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Propagacion in vitro de jengibre

Proyecto especial presentado como requisito parcial para optar al titulo de Ingeniero Agr6nomo en el Grado

Academico de Licenciatura presentado por

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Juan Diego Pefiaherrera Palacios

Zamorano, Honduras Abril, 1998

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El autor concede a Zamorano permiso para reproducir y distribuir copias de este

trabajo para fines educativos. Para otras personas fisicas o juridicas se reservan los derechos del autor.

Juan Diego Pefiaherrera P.

Zamorano, Honduras Abril, 1998

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Propagaci6n in vitro de jengibre

presentado por

Juan Diego Pefiaherrera Palacios

Aprobada:

f).[J.~ Juan Jose Alan, Ph.D. Asesor Principal

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f}f}-~ Juan Jose Alan, Ph. D. Coordinador PIA

J~'ffil Carlos Rosas, Ph. D. Jefe de Departamento

Antonio Flores, Ph. D. Decano Academico

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DEDICATORIA

A mis padres, por su apoyo incondicional y confianza.

A Marcela por su paciencia y amor.

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AGRADECIMIENTOS

AI Dr. Juan Jose Ahin por su amistad, su ayuda en Ia preparacion de este proyecto y todos los jalones de orejas.

A Ia Ing. Agr. Dinie de Rueda, M. Sc. por su colaboracion, su apoyo oportuno y Ia confianza brindada.

AI Dr. Pablo Emilio Paz por su apoyo.

A los Ingenieros: Julio Ventura, Rommel Reconco y Edgardo Varela por su amistad.

A los Doctores: Francisco Gomez y Wilfredo Colon por Ia ayuda brindada.

En general a todo el personal del Departamento de Agronomia, especialmente a Zoila Sandoval y a Olga Murillo por su colaboracion.

AI Ing. Agr. Julio Hasing, por su apoyo moral, logistico y especialmente por su amistad.

AI Ing. Agr. Luis Arriaza por su amistad y ayuda.

AI Arquitecto Teodoro Albomoz por su colaboracion en Ia parte fotognifica.

A mis amigos los Ing. Agr: Joffre Arregi, Agusto Teran, Alvaro Perez, Edgar Freire, Ignacio Landivar, Juan Jose Olaechea, Alejandro Tonello, Jaime Del Carmen, Pedro Pablo Rodriguez, Enrique Duarte, Roderico Mendez, Juan Pagan, Mario Pefia, Guillermo Torufio, Carlos Bravo, Rene Barrientos, Pedro Vargas, Jack Camino, Ricardo Zambrano, Andres Macias, Gonzalo Coimbra, Cristian Chicaiza, Rodolfo Pacheco, Edwin Flores, Francisco Orozco, Miguel Yunez, Edison Jerez, Carlos Arias, y a todos de los que me olvido mencionar Ia, gratitud es grande Ia memoria pequefia. Por su amistad y momentos compartidos.

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RESUMEN

Pefiaherrera, Juan Diego. 1998. Propagaci6n in vitro de jengibre. Proyecto Especial del Programa de Ingeniero Agr6nomo, Zamorano, Honduras. 29 p.

En Honduras, los productores de jengibre para exportaci6n han tenido dificultades debido a que usan como semilla el rechazo de las empacadoras al que le dan un mal manejo en almacen, lo que se traduce en una serie de problemas fitosanitarios. Una soluci6n es propagar jengibre in vitro. El presente estudio se dirigi6 a buscar Ia mejor combinaci6n de auxinas, acido naftalenacetico (ANA) y acido indolacetico (AlA) y citoquininas kinetina (Kin) y bencil aminopurina (BAP). Se prob6 una citoquinina con una auxina mediante un factorial de cuatro dosis de cada una en un medio de Murashigue y Skoog (MS) modificado. La combinaci6n mas eficaz fue lade ANA con BAP. En la etapa de establecimiento se observ6 que el jengibre responde a dosis altas de BAP (5 y 7.5 mg/1). En la etapa de multiplicaci6n en un medio de crecimiento de MS con 5 mg/1 de BAP se pudo multiplicar satisfactoriamente, obteniendose plantas completas con hojas y raices listas para pasar a Ia etapa de aclimataci6n. Para esta etapa, se cultivaron en un invemadero en cajas de plastico (para mantener la humedad y la temperatura altas) en un medio organico previamente pasteurizado. Las plantas, luego de una etapa de dos semanas empezaron a crecer aceleradamente.

Palabras claves: acido naftalenacetico, bencil aminopurina, cultivo in vitro

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NOTA DE PRENSA

PROPAGACI6N IN VITRO DE JENGffiRE: UNA OPCI6N VIABLE PARA

OBTENER PLANTULAS EN GRANDES CANTIDADES YEN POCO TIEMPO

Los exportadores de jengibre en Honduras, han tenido problemas por bajos rendimientos, debido a que usan como semilla el rechazo de las exportadoras. Ademas, no almacenan Ia semilla adecuadamente por lo que se infecta de hongos y bacterias. Todo esto conduce a una disminucion en los rendimientos y perdidas economicas para los productores. Como una altemativa de solucion a los problemas mencionados se propone Ia propagacion de jengibre in vitro, es decir, en recipientes de vidrio que contienen un medio nutritivo adecuado para que las partes de las plantas (yemas de rizomas de jengibre) que se usan como prop{lgulo se espera que formen nuevas plantas completas.

Las yemas no crecen unicamente con el medio nutritivo, tambien necesitan ciertas sustancias que permiten Ia formacion de raices, tallos y hojas Estas sustancias son llamadas hormonas vegetates. Las hormonas que promueven el crecimiento de raices son las auxinas, y las que promueven el crecimiento de tallos son las citoquininas. Hay diferentes tipos de auxinas y citoquininas, y dependiendo de Ia planta se necesitan diferentes cantidades y diferentes tipos de hormonas. Con el fin de conocer que tipos de hormona y que cantidades necesita el jengibre, en Zamorano se estableci6 un experimento en 1997. En este experimento se observ6 que el jengibre crece mejor con dosis bajas (0.5 mg por litro) de Ia auxina acido naftalenacetico (ANA) y Ia citoquinina bencil aminopurina (BAP) a una dosis entre 5 y 7.5 mg por litro de medio.

Una vez que se observa Ia formacion de brotes y a veces de raices, se dividen en porciones y se transfieren a un recipiente grande con el mismo medio nutritivo y con 5 m/1 de BAP para que crezcan y se multipliquen. En este medio se pudo apreciar que los brotes crecieron y formaron hojas ademas de raices, lo que indic<> que no era necesario pasarlos a otro medio para que formaran raices.

Cuando las plantas tenian hojas y raices se pasaron a un invemadero bajo condiciones de alta temperatura y alta humedad, en macetas con un medio formado por suelo organico y arena. A partir de Ia segunda semana empezaron a crecer rapidamente. Despues de tres semanas estaban listas para cultivarse en el campo para Ia produccion de semilla sana. El porcentaje de mortalidad en esta etapa fue muy bajo.

