas, aunquees importante destacar que la transcripción del oncogen c-fos se

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encuentra regulada por la acción de la proteina quinasa depen­diente de AMPc,que proteinas que controlan el ciclo celular tam­bién son reguladas por fosforilación y que Ha-ras aumenta la ac­tividad de c-Jun (Binetruy et al, 1991). De igual manera, es re­levante mencionar que la alteración funcional de otras proteinasG, tal como G1, Go, Gt o G2, que no se encuentran acopladas aadenilil ciclasa, podrían desencadenar eventos de transformacióncelular a través de modificaciones en las actividades de protei­nas efectoras, tales comofosfolipasa C, proteina quinasa C, ca­nales de Ca2+ o de K+. Frank McCormickya especula sobre estasbases: "Es posible que la activación de proteína G pudiera desen­cadenar transformación maligna. Es por eso que estamos expectan­tes sobre esta nueva serie de oncogenes, la mayoria con funciónbiológica conocida”.

MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

1) ADP-RIBOSILACION

La ADP-ribosilación comprende un grupo de modificaciones pos­traduccionales en las que se une un grupo ADP-ribosa a aminoá­oidos específicos de determinadas proteínas (vgr, proteínas G)utilizando NAD+como donor (Figura 13). Hoy día, se considera

CNHZ \\ I‘NHZ

N l/

N l > 9 9 N/k N o CHZ’O'P'O'P'O'CHZO QN ' '

OH OH

Ho OH HO OH

a-NAD‘

que la ADP-ribosilación es una de las mejores maneras que pre­sentan los organismos vivos para modificar sus estructurasproteicas, y por consiguiente, sus funciones (Wold, F., 1981).Los dos grupos de reacciones de ADP-ribosilación, monoADP-ri­

INTRODUCCION - 38 —

bosilación y poli ADP-ribosilación, no sólo difieren en lalongitud de la cadena sino también, en las caracteristicas delresiduo aminoacidico blanco, en el tipo de enzima modificadoray en el sitio de reacción.

poliADP-ri­bosilación nuclear con vejez y eutanasia celular y reparacióndel DNA(Gaal et al, 1987). ADP­ribosilación predomina, en un factor de 10, sobre la poli ADP­

Hoydía existen bastantes datos que relacionan la

Se ha reportado que la mono

ribosilación (Uedaet al, 1985), lo cual resalta la importan­cia de aquélla en células eucariotas, bajo condiciones fisio­lógicas.

Hasta ahora, la ADP-ribosilación de proteinas G ha sido apro­vechada comoherramienta en los ensayos de purificación y ca­racterización de las mismas, utilizando comoenzimas modifica­doras a toxinas bacterianas. Pero lo que aún no se ha diluci­dado es si realmente la ADP-ribosilación interviene, como me­canismo regulatorio, en los procesos de transducción de seña­les mediados por proteínas G. Un importante avance se logró alcaracterizar diferentes tipos de monoADP-ribosiltransferasas,a saber (Tabla B):

AMINOACIDO PESO FUENTE LOCALIZA­TIPO QUE MODIFICA MOLECULAR EXTRACCION CION CITAS

A arginina 25500 eritrocitos citosólica Mosset a1,1980higado Moss et al,1981

B arginina 32000 eritrocitos citosólica Yost et ¿1,1983

C arginina 35000 eritrocitos membrana West et a1,1986

A' arginina 27500 eritrocitos nuclear Tanigawaet a1,1984

INTRODUCCION - 39 ­

La existencia de una ADP-ribosil-arginina hidrolasa apoya fuer­temente la hipótesis de que la ABF-ribosilación de proteínaspuede ser reversible y que Juega un papel importante en la re­gulación de células animales (Moss et al, 1985). En 1988, uti­lizando la ADP-ribosil transferasa C de glóbulos rojos humanos,se realizó la primera ADP-ribosilación de una proteína G (a1) encondiciones que se podrían considerar fisiológicas (Tanumaet al,1988). Esto sugiere que esta enzima podria regular endógenamentelos sistemas de transducción de señales mediante la ADP­ribosilación de proteinas G.

Desde el punto de vista no fisiológico, se ha visto que lastoxinas de Víbrio cholerae, Bbrdetella pertussís y Cüostridiumbotulinum, producen la ADP-ribosilación de proteínas G. Esto fueutilizado comocriterio de existencia de alguna proteina G y desu clasificación en subfamilias.

Toxina de Vïbrio cholerae

Este producto proteico es el responsable de las devastadoras con­secuencias del cólera. Su efecto resulta en una activación perma­nente de la adenilil ciclasa, provocando un aumentodescontroladodel AMPcíclico. Esto se debe a que la ADP-ribosilación de ag,por ejemplo, produce una drástica disminución en la actividadGTPásica (Cassel et al, 1977), manteniendo irreversiblemente laforma ag-GTPque activa permanentemente a la adenilil ciclasa.

La holotoxina está compuesta por una subunidad A y cinco subuni­dades B, con un peso molecular total de 84000. La subunidad A esla encargada de olivar el B-NAD+y de transferir covalentementeel grupo ADP-ribosa a la subunidad a de las proteinas G, mientrasque las subunidades B son responsables de la entrada de la toxinaa la célula. Los sustratos de esta toxina más estudiados son lassubunidades ag (Northup et al, 1980) y transducina (Van Dop etal, 1984b), viéndose en ambas que el aminoácido modificado erauna arginina. No se pudo encontrar ADP-ribosilación de a1, ag, ao

INTRODUCCION - 40 —

aunque por análisis de secuencia se comprobóla presencia de ar­ginina blanco (Figura 14):

PROTEINA SECUENCIA BLANCO ADP-RIBOSILACION

aa L L R C R V L T S +

au V L R S R V K T T +

aora L L R C R V L T S +?

a1 V L R T R V K T T

ao V L R T R V K T T

dz I L R S R D K T T ­

Esto sugiere que la presencia de la arginina blanco es necesaria,pero no suficiente, para la ADP-ribosilación por toxina de V.cholerae requiriendo además de ésta un entorno aminoacidico pecu­liar para actuar. En el caso de COLE, la secuencia aminoacidicaconcuerda en un 100%con la de a. en dicha zona blanco y, ademásen preparaciones crudas de cilios olfatorios se encontró la pre­sencia de bandas de ADP-ribosilación (Bruch et al, 1987). Aunquepara tener la certeza, habria que realizar los mismosensayos conel producto del clon recombinante puro.

Se ha descubierto en 1986, la presencia de un factor necesariopara la ADP-ribosilación por toxina de V. cholerae. Dicho factor(ARF)comoya fue descripto anteriormente, es una proteina de 21kD de membrana, que une GTP y forma el complejo ag-ARF-(GTP), quesería el verdadero sustrato de la toxina.

La presencia de ARFen todas las células eucarióticas hasta ahoraprobadas y la alta conservación sugieren un papel más importanteque el de ser cofactor de una toxina que no es un integrante fi­siológico de la célula. Aún no se conoce el efector de ARF y,hasta ahora no se lo ha podido adjudicar comocofactor para nin­guna de las ADP-ribosil transferasas endógenas.

INTRODUCCION - 41 ­

Toxina de Bbrdbtella pertussis

El producto proteico secretado por la bacteria B. pertussis causaactivación de las células de los islotes pancreáticos , aumentarespuesta secretoria a glucosa, glucagón y epinefrina; estosefectos tanto comola sensibilización a histamina pueden contri­buir con algunos de los síntomas de la tos convulsa (Pittman, M.,1984). La toxina es un oligómero de 117000 D compuesta por cincosubunidades diferentes de la siguiente manera: 81-(82-84)(SB)(Sa-S4). La subunidad 81 es la que posee la actividad ADP-ribosiltransferasa y la NAD-glicohidrolasa (Mosset al, 1986), transfi­riendo el grupo ADP-ribosa a las subunidades a de G1 (Neer et al,1984), transducina (West et al, 1985) y Go (Tsai et al, 1987). Elsitio de la modificación es una cisteina cercana (a 4 aminoáci­dos) al extremo COOH-terminalde algunas subunidades a (Figura15):

PROTEINA SECUENCIA BLANCO ADP-RIBOSILACION

a1 N L K C G L F +

ao N L R C G L V +

at N L K C G L F +

a. H L R Y E L L ­

az N L K I G I C

La ADP-ribosilación por esta toxina bloquea la transmisión de laseñal de la proteína G sobre la que actúa, ya que acelera la li­beración de GTPestimulando la hidrólisis del mismo, dejando a laproteina en su conformación inactiva, (ríGDPKB.Asi interfierecon la inhibición de la adenilil ciclasa por G1, mediada por ago­nistas inhibitorios (Katada et al, 1980), con la interacción deGo con receptores muscarinicos (Kurose et al, 1986), y con la ac­tivación de Gt (VanDopet al, 1984).

INTRODUCCION — 42 ­

2) ACILACION

La mayoría de las proteinas G, con excepción de la transducina,sólo pueden ser extraídas de las membranasutilizando solucionesde detergentes; este comportamiento, que no se condice con su na­turaleza hidrofilica, puede ser explicado mediante el mecanismode acilación con lípidos que permitiría el anclaje de las proteí­nas G a la membrana(figura 16)

SHH /H

uHC\ /H H 9: A\C/ H E_OHNáwmmo,/C\/C\ /N\ /C\ / \ / \ /N CI; /C\ N ll C\H o H A H o H x

Fc A A x4

S / / /H/

"HC\C/HH "A/HÑ' 'c' OH/\/\/N\/C\/\/\/N C C N C‘— u / \ H II / \

0 H A o H x

PepUdasaMO HC/S H" H‘\ 1’

H/C\N/C\C/°‘- H llO

Carboxhnefiltranferasa

5 // z/ //o HC/ HÉ H \c/ 0—-CH3// \\N/’ \\4/

INTRODUCCION - 43 ­

Las proteinas de la familia ras se encuentran asociadas a la caracitoplasmática de la membrana,siendo éste el primer paso paradesencadenar su actividad transformante. Todas las proteinas raspresentan el dominio C-A-A-X(C, cisteína; A, aminoácido alifáti­co; y X, cualquier aminoácido), y cisteínas adicionales a pocosaminoácidos de dicho extremo.

Comose ve en la figura 16, un grupo farnesilo se une a la ciste­ina 186 mediante un enlace tioester (Casey et al, 1989b); luegose produce la remoción de los tres últimos aminoácidos (A-A-X)y,finalmente, la cisteína 186, ahora extremo COOH-terminal, sufreun proceso de carboximetilación (Anderegg et al, 1988) (Clarke eta1, 1988).

Tambiénlas demáscisteínas son propensas a las modificacionespor palmitato, siendo éste un evento posterior a la farnesila­ción. A pesar de que la palmitoilación parece contribuir al an­clado a membrana, no se lo requiere ni para la asociación conmembranani para su actividad oncogénica (Hancock et al, 1989).

Aunque el motivo C-A-A-Xtambién se encuentra presente en ao, a1y at (siendo la cisteína -4 el residuo blanco de la acción de latoxina de B. pertussis), no ha sido reportada aún ninguna modifi­cación postraduccional en dicha zona (Buss et al, 1987).

Coincidente con la apreciación anterior hay un trabajo en el cualsólo obtienen isoprenilación efectiva de au_luego de cambiar sus4 últimos aminoácidos (CGLF)por la zona COOH-terminal de H-ras(CVLS). Esto indica que la secuencia original (CGLF)no es reco­nocida por la enzima que lleva a cabo la isoprenilación, y queesta reacción no es característica de las proteínas G (Jones etal, 1990).

Sin embargo, se ha descripto la farnesilación y posterior metil­esterificación en la zona C-A-A-Xde la subunidad 32 de la trans­ducina, mientras que en Bu; dichas modificaciones no ocurren. Es­ta diferencia seria la responsable de la diferente afinidad de dtpor 3ta y th, es decir que la acilación de 3 estaria involucrada

INTRODUCCION - 44 ­

en la interacción con Gt y fic más que en el anclado a membrana(Fukada et al, 1990).

Numerosasproteínas son capaces de incorporar un residuo miristi­co, en la glicina +2, y aunque se cree que sirve para el anclajea membrana, su función real no ha sido totalmente dilucidada; a1,ao, az y ac presentan dicho consenso, y en 1987 fue reportada lamiristilación de estas subunidades a mediante inmunoprecipitacióny análisis del residuo lipidico incorporado (Buss et al, 1987).I­gualmente el significado funcional de ésta modificación no ha si­do aún aclarado.

RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEINAS G

La mayoria de las hormonas y drogas inician su acción biológicainteractuando con receptores celulares.

El 80%de las hormonas y neurotransmisores conocidos ("mensajerosprimarios”), desencadenansu respuesta celular especifica a tra­vés de proteínas G que se encuentran acopladas a los receptores.Hasta este momentohan sido purificados y clonados 23 de dichosreceptores de mamíferos.

Ellos son:

01** cuatro opsinas (Nathans e a1, 1986)* tres receptores B-adrenérgicos 61,92YB3,

(Kobilka et al,1987a)(Frielle et al,1987)(Emorine et a1,1989)

* tres receptores a-adrenérgicos (Cotecchia et a1,1988)(Kobilka et al,1987b)(Regan et 31,1986)

* cinco tipos de receptores muscarinicos (Martin et al,1990)* receptores para neurosustancia K (Masu et a1,1987)

I

I

I«IllIIII

lIl.llllIllIII

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(Fargin et a1,1988)(Bunzow et al,1988)(Van Tol et al,1991)(Sunahara et al,1991)

* receptores para 5-HT* receptores dopaminérgicos Dh-Ds

Basados en el análisis de predicción de conformación a partir dela secuencia, todos estos receptores pertenecen a una superfami­lia de proteínas que atraviesan siete veces la membranaplasmáti­ca y que tienen un extremo GOGH-terminal citoplasmático y un NH2­terminal extracelular (Figura 17).

H0n lllAlslh n.

n vcrrïnn

num“ n

Los receptores 131 y 82 adrenérgicoe son capaces de estimular laadenilil ciclasa a través de la proteína Ga. La desensibilizaciónhomóloga o específica de agonista del receptor B es mediada, comoen el caso de la rodopsina, por una proteína quinasa especifica(quinasa del receptor B—ARK—).Esta enzima, de 80 kD, fosforilaal receptor en su forma activa, unido al ligando, en una relación

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de 8 moles de fosfato por mol de receptor (Benovic et al, 1987).Recientemente, se descubrió el cofactor de la quinasa necesariopara inhibir la función del receptor, siendo aquél una proteinade 45 kD (B-arrestnun que se uniria al receptor fosforilado, im­pidiendo la interacción de este Ge (Lohse et al, 1990). Como seve, no sólo existe homologíaestructural, de secuencia entre larodopsina y el receptor B-adrenérgico, sino que los mecanismosdeactivación-desactivación, así comolos constituyentes proteicosencargados de llevar a cabo estos procesos, son similares.

El receptor d2-adren6rgnm:inhibe la adenilil ciclasa, via laproteína G1, mientras que ai-adrenargmcoestimula la fosfolipasa Cmediante la acción de una pobremente caracterizada proteína G.

Recientemente se aisló y caracterizó una potencial proteina G(llamada Gh) de 74 kD con una subunidad B de 50 kD que estaríaacoplada al receptor de ai en membranas de higado (Im et al, 1990a y b). El futuro clonado de dichas subunidades a y B despejaránlas dudas sobre la aparición de una nueva proteina G con pesosmoleculares diferentes al de todas las conocidas hasta ahora.

FOTORECEPTORES

La transducción de señales a través de fotoreceptores se basa enel cambio de conformación del grupo prostático de la proteina fo­toreceptora, con la subsecuente activación de la mismay el tras­paso de la información hasta la aparición de la respuesta final.

La rodopsina es uno de los fotoreceptores más estudiados y carac­terizados, y del cual se conoce a fondo la forma en que transducela señal luminosa. Asimismo, han sido clonados y caracterizadoslos fotoreceptores de conos, responsables de la visión en colo­res, proteinas que presentan alta homología (43%)con la rodopsi­na (Nathans et al, 1986).

En procariotes, el fotoreceptor más estudiado es la bactericro­dopsina de Hblobacterium halobium, que contiene una molécula de

INTRODUCCION - 47 ­

"todo-trans-retinal” unida a un residuo de lisina; un fotón causala isomerización del cromóforo al isómero 18-013; este cambioproduce la translocación de un protón hacia el medio exterior ydicho gradiente es el responsable de la generación de ATPpor laenzima ATPasa (Khorana, H., 1988).

Las plantas superiores contienen variados fotoreceptores que jue­gan un papel fundamental en el desarrollo vegetal. El más estu­diado y caracterizado es el fitocromo, una cromoproteina cito­plasmática de 120 a 127 kD covalentemente unida a un tetrapirrollineal.

FITOCROMO

El fitocromo existe en la planta en dos isoformas que presentandiferencias espectroscópicas, inmunológicas y, fundamentalmente,funcionales. La forma Pr tiene su máximo de absorción a 680 nm, yla otra (Pïr) a 730 nm, siendo ambas interconvertibles por absor­ción de la luz correspondiente. La luz roja (660 nm) convierte Pren PÏr, y la luz roja lejana (730 nm) revierte el efecto, pasandoPtr a Pr (figura 18).

LUZ ROJA(660nm)_A RESPUESTA

Pr ,——— Ptr BIOLOGICALUZ ROJA

LEJANA(730 nm)

La fotoconversión a Pfr en la célula induce numerosas respuestasmorfogénicas, tales comogerminación de las semillas, elongaciónde tallos, expansión de hojas, floración y senescencia, y la re­conversión a Pr cancela la inducción de dichas respuestas. Es de­

INTRODUCCION - 48 ­

Cir, el fitocromo funciona comoun switch biológico reversible,en el cual la forma PÏr es la activa, y la Pr es la inactiva.

Regulación de los niveles de fitocromo

La concentración celular de fitocromo es producto de los distin­tos niveles de control.

La molécula es sintetizada de novo en la forma Pr, acumulándoseen el citoplasma de los tejidos crecidos en oscuridad hasta al­canzar un estado estacionario que depende del balance entre lavelocidad de sintesis y la de degradación (Quail et al, 1973). Lairradiación de dichos tejidos vegetales genera una rápida dismi­nución de los niveles de fitocromo, pues la velocidad de degrada­ción de Pïr es 100 veces mayor que la de Pr. En plantas transfe­ridas a luz blanca continua, se establece un nuevo nivel constan­te de concentración de la proteína de alrededor del 3%del fito­cromoinicial, producto del balance entre la sintesis de Pr y ladegradación ahora, del Pïr (Hunt et al, 1979). El retorno del te­jido iluminado a la oscuridad produce la reacumulación del fito­cromo, en su forma Pr por síntesis de novo continua (Shimazaki etal, 1985). Este control puede observarse en la figura 19.

¿SL LUZPr Pfr

KD KD

DEGRADACION

siendo KsPr la constante, de orden cero, de la síntesis de Pr

KDPTla constante, de orden uno, de degradación de Pr

KDPïr la constante, de orden uno, de degradación de Pïr

INTRODUCCION — 49 ­

En 1985, el grupo de Peter Quail descubrió otro mecanismo de re­gulación de los niveles de fitocromo (Colbert et al, 1985). Seobservó, ya a los 15 min de haber dado un pulso de 5 segundos deluz roja (660 nm) a una planta crecida en oscuridad, una abruptadisminución de los niveles de mRNAde fitocromo, siendo completala degradación a las 2 hs. El efecto de la luz roja pudo ser re­vertido aplicándosele inmediatamente después de la irradiación,un pulso de 6 segundos de luz roja lejana (730 nm). Esto indicóque existia una autoregulación sobre los niveles citoplasmáticosde su propio mRNA. Entonces, el esquema de regulación se amplió(figura 20).

‘ IRNA Pr

GEN m mRNA LUZ—-__Ji» Jum- —KS—* —*<——

DEGRA D ACION

en el cual KstNA es la constante, de orden cero, de la síntesisdel mensajero

KDERNAes la constante, de orden uno, de degradacióndel mensajero

La fotoconversión a PÏr no sólo estimula la degradación de lacromoproteina, sino que también reduce la velocidad de sintesispor una disminución en los niveles de mRNA.

Comopuede observarse, todos estos mecanismos de regulación hacenque la activación del fitocromo con sus consiguientes respuestasfinales, sea un proceso rápido, efectivo, comosi estuviéramosconsiderando al traspaso de la señal luminosa, como “cuántos de

INTRODUCCION - 50 ­

transducción”; estos se generan (activación a PÏr), se utilizan(transducción de la señal), y desaparecen (autoregulación negati­va del fitocromo).

En realidad, también se debe tener en cuenta que las plantas noreciben, en su medio ambiente natural, radiaciones discriminadas;la luz solar contiene mayor proporción de luz roja que de rojalejana, pero también la transmisión de la luz diurna, a través deun entorno natural de plantas, causa una aguda disminución de labanda de luz roja frente a la de roja lejana, debido a la absor­ción de aquélla comoradiación fotosintéticamente activa (Smith,H., 1982). Entonces, la variación de las proporciones en dichasbandas causa cambios en el fotoequilibrio in vivo del fitocromo,muydiferentes a los que se logran en experimentos in Vitro conradiaciones discriminadas.

