PROTEIN: uji proteinRabiatul Adawiyah (G84080001)1, Putra2, Waras Nurcholis3,

Mahasiswa Praktikum1, Asisten Praktikum2, Dosen Praktikum3

Struktur dan Fungsi BiomolekulDepartemen Biokimia, FMIPA, IPB

2010

Abstrak

Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang sangat bervariasi, dan memiliki struktur yang sangat bervariasi. Perubahan struktur protein disebut denaturasi. Percobaan uji protein bertujuan mengetahui factor-faktor yang menyebabkan protein terdenaturasi. Percobaan yang dilakukan dalam uji protein, meliputi pengendapan protein oleh logam dan garam, uji koagulasi, uji alkohol, dan denaturasi protein. Pengendapan oleh logam, yaitu protein direaksikan dengan logam Ag, Hg, dan Pb. Pengendapan oleh garam menggunakan natrium sulfat, kemudian diuji dengan uji Millon dan uji Benedict. Asam asetat dan pemanasan dilakukan pada uji koagulasi. Uji alkohol dan denaturasi dilakukan dengan penambahan HCl, NaOH, dan buffer asetat 4.7 pada campuran alkohol dan protein, tetapi denaturasi tidak menggunakan alkohol. Hasil percobaan, yaitu logam yang paling bahaya adalah logam Ag. Garam mendenaturasi protein secara reversible. Penambahan alkohol dapat mendenaturasi protein terutama dalam keadaan isolistrik. Protein paling banyak terdenaturasi pada keadaan basa dan isolistrik.

Pendahuluan

Protein merupakan senyawa organik kompleks dengan bobot molekul tinggi

yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu

sama lain dengan ikatan peptida (Hart 2003). Protein adalah instrumen yang

mengekspresikan informasi genetik. Protein di dalam sel dalam jumlah yang sangat

besar, masing-masing membawa fungsi spesifik yang ditentukan oleh gen yang sesuai.

Protein sangat bervariasi fungsinya (Lehninger 1994). Protein disusun oleh dua puluh

asam amino. Asam amino tersebut terdiri atas 9 asam amino esensial (asam amino yang

tidak dapat dibuat tubuh dan harus diperoleh dari makanan) dan 11 asam amino non

esensial (Campbell et al. 2002).

Arsitektur suatu protein terdiri atas tiga tingkatan struktur yang saling

berimpitan, yaitu struktur primer, sekunder, tersier, dan kuarterner. Struktur primer

suatu protein adalah urutan uniknya yang terdiri atas asam amino. Strutur sekunder

protein, yaitu sebagian besar segmen-segmen dalam rantai polipeptidanya yang terlilit

dan terlipat secara berulang dalam pola yang membentuk protein secara keseluruhan.

Lapisan yang tumpang tindih di atas pola struktur sekunder adalah struktur tersier

protein yang terdiri atas pemutar balikan tak beraturan dari ikatan antara rantai-rantai

samping berbagai asam amino. Struktur kuarterner adalah keseluruhan struktur protein

yang dihasilkan dari penggabungan semua subunit polipeptida ini (Sumardjo 2009).

Rantai polipeptida dengan suatu urutan asam amino tertentu dapat secara

spontan mengatur diri mengambil suatu bentuk tiga dimensi yang dipertahankan oleh

interaksi-interaksi yang menyebabkan struktur sekunder dan tersier. Keadaan ini terjadi

secara normal ketika protein sedang disintesis dalam sel. Namun, konformasi protein

juga tergantung pada kondisi fisik dan kimiawi lingkungan protein tersebut. Jika pH,

konsentrasi garam, suhu, atau aspek lain dari lingkungannya diubah, protein tersebut

bisa terbuka dan kehilangan konformasi aslinya. Perubahan pada protein tersebut

disebut denaturasi (Campbell et al. 2002).