Portadilla Autoria Pagina de finnas Dedicatoria Agradecimientos Resumen Nota de prensa Contenido Indice de Cuadros lndice de Figuras

Vlll

CONTENIDO

1 INTRODUCCION

2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.9.1 2.9.2 2.9.3 2.9.4

3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.5.1 3.6 3.7 3.7.1 3.7.2 3.7.3 3.8 3.8.1 3.8.2

REVISION DE LITERA TURA HIS TO RIA PRODUCCION CONSUMO usos BOTANICA Y DESCRIPCION CULTIVO CUL TIVO IN VITRO DE MERISTEMAS API CALES MUL TIPLICACION MASIVA DE VEGET ALES MICROPROPAGACION DEL JENGIBRE Establecimiento Multiplicaci6n Enraizamiento Aclimataci6n

MA TERIALES Y ME TO DOS LOCALIZACION CAMARA DE CRECIMIENTO MATERIAL VEGETAL CRIST ALERIA E INSTRUMENTOS MEDIO DE CUL TIVO Preparaci6n del medio DESINFECCION DISECCION Y CUL TIVO Etapa de establecimiento Etapa de multiplicaci6n Etapa de aclimataci6n VARIABLES ESTUDIADAS Establecimiento Multiplicaci6n

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2 2 2 3 3 3 4 4 5 5 5 6 6 6

7 7 7 7 7 7 9 9 10 10 10 10 11 I 1 I I

IX

3.8.3 Aclimataci6n II

4 RESULTADOS I2 4.1 EFECTO DE LA COMBINACION DE ANA 0 AlA CON

BAP 0 KIN SOBRE YEMAS DE JENGIDRE I2 4.2 EFECTOS DE ANA Y BAP EN LA ETAPA DE

EST ABLECIMIENTO I3 4.3 ET AP A DE MUL TIPLICACION 20 4.4 ETAPA DE ACLIMATACION 22

5 DISCUSION 24 5.1 EST ABLECIMIENTO 24 5.2 EXPERIMENTO DE DIFERENTES DOSIS DE ANA CON BAP 24 5.3 MUL TIPLICACION 25 5.4 ACLIMA TACION 25

6 CONCLUSIONES 26

7 RECOMENDACIONES 27

8 BIBLIOGRAFiA 28

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iNDICE DE CUADROS

Cuadro

1. Medio de cultivo uti1izado en Ia etapa de establecimiento y multiplicaci6n formado por las sales minerales de Murashigue y Skoog y complementos orgcinicos.

2. Combinaciones de diferentes dosis de auxinas y citoquininas.

3. Formaci6n de brotes, callos o raices a partir de yemas apicales de jengibre utilizando varias dosis de AlA y BAP.

4. Formaci6n de brotes, callos o raices a partir de yemas apicales de jengibre utilizando varias dosis de ANAy BAP, a los 68 dias de siembra.

5. Explantes sobrevivientes que produjeron callos, brotes o raices en Ia etapa de establecimiento con ANA y BAP a los 68 dias de transplante.

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INDICE DE FIGURAS Figura

1. Y ema apical de jengibre desprendiendo bnicteas. Se puede observar Ia formaci6n de callo. 16

2. Y ema apical de jengibre con brotes y raices a los 35 dias de sembrada. 17

3. Yema apical de jengibre que form6 brotes y raices con 5 mg/1 de BAP y 0.5 mg/1 de ANA, a los 68 dias de siembra. N6tese que los brotes parten de yemas laterales preexistentes. 18

4. Yema apical de jengibre que form6 brotes y raices con 7.5 mg/1 de BAP y 1 mg/1 de ANA, a los 68 dias de siembra. 19

5. Plantulas de jengibre en multiplicaci6n provenientes de una secci6n de un explante que creci6 en un medio con 5 mg/1 de BAP y 1.5 mg/1 de ANA. 21

6. Planta de jengibre en crecimiento, luego de tres semanas de transferida al suelo en el invernaculo. N6tese que las primeras hojas formadas in vitro muneron. 23

1. INTRODUCCION

El jengibre (Zingiber officina/e) es originario de Asia. Es una planta de gran importancia econ6mica debido a sus usos como especia y en medicina. Se propaga normalmente por medio de rizomas, lo que constituye un problema, porque se pueden transmitir enfermedades y nematodos que merman considerablemente la productividad.

El mal manejo del rizoma que se usa como semilla aumenta el riesgo de transmisi6n de enfermedades. Tal es el caso de Honduras, en donde los rendimientos son bajos debido a que el material de rechazo de las exportaciones se usa como semilla. Ademas, no existe un proceso adecuado de curado durante el almacenamiento previo a la siembra y se hace un uso inapropiado de plaguicidas para tratar de combatir los bongos parasitos.

Cerca de un 80% los de productores en Honduras tienen problemas durante el proceso de seleccionado, manejo y almacenamiento de la semilla, que se incrementa al aumentar las areas de producci6n. Son pocos los productores que, a nivel nacional, le dan importancia al buen manejo de la semilla. Las pesimas condiciones de almacenamiento favorecen la aparici6n y el desarrollo de bongos como Fusarium sp. y Pythium sp. y de bacterias como Erwinia sp. y Pseudomonas sp., responsables de las perdidas durante esta fase (Ramirez, 1996).

De ahi la importancia de su propagaci6n in vitro, pues asi se aseguraria la obtenci6n de semilla sana, en grandes cantidades y en un menor tiempo.

En Zamorano se ha estudiado la micropropagaci6n in vitro del jengibre. Se han evaluando los efectos de algunas hormonas, en diferentes concentraciones, en el medio de Murashigue & Skoog (MS) (1962). Ademas, se trabaj6 en la desinfecci6n del material vegetal, probando varios fungicidas, bactericidas y alcohol en varias concentraciones y tiempos de contacto basta que se consigui6 una combinaci6n eficaz para la desinfecci6n y el posterior trabajo de propagaci6n. En el presente trabajo se trat6 de comprobar los resultados obtenidos anteriormente, ademas de probar otras hormonas y llegar a la etapa de aclimataci6n de plantulas de jengibre propagadas in vitro.

Los objetivos generales del trabajo fueron multiplicar masivamente plantas de jengibre y su aclimataci6n. El objetivo especifico fue probar combinaciones de las auxina acido naftalenacetico (ANA) y acido indolacetico (AlA), y las citoquininas bencil aminopurina (BAP) y kinetina (Kin) en Ia multiplicaci6n masiva de jengibre.

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2. REVISION DE LITERATURA

Desde 1989. en Honduras se inici6 Ia exportaci6n de jengibre hacia diferentes partes del mundo. Los rendimientos han sido muy bajos durante casi todo este periodo por razones de mal manejo de Ia semilla (Ramirez. 1996).

