Proiecte de Cercetare Exploratorie tip PCE PN-II-ID-PCE ...icfundeni.ro/wp-content/uploads/2016/10/raport-stiintific-proiect... · Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor

1

Proiecte de Cercetare Exploratorie tip PCE

PN-II-ID-PCE-2012-4-0018

Contractor: Institutul Clinic Fundeni

Contract nr.: 22/2013

RAPORT STIINȚIFIC

Titlu:

ROLUL MICRORNA IN MODULAREA IMUNA DUPA

SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA

Director de proiect: Conf. Dr. Catalin Vasilescu

Perioada raportata: 02.09.2013 - 30.09.2016

2

INSTITUTUL CLINIC FUNDENI

TEMA ”ROLUL MICRORNA IN MODULAREA IMUNA DUPA

SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA”

Responsabil stiintific al proiectului : Conf.Dr.Catalin Vasilescu

OBIECTIVE GENERALE

După splenectomie apar perturbari majore ale sistemului imunitar. In ultimii ani se

contureaza tot mai pregnant rolul ARN-urilor noncodante in imunitatea innascuta. Plecand de la

experienta pe care colectivul nostru o are in realizarea splenectomiilor totale si partiale si in

studierea rolului mRNA in acest proiect este urmarita identificarea microRNA-urile exprimate

diferit in plasma/serul pacientilor care au fost splenectomizati total sau partial.

Intelegerea rolului microRNA-urilor in cadrul raspunsului imun are o importanta clinica

reala in preventia si tratamentul timpuriu al posibilelor complicatii infectioase ce pot sa apara

dupa indepartarea chirurgicala a splinei. Aceste noi informatii permit stabilirea semnificatiei

prognostice si diagnostice ale acestor microRNA-uri din plasma/serul pacientilor

splenectomizati. Deoarece in splenectomia subtotala sunt conservate o parte a functiilor splenice,

ipoteza care sta la baza acestui proiect este aceea ca in plasma/serul pacientilor splenectomizati

partial/subtotal, nivelurile de microRNA sunt diferite semnificativ de nivelurile de microRNA-

uri la pacientii splenectomizati total. In continuare, vom corela nivelurile microRNA-urilor cu

modificarile specifice din cadrul raspunsului imun la pacientii splenectomizati total si subtotal.

3

Studiul de fata detine o componenta prospectiva, deoarece va include investigarea

aspectelor particulare raspunsului imun (descrise mai jos) in cadrul a trei categorii diferite de

pacienti selectati (grupul pacientilor care urmeaza sa efectueaza splenectomie subtotala/partiala,

grupul pacientilor care urmeaza sa efectueze splenectomie totala, grupul de control). De

asemenea, studiul va avea o componenta retrospectiva deoarece aceeasi parametrii (descrisi mai

jos) vor fi cercetati si la pacientii deja splenectomizati si care acum se afla sub urmarire clinica.

Planul proiectului este alcatuit din 2 parti:

1. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina ca expresie a

raspunsului imun innascut prin aprecierea capacitatii monocitelor/macrofagelor de

secretie a citokinelor inflamatorii (TNF alfa , IL-1, IL-6, IL-10) dupa stimularea cu LPS,

folosind ca metoda principala de detectie tehnica ELISA.

2. Identificarea nivelurilor de microRNA-uri exprimate diferit in

plasma/serul pacientilor dupa splenectomia totala respectiv partiala si corelarea acestora

atat cu nivelurile de citokine pro-inflamatorii dupa stimularea cu LPS.Mai departe, vom

utiliza microRNA-urile identificate drept markeri pentru aprecierea diferentelor intre

raspunsul imun innascut post-splenectomie totala si respectiv, post-splenectomie partial.

In acest sens, vom sublinia avantajele imune ale splenectomiei partiale/subtotale.

Rolul posibil al microRNA-urilor in reglarea raspunsului imun la pacientii la care s-a

efectuat splenectomie totala sau partiala este un domeniu inca insuficient explorat. Daca vor fi

identificati, acesti bio-markeri au o importanta clinica deosebita deoarece pot orienta clinicianul

in profilaxia si tratamentul timpuriu al complicatiilor infectioase grave post-splenectomie, cum ar

fi OPSI.

OBIECTIVELE PROIECTULUI

ETAPA 1

1.Evaluarea stadiului actual de cunoastere in domeniul proiectului

1.1. Studiul bibliografic, stabilirea protocoalelor de lucru si a criteriilor de

includere, participarea la stagii de formare si perfectionare

4

1.2 Determinarea surselor optime din punct de vedere al raportului calitate-pret al

echipamentelor si reactantilor

2. Generarea materialului biologic

2.1. Colectarea de materiale biologice

2.2. Inregistrarea datelor clinice

FINANTARE: 140300 RON

ETAPA 2



1.2 Inregistrarea datelor clinice

2. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina

2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate

3. Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor

3.1. Analiza bioinformatica de etapa

3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare. Prezentarea rezultatelor la

conferinte internationale in domenii specifice proiectului


ETAPA 3




2. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina

2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate

2.2. Evaluarea raspunsului imun nespecific si fenomenului de toleranta la

endotoxina

3. Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor

3.1. Analiza bioinformatica de etapa

3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare. Prezentarea rezultatelor la

conferinte internationale in domenii specifice proiectului


5

ETAPA 4




2. Identificarea microRNA-urilor in plasma/serul pacientilor inclusi in studiu

2.1. Identificarea in plasma pacientilor splenectomizati a miRNA-urilor specific

exprimate

2.2. Aprecierea semnificatiei prognostice si diagnostice ale microRNA-urilor

identificate

3. Analiza finala a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor

3.1. Analiza bioinformatica finala

3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare, organizarea de intruniri

(conferinte, mese rotunde) pentru diseminarea rezultatelor obtinute in cadrul proiectului.

Prezentarea rezultatelor la conferinte internationale in domenii specifice proiectului


EVALUAREA STADIULUI ACTUAL DE CUNOASTERE IN DOMENIUL

PROIECTULUI

Imunitatea innascuta

Sistemul imunitar cuprinde mecanismele de apărare ale organismelor vii față de agenții

patogeni. Este format din două mari componente: imunitatea înnăscută şi imunitatea adaptativă.

Imunitatea înnăscută sau nespecifică grupează mecanismele imune care formează prima

linie de apărare împotriva infecţiilor. Acest tip de răspuns nu este specific unui antigen, cu toate

că include mecanisme celulare şi moleculare care recunosc anumite clase moleculare antigenice,

dar care sunt prezente înainte de contactul organismului cu agentul agresor, iar acţiunea lor oferă

răgazul intrării în funcţiune a răspunsului imun adaptativ (Murphy, 2008).

Imunitatea înnăscută sau nespecifică este antigen independentă şi nu prezintă memorie

imunologică. Aceasta înseamnă că celulele sistemului imunitar înnăscut sunt capabile să

recunoască și să reacționeze la agenții patogeni în mod general, fără a conferi o imunitate

6

protectoare sau de lungă durată gazdei. Este sistemul imunitar dominant la plante, fungi, insecte

și organisme pluricelulare (Abbas, 2012).