Protein yang terdenaturasi akan menjadi inaktif dan kehilangan fungsi

biologisnya. Sebagian besar protein terdenaturasi ketika dipindahkan dari lingkungan

aqueous ke suatu pelarut organik, seperti eter atau kloroform; protein akan menjadi

terbalik (bagian luar masuk ke bagian dalam), daerah hidrofobiknya berganti tempat

dengan bagian hidrofiliknya. Protein bersifat amfoter, yaitu dapat bereaksi dengan

larutan asam dan basa. Apabila protein dipanaskan atau ditambah etanol absolut, maka

protein akan menggumpal (terkoagulasi). Proses koagulasi protein timbul seiring dengan

proses denaturasi (Jain 2005). Agen denaturasi lain, meliputi bahan kimiawi yang

merusak atau mengganggu ikatan hidrogen, ikatan ionik, dan jembatan disulfida yang

mempertahankan suatu bentuk protein. Denaturasi dapat juga disebabkan oleh panas

yang berlebihan, yang mengagitasi (merangsang) rantai polipeptida sedemikian rupa

sehingga cukup untuk mengatasi interaksi lemah yang menstabilkan konformasi

tersebut (Campbell et al. 2002).

Kelarutan protein di dalam suatu cairan, sangat dipengaruhi oleh beberapa

faktor antara lain, pH, suhu, kekuatan ionik dan konstanta dielektrik pelarutnya.

Protein seperti asam amino bebas memiliki titik isoelektrik yang berbeda-beda.

Titik Isoelektrik adalah keadaan ketika protein tidak mempunyai selisih muatan

atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak ketika

diletakkan dalam medan listrik. Protein pada saat keadaan pH isoelektrik sangat

mudah diendapkan karena pada saat itu muatan listriknya nol (Hart 2003).

Percobaan yang dilakukan dalam uji protein, meliputi pengendapan

protein oleh logam dan garam, uji koagulasi, uji alkohol, dan denaturasi protein.

Percobaan tersebut bertujuan mengetahui faktor-faktor yang dapat mendenaturasi

protein. Selain itu, kondisi yang menyebabkan protein terdenaturasi dapat dilihat

melalui percobaan-percobaan tersebut.

Bahan dan Metode

Percobaan dilakukan di laboratorium pendidikan Biokimia, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan alam, Institut Pertanian Bogor. Waktu

percobaan, yaitu Senin, 25 Oktober 2010, pukul 08.00 WIB. Uji protein yang

dilakukan, yaitu pengendapan oleh logam, pengendapan oleh garam, uji koagulasi,

pengendapan oleh alkohol, dan denaturasi protein.

Pengendapan oleh logam. Larutan albumin sebanyak 3 ml ditambahkan 5

tetes larutan HgCl2 2%. Percobaan diulangi dengan menambahkan Pb-asetat 5%

dan AgNO3 ke dalam larutan albumin.

Pengendapan oleh garam. Larutan albumin sebanyak 5 ml dijenuhkan

dengan menambahkan (NH4)2SO4 sedikit demi sedikit. Campuran tersebut diaduk

hingga mencapai titik jenuh, kemudian disaring. Uji kelarutan campuran tersebut

dengan air. Endapan diuji dengan pereaksi Millon, dan filtrat diuji dengan

pereaksi Biuret.

Uji koagulasi. Asam asetat 1 M sebanyak 2 tetes ditambahkan ke dalam

2.5 ml larutan albumin. Tabung dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit.

Endapan diambil dengan batang pengaduk, kemudian uji endapan tersebut dengan

pereaksi Millon.

Pengendapan oleh alkohol. Tabung reaksi sebanyak tiga buah disediakan

dan dibuat campuran sesuai tabel dibawah ini:

Tabung 1 2 3Larutan albumin 2.5 ml 2.5 ml 2.5 mlHCl 0.1 M 0.5 ml - -NaOH 0.1 M - 0.5 ml -Buffer asetat pH 4.7 - - 0.5 mlEtanol 95% 3 ml 3 ml 3 ml

Perhatikan perbedaan proses pengendapan protein oleh logam, protein oleh

garam, dan protein oleh alkohol.