Se exporta el mejor material producido y el rechazo es utilizado como semilla. Ademas. este rechazo. es mal manejado y generalmente no es sometido a selecci6n. a un curado y a un proceso de cicatrizaci6n de los cortes. Por un periodo de tres afios los productores emplearon para el curado un solo producto (Benomil en dosis inadecuadas ), lo que ha dado Iugar a problemas de resistencia de los hongos. Durante Ia etapa de almacenamiento. Ia semilla no es revisada peri6dicamente cuando son colocadas en bolsas de polietileno para estimular el desarrollo de brotes. en donde las condiciones de alta temperatura y alta humedad favorecen el rapido desarrollo de enfermedades (Funez. s.f ).

2.1 HISTORIA

Es una de las especias mas conocidas. Desde los tiempos mas remotos se empleaba en China y en Ia India. El nombre de Zingiber. del cual se ha derivado el de jengibre, debi6. ser tornado. segtin se cree. del sanscrito "sanjabil". que dio "zanzabil" en arabe. Los antiguos griegos y romanos lo apreciaban mucho; y lo obtenian por medio de comerciantes arabesque lo traian de Ia India (Maistre, 1989).

Su uso fue introducido a Francia y Alemania en el siglo IX y a Inglaterra en el siglo X. La planta fue introducida en America poco despues del descubrimiento. A Mexico Ia introdujo Francisco de Mendoza, hijo del virrey de este territorio. De alii paso pronto a las Antillas. especialmente a Jamaica, que en 1547 ya exportaba 1100 toneladas de rizomas a Espana y h.a continuado desde entonces como uno de lo principales paises productores de jengibre (Maistre. 1989).

2.2 PRODUCCI6N

Cierto ntimero de paises productores de jengibre son al mismo tiempo consumidores. Por esta raz6n, es dificil dar una cifra exacta del conjunto de Ia producci6n anual mundial de jengibre. Sin embargo. se puede estimar en total en unos cuarenta millones de toneladas aproximadamente. Las tinicas informaciones sobre Ia producci6n mundial que se conocen son las siguientes: India 16700 t, Jamaica 1600 t. Sierra Leona 2000 t, Nigeria 1200 t.

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Ceilan 3500 t, China Continental 4000 t, Formosa 6000 t, lo que representa un total de 35000 t (Maistre, 1989).

Segim Ramirez ( 1996), en Honduras, este cultivo ha encontrado gran aceptaci6n para explotaciones comerciales, y desde 1989 se comenz6 a exportar, por lo que las areas de producci6n se han incrementando.

2.3 CONSUMO

Los principales consumidores son algunos paises productores, tales como Ia India, Ceilan, China Continental, pero tambien los paises arabes (Aden, Arabia Saudita, Egipto ), los Estados Unidos e Inglaterra (Maistre, 1989).

Tradicionalmente, el jengibre se habia consumido intemamente en los paises productores, pero a medida que Ia poblaci6n asiatico - oriental, hindu y arabe ha emigrado, Ia demanda ha aumentado considerablemente (El Salvador, Fundaci6n Salvadorefia para el Desarrollo Econ6mico y Social, 1994 ).

2.4 usos

Los rizomas son utilizados extensamente como condimento; en forma fresca, seca (especia) o en conserva, salmuera, enlatado, etc. Adicionalmente, este producto es muy utilizado en Ia fabricaci6n de algunas bebidas (El Salvador, Fundaci6n Salvadorefia para el Desarrollo Econ6mico y Social, 1994). La industria medica lo utiliza en Ia fabricaci6n de carminativos y aromaticos para el tracto gastrointestinal y respiratorio. En el pasado, el jengibre adquiri6 reputaci6n de afrodisiaco y fue extensamente usado en Ia India y el Medio Oriente para tal prop<)sito (El Salvador, Fundaci6n Salvadorefia para el Desarrollo Econ6mico y Social, 1994 ).

2.5 BOTANICA YDESCRIPCI6N

El jengibre (Zingiber officina/e) pertenece a Ia familia de las Zingiberaceas. La planta se forma de un rizoma subterraneo del que parten vastagos aereos, cubiertos por las vainas envolventes de las hojas. La planta alcanza hasta un metro de altura; el follaje es de color verde palido. Normalmente hay un escapo floral que parte del rizoma. Los rizomas del jengibre son tallos monopodiales, hasta de 50 centimetros de largo (Leon, 1987).

Cuando se cosechan maduros, esto es, una vez seca Ia parte aerea de Ia planta, los rizomas frescos de jengibre se presentan en forma de 6rganos irregulares, alargados, del grueso de un dedo pulgar con ramificaciones obtusas en el mismo plano. Se les designa como manos y son tanto mas apreciadas cuanto mas rectilineas y desarrolladas son sus ramificaciones o dedos. El volumen y peso varian segim las condiciones ecol6gicas y el

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esmero con que se ha llevado a cabo el cultivo. Las manos mas gruesas pueden pesar mas de 200 g y medir 15 em o mas, mientras que los dedos suelen tener de 3 a 6 em de largo por uno o dos de ancho. La mayor parte de los autores coincide en que el fruto es desconocido. Otros afirman que es raro y que se presenta en forma de capsula de paredes alargadas, trilocular, dividido en varias celdas que se abren en tres valvulas y contiene un cierto nfunero de semillas negras, pequeiias y angulosas (Maistre, 1989).

2.6 CULTIVO

Requiere de clima tropical a subtropical con temperaturas entre 25 y 30 grados centigrados y precipitaci6n mayor de 2000 mm anuales distribuidos durante todo el aiio. Los suelos sueltos con alto contenido de materia organica, con buen drenaje, son los mas recomendados. La semilla son trozos de rizoma; se siembra a una densidad de 20,000 plantas por hectarea. La distancia entre plantas es de 0.40 m entre plantas y 1.30 m entre surco. La cosecha se lleva a cabo de nueve a diez meses despues de Ia siembra (Solano, 1991).

2.7 CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMAS APICALES

De todos los tejidos utilizados para Ia micropropagaci6n se prefieren los meristemas ya que pueden regenerar plantulas completas mas rapidamente que los tejidos de otras fuentes. Las plantulas regeneradas usualmente tienen las caracteristicas geneticas de los progenitores debido a Ia naturaleza diploide de las celulas meristematicas (Murashigue, 1974).

Desde los aiios 60, cuando se descubri6 Ia capacidad que tienen las puntas de los brotes y los meristemas de orquideas, cortados apropiadamente y sembrados en un cultivo aseptico para crecer y desarrollarse en plantulas (Morel, 1964 ), estos explantes han sido utilizados para propagar otras plantas, mantener y multiplicar los materiales geneticos. De una punta de brote cultivado o de un explante, en algunos casos, se regenera una planta y en otros casos se puede estimular Ia formaci6n de brotes multiples (Styer y Chin., 1983).

En realidad, en cada uno de estos casos se espera a menudo lograr Ia formaci6n de ramas axilares que puedan separarse y enraizarse; te6ricamente los brotes axilares o laterales pueden a su vez producir ramas axilares adicionales a perpetuidad, a medida que se subcultiva cada brote recien formado o cada explante de nudo. Por lo tanto, el metodo es bueno para obtener una rapida multiplicaci6n clonal y se ha aplicado a una gran variedad de especies, desde las herbaceas basta las leiiosas (Krikorian, 1982).