Pero, ¿cuál es la función in vivo de la fotoreversibilidad? Elfitocromo de la hoja, particularmente de una planta en una zonade densa vegetación está, comose dijo anteriormente, expuesto auna luz con baja proporción luz roja/luz roja lejana (R/F). Estacaracterística del medio ambiente puede haber sido el motivo dela presión de selección que ha sufrido en la evolución el fito­cromo comodetector de luz. Quedaria claro entonces, que la fun­ción más importante del fitocromo en la naturaleza es detectarvariaciones en la cantidad de luz y modificar el crecimiento deacuerdo a esos cambios.

Unclaro ejemplo es la elongación de los entrenudos de los tallosde plantas que no pueden crecer en zonas sombrias, cuando se dis­minuye la relación R/F, generándose plantas hasta 4 o 5 veces másaltas, como en el caso de Chenopodiumalbum (Kendrick et al,1983)(Morgan et al, 1976). Se reportó también, que cuando setransferian los brotes de Sinapsis alba a zonas con plantas deigual estatura, aquellas respondian elongando sus entrenudos; es­ta respuesta se reprimía cuando se bloqueaban los internodos a laradiación roja lejana reflejada por las demásplantas (Ballaré etal, 1990).

INTRODUCCION — 51 ­

La germinación de semillas de Püantago major disminuye de un 95%,-cuando R/F es 1,18- a un 5% (R/F de 0,10) demostrando que lassemillas no germinan si "detectan" que las futuras plantas no po­drán fotosintetizar lo necesario para asegurar un crecimientoadecuado (Frankland et al, 1980).

Modode acción del fitocromo

Los primeros trabajos en los cuales se observaba activación dealgún proceso fenotípico en la planta (germinación de la lechuga,por ejemplo) por luz roja y reVersión del mismopor el efecto deluz roja lejana, se remontan a más de 50 años (Flint et al,1937).

Ya en 1972, se propuso que el fitocromo mediaba los efectos sobreel desarrollo vegetal, ya sea por activación o represión de genesespecíficos y de sus productos. En 1977, Schopfer publicó unalista de 52 enzimas cuya expresión se modificaba por acción delfitocromo (Schopfer, P., 1977).

Ahora es ampliamente conocido que el fitocromo regula la trans­cripción de numerososgenes. Esta regulación puede ocurrir rápi­damente, comoes el caso de su autoregulación negativa y la regu­lación positiva de los genes de la subunidad pequeña de la ribu­losa bifosfato carboxilasa (rch)(Silverthone et al, 1984), olentamente como en el caso de B-amilasa (Sharma et al, 1982).

Ademásde una diferenciación temporal, existe una diferenciaciónespacial, ya que mientras el fitocromo inhibe la arginina de car­boxilasa en hipocótilos, al mismotiempo activa la enzima en ca­pullos (Dai et al, 1981).

Las grandes diferencias temporales y espaciales para cada una delas proteinas reguladas por fitocromo, sugiere la existencia demoléculas transductoras o transmisoras de la señal que serian di­ferentes para cada fotorespuesta, a pesar de que el inicio de lacadena de regulación sea el mismo (activación de fitocromo). Ya

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la acción primaria del fotoreceptor podria diferir, con respectoa cada respuesta individual, aumentandola multiplicidad de lasvias de transducción. Hasta ahora la naturaleza molecular de es­tas moléculas transmisoras no es conocida, asi como tampoco a quénivel del evento de transcripción ocurre la regulación.

En los últimos años hubo un gran avance en el estudio de las zo­nas promotoras de los genes regulados por fitocromo y sus corres­pondientes factores de transcripción. Estas secuencias especifi­cas (LRE: light responsíve elements) fueron principalmente estu­diadas en el promotor de rch utilizando técnicas de retardo engeles y fbotprinting. Las zonas y sus correspondientes factoreshasta ahora descriptos son:

* BOX II, III, II* y III* (o GT-l boxes) en cuyas zonas se uneespecificamente el factor GT-l (Green et al, 1988). Estas se­cuencias aparecen en numerosos genes regulados por fitocromo(Gilmartin et al, 1990).

* G-BOX,secuencia que se encuentra en otros genes igualmenteregulados, y en la cual se une el factor CG-l (Staiger et a1,1989).

* SAFl-SITE, es la zona más cercana al inicio de la transcrip­ción, y su papel en el promotor de rch aún no está totalmen­te dilucidado, aunque seguramente su contribución estaria da­da por la interacción con otras proteinas unidas a secuenciasadyacentes.

* AT-l SITE, se lo considera un sitio de activación de latranscripción, ya que su deleción reduce la transcripcióndrásticamente (Ueda et al, 1988).

* MOTIVOSGATA,al cual se le unirian por lo menos tres facto­res distintos, GAF-l, ASF-2 y SAF-l.

La capacidad de secuencias regulatorias de conferir regulación dela expresión en plantas heterólogas, sugiere que estos mecanismosestán de alguna manera conservados.

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La regulación ejercida por el fitocromo no ocurre solo a nivel dela transcripción sino que también regula la traducción, activa­ción o inactivación enzimática, etc. Por ejemplo a los 5 minutosde irradiar con luz roja hay un considerable aumento de la acti­vidad de nitratoreductasa, aparentemente producto de una simpleactivación post-traduccional (Johnson, C. 1976).

Eventos primarios en la activación del fitocromo

El mayor problema en descifrar el modode acción del fitocromo esque éste interviene en una gran variedad de procesos en todas lasfases del ciclo de vida de las plantas.

Existen también un gran número de fotorespuestas que se iniciandentro de los minutos o segundos luego de la irradiación de laplanta con la luz correspondiente, comopor ejemplo:

* movimiento de hojas de Mimosapúdica (planta sensitiva) a los20 min después de haber dado un pulso de 2 min con luz roja(Fondeville et al, 1966).

* cambio en la permeabilidad iónica de las membranasde ápicesde raíz, lo cual le permite adherirse a vidrio negativamentecargado; esta variación se observó a los 30 seg de irradiarcon luz roja (Tanada, T., 1968).

* movimiento de los cloroplastos en el alga verde Mbugeotia(Haupt, W., 1982).

* mitocondrias aisladas reducen NADP+exógeno a alta velocidaden presencia de luz roja, mientras que luz roja lejana re­vierte dicho efecto (Manabeet al, 1974).

La rapidez de dichas efectos sugiere que una de las primeras ac­ciones del fitocromo en iniciar una fotorespuesta debe correla­cionarse con la fototransformación de la proteina a su forma ac­tiva. Pero, la mayoria de la cadena de transducción de la señalluminosa luego de la formación del Prr hasta la aparición de una

r’w'”"“'”‘“ ' ' ' " ' l

INTRODUCCION — 54 —

fotorespuesta, permanece aún comouna “caja negra” (figura 21).

730nmPr 2-, Pfr—> Redístríbucionintracelular

GGOnm

7% CAJANEGRA/ Á

Cambiosen _ Transportepenneabiüdad deiones

Liberación de. Movimiento Orientación deSegundos mensajeros de hojas cloroplastos

ADN—> ARN Inactivacio'nde enzimas

Sintesis enzimática Activacíon enzimática

DIFERENCIACION CELULAR

Normalmenteel efecto de la luz roja sobre la fotorespuesta puedeser revertido por un pulso de luz roja lejana dado inmediatamentedespués de la primera irradiación. Si se inserta un intervalo deoscuridad entre ambospulsos, se observa un escape de la reversi­bilidad dependiendode la duración del intervalo. Esto significaque cuando el fitocromo completa su acción primaria, la señal setraspasa hacia el componenteposterior en la cadena. En este mo­mento se pierde la fotoreversibilidad, pues la señal ya ha sobre­pasado el campo de acción del fitocromo (Das et al, 1985)(Oelze—Karowet al, 1982). Se ha podido establecer estudiando la cinéti—ca del escape, que los eventos primarios del fitocromo se comple­tan dentro de los segundos o minutos, y que la manifestación dela fotorespuesta recién se desencadena horas o dias después.

La concreción, en tan poco tiempo, de los eventos primarios delfitocromo requiere una interacción eficiente entre Pbr y el/lossiguiente/s componente/s de la cadena de transducción de señales

INTRODUCCION - 55 ­

luminosas en la planta.

Hansido propuestas dos hipótesis concernientes a la primera ac­ción del fitocromo:

1) la forma Prr interacciona directa o indirectamente con lamembranaplasmática o con algún componente proteico de ella(Marmé et al, 1973), o que

2) el fitocromo activado interactúa con el genomaregulando losniveles de expresión (Tobin et a1, 1985).

Estudios inmunocitoquimicos demostraron que el fitocromo en co­leoptilos de avena crecidos en oscuridad, se encuentra uniforme­mente distribuído en el citoplasma en su forma Pr (Colemanet al,1974). Luegode la fotoactivación, la cromoproteina es secuestra­da formando numerosas áreas discretas (Verbelen et al, 1982). Es­ta distribución, obviamente, presenta reversibilidad luego deirradiar con luz roja lejana. En 1986, el grupo de Lee Pratt de­muestra por experimentos inmunocitoquímicos, que el secuestroocurre dentro de los 2 primeros segundos e involucra la asocia­ción rápida de PÏr, con algún sitio de unión, seguido de la agre­gación de dichas zonas de secuestro. Esta distribución intracelu­lar no es inhibida ni por colchicina ni por citocalasina B, indi­cando que estos eventos celulares no requieren la acción de mi­crotúbulos o microfilamentos (McCurdyet al, 1986).

La naturaleza de este reordenamiento permanece aún sin aclararse.De cualquier manera, el secuestro del fitocromo representa unejemplo único de una rápida, especifica y altamente controladaredistribución celular de una proteína en respuesta a un estímuloexterno.

Fitocromo y segundos mensajeros

Queda realmente claro que deben existir pasos de transducción dela señal entre la acción primaria del fitocromo (segundos a minu­

INTRODUCCION - 56 —

tos luego de la fotoactivación) y la expresión final de la foto­respuesta (horas o días, en algunos casos). Estos componentes,llamados segundos mensajeros, en analogía a las células animales,deben ser moléculas pequeñas, difusibles y que amplifiquen de ma­nera especifica la señal recibida. Muypoco, o casi nada, se haavanzado en lo que respecta a la caracterización de los componen­tes protéicos de dicha cadena de transducción, a pesar de la grancantidad de trabajos publicados y de las décadas dedicadas a re­solver este enigma. En 1989, el grupo de Nam-Hai Chua, en uno delos pocos trabajos concluyentes sobre el tema, demuestra que in­hibidores de calmodulina bloquean la inducción de la transcrip­ción del gen de la proteína a-b que une clofbrila (CAB), llevadaa cabo regularmente por fitocromo. Proponen que la activación dela calmodulina por irradiación es necesaria pero no suficientepara inducir expresión máxima del gen CAB(Lam et al, 1989).

Otro aporte interesante se realizó tomandocomorespuesta final,el engrosamiento o hinchazón de los protoplastos. Este procesoresponde a fitocromo y puede ser a la vez inducido por análogosno hidrolizables de GTP(GTP-X-S) y bloqueado, aún irradiando conluz roja, por inhibidores de PLC (neomicina) y por análogos nohidrolizables de GDP(GDP-B-S)(Bossen et al, 1990).

Todos estos aportes sugieren que en el sistema de transducción deseñales asociado a fitocromo intervendrían proteinas (proteínasG, calmodulina) y enzimas (PLC, proteína quinasa C), con caracte­rísticas similares a la de los sistemas animales.

Aúnobviamente resta caracterizar y probar fehacientemente susintervenciones, y aclarar de qué manera un solo receptor podríaactivar tantos caminosdiferentes de transducción a partir de unamisma señal.

Fitocromo y hormonas vegetales

La similitud en algunas de las respuestas provocadas por la foto­activación del fitocromo y por hormonasvegetales, sugiere que el

INTRODUCCION - 57 ­

fotoreceptor controlaría los niveles hormonales, y ambos seríanlos encargados de generar las fotorespuestas finales.

En algunos casos, la acción del fitocromo es imitada por el agre­gado exógeno de la hormona, comopor ejemplo, el ácido giberélico(GA) aumenta el tamaño de los protoplastos, tal como lo provocala luz roja (Blakeley et al, 1983); también el ácido indol-acé­tico (IAA) y el ácido abscicico (AA)producen la adherencia delos ápices de raiz, igual que la fotoactivación de la cromoprote­ína (Tanada, T., 1973).

Algunos reportes indican que el fitocromo regularia los niveleshormonales. Un pulso de luz roja aumenta, luego de 20 min, losniveles de GA(Hilton et a1, 1980). Datos contradictorios han si­do publicados para el caso de auxinas, citoquininas y etileno(Sharma, R., 1984).

También se ha propuesto que la acción del fitocromo y hormonasestarían ligadas, aunque numerosos trabajos sugieren que ambas sedesarrollarian independientemente.

Hasta la fecha resulta imposible cubrir todos los reportes refe­ridos al fitocromo y su modode regulación del desarrollo vege­tal. Queda claro que el primer evento de la fotomorfogénesis es1a activación de la cromoproteina a su forma Prr. Numerososestu­dios sobre la fotoquimica del receptor avalan esta afirmación(Aramendia et al, 1987). También quedan definidas las fotores­puestas inducidas por fitocromo, ya sea la activación de latranscripción de numerosos genes hasta la respuesta fenotipicafinal de la planta. Pero para una comprensión completa del proce­so de fotomorfogénesis se requiere una elucidación total del es­quemade la regulación de los caminos metabólicos del fitocromo,y para ello habrá que esperar, pues han transcurrido sólo 50 añosdesde los primeros experimentos.

INTRODUCCION - 58 —

EFECTORES ACOPLADOS A PROTEINAS G

Adenilil ciclasa

as investigaciones sobre los procesos de transducción de señalesL‘"

comenzaron en 1957, año del descubrimiento del AMPc.

A partir de esa fecha, y hasta nuestros dias, infinidad de publi­caciones, muchos descubrimientos y, a la vez, muchas contro­versias han conseguido contestar gran cantidad de preguntas, peroaún esta lista continúa siendo extensa.

En 1962, Sutherland y Rall demostraron la existencia de una ade­nilil ciclasa que era la responsable de la formación, a partir deATP, de AMPcíclico, metabolito intracelular de gran relevanciaen la respuesta a una cantidad de hormonas, neurotransmisores,drogas, etc.

Ya era importante el concepto de que las hormonas podían afectarel metabolito celular sin necesidad de entrar a la célula, apare­ciendo en escena de manera inevitable, la molécula receptora (Fi­gura 22).

Membranacehflar

ATP

Hormona—> R C —> lAMPC

INTRODUCCION- 59 ­

Luego, se descubrió que diferentes hormonas podían estimular unasola adenilil ciclasa a través de diferentes moléculas receptoras(Rodbell et al, 1970)(Figura 23).

Glucagon TSH ACTH LH Epinefrinacese ReceptoresHormonahs

Adenflfl dchsa

Mg ATP AMPc

Inmediatamentesurgió la teoria de la existencia de un transduc­tor que era el encargado de transmitir la señal desde el discri­minador (receptor hormonal) hasta el amplificador (adenilil ci­clasa)(Rodbell et al, 1971a)(Figura 24).

i x [ATPl l

DISCRIMI- ' TRANSDUCTOR ' AMPLIFICADORHORMONA.’> NADOR 'I l,

l

‘\ ‘ AMPC\ \

}———MEMBRANA PLASMAT!CA———-—|

El papel del GTPen la eStimulación hormonal de la adenilil ci­clasa fue descubierto en 1971; se vio que sin GTP, el glucagón notenia efecto sobre la formación de AMPcíclico (Rodbell et al,197lb), y que análogos no hidrolizables de GTP(vgr, GTPZtSJ) ac­tivaban la adenilil ciclasa en forma irreversible (Londoset al,1974), hecho que sugirió que el GTPera un activador más próximoa la adenilil ciclasa que la hormonay que el sitio regulatorio

INTRODUCCION — 60 —

de unión del GTPtendria que tener actividad GTPásica. Estos ha­llazgos obligaron a ampliar el modelo (Figura 25)

GLUCAGON

ADENluÜCLASA

TRANSDUG­TOR

MSCRHWP

En 1976 se descubrió la existencia de una actividad GTPásica enmembranasde eritrocitos de pavo, estimulada por hormonas e inhi­bida por toxina de V. cholerae. Para ese entonces, se propuso elprimer ciclo regulatorio de la "GTPasa",en el cual la hidrólisisdel GTPtermina con la estimulación del efector, y las hormonasfacilitan el intercambio GTP-GDF(Cassel et al, 1978)(Figura 26).

Toxinadel colera

Acmmsa(ïpachva

0°”

É° ¿eI ho

GTP Adenilíl piclasa GDP’PiInachva

En 1977, Pfeuffer demuestra, en un excelente trabajo, que el com­ponente regulador que une GTPera una proteína de 40 kD distinta

INTRODUCCION - 61 ­

del receptor y de la adenilil ciclasa (Pfeuffer, T., 1977). Esecomponente regulador fue llamado originalmente Ne (N por nucleó­tido) o G/F (por sus efectos de GTPy fluoruro). Paralelamente sedescubrió que el efecto hormonal inhibitorio de la adenilil ci­clasa estaba bajo el control de GTPy que, asi comoexistía unaGa, también estaba presente una G1encargada de transmitir la in­hibición (Hildebrandt et al, 1983b). Entonces era necesario rede­finir el modelo (Hildebrandt et al, 1984a)(Figura 27).

Hormonas HormonasEstimulantes Inhibitorias

RS RiJ

AMPc

A partir de allí comienza la controversia sobre el verdadero me­canismo de inhibición mediado por G1, controversia aclarada ante­riormente.

Pero se tornaba imperioso demostrar que dichas interacciones ocu­rrían realmente en la célula. Entonces comenzarona ser frecuen­tes los experimentos de reconstitución entre receptores, proteí—nas G y la adenilil ciclasa utilizando preparaciones puras de lasproteínas en vesículas fosfolipídicas (Cerione et al, 1984).

A pesar de haber sido el primer componente proteico descubierto,la adenilil ciclasa sucumbió, en lo que a caracterización se re­fiere, frente al avance de las proteinas G y receptores hormona­les.

Recién en 1989 se consiguió clonar la adenilil ciclasa de cerebro

INTRODUCCION — 62 —

bovino (Krupinski et al, 1989). A partir de la secuencia de sus1134 aminoácidos se puede inferir la presencia de dos dominios.Cada uno de ellos contiene seis pasos transmembrana (región hi­drofóbica) separados por regiones intracelulares (hidrofílicas),donde se produciría la unión del nucleótido y la catálisis (Figu­ra 283

cüoMasma

,P KC C

PKA

Desde el punto de vista topográfico, presenta alta homologia conproteinas transportadoras de membranay proteinas del canal aun­que no se encuentra apoyada por una similitud en la secuenciaaminoacidica. Posee también una secuencia consenso para la fosfo—rilación por proteina quinasa C y otra para la dependiente de AMPcíclico.

La adenilil ciclasa se encuentra presente en la mayoria de losorganismos a lo largo de la escala evolutiva, comopor ejemplo en

bacterias Eboherichia coli (Aiba et a1,1984)Bbrdetella pertussis (Ladant, D.,1988)Anabaena sp. (Bianchini et al, 1990)

hongos Efictyostellium discoideum (Kachatrian et al,1987)Saccharomycescerevisiae (Kataoka et al,1985)Neurospora crassa (Flawiá et al,1972ayb)MUcorrouxii (Cantore et a1,1982)

INTRODUCCION - 63 ­

protozoos ITypanosomacruzi (Torruella et al,1986)plantas Mbdicagvsativa (Carricarte et 31,1988)mamíferos B. taurus

hígado (Pohl et a1,1969)cerebro (Coussen et ¿1,1985)eritrocitos (Davorenet a1,1963)

(Figura 29)

CGR CGR CGR CGR CGR CGR? c CG c cAV! S REPÏILES MAMIFEROS ANFIBIOS PECES INVERÏEBRADOS PLANÏAS ALGAS HONGOS BACH RIAS

P C

Í HONGOSFLAGELADOS

¡oo - ¡05a

REPTILESPRIMIÏIVOS

METAZOOS

EUCARIOTESPRIHITIVOS

PROCARIOÏESPRIHIÏIVOS

3600-Io‘

En eucariotes inferiores el AMPcíclicodesarrolla variadas fun­ciones tales como, conidiación, elongación de hifas, agregacióncelular, germinacion de esporas, transporte, producción de meta­bolitos, etc.

Las adenilil ciclasas de bacterias y eucariotes inferiores pre­sentan sólo el componentecatalitico, siendo su sustrato exclusi­vamente ATP-Mn2+(protociclasas), mientras que las de eucariotessuperiores que se encuentran reguladas por proteínas G, utilizan

INTRODUCCION — 64 —

ATP-Mg2+como sustrato (holociclasas).

Las protociclasas presentan actividad sólo en presencia de ATP­Mn2+,son insensibles al fluoruro, a los nucleótidos de guanina,a forskolina y a las toxinas ADP-ribosilantes; algunas de ellas,como la de N. crassa, interaccionan además, con Ca2+ y calmoduli­na, siendo estimuladas en presencia de Mg2+(Reig et al, 1984).