Imunitatea înnăscută este moştenită genetic şi nu mai poate fi influenţată până la sfârşitul

vieţii. Ea utilizează receptori codificați genetic pentru recunoasterea microorganismelor

patogene, iar acest fapt o diferențiază de cealalată componenta a imunitații, cea dobandita care

este prezentă numai la vertebrate.

Imunitatea înnăscută sau nespecifică este asigurată de: structurile anatomice cu rol

protector (tegumente, mucoase – intestinală, respiratorie), enzimele din secreţiile exocrine –

lizozimul, bactericina, mucusul care acoperă mucoasele, pH-ul acid al sucului gastric, care

împiedică colonizarea bacteriană, temperatura corpului prin declanşarea reacţiei febrile, ce

creaza un mediu nefavorabil dezvoltarii microorganismelor, hemostază, bariera celulara – prin

celulele cu rol fagocitar: PMN, macrofage, răspunsul inflamator.

Principalele celulele efectoare ale sistemului innascut sunt polimorfonuclearele (in

special cele neutrofile), macrofagele (MF) si celulele natural killer (NK). Macrofagele şi

polimorfonuclearele sunt celule fagocitare pentru microorganisme. Celulele NK au activitate

impotriva celulelor proprii infectate viral si celulelor tumorale.

Citokinele sunt molecule de natură proteică ce au rolul important de a transmite

informații între celulele sistemului imun, care le şi produc. Deci au rol de mesageri intercelulari.

Nu au rol efector prin ele însele şi majoritatea sunt secretate, dar pot fi şi unele exprimate pe

suprafata membranelor sau stocate in rezervoare in matricea extracelulara. Acestea se leaga de

receptori specifici de pe suprafata celulelor tinta si majoritatea sunt factori de crestere sau de

diferentiere care actioneaza asupra acestor celule din cadrul sistemului hematopoietic.

După mecanismul de acţiune, citokinele se împart în două categorii:

proinflamatoare (TNFα, IL - 1,6 şi 8, G-CSF) şi antiinflamatoare (IL-10, receptorii de TNF şi

receptorul de IL-1).

microRNA- noi actori implicati in imunitate

MicroRNA sunt fragmente de ARN non-codant, recent descoperite, cu o lungime de 20-

22 de nucleotide. Rolul lor constă în reglarea post-transcripţională a expresiei genelor prin

degradarea sau represia translaţiei unor tipuri specifice deARNmesager ("target"). Importanţa

microRNA-urilor în reglarea funcţiilor celulare normale a devenit mai clară odată cu

descoperirea şi studierea mai multor tipuri de microRNA,respectiv a targetului lor, ARN

7

mesager. Rolul exact al reţelei de microRNA precum şi rolul individual al fiecărui microRNA în

cadrul proceselor celulare se află în continuare în studiu (Du, 2007; Lu, 2009).

Dovezi recente indică faptul că reglarea expresiei genice prin intermediul microRNA

joacă un rol foarte important în procese celulare precum apoptoza, diferenţierea şi ciclul celular.

MicroRNA sunt implicate în reglarea funcţiilor imunologice, a răspunsului imun înnăscut şi a

celui dobândit, în dezvoltarea şi diferenţierea celulelor imune şi în prevenirea autoimunităţii

(Lewis, 2005; Selbach, 2008). In sistemul imun, microRNA intervin în diferenţierea celulelor

limfocitare B şi în inducţia, funcţia şi menţinerea reglării liniei celulare limfocitare T. La nivelul

celulelor dendritice şi macrofagelor intervin prin intermediul receptorilor Toll-like şi au rolul de

a supresa funcţia lor efectoare înainte de activarea lor sau de a urmări funcţia lor după stimulare

(Lu, 2009).

Expresii modificate ale microRNA s-au întâlnit în unele tipuri de proliferare malignă,

unde pot avea atât rol de onco- gene (miR-21, miR-106 şi miR-155), cât şi de supresoare

tumorale (let-7, miR15a/16, miR-34a şi miR-143/145). Unele microRNA sunt deja utilizate ca

biomarkeri în cancere, iar altele sunt candidate pentru terapia genică a cancerului (Croce, 2009).

Recent a fost studiată implicarea microRNA în elaborarea răspunsului imun înnăscut. În

uma stimulării cu LPS a celulelor participante la elaborarea răspunsului imun înnăscut, a

monocitelor şi macrofagelor, s-a înregistrat o creştere a expresiei unor tipuri de microRNA cum

ar fi: miR-146a, miR-155, miR-125a, miR-9, miR-132 (O'Connell, 2007; Taganov, 2006; Tili,

2007).

Rolul splinei în imunitatea înnăscută

Rolul important al splinei în protecţia împotriva agenţilor patogeni din sânge a fost

evidenţiat în studii pe pacienţi splenectomizaţi la care s-a demonstrat un deficit în formarea

răspunsurilor imune împotriva câtorva produse bacteriene, şi necesită, aşadar, profilaxia

antibiotică pe termen lung a infecţiilor (de Porto, 2010; Vasilescu, 2003; Vasilescu, 2006).

Splina este un organ limfatic cu rol fundamental in apararea antiinfectioasa. Pulpa alba

care reprezinta compartimentul imunologic activ al splinei este impartita in doua zone

limfocitare distincte ce contin limfocite T, respectiv B. Splina imbina intr-un mod unic aparare

imuna innascuta si dobandita, fiind capabila de un raspuns imediat, nespecific la stimulul

bacterian (apararea innascuta) cat si un raspuns ulterior, specific ceea ce presupune interactiunea

celulelor efectoare imune specifice unui anumit antigen cu ajutorul moleculelor complexului

8

major de histocompatibilitate (MHC- Major Histocompatibility Complex) exprimate de celulele

prezentatoare de antigen (APC- antigen-presenting cell) (Mebius, 2005). Aceasta presupune

faptul ca splina joaca un rol fundamental in clearance-ul bacterian fie prin raspuns antigenic, fie

prin capacitatea bactericida a macrofagelor. De asemenea exista dovezi ca splina contribuie si la

decontaminarea endotoxinica bacteriana (Altamura, 2001).

Tecile limfatice periarteriale (PALS -periarterial lymphatic sheaths) contin limfocite T si

reprezinta zona timodependenta, in timp ce foliculii limfatici (primari si secundari) contin

limfocite B si reprezinta zona timoindependenta a pulpei albe. Acestia circumscriu tecile

limfatice (Mebius, 2005). O alta zona importanta din structura splinei este zona marginala care

circumscrie foliculii primari sau zona de manta a foliculilor sendari. Zona marginala pare sa fie

locul initial in care patrund limfocitele B si T si iau contact cu antigenele circulante. In zona

marginala se gasesc limfocitele B cu memorie consecutiv raspunsului imun primar.

In ceea ce priveste macrofagele splenice, ca si efectori ai imunitatii inascute, cele din

pulpa rosie sunt mai putin diferentiate, exprima niveluri ridicate de molecule MHC II si

fagociteaza polizaharidele capsulare ale S. pneumoniae (Timens, 1991). Macrofagele zonei

marginale sunt mai diferentiate, au o exprimare limitata a moleculelor MHC II si se afla in

contact strans cu limfocitele B (Timens, 1991).