El estudio detallado in vitro de los requerimientos nutricionales, hormonales y ambientales nos ayuda a entender los mecanismos reguladores que controlan la diferenciaci6n de las plantas. De aqui Ia gran importancia de los meristemas de Ia planta, pues se encuentran asociados con celulas altamente diferenciadas, ademas de que dan

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origen a diverso tipo de celulas, tejidos y 6rganos para formar una planta completa. Tambien, se perpetilan a si mismos, produciendo celulas que retienen su actividad meristematica (Navarro, 1988).

2.8 MULTIPLICACION MASIV A DE VEGETALES

La facilidad de usar la tecnica de cultivo de tejidos vegetates para Ia multiplicaci6n masiva es que produce material vegetal in vitro por Ia iniciaci6n de brotes adventicios, bulbos, tuberculos, embriones asexuales o por crecimiento de brotes de yemas axilares y producci6n masiva de phintulas a partir de meristemas (Hurtado y Merino, 1988).

Los propagadores comerciales tienen estandarizado el metodo de mantenimiento de un lote comercial de material madre in vitro, en el que ademas de tener Ia ventaja de mantener este material, se mantiene un gran nfunero de plantulas en un espacio reducido con las condiciones ambientales requeridas y Ia calidad y sanidad deseables. Esto es debido al potencial morfogenetico que tienen los meristemas y otros tejidos de Ia planta en Ia producci6n masiva de brotes (Hurtado y Merino, 1988).

2.9 MICROPROPAGACION DEL JENGffiRE

Las flores del jengibre aparentemente no producen frutos por lo que no hay sistemas de propagaci6n sexual (Malamug et al. 1991 ). La propagaci6n debe hacerse vegetativamente mediante rizomas; sin embargo, Ia tasa de multiplicaci6n obtenida es muy baja, ademas de que facilita la diseminaci6n de diversas plagas y enfermedades (Chen-Han y Jimenez, 1994). Esto hace que la micropropagaci6n por cultivo de tejidos in vitro para Ia propagaci6n del jengibre sea una opci6n rentable. La propagaci6n clonal por medio de cultivo de tejidos se ha dividido en cuatro etapas: establecimiento, multiplicaci6n, enraizamiento y aclimataci6n (Murashigue, 1974).

2.9.1 Establecimiento

Zelaya, ( 1997) informa que yemas apicales y axilares de jengibre en un medio de iniciaci6n de MS que contenia acido naftalenacetico (ANA) como auxina y bencil amino purina (BAP) como citoquinina, produjeron brotes y callos, pero no logr6 determinar las dosis 6ptimas de cada hormona debido a la gran contaminaci6n end6gena de los explantes que us6. En jengibre rojo (Alpinia purpurata), planta ornamental perteneciente a Ia misma familia esta etapa dura normalmente 30 dias (Chen-Han y Jimenez, 1994). En el experimento realizado por Zelaya obtuvo respuestas de los explantes despues de los 40 dias luego de Ia siembra.

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2.9.2 Multiplicacion

Para jengibre rojo, los explantes, que son los hijuelos formados en la base de las bnicteas florales partidos por la mitad, fueron transferidos al medio de MS con una concentraci6n alta de BAP (4 mgll). El periodo de formaci6n de brotes dura aproximadamente 30 dias, pudiendose hacer ciclos de multiplicaci6n mensuales (Chen-Han y Jimenez, 1994). Zelaya ( 1997) indic6 que las Zingibeniceas necesitan alrededor de 5mg/l de BAP para inducir la multiplicaci6n.

2.9.3 Enraizamiento

Chen-Han y Jimenez (1994) indican que transfirieron los brotes desarrollados para que formaran raices y asi obtener plantas completas in vitro. En esta etapa, usaron el medio de MS y generalmente, suprimen las citoquininas y utilizaron ANA en una dosis de 0.5 mg/l. A los 30 dias (con jengibre rojo ). aproximadamente, obtivieron una buena relaci6n entre las raices y el foliage. Hay ciertas especies que no necesitan una etapa de enraizamiento pues forman raices en la etapa de multiplicaci6n o en el invemadero de aclimataci6n sin mayores problemas.

2.9.4 Aclimataci6n

Pierik (1990) informa que una planta originada in vitro difiere en muchos aspectos de las que se originan in vivo. Tienen una cuticula escasamente desarrollada debido a la alta humedad relativa dentro del tubo de ensayo; por lo tanto, hay mayor transpiraci6n y las hojas son fotosinteticamente poco activas. Los estomas de la planta no son suficientemente operativos y permanecen abiertos cuando han pasado al suelo. Lo anterior conduce a un estres hidrico y a la carencia de a.zUcares, por lo que es necesario brindar un trato especial a estas plantas. Generalmente, lo que se hace es mantener Ia humedad relativa alta en el ambiente al que pasan, por medio de riegos por aspersi6n o en cajas de plastico, ademas de una fertilizaci6n foliar y riegos frecuentes ya que tienen raices poco funcionales

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3. MA TERIALES Y ME TO DOS

3.1 LOCALIZACION

Los ensayos se realizaron en el Laboratorio de Biotecnologia y en los invemaderos del Departamento de Agronomia, Zamorano.

3.2 CAMARA DE CRECIMIENTO

La camara de crecimiento tiene las siguientes caracteristicas: temperatura de 25 grados centigrados ± 1, un fotoperiodo de 16 horas de luz y 54 micromol/m2/s-1, tiene estanteria de madera y Ia fuente de luz queda alrededor de 50 em de los recipientes de cultivo.

3.3 MATERIAL VEGETAL

Se utilizaron rizomas de cosecha reciente, de los cuales se extrajeron las yemas tanto apicales como laterales. Para Ia extracci6n de las yemas, los rizomas fueron inducidos a brotaci6n, dentro de sacos de plastico, por un tiempo aproximado de tres semanas, manteniendolos a temperaturas y humedades altas en el invemadero. La mayoria del material vegetal pro venia de las cercanias del lago de Y ojoa departamento de Cortes, Honduras, lo demas se consigui6 de los invemaderos del Departamento de Agronomia.

3.4 CRISTALERiA E INSTRUMENTOS

La cristaleria se lav6 con detergente, se enjuag6 con abundante agua de Ia cafieria y al menos tres veces con agua bidestilada. Se sec6 en un homo a temperatura constante de 120 grados centigrados durante cuatro horas. Las pipetas, frascos volumetricos y probetas se secaron al aire.

3.5 MEDIO DE CULTIVO

El medio de cultivo que se utiliz6 fueron las sales de MS (Murashigue y Skoog, 1962 ), complementado con compuestos organicos (Cuadro 1 ). El pH del medio de cultivo se ajust6 a 5.8 antes de Ia esterilizaci6n.

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Cuadro 1. Medio de cultivo utilizado en la etapa de establecimiento y multiplicaci6n formado por las sales minerales de Murashigue y Skoog y complementos organicos.

