Protein dockinge

drug discovery

E’ noto da tempo che i siti attivi degli enzimi sono ospitati in tasche (cavità) ricavate nella struttura proteica con specifiche caratteristiche chimico fisiche.

L’interazione proteina-ligando è dettata principalmente dalle caratteristiche di complementareità dei due composti: ligandi idrofobici legheranno regioni idrofobiche e ligandi carichi tenderanno ad essere richiamati da regioni cariche di segno opposto.

Anche se la catalisi è operata da pochi residui soltanto, la specificità degli enzimi è dettata dalle caratteristiche dei residui che stanno loro attorno e che generano dei campi di forze e delle caratteristiche geometriche precise.

Se si capisce come una proteina lega il suo ligando, si è in grado di alterare in qualche modo o la proteina o il ligando per migliorare o peggiorare la specificità del legame.

Il docking è la simulazione in silicio dell’aggancio di una proteina con un ligando secondo varie caratteristiche che

vengono prese in considerazione negli algoritmi di docking.

I criteri su cui si basano questi algoritmi sono essenzialmente:

1. Geometria delle superfici.

2. Interazioni tra residui affini.

3. Campi di forza elettrostatici.

Questi tre aspetti sono spesso considerati insieme, anche se la parte preponderante in genere è la

geometria.

L’approccio del docking è utile per molti aspetti sia biologici sia farmaceutici:

1. Identificazione di nuovi farmaci che funzionino da inibitori per le proteine (de novo drug discovery).

2. Miglioramento di ligandi già noti ma di cui non si conosce il meccanismo di interazione.

3. Studio dell’interazione tra proteine.

4. Ricerca di substrati per una proteina ignota da un punto di vista funzionale.

In ogni caso per poter procedere con una maetodica di docking è necessario conoscere la struttura tridimensionale della proteina. Inoltre, maggiore è la risoluzione della struttura,

migliori saranno i risultati, indipendentemente dall’algoritmo utilizzato.

I primi algoritmi di docking richiedevano la struttura tridimensionale della proteina e del recettore e cercavano di posizionare quest’ultimo in modo che le stesse più vicino possibile, considerando la geometria pura delle superfici. In pratica il ligando doveva essere già noto e gli algoritmi lo facevano “rotolare” lungo tutta la molecola fino ad una posizione di minima energia potenziale.

Oggi è possibile utilizzare algoritmi che chiedono il sito attivo della proteina e cercano in banche dati di strutture chimiche tutti i possibili ligandi.

Quest evoluzione è stata possibile grazie al potenziamento delle infrastrutture computazionali ma anche grazie all’ottimizzazione degli algoritmi che riescono a scartare tutte le combinazioni geometriche impossibili e a velocizzare il calcolo di tutte quelle possibili.

Nonostante tutte le ottimizzazioni il docking è un processo che richiede molto tempo di calcolo (anche settimane) e ne richiede tanto di più quanto più:

. estese sono le superfici da analizzare

. maggiore è l’accuratezza richiesta

Ogni algoritmo infatti si basa su un campionamento dello spazio di ricerca sul recettore basato sulle possibili roto-traslazioni: i parametri da impostare sono sempre tantissimi, ma i più importanti riguardano

. il numero di campionamenti dello spazio (es. se ho 360° di possibili rotazioni, posso scegliere di campionare ogni grado, ogni 5 gradi ecc., abbassando la precisione)

. gli elementi da tenere in considerazione (geometria, potenziale ecc.)

. la soglia di accettabilità (il minimo di energia richiesta)

Il limite maggiore delle tecniche attualmemte disponibili dipende da una assunzione implicita e spesso trascurata:

le proteine non sono modelli statici, ma si muovono continuamente secondo i loro equilibri interni.

Inoltre non si muovono casualmente, ma spesso è proprio l’arrivo del ligando che induce una proteina a modificazioni

geometriche che la rendono adatta al legame.

Se si assume la teoria del CORPO RIGIDO, si possono commettere gravi errori, ma è ad oggi l’assunzione più utilizzata nei programmi di docking.

Attualmente i programmi considerano il recettore come un corpo rigido e il ligando, che normalmente è una molecola relativamente piccola, come flessibile, migliorando molto le capacità predittive.

Algoritmi di ricercaCasuali: provano tutte le possibili posizioni del ligando su tutte le possibili posizioni del recettore, fissando le posizionia minima energia. Sui loro risultati si applicano spesso altri algoritmi più specifici.

Corpo rigido: (DOCK, FTDOCK, QSDOCK, LIGIN) utilizzano “soltanto” sei gradi di libertà per i movimenti, assumendo le due molecole come corpi statici. Per le interazioni proteine-proteina il corpo rigido è accettabile, visto l’alto numero di interazioni richieste per l’aggancio.