Capacitatea de fagocitoza a macrofagelor splenice este fundamentala pentru indepartarea

bacteriilor din torentul sanguin, intrucat macrofagele zonei marginale actioneaza ca APC pentru

polizaharidele bacteriene, inducand secretia de catre limfocitele B a anticorpilor specifici IgM

anti-polizaharid. Acest clearance bacterian este mai putin eficient la pacientii splenectomizati

(Jirillo, 2003).

Postsplenectomie, mecanismele de clearance bacterian sunt alterate crescand riscul la

acesti pacienti de sepsis cu bacterii gram pozitive dar si gram negative, si care este cunoscut sub

numele de OPSI (overwhelming post-splenectomy infection). Sepsisul postsplenectomie are, de

obicei un curs fulminant cu o mortalitate cuprinsa inte 50-70% (Okabayashi, 2008). OPSI este

cauzat in special de bacterii incapsulate gram pozitive precum Streptococcus pneumoniae (care

este agentul etiologic in aproximativ 80% din cazuri), Neisseria meningitidis si Haemophilus

influenzae. In ceea ce priveste mecanismele patogenice ale sepsisului cu bacterii gram pozitive

par sa existe similitudini cu sepsisul gram negativ, cel putin in ceea ce priveste eliberarea de

mediatori nocivi si citokine .

9

Iata deci ca splina joaca un rol important in protectia gazdei impotriva patogenilor

bacterieni, iar indepartarea ei ar trebui sa reprezinte o decizie medicala atent cantarita si nu o

manevra chirurgicala nediscriminativa (Tiron, 2008; Vasilescu, 2006). De exemplu la pacienti cu

risc crescut de sepsis cum ar fi cei infectati cu virus hepatitic C, boli inflamatorii intestinale sau

neoplazici splenectomia nu este recomandabila, pentru a evita eventuale complicatii fatale

(Altamura, 2001).

REZUMATUL PROIECTULUI

In prima etapa proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de

Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institulului Clinic Fundeni la care s-a efectuat

splenectomie totala sau partiala prin abord clasic sau minimal invaziv.

La pacientii aflati in studiu s-au prelevat probe conform protocolului si a fost

evaluata toleranta la endotoxina prin determinarea eliberarii monocitare de citokine: TNF alfa,

IL-1, IL-6, IL-10 utilizind tehnica ELISA. De asemenea probele prelucrate in vederea

determinarii de microRNA au fost depozitate pentru analiza ulterioara

Baza materiala a fost completeta prin achizitionarea de reactivi de laborator folositi

pentru determinarea de citokine umane (IL-10, IL-6, IL-1 , TNF alpha) si de reactivi si materiale

necesarea protoacoalelor de laborator.

In perioada 17-30 noiembrie 2013, directorul de proiect a efectuat o vizita in

vederea schimbului de experienta, in cadrul laboratorului Experimetal Therapeutics din cadrul

MD Anderson Cancer Centre, Houston, USA; laborator condus de catre Prof. Dr. George Calin,

un specialist cu recunoastere internationala, in domeniul microRNA. In cadrul acestei vizite

Conf. Dr. Catalin Vasilescu a sustinut o prezentare orala cu titlul “MicroRNAs and the

Dysfunction of the Innate Immune System in Sepsis” in cadrul manifestarii “MD Anderson

Cancer Center Seminars”.

A fost publicat articolul „Fractal-like kinetics of intracellular enzymatic reactions: a

chemical framework of endotoxin tolerance and a possible non-specific contribution of

macromolecular crowding to cross-tolerance.”, autori: Vasilescu C, Olteanu M, Flondor P, Calin

GA in Theor Biol Med Model. 2013 Sep 14;10:55. doi: 10.1186/1742-4682-10-55. Revista este

clasificata ISI, are un factor de impact de 1,46 si un factor relativ de influenta de 0,753.

10

In a doua etapa a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de










In perioada 10-13 septembrie 2014 o echipa formata din directorul de proiect

Conf. Dr. Catalin Vasilescu si un membru al echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor a participat la

congresul international MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK 2014 ANNUAL

MEETING & ENDO EXPO, care a avut loc in Statele Unite ale Americii. La aceasta conferinta

a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Minimally invasive splenectomy - twenty years,

single team experience”.

In perioada 8-11 octombrie 2014 o echipa formata din directorul de proiect Conf.

Dr. Catalin Vasilescu si 3 membrii ai echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor, Dr. Vlad Nacev si

Dr. Monica Lacatus, a participat la congresul international International Congress of Endoscopic

and Laparoscopic Surgeons of Asia (ELSA) 2014 MINIMALLY INVASIVE SURGERY :

NOW AND FUTURE. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul:

„Robotic Versus Laparoscopic Splenectomy. Overcoming technical challenges with robotic

surgery in minimally invasive splenectomy”.

A fost publicat articolul „MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic implications of RNA

networks” autori: Giza DE, Vasilescu C, Calin GA. in EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL

THERAPY ; 2014 Sep;14(9):1285-93. doi: 10.1517/14712598.2014.920812. Revista este


A fost publicat articolul „Robotic Splenectomy: What is the Real Benefit?” autori: Giza

Dana Elena, Tudor Stefan, Purnichescu-Purtan Raluca Roxana, Vasilescu Catalin, in World

Journal of Surgery 2014 Dec;38(12):3067-73. doi: 10.1007/s00268-014-2697-6. Revista este


11

In a treia etapa a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de










In perioada 4 – 6 iulie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr. Catalin

Vasilescu si un trei membii ai echipei de cercetare, Dr. Monica Lacatus, Dr. Stefan Tudor si Dr

Bogdan Trandafir a participat la congresul international „23rd INTERNATIONAL CONGRESS

OF THE EUROPEAN ASSOCIATION FOR ENDOSCOPIC SURGERY (EAES)” care a avut

loc in Bucuresti, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul:

„Partial laparoscopic splenectomy”.

In perioada 2-5 septembrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.

Catalin Vasilescu si un doi membii ai echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor si Dr Bogdan

Trandafir a participat la congresul international „MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK

2014 ANNUAL MEETING & ENDO EXPO”, care a avut loc in New York, Statele Unite ale

Americii. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Minimally

Invasive Partial Splenectomy – from laparoscopic to robotic surgery”.

In perioada 14-17 octombrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.

Catalin Vasilescu si trei membrii ai echipei de cercetare, Dr. Stefan Tudor, Dr. Monica Lacatus,

si Dr Bogdan Trandafir a participat la „CONFERINȚA NAȚIONALĂ DE CHIRURGIE 2015”

care a avut loc in Bucuresti, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala

cu titlul: „Why Do We Love da Vinci? Robotic Surgery: Myths and Realities”.

In perioada 15-18 octombrie 2015 directorul de proiect Conf. Dr. Catalin Vasilescu a

participat la „A XXIII-A CONFERINTA NATIONALA DE HEMATOLOGIE CLINICA SI

MEDICINA TRANSFUZIONALA” care a avut loc in Sinaia, Romania. La aceasta conferinta a

fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Chirurgia in bolile hematologice”.

12

In perioada 29 – 31 octombrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.

Catalin Vasilescu si un trei membii ai echipei de cercetare, Dr. Monica Lacatus, Dr. Stefan

Tudor si Dr Bogdan Trandafir a participat la congresul international „THE 4TH

INTERNATIONAL CONGRESS IN ROBOTIC SURGERY” care a avut loc in Bucuresti,

Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Robotic Partial

and Total Splenectomy - Experience of a Single Team in a Series of 95 Cases”.