TRANSDUCCION VISUAL

El proceso de transducción visual comienza con la conversión delos paquetes de energia electromagnética (fotones) en una res­puesta celular eléctrica (hiperpolarización celular) que será de­tectada a nivel de la sinápsis del nervio óptico y finalmenteanalizada en el cerebro.La transducción visual es llevada a cabopor las .células fotoreceptoras del ojo (Figura 30), que se en­

INTRODUCCION - 65 ­

cuentran ubicadas sobre la superficie de la retina. La córnea yel cristalino del ojo forman una imagen del mundoexterior sobrela capa celular de los fotoreceptores. Cadacélula absorbe la luzde cada uno de los puntos de la imagen y genera una señaleléctrica proporcional a la luz absorbida.

En la retina de la mayoría de los vertebrados existen dos tiposde células fotoreceptoras:

* bastones encargados de formar imágenes en blanco y negro bajoluz débil.

* conos células especializadas para la visión en colores encondiciones de luz diurna.

Los conos y los bastones presentan desde el punto de vista fun­cional, tres características fundamentales:

* Altisima sensibilidad, ya que un solo fotón puede activar atoda una célula.

* Reproducibilidad en la amplitud y tiempo de la respuesta fi­nal.

* Simplicidad y eficiencia, ya que toda la maquinaria encargadade tan trascendente proceso se encuentra concentrada en unaporción discreta de la célula, el segmentoexterno, separadadel resto, segmento interno, que es el encargado de generar laenergia y sintetizar las proteínas necesarias para dicho meca­nismo.

Células de los bastones

La estructura de los segmentos externos de bastones de retina esla de un sistema de doble membrana. Alrededor de 2000 discos seencuentran apilados en el segmento externo que, a su vez, poseesu membranaexterna propia y un citoplasma dividido en capas in­terdiscales de alrededor de 15 nm. La membranaplasmática luego

INTRODUCCION - 66 —

se invagina formando el oilio que conecta con el segmento internode los bastones (Figura 31).

SEGM ENTOEXTERNO

SEGMENTOINTERNO

PLASMATICA

CITOPLASMATICO

INTRADÍSCO

MITOCONDRIA

GOLGI

ENDOPLASMICO

TERMINALSINAPTICO

INTRODUCCION - 67 —

En oscuridad, las células fotoreceptoras no permanecen en un es­tado de latencia, sino que se encuentran activas. La membranace­lular externa separa soluciones que presentan diferentes concen—traciones de iones. El entorno externo está concentrado en ionesNa+, mientras que el citoplasmático en iones K+. Este gradientede concentración en ambos iones, es mantenido por la acción deuna "bombaNa+/K+”localizada en el segmento interno, que utilizaenergia para expulsar Na+ e introducir K+. Comola membrana delfotoreceptor es permeable al K+especialmente en el segmento in­terno, este tiende a salir al medio extracelular generando un po­tencial interno negativo en la célula. También, en oscuridad, elfotoreceptor presenta una apreciable permeabilidad al ión Na+ (enla zona del segmento externo), permitiendo la entrada del mismo.Así entonces se produce una “corriente eléctrica oscura" que re­sulta del balance de una corriente hacia el citoplasma (producidapor la entrada de Na+), y de una corriente desde el citoplasma(por la salida de K+)(Figura 32).

OSCURDAD LUZ

(Na‘) Na‘

Corriente Na"oscura

(K‘)

gana! deGMPcNa‘-—> Na’—'

Cuando la célula absorbe un fotón, el influjo de iones Na+ sebloquea reduciendo la corriente oscura e hiperpolarizando negati­

vamente elvoltaje transmembranavaríaluego de un flash de luz.

interior celular conde -40 mV en

Esta hiperpolarización es necesaria y

INTRODUCCION — 68 ­

respecto al medio externo. Ella oscuridad a -70 mV

suficiente para controlar el flujo de información a través de lasinápsis con otras neuronas del aparato visual.

La transducción deabarca desde la absorción del fotón hasta el cierre de los

señales, desde el punto de vista bioquímico,cana­

les de Na+ sensibles a GMPcíclico y es llevada a cabo en su tota­lidad sólo por 8 proteínas que se enumeran en la tabla C:

Peso Mole­No.de moléculasactivadas por

PROTEINA cular (kD) Ubicación un fotón

Rodopsina 39 Intrínseca l(membrana disco)

Transducina 80 Periférica 100-1000(39+37+6) (membrana disco)

Fosfodiesterasa 200 Periférica 100-1000de GMPc (88+84+13+13) (membrana disco)

Arrestina 48 Soluble 1

Rodopsina quinasa 65 Soluble 1

Guanilato ciclasa ? Soluble

Canal de Na+ 66 Intrinseca 100-1000sensible a GMPc (Segm.externo)

Bomba Na+/K+ Intrinseca(Segm. interno)

SegmentoExterno

SegmentoInterno

INTRODUCCION - 69 ­

La molécula de rodopsina es un componente intrínseco de la mem­brana del disco, mientras que la transducina y la fosfodiesterasade GMPcson periféricas, y la arrestina y rodopsina quinasa, so­lubles. (ATP,GMPc,GTPy Ca2+) viajan rápidamente desde el compartimento in­

Los metabolitos y segundos mensajeros generados

terdisco a la zona citoplasmática cercana a la membrana externa.La guanilato ciclasa no se encuentra asociada con los discos,mientras que el canal de Na+ sensible a GMPces un componente in­trínseco de la membranaexterna. Ambasproteínas regulan de manesra positiva y negativa, respectivamente, el contenido de GMPcin­tracelular (Figura 33).

ÜÜÜÜÜOÜÜÜ

SEGMENTOEXTERNO(bastoncito)

MEMBRANAExt

sCUERPOSNAPHCO

CELULA FOTORRECEPTORA(bastoncito de retina)

INTRODUCCION - 70 ­

Rodopsina

La rodopsina es la molécula receptora de la señal (fotón), encar­gada de iniciar este proceso de transducción de señales. Su con­centración es muy alta (alrededor de 3 mM,unas 1000 veces másque un receptor B-adrenérgico), comprendiendo alrededor del 90%de las proteinas integrales del disco. Esta cantidad se hace ne­cesaria debido al carácter fisico de la señal a recibir, ya quelos fotones no difunden en el medio extracelular, como las hormo­nas, antes de ser capturados por el receptor. Presenta siete pa­sos de hélice a a través de la membranade los discos, dos sitiosde N-glicosilación en la zona NHz-terminal y la zona COOH-termi­nal es la zona blanco de la fosforilación por la rodopsina quina­sa (Figura 34). El grupo cromóforo (ll-cis-retinal) se une me­diante un enlace base-Schiff a una lisina localizada en la mitadde la séptima hélice, permaneciendo en la mitad de la membrana,paralelo a su superficie.

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e.NL \

INTRODUCCION - 71 —

1) Estado basal oscuridad

En oscuridad, el cromóforo de la rodopsina permanece en su formainactiva (ll-cisretinal), y el sitio proteico lo protege de algu­na posible isomerización térmica. La transducina se encuentraunida a la membrana de los discos en su formatríGDPXM pero demanera débil, ya que puede ser extraída de los segmentos externosutilizando un buffér de baja fuerza iónica (Kühn, H., 1980)(Figura 35).

69.9ni

N

2) Primer paso- Interacción rodopsina-transducina inducida porluz

La luz isomeriza el cromóforode su forma inactiva (ll-cissreti­nal) a la forma "todo-trans“. Luego de pasar por varios interme­diarios, el proceso se detiene en la forma Metarodopsina II, enla cual la base de Schiff no está protonada y el cromóforo aúnunido a la lisina se encuentra en la forma todo-trans retinal

INTRODUCCION — 72 —

(Emeis et al, 1982)(Figura 36).

Ya activada la rodopsina, comienzan a producirse nuevos cambiosconformacionales en su cara citoplasmática (Vuonget al, 1987) detal maneraque los residuos serina y treonina se tornan suscepti­bles a la fosforilación por rodopsina quinasa, y esto se correla­ciona con una mayor sensibilidad de la zona COOH-terminala ladegradación proteica (Chabre et al, 1989).

Sin embargo, el más importante cambio es la aparición en la zonacitoplasmática del sitio de unión para la transducina, a tal pun­to que, si se suprime el GTP del medio, dicha interacción espermanente.

A pesar de que la acción catalitica de la rodopsina activada (R*)es sobre at, solamente,es necesaria la presencia de la holoprote­ína avíGDPrífi en la membranapara que se produzca dicha interac—ción (Fung et al, 1983).

En este momento se modifica la conformación de at y el GDPunidose libera rápidamente debido a una enorme variación en su cons­tante de disociación. El desplazamiento hacia el estadío au-(GTP)no estaria dado por una mayor constante de asociación para GTP

INTRODUCCION — 73 —

que para GDP(Bennet et al, 1985) (Figura 37),

sino que la unión del GTPproduciría un cambio en la conformaciónde at que causaría la disociación del complejo en sus tres com­ponentes: R*, BKy at—(GTP), liberándose este último hacia elcitoplasma (Figura 38). Esta liberación es prácticamente ins­

UHHHIH un n u u

H INN“ HH H ll

tantánea, siendo su duración total, medida en condiciones fisio­lógicas, de alrededor de l mseg (Vuong et al, 1984). Por eso esque, aunque sólo sean activadas pocas moléculas de rodopsina, lareacción de intercambio se completa sobre la totalidad de molé­

iINTRODUCCION - 74 —

culas de transducina, confirmandola alta amplificación.

3) Segundo paso. Activación de la fosfodiesterasa de GMPc

La activación de la fosfodiesterasa de GMPc(PDE-GMPC)por inter­mediode la transducina activada constituye en realidad el blo­queo de una inhibición.

La enzima es purificada como un heterotrímero (a-B-I) en una re­lación 1:1:1 en la holoenzima inactiva, siendo a y B las subuni­dades que le otorgan la actividad, e I el inhibidor de dicha ac­tividad.

La afinidad de I por PDE-aBes muy alta (Kdle-lo M), lo cual su­giere que el primer paso de la activación es la formación delcomplejo

aríGTP%{—PDEaB.

En este complejo, at interacciona con I, reduciéndole a éste suafinidad por PDEaBy, por lo tanto, liberando su acción inhibito­ria sobre PDEaB(Deterre et al, 1986)(Figura 39).

Hoydia se sabe que la relación es PDEthL con intermediariosactivos PDEaBy PDEaBI(Deterre et al, 1988).

INTRODUCCION - 75 ­

4) Señal de salida- Cierre de los canales de Na+ sensüfles aGMPcíclico

La fotoexcitación de una sola molécula de rodopsina produce luegode 0,2 seg, la hidrólisis de por lo menos lO5 moléculas de GMPC,hidrólisis suficiente para producir el cierre de todos los cana­les de Na+ sensibles a GMPcíclico en una longitud de 5 um (Figura40).

:MP 6;)ch‘6 ¡P

‘¿Voo

°‘ (5

IHHHHIH¡HHH IHHHIIlIHIHHHÍHHIIIHHHHH

MMMHULMUHUULUJUULUJUUULHJLU

En 1987 se purificó una proteina de 68 kD que seria la proteínadel canal de Na+ sensible a GMPoiclico. Cuando se la incorporó amembranade liposoma, la proteína purificada mediaba el eflujo deCa2+ de manera dependiente de GMPccon un coeficiente de Hill dealrededor de 3 (Cook et al, 1987). A pesar de que había variadosreportes sobre su exacta ubiación dentro de la célula del bastón,se probó, utilizando técnicas de purificación e inmunohistoquími­cas, que el canal de Na+se encontraba localizado exclusivamenteen la membranaplasmática (Cook et al, 1989).

5) Fin de la cascada

INTRODUCCION — 76 —

a)RQdQnsinaguinasayannesLina

Luegode 0,5 seg, las entidades proteicas comienzana desactivar­se, paralelamente, los canales dependientes de GMPCson reabier­tos y la célula recupera un estado inicial despolarizado basal,lista para responder a otro fotón.

La inacticación de R* es un proceso dependiente de ATPen el cualla rodopsina quinasa fosforila hasta 9 residuos serina y treoninade la zona GOGH-terminalde la rodopsina activada (Figura 41).

6.9.?

ATP)qu TokADP

Dli ÍRH

La multifosforilación impide aunque no completamente, la accióncatalitica de R* con at. En 1986, en un excelente trabajo, Kühndemuestra que la arrestina se une especificamente a R*, bloquean­do su capacidad de activar a la transducina (Wilden et al, 1986)(Figura 42).

INTRODUCCION — 77 —

b) Inanñdngina. Hidnáliñiñ del SIR

El bloqueo de la rodopsina activada es necesario, pero no sufi­ciente, para desactivar por completo el sistema, ya que el com­plejo ac-(GTP) podría seguir activando moléculas de PDE-GMPc.

La hidrólisis del GTP, al formar at-(GDP), produce un cambio con­formacional en la proteína, disminuyendo su afinidad por el inhi­bidor de la PDE-GMPc;de esta manera se produce la unión con lassubunidades B3 de la transducina, regenerando asi el heterotríme­ro (Chabre et al, 1989).

CAPITULO l

CAPITULO 1 - INTRODUCCION

CAP.1-INTRODUCCION - 80 ­

La reconstitución de sistemas heterólogos constituye basicamentela formación de un nuevo sistema de transducción de señales, enel cual se ha reemplazado alguno de sus constituyentes originalespor un integrante similar, de otra vía diferente. Tambiénconsis­te en el rearmado de las mismasentidades proteicas que transmi­ten la señal normalmente in vivo, en un sistema no fisiológicoconservativo (vesículas fosfolipidicas), pudiendo reproducir pasoa paso los eventos de transducción.

En general, el ensayo se lleva a cabo reemplazando las proteínasreceptoras, las proteínas G o las enzimas efectoras, produciendosistemas mixtos en los cuales se conserva el mecanismode accióna pesar de que se genera una respuesta final, diferente a la fi­siológica, frente a un mismoestímulo inicial.

Las tres técnicas másutilizadas son:

* fusión de membranaspuras mediada por polietilenglicol 6000;se produce la mezcla de las proteínas de ambas membranas pu­diéndose generar nuevos sistemas heterólogos.

* extracción con detergente de proteínas de membranay poste­rior adición a otras membranas.

* armadode vesículas fosfolipidicas utilizando los componentespurificados y generando el sistema que se desee investigar.

Con el uso de estos protocolos se ha logrado:

* reconstituir el sistema de receptor B-adrenérgico, proteína,Gey adenilil ciclasa en vesículas fosfolipidicas, a partirde sus constituyentes purificados, y lograr reproducir fiel­mente las respuestas de la enzima, obtenidas normalmente ensu entorno fisiológico (membranaplasmática)(Cerione et al,1984).

* rearmar en vesículas fosfolipidicas las interacciones entreel receptor B-adrenérgico, rodopsina, proteínas Ga, G1Y'Gt.Utilizando esta tecnica se comenzóa evidenciar que, a pesar

CAP.l-INTRODUCCION — 81 ­

de que actúen todas de igual manera, no son, las proteinas G,intercambiables para cualquier sistema; por ejemplo, transdu­cina y Ga interaccionan de manera muydébil con el receptorB-adrenérgico y rodopsina, respectivamente (Cerione et al,1985).

* diferenciar funcionalmente las subunidades 83 de G1 Y 58 detransducina, sugiriendo un potencial papel regulatorio a lassubunidades X (Cerione et al, 1987).

* reconstituir funcionalmente un sistema en el que receptorespara opiodes interactúan con G1y Go de cerebro bovino (Uedaet al, 1988) y en el que receptores muscarinicos interaccio­nan con Go (Florio et a1, 1989).

Estas reconstituciones proveyeron información pertinente sobre elmecanismogeneral de la interacción receptor-proteína G, de suespecificidad y sobre la capacidad de las enzimas efectoras pararesponder a determinadas drogas y hormonas. También sirvió paracomenzar a asignarle funcionalidad propia a las subunidades BK, ycomoherramienta para la elucidación de las zonas de contacto in­tramoleculares de los componentes en cuestión.

Todosestos ensayos se realizaron purificando y utilizando prote­ínas del mismotejido (es decir, que interactúan fisiológicamen­te), o a lo sumode diferentes tejidos pero siempre dentro delmismoser vivo, lo cual no permitía inferir sobre la conservaciónevolutiva de los constituyentes protéicos.

Este análisis se logró reconstituyendo sistemas en los cuales lascélulas animales proveian las moléculas receptoras y transducto­ras, y las células de eucariotes inferiores (Néurospora crassa oITypanosomacruzi), la molécula efectora (adenilil ciclasa).

Asi se logró "crear" una adenilil ciclasa de N. crassa (exclusi­vamente dependiente de ATP-Mn2+para formar AMPcíclico) que ac­tuaba en presencia de ATP-Mg2*y era activable por análogos nohidrolizables de GTPy agonistas B-adrenérgicos (Flawiá et al,1983). Esto implicaba que la adenilil ciclasa de eucariotes infe­

CAP.l-INTRODUCCION — 82 ­

riores era capaz de reconocer los componentesregulatorios de losvertebrados. La protociclasa de N. crassa presenta la gran venta­ja sobre todas las demás enzimas utilizadas en mecanismosde re­constitución, de no tener proteinas G asociadas, lo cual facilitala fusión de membranassin tener necesidad de purificar sus com­ponentes, comoen el caso de células animales.

De igual manera, se logró el mismoobjetivo utilizando factoresregulatorios de hígado y la adenilil ciclasa de T. cruzi (Eisens­chlos et al, 1986a).

CAPITULO 1 — OBJETIVOS

CAP.l-OBJETIVOS - 84 ­

Una de las metodologías mas novedosas empleada en los últimosaños, para el estudio de un sistema determinado es la formaciónde un nuevo sistema mixto.

Comparando de que manera se comporta el nuevo sistema con respec­to al original se puede obtener información precisa acerca delfuncionamiento de diferentes partes del sistema en estudio.

Un claro ejemplo es la inserción de fragmentos de ADNen un gendeterminado modificando, por ejemplo, la regulación de su trans­cripción, el destino final de la proteina sintetizada, sus carac­teristicas, etc.

De igual manera la producción de proteinas hibridas a partir dequimera de genes proporcionan información, única, sobre las zonasde interacción proteína-proteína.

Así también las reconstituciones de sistemas proteicos heterólo­gos proveen información acerca de la conservación evolutiva, des­de el punto de vista funcional, de los constituyentes proteicosde los sistemas de transduccción de señales; en algunos casos seconvierte también en la herramienta indicada para poder demostrarde manera fehaciente el funcionamiento de alguna proteína de mem­brana, por ejemplo, la existencia de una proteína G que regule lafosfolipasa C. Stockenius así lo demostró con la bacteriorodopsi­na.

Esta técnica de igual forma puede ser utilizada comovehiculo pa­ra acercar información acerca de la posible causa de determinadasenfermedades en las que se vean involucradas proteínas intervi­nientes en procesos de transducción de señales.

CAP.l-OBJETIVOS — 85 ­

En este capitulo se presenta, entonces, un nuevo sistema de re­constitución de proteinas heterólogas en el cual se genera unaadenilil ciclasa dependiente de la radiación visible utilizando ala enzima de un eucariote inferior (N. crassa) y rodopsina ytransducina bovina. También, utilizando el mismosistema, se des­criben estudios con preparaciones de ratones afectados por unadegeneración genética de las células de los fotoreceptores.

CAPITULO 1 — RESULTADOS

CAP.1—RESULTADOS - 87 ­

E l. .1 l i i .].] . J l i .E. i

de Neurospora 0153888

Conanterioridad a los ensayos de reconstitución, se midió la ac­tividad de la enzima adenilil ciclasa de membranasde N. crassaen preparaciones crudas y purificadas por gradientes de sacarosa.Este control se tornó imperioso realizarlo en cada medición, paraverificar la viabilidad del componentecatalitico de la adenililciclasa utilizado comovariable en las distintas fusiones de mem­branas.

Actividad Especifica(pmol/min.mgprot.)

N.crassa membr.crudas Mn2+ 734,50 i 15,00

Mg2* 7,00 i 0,50

N.crassa banda z 0,40M Mn2+ 954,00 i 16,40

(grad.sacarosa) Mg2+ 5,20 i 0,40

N.crassa banda z 0,60M Mn2+ 228,30 i 10,40

(grad.sacarosa) Mg2+ 4,30 i 0,40

N.crassa precipitado Mn2+ 55,20 i 9,60

(grad.sacarosa) Mg2* 1,90 i 0,10

Comose puede observar en la Tabla D, las membranas crudas de N.crassa presentaron una alta actividad de adenilil ciclasa depen­diente, casi exclusivamente, de Mn2+ATP.

Las mediciones efectuadas en las tres fracciones obtenidas del

CAP.1-RESULTADOS - 88 ­

gradiente de sacarosa, mostraron una banda densa (alrededor de0,40 Men sacarosa) con una muysignificativa actividad de la en­zima, en comparación con las otras dos zonas extraídas del gra­diente (alrededor de 4 veces con respecto a la banda de 0,60 Mensacarosa, y 19 veces con el precipitado).