Denaturasi protein. Tabung reaksi sebanyak tiga buah disediakan dan

dibuat campuran sesuai tabel dibawah ini:

Tabung 1 2 3Larutan albumin 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml

Buffer asetat pH 4. 7 - - 0.5 mlHCl 0.1 M 0.5 ml - -NaOH 0.1 M - 1 ml -

Tabung tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 15 menit dan

didinginkan pada suhu kamar. Tabung 1 dan 2 yang telah dipanaskan

ditambahkan 5 ml buffer asetat pH 4.7 dan perhatikan perubahan yang terjadi.

Hasil dan Pembahasan

Koagulasi protein dapat disebabkan oleh keadaan lingkungan sekitar yang

dapat mendenaturasi protein. Beberapa penyebab terdenaturasinya protein, yaitu h

penambahan asam, basa, logam berat, garam, dan alkohol serta suhu tinggi pada

protein. Percobaan yang dilakukan untuk melihat beberapa faktor yang dapat

menimbulkan koagulasi pada protein, meliputi pengendapan oleh logam,

pengendapan oleh garam, uji koagulasi, pengendapan oleh alkohol, dan denaturasi

protein.

Hasil percobaan pengendapan oleh logam (Tabel 1) menunjukkan

bahwaalbumin dapat diendapkan oleh penambahan HgCl2, dan AgNO3, tetapi

tidak dengan penambahan Pb-asetat. Logam Ag, Hg, dan Pb merupakan logam

transisi, dan posisi logam Ag dan Hg lebih reaktif daripada Pb pada sistem

periodik unsur. Albumin yang ditambahkan Pb-asetat tidak menimbulkan endapan

putih, hanya mengkeruhkan warna larutan. Endapan putih terbentuk pada albumin

yang ditambahkan HgCl2 dan AgNO3. Endapan lebih banyak terbentuk pada

penambahan AgNO3 dibandingkan penambahan HgCl2. Reaksi antara logam

dengan protein dapat menyebabkan terputusnya rantai samping pada protein yang

menyebabkan protein menjadi tidak aktif. Selain itu, logam tersebut dapat

memutuskan ikatan disulfida dan ikatan pada jembatan garam. Protein yang

terdenaturasi terlihat dari endapan putih yang terbentuk. Logam Ag+ bermuatan 1

yang nilainya lebih kecil dari Hg2+ sehingga lebih reaktif dan ikatan antara gugus

–COOH dan –NH2 dengan ion logam yang terbentuk sangat kuat untuk memutus

ikatan disulfida dan ikatan pada jembatan garam (Ophart 2003).

Tabel 1 Pengendapan oleh logamLarutan garam logam Hasil Pengamatan

HgCl2 2% ++Berwarna putih susu, terdapat endapan

Pb-asetat 5% + Berwarna putih keruh

AgNO3 5% +++Berwarna putih susu, ada endapan

Keterangan:+++: Terbentuk banyak endapan putih++ : Terbentuk endapan putih+ : Terbentuk sedikit endapan putih- : Tidak terbentuk endapan putih

Gambar 1 pengendapan protein oleh logam (a) HgCl2, (b) Pb-asetat, (c) AgNO3

Percobaan kedua, yaitu pengendapan protein oleh garam. Garam yang

digunakan untuk menggumpalkan protein adalah natrium sulfat. Hasil percobaan

penggumpalan protein oleh garam (Tabel 2) menunjukkan bahwa terjadi

penggumpalan protein saat ditambahkan garam natrium sulfat. Penggumpalan

yang terjadi setelah penambahan garam disebabkan oleh tertariknya mantel air

koloid hidrofil oleh elektrolit, peristiwa ini disebut salting out. Endapan protein