Sales minerales de (mg/1) MS

NRtN03 1650.00 KN03 1900.00 KH2P04 170.00 CaCI2• 2H20 440.00 MgS04• 7H20 370.00 KI 0.83 H3Bo3 6.20 MnS04• 4H20 22.30 ZnS04• 7H20 8.60

Na2Mo04• 2H20 0.25 CuS04• 5820 0.025 FeS04• 7H20 27.80 Na2EDTA 37.30 CoCh.6H20 0.025

Compuestos Or2anicos Inositol 100.00 Tiamina (V_it. B1) 0.001 Glicina 4.00 Piridoxina(Vit.B6 0.001 ) Ac. nicotinico 0.001 Sacarosa 30000.00 Phytagel 3500.00 pH 5.8

Las citoquininas que se utilizaron fueron bencil amino purina (BAP) o kinetina (Kin), y las auxinas fueron el acido indol acetico (AlA) o acido naftalenoacetico (ANA). Se combinaron por medio de un factorial de 4 x 4, en experimentos en que se estudiaron una citoquinina y una auxina a la vez. De estas combinaciones resultaron cuatro experimentos. Para cada combinaci6n de hormonas, el factorial 4 x 4 representaba cuatro concentraciones de auxinas y cuatro de citoquininas. Las concentraciones de auxinas fueron: 0, 0.5, 1 y 1.5 mg por litro de medio y las de citoquininas: 0, 2.5, 5 y 7.5 mg por litro de medio (Cuadro 2).

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Cuadro 2. Combinaciones de diferentes dosis de auxinas y citoquininas

Ci!_oquinina 0 2.5 5.0 7.5

0 0;0 0; 2.5 0;5 0; 7.5 Auxina 0.5 0.5; 0 0.5; 2.5 0.5; 5 0.5; 7.5

1.0 1 ; 0 1;2.5 1 ; 5 1 ; 7.5 1.5 1.5;0 1.5;2.5 1.5;5 1.5 ; 7.5

3.5.1 Preparacion del medio

Para Ia preparaci6n del medio de cultivo se usaron soluciones madres de los macro nutrimentos ( concentrada 10 veces ), micronutrimentos ( concentrada 1000 veces) y de FeNa-EDTA (concentrada 200 veces). La cantidad de soluci6n madre se colocaba en un "beaker" y luego de afiadir agua bidestilada se aforaba a un litro, los otros componentes se colocaron a Ia soluci6n que estaba sobre un agitador horizontal magnetico.

El medio preparado se transfiri6, con la ayuda de una jeringa automatica, a tubos de ensayo de 18 x 150 mm, los que se taparon con tapas de plastico. Los tubos se marcaron previamente con el nfunero del tratamiento correspondiente. Se utilizaron 6 mililitros de medio por cada tubo de ensayo.

De un litro de medio se obtuvieron 10 tubos de cada tratamiento, considerandose cada tubo como una repetici6n. Los tubos con medio de cultivo se esterilizaron en un autoclave a 121 grados centigrados (259 grados Farenheit) y a 1.06 kg I cm2 (15 Iibras por pulgada cuadrada) de presion durante 20 minutos.

3.6 DESINFECCI6N

Cuando se observaban claramente las yemas laterales y los brotes tenian cerca de dos centimetros de altura, los rizomas se lavaron con una soluci6n jabonosa. Para su desinfecci6n fueron sumergidos en una soluci6n acuosa de estreptomicina al 1.5%, sulfato de cobre al 1% y carbendazim al 1%, durante 24 horas. Luego, los brotes fueron cortados con suficiente tejido y sumergidos en la misma soluci6n desinfectante por 12 horas. Despues, se sumergieron en alcohol etilico al 70% durante 30 segundos (Zelaya, 1996), y en hipoclorito de calcio al 1% e hipoclorito de sodio al 1% por 20 minutos en cada uno. Luego, en la camara de flujo laminar se realizaron tres enjuagues con agua bidestilada esteril para eliminar el exceso de desinfectante.

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Se usaron pinzas, bisturfes y agujas hipodermicas, que se esterilizaron flameandolos en la llama de un mechero de alcohol antes de cada operaci6n. Durante el tiempo que no se usaban, permanecieron sumergidos en alcohol al 70%. Los instrumentos se enfriaron en agua bidestilada esteril antes de cada operaci6n para no daftar los tejidos

3.7 DISECCIONYCULTIVO

La disecci6n realiz6 en la camara de flujo laminar. A los brotes se les removieron las yemas bajo un estereoscopio, a las que se les quitaron algunas de las bracteas que las recubren. Los apices se disecaron utilizando pinzas, bisturfes y agujas hipodermicas. La disecci6n se hizo sobre discos de papel filtro esterilizado en el autoclave en platos Petri. Cuando el explante fue extraido se coloc6, usando una pinza en el tubo de ensayo que contenia el medio. La boca del tubo se flame6 en el mechero al abrirlo y antes de taparlo. Al final el tubo se sell6 con Parafilm.

3. 7.1 Etapa de establecimiento

Una vez que las yemas se sembraron en los tratamientos correspondientes se trasladaron a Ia camara de crecimiento para su incubaci6n.

3. 7.2 Etapa de multiplicacion

Los brotes de cada explante fueron separados en Ia camara de transferencia y transferidos al medio de MS con los mismos aditivos organicos y con una concentraci6n de 5 miligramos por litro de BAP, y se incubaron en la camara de crecimiento.

3.7.3 Etapa de aclimatacion

Cuando las planrulas estaban lo suficientemente grandes (3 em en adelante ), fueron transferidas a un invemadero, subcultivandose el callo restante, que contenia brotes aim pequeftos para ser pasados al invemaculo. Se transplantaron a un medio organico previamente esterilizado y se colocaron en camaras de crecimiento de plastico dentro del invemaculo se mantuvieron a temperatura y humedad relativa elevadas. Antes del transplante el medio de cultivo pegado al las raices fue lavado por completo. Se regaron dos veces por dia y fueron sometidas a una fertilizacion foliar por semana, con la formula 20- 20 - 20, a razon de lO g por litro de agua. Ademas, fueron tratadas semanalmente con una soluci6n acuosa de estreptomicina al 1.5%, sulfato de cobre al 1.5% y carbendazim al 1%

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3.8 VARIABLES ESTUDIADAS

Las variables que se estudiaron fueron las descritas a continuaci6n.

3.8.1 Establecimiento

• Sobrevivencia.- se observ6 si el explante sobrevivia en el cultivo in vitro. • Formaci6n de callos.- se observ6 si el explante form6, yen que tiempo lo form6 • Tamafio de los callos.- al final de la etapa se midi6 el diametro aproximado del callo. • N(unero de brotes por explante.- al final de la etapa se contaron los brotes que produjo

el explante • Altura del brote.- se midi6 al final de la etapa, desde la base del explante hasta la

punta del brote. • Promedio de brotaci6n por tratamiento

3.8.2 Multiplicacion

• Numero de brotes por explante. • Promedio de brotaci6n por tratamiento. • Formaci6n de raices.- se observ6 silos brotes tenian raices. • Longitud de lo brotes.