In data de 21 noiembrie 2015 directorul de proiect Conf. Dr. Catalin Vasilescu a

participat la conferinta „ACTUALITĂŢI ÎN MANAGEMENTUL AFECŢIUNILOR

HEMATOLOGICE RARE” care a avut loc la Cheile Gradistei, Romania. La aceasta conferinta a

fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Splenectomia la pacientul cu PTI”.

A fost publicat articolul „Cellular and Kaposi's sarcoma-associated herpes virus

microRNAs in sepsis and surgical trauma” autori: Stefan Tudor, Dana Elena Giza, Catalin

Vasilecu et. al. in revista Cell Death & Disease, (2014)5, e1559; doi:10.1038/cddis.2014.515.

Revista este clasificata ISI, are un factor de impact de 5,014 si un factor relativ de influenta

de 1,639.

In ultima etapa, a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de






determinarii de microRNA au fost analizate in cadrul departamentului Experimental

Therapeutics, MDAnderson Cancer Center, Houston, USA sub supravegherea directorului de

proiect Conf Dr Catalin Vasilescu care a avut un stagiu de lucru in perioada 1-16 august in

laboratorul condus de Prof George Calin.




In perioada 11-14 mai 2016 o echipa formata din 2 membii ai echipei de cercetare, Dr.

Simona Manciu si Dr. Stefan Tudor a participat la congresul international 13º Congresso

13

Brasileiro de Videocirurgia SOBRACIL, Sao Paulo, Brazilia unde a fost prezentata lucrarea cu

titlul: Minimally invasive splenectomy - experience in a series of 530 cases.

In perioada 15-18 iunie 2016 o echipa formata din trei membrii ai proiectului, Dr. Daniel

Gavrila, Dr. Bogdan Trandafir si Dr. Laura Costin a participat la congresul international 24th

International congress of the EAES, Amsterdam, Olanda unde a fost prezentata lucrarea:

minimally invasive treatment of splenic cysts: the role of robotic surgery in partial splenectomy.

In perioada 31 August-3 Septembrie 2016 Dr Bogdan Trandafir a participat la congresul

international Minimally Invasive Surgery Week 2016 SLS Annual Meeting, SRS Annual

Meeting, Boston, USA unde a sustinut lucrarea The Role of Robotic Surgery in Partial

Splenectomy.

In perioada 1-16 august 2016, directorul de proiect a efectuat o stagiu de lucru, in cadrul

laboratorului Experimetal Therapeutics din cadrul MD Anderson Cancer Centre, Houston, USA;

laborator condus de catre Prof. Dr. George Calin, un specialist cu recunoastere internationala, in

domeniul microRNA.

A fost publicat articolul From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs

motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular

localization. Vasilescu C, Tanase M, Dragomir M, Calin GA. Math Biosci. 2016 Oct;280:50-61.

doi: 10.1016/j.mbs.2016.07.012. Epub 2016 Aug 4 IMPACT FACTOR 1,64, SCOR

RELATIV DE INFLUENTA 1,337.

A fost acceptat pentru publicare articolul Cellular and viral microRNAs in sepsis:

mechanisms of action and clinical applications Dana Elena Giza, Enrique Fuentes-Mattei, Marc

D Bullock, Stefan Tudor, Mathew Goblirsch, Muller Fabbri, Florea Lupu, Sai-Ching Jim Yeung,

Catalin Vasilescu and George A Calin. Cell Death and Differentiation (2016), 1–12 Macmillan

Publishers Limited, part of Springer Nature. All rights reserved 1350-9047/16; Received

21.11.15; revised 30.7.16; accepted 02.8.16. IMPACT FACTOR 8,385, SCOR RELATIV DE

INFLUENTA 3,674.

A fost acceptat pentru publicare articolul Patients after splenectomy: old risks and new

perspectives. Mihnea Dragomir, George Emil Dragoș Petrescu, Grațiela Elena Manga, George A.

Călin. Revista Chirurgia, Bucuresti

A aparut cartea „Splina. De la laparoscopie la chirurgia robotica si inapoi.” La Editura

Medicala, ISBN 978-973-39-0815-9. Cătălin Vasilescu

14

MATERIAL SI METODA

Acest studiu prospectiv cuprinde pacienți splenectomizați total sau subtotal pe cale

clasica sau minimal invaziva pentru diferite afecțiuni splenice în Clinica de Chirurgie Generala si

Transplant Hepatic a Institutului Clinic Fundeni.

Splenectomia subtotalã a beneficiat în ultimii ani de o atenţie crescutã, fiind privitã ca o

alternativã la splenectomia totalã în tratarea multor afecţiuni cu determinare splenicã, cum ar fi

de exemplu o serie de afecţiuni hematologice. Chiar dacã splenectomia totalã are efecte net

benefice in astfel de afecţiuni, reducând simptomele şi îmbunãtãţind semnificativ calitatea vieţii

acestor pacienţi, totuşi in urma exerezei totale a splinei se vor manifesta ulterior consecinţele

aspleniei, una dintre cele mai importante fiind infecţiile fulminante cu diferite bacterii

încapsulate, cum ar fi Streptococcus pneumoniae (OPSI). OPSI este precedat de un tablou clinic

nespecific ce cuprinde febrã, migrenã, senzaţie de greaţã, diaree, stare de rãu general.

Cei mai mulţi dintre pacienţi dezvoltã coagulare intravascularã diseminatã si de

asemenea, acidoza şi insuficienţa renalã reprezintã, de multe ori, complicaţii majore, iar

mortalitatea este cuprinsã între 50% şi 60%. S-a demonstrat ca OPSI survine în principal în caz

de infecţii nosocomiale sau în cazul pacienţilor imunodeprimaţi (Crandall et al. 2009;Okabayashi

and Hanazaki 2008;Vasilescu et al. 2003;Vasilescu et al. 2006).

Datele referitoare la pacienti au fost obținute din studiul foilor de observație, al

protocoalelor operatorii și din studiul monocitelor și eliberării de citokine de către acestea, cu

ajutorul tehnicii ELISA, din sângele periferic al pacientilor.

Parametrii studiați au fost:

• Vârsta și sexul pacienților;

• Tipul bolii ce determină afectare splenică;

• Valoarea plasmatică a citokinelor TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10, măsurate preoperator (în

pg/ml) , la 7 zile si la o lună postoperator inainte si după stimulare cu LPS bacterian;

• Numărul de leucocite si de monocite secretoare de citokine din sângele fiecărui pacient în

parte

Descrierea tehnicii WBS

Probele de sânge au fost prelevate de la pacienți prin puncționarea venei cubitale. Peste

probele de sânge (20 ml în tuburi de propilen) s-au adaugat 15 UI de heparinat de sodiu pentru

15

fiecare ml de sânge. Substanța anticoagulantă a fost testată înainte pentru a putea verifica

absența contaminării cu endotoxina.

O parte alicotă din sângele heparinizat, 15 UI/ml de sânge, a fost amestecată cu

endotoxina provenind de la Escherichia coli 055:B5, până la o concentrație finală de 0,1 ng per

ml de sânge.