Comparandocon la preparación cruda, las membranasobtenidas delgradiente de sacarosa fueron purificadas sólo en un 30%por locual se decidió, luego de utilizar esta preparación, seguir em­pleando las membranascrudas para los ensayos de reconstitución,ya que si bien éstas presentaban menoractividad específica, seganaba, a su vez, en tiempo pudiendo realizar las fusiones en elmismo día (sin tener necesidad de congelar las membranas a-70°C).

I . .. i J l .].] . J i l. "El

Otro ensayo que hubo que realizar antes de fusionar las membra­nas, fue el de encontrar la concentración necesaria y suficientede NEMpara inactivar la adenilil ciclasa de retina, para tenerla certeza de que en las fusiones de membranas todo el AMPcfueraproducido por la adenilil ciclasa de N. crassa.

Para ello, se trataron las membranasde ROScon distintas concen­traciones de NEMy, luego de 2 lavados con NaHCOsl mMse midióla actividad de adenilil ciclasa, utilizando Mg2*-ATPcomo sus­trato. Hay una importante inactivación de la enzima con l mM deNEM(40%de la actividad). Para ensayos posteriores, se empleóuna concentración de l mM de NEMque resultó suficiente para lainactivación casi total de la enzima de ROS,previniendo asi unaposible interferencia en las reconstituciones que, además, no fuetan elevada comopara inactivar los otros componentes proteicosde la retina.

CAP.1—RESULTADOS - 89 ­

Euaián_de_memhna.naa_deN- crasümmmlxaiaLdLBQLLinmrMMM.)En la figura 43 se exponen los datos de actividad especifica deadenilil ciclasa de membranasde N. crassa (cepa salvaje), demembranas de ROSy de sus fusiones correspondientes.

600­

'I'

500­

N-E

É 1.00­icnE' 300­

.EE\¿f 200­z<¡n03 |00­EO.

” vez-Ne @@an’ MgÏ' MgÏ’ Mgz’ M92’ Mgz' Mgz°-GTP

OSCURIDAD * ‘ ’ ’ ’

LUZ + o o o o o +

Confirmandodatos previos (Flawiá et al, 1983), la cepa salvajede N. crassa mantuvo su actividad enzimática (dependiente de Mn2+y despreciable en presencia de Mg2+)luego de la fusión mediadapor PEG, lo cual indicó que la enzima iba a mantenerse viable enlos ensayos de reconstitución heteróloga descriptos a continua­ción. También como era de esperar, las membranas de ROS (inacti­vadas con NEM),ya virgenes o fusionadas homólogamente y medidasen oscuridad o iluminadas, no presentaron actividad enzimáticadetectable, lo cual implicó que no hubo una plausible renaturali­zación de la adenilil ciclasa de ROSluego del ensayo de fusión

CAP.1-RESULTADOS - 90 —

(proceso que si hubiera ocurrido anularía todos los datos si­guientes).

Tampoco se formó, como podria suponerse, AMPccuando se mezcla­ron, sin fusionar con PEG, membranas de N. crassa y de ROS.

Finalmente, luego de fusionar las dos membranas, la preparaciónhíbrida mostró en oscuridad un pequeño incremento de la actividadenzimática. Este efecto fue frecuentemente observado en los sis­temas de reconstitución heteróloga entre membranasde N. crassa ymembranasde mamíferos que contenían proteinas G como transducto­ras de señal (Eisenschlos et al, 1986a y b). Pero, en presenciade luz blanca (iluminadás), se encontró una estimulación de 8 a10 veces en la actividad de la adenilil ciclasa de las membranasfusionadas.

Esto demuestra que existió una interacción entre la adenilil ci­clasa de N. crassa y los fotoreceptores y proteinas regulatoriasde ROS, y que dicho sistema reconstituido produjo AMPcsólo enpresencia de luz.

Comofue observado en otras reconstituciones (Flawiá et al, 1983)(Eisenschlos et al, 1986a y b), utilizando membranasde N. crassael alcance de la estimulación fue proporcional a la concentraciónde proteínas de la preparación de membranasde mamíferos. En esteexperimento, la máximaactividad enzimática fue observada utili­zando membranasde ROSa una concentración inicial (en la fusión)de 5 mg/ml. Mayores cantidades de membrana no incrementaron laactividad de adenilil ciclasa. Es importante señalar que no hubovariaciones en los datos obtenidos, ya sea iluminando en el mo­mento de fusionar ambas membranas o realizando la fusión en oscu­ridad e iluminando luego, durante el ensayo enzimático.

El agregado de GTP 10 uM o p[NH]ppG 10 uM en el ensayo enzimáticode las membranasfusionadas, incrementó en sólo un 25%la activi­dad de la adenilil ciclasa dependiente de luz, lo cual podria ex­plicarse por la presencia de GTP endógeno en las preparacionesproteicas que fueron fusionadas.

CAP.1-RESULTADOS — 91 ­

E ., i 1 ¡a M 223553 (cepa mutante Gr-1) X de BQS[. l. i HE“)

Para desechar la posibilidad de que la formación de AMPcen lasfusiones anteriores fuera simplementeproducida por una reactiva­ción, dependiente de la luz, de la adenilil oiolasa de retinacausada, por ejemplo, por lípidos de membranadel hongo, utiliza­mos para los ensayos de fusión de membranas, la cepa mutante deN. crassa cr-l (mutación puntual del genomaen el Grupo l de li­gamento), que era deficiente en adenilil ciclasa, tal como fuedescripta anteriormente (Flawiá et al, 1977).

Comose puede observar en la figura 44, dichas membranas de N.crassa no fueron capaces de reconstituir el sistema heterólogo.

1000­

o 1L Jrg > ‘ 5 5 >

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cE 100\Kíu, 50­2oEo.

Nc crísp! crispl INc-Nc [salvaje INccríSpl-ROSNEMIan‘ Mgz' an‘ Mgz' an‘ Mgz’ Mgz‘ ­

OSCURIDAD + + + + + + +

LUZ + + + + + + +

CAP.l-RESULTADOS - 92 —

I E] . i J l . l K E l E l . J _

l.l .. l l .1

La transducina es, hasta ahora, la única proteina G que puede serADPribosilada ya sea por la toxina del cólera o por la toxina deB. pertussis (Aboodet al, 1982)(Van Dop et al, 1984a). El efectodel tratamiento con estas toxinas sobre las membranas de ROScomopaso previo a la reconstitución, se observa en la Tabla E.

N. crassa ROSNEM Actividad A.ciclasa(MgZ*-ATP)(pmol/min.mg proteína)

oscuridad iluminadas

Salvaje control 1,0 i 0,5 188 + 3

Salvaje toxina cólera 2,0 i 0,5 225 + 4

Salvaje toxina pertussis 1,0 i 0,3 59 i 2

Es evidente que la toxina del cólera aumentó escasamente (20%) laactividad de la enzima reconstituida, mientras que la toxina deB. pertussis inhibió fuertemente la adenilil ciclasa dependientede luz. Estos resultados confirmaron los experimentos anterioresy fueron coincidentes con las observaciones previas, que la toxi­na de Hipertussis ADP-ribosila preferencialmente la forma holomé­rica, unida a GDPe inactiva de la transducina.

Consecuentemente, la afinidad de la transducina por la rodopsinafotoexcitada disminuye, y la fotoactivación de la enzima efectora(en este caso, adenilil ciclasa y, fisiológicamente, la PDE deGMPcíclico), es bloqueada.

Por otra parte, la toxina del cólera ADP-ribosila preferencial­mente y estabiliza la forma activa de la subunidad a de la trans­ducina, que es la que se encuentra unida a GTP.

CAP.1-RESULTADOS - 93 ­

D 1 . l J .l i i i i J . i. ., i J E _

.. l l

La rodopsina presenta su máximo de absorción entre 500 y550 nm-(Keirns, J- et al, 1975) Entonces, para aportar otro datoa favor de que en el sistema de reconstitución la rodopsina es laque actuó comoreceptor, se decidió medir la actividad enzimáticadel sistema reconstituido a diferentes longitudes de onda deirradiación.

Comose puede observar en la figura 45, el gráfico de producciónde AMPCen el sistema reconstituido concidió con el de absorciónde la rodopsina, presentando ambos un máximo a 500-550 nm.

eo}ONC'RNEM

60" /\°o

40­

o

20-/o

o

OH]! Í l l I l < ‘400 450 500 550 600 Luz Oscurldad

Longitud de onda (nm)

CAP.1—RESULTADOS - 94 —

Tal comose describe en Materiales y Métodos, los extractos hipo­tónicos de membranas de ROSfueron sembrados en una columna deDEAE-celulosaprocediéndose a la elución de las proteinas reteni«das especificamente en la resina, entre ellas, la transducina conun gradiente discontinuo de NaCl.

La figura 46 muestra el perfil de dicha columna, a la cual se lemidió unión específica de [35SJGTP—3—S,presentando total simili—tud con el gráfico descripto por los autores del método. El pico

2- —2. . _°_

E \ ’éD . L2 a

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32 g[L ¡11S 1- ‘ .s_ 2g Po\ o-‘| eo. o ° ru O­\ z

° ' 026

\%.ÁO /° n\- -_n AO A - A]- A - ¡/- .\/ l l I o

10 20 30 40 50 60

Volumen de elución (ml)

'e máxima unión específica de [35SJGTP—X—S(33-39 ml) se junto yse lo usó (comofuente de transducina parcialmente purificada){L

para los ensayos de reconstitución posteriores. Comocontrol ne­gativo se guardo un eluido de la columna que no presentó activi­dad de unión específica de [3581GTP-X-S.

lCAP.1—RESULTADOS — 95 —

C l 1 l . 1.1.1 i 1 l i . I l .. HE“

Evidencias previas (Ho et al, 1984) indicaban que la incubaciónde transducina purificada en presencia de 0,25 mMde NEM durante30 minutos a 22°C producía la pérdida total de la capacidad deunión especifica de [35SJGTP-X—Sde la transducina.

Considerandoque para inactivar la adenilil ciclasa de retina in­cubamos las membranas de ROS con l mM de NEM, se podria asumirque no quedaria transducina viable para los ensayos de reconsti­tución heteróloga. Sin embargo, comose puede observar en la fi­gura 47, fue evidente que alrededor del 50%de la actividad de

100

(%)

O

E o

"5 Ó< \ .\25'

Jo\o l r m 1_

o 1 2 3 4 5

NEM(mM)

unión especifica de [3581GTP—3—Sfue preservada en membranas deROS ( ) luego del tratamiento con NEMl mM.Por el contrario,luego de la extracción de membranay su posterior purificación,la transducina se inactivó totalmente ( ), indicando entonces quelos grupos SH de la transducina (necesarios para su viabilidad)son protegidos, de alguna manera, en el entorno membranoso.

CAP.l-RESULTADOS — 96 ­

E ., l 1 l Bos I l 1 . l. l. l J

con AL_QEaEEa_UEHXLJüLUüïfiil

Para asegurar que la reconstitución de adenilil ciclasa depen­diente de luz es también dependiente de la presencia de transdu­cina viable, se realizaron las fusiones de las membranas inacti­vadas, reactivadas y controles con N. crassa.

Los resultados se muestran en la Tabla F.

Actividad A. ciclasa(Mg2+—ATP)(pmol/min.mgprot)

N. crassa ROS FUSION oscuridad iluminadas

InactivasNEM N0 6,0 i 0,5 8,0 i 0,5

ReactivadaSNEM SI 2,0 i 0,3 2,0 i 0,3

N0 3,0 i 0,2 2,0 i 0,2

Salvaje InactivasNEM NO 2,0 i 1,0 3,0 i 1,5

Salvaje ReactivadasNEM SI 10,0 i 0,5 217,0 i 3,0

Salvaje ControlNEM SI 2,0 i 0,5 178,0 i 3,0

Salvaje Control de SI 2,0 i 0,4 3,0 i 0,4columnaNEM

Comopuede observarse, las membranas de ROSdepletadas de trans­ducina (inactivas) fueron incapaces de reconstituir el sistemaestimulado por luz. La adición de la preparación purificada de

CAP.l-RESULTADOS - 97 —

transducina a dichas membranas depletadas (membranas reactiva­das), restauraron la capacidad de reconstituir la actividad de laadenilil ciclasa estimulable por luz.

Por otra parte, cuando se añadió a las membranasdepletadas queluego serían fusionadas un eluído de la columna que no presentabaactividad de unión de [35SJGTP-3—S(control de columna) no huboreconstitución del sistema heterólogo.

A partir de todos estos datos, se puede asegurar que en el ensayode reconstitución, la proteína G que transduce la señal del re­ceptor (rodopsina) a la enzimaefectora (adenilil ciclasa), es latransducina de ROS.

La rodopsina y el receptor Beadrenérgico presentan entre si homo­logia de secuencia, tridimensional, de funcionamiento, de unión asimilares proteinas transductoras del tipo G, de mecanismos dedesensibilización, etc. (Dohlmanet al, 1987)(Sibley et al, 1987)(Figura 48). Tomandoen cuenta estos antecedentes, se realizó el

'- . :

‘Ï"'"I¿<-m15=é8,13

--xr-r-(-v-’I-om'o=o .ooo-n‘r-mJ-‘á

RDDDPSINA B-ADRENERGICD

CAP.1—RESULTADOS - 98 ­

ensayo de reconstitución heteróloga, preincubando en oscuridadlas membranasfusionadas en presencia de isoproterenol (agonistaB-adrenérgico) y propanolol (antagonista B-adrenérgico).

Comose puede observar en la figura 49, la preincubación con iso­

300 ’ NC'ROSNEM

U I Isoproierenol

.8 Ü lsoproferenolo propanold 155M

‘5O.m 200"E2É .

“ %_ 100- á?O

E %D. í%o á

-h\) .ho 10‘5 M 10'5M 10'7M ¡o'BM 10'9Ml ' gn

r ULCI u nOscuridad Luz

proterenol resultó en una activación sobre el basal obtenido conluz. Dicha sobreactivación fue proporcional a la concentracióndel agonista y fue completamente reVertida a niveles basalescuando en la preincubación se añadía propanolol 10“5 M, lo cualindicó que la sobreactivación fue especifica.

Es necesario comentar que para obtener dicha sobreactivación fuenecesario iluminar las membranasfusionadas, ya que la curva conel agonista realizada en oscuridad no presentó valores detecta­bles de formación de AMPc.Esto indicó que la luz es imprescindi­ble para la activación de la rodopsina y que, posiblemente, loque haga el isoproterenol sea mantener más tiempo activada a larodopsina.

CAP.1—RESULTADOS - 99 —

Conel objeto de aportar más datos que pudieran llegar a esclare­cer el mecanismode acción de la enfermedad degenerativa, retini­tis pigmentosa, se realizó el mismoesquemade reconstitución he­teróloga utilizando membranasde N. crassa y membranasde retinade ratón C57BL(normal). Los datos se ilustran en la figura 50.

1000* r}

5) ‘ %msE0‘én.

E‘. 300“

.EE ‘

\ 200- ‘Un.2<E mo­oEa

o ¿a [Éj rE1 [:1 E:NC-RNEM El man‘ MQZ' M926 MgZ' M920

OSCURIDAD o + 4.

LUZ + + + + +

Se observó que, en ratones normales C57BL, el mecanismo de re­constitución heteróloga funcionó tan eficientemente comoel deretina bovina.

CAP.1—RESULTADOS - 100 —

E .. i J ¡M l J .1 l. ¡ _l, E 1 a H i, ¡JI I. l. i "Em

En la figura 51 se puede observar que la cepa heterocigota adulta

300" “1/.

AMPc/mín/oprotel'naC

pmol

Nc-rdRNEM NC-TdRNEM"días adulta

NC‘RNEM NC-RNEM NC'RNEM NC-deNEM

Bdfas 11días adulta 8du’as

(rd/+) presentó niveles normales de formación de AMPcen el sis­tema heterólogo, mientras que la cepa homocigota adulta (rd/rd)fue capaz sólo parcialmente de reconstituir el sistema. Una in­terpretación de estos datos podria ser que a los 28-30 días (rataadulta) el proceso degenerativo habia eliminado todos los basto­nes (Carter et al, 1978) y que los pocos conos que permanecieronen la retina fueron los que contribuyeron en la reconstitucióndel sistema.

Conel objeto de detectar cambios más específicos, los estudiosfueron dirigidos hacia ratones de 8 y ll días, que es el momentocrítico en la diferenciación de los fotoreceptores normales o enel comienzo de la degeneración de los mismos (La Vail et al,1974). Como se muestra en la figura 51, a los 8 y 11 días ambosratones (rd/rd y rd/+) no fueron capaces de formar AMPCen pre­sencia de luz. El resultado en ratones homocigotas fue el espera­

CAP.l-RESULTADOS - 101 ­

do, y fue similar al del ratón adulto, producto de la degenera­ción de los bastones. En el caso de los ratones heterocigotas, elhecho de que ratones de 8 dias no presentaran niveles similaresal adulto se debería a que comoa partir de esa edad comienza aproducirse la diferenciación pigmentaria, los fotoreceptores nose encontraban funcionales comoen el caso de los adultos.

Lo que si llamó la atención fue que ratones de 11 dias (tiemponecesario para la maduración de las células fotoreceptoras), nofueron aptos en los ensayos de fusión. Una plausible explicaciónpara este resultado es que las proteínas G no se encontrarian enel mismoestado funcional que en las ratas adultas.

.- . . . . + +

de_fii_ll_diaa_z_adnltcs

Para tratar de dilucidar la causa de la falta de reconstituciónen ratas heterocigotas (rd/+) de ll dias, medimosactividad deadenilil ciclasa de retina (Hblociclasa) en presencia de ATP­Mg2+.

Comose observa en la figura 52 hubo una importante activación

300 l­

+ GppNHp0/0 rd/rd

pmolesAMPc/mín/mgProteínaC

CAP.1—RESULTADOS — 102 —

producida por GppNHpa los 8 y ll dias disminuyendo totalmente enratones adultos. Esto podría implicar que en los ratones adultosla actividad GTPásica es mucho menor o que la afinidad por el GTPes mayor si se lo compara con la de los ratones de 8 y 11 días.

Este resultado explica la ausencia de reconstitución en los rato­nes de 11 días (heterocigotas). Si dicha ausencia se debió a unafalta en la funcionalidad de la transducina, se podría revertir,comoen el caso de la adenilil ciclasa de retina, con el agregadode GppNHpen el ensayo de reconstitución.

E .- i 1 . i G ¡HI

Ratones heterocigotas de ll días, en presencia de GppNHp, final­mente presentaron valores normales de producción de AMPcen pre­sencia de luz (figura 53).

o 1.00­85 rd/oe t——-———-—'1Q

g 300­

.EE\g 200­3% rd /rd

'6

E 100- áa EE](D

NC’RNEM Nc-RNEM NC-RNEM Nc-rd RNEM NC-rdNEM Nc-rdNEM8dl'as Udías adulta 8dl'as Hdl'as adulta

Comose puede observar en ratones adultos heterocigotas, la acti­vación por GppNHpfue mínima, mientras que a los 8 días y en ra­tones homocigotas (rd/rd) los niveles de AMPCfueron muy bajos

aún en presencia de GppNHp.

CAP.l-RESULTADOS - 103 ­

Conel propósito de obtener otro control de la reconstitución, sedecidió preincubar las membranasrodopsina.anticuerpo inhibiódependiente de luz.

de retina con anticuerpo anti­Comose ve en la Tabla G, la preincubación con dicho

en un 66%la actividad de la adenilil ciclasaLa inhibición no fue total debido a que el

anticuerpo en cuestión no pudo neutralizar en su totalidad, a lagran cantidad de rodopsina presente en los bastones de retina.

Actividad adenililciclasa(pmol/mg.min)

N. crassa Retina ratón normal

Salvaje Sin agregados

Salvaje + Anti-Rodopsina

FUSION

SI 252 i 8

SI 84 i 3

CAPITULO 1 - CONCLUSIONES

CAP.l-CONCLUSIONES - 105 ­

En este capitulo se demostró que la adenilil ciclasa de Néurospo­ra crassa pudo interactuar con fotoreceptores y factores regula­torios de segmentos externos de bastones (ROS)de retina bovina.Comoresultado de dicha interacción, se ha reconstituido una ade­nilil ciclasa que utilizó a la luz comoagonista (Muschietti etal, 1989).

La interacción anteriormente mencionada se produjo entre la ng­dgpsina (que actúa como "receptor estimulatorio" de 1a adenililciclasa), 1a tranadngina (que funciona comoproteina G del tipoestimulatorio “Gs") y la adenilil_cinlaaa de N- crassa.

Las siguientes observaciones ratifican que fue efectivamente latransducina la involucrada en dicho sistema de reconstitución:

* Las membranas de ROSdepletadas de transducina no fueron capa­ces de reconstituir el sistema.

* El agregado de la preparación de transducina a dichas membra­nas depletadas restauraron la capacidad de producir AMPc enpresencia de luz.

* La ADP-ribosilación de las membranas de ROSpor toxina de B.pertussis provocó una disminución en la aptitud de reconsti­tuir el sistema.

* La ADPribosilación por toxina del cólera incrementó la acti­vidad de la adenilil ciclasa reconstituida.

A su vez, para la rodopsina:

* La curva de producción de AMPcen función de la longitud deonda de la luz irradiada coincidió con la curva de absorciónde la rodopsina.

CAP.l-CONCLUSIONES - 106 ­

* La preincubación de las membranas de ROScon anticuerpos anti­rodopsina bloqueó considerablemente el ensayo de reconstitu­ción.