3.8.3 Aclimatacion

• Porcentaje de Sobrevivencia.- se sac6 la relaci6n de plantas muertas en invemadero contra el total de plantas transferidas a aclimataci6n.

• Crecimiento semanal.- se midi6 l a altura de las plantas semanalmente, desde la base hasta la hoja mas alta.

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4. RESULTADOS

Todos los experimentos presentaron contaminaci6n a pesar del tratamiento con bactericida y fungicida; Ia contaminaci6n fue alta y vari6 entre el 51% y el 68%. El 66% de Ia contaminaci6n fue por hongos, lo restante por bacterias. El segundo grupo de repeticiones del experimento con ANA Y BAP se contamin6 100% debido a bacterias, pese a que se sigui6 el mismo procedimiento de desinfecci6n. La contaminaci6n se debi6, posiblemente, al mayor tiempo de almacenado de los rizomas. Para el tercer grupo de repeticiones se consigui6 material fresco, producido en invemadero. Las plantas de las que provenian fueron tratadas semanalmente con fungicidas y bactericidas durante todo el ciclo de crecimiento. La contaminaci6n disminuy6 a un 40%. En Ia etapa de multiplicaci6n Ia contaminaci6n fue de 2 %, en su totalidad por hongos. En los subcultivos Ia contaminaci6n fue de 0.5%, tambien por de hongos.

4.1 EFECTO DE LA COMBINACION DE ANA 0 AlA, CON BAP 0 KIN, SOBRE YEMAS DE JENGffiRE

En los experimentos en los que se us6 Kin las yemas de jengibre no respondieron. Los explantes conservaron su color verde por pocos dias. A los quince dias, aproximadamente Ia mayoria de las yemas tenian Ia base blanca y el extremo superior ennegrecido.

Los tres explantes (Cuadro 3) que respondieron en el experimento de AlA y BAP formaron callos que eran casi blancos con pocas manchas verdes, sin producir brotaci6n . Los otros explantes permanecieron sin cambiar su color verde durante diez dias , aproximadamente. A los 15 dias la mayoria presentaba Ia base blanca y el extremo superior ennegrecido y otros estaban completamente blancos. Asi permanecieron hasta que fueron retirados de Ia camara de crecimiento a los cuarenta y cinco dias de sembrados.

CUADRO 3. Formaci6n de Brotes, callos o raices a partir de yemas apicales de jengibre utilizando varias dosis de AlA y BAP.

BAP (m2fl) 0 2.5 5.0 7.5

0 0/9 0/8 0/3 0/3 AlA (mgll) 0.5 119 2/3 0/0 0/3

1.0 0/5 0/3 011 0/8 1.5 0/5 0/0 0/0 0/6

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4.2 EFECTOS DE ANA Y BAP EN LA ETAPA DE ESTABLECIMIENTO

En los 41 brotes sobrevivientes en el primer experimento con ANA y BAP ( Cuadro 4) se comenz6 a observar respuesta a los ocho dias de la transferencia. Los explantes empezaron a expander las bnicteas que los recubrian, mostrando un ligero aumento en el tamafio(Figura 1 ). A los quince dias de sembrados se pudo notar la formaci on de callos de color verde claro o blancos, de apariencia granular y friables. A los treinta y cinco dias se empezaron a observar algunas raices, especialmente en los tratamientos con citoquinina. Ciertos brotes crecieron a partir de las yemas del explante (Figura 2) y a los sesenta y ocho dias habia algunos de cerca de 5 mm. Otros apenas se notaban.

Cuadro 4. Formaci6n de brotes, callos o raices a partir de yemas apicales de jengibre utilizando varias dosis de ANA y BAP, a los 68 dias de siembra.

BAP (mg/1) 0 2.5 5.0 7.5

0 1/1 1/1 8/8 1/1 ANA (mg/1) 0.5 4/6 4/7 6/8 2/3

1.0 4/5 3/4 5/6 2/4 1.5 3/3 9/9 8/8 1/2

En el Cuadro 5 se representan los nfuneros y porcentajes de explantes que sobrevivieron y produjeron callos, brotes o callos y raices, a los 68 dias despues de la siembra.

En el experimento anterior se not6 que hubo mejor respuesta a la combinaci6n de ANA y BAP por lo que se procedi6 a realizar mas repeticiones, haciendo 20 replicas mas de cada tratamiento, en dos grupos

Cuadro 5. Explantes sobrevivientes que produjeron callos, brotes o raices , en la etapa de establecimiento con ANA y BAP a los 68 dias de transplante.

BAP (mg/1)

ANA 0 2.5 5.0 7.5 (mg/1) No. % No. % No. % No. %

0 1/6 16 2/6 33 7/13 54 2/7 29 0.5 1111 9 2/9 22 0110 0 8/10 80 1.0 2/12 16 2/4 50 3/9 33 6/9 66 1.5 0/11 0 6/13 46 7/13 54 5/8 63

Solo una yema del tratamiento sin hormonas form6 un callo al comienzo, era grande, de color verde claro y friable y con una raiz gruesa con brotes pequefios que provenian de las yemas que rodeaban a la yema apical. Las otras cinco formaron callos blanquecinos, de 2 mm de diametro en promedio, sin que se diferenciaran brotes y raices.

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Con 0.5 mg de ANA por L de medio, yen ausencia de citoquininas, solo un explante de los once sobrevivientes produjo un callo, de color verde claro, de apariencia granular y friable, que se observ6 claramente a los 35 dias. A los 68 dias de cultivo habia producido cinco brotes, que partian de las yemas circundantes, dos de ellos de 5 mm de longitud, y los restantes de menos de 2 mm, ademas de raices gruesas y lisas. Los dos explantes del tratamiento con 1 mg de ANA y 0 de BAP por L de medio, produjeron callos de color blanco opaco de unos 3 mm de diametro en promedio. No se produjo desarrollo ni diferenciaci6n de 6rganos. En el tratamiento de 1.5 mg ANA y 0 de citoquinina por L ninguna yema respondi6. Conservaron su color verde por poco tiempo, luego se tomaron blancas y asi permanecieron hasta que se retiraron de la camara de crecimiento.

Con 2.5 mg BAP y 0 de ANA por L se produjeron callos en dos de los seis explantes sobrevivientes. Tenian aproximadamente 5 mm de diametro. Uno de los explantes produjo cuatro brotes que partian de las yemas laterales y tenian entre 3 y 5 mm de longitud, el otro produjo dos brotes de iguales caracteristicas. Los callos eran de color verde claro de apariencia granular y friable. Ambos explantes produjeron raices. Los cuatro callos restantes permanecieron completamente blancos, de mas o menos 3 mm de diametro, sin 6rganos apreciables .