tersebut diuji kelarutannya terhadap air, dan menunjukkan bahwa endapan

tersebut larut dalam air. Endapan yang melarut kembali berarti albumin

mengalami denaturasi dapat balik (reversible) atau redenaturasi yang hanya

mengganggu ikatan struktur tertier protein pada salah satu ikatan rantai samping

(Poedjiadi 1994).Namun, endapan tersebut seharusnya tidak larut air karena

salting out. Kondisi ini menyebabkan protein tidak dapat lagi melarutkan garam

sehingga larutan jenuh. Uji Millon (Gambar 2b) yang dilakukan terhadap endapan

yang terbentuk menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya warna kuning,

yang membuktikan bahwa endapan tersebut mengandung protein. Hal ini

menunjukkan bahwa penambahan garam tidak merusak protein, garam hanya

menutupi permukaan protein yang aktif. Uji Benedict (Gambar 2ª) yang dilakukan

terhadap filtrat memberikan hasil negatif sehingga dapat disimpulkan bahwa filtrat

tersebut tidak mengandung protein. Hal ini berarti protein sudah mengendap

secara sempurna sehingga tidak tersisa lagi pada filtrat.

cba

Protein mengalami koagulasi pada percobaan uji koagulasi protein yang

ditambahkan asam asetat dengan bantuan pemanasan. Penambahan asam asetat

bertujuan agar larutan albumin mencapai pH isolistriknya, titik isolistrik albumin berada

pada pH 4.55-4.90 (Poedjiadi 1994). Muatan gugus amino dan karboksil bebas akan

saling menetralkan pada pH isolistrik sehingga molekul bermuatan nol dan mudah

diendapkan (Winarno 2002). Ketika pemanasan dilakukan dan mencapai temperatur

diatas 60oC kelarutan protein akan berkurang karena pada temperatur yang tinggi

energi kinetik molekul protein meningkat sehingga terjadi getaran yang cukup kuat

untuk merusak ikatan atau interaksi rantai samping pada struktur tertier dan kuartener

yang menyebabkan koagulasi. Hasil uji koagulasi protein menunjukkan bahwa endapan

tidak larut air yang berarti protein telah terdenaturasi oleh pemanasan yang dilakukan.

Uji Millon (Gambar 3) tidak memberikan warna apapun juga menunjukkan bahwa

protein juga tidak terdapat dalam filtrat.

Tabel 2 Data uji pengendapan protein oleh garam

Perlakuan Hasil uji KeteranganEndapan1. Uji kelarutan2. Uji Millon

++

Larut dalam airLarutan putih keruh, endapan kuning putih

Filtrat1. Benedict - Larutan berwarna biru

Gambar 2 Pengendapan oleh garam (a) uji Benedict, (b) uji Millon

Tabel 3 Data uji koagulasi protein

Perlakuan pada endapan Hasil uji KeteranganUji kelarutan - Tidak larut dalam airUji Millon - Tidak berwarna

a b

Gambar 3 Uji koagulasi (uji Millon)

Ikatan hidrogen terjadi antara gugus amida dalam struktur sekunder

protein. Ikatan hidrogen antar rantai samping terjadi dalam struktur tersier protein

dengan kombinasi berbagai asam amino penyusunnya (Ophart 2003). Ikatan ini

dapat dirusak dengan penambahan alkohol sehingga protein akan mengalami

pengendapan. Hasil percobaan pengendapan protein oleh alkohol setelah ditambah

etanol 95%, terlihat warna putih keruh pada larutan protein yang ditambahkan

HCl. Larutan yang ditambahkan NaOH hanya memiliki endapan yang sangat kecil

jumlahnya. Larutan yang ditambahkan buffer asetat pH 4.7 membentuk endapan

yang banyak. Hal ini menunjukkan bahwa protein banyak terdenaturasi ketika

ditambahkan buffer asetat 4.7.