Por otro lado, las retinas de ratones que padecen retinitis pig­mentosa (homocigotas, rd/rd) no fueron capaces de reconstituir elsistema heterólogo. Es importante destacar que en la enfermedaden ratones, el GMPcíclico comienza a acumularse en 1a retina an­tes de cualquier cambio morfológico. Dicho incremento en los ni­veles de GMPces causado por una deficiencia en la fosfodiestera­sa de GMPcíclico (Farber et al, 1974) (Farber et al, 1976). Estaenzima es normalmentesintetizada en retinas de ratones rd/rd(Farber et al, 1988), pero es activada mínimamentepor luz, locual podría implicar que la falla existe en la rodopsina o en latransducina. Dicha anormalidad está fundamentada por los bajosniveles obtenidos en la reconstitución heteróloga utilizando ra­tones rd/rd.

Coincidiendo con lo expuesto anteriormente, en retinas degenera­das se encontraron bajos niveles de fosforilación in vitro de larodopsina. Este defecto podria ser la consecuencia de alguna al­teración en los niveles de rodopsina o en la proteina quinasa derodopsina o en su fosfatasa específica.

Por otro lado, a pesar de que los niveles de ARNmensajeros quecodifican para la opsina y para las diferentes subunidades de latransducina son comparables en ratones +/+ y rd/rd, mínimas alte­raciones en la composicióno estructura de las proteínas transdu­cidas pueden ser los responsables de dichas anormalidades.

Estos resultados fueron importantes por la posibilidad de obteneruna adenilil ciclasa que use, in_yitng, a la luz en lugar de hor­monas. A través de la utilización de sistemas de reconstituciónheteróloga es posible investigar, comoen este caso, el motivo deenfermedades que involucren a proteinas presentes en procesos detransducción de señales (Ver Introducción).

CAPITULO 1 - METODOS

CAP.1-METODOS — 108 ­WQ ¡.. l Jl.

Se utilizaron para los ensayos de reconstitución heteróloga, lassiguientes cepas de Néurospora crassa:

St. Lawrence 74 salvaje (Flawiá et al, 1972a y b)Cr-l mutante deficiente en adenilil ciclasa

(Terenzi et al, 1974)

Estas cepas fueron crecidas en medios N de Vogel (Vogel,H., 1956)suplementados con sacarosa 2% (masa en volumen) y 2,5 ug/ml de d­biotina. Los cultivos se llevaron a cabo en Erlenmeyers de 2000ml que contenían 500 ml de medio de cultivo, durante 40 horas auna temperatura de 28-30°C con una agitación de 200 rpm.

El cultivo se inició con un inóculo de alrededor de 105 conidias/ml.

El micelio finalmente obtenido, se colectó por filtración en unembudoBuchner, se lavó con agua bidestilada y se guardó a -70°Chasta su ulterior procesamiento.

o]! .. l E .- . J l .E. l

El micelio anteriormente obtenido y congelado, fue molido en unmortero de acero inoxidable utilizando N2 líquido comodisgregan­te. El polvo congelado resultante, fue resuspendido en bufférTris-HCl 50 mMpH 7,4, DTT lmM, glicerol 2% en una relación de 1ml/g material húmedo,utilizando un homogeneizadorvidrio-vidrio.Dicha suspensión se centrifugó durante 10 minutos a 12000 xg y elsobrenadante obtenido se volvió a centrifugar a 105000xg por 2horas. El sedimento obtenido constituyó lo que luego se denominómambnanaacrudas. Esta fracción se resuspendió en una solución deNaHCOal mMhasta alcanzar una concentración de 5 mg/ml y fue in­

CAP.l-METODOS — 109 —

mediatamenteutilizada en los ensayos de reconstitución.

Conel propósito de obtener membranasplasmáticas purificadas pa­ra los experimentos de reconstitución, la fracción cruda se re­suspendió en NaHCOsl mMque contenía sacarosa 0,25 M. Este pre­parado se sembró en un gradiente discontinuo de sacarosa de0,40 M, 0,85 My 1,30 M, y se centrifugó durante 3 horas a 25000rpm en un rotor SW28.

Al finalizar la corrida se observaron dos bandas turbias de mate­rial (alrededor de 0,40 My 0,60 M), y un precipitado. Por aspi­ración con pipetas Pasteur se extrajeron dichas bandas, se dilu­yeron con NaHCOsl mMy se recentrifugaron a 105000 xg durante 2horas.A todas las fracciones obtenidas se les midió actividad deadenilil ciclasa con el objetivo de contar, para los posterioresensayos de reconstitución, con una enzima de gran actividad espe­cifica.

El procedimiento utilizado para la obtención de dichas membranas(Papermaster, 1974) se muestra en la figura 54.

01° ———————+'REnNA

MEMODEHOMOGENEMAGONmnmmn

PRECI'DITADOREHOMOGENHMON SOBRE 4ADANTE

[______4L______1 ////, mwmmPRECÍPITADO SOBRENÁDANTE I

(ROS crudas) PRECIPITADO SOBRENAOANTE

GRADIENTE DESACARÜSA

M

0,77

018,,Iflqmo¡"llll‘I’

«ROS purificados

CAP.1—METODOS — 110 —

Los ojos bovinos fueron obtenidos en el matadero local e inmedia­tamente colocados en hielo y en oscuridad, hasta su posteriorprocesamiento. Este fue llevado a cabo dentro de las 8 horas desu obtención.

Por cada preparación de ROSse utilizaron 60 ojos de vaca adulta.Primeramentese separó la parte anterior del ojo (iris, cristali­no) de la parte posterior (retina, coroide, nervio óptico), eli­minándose de esta manera el humor vítreo (figura 55).

VENA -—< " ' 'l CCRO'DESCILIAR

CONJUNTIVA

ESCLERÓTICA ,

3 CORNEA,,\conomss/ Q¿1'RETlNAá :\b

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Í,í/k: l

'7/ ’ CRISTAUNOZ .

NERV'O // ‘ï zonumOPTICO r DEsz

l PLEXOS

CILIARES .

' IIÏISERClÓN- MUSC. RECYO

De la parte posterior, la cual fue dada vuelta previamente, seextrajo la retina raspando sobre la superficie expuesta con unaespátula. Este procedimiento se debió realizar con mucho cuidadopara no arrastrar en el raspaje, células de la coroide. Luego dehaber despegado la retina, se cortó el nervio óptico y se la co—locó en un tubo de centrífuga en hielo. A cada tubo de centrífu­ga, con retinas de 10 ojos, se le agregó 10 ml del siguientebuffér:

Tris-HCl 5 mM, pH 7,4Sacarosa 40% (P/P)NaCl 65 mM

MgClz 2 mM y se homogeneizópor vortex 1 minuto (este procedimiento permite luego de liberar

CAP.1—METODOS- lll ­

los bastones del resto de tejido, cortar la mayoría de los basto­nes a la altura del cilio conector separando ROSde RIS).

Se centrifugaron los 6 tubos a 4000 rpm durante 4 minutos, y sejuntaron los sobrenadantes filtrándolos a través de una red denylon de 54 um en un Erlenmeyer de 500 m1. Los precipitados rema­nentes se volvieron a extraer, con igual volumen del mismobufÏEr, a homogeneizar y a centrifugar. A los dos sobrenadantesobtenidos se les agregó el doble de volumen (240 ml) del buÍÏErTris-HCl 50 mMpH 7,4, MgC12 1 mM.

La mezcla obtenida se centrifugó a 14000 rpm por 40 minutos; losprecipitados resultantes (membranas de ROScrudas) se resuspen­dieron en el mismo buffér anterior, suplementado con sacarosa0,77 M, se sembraron sobre un gradiente discontinuo de sacarosa,0,84 M, 1,00 M y 1,14 M, y se centrifugaron a 27000 rpm por 30minutos (Rotor SW-28).

Se obtuvo una banda blanca en la interfase 0,77 M/0,84 Mque co­rresponde a mitocondrias y ROSrotos durante el proceso de homo­geneización. El precipitado de color negro se debe a mitocondriasenteras, gránulos de pigmentos y células de la coroide que fueronarrastrados junto con la retina. Tambiénse observó una banda ro­sa en la interfase 1,00 M/l,14 M, producto de algunos discos deROSy, principalmente, de los segmentos internos de los bastones(RIS).

Finalmente se recuperó una densa banda roja, en la interfase0,84 M/l,00 Mque contenía aproximadamente el 90%de la rodopsinapresente en la retina Conuna pipeta Pasteur se extrajo cuida­dosamente esta interfase correspondiente a los ROSy se centrífu­gó a 17000 rpm por 30 minutos¿ Luego de dos lavados para eliminarla sacarosa, los precipitados de ROS se almacenaron a -70°C encompleta oscuridad­

El rendimiento usual es de 80-35 mg proteína de ROSpor cada ex­tracción de 60 ojos bovinos.

Es de fundamental importancia aclarar que todos los pasos corres­

CAP.1—METODOS - 112 —

pondientes a la purificación fueron (y deben ser) realizados bajoluz roja difusa.

E I ., .E. ._ l I i .

El métodode extracción y purificación parcial de transducina apartir de membranaspuras de segmentos exteriores de bastones(ROSm)es una modificación de los de Kühn (Kühn H.,1980) y Apple­bury (Baehr et al, 1982)(Figura 56)

ROSmBuffer Isotónico (2veces)

EN I_—L__1LUZ

ROJA SOBRENADANTE PRECIPITADO

DlFUSA I Buffer Hipotónico (3veces)

SOBRENADANTE PRECHNTADO

TRANSDUCINA

El precipitado de membranas (z20 mg) se resuspendió en 20 ml delbuffér isotónico

Tris-HCl lO mM, pH 7,4NaCl 60 mM

MgClz 5 mM

DTT 1 mM

PMSF lO uM se agitó en oscuri­dad, a 4°C durante 20 minutos y se centrifugó 30 minutos a 15000rpmen centrífuga Sorvall refrigerada. Esta primera extraccióntiene como propósito despegar de las membranas de ROSotras pro­teinas periféricas diferentes a la transducina. Luegode repetirel procedimientoanterior, se extrajo el precipitado resultante

CAP.1-METODOS - 113 —

con el buÍÏEr hipotónico

Tris-HCl 10 mM, pH 7,4DTT 1 mM

EDTA 0,1 mM

PMSF 10 uM durante 20 minutos,en total oscuridad, a 4°C con agitación. La mezcla obtenida secentrifugó a 15000 rpm por 30 minutos, se apartó el sobrenadante,y el precipitado se reextrajo dos veces más. De esta manera, lossobrenadantes obtenidos se encuentran mayoritariamente enriqueci­dos en transducina y, en menor proporción, en PDEde GMPcíclico.

Se sembraron los tres extractos conseguidos en una columna de in­tercambio aniónico del tipo DEAEcelulosa (volumen total: 20 ml)equilibrada con buffér Tris 50 mMpH 7,4, DTT 1 mMy EDTA0,1 mM,a un flujo de alrededor de 150 i 30 segundos/ml. Luego se lavócon 100 ml del buffer de equilibrio y, finalmente, se eluyeronlas proteinas retenidas especificamente por la resina (entreellas, la transducina) utilizando un gradiente por pasos de 0,1 M(10 ml) y 0,5 M (40 ml) en NaCl en el buÍÏEr de equilibrio. Seobtuvieron 20 fracciones de eluido de 3 ml cada una, las cualesfueron ensayadas junto con el sembrado, percolado y lavados, ensu capacidad de unir GTP(determinación característica de la pre­sencia de transducina).

Para dicho propósito, las membranaspuras de ROSfueron resuspen­didas en 10 ml de buffér hipotónico suplementado con l mM GTP,agitadas durante 20 minutos a 4°C y centrifugadas a 105000 xg du­rante 1 hora. Este paso de lavado fue repetido cuatro veces más.Estas preparaciones de membrana llamadas “membranas de ROS inac­tivas“ por ser inactivas en el proceso de transducción de señalesal ser depletada de transducina, se las guardó a —70°Cen oscuri­dad.

CAP.l-METODOS - 114 ­

Il.li l il. ¡Bos l i. .E._MWMembranas inactivas de ROS(100 ug de proteina) y eluidos de laDEAEcelulosa, en los cuales se encontró significativa unión de[35SJGTP—3-S-presencia de transducina- (200 ug de proteina),fueron incubados con buffér

Tris-HCl 20 mM, pH 7,5NaCl 100 mM

MgClz 5 mM

DTT 1 mM

EDTA 0,1 mM por 10 minutos a30°C, 30 minutos a 0°C, y 10 minutos a 30°C. La mezcla fue final­mente centrifugada a 105000 xg durante 60 minutos, y el precipi­tado obtenido fue lavado con igual buffér en dos ocasiones. Lasmembranas asi recuperadas se conocerán como “membranas de ROSreactivadhs (por la incorporación de transducina). Como controlnegativo se realizó el mismotratamiento entre las membranas in­activas y un eluido de la DEAEcelulosa que no habia presentadounión de [3551GTP—X-S(ausencia de transducina).

Membranasde ROS(controles, tratadas con toxinas, inactivas yreactivadas) fueron resuspendidas en NaHCOa1 mMhasta alcanzaruna concentración cercana a los 6 mg/ml e incubadas por 30 minu­tos a 37°C en presencia de N-etilmaleimida (NEM).La reacción fuedetenida por la adición de 6 volúmenes de NaHCOa1 mM.El preci­pitado de membranasfue recuperado luego de una centrifugación a105000 xg durante 60 minutos y posterior lavado con NaHCOsl mM.

pm“Para obtener la curva de unión de [35SJJir—3-S en función de NEM,precipitados de membranas de ROS y fracciones de transducina(eluidos de DEAEcelulosa) fueron preincubados con concentracio­nes variables de NEMy luego ensayados en su capacidad de unirespecificamente [35SJGTP-3—S.

CAP.1-METODOS - 115 ­

IW ' 'P Lmemtzcanas_dc__BQS_Qon_thina.de ZibciQQlefimfi yfirdeiemenmfisia

La mezcla de reacción para dicho tratamiento contenía 10 mg/ml deproteina de ROS, 20 ug/ml de toxina de V. cholera o 10 ug/ml detoxina de B. pertussis (ambas preactivadas con DTT20 mMpor 30minutos a 37°C) en el buffér

Tris-HCl 50 mM, pH 7,4MgC12 2 mM

DTT 1 mM

NAD+ 1 mM

ATP 1 mM en l ml de volumen

total. La incubación fue llevada a cabo en total oscuridad, a37°C por 30 minutos y detenida por la adición de 5 ml de Tris-HCl50 mMpH 7,5, DTT 1 mM. El precipitado de membranas fue recupera­do por una centrifugación a 105000 xg durante 60 minutos. Lasmembranascontroles de ROSfueron tratadas bajo las mismas condi­ciones pero omitiendo las toxinas.

BEIINA_DE_BAIQH

Q ¡.1. l

Las cepas de ratón utilizadas para los experimentos de reconsti­tución provenían de Simonsen Laboratories (Gilroy, California,Estados Unidos), y del Jules Stein Eye Institute (Universidad deCalifornia, Los Angeles), y fueron los siguientes:

C57BL/6N Control normal +/+

CS7BL/6Jrdle/rdle Homocigota para gen rd rd/rd(degeneración de receptores)

C57BL/6Jrdle/+ Heterocigota para gen rd rd/+(normal fenotipicamente)

CAP.1-METODOS - 116 ­

Unamás detallada descripción de las caracteristicas de dichosratones fue reportada por Shuster y Farber (Shuster, 1986). Losestudios fueron realizados con ratones de 30 días (adultos) odentro de los 8 a ll días de edad, pues ya a partir de esa edadse presenta una diferenciación normal (en +/+ y rd/+) o una dege­neración total (en rd/rd) de los bastones de retina.

Dll .. l l. i l,

Las retinas fueron seccionadas bajo luz roja difusa y homogenei­zadas en el bufÏEr

Hepes 5 mM, pH 6,9NaCl 130 mM

KCl 10 mM

MgClz 5 mM y la suspensión fuecentrifugada a 12000 rpm por 10 minutos. El precipitado obtenidofue guardado en oscuridad y a -70°C hasta su uso.

ENSAXQ_DE_BEQQNSIIIUQIQH_HEIEBQLQGA

E .. l l l. i 1. ¡.1 1. J [EEG 5000]

Las reconstituciones fueron realizadas tanto bajo luz roja difusa("OSCURIDAD")como bajo luz blanca fluorescente ("ILUMINADO").

Los diferentes precipitados de membranasde ROSbovina (contro­les, inactivas y reactivadhs) y de ratón -tratados con NEM-y lasmembranas(crudas o purificadas) de N. crassa, fueron resuspendi­das en NaHCOal mM(5,0 mg/ml y 4,8 mg/ml, respectivamente). Ali­cuotas de 0,25 ml de cada una de las suspensiones fueron mezcla­das e incubadas a 37°C con agitación durante 20 minutos. Luego seagregaron 0,50 ml de PEG 6000 (520 mg en 0,50 ml de NaHCOal mM)y la incubación (fusión de membranas) prosiguió durante 2 minutosmás. Finalmente, con el fin de detener la reacción de fusión, seincorporaron 8 ml de NaHCOs1 mMde manera muy lenta y la mezcla

CAP.1—METODOS — 117 —

obtenida se centrifugó a 105000 xg durante 60 minutos. Los pre­cipitados de membranas fusionadas fueron resuspendidos en NaHCOs1 mMe inmediatamente ensayados para adenilil ciclasa.

D i . J 1.] i i J 1 l . i. .,

Se estudió la incidencia de la irradiación monocromáticaa dife­rentes longitudes de onda sobre la actividad de la enzima adeni­lil ciclasa en las reconstituciones anteriormente detalladas. Pa­ra dicho propósito, el ensayo enzimático fue llevado a cabo pre­irradiando las membranasya fusionadas en oscuridad con luz mono­cromática a diferentes longitudes de onda (400 nm, 450 nm,500 nm, 550 nm y 600 nm). Comocontroles se realizaron tambiénmediciones en condiciones de oscuridad e iluminadas, comoya fue­ron detalladas.

I E] . l . I B i . .

Las membranasfusionadas en oscuridad fueron puestas en contactocon concentraciones variables del agonista B-adrenérgico 150 ing­encienenol y su antagonista anDanlQl. Luegode dichas preincu­baciones, realizadas también bajo luz roja difusa, se iluminó conluz blanca y se midió actividad de la enzima adenilil ciclasa. Eneste caso, el tiempo de incubación fue de 3 minutos.

I .¡ . i l. ¡.3 l .

Conanterioridad al ensayo de reconstitución heteróloga se proce­dió a preincubar las membranasa fusionar con una dilución 1:500del anticuerpo anti-rodopsina.Luego de 30 minutos de preincuba­ción las membranas fueron lavadas y listas para ser fusionadas.Los valores resultantes se compararoncon los obtenidos utilizan­do un suero preinmune como control.

CAP.1-METODOS - 118 —

ENSAIQ_DE_UNIQN_DE [35SFÉTP—X—S

Para determinar unión especifica de [35SJGTP-3-S(Northup et al,1982)(Wa1do et al, 1987), se incubaron 0,100 m1 de las muestrasproteicas (100-200 ug por ensayo) y 0,080 ml del bufÏEr

Tris-HCl 20 mM, pH 8EDTA 1 mM

DTT 1 mM

NaCl 100 mM

Lubrol PX 0,1% (v/v)

La reacción se inició con el agregado de [35SJGTP—X-S10 nM (3x105 cpm/ensayo; 1122 Ci/mmol), MgClz 10 mMy Lubrol PX 0,1%, y seincubó a 30°C por 60 minutos. La misma se detuvo, por dilución,con 2 ml del buffér

Tris-HCl 20 mM, pH 8NaCl 100 mM

MgClz 25 mM

Fosfato 1 mM y se filtró inme­diatamente a través de discos de nitrocelulosa (BA85Schleieher &Schuell). Posteriormente se lavó 5 veces cada filtro con 2 ml delmismo bufÏEr y se secaron en estufa a 75°C por 15 minutos. Luego,se colocaron los filtros en un vial de plástico (Polistor), seagregó mezcla centelleante (Tolueno-Omnifluor) (Kobayashi et al,1974) y se midió la radioactividad en un contador de centelleoliquido.

La unión inespecifica fue calculada realizando el mismo ensayopero en presencia de 100 uMGTP-X-S.

EHSAIQ_LmLAQIIMIDALLIELADEHILIL_QIQLASA

Se mezclaron 0,050 ml de la fuente enzimática (membranas crudas opuras de N. crassa, membranas de ROSy membranas fusionadas) conigual volumen de la mezcla de reacción, que contiene

CAP.l-METODOS — 119 ­

Tris-HCl 0,500 mM, pH 7,4MIX 0,2 mM

AMPc 1 mM

Fosfocreatina 2 mMCreatina quinasa 0,2 mg/ml(Mn2+ o Mg2+) 2,5 mM

a[32P]-ATP 0,5 mM(act.específica 50-200 cpm/pmol)

La mezcla anterior se incubó por 15 minutos a 37°C y se detuvoagregando 0,1 ml de una solución que contenía ATP 40 mMy 3H-AMPcíclico 12,5 mM(actividad específica 3800 cpm/mol) y se calentó3 minutos en un baño de agua hirviendo (Visconti et al, 1990).