Annealing simulato: (AUTODOCK) iniziano la ricerca da uno stato in cui ho la massima libertà di movimento (maggiore temperatura) e poi la libertà viene abbassata (raffreddamento). Se vengono memorizzate le posizioni più stabili ad ogni temperatura, via via otterrò la posizione a minor entergia e con minor incertezza di posizione. Un docking, appunto.

Genetici: (GOLD, DARWIN, AUTODOCK) all’inizio ho una posizione con una certa stabilità. Questa condizione viene mutata continuamente e casualmente finchè non se ne trova una migliore secondo un criterio selettivo preimpostato (miglior fitness). A questo punto si tiene la nuova soluzione e si riinizia con le mutazioni casuali. Mantenendo costanti i livelli di pressione selettiva, alla fine le soluzioni evolvono verso le forma a minima energia.

Tabu: (PRO_LEADS) si parte da una posizione ad energia minimizzata e la si prova in tutte le posizioni del campo di docking. Se si trovano soluzioni a bassa energia, queste vengono utilizzate per ripetere le prove sulle superfici inesplorate della superficie. Alla fine ottengo una lista di possibili siti di docking con una lista di possibili orientazioni recettore-ligando.

Incremento di costruzione : (FLEXX, HAMMERHEAD, HOOK, LUDI) viene preso il ligando e spezzettato ai suoi angoli di torsione. Il frammento maggiore viene esaminato in termini di posizioni di docking, poi si cerca di aggiungere via via i pezzi che erano stati tolti, finchè non si ricostruisce il ligando completo.

E’ difficile scegliere un metodo che dia risultati accettabili, anche perché, se si effettuano studi di docking, si cercano orientazioni e possibilità inesplorabili a priori e da validare secondo un punto di vista sperimentale.

La maggior parte dei programmi di docking gratuiti girano sotto UNIX o altre piattaforme. Le versioni per Windows sono spesso a pagamento (in effetti se funzionano sono strumenti importanti per il drug design, e le ditte farmaceutiche hanno i brevetti).

CAPRI

Ogni anno vengono chiesti ai gruppi partecipanti dei possibili ligandi per proteine a struttura nota. Ci sono sempre più proteine con diverse forme e caratteristiche, dalle piu facili alle più difficili, e ogni programma di docking viene valutato in base a risultati sperimentali già noti ma segreti (blind test.

Le sezioni principali sono:

Docking di piccoli ligandi.Interazioni proteina-proteina.Valutazioni struttura funzione.

I programmi di docking accessibili a tutti e che girano sotto Windows sono principlamente 2:

GRAMM: Global RAnge Molecular Matching, fa una ricerca esaustiva nelle sei dimensioni di tutte le possibilità di interazione tra gli atomi di due strutture tridimensionali. Il docking è prettamente di natura geometrica e lo scoring dei risultati viene calcolato secondo delle regole di minima energia di repulsione tra gli atomima (o può essere rifinito secondo l’idrofobicità).

HEX: ha una natura più geometrica ed un’interfaccia grafica. Per ogni molecola viene modellata la sua superficie utilizzando funzioni parameteriche che tengano in considerazione non solo la forma ma anche la carica elettrostatica superficiale e la distribuzione superficiale dei potenziali. I vari parametri possono essere cambiati per limitare o rifinire il docking.

GRAMM

Non ha una interfaccia grafica, ma si basa sulle impostazioni di tre semplici file di testo in cui vengono indicati i parametri per controllare il docking.

File rpar.gr: il file dei parametri. Da qui si controlla l’accuratezza, la precisione, e di fatto la qualità del processo di docking. Bisogna conoscere bene il significato delle varie impostazioni perché si rischia di lanciare una procedura troppo lunga (incompatibile con i normali tempi di attesa)

File rmol.gr: il file dove vengono indicati i file PDB con le strutture da analizzare e le zone interessate dal docking (è possibile selezionare solo le zone del sito di binding, se lo si conosce.

File wlist.gr: il file dei risultati, dove è possibile specificare se si devono generare tanti file quanti sono i risultati o raggrupparli tutti nello stesso PDB o raggrupparne alcuni in base a qualche criterio.

Il programma viene lanciato dal prompt del DOS e può generare due tipi di risultato

>gramm scan : un file denominato .res in cui sono contenute tutte le coordinate dei risultati anche se non viene generato alcun file .pdb vero e proprio.

>gramm coord: viene letto anche il file wlist.gr e si generano i files.pdb corrispondenti ai risultati.

E’ possibile lanciare >gramm scan coord per generare tutti e due i files.

HEX