Tabel 4 Pengendapan oleh alkoholTabung Hasil GambarHCl 0.1 M ++

NaOH 0.1 M +

Gambar 4 Uji kogulasi (a) HCl, (b) NaOH, (c) buffer asetat

Buffer asetat pH 4.7 +++Keterangan:+++ : endapan sangat banyak++ : endapan cukup banyak+ : endapan sedikit- : tidak ada endapan

Denaturasi protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin

terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Denaturasi tidak cukup kuat untuk

memutuskan ikatan peptida karena struktur primer protein tetap sama setelah proses

denaturasi. Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur sekunder dan

a b c

tersier protein. Struktur protein tersier terdiri atas empat jenis interaksi yang

membentuk ikatan pada rantai samping seperti; ikatan hidrogen, jembatan garam,

ikatan disulfida, dan interaksi hidrofobik non polar, yang kemungkinan mengalami

gangguan. Denaturasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi

protein (Ophart 2003).

Denaturasi memiliki derajat yang bertingkat, dari ringan sampai berat. Pada

denaturasi ringan, yang berubah hanya struktur konformasi rantai polipeptida, yaitu

lipatan-lipatan rantai membuka. Derajat denaturasi ringan masih masih reversibel dan

dapat kembali ke struktur semula (renaturasi). Perubahan yang terjadi ialah lipatan atau

gulungan rantai polipeptida membuka secara tidak beraturan, tetapi struktur kerangka

kovalennya tetap utuh. Denaturasi berat merubah struktur konformasinya dan ikatan-

ikatan kovalen antara residu-residu asam amino dapat rusak sampai putus. Derajat

denaturasi berat bersifat irreversibel (Hawab 2003). Denaturasi protein ditunjukkan oleh

tabel 5. Penambahan HCl tidak menimbulkan gumpalan atau endapan pada larutan

albumin. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan HCl dalam jumlah kecil tidak dapat

mendenaturasi protein. Albumin yang ditambahkan NaOH dan buffer asetat membentuk

suatu serat atau gumpalan putih. Hal ini menunjukkan bahwa protein paling banyak

terdenaturasi pada keadaan isolistrik dan dalam kondisi basa.

Tabel 5 Denaturasi proteinTabung Hasil GambarHCl 0.1 M Larutan tidak berwarna

NaOH 0.1 M Terdapat serat-serat putih

Gmbar 5 denaturasi Protein (a) HCl, (b) NaOH, (c) buffer asetat

Buffer asetat pH 4.7Gumpalan putih mengapung

Simpulan

Protein dapat didenaturasi oleh logam. Logam yang paling merusak

protein adalah logam Ag. Garam menggumpalkan protein karena keadaan salting

out, bukan dengan merubah bentuk struktur protein. Garam mendenaturasi protein

secara reversible. Denaturasi juga disebabkan karena suhu yang sangat tinggi

sehingga mengakibatkan struktur protein menjadi rusak. Penambahan alkoholpada

a b c

protein dapat menyebabkan protein terdenaturasi. Denaturasi protein yang

menghasilkan banyak gumpalan, yaitu ketika lingkungannya dalam kondisi basa

dan dalam keadaan isolistrik.

Daftar Pustaka

Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2002. Biologi. Jilid 1. Lestari R, penerjemah; Safitri A, editor. Terjemahan dari: Biology. Jakarta: Erlangga.

Hart C, Craine LE, dan Hart DJ. 2003. Kimia Organik: Suatu Kuliah Singkat. Achmadi SS, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry.

Hawab HW. 2003. Pengantar Biokimia. Malang : Bayu Media Publishing

Jain JL, Jain S, Jain N. 2005. Fundamentals of Biochemistry. New Delhi: S. Chand & Co.

Lehninger AL. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jilid ke-1. Thenawidjaya M, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.

Ophart CE. 2003. Virtual Chembook: Denaturation of Protein. [terhubung berkala]. www.elmhurst.edu.class.fst. [11 November 2010].

Poedjiadi A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Pr

Winarno FG. 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.