Aceste probe stimulate cu endotoxina bacteriană, împreună cu cele fără endotoxină,

pentru fiecare pacient în parte au fost incubate pentru două ore la 37°C, într-o atmosferă cu 5%

CO2. După aceste două ore, plasma a fost separată prin centrifugare la 2000 g pentru 10 minute.

Au fost masurate nivelele următoarelor citokine: TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10.

Valorile citokinelor plasmatice au fost cuantificate prin utilizarea de teste ELISA obținute

de la R&D Systems.

Pentru toți pacienții incluși în studiu am măsurat valorile acestor citokine (bazale și după

stimularea cu LPS bacterian), atât preoperator, cât si postoperator (la 7 zile si la o lună).

Apoi am calculat numărul monocitelor, secretoare de citokine, per mililitru de sânge,

utilizând numărul de leucocite, obținute din hemoleucogramă si procentul de monocite obținut

din formula leucocitară, efectuate pentru fiecare pacient preoperator și postoperator, la 7 zile,

respectiv o luna.

Am raportat apoi valorile citokinelor, obținute în urma stimulării sangvine cu LPS, la

numărul de monocite per ml, calculate anterior, și am obtinut, o asa numită, valoare corectată a

citokinelor, pentru fiecare pacient si determinare în parte pentru a evidentia capacitatea

monocitului de a elibera citokine sub stimul endotoxinic. Valorile corectate au fost cele utilizate

pentru comparația, în ceea ce privește eliberarea de citokine, între cele două grupuri de pacienți,

adică cei cu splenectomie totală și cei cu splenectomie subtotală.

Am calculat media valorilor corectate ale citokinelor,separat pentru fiecare grup de

pacienți în parte și separat pentru fiecare dintre cele trei date de determinare ale citokinelor, adică

preoperator, la 7 zile și la o lună. Cea preoperatorie am considerat-o valoarea de referință pentru

a putea observa daca au existat diferențe în ceea ce privește eliberarea de citokine la

determinările ulterioare în cadrul aceluiași grup de pacienți și între pacienții din cele două

grupuri diferite (cu splenectomie totală si subtotală).

A fost realizata baza de date de splenectomii efectuate in clinica noastra in perioada

raportata. Au fost inclusi in studiu numai pacientii la care splenectomia a fost interventia

16

principala, fiind exclusi din studiu pacientii la care splenectomia a fost o interventie secundata

sau a fost impusa de o anumita tactica operatorie;de asemenea au fost inclusi in studiu pacientii

la care interventia a fost efectuata prin abord clasic, cit si prin abord laparoscopic principalul

argument pentru alegerea caii de abord fiind dimensiunea splinei, luind in considerare faptul ca

in cazurile cu splenomegalii masive abordul laparoscopic este considerat riscant sau uneori

imposibil.

Probele de singe au fost duse la laboratorul central de hematologie unde s-au efecuat

dozarile de anticorpi folosind tehnica ELISA si s-au prelucrat si stocat probele de singe in

vederea determinarii ulterioare a microRNA-urilor.

Metoda utilizată în cadrul studiului de față și prin care am reușit să ajungem la aceste

rezultate, respectiv Whole Blood Stimulation ( WBS) este o metoda foarte fiabilă, deoarece

reduce factorii perturbatori, legați de culturile celulare de monocite din sângele periferic, cum ar

fi contaminarea cu endotoxina a acestora, influețând astfel rezulatele finale și modificându-le.

Sangele integral reprezinta un mediu fiziologic, unde eliberarea de citokine poate fi

studiata, deoarece sunt pastrate aici LPS binding protein si modulatorii secretiei acestora, cum ar

fi cortisolul. (Berger et al. 1997;Ertel et al. 1995).

Prin aceasta metodă am creat un model ex-vivo de sepsis, cu toate că nu poate sa confere

informatii despre procesele inflamatorii din tot organismul, însă poate fi analizată secreția de

citokine dintr-un compartiment al acestuia, în acest caz porțiunea numită PALS a splinei (Ertel,

Kremer, Kenney, Steckholzer, Jarrar, Trentz, & Schildberg 1995).

Există anumite studii care au demonstrat că TNF-α este un trigger al eliberării de

citokine, așa ca TNF-α poate induce ea singură eliberarea, de exemplu, de IL-1 sau IL-6, în

aceeași manieră ca și endotoxinele. Aceste studii sugerează de asemenea ca TNF-α acționează ca

un stimul pentru IL-1 sau IL-6, în timpul sepsisului, pentru că s-a observat că atunci cand

bacteriile sau endotoxinele ajung în sânge, are loc o masivă eliberare de TNF-α, urmată abia

dupa aceea de un varf al eliberarii de IL-1 sau IL-6 (Cannon et al. 1990;Rodrick et al. 1992).

Exista numeroase studii in literatura de specialitate privind rolul splenectomiei subtotale

în prezervarea funcției imunologice a splinei. Astfel un studiu publicat în anul 1997 de catre

Moeniralam et al (Moeniralam et al. 1997) a avut scopul de a demonstra faptul ca splina este si

ea implicata, alaturi de ficat, in producerea de IL-6,care este o citokina proinflamatorie, dupa

stimularea cu endotoxina bacteriana, datorita functiei imunologice pe care aceasta o detine.

17

Valorile citokinei IL-6, după administrarea de endotoxina, au fost masurate atat la grupul de

control cat si la cel splenectomizat si s-a observat ca in cazul celor din urma acestea au fost mai

mari decat la ceilalti, ceea ce demonstreaza splina moduleaza cinetica citokinelor.

Rezultate acestui studiu sunt relevante și pentru studiul nostru arătând faptul că splina are

rol în imunitatea înnăscută, iar splenectomia totală, spre deosebire de cea subtotală, privează

organismul gazda de posibilitatea de apărare în fața bacteriilor, provocând astfel complicații

infecțioase grave.

Ertel si colab. (Ertel, Kremer, Kenney, Steckholzer, Jarrar, Trentz, & Schildberg 1995) a

demonstrat prin stimularea sangelui integral cu LPS, metoda folosita si in studiul de fata sinteza

scazuta de citokine in sepsis. In cadrul studiului s-a utilizat sange integral recoltat de la 15

pacienti aflati in stare septica si de la 20 de pacienti reprezentand grupul de control, ce nu

prezentau nici unul dintre criteriile sepsisului ( in expectative interventiei chirurgicale

reprezentate de cura herniei sau colecistectomie). Sangele de la pacientii septici a fost recoltat in

ziua admisiei in spital si apoi la 1, 2, 3, 5, 7 si 10 zile dupa si de la cei din grupul de control ,

doar preoperator pentru a exclude orice influenta asupra rezultatelor, cauzata de stresul

chirurgical sau de anestezie, pentru a putea masura nivelele de citokine proinflamatorii TNF-α,

IL-1 β si IL-6 si cinetica acestora.

O parte din sangele, de la fiecare pacient in parte, din cadrul ambelor grupuri, respectiv

cel cu septici si cel de control , a fost stimulat cu antigene bacteriene , si anume lipopolizaharid

provenind de la E.coli, in cantitate de 1µg/ml, masurandu-se comparativ nivelele de citokine

TNF-α, IL-1 β si IL-6 din momentul incubarii si la 24 de ore ulterior, si de asemenea din partea

de sange nestimulata.

