Protein De-Novo Design

Mooli Tayer, Assaf FaragyAdvised by Dr. Ora Furman-Schueler

אז מה יהיה לנו היום?

בעיית החיזוי והתוויית דרך לפתרון חישובי

Rosetta and the it’s Unified Framework

Computational redesign of DNA endonuclease

Kemp elimination catalysts by computational enzyme design

2

בעיית חיזוי מבנה

מבנה רצף

3

בעיית החיזוי

הנחה: המבנה הנטיביהוא המצב האנרגטי

הנמוך ביותר של החלבון.

גישה נאיבית4

Levinthal Paradox10143

תהאX קבוצת המבנים האפשריים לרצף הנתון.

תהאf: X→R.פונקציית אנרגיה

רוצים למצוא אתMin f(x) לכל xX.

בעיית החיזוי: מבט שני

5

מצרכים לפתרון

פונקציית אנרגיה

( שיטת דגימהSampling Method)

כוח חישוב6

Rosettaאלגוריתם

פרוייקט משותף שלמעבדות רבות

TOP7

7

The Baker lab, University of Washington

פונקציית האנרגיה

שיקולים אנרגטיים:קשרי מימן

אריזה צפופה

האפקט ההידרופובי

8

מודל קשרי מימן מפורש

Lennard-Jones potential

Implicit solvation model

סכימה בפונקציית האנרגיה

.דיברנו על מחיר לאינטראקציות בודדות

:הסכימה נעשית בשני שלבים:)סכימה עבור אפקט ספציפי )למשל קשרי מימן

: סכימה עבור סה"כ המרכיבים

9

חסרונות

שיקולי רזולוציה

10

Conformations

Ener

gy

Global minimum

שיקולי רזולוציה

:שני שלבים ברזולוציה משתנה

11

Sampling Method

אתחול שיירים בערכיםמצויים

בחירת קונפורמציותמקומיות מועדפות

(Fragment libraries)

12

Simulated annealing search (Backbone-

dependent rotamer library)

שימוש בפרוטוקולMonte-Carlo

רב-שלבי.

Sampling Method: Refinement

13

14

Rosetta@homeכוח חישוב:

שיתוף פעולה אקדמי-קהילתי

BOINC distributed computing

Google, YouTube & download: Rosetta@home BOINC

בעיית החיזוי והתוויית דרך לפתרון חישובי

Rosetta and the it’s Unified Framework

Computational redesign of DNA endonuclease

Kemp elimination catalysts by computational enzyme design

15

ומה עם בעיות אחרות?

A UNIFIED FRAMEWORK

התאמה של Rosetta

כללי משחק דומים

בעיות שכנות עם מאפייניםמשותפים

16

+

יתרונות של מסגרת אחידה

17

חיסכון גדול בעבודה

פידבק מקבוצות שונות שיפור האלגוריתם

גילוי פגמים ומגבלות

בעיות חיזוי

18

a Protein structure prediction

b Loop modeling

בעיות חיזוי

19

"... כך סתם פגש חלבון את חלבון,בחום היפה, באור הנכון,

ומהם יצא חלבון עם כשרון...והתכשיט כבר יודע לעשות חשבון!"

בעיית חיזוי מבנה

מבנה רצף

20

בעיות תכנון

21

בעיות תכנון

22

מגבלות ואתגרים

מרחב החיפוש גדל אקספוננציאלית כתלות בדרגותהחופש.

קושי במידול אינטראקציות פולריות, אנטרופיה

( אוטומציהRobetta)

פיתוח פונקציית אנרגיה לRNA

23

בעיית החיזוי והתוויית דרך לפתרון חישובי

Rosetta and the it’s Unified Framework

Computational redesign of DNA endonuclease

Kemp elimination catalysts by computational enzyme design

24

ברצוננו ליצור אנזים חדש השונה מגזע הברבשתי תכונות:

נקשר לאתר מטרה חדשאינו נקשר לאתר הישן

:ודומה לו בשתי תכונותחיתוךהבחנה

Computational redesign of endonuclease DNA binding and cleavage specificity

ברצוננו ליצור אנזים חדש השונה מגזע הברבשתי תכונות:

נקשר לאתר מטרה חדשאינו נקשר לאתר הישן

:ודומה לו בשתי תכונותחיתוךהבחנה

.LAGLIDADGשייך למשפחת אנזמי ה-

חומצות אמינו170אנזים הומודימרי בעל

זוגות בסיסים 20-24חותך אזורים באורך בספציפיות גבוהה.מקודד באינטרון

)???(

I – MsoI

תוכנית פעולה

שלב מקדים

תוכנית פעולה

שלב א – פגיעה בקישור אנזים דנ"א

28+(עם ליזין 6 בA- ו6 בGקשר מימן של הפורין )של החלבון.