En el tratamiento con 2.5 mg de BAP de y 0.5 mg de ANA por L de medio se formaron dos callos. Los explantes formaron cuatro brotes cada uno, y fueron el desarrollo de las yemas contenidas en el explante, algunos midieron casi 5 mm de altura; todos tenian raices. Los siete explantes restantes no crecieron, eran blanquecinos y de unos 3 mm de diametro. En el tratamiento con 2.5 mg de BAP y 1 mg de ANA por L, cuatro explantes sobrevivieron, dos se diferenciaron formando brotes y varias raices, (uno con tres brotes y otro con cuatro ). Los explantes tenian algo mas de 1 em de diametro, y los brotes median entre 2 y 5 mm de altura. En el tratamiento con 2.5 mg de BAP y 1.5 mg de ANA por L de medio, seis explantes formaron 6rganos de trece sobrevivientes. El numero de brotes vari6 entre uno y seis y sus alturas variaron entre 2 y 6 mm aproximadamente. Los seis explantes produjeron raices. Los explantes que no se diferenciaron produjeron callos que crecieron hasta tener un diametro de 4 mm aproximadamente y de color blanquecino.

De los trece explantes del tratamiento con 5 mg de BAP y 0 mg de ANA por L de medio, en ocho explantes se produjeron brotes y raices, cuatro de estos tenian un solo brote de casi 6 mm de altura. Un explante produjo dos brotes a partir de sus yemas, de la misma altura aproximadamente. Los dos explantes restantes produjeron de cuatro a seis brotes, con alturas que variaron entre 3 y 5 mm. Los explantes que no se diferenciaron fueron blanquecinos y de unos 4 mm de diametro.

En el tratamiento con 5 mg de BAP y 0.5 mg de ANA por L, los diez explantes formaron callos hasta llegar a un diametro de 4 mm, sin que el explante o el callo produjeran 6rganos.

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De los nueve explantes del tratamiento con 5 mg de BAP y I mg de ANA por L de medio, tres formaron brotes y raices. Dos explantes produjeron brotes de aproximadamente 5 mm de altura , el otro explante produjo dos brotes, uno de casi 3 mm de altura y el otro de menor longitud. Los seis explantes restantes formaron callos, pero no brotes.

En el tratamiento con 5 mg de BAP y I.5 mg de ANA por L de medio, en siete explantes de trece se produjeron brotes y raices. Un explante produjo ocho brotes de tamafio variable y este fue el de mayor brotaci6n en el experimento. La mayoria de explantes produjeron raices. Los otros produjeron entre dos y cinco brotes cada uno. Los explantes alcanzaron aproximadamente 1.5 em de diametro (Figura 3).

Con 7.5 mg de BAP por L de medio y sin ANA, dos explantes de siete formaron 6rganos. Uno form6 tres brotes visibles y el otro produjo uno. Los diametros de los explantes variaron entre 5 mm y I em y eran de color verde claro.

Con 7.5 mg de BAP y 0.5 mg de ANA por L de medio ocho de diez explantes brotaron y formaron raices. El numero de brotes vari6 entre uno y seis. Los explantes midieron I.5 em de diametro aproximadamente, y los brotes alcanzaron hasta 1 em de altura.

De los nueve explantes del tratamiento con 7.5 mg de BAP y 1 mg de ANA por L de medio, seis produjeron 6rganos. Los explantes eran de color eran verde claro, tenian entre 1.4 a 1.5 em de diametro. Todos los explantes formaron brotes y raices, los brotes median entre 0.5 y 1.2 em de altura, aproximadamente (Figura 4).

En el tratamiento con 7.5 mg de BAP y 1.5 mg de ANA por L de medio, cinco de ocho explantes formaron 6rganos, tanto raices como brotes. El diametro de los explante fue de alrededor de 1.5 em. Los explantes produjeron entre uno y cinco brotes con alturas que variaron entre 0.5 y 1.2 em.

hgura Yema apical de jcngibrc dcsprcndicndo br~Ktcas. Sc pucdc ob'-.CI\ ar Ia

formaci('m de callo

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lrgura ~ Y em a apical de JCngibrc con brotcs \ raiccs a los 35 dias de scmbrada

18

I· igura -~ Y em a apical de _jengihre que form6 brotcs y raices con S mg, I de BAP \ () ;;; mg/1 de ANA, a los 68 dias de siembra. Notese que los brotes partcn de ycmas latcraks preexistcntes

hgura 4 Yema apical de jengibre que form<'> brotes y raices con 7. 5 mg~ I de BAP v ! mg. I de ANA. a los 68 dias de sicmbra.

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4.3 ETAPA DE MULTIPLICACION

Para esta etapa se usaron 5 mg de BAP por L de medio. Los explantes sobrevivientes de la etapa de establecimiento se dividieron en tantas partes como lo permitian. Se intent6 dejar un brote en cada secci6n, o si el callo era grande pero sin brotes se dividia en varias porciones. Luego de 15 dias de transferidos al medio de multiplicaci6n, se observ6 que solo crecieron los brotes que procedian de medios de establecimiento que contenian dosis de 2.5 mg de BAP y 1 mg de ANA por L de medio o mayores

Despues de 45 dias de transferidos, una secci6n proveniente del tratamiento con 2.5 mg de BAP y 1 mg de ANA por litro habia crecido y se habia multiplicado, tenia dos brotes de 7 em de longitud con raic es y otra secci6n tenia varios brotes pequefios.

De las porciones que venian de explantes del tratamiento de 2.5 mg de BAP y 1.5 mg de ANA por litro, en dos no se observ6 un crecimiento de los de los brotes en esta etapa. De los cuatro restantes, unicamente tres habian producido pllintulas completas a los 45. Las phintulas tenian cerca de 9 em de altura. En promedio habia cuatro brotes por tubo, todos con raices. La porci6n restante respondi6 mas tarde y a los 90 dias tenia once brotes con raices.

Las porciones que provenian del tratamiento con 5 mg de BAP y 0 de ANA por litro, una no mostr6 crecimiento de brotes, solo aument6 su tamafio. Lleg6 a medir I em de diametro, era blanca, con manchas verdes y de apariencia granular. Dos secciones formaron tres brotes cada una, con raices que median casi 7 em. Las cuatro restantes respondieron mas tarde y a los 90 dias tenian entre uno y cuatro brotes con raices. Las secciones que provenian del tratamiento de 5mg de BAP y 0.5 mg de ANA por litro, no proliferaron en Ia etapa de multiplicaci6n. Las porciones del tratamiento con 5 mg de BAP y I mg de ANA por litro respondieron lentamente. Y a los 90 dias habian formado plantas completas. Una secci6n del explante produjo dos brotes y el otro diez, todos con raices, que midieron cerca de 9 em de altura. Las secciones de explante del tratamiento con 5 mg de BAP y I.5 mg de ANA por litro de medio. Formaron plantas completas y a los 45 dias tenian un promedio de cuatro brotes y midieron aproximadamente 8 em (Figura 5).

Ninguna de las dos porciones del tratamiento con 7.5 mg de BAP y 0.5 mg de ANA por litro, crecieron ni se diferenciaron.

La secci6n proveniente del tratamiento que contenia 7.5 mg de BAP y I mg de ANA por litro de medio, form6 cinco brotes con raices. Los brotes midieron alrededor de 9 em, a los 45 dias de estar en el medio de multiplicaci6n.