El AMPcobtenido se purificó siguiendo el procedimiento de croma­tografía secuencial en columnas de DOWEX50W-X4(malla 200-400)(Bio-Rad) y alúmina. La base del método consiste en separar elAMPcradioactivo formado, de los otros fosfatos radioactivos(ATP, ADP, AMP,PPi, Pi), también producidos inespecificamente enla reacción, a través de una resina intercambiadora de cationes(DOWEX50w-X4); las proteinas de los grupos sulfónicos de la re­sina se intercambian con los NHsde la adenina de los nucleóti­dos. El AMPces el único compuesto de fosfato parcialmente rete­nido por la resina, pues su carga positiva (adenosina) no es to­talmente contrarrestada por la única carga negativa del grupofosfato. Luego del pasaje por la DOWEX50W-X4, el AMPces adicio­nalmente purificado en una columna de alúmina, que retiene a to­dos los fosfatos aún contaminantes.

La secuencia de pasos de la purificación comprende el agregadode:

1 ml de H20 en los tubos y se siembra sobre DOWEX,

1 ml de H20 sobre DOWEX,descartando el eluido,

4 ml de H20 sobre DOWEX,descartando el eluido,

6 ml de H20 sobre DOWEX,recogiendo el eluído sobre columnas dealúmina neutra,

CAP.l-METODOS - 120 —

l ml de Imidazol-HCl 100 mMpH 7,5 sobre alúmina, descartando eleluido,

4 ml de Imidazol-HCl 100 mMpH 7,5 sobre alúmina, recogiendo enviales de vidrio.

A cada vial se le agregaron 13 ml de líquido de centelleo (Bray,L-, 1960) y se determinó la radioactividad en un contador de cen­telleo líquido.

2,] J l J I. .l i ,E.

La radioactividad específica del a[32P]-ATPdebe ser igual a ladel [32PJ-AMPcobtenida en el ensayo.

Cpm-AMPC-azpobtenido CPm-ATp-szpenaayo

mel-AMPC—32Pobten1do PmOl-ATP-szpenaayo

mel-ATP*32Panaayomel-AMPC-azpobtenido = cpm-AMPc-32Pobten1ao

Cpm—ATP-32Penaayo

Pero no todo el AMP032Pobtenido se recupera en el pasaje por lasdos columnas; por eso, la lectura de 3Hpermite calcular la recu­peración del AMPc después de su pasaje por las resinas Dowex yAlúmina:

Cpm-AMPC—3HatopCpm-AMPC-32Pobten1do = CPm-AMPC-azpcontadae

CPm-AMPc-chontadae

Reemplazando:

CPI-AHPC'azpcontadae cpu-AHPc3Hazop PIOJCS'ATP'azponlnyo

PDOI'AHPC'azpobtenido : . .

CPI-AHPC'chontndan CPI-ATPazPenoayol l

relación 32P/3H factor

Para pasar a Actividad Específica se divide por la cantidad de

CAP.l-METODOS - 121 ­

proteína utilizada y por el tiempo.

relación 32P/3H . factorAct.Esp. =

mgproteinaanaayo.tiempo de incubación(pmol/min.mg.prot)

Las cantidades de proteinas utilizadas en cada uno de los ensayosfueron determinadas por el método de Lowry.

CAPITULO 2

CAPITULO 2 - INTRODUCCION

CAP.2-INTRODUCCION - 124 ­

A lo largo de su ciclo de vida, las plantas responden a una va­riedad de señales, ya sea endógenas o exógenas, tales como luz,gravedad, temperatura, elicitors microbianos u hormonas, que re­gulan los procesos fisiológicos. Los mecanismosa través de loscuales estas señales se transducen y se convierten en una res­puesta, permanecenaún sin ser aclarados.

Auxinas

Los mecanismos de través de los cuales las auxinas desencadenansus efectos son aún desconocidos.

La auxina predominante en la mayoría de las plantas, el ácido in­dol-S-acético (IAA), se sintetiza en hojas jóvenes y semillas quese encuentran germinando, y se transporta a través de toda laplanta. Se sabe que las auxinas se encuentran asociadas a proce­sos de elongación, división celular, y diferenciación de tejidosvasculares.

La búsqueda de receptores para auxinas en plantas se basó ini­cialmente en la alta afinidad de binding de la hormona a membra­nas plasmáticas (Hertel et al, 1972) aunque recién en 1989 seclonó y caracterizó un posible receptor. Dicha proteina de 22 kDse expresa en todos los tejidos vegetales en un alto nivel, nopresenta homologiacon otras proteínas, y contiene las secuenciasnecesarias para insertarse en membranaplasmática (Hesse et al,1989).

Hay también evidencias preliminares sobre la participación de unaproteina que une GTPen la transducción de señales de las auxinas(Zaina et al, 1990), aunque aún no se la ha podido caracterizar yconfirmar su presencia en dicho camino metabólico.

Han sido descriptos varios mRNAsinducidos por auxinas, cuyos ni­veles aumentan ya a los 10 min del agregado de la hormona. Dichos

CAP.2-INTRODUCCION — 125 —

genes no presentan homologia con ninguna otra proteina conocida,con la excepción del gen Gmhsp26-A de soja, que si la tiene congenes de respuesta a estrés térmico (Czarnecka et al, 1988). Tam­poco se ha podido hallar homologia en lo que respecta a la zonapromotora de todos estos genes, lo cual sugiere que es complejala identificación de elementos que respondan a auxinas (Hagen,G., 1989).

Adenilil ciclasa

En plantas superiores, es desconocido el papel que desempeña elAMPcíclico en los procesos celulares.

Algunos reportes indicaban la presencia de AMPcíclico en tejidosvegetales (Brownet al, 1981), aunque otros autores la negabanaduciendo errores en su determinación por radioinmunoensayo(Spiteri et al, 1989).

Recién en 1988 se reportó la presencia de una adenilil ciclasa enraiz (principalmente localizada en meristemas apicales radicula­res) de Medicagosativa (alfalfa)(Carricarte et al, 1988). Estaenzima era citoplasmática, su sustrato era ATP-Mg2+-Ca2+,y eraactivable por calmodulina, pero no asi por activadores propios deproteina G.

Este aporte era coherente con el hecho de que la concentración decalmodulina en meristema radicular era cuatro veces mayor que enla base de la raiz (Poovaiah, et a1, 1987).

Mientras variados reportes indican que el AMPcno interviene enprocesos dependientes de fitocromo (Sharma, R., 1984), se ha pu­blicado la acción sinérgica de la luz roja y del AMPcen el en­grosamiento de protoplastos etiolados de avena (Chung et al,1988). La acción del AMPcno es inhibida ni por neomicina ni porLiCl (inhibidores de PLC), y es dependiente de Ca2+ pero no deactivadores de proteinas G (Bossen et al, 1990), lo cual coincidecompletamentecon las caracteristicas de la adenilil ciclasa des­

CAP.2-INTRODUCCION - 126 —

cripta en alfalfa, dependiente de Ca2+, activable por calmoduli­na, pero no por GTP.

En un peculiar trabajo del año 1990, se observó en Arabidopsisthaliana que el viento, el minimotoque, el daño, la oscuridad,la subirrigación, y el rociado de sus hojas con agua, pero no elmovimiento o la música (de Talking Heads), eran capaces de acti­var cien veces la transcripción de cuatro genes especificos; dosde ellos presentaban 73%y 44% de homologia con calmodulina(Braam et al, 1990). Este dato abre el panorama sobre la posibleregulación génica a cambios en el medio ambiente mediado porCa2+, calmodulina y proteinas que se unan a ella, como la adeni­lil ciclasa, por ejemplo.

Proteínas G

Hasta ahora existen variados pero tibios reportes sobre la pre­sencia de proteinas G en plantas superiores.

El grupo de Hasunuma, utilizando el sistema de binding de GTP­X[35S], encuentra hasta siete fracciones de una columnade fil­tración en gel que unen especificamente el nucleótido en homoge­natos de Lemnapaucicostata y Pisum sativum (Hasunumaet al, 1987a, b y c). Propone que existen cuatro proteinas G con pesos mole­culares variados, pero no coincidentes con todos los reportadoshasta la fecha, y que dichas proteinas también unen ATP (Hasunumaet al, 1989). Ya Guy Thompsonaclara sobre este hecho: “Esta (launión conjunta de ATPy GTP) no es una caracteristica de una ti­pica proteina G animal, que presenta muypoca tendencia a unirnucleótidos que no contengan guanina" (Einspahr et al, 1990).También es importante la aseveración de Benjamin Horwitz: “Losreportes sobre la presencia de proteinas G en extractos crudos deLemnason limitados por la falta de una separación en gel de lasprobables proteínas. Una ADP-ribosilación por toxina de Vibriocholerae hubiera sido una manera preferible de marcar las protei­nas” (Horwitz, B., 1989).

CAP.2-INTRODUCCION - 127 ­

Paralelamente, se localizaron cuatro distintas proteínas que unenGTP en Cúcurbita pepo (zapallitos), utilizando GTP-a-[32P] ytransferencia a nitrocelulosa. Estas proteinas presentaban pesosmoleculares de 23400, 24800, 26600 y 28500 (Dróbak et al, 1988).

Unapreparación similar de zucchini contenía proteinas que unianespecificamente GTPy se detectó, empleando antisueros contra ag,la presencia de dos bandas con pesos moleculares aparentes de33000 y 50000 (Jacobs et al, 1988).

Tambiénse observó la presencia de proteínas que reaccionaban conantisueros hechos contra la zona A de Halliday (consenso de uniónde GTP) en membranas de Vícia faba, Arabidopsis thaliana y Cbmme­lina communis;cada una de estas tres especies tenia dos protei­nas inmunoreactivas de 37 y 31 kD, 36 y 31 kD, y 38 y 34 kD, res­pectivamente. Los pesos moleculares de estas probables proteinasG no coinciden con los descriptos en la literatura, para todoslos demás integrantes de esta familia (Blum et a1, 1988).

El primer trabajo concluyente aparece en 1990 y trata sobre elclonado de GPAl, la primera subunidad a de una proteina G enplantas superiores (Arabidopsis thaliana)(Ma et al, 1990). El gentiene 14 exones y el peso molecular esperado de la proteina es de44500; también presenta 73%de homología conservativa con at yaaa, todos los consensos de Halliday, la zona blanco de ADP-ribo­silación por la toxina de V. cholerae y le falta la cisteinablanco de la toxina de B. pertussis. El mRNAes más abundante enhojas y raiz, y menos en flores. Asi sugieren la presencia deotras subunidades a, por hibridaciones a baja astringencia y pro­ponen la existencia de subunidades B y X.

Han sido de igual manera clonados dos genes que codifican paraproteínas de la superfamilia ras en plantas (Palme et al, 1988)(Matsui et al, 1989).

CAP.2-INTRODUCCION - 128 —

Foefolipasa C y polifoefoinosítidos

La presencia de fosfolipasa C en tejidos vegetales que preferen­cialmente hidroliza inositol fosfatos ha sido ampliamente repor­tada (Melin et al, 1987)(McMurrayet al, 1988)(Pfaffmann et al,1987)(Einspahr et al, 1989)(Tate et al, 1989).

A pesar de que McMurrayy Melin niegan la presencia de una prote­ína G que regule a la PLC, se ha reportado que GTP-X-[S] estimulala formación de inositol fosfatos, mientras que GDP-B-[S]la in­hibe (Dillenschneider et al, 1986).

El grupo de Melin encontró que la actividad de PLCde membrana dela parte aérea de cebada crecida en oscuridad, era mayor que lascrecidas en luz. En contraste, la actividad enzimática en raicesera insensible al régimen de iluminación.

La presencia en plantas de PIP2 y PLC sugiere que el inositoltrifosfato (IPs) también se encontraría en células vegetales. Hayalgunos trabajos preliminares que muestran que IP3 libera Ca2+devacuolas en raíz de avena (Schumaker et al, 1987), asi como tam­bién que GTPestimularia la liberación de Ca2+ en plantas (Allanet al, 1989), aunque la relación entre GTPe IPa permanece sinser aclarada.

Proteínas quinasas

Hasta la fecha se han descripto gran variedad de proteinas quina­sas (Tabla H):

dependiente de Ca2+ avena (Polya et a1,1982)arveja (Hetherington et al,1982)

dependiente de Ca2+ zapallito (Salimath et al,1983)y calmodulina

de fosfatidil inositol avena (Sandelius et al, 1986)

dependiente de Ca2+y zapallito (Schafer et al, 1985)fosfolipidos (PKC) espinaca (Muto et al,1985)

CAP.2-INTRODUCCION - 129 ­

Aúnqueda sin demostrarse su papel dentro del desarrollo vegetal,así comotampoco se han podido hallar las proteínas blanco de di­chas fosforilaciones.

En lo que respecta a PKC, la mayoria de los reportes se basan so­lamente en el requerimiento de Ca2+y los efectos estimulatoriosde lípidos, pero aún no hay estudios sobre la translocación amembranas, su regulación o su posible dependencia de la actividadcon las hormonasvegetales o con las irradiaciones.

Hasta ahora han sido vanos los esfuerzos para detectar la protei­na quinasa dependiente de AMPcíclico (PKA), aunque los reportessobre la adenilil ciclasa y las demásquinasas en plantas, talcomoaparecen en células animales, hace pensar de la segura pre­sencia de la PKAaunque los métodos de detección no hayan dadoaún con ella.

CAPITULO 2 - OBJETIVOS

CAP.2-OBJETIVOS — 131 ­

En comparación con lo acontecido en bacterias y mamíferos, lasplantas fueron relegadas a ocupar un sitial menor en la cruzadacientífica de los últimos años, a pesar de que la genética nacecon G. Mendel y B. McClintock y de que la primera enzima crista­lizada provenía de arvejas.

Mientras la bioquímica y la biología molecular de mamíferos,levaduras, bacterias, virus era desentrañada a pasos agigantadosy las mejores publicaciones competían por albergar en sus páginasesos nuevos descubrimientos, las investigaciones en dichas áreassobre el reino vegetal constituían un porcentaje mínimoy soloeran publicadas en revistas específicas.

En los últimos años mediante el empuje económico asignado a labiotecnología asociada a la agricultura, se produjo un avance ne­cesario concerniente a la elucidación de los procesos bioquímicosy moleculares que ocurren en las plantas.

Estos adelantos recientes no requirieron (solo desde el puntotécnico) un conocimiento sobre botánica o fisiología vegetal, yaque el ADNo las proteinas vegetales pueden ser trabajadas invitro comoen cualquier otro organismo.

En lo que respecta a los mecanismos de transducción de señalesresulta llamativo que mientras se conoce de manera profunda losdistintos mecanismosde transferencia de la información en mamí­feros, en plantas no haya ni siquiera precisiones acerca de laexistencia de dichas proteínas encargadas de transducir las seña­les.

CAP.2-OBJETIVOS - 132 ­

En este capítulo, entonces, Se presenta la caracterización de unaproteína G en alfalfa con características bioquímicas e inmunoló­gicas y comportamientosfuncionales similares a las ya descriptasen mamíferos.

CAPITULO 2 - RESULTADOS

CAP.2-RESULTADOS - 134 —

1311131ELQAQQLBARLLI_AL_DE_LA.EEQIELNA_G

CromatografiamdelintercambiomionicoanEAE-celulosal

Tal comose describe en Materiales y Métodos, el extracto de co­lato de membranasplasmáticas puras de hojas de Médicago sativa,fue sembrado inmediatamente en una columna de DEAE-celulosa yluego se procedió a la elución de las proteinas retenidas especí­ficamente en la resina, entre ellas la proteina G, con un gra­diente continuo de O a 200 mMde NaCl.

La figura 57 mostró el perfil de elución de dicha columna a la

I l Í l l I l

1 60 " o o

g \ zoo3' o 50 ' o zÉ E g;E :1 ¿0- -150 ._'- a.o y o Sg E 30- f ° / -100 E

8‘ :3 /o l\ o »s L 20- /z / o.E EL o. o

a] /°\ /° oí; g 0‘0‘0 °\ ¡ohoso/\0/ \:\o _5010- o 0/] o o/ o- ,0/ .'.-.'.'."*.\82°,áhzSmmi¿ÍLl____i____4____;L:::Lá4¿¿msco0 50 100 150 zoo 250 300 350

Eluído (ml)

cual se le midió binding especifico de [35S]GTP—-S. Aquel pre­sento la aparición de un solo pico de binding especifico que elu­ó alrededor de 70 mMde sal. El comportamiento de dicha cromato­

'<1

grafía fue similar al descripto para otras proteinas G de mamífe­( Sternweis et al. 1981)(Codina et al. 1984).

0BindingdeGTP(pmol/ml)

CAP.2-RESULTADOS — 135 ­

Q l E, 1 1 . , [El]! J E e a ¡J

Las fracciones correspondientes al pico de binding‘(9 ml de volu­mentotal) fueron reunidas y luego concentradas hasta alrededorde 0,8 ml por ultrafiltración a través de AmicónPMlO.Una alí­cuota de 0,6 ml de las fracciones concentradas fue sembrada enuna columna de exclusión del tipo Ultrogel AcA34.

Puede observarse en la figura 58 la aparición de dos picos de

25% 'Vo LDH MDH OA Cc Vt

‘ 1 1 a l o20" .g'.0/0 0V... 3

°\o/° ° '3715- ° —150

l o o “°\ ' \ . J E

10- ° ° —100 \/ O o\ O '3­

0 o I.’ \. °\.7'o o “'

_ /a ’ o5 -50f . o o

/.\.r. \' \o\o[y ‘ifiïf0003m’ l 1 Fx 0

0 zo 30 ¿o so

' Eluído (ml)

binding: ambos fueron especiricos pues eran desplazados en un 8 %con GTPXS 10 uM en la mezcla de incubación, y en un 8% con ATP lOuM-El primero de estos picos -el de mayor actividad- correspon­dió a una/s proteina/s de alrededor de 40 Kd y el de menor acti­vidad de binding a una/s de 90 Kd.

Este resultado indicó la posibilidad de que ambospicos corres­pondieran a las dos formas en las que se puede encontrar a lasproteinas del tipo G: el de menor peso molecular (40 Kd) pertene­ce a la subunidad a y el de mayor peso molecular (90 Kd) a la

CAP.2-RESULTADOS - 136 ­

proteina oligomérica con sus tres subunidades (a, B y 8). Estecomportamiento ya habia sido descripto en trabajos anteriores(Codina et al, 1984) aunque en ese caso los autores atribuyen di­cho perfil a una plausible interacción entre la matriz de la re­sina y zonas hidrofóbicas de la proteina en cuestión. Otros gru­pos de trabajo (Sternweis et al, 1984)(Sternweis et al, 1981) ha­llaron, al utilizar Ultrogel AcA34,un solo pico de binding de[35SJGTP3-Ssituado entre los dos presentados en esta tesis y enel trabajo de Birnbaumer. Aquel pico tenia pendientes muy pocopronunciadas, lo cual sugiere —elmismoSternweis lo aclaró- he­terogeneidad de las entidades proteicas alli presentes.

La tabla I muestra los resultados de esta purificación parcial:

VOLUMEN PROTEINA pMOLES pMOLES PURIFI­PASO TOTAL(ml) TOTAL(mg) TOTALES ESPECIFICOS CACION

Membranas 18 149,40 5,04 0,03 1

Extracto decolato 15 19,50 1,50 0,07 2,3

DEAE-celulosa 9 1,50 1,90 1,26 42,0

Ultrogel AcA34 1 0,33 1,79 5,46 182,0

El paso de extracción con colato fue necesario ya que para sem­brar en las columnasse debió contar con material clarificado,pero en si, no contribuye en demasia al esquema de purificación.

La cromatografía de intercambio se comportó dentro de los rangosesperados para columnas de ese tipo, alrededor de 20 veces en laescala de purificación. El Ultrogel AcA34aportó poco en lo que apurificación se refiere, en cambio fue de gran utilidad en la in­formación sobre el peso molecular de la proteina.

CAP.2-RESULTADOS — 137 —

Vale la pena puntualizar la poca estabilidad de la proteina deltipo G, lo cual dificultó enormementecualquier proceso de purificación empleado y también disminuyeron, de manera ostensible,

res de actividad, recayendo este efecto en los datos fi­o

nales de purificación.

De ahora en más, el objetivo se centró exclusivamente en la ca­racterización bioquímica, inmunológica y funcional de la proteinaen estudio. En algunos casos, se hizo necesario trabajar con elsistema clarificado empleandoentonces el pico de actividad debinding de [35S]GTP-3—Sde nuevas cromatografias de intercambio(DEAEcelulosa).WWWlariaeiánjeljindingdLLañfilGIPjSWWW­! . i l l l .

Conel objeto de aportar nuevos datos referidos al comportamientode esta nueva proteína G de alfalfa, y para encontrar las mejorescondiciones de bindíng de [3581GTP—3—S,se llevó a cabo las va­riaciones correspondientes en función del tiempo y de la cantidadde proteina.

En la figura 59 puede verse que el bindíng llegó a un estado es­

BindingGTP(pmol/mg)

(A)

I l

fiempolha

CAP.2-RESULTADOS - 138 ­

tacionario recién a las 3 horas, tiempo que coincide con el deotras proteínas del tipo G caracterizadas anteriormente (Linderet al, 1990)(Northup et al, 1982).