קשר בתיווך מים עם תראונין.

העלות האנרגטית של אובדן קשרי המימן .3.2kcal/mol: +28 של ליזין desolvationו

Figure S2. b) Hydrogen bonding energy between protein and DNA basepairs, not including the DNA phosphate backbone/

תוכנית פעולה

התאמת חלבון לאתר החדש

צפוי לעשות שני 83ארגינין •.G-Cקשרי מימן עם הצמד

מעלה את אנרגיית 28לאוצין • )ובכך W.Tהקישור לדנ"א

משבשת אותו(ומבצע של 5אינטראקציה עם פחמן

C.בדנ"א המוטנטי

תוצאות

תוצאות

תוצאות

Competitive in vitro cleavage assays –W.T

במבחנה: דנ"אW.T ,8.3 , דנ"א מוטננטיkb -W.T I או מוטנטי I-MsoIשל דנ"א לא ספציפי,

MsoI.

Competitive in vitro cleavage assays

הבחנה של הW.T > 32)בין שני האתרים(.

הבחנה של הDES ≈ 16.

W.T> ביחס 27 חותך אתר מטרה בספצפיות( לדנ"א כללי(

DES> 25 חותך אתר מטרה בספצפיות

DNA – Protein complexes

השלכות

נקודת פתיחה טובה ליצירה של אנזימיםהמכוונים לאתרים ספצפיים לצורך שימושים

בגנומיקה ובריפוי גנטי.

המחקר מציג התקדמות משמעותית בתכנוןאינטראקציית חלבון דנ"א בעזרת מודל חישובי

היורד לרמה האטומית.:הכללה לממשקי דנ"א חלבון כללים

TF(ZFNs)

בעיית החיזוי והתוויית דרך לפתרון חישובי

Rosetta and the it’s Unified Framework

Computational redesign of DNA endonuclease

Kemp elimination catalysts by computational enzyme design

42

Kemp elimination catalysts by computational enzyme designRöthlisberger D et al, 2008, Nature 453 190-5

45

Kemp elimination

!לא ידועים זרזים טבעייםצעד קובע-קצב בריאקציות רבות

מצב מעבר

46

שני מנגנוני קטליזה:

Glu/Asp base His base, polarized by Glu/Asp

47

שני מנגנוני קטליזה:

Glu/Asp base His base, polarized by Glu/Asp

48

חלבון קיים, קושר ליגנד

שלד קשיח

גיאומטריה ומאפייניםמבניים

חיפוש מארח

49

RosettaMatch

נדרשה התאמה שלהאלגוריתם לטיפול

בשיירים

100,000יותר מ מארחים אפשריים

התאמה של כל מארחברמת השיירים לייצוב

מצב המעבר

KE59 catalytic site in Rasmol

51

מהמחשב למבחנה

.עימות המודל הממוחשב מול המציאות

הראו 8 אנזימים פוטנציאליים, 59מתוך פעילות קטליטית מדידה.

( בדיקת האתר הקטליטי ע"י מוטציותKE70 D44N, H16A.)

52

מהמחשב למבחנה

53

מהמחשב למבחנה

54

קריסטלוגרפיה

שגיאות (RMSD:)

0.32Åשלד:

0.95Åשיירים:

55

אבולוציה מוכוונת

56

למה אבולוציה מוכוונת?

השיטה הנפוצה והמוצלחת ביותר לשיפור שלקטליסטים, ע"ע אנזימים טבעיים.

( מחדדת ניואנסיםFine-tuning.)

.מצביעה על חסרונות של המודל הממוחשב

57

תוצאות

58

תוצאות

מוטציות, שיפור בפקטור של יותר 4-8עם באפקטיביות.200מ

.ללא מוטציות בשיירים הקטליטיים

.מוטציות מופיעות לעתים קרובות בסמוךלמה?

59

מסקנות והשלכות

.תכנון אנזימים חדשים למגוון ריאקציות

שיפור של ההבנה שלנו את המנגנוןהאנזימטי.

נדרש שיפור של קצב הריאקציה והאפיניותלמצב המעבר.

סדרי גודל מקבועי קצב של 4-5הפרש של אנזימים טבעיים

60

מקורות

Das R and Baker D (2008), Macromolecular Modeling with Rosetta, Annual Review of Biochemistry 77: 26.1-26.11.

Ashworth J et al (2006), Computational redesign of endonuclease DNA binding and cleavage specificity, Nature 441: 656-659.

Röthlisberger D et al (2008), Kemp elimination catalysts by computational enzyme design, Nature 453: 190-195.

Zhanghellini A et al (2006), New Algorithms and an in silico benchmark for computational enzyme design, Protein Sci. 15, 2785-2794.

Wikipedia

61

תודה

אורה פורמן )מקצוענית אמיתית(!