Despues se realiz6 una segunda etapa de multiplicaci6n con los brotes y plantas que no llegaron a] tamafio (3 em) adecuado para aclimataci6n, en este subcultivo se observ6 que las porciones transferidas tenian Ia misma tasa de brotaci6n que en Ia primera etapa de multiplicaci6n

2\

l·1gura .;; Plantulas de _1engibre en multiplicaci6n prO\enientes de una secL'Ion Je un e-.,:plantc que crecit) en un medio con :" mg. I de 13AP y I .;; mg I de AN·\

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4.4 ETAPA DE ACLIMATACION

Se transfirieron al invernadero de aclimataci6n un total de 55 plantas, que tenian entre 3 y 9 em de largo. En las mas pequefias se observ6 que las hojas iniciales morian poco tiempo despues pero brotaban nuevas hojas. La primera semana, las plantas no crecieron, pero desde Ia segunda semana en adelante se observ6 un rapido crecimiento casi de un centimetro por semana. A las tres semanas de mantenerlas con alta humedad y temperatura, las plantas estaban en constante crecimiento y podian soportar condiciones ambientales normales (Figura 6). De las cincuenta y cinco plantas pasadas a invernadero murieron cinco ( 10 % de mortalidad).

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~' --'

IIgura h Planta de Jengibre en crccimicnto_ luego de trcs semanas de trans!Crida al suclo en el Ill\ crnaculo Nt')tcse que las primcras hojas formadas '" ,-,rro muneron

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5. DISCUSION

5.1 ESTABLECIMIENTO

Se observ6 claramente que hubo superioridad en Ia respuesta de los explantes con Ia combinaci6n de ANA y BAP. Se sabe que cada especie requiere un balance hormonal diferente, en cuanto a cantidades y tipos de hormonas. La mayor respuesta del jengibre al ANA en este experimento y no al AIA probablemente se deba a que esta ultima es una auxina natural que no se acumula en grandes cantidades en las celulas, debido a que existen procesos naturales de inactivaci6n y destrucci6n, que son menos eficientes con las auxinas sinteticas (por ejemplo ANA), lo que les permite acumularse y tener un periodo activo relativamente largo al aplicarlas ex6genamente. Las auxinas sinteticas son mas estables debido a que existen pocos sistemas enzimaticos que las ataquen facilmente, llegando al punto de que en grandes cantidades son t6xicas (Bidwell, 1979). En cuanto a las citoquininas se sabe que las sinteticas del tipo purinico y sustituidas con un anillo de bencil (BAP, por ejemplo) son aun mas activas que Ia misma zeatina (Ia citoquinina natural de mayor potencia). Son aun mas activas si Ia cadena lateral tiene alrededor de cinco carbonos, y Ia actividad se incrementa porIa presencia de un anillo bencenico o por insaturaciones en Ia cadena lateral, que es el caso del BAP. La Kin no posee el anillo bencenico, por lo que su poder citocinico es menor que el BAP (Hurtado y Merino, 1988). Lo anterior probablemente explica Ia respuesta superior de los explantes en los tratamientos que contenian ANA y BAP, en comparaci6n con los tratamientos con AlA­Kin y ANA - Kin, y una respuesta insignificante de los tratamientos con AlA - BAP pues unicamente dos tratamientos respondieron.

5.2 EXPERIMENTO DE DIFERENTES DOSIS DE ANA CON BAP

Por los resultados obtenidos, parece que el jengibre en Ia etapa de establecimiento, necesita de ANA y BAP, en especial de BAP en dosis altas, pues se observ6 una mejor respuesta en los tratamientos con 5 mg o 7.5 mg de BAP por litro de medio. Los promedios de brotaci6n fueron mayores con estas dos concentraciones, en especial en los tratamientos con 7.5 mg de BAP por litro. Hosoki y Sagawa ( 1977) encontraron que Ia inducci6n de brotes por las citoquininas en jengibre es similar a lo reportado en otras monocotiled6neas, ya que se produce una ruptura de Ia dominancia apical permitiendo Ia brotaci6n de las yemas que rodean a Ia apical. Parece que las yemas apicales de jengibre, al ser expuestas, a ANA y BAP y en las concentraciones experimentadas, rompen su dominancia apical, dando Iugar a Ia brotaci6n de las yemas laterales que las rodean,

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produciendose el inicio de Ia propagaci6n masiva. Cada uno de estos brotes, al ser transferido a un medio similar sufrini el mismo proceso de brotaci6n, lo que permite mantener constantemente material de propagaci6n en el laboratorio, y material para transferir a Ia etapa de aclimataci6n en invemadero. A pesar de que las yemas formaron callos, este no estuvo relacionado con Ia organogenesis del jengibre. En jengibre encontramos Ia proliferaci6n de brotes por medio del rompimiento de Ia dominancia apical en los explantes (yemas).

5.3 MULTIPLICACION

Aparentemente el tratamiento anterior, aplicado en establecimiento, no influye en Ia cantidad de plantas obtenidas en multiplicaci6n, pues se observ6 que tanto los explantes que provinieron de tratamientos con bajas concentraciones de citoquinina y auxina, como los de tratamientos con altas concentraciones respondieron bien a Ia alta concentraci6n de citoquinina ( 5 mg de BAP por litro) usada en esta etapa. AI ser pasados los brotes a! medio de multiplicaci6n que contiene una dosis alta de BAP, se da nuevamente Ia ruptura de Ia dominancia apical, aumentando el numero de brotes y permitiendo que los antiguos se desarrollen, permitiendo Ia transferencia constante de plantas al invemadero y continuar con la multiplicaci6n.

5.4 ACLIMA T A CION

Al inicio las plantas no crecieron, probablemente por que estaban reestableciendo su sistema radical, ya que las raices formadas in vitro son poco funcionales, pasado cierto periodo las hojas iniciales murieron pero los primordios formados antes, dieron Iugar a nuevas hojas inmediatamente, estas hojas ya eran fotosinteticamente activas, por esto Ia planta empez6 a crecer normalmente, luego de un periodo de adaptaci6n.

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6. CONCLUSIONES

• La mejor combinaci6n de hormonas para micropropagar jengibre es Ia de BAP con ANA

• El jengibre necesita dosis de 5 mg/1 7.5 mg/1 (o mas altas) de BAP para su establecimiento in vitro.

• El jengibre responde a una dosis de 5 mg/1 en Ia etapa de multiplicaci6n.

• No es necesaria Ia etapa de enraizamiento en jengibre pues enraiza en multiplicaci6n.

• El jengibre se adapta satisfactoriamente a una aclimataci6n con alta temperatura y alta humedad relativa en el invernaculo.

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7. RECOMENDACIONES

• Utilizar explantes procedentes de plantas previamente tratadas con fungicidas y bactericidas.

• Utilizar explantes que provengan de rizomas con poco tiempo de almacenados.

• Realizar pruebas de rendimiento en el campo, comparando plantaciones de plantas procedentes de cultivo in vitro, contra plantaciones hechas con semilla comercial.

• Hacer un estudio economico comparativo entre plantaciones sembradas con rizomas de semilla comercial contra plantaciones hechas con plantas propagadas in vitro.

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