La curva de variación con la cantidad de proteína (figura 60)

(pmoH

BindingGTP

I

o 0,1 0,2 0,3

Proteína (mg)

dentro del rango en el cual se llevó a cabo el ensayo (lO-150ug), se comportó de manera lineal.

E1 análisis de Scatchard (figura 61) de la interacción de la pre­

20 ­O

- 15_‘D o9 o

3 10- —u\m

O5­O

l l l l l l

0 10 20 30 40 50 60

B Mmm)

CAP.2—RESULTADOS — 139 ­

PaPaCiÓn de DEAEcon GTP-X-Smostró la existencia de un solo si­tio de binding con un Kd de 170 nM, similar a los valores repor­tados en otros tejidos vegetales (Hasunumaet al, 1987a) (Zbellet al, 1989).

Unión de [32PJGTP—aen geles

Conel firme propósito de precisar la información sobre las ca­racteristicas de la proteína G de alfalfa, en lo que se refiere asu peso molecular y posibles subtipos, se realizó el ensayo decrosslinking de [32PJGTP-da preparaciones de membrana.

Este métodoha sido usado por varios grupos para identificar si­tios de unión en proteinas, por ejemplo, ATPen miosina (Marutaet al, 1981), GTPen tubulina (Nath et al, 1985)(Linse et al,1988). La reacción inducida por luz UVa 254 nm, usualmente invo­lucra decarboxilación y unión covalente de la proteína a la baseen cuestión, a través de los residuos ácidos, asparragina y glu­tamina. La ventaja de la reacción fotoafin directa sobre otrosanálogos fotoquimicos, es que el ligando natural es el que quedafinalmente unido. Esto incrementa la probabilidad de que la in­teracción en la proteina ocurra en el sitio de unión y que éstasea especifica reduciendo, de esta manera, la probabilidad decambios conformacionales que se podrían generar si el ligando es­tuviera modificado.

En nuestro caso se detectó la aparición de dos bandas marcadas(figura 62) con movilidades electroforéticas correspondientes a57 kD y 40 kD, desapareciendo la marca de la última banda al rea­lizarse la incubación en presencia de 1 mMGTP.

Este resultado indicó la presencia de por lo menos un subtipo deproteina G cuyo peso molecular (en realidad el de la subunidad a

CAP.2-RESULTADOS - 140 ­

que es la que une el GTP) se encuentra dentro del rango de lasproteínas G descriptas hasta ahora.

ADPribosilación

Las subunidades a de las proteínas G (excepciones, ver Introduc­ción), son sustratos de una o de ambas de las ADPribosiltransfe­rasas bacterianas, la toxina de Víbrio cholera (TC) y la toxinade Bordetella pertussis (TP).

La figura 63 muestra los resultados luego de llevar a cabo la ADPribosilación en presencia de ambastoxinas; la actividad fue en­teramente dependiente de la presencia de toxina de V. cholerae yno pudo ser reemplazada por toxina de B. pertussis.

CAP.2—RESULTADOS - 141 ­

pmolesdeADPr/mgproteína

,0Proteina + + - - 0 # 0

- - TC TC TC TC TP

NADhnM - + - O - + ­

No se encontró marcaje endógeno de la proteina G producido poralguna ADPribosiltransferasa de la planta (controles sin toxina)ni tampocoradioactividad en los filtros de nitrocelulosa produ­Cida por una auto ADPribosilación de la subunidad A de dicha to­xina (Moss et al, 1990).

Los productos marcados mostraron una movilidad electroforética engeles de poliacrilamida con SDS, levemente menor que la transdu­cina ADP-ribosilada, presentando un peso molecular aparente de

CAP.2—RESULTADOS — 142 ­

43000. (Figura 64).

Mw (Kd)

1.8.5 «

El comportamientode esta proteina G de alfalfa coincidió plena­mente con el esperado a partir de la secuencia de GPAlde Arabi­dopsis thaliana (Maet al, 1990). Esta presenta un peso molecularde 44000, la arginina caracteristica de la ADPribosilación portoxina de V. cholerae, faltándole la cisteina COOH-terminal, si­tio de pegado de la ADP-ribosa por toxina de B. pertussis.

CARACTERIZACION INMUNOLOGICA DE LA PROTEINA G DE ALFALFA

Anticuerpos especificos contra las distintas subunidades de lasproteinas G, preparados en muchos laboratorios, proveen el mejormétodo para completar una minuciosa caracterización de un nuevointegrante de esta familia. Se contó para este propósito, con unabatería de antisueros preparados contra péptidos sintéticos co­

CAP.2-RESULTADOS — 143 ­

rrespondientes a distintas zonas de las proteinas G. A saber(Tabla J):

Identi- Secuencia Zona Recono­ficación aminoacídica . cimiento

9193 CGAGESGKSTIVKQMK Unión GTP a común(subunidad a)

AS/7 KENLKDCGLF COOHterminal at au,anda22

C—584 CKQLQKDKQVYRATHR NH2 terminal aa ae

SWl COOHterminal B B

En la figura 65 quedan presentados los resultados correspondien­

__ Mw (kd)

_ .k.._._.<_/8¿,_o

l A ¿ie-58.0

.."N"....N..,...:.--¿:‘-.-..Y.v

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'1 2 3

“L­

CAP-2-RESULTADOS - 144 ­

tes a la inmunodetecciónutilizando el antisuero AS/7 (at). Sedetectó una sola banda específica en membranade brotes de alfal­fa, de alrededor de 43000 D (calle 1). Este polipéptido inmuno­reactivo también fue identificado en brotes de alfalfa etiolados,en membranas de hojas de plantas adultas pero no en fraccionescitosólicas (calle 3). De igual manera se observó la aparición dela mismaproteína inmunoreactiva en la calle 2, que contenía eleluído de la columna de afinidad de GTP-sefarosa, siendo éste eldato más importante de esta inmunodetección ya que entonces sepudo asegurar que la proteína que unía GTPen membranas y la quees reconocida por los antisueros específicos, es la misma, con locual la caracterización de la proteína G de alfalfa ha sido com­pleta.

El revelado con antisuero 9193 (a común)(figura 66), alumbró una

sola banda específica de 43000 D (calle 3),( si se la compara conel revelado con suero preinmune (calle 2), correspondiendo almismopolipéptido identificado en AS/7. También fue detectada una

CAP.2-RESULTADOS — 145 ­

banda especifica de alrededor de 48000 D cuando se empleó el an­tisuero C-584 (ae)(ca11e 1). Este dato nos induce a pensar laexistencia de por lo menosdos tipos diferentes de proteinas G enalfalfa:

l) una proteína G de alrededor de 43000 D detectada con antisueroAS/7 (at) y que concuerda con las características presentadaspor Ma y colaboradores, ya que GPAl presenta un 73% de homo­logia con transducina y, según la secuencia, podría ser reco­nocida por el antisuero AS/7.

2) una proteina G de alrededor de 48000 D, con homología inmuno­lógica con las as —yaque fue alumbrada por C-584 (ds)- y queencuentra correlación con la detección inmunológicapresenta­da en CUcurbita pepa (zapallito)(Jacobs et al, 1988).

La falta de una banda de alrededor de 48000 D cuando se utilizóel antisuero 9193 (a común), puede ser explicada por reportes an­teriores del Dr. Allen MSpiegel: “La falla de antisueros reali­zados contra subunidades a que puedan tener reacción cruzada con­tra otras ag es sorprendente dada la alta homologia de secuenciade estas zonas; en particular, las regiones correspondientes adominios de unión de GTPque muestran una total conservación. Es­to implicaría que estas zonas son pobremente antigénicas". (A.Spiegel, 1990).

Las diluciones empleadas (1:200 en todos los casos) se encuentrandentro de los valores normales para este tipo de antisueros, aúnconsiderando la pobre abundancia de esta proteína G en alfalfa sise la compara con otros tejidos de mamíferos empleados (A. Spie­gel, 1990,).

Hasta ese momento, los pocos datos inmundlógicos sobre proteínasG en plantas sólo hablaban de subunidades a, no habiéndose lleva­do a cabo ningún aporte sobre la presencia de la subunidad B, co­moen mamíferos. Con este propósito, se utilizó el antisuero SWl(B), que finalmente alumbró una banda especifica de alrededor de

CAP.2—RESULTADOS — 146 ­

36000 D (figura 67), en sobrenadante de brotes de alfalfa, creci

ï.‘y ..,

¿ifrgxfgu-v. e 3 6 .5N

dos en luz o en oscuridad, también en hojas de plantas adultas,pero no en membranasplasmáticas de las mismas preparaciones.

Este experimento aporta un dato muyinteresante: las plantas pre­sentan proteinas G del tipo oligomérico, comoson caracteristicasen mamíferos, sugiriendo procesos de activación-desactivación delas mismas, con hidrólisis e intercambio de nucleótidos, libera­ción e interacción de la subunidad a con B, y finalmente, trans­misión de la señal, proveniente de algún receptor de membrana, aalguna proteina efectora.

Luegode haber finalizado la caracterización de una proteína G enalfalfa, nos abocamos al estudio funcional de la misma tratandode aportar nuevas evidencias al esquema de transducción de seña­les propuesto en el párrafo anterior.

CAP.2-RESULTADOS - 147 ­

CARACTERIZACION FUNCIONAL DE LA PROTEINA G DE ALFALFA

A pesar de que se conocen, cada día más, genes cuya expresión esregulada por fitocromo, y se sabe con detalle la estructura delfotoreceptor, muypoco se ha avanzado sobre los eventos que ocu­rren entre la formación del Ptr y sus posteriores cambios en losniveles de mRNAcelular. Considerando la diversidad de respuestasprovocadas por el fitocromo, aparece como improbable que sea éldirectamente el encargado de activar los genes, sino por el con­trario, tendria que existir un inicio comúndel camino, que luegose ramificaría en diferentes clases de fotorespuestas, requirien­do entonces diferentes mensajeros intracelulares.

Un modelo que combinaría lo expuesto hasta ahora en la caracteri­zación de la proteína G en alfalfa y los conocimientos sobre ac­tivación-desactivación del fitocromo, involucra la interaccióndel Pfr, que es una proteina soluble en su forma inactiva (Pr), auna proteina periférica citoplasmástica de membrana(proteina G)produciendo finalmente la activación de alguna enzima o proteinaefectora.

Con el propósito de aportar evidencias sobre la forma en que setransducen las señales en plantas, se realizaron los siguientesexperimentos.

Variación del ¿finding de [35SJGIP_-‘6:_Scon el Liam de irradia­ción con luz roja (5.69 nm)

En teoria, la irradiación con luz roja (660 nm) deberia estar se­guida de una variación en la velocidad del intercambio de nucleó­tidos de guanina a nivel de la proteina G.

Conese criterio, protoplastos etiolados de alfalfa fueron some­tidos a diferentes tiempos de irradiación (1-120 segundos) conluz roja (660 nm) y luego ensayados en su capacidad de unir[3581GTP-3—Sdurante un mismo tiempo (5 minutos). Como se observa

CAP.2-RESULTADOS - 148 —

en la figura 68, 60 segundos de irradiación producen un incremen­to transitorio del bindíngg retornando a niveles basales conmayores tiempos de irradiación.

¿ooLLfiempo deincubadón:5nfinl

300

200

100

°/odeincrementosobreoscuridad(GTPunido)

D 1 10 30 60 120

Duracion del tratamiento con luz roja (GGOanseg)

ManiaciándelbizzdingdeEWSJGIEXficoneltiemQQdeincummnluegodeimdiarconluzmjamfignm)

Ahora se observó la cinética del bíndingy luego de irradiar conluz roja (660 nm) los protoplastos etiolados durante el mismotiempo (60 segundos).

CAP.2—RESULTADOS - 149 —

En la figura 69 puede observarse que entre los 2 y los 5 minutos

2,5L Ü Oscuridad

Luz roja (60seg)

7

pmolGTPunido

m&\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\N O

Tiempo de incubación (min)

de incubar con [35S]GTP—Z—Sse produce la mayor diferencia entreel binding de protoplastos irradiados y el de protoplastos en os­curidad.

Estas dos figuras sugieren que, entre los 2 y los 5 minutos irra­diando previamente 60 segundos con luz roja (660 nm), se producela transducción de la señal del fitocromo activado (Pfr) a 1aproteina G, transmitiendose ésta a un componenteposterior de laVía metabólica entre los 5 y los 10 minutos siguientes a la irra­diación.

mnolGTPKSumdo

CAP.2-RESULTADOS — 150 ­

pre .,1 1 J b. 1.” Jueüq QE la .fir d. G.5 Or 1 ._ J .(ZBQ nm)

Un importante control a realizar cuando se trabaja con fitocromo,es la verificación de la reversión, por mediode luz roja lejana(780 nm), de los efectos producidos por irradiación con luz roja(660 nm).

En la figura 70 se observan los resultados de las diferentes

V

‘N

\

mmm

V

‘m\\

k\\\\\\\\\\\\\\\.\\\\\

basalosmnfifi"1_

l

Condiciones de irradiación

irradiaciones. Luz roja lejana (730 nm), suministrada durante 60segundos, no revierte la estimulación producida por los 60 segun­dos de luz roja (660 nm)(1 y 2); sin embargo, si lo hace la irra­diación de 240 segundos (3).

Al intercalar un período de oscuridad de 60 segundos entre ambasirradiaciones, no existió reversión ya sea irradiando 60 o 24Dsegundos con luz roja lejana (730 nm)(4 y 5), indicando que elescape para estas respuestas es muyrápido.

CAP.2-RESULTADOS - 151 ­

Según la figura anterior, en el segundo minuto luego de la irra­diación, se produciría el pasaje de la información del fotorecep­tor a la proteina G, lo que explicaría la imposibilidad de rever­tir la activación cuando se intercala el intervalo de 60 segundosde oscuridad (4 y 5) entre ambas irradiaciones.

Tambiénes importante resaltar la disminución de los valores debindíng, al irradiar 120 segundos con luz roja (660 nm), compa­rándolos con los obtenidos al iluminar 60 segundos seguidos de 60segundos en oscuridad, indicando que los mecanismos de regulaciónnegativa del PÏr comenzarian en el segundo minuto y alcanzarian ala proteína G, desactivándola.

La actividad medida en oscuridad fue considerada como binding noinvolucrado en los eventos de transducción mediados por fitocromogenerados por protoplatos rotos o restos de membranasplasmáticasque poseían actividad de binding pero no regulación del mismoporlas irradiaciones.

Todos estos resultados corroboran los modelos que propone la in­teracción del fitocromo activado (Prr) con la/s proteina/s G demembrana,siendo éstas las encargadas de transducir las señales alas proteinas efectoras.

CAPITULO 2 - CONCLUSIONES

CAP.2-CONCLUSIONES - 153 ­

En este segundo y último capitulo se demostró la presencia en ho­jas e hipocótilos de Mbdioagosativa (alfalfa) de una proteína Gque conserva las caracteristicas de sus homónimasde células ani­males y que seria la encargada de transducir la señal provenientedel fitocromo activado por la radiación.

La caracterización fue realizada cubriendo los aspectos:

bioquímicos

* Los perfiles de columnade intercambio aniónico y filtraciónen gel fueron similares a los de otras proteinas G descrip­tas.

* La unión de GTP-a-[32P] en geles reveló la presencia de porlo menos un subtipo de proteínas G con un peso molecular de43000.

* Se encontró ADP-ribosilación específica utilizando a la toxi­na de Vibrio cholerae comoenzima modificadora, mientras quela de Bbrdetella pertussis fue inefectiva. El peso moleculardel polipéptido marcado con NAD+[32P]fue también de 43000.

inmunológicos

* La proteina G de 43 Kd caracterizada bioquímicamente, presen­ta epitopes conservados con la transducina, pues es reconoci­da por el antisuero AS/7, fabricado contra la zona COOH-ter­minal de Gt. La banda especifica alumbró tanto en membranascrudas como en el eluído de una columna de GTP-sefarosa. Elcontrol con la columna de afinidad y posterior reacción inmu­nológica no deja lugar a ninguna duda de que la que se estuvocaracterizando es una proteína G, y no otra proteína que pudounir GTPpero que no perteneciera a la familia de las trans­ductoras de señales.

* Comoera de esperar, la misma proteina G era detectada cuandose utilizó el antisuero 9193 específico de la zona A deHalliday, involucrada en la unión del GTP.

CAP.2-CONCLUSIONES - 154 ­

* Tambiénse reportó la presencia de otra probable proteina Gde 48000 D con homologia inmunológica con ag, ya que fue re­conocida por el antisuero C-584, preparado contra una zonapropia de las ag.

* Utilizando la mismametodología se demostró 1a presencia deuna subunidad B en plantas, puesta en duda hasta este momen­to, por medio de un antisuero específico, sugiriendo la pre­sencia de una subunidad X que forme el heterotrimero, comúnen células animales.

funcionales

* La irradiación de 1 min a 660 nmde protoplastos etiolados dealfalfa, produce un incremento máximoen la actividad de laproteina G. Luegode dicho periodo de irradiación, la veloci­dad de binding de GTP-X-Stiende a decaer. La activación deesta velocidad fue consecuencia del pasaje de la forma Pr aPzr del fitocromo, y dicho efecto no es permanente sino quedesaparece cuando el evento de transducción se completa.

* Durante los 5 primeros minutos posteriores a la irradiaciónse desarrollaría el pasaje de la información del PÏr a laproteina G, produciéndose el escape de la misma (por activa­ción de alguna enzima efectora) en los 5 minutos posteriores.

* El efecto activador del pulso de luz roja (660 nm) sobre lafotorespuesta pudo ser revertido cuando inmediatamente seirradió con luz roja lejana (730 nm), poniendo de manifiestoque la actividad de la proteina G se encuentra bajo los efec­tos fotoreversibles del fitocromo y sugiriendo una interac­ción entre ambasproteinas.

* Al intercalar un periodo de oscuridad entre ambas irradiacio­nes, se pudo bloquear la reversión de la información por luzroja lejana (730 nm); esto indica que en ese lapso sin irra­diar se produjo el escape de la información hacia el siguien­te componente de la cadena metabólica.

CAP.2-CONCLUSIONES — 155 ­

En definitiva, se ha caracterizado exhaustivamente la primer pro­teína G de plantas superiores desde el punto de vista bioquímicoe inmunológico, hallando gran similitud con los demás integrantesde la familia presentes en células animales.

Las caracteristicas de la proteína G descripta son altamentecoincidentes con las reportadas por Hong Maen el clonado deGPA1,lo cual es una certificación adicional importante de supresencia (Maet al, 1990).

Tambiénse ha puesto de manifiesto su participación en los even­tos de fototransducción generados por el fitocromo.

Ya en 1988, Nam-HaiChua se referia a este tema: "La identifica­ción de una versión vegetal de la transducina, posible conectorintracelular del fitocromo, será uno de los mayores avances haciala comprensión de los mecanismos moleculares de la acción del fi­tocromo sobre la expresión genética en plantas” (Cuozzo et al,1988).

Hoy, se ha avanzado considerablemente en dicha dirección.

CAPITULO 2 - METODOS

CAP.2-METODOS — 157 —

MIERI“ manzano. M l. l. l JE ¡E 1

Elantaudnltaa

Médicagosativa L fue cultivada en campos fertilizados con super­fosfato de amonio (30 Kg/hectárea) durante uno o dos años. Lashojas extraídas de la planta adulta y separadas de sus tallos,fueron congeladas en N2 liquido y guardadas a —70°Chasta su ul­terior utilización.

B] l .. u l J

Las semillas de alfalfa, luego de haber sido esterilizadas en unasolución de lavandina (1%), fueron crecidas a 28°C sobre una gasaembebida en Ca804 1 mM,ya sea en oscuridad (brotes etiolados) obajo luz fluorescente (8 hs de luz seguido de 16 hs en oscuri­dad).

En el quinto dia de crecimiento (z 10 cm de longitud), las partesaéreas fueron extraídas y congeladas en N2 liquido y guardadas a—70°Chasta su uso o utilizadas inmediatamente en la preparaciónde protoplastos.

B .. i l J .l.

Las membranasplasmáticas, ya sea de las hojas de alfalfa adultao de los brotes de 5 días fueron purificadas utilizando gradien­tes de sacarosa (Hodges et a1, 1986).

El tejido vegetal fue molido en un mortero en presencia de N2 li­

CAP.2-METODOS - 158 —

quido y luego homogeneizado con buffér

Tris-HCl 25 mM, pH 7,4EDTA 3 mM

DTT 2 mM

MgClz 2 mM

Sacarosa 100 mM

PMSF 0,5 mM

Leupeptina 50 “MAprotinina 2 U/ml en una relación de

4 ml por gramo de tejido. El homogenato obtenido fue pasado porgasa y centrifugado a 12000 xg durante 10 minutos. El sobrenadan­te se volvió a centrifugar 60 minutos a 105000xg, y el precipi­tado microsomal fue resuspendido en el mismo buffér que conteníasacarosa 20%(peso/peso). Dicha suspensión fue sembrada sobre ungradiente discontinuo de sacarosa de 30, 35 y 45%, y fue centri­fugado a 95000 xg durante 60 minutos (Beckman, rotor SW-28). Lasmembranasfueron obtenidas del gradiente por aspiración de la in­terfase 35%/45%,y luego centrifugadas a 105000 xg durante 120minutos. Finalmente se guardaron a -70°C.