S-a observat o crestere semnificativa a nivelului de citokine proinflamatorii in sangele

stimulat cu LPS bacterian la 24 de ore de la incubatie, in cazul pacientilor din grupul de control ,

in timp ce in cazul pacientilor septici , din contra, s-a inregistrat o scadere marcata a acestora , ce

s-a mentinut de altfel 10 zile. Acest lucru demonstreaza ca in cazul organismelor

imunodeprimate, cum se intampla in cazul pacientilor septici, monocitele din sange nu mai sunt

capabile de a sintetiza si elibera citokine proinflamatorii ca raspuns la un stimul antigenic, de

exemplu bacterian.

18

In cursul etapei 3 pe masura acumularii rezultatelor preliminarii au aparut urmatoarele

aspecte:

1. necesitatea introducerii unui lot de control fata de planul initial. Observatiile si analiza

rezultatelor obtinute in etapele anterioare au impus introducerea unui nou lot de control alcatuit

din pacienti cu operatii elective, dar fara splenectomie si de pacienti cu imunodepresie de alta

natura (de exemplu pacienti septici). Introducerea acestui nou lot de control a aparut ca absolut

necesara pentru clarificarea rolul microRNA in modularea imuna dupa splenectomia totala si

partiala.

2. Adaptarea design-ului de studiu la rezultatele deja obtinute a impus restructurarea

loturilor de control.

3. Analiza doar acestor pacienti cu operatii elective si cu imunodepresie datorata

sepsisului a condus la descoperirea unui fenomen nou: identificarea unui nivel constant crescut

de mRNA virale (KSHV - Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus) la pacientii cu diverse tipuri

de operatii si la pacientii septici. Aceste rezultate colaterale au fost bine primite in comunitatea

stiintifica si au facut deja in parte obiectul publicarii in revista Cell Death & Disease care face

parte din grupul de publicatii Nature. Aceasta revista are IMPACT FACTOR 5,014 si SCOR

RELATIV DE INFLUENTA 1,639.

REZULTATE

Principalele obiective ale studiului sunt::

a. identificarea unor modificari ale imunitatii innascute dupa splenectomie,

modificari care ar putea sa constituie suportul fiziopatologic al patologiei infectioase si non-

infectioase asociate splenectomiei

b. cercetarea rolului microRNA in instalarea acestor perturbari ale echilibrului imun

Pentru atingerea acestor obiective au fost incluse in studiu mai multe loturi de pacienti,

dupa cum urmeaza:

1. Pacienti cu splenectomie totala si subtotala

19

2. Un lot de control cuprinzand pacienti cu alte tipuri de interventii chirurgicale, care

sa permita distinctia intre modicarile imune datorate indepartarii parenchimului splenic si

efectele reactiei de faza acuta postoperatorie

3. Pacienti cu modificari cunoscute, bine caracterizate, ale imunitatii innascute, care

sunt pacientii septici

La toate aceste grupe au fost studiate atat nivelul productiei ex-vivo de citokine sub

stimul endotoxinic (cea mai fidela metoda de masurare a imunitatii innascute) cat si nivelurile

microRNA plasmatice si celulare.

Observatii colaterale in cursul efectuarii studiului:

1. Aspectele de metoda chirurgicala au fost abordate cu prioritate. Fara aceasta

etapa, de clarificare a indicatiilor, limitelor si a criteriilor de selectie a pacientilor, nu se poate

trece la analizarea aspectelor de reglare fina a imunitatii. Observatiile de tehnica chirurugicala au

facut obiectul a doua publicatii si a mai multor comunicari stiintifice (Robotic Splenectomy:

What is the Real Benefit? Giza DE, Tudor S, Purnichescu-Purtan RR, Vasilescu C. World J

Surg. 2014 Dec;38(12):3067-73. doi: 10.1007/s00268-014-2697-6. IMPACT FACTOR 2,523;

monografia „Splina. De la laparoscopie la chirurgia robotica si inapoi.” La Editura Medicala,

ISBN 978-973-39-0815-9. Vasilescu C 2016)

Astfel, analiza retrospectiva a datelor obtinute de la pacientii la care s-a practicat

splenectomie totala sau partiala prin abord minimal invaziv (laparoscopic sau robotic), a permis

delimitarea acestor indicatii. Loturile analizate au inclus pacienti operati de catre o singura

echipa chirurgicala prin abord laparoscopic sau robotic. Ipoteza de lucru a fost ca splenectomia

laparoscopica ramane abordul de ales in majoritatea indicatiilor de splenectomie, iar abordul

robotic reprezinta o optiune mai ales in splenectomiile dificile (splenetomii partiale,

splenectomiile din ciroza hepatica, tumorile splenice si hemopatiile maligne). Obiectivul

studiului a fost sa documenteze complexitatea fiecarei proceduri si sa evalueze situatiile in care

chirurgia robotica aduce avantaje comparativ cu laparoscopia. Pentru a defini gradul de

dificultate al splenectomiei minimal invazive a fost conceput un scor de evaluare preoperatorie

(MISS – minimally invasive splenectomy score) utilizind o serie de parametri clinici

preoperatori.

20

Principalele avantaje tehnologice ale sistemului robotic sunt imaginea realistă 3-D,

scalarea mişcării precum şi filtrarea tremorului fiziologic al mâinii. Cea mai mare utilitate a

robotului chirurgical în efectuarea splenectomiei e conferită de excelenta imagine şi motilitatea

foarte bună a instrumentelor robotice. Nu lipsesc însă nici criticile. Punctele slabe cel mai adesea

invocate sunt durata mai mare a intervenției chirurgicale, lipsa de mobilitatea a mesei de operație

în cursul procedurii, manipularea anumitor instrumente chirurgicale de către ajutoare (pensa de

Ligasure, canula de lavaj și aspirație) pe trocarele auxiliare, necesitatea unui antrenament special

atât pentru operator cât și pentru ajutoare, volumul mare al echipamentului. Aceste neajunsuri

sunt însă din plin compensate de posibilitățile mult mai bune de disecție şi ligatura vasculară.

Odată parcursă curba de învățare, chirurgul beneficiază de avantajele sistemului robotic şi evită

limitările acestuia.

Splenectomia robotică, cel puțin cu echipamentul disponibil la ora actuală, nu va înlocui

probabil splenectomia laparoscopică în poziția de standard chirurgical pentru indicațiile comune:

PTI, anemii hemolitice. Ea este însă în mod clar de mare utilitate în splenectomiile dificile:

splenectomii parțiale, splenectomii în ciroza hepatică, în splenomegalii tumorale și hemopatii

maligne. Abordul robotic la aceste categorii de indicații poate să scurteze timpul operator, să

scadă pierderea de sânge și riscul accidentelor hemoragice, sau chiar să facă posibilă realizarea

21

minimal-invazivă, cu toate avantajele binecunoscute ale acestui tip de chirurgie, a unor

splenectomii care altfel ar fi dificil de realizat laparoscopic.

2. In cursul desfasurarii studiului, a aparut ca neaparat necesara lămurirea unor

aspecte ale mecanismului de actiune a microRNAs in ansamblul reglarii epigenetice (From

mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs

interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Vasilescu C, Tanase M,

Dragomir M, Calin GA. Math Biosci. 2016 Oct;280:50-61. doi: 10.1016/j.mbs.2016.07.012.