La fracción citosólica fue obtenida por posterior centrifugacióndel sobrenadante de 105000 xg, a 150000 xg durante 90 minutos.WWDEAEJelleaa(QmmamgnafiadsintemamhiQiánim)

La preparación de membranaspurificadas en gradiente de sacarosafue diluida en buffer

Tris-HCl 50 mM, pH 7,4DTT 2 mM

Glicerol 2% (v/v)Colato de sodio 1%(peso/vol), se extrajo durante

90 minutos a 4°C con agitación, y luego se centrifugó 60 minutosa 105000 xg. El sobrenadante logrado (extracto de colato) fue

CAP.2—METODOS — 159 ­

sembrado en una columna de DEAE-celulosa (25 cm x 0,6 cm) equili­brada previamente con

Tris-HCl 20 mM, pH 8EDTA 1 mM

[Buffer A] DTT l mM

Lubrol PX 0,1% (vol/vol) a un flujode 0,5 ml por minuto. Luego de lavar con 200 ml del buffer A, lasproteinas fueron eluidas con 350 ml de un gradiente 0-200 mM deNaCl. Se recogieron fracciones de 5 ml y en cada una de ellas seensayó su capacidad de unir específicamente [3581GTP-X-S.

QLtLQgQLAQASAmLQmaLogmfiadeexclusiónmolmlar)

Los eluidos con mayor actividad se mezclaron (9 m1) y se concen­traron hasta un volumen de 0,8 ml utilizando un concentrador Ami­cón PM-lO. Una fracción (0,6 ml) de los eluídos concentrados fue­ron sembrados en una columna de filtración en geles (UltrogelAcA34, 30 cm x 0,75 cm) que se habia equilibrado con buffer Aadicionado con 100 mM de NaCl. Se colectaron 50 fracciones de1 ml cada una a un flujo de 0,2 ml/min. Comoen el caso anterior,se les midió actividad de unión especifica de [35SJGTP-X-Sa cadauna de las fracciones.

Con el objeto de tener una idea aproximada del peso molecular secalibró en forma paralela al Ultrogel empleandouna batería deproteínas marcadoras.

Lactatg debidrggenasa (142 kD)(músculo de conejo): 0,03 mg/ml;su actividad se determinó por el consumode NADH,en presencia de piruvato, re­gistrando la disminución de su absorban­cia a 340 nm (Worthington Enzymol. Ma­nual, 1972).

CAP.2—METODOS - 160 ­

Malatg debidngggnaaa (70 kD)(corazón porcino): 0,01 mg/ml; supresencia se detectó por el consumo deNADH,en presencia de oxalacetato, delmismo modo que para lactato dehidrogena­sa- (Worthington Enzymol. Manual, 1972).

ngalhúmina (45 kD): se siguió por su absorbancia a280 nm.

Qiiccngmo Q (13 kD): se midió su absorbancia a 410nm.

GIJL-Seiancsa(gnomamgnaíiadaaiinidad)

La columna de guanosina 5'—trifosfato agarosa (l cm x 1,5 cm) fuepreviamente equilibrada con 50 ml de buÍÏEr

Tris-HCl 20 mM, pH 7,4EDTA l mM

[BufÍEI B] MgClz 2 mMNaCl 100 mMy posteriormente cargada con

50 ml del extracto de colato (0,4 mgproteína/ml) a una velocidadde 0,1 ml/min y lavada con el buffbr B hasta desaparición totalde la absorbancia a 280 nm, mediante el uso de un detector de UV(LKB). La elución fue llevada a cabo con 30 ml del mismo bufférque contenía lOO uMde GTPa igual velocidad. El eluido en su to­talidad fue dializado durante 18 hs contra Tris-HCl 10 mMpH 7,4y carbón activado 10 mg/l, y finalmente liofilizado.

E] l E . 1 l 1. .1 .¡

En todos los casos, salvo otra indicación, se han usado geles depoliacrilamida con SDS, de 10 cm x 12 cm x 1,5 mmde las siguien­tes caracteristicas:

CAP.2-METOD08 - 161 ­

G21 separador: 10 ml 10% Acrilamida pH 8,8

Gel congentnadgn: 5 ml 5% Acrilamida pH 6,8

SEPARADOR CONCENTRADOR

Acrilamida + Bis-Acrilamida 3,30 ml 0,83 ml(30:1)SDS 10% 0,10 ml 0,05 mlTris-HCl 1,5 M pH 8,8 2,50 ml -­Tris-HCl 1,0 M pH 6,8 -- 0,63 mlH20 4,00 ml 3,40 mlTEMED 5 ul 5 ul

PSA 20 mg 15 mg

Todas las muestras fueron tratadas con un volumen de crackingbuffér 2x

SDS 2%

2-mercaptoetanol 2%Tris 50 mMglicina 400 mMpH 8Azulbromofenol 0,02% durante 10

minutos a 100°C y luego sembradas en el gel.

El buffér utilizado para la corrida fue:

Tris 3,03 g/lGlicina 14,4 g/lSDS 0,1% y la electroforesis

se efectuó a una corriente constante de 15 mApara el gel concen­trador X de 25 mApara el separador; el tiempo aproximado de co­rrida fue de 3 hs.

En las corridas electroforéticas se utilizaron comomarcadores depeso molecular, una mezcla de proteínas preteñidas, a saber:

CAP.2—METODOS — 162 ­

triosafbsfatoisomerasa 26.600 Dlactato hidrogenasa 36.500 DÍUmarasa 48.500 Dpiruvato guinasa 58.000 Dffuctosa-ó-fbsfato guinasa 84.000 DB-galactosidasa 116.000 Daz-macroglobulina 180.000 D

En los casos que correspondía, dichos geles fueron teñidos conuna solución de

Metanol 45% (v/v)Acido acético 10% (v/v)Coomasie Brillant blue R-25O 0,2% (peso/vol) durante 1

hora y, posteriormente, se los decoloró con la mezcla metanol­ácido acético-agua durante 3-4 horas.

Para los ensayos de ADP-ribosilación con [32PJNAD y unión de[32PJGTPd, los geles, luego de haber sido teñidos se los secó yse los expuso, con pantalla intensificadora a -70°C durante 48hs.

WWE}!IlniáusmcificaJLP5SJGTP-3-S

Utilizamos dicho métodode identificación -comoel principal-, enlos casos de seguimiento, caracterización, purificación y varia­ciones en su actividad, de la proteína G de alfalfa.

Conexcepción de los casos en los que se presentaron variaciones,las características fundamentales del método fueron las que ha­bían sido descriptas en el Capítulo l.

El análisis de Scatchard de la unión específica de [35SJGTP—3—Salas fracciones de membrana, fue llevado a cabo manteniendo cons­tante la masa de [3583GTP-3-S y variando 1a concentración de GTP­3-8 (no radioactivo), desde 100 pMhasta 10 uM(Rubinstein et al,

CAP.2—METODOS - 163 ­

1989)(Santa Colomaet al, 1986). Las actividades especificas fue­ron calculadas para cada concentración total de ligando, y dichasactividades fueron empleadas para averiguar los moles de ligandounidos, a la respectiva concentración de ligando libre. La uniónno especifica (en presencia de 100 uM de GTP-X-S) fue menor al10%si se lo compara con el ensayo sin ligando no radioactivo.

Mmm" ciónEl ensayo de ADPribosilación es utilizado, en la mayoria de loscasos, con posterioridad al de unión de [35SJGTP—‘-Sy sirve,fundamentalmente, comoconfirmación de la presencia de una prote­ína C y caracterización de sus diferentes subtipos.

Para determinar la transferencia especifica de ADP-ribosacatali­zada por toxinas de Víbrio cholerae y de Bbrdetella pertussis auna proteina del tipo G, se incubaron 0,100 ml de las fraccionesproteicas (100-200 ug de proteina por ensayo) y 0,080 ml delbufÏEr

Tris-HCl 100 mM, pH 8EDTA 1 mM

DTT l mM

MgClz 2 mM

Lubrol PX 0,1 % v/v

Luego, dependiendo de qué tubo se tratara, se agregaron las toxi­nas:

cólera concentración final 200 ug/ml

pertussis concentración final 200 ug/ml previa­mente activadas en una solución de DTT10 mMdurante 30 minutos a30°C.

Finalmente, iniciando de esta manera la reacción, se incorporóATP 1 mM, Timidina 10 mM, GTP 200 “M (en los casos que correspon­día), y 1 HM[32PJNAD(4.10e cpm/ensayo; 30 Ci/mmol), y se reali­

CAP.2-METODOS - 164 ­

zó la incubación por 90 minutos a 30°C con agitación. El volumenfinal fue de 0,200 ml.

La reacción se detuvo con el agregado de 1 ml de SDS 3% y BSA10 ug/ml, las proteínas fueron precipitadas incorporando l ml deTCA30%(vol/vol) frío y finalmente filtradas a través de discosde Nitrocelulosa (BA85Schleicher & Schuell). Los filtros fueronlavados 5 veces con 4 ml de TCA6%, fueron secados en estufa ycontada su radioaotividad en un contador de centelleo líquido.

Para el ensayo de ADP-ribosilación en geles de poliacrilamida, elmétodo no revistió variantes, con la excepción de los volúmenesagregados ya que en este caso, el volumen final fue de 0,050 ml.Luego de los 90 minutos de incubación, se agregó a las muestrasradioactivas 0,050 ml de cracking buÍÏEr , se calentaron 3 minu­tos a 100°C y luego se sembraron en el gel.

MW [32PJGTP—aUnmétodo importante, desde el punto de vista de la identifica­ción de proteínas G, es el marcado fotoafín de dichas proteinasutilizando 8-azido [3-32PJGTP (Evans et al, 1986) o [32PJGTP-a(Linse et al, 1988). La ventaja de este ensayo es la identifica­ción y separación cualitativa en un gel de poliacrilamida, de to­das las proteinas que son capaces de unir GTP, a diferencia delmétodo de [35SJGTP—X-Sen el cual resulta imposible dicho proce­dimiento de discriminación.

Con este propósito, se incubó en un tubo Eppendorf, las fraccio­nes proteicas a identificar, suplementadas con MgClz 1 mM, DTT1 mM, ATP l mMy [32PJGTP-a (4.107 cpm/ensayo; 3000 Ci/mmol), enun volumen final de 0,100 ml.

Los controles en oscuridad fueron realizados cubriendo los tuboscon papel de aluminio, y a los controles desplazados se les agre­gó GTP1 mMconjuntamente con el nucleótido radioactivo.

CAP.2-METODOS — 165 —

Se incubaron previamente 15 minutos a temperatura ambiente y lue­go se irradiaron las muestras con luz UV (254 nm; lámpara de HgHBO 100 W/2, Osram), a una distancia de 10 cm por 20 minutos. Lareacción se detuvo agregando igual volumen de cracking buffér 2xy las muestras se sembraron en un gel de poliacrilamida (10% =T); volumen gel separador 40 ml; volumen gel concentrador 15 ml).Luego, el gel se fijó, se lavó en la solución fijadora suplemen­tada con 1 mMPO4H3, se secó y se expuso a —70°Cpor 48 horas.WComoúltimo paso en la caracterización e identificación de prote­inas G, la detección inmunológica cobró real trascendencia en losúltimos años. Disponiendo de una bateria de anticuerpos contradistintos epitopes de las distintas clases de proteínas G, es po­sible identificar fehacientemente qué subtipo de dichas proteinasse encuentra presente en el sistema estudiado.

Para lograr dicho objetivo, las proteínas (fracciones de membra­nas, sobrenadantes y eluídos de columnas, como en el caso de GTPsefarosa) previamente separadas en el gel, fueron transferidas amembranasde nitrocelulosa y reveladas con diferentes antisuerosespecíficos de proteina G.

Los antisueros utilizados fueron donados por los Dres. AllenSpiegel (AS/7 y SWl) del National Institute of Health, Bethesda,Maryland; Alfred Gilman (0-584) del Southwestern Medical Center,Dallas, Texas y Daniel Altschuler (9193) de la Burroughs Well­come, Research Triangle Park, North Caroline.

MencíaLa transferencia se realizó colocando la membranade nitrocelulo­sa en contacto directo con el gel y ubicando dicho “sandwich” enun campoeléctrico para permitir el pasaje de las proteinas a di­

CAP.2-METODOS — 166 ­

cha membrana.

Se utilizaron los siguientes buffbrs:

* Buffer catódico: Tris 25 mMpH 9,4Acido 5-amino-n-hexanoico 40 mMMetanol 20 %

* Buffer anódico 1: Tris 300 mMpH 10,4Metanol 20%

* Buffer anódico 2: Tris 25 mMpH 10,4Metanol 20%

Se colocaron seis trozos de papeles WhatmannSMMque habian sidohumedecidosen el buffér anódico l, sobre el grafito anódico,cuidando de que no quedaran burbujas. Sobre ellos se pusierontres capas de papel Whatmannhumedecidas en buffér anódico 2 y,sobre éstas, la membranade nitrocelulosa. El gel se apoyó suave­mente sobre la nitrocelulosa, expulsando las burbujas con una es­pátula. Luego se montaron los últimos seis trozos de papel What­mannembebidos en buffér catódico sobre el gel. Finalmente, secubrió el “sandwich”con el grafito catódico.

Se conectó el aparato a una fuente de poder y se transfirió a unacorriente constante de 0,8 mA/cm2de gel durante 1 hora a tempe­ratura ambiente.

Conanterioridad al proceso de inmunodetección, se tiñó la nitro­celulosa transferida con una solución de Ponceau S 0,5% (peso/vo­lumen en 0,1% ácido acético) comocontrol de la corrida electro­forética y de la electrotransferencia.

Blogueo

Unavez realizada la transferencia de las proteinas a la membra­na, se efectuó un bloqueo para evitar la adsorción inespecíficade los reactivos inmunológicosa la nitrocelulosa.

Se sumergió la membranade nitrocelulosa en la siguiente solución

CAP.2-METODOS - 167 ­

de bloqueo:

Tris-HCl 25 mMpH 8

NaCl 0,9% (p/v)(TBS 1x)

suplementada con Leche descremada 4% (p/v)Glicina 2% (p/V)Lisado de E. coli 0,5% (v/v) y se

incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación.

El. ., l l.

Luego del bloqueo, se detectó el antígeno (proteina G) por unióndel anticuerpo especifico. Para dicho propósito utilizamos detec­ción indirecta, empleando anticuerpos secundarios (marcados conbiotina) que reconocen al anticuerpo primario.

Se descartó la solución de bloqueo y se lavó durante 5 minutoscon solución de TBS lx adicionada con 0,05% (vol/vol) de Tween20. Luego, se añadieron las soluciones con el primer anticuerpo(especifico), diluido 12200para todos los casos. Dicha solucióncontenía:

Leche descremada 4%Glicina 2%Tween 20 0,05%en TBS lx y se incubó

durante 90 minutos a temperatura ambiente, con agitación.

Luego se hicieron 5 lavados de 5 minutos cada uno, con TBS lx ­Tween 20 0,05%, y se procedió luego a incubar por l hora con elsegundo anticuerpo. Se usó un suero de cabra anti-conejo biotini­lado (dilución 1:200) que habia sido preparado en la misma solu­ción del primer anticuerpo, agregándole 1% (vol/vol) de sueronormal de cabra. Se hicieron 5 lavados de 5 minutos cada uno conTBS 1x - Tween 20 0,05% y se incubó durante 1 hora con avidina­biotina (Vectastain Kit).

CAP.2-METODOS — 168 ­

Finalmente se hicieron 3 lavados con TBS 1x (sin Tween 20), y elfiltro ya estaba listo para realizarle la reacción de detección.

122mm

La presencia de la enzima fosfatasa alcalina (que se encontrabaacoplada a la biotina en el paso anterior), fue detectada utili­zando los siguientes sustratos:

Bromo-cloro-indoil-fosfato(BCIP) 60mg/mlen dimetilformamida 100%

Nitro blue tetrazolium (NBT) 50mg/ml en dimetilformamida 70%

Se agregaron 66 ul de NBTy 33 ul de BCIP en 10 ml del buffér

Tris-HCl 100 mMpH 9,5NaCl 100 mM

MgC12 5 mM y dicha solución seañadió al filtro. Este se incubó durante 10-20 minutos en oscuri­dad. La reacción se detuvo colocando los filtros en una solucióndiluida de EDTA.

BBQIQBIASTQíDILALEALEA

Q]! ..

Para obtener protoplastos de hiopocótilos de brotes de alfalfa,primeramentese crecieron las plántulas en forma estéril.

Para ello, se esterilizaron las semillas en etanol 70%durante 10minutos, en hipoclorito de sodio 1%durante 15 minutos. Luego delavarlas exhaustivamente con agua bidestilada estéril (5 cambiosde volumen), se transfirieron las semillas asépticamente a fras­cos de vidrio estériles (12 cm x 10 cm x 12 cm) que contenían unasolución de Ca804 1 mMestéril.

Se germinaron las semillas, ya sea en oscuridad o en luz, a 28°C

CAP.2-METODOS - 169 —

durante 6 dias.

Los hipocótiles obtenidos, se cortaron transversalmente en seg­mentos (z 1 mm)y se los plasmolizó durante l hora en la soluciónCPW13M, que contenía:

KNOa 101 mg/l

KH2PO4 27 mg/l

CaCl2.2H20 1480 mg/lMg804.7H2O 246 mg/lKI 0,6 mg/lCuSO4.5H20 0,025 mg/l

pH 5,8 suplementado con13%(peso/vol) de manitol.

Finalmente, el tejido se transfirió a la solución enzimática quecontenía 0,5% celulosa, 0,2% macerozima, y 0,1% pectinasa prepa­rada en el medio CPWlSM.Se añadió Ampicilina (400 mg/l) y se in­cubó con agitación (30 ciclos/minuto) a 25°C durante 18 horas.

Se filtró la mezcla de incubación con una malla de 50 um y secentrifugó a 120 xg durante 10 minutos. El sedimento obtenido selavó 3 veces con CPW13M.

Antes de realizar los ensayos de irradiación se calculó el por­centaje de protoplastos viables obtenidos, utilizando una doblecámara y diacetato de fluoresceina (FDA). Se empleó una soluciónde FDAde 5 mg/ml en acetona, y se añadió 1 gota a lO ml deCPW13M.Se mezclaron iguales volúmenes de la solución de FDAy dela solución de protoplastos obtenida. Luego de 5 minutos se exa­minó en un microscopio de fluorescencia.

fi protoplastos fluorescentes

%protoplastos viables = x 100

fi protoplastos totales

CAP.2-METODOS — 170 ­

Innadiación

Las irradiaciones efectuadas a preparaciones de protoplastos fue­ron llevadas a cabo utilizando un proyector de diapositivas(Kodak de 300 W, B-2AR) a través de filtro RG-9 (Schott & Mainz:fluence rate 7Wm-2), para las irradiaciones a 730 nmy un filtrode interferencia para las de 660 nm (Schott & Mainz, 660 i 5 nm).Todos los tratamientos fueron producidos antes de las reaccionesde unión de [3581GTP—3-S-La duración y series de irradiación consus periodos de oscuridad se especifican en las figuras cor­respondientes.

CONCLUSIONESGENERALES

CONCLUSIONES GENERALES - 172 ­

Esta tesis presenta en conjunto aspectos diversos sobre la inter­acción de proteínas G y fotoreceptores, asociados ambos a caminosde transducción de señales.

En el capítulo l se ahondó sobre la capacidad de reconstitutcióndel sistema de la visión, mientras que en el capitulo 2 se carac­terizó una proteina G de alfalfa virtualmente asociada a fitocro­mo­

La tangible independencia de amboscapítulos no resulta tan evi­dente comoparece. Por eso es necesario realizar una comparaciónentre los sistemas de transducción de señales en plantas y elsistema de percepción visual en vertebrados.

La presencia en los conos de retina de tres proteínas receptorasresponsables de la visión en colores (Nathans et al, 1986) conalta homologia con la rodopsina se asemeja a la distribución yespecificidad del fitocromo y de los demás fotoreceptores vege­tales. Esto conlleva a entender por qué Nam-HaiChua considera alos fotoreceptores vegetales, "los ojos del sistema visual de laplanta“.

La transduccion de la señal luminosa por intermedio de la rodop­sina involucra la interacción con una proteina G (transducina) yla subsecuente activación de una enzima efectora (PDE-GMPc). Laexistencia en plantas de una proteina G —versión transducina- queseria el posible receptor intracelular del fitooromo, provee aca­bada evidencia de la similitud entre ambosprocesos (Figura 71).

go Enzima0 —-> Efectora —> VISION(PDE-GMPC)

Gt

? e ? Proteína ?o —>-Efectora —> FOTOMORFOGENESIS(?)G

CONCLUSIONES GENERALES - 173 ­

Resulta llamativo el alto grado de paralelismo entre dichos sis­temas de transducción de señales ya que ambos se desarrollan enentidades pertenecientes a reinos diferentes, en células cuya es­tructura, función y morfología es altamente dispar y que generanrespuestas finales completamentediferentes.

BIBLIOGRAFIA

BIBLIOGRAFIA - 175 ­

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