Epub 2016 Aug 4 IMPACT FACTOR 1,64; MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic

implications of RNA networks. Giza DE, Vasilescu C, Calin GA. Expert Opin Biol Ther. 2014

Sep;14(9):1285-93. doi: 10.1517/14712598.2014.920812. IMPACT FACTOR 3,653)

Asfel, noul concept al reglarii post-translationale, in care anumite ARN-uri endogene

(ceRNAs- competitive endogenous RNAs) regleaza activitatea microRNA, sugereaza ca ARNm

tinta joaca un rol activ ca si element cheie in reglarea disponibilitatii miRNA in celule. ceRNA-

urile sunt considerate a fi ”momeli” naturale in procesul reglarii genice pentru microRNA,

putandu-le astfel influenta expresia. ceRNA formeaza retele cu rol in reglarea transcriptiei genice

(ceRNETs) a caror structura si functii au fost descrise prin modele matematice si validate

experimental. Ele sunt implicate atat in reglarea proceselor celulare normale cat si in anumite

conditii patologice precum neoplaziile sau sepsisul, in care sistemul imun al gazdei este alterat.

Alterarea retelelor ceRNETs ar putea fi implicate in in initierea si dezvoltarea proceselor

patologice, oferind astfel noi perspective terapeutice. Aceste noi abordari ar putea viza anumite

microRNA-uri si retele complexe de ceRNA care determina tipul de raspuns sau rezistenta la un

anume tratament specific, constituind premisele unui tratament adaptat fiecarui pacient in parte

(ceea ce defineste conceptul de patient tailored treatment).

In ceea ce priveste mecanismul exact de interactiune dintre microRNA si ARNm tinta,

acesta nu afost pe deplin elucidat in ciuda numeroaselor modele propuse pana in prezent. In orice

caz, ele nu pot fi privite ca interactiuni izolate sau in perechi, ci isi exercita efectele prin

interactiuni suprapuse, uneori redundante. Unul dintre modelele ce descriu interdependenta

acestor molecule este modelul „crosstalk” care se bazeaza pe competitia intracitoplasmatica a

mai multor ARNm tinta reglate de acelasi microRNA.

22

In articolul From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may

explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization autorii

propun un model matematic al acestei interactiuni sugerat de date experimentale („single particle

tracking”) care indica faptul ca mobilitatea intracelulara pare a fi de tip transport activ

intermitent (intermittent active tranport- IAT).

Acesta presupune alternanta intre transportul activ (AT) si miscarea browniana (BM). Pe

baza modelului matematic propus faza AT poate explica eficienta in tintirea moleculelor ARNm

indepartate, in timp ce faza BM explica competitia. Mai mult decat atat, aceasta interactiune

microRNA- ARNm depinde de concentratia moleculelor, afinitatea dintre ele, precum si de

localizarea lor intracitoplasmatica.

The Markov chain for dimension d=1: Brownian Motion phase (B), Active Transport

phase (A).

23

The Markov chain for dimension d=2: Brownian Motion phase (B), Active Transport

phase (A).

Conceptul de “medicina translationala”, reprezinta de altfel modelul cercetarii

fundamentale a ultimilor ani. Toate progresele de intelegere a patologiei septice si tumorale

trebuie sa-si gaseasca aplicare rapida in ajustarea posibilitatilor de screening (cu sensibilitate

superioara celor deja existente), diagnostic precoce si tratament adaptat fiecarui caz in parte

("precision medicine")

3. A aparut de la bun inceput nevoia de a clarifica bazele chimice ale modificarilor

imunitatii innascute si in instalarea tolerantei la endotoxina, model al depresiei imune

postoperatorii si in sepsis (Fractal-like kinetics of intracellular enzymatic reactions: a

chemical framework of endotoxin tolerance and a possible non-specific contribution of

macromolecular crowding to cross-tolerance., autori: Vasilescu C, Olteanu M, Flondor P, Calin

24

GA in Theor Biol Med Model. 2013 Sep 14;10:55. doi: 10.1186/1742-4682-10-55. IMPACT

FACTOR 1,46)

Scopul acestui studiu a fost de a analiza reactiile chimice din procesul de dezvoltare al

tolerantei la endotoxina si a demonstra ca analiza fractala le poate explica, cel putin partial. S-a

dezvoltat un model matematic bazat pe ecuatii diferentiale ce iau in considerare legaturile dintre

procesul de aglomerare macromoleculara si semnalele chimice generate de LPS bacterian in

cadrul procesului de toleranta la endotoxina. Se propune ideea ca proprietățile fractale ale

mediului intracelular influenteaza instalarea toleranței la endotoxină. Constructia se bazează pe

doua modele matematice ale reactiilor enzimatice: una este kinetica fractala a lui Kopelman si

cealalta este dependenta de tip power law a lui Savageau. Ipoteza noastra este ca intr-un mediu

fractal, LPS-signaling sufera modificari sub influenta reactiilor enzimatice ce se petrec in acest

mediu. Daca aceasta ipoteza se verifica , se poate demonstra, modul cum se desfasoara reactiile

chimice ce duc la dezvoltarea tolerantei la endotoxina si modul cum se produce imunosupresia la

pacientii cu sepsis. Productia de TNF-α este rezulatul unui lant de reactii enzimatice, avand un

anumit numar de secvente ce se petrec in mediul intracelular. In modelul propus de noi, lantul se

rezuma la o singura reactie, ce are loc intr-un mediu fractal, conditie ce ne-a directionat catre

posibilitatea utilizarii celor doua modele amintite mai sus. Modelele stabilesc astfel o legatura

intre morfologia mediului de reactie si rata reactiilor enzimatice intracelulare. Utilizand modelul

analitic fractal al lui Kopelman si mecanismul Michaelis-Menten pentru reactii enzimatice, am

construit o ecuatie diferentiala ce analizeaza matematic eliberarea de TNF-α sub stimularea de

LPS.

25

Modelul lui Savageau propune o alta abordare a kineticii enzimatice intr-un mediu

fractal. Au fost testate doua ipoteze: 1.endotoxina (LPS) actioneaza ca un trigger pentru reactie și

2. produsul (TNF-α) este eliberat in mod natural permanent. Simularile pe calculator, folosind

ecuatiile matematice dezvoltate in cadrul studiului, sustin ipoteza conform careia mediul

intracelular fractal si reactiile enzimatice ce se petrec in acest mediu joaca un rol in dezvoltarea

tolerantei la endotoxina. Se atrage atentia asupra faptului ca procesul de aglomerare

macromoleculara poate contribui in mod semnificativ la inducerea tolerantei la endotoxina prin

impunerea unor constrangeri de ordin geometric in mediul de reactie si a unei cinetici particulare

a reactiilor enzimatice intracelulare.

26

4. In cursul determinarilor efectuate la loturile de control cu pacienti septici si cu

reactie de faza acuta post-operatorie au aparut rezultate neprevazute, care au fost confirmate

ulterior. Au fost constatate in depresia imuna din sepsis si cea consecutica interventiilor

chirurugicale elective cresteri semnificatie ale microRNA virale. Observatiile au facut obiectul

unor publicatii in reviste cu o buna vizibilitate internationata (Cellular and Kaposi's sarcoma-

associated herpes virus microRNAs in sepsis and surgical trauma: Stefan Tudor, Dana Elena

Giza, Catalin Vasilecu et. al. Cell Death & Disease, (2014)5, e1559;

doi:10.1038/cddis.2014.515. IMPACT FACTOR 5,014, SCOR RELATIV DE INFLUENTA

1,639. Cellular and viral microRNAs in sepsis: mechanisms of action and clinical applications

Dana Elena Giza, Enrique Fuentes-Mattei, Marc D Bullock, Stefan Tudor, Mathew Goblirsch,

Muller Fabbri, Florea Lupu, Sai-Ching Jim Yeung, Catalin Vasilescu and George A Calin. Cell

Death and Differentiation (2016), 1–12 Macmillan Publishers Limited, part of Springer Nature.

All rights reserved 1350-9047/16; Received 21.11.15; revised 30.7.16; accepted 02.8.16.

IMPACT FACTOR 8,385). Factorul de impact cumulativ al articolelor publicate pana acum din

rezultatele studiului este de 16.

Observatiile si analiza rezultatelor obtinute in etapele anterioare au impus introducerea

unui nou lot de control alcatuit din pacienti cu operatii elective, dar fara splenectomie si de

pacienti cu imunodepresie de alta natura (de exemplu pacienti septici). Introducerea acestui nou

lot de control a aparut ca absolut necesara pentru clarificarea rolul microRNA in modularea

imuna dupa splenectomia totala si cea partiala.

Analiza pacientilor cu operatii elective si cu imunodepresie datorata sepsisului a condus

la descoperirea unui fenomen nou: identificarea unui nivel constant crescut de microRNA virale

(KSHV - Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus). Asa cum s-a aratat,aceste rezultate colaterale

au fost bine primite in comunitatea stiintifica si au facut deja in parte obiectul publicarii in

revista Cell Death & Disease care face parte din grupul de publicatii Nature.

La pacientii cu interventii chirurgicale elective nivelele plasmatice de microRNA-uri

virale (KSHV – Kaposi’s sarcoma associated herpes virus) au un nivel foarte scazut preoperator,

foarte crescut in ziua 1 postoperator cu revenire la normal in ziua 7 postoperator. Dintre pacientii

chirurgicali doar 11,9% aveau un nivel detectabil de microRNA-uri virale preoperator pentru ca

in ziua 1 pstoperator acestea sa fie detectabile la 71,42% dintre pacienti.

27

Compararea nivelurilor plasmatice de microRNA-uri virale in functie de abord (deschis,

laparoscopic si robotic) a permis detectarea unei cresteri mai accentuate a acestora la pacientii la

care abortul chirurgical a fost cel clasic, deschis. De asemenea s-a constatat o crestere accentuata

a microRNA-urilor virale la pacientii operati pentru afectiuni maligne prin abord chirurgical

deschis comparativ cu cei la care interventia chirurgicala a fost pentru afectiuni benigne.

Mai mult decat atat, nivelurile plasmatice a doua microRNA-uri virale studiate (miR-K-

12-10b si miR-K-12-12) s-au corelat cu nivelurile plasmatice de IL-10 la pacientii septici.

Imunosupresia asociata sepsisului poate conduce la un raspuns imun neadecvat, crescand astfel

28

riscul de reactivare al virusurilor endogene sau riscul de infectii nosocomiale. In culturi celulare

miR-K-12-10b si miR-K-12-12 s-au legat de TLR8 inducand o secretie crescuta de IL-6 si IL-10.

Faptul ca microRNA-uri virale specifice (KSHV) au fost exprimate la majoritatea

pacientilor in ziua 1 postoperator reprezinta o descoperire cu mare importanta clinica., Ea

implica o incidenta mult mai mare a infectiei cu KSHV, care apare ca fiind mult mai raspandita

decat o arata testele serologice actuale.

Indiferent de etiologie, odata sepsisul declansat, ratele de supravietuire la aceasta

categorie de pacienti scad cu fiecare ora de intarziere a tratamentului. Din aceasta perspectiva

diagnosticul precoce si stratificarea pacientilor septici pe grupe de risc reprezinta o prioritate

care sa permita ameliorarea prognosticului si deci cresterea supravietuirii. Biomarkerii serici ar

reprezenta instrumente utile in atingerea acestui obiectiv. Din pacate, pana la ora actuala, nu a

fost validat un astfel de biomarker. Cercetarile fundamentale din ultimii ani au identificat

microRNA ca elemente cheie cu rol in reglarea raspunsului inflamator in sepsis. Desi

modificarea expresiei microRNA in sepsis a fost evidentiata de numeroase studii recente,

proceselor fiziopatologice in care aceste molecule sunt implicate nu sunt inca pe deplin intelese.

Mai mult decat atat implicarea microRNA-urilor virale contribuie si ele la exacerbarea

productiei de citokine pro- si antiinflamatorii amplificand perturbarile imune.

29

5. In etapa de analiza a datelor in care ne aflam acum se pot deja face unele

observatii interesante care sunt in curs de a fi comparate cu datele din literatura (Patients after

splenectomy: old risks and new perspectives. Mihnea Dragomir, George Emil Dragoș Petrescu,

Grațiela Elena Manga, George A. Călin. Revista Chirurgia, Bucuresti 2016)

Astfel, datele obtinute precum si trecere in revista a cunostintelor actuale legate de

splenectomie si impactul aceteia asupra organismului uman contureaza ipoteza conservarii pe cat

posibil de parenchim splenic in scopul mentinerii functiei imune a acesteia. Legătura dintre

splenectomie și aceste riscuri este doar parțial înțeleasă. Răspunsul imun al gazdei împotriva

infecției este profund modificat post-splenectomie, iar acești indivizi sunt mai susceptibili să

dezvolte sepsis, uneori cu evoluție fulminantă, cunoscut ca si OPSI (overwelming

postsplenectomy infection). Splenetomia este de asemenea un potențial factor de risc pentru

numeroase complicații vasculare care rezultă în urma obstrucției parțiale sau totale ale unei

artere sau vene. În plus, hipertensiunea pulmonară poate fi o complicație severă și uneori fatală a

splenectomiei. Unii autori includ și neoplaziile, diabetul zaharat și pancreatita acută în categoria

complicațiilor non-infecțioase post-splenectomie. Cea mai de temut complicație pentru pacienții

splenectomizați rămâne insa sepsisul. Decesul în sepsis poate surveni fie în urma hiper-

inflamației, fie în urma imunosupresiei. Multiple dovezi experimentale au dovedit implicarea

microRNA-urilor celulare și virale în sepsis. Considerăm faptul că microRNA-urile sunt de

asemenea asociate cu imunosupresia pacientului asplenic, ceea ce determină o creștere a riscului

de sepsis fatal. Nivelul de microRNA-uri (celulare si plasmatice) creste dupa splenectomie si

atinge un maxim in ziua 1 postoperator. (vezi figura)

Studierea nivelului expresiei plasmatice a microRNA-urilor circulante la pacienții

asplenici, ar putea conduce la o mai bună înțelegere a imunosupresiei post-splenectomie,

indicandu-i ca biomarkeri de screening si diagnostic precoce care sa permita abordul adecvat al

pacientilor cu risc crescut de sepsis postsplenectmie.

Rezultate preliminare pe principala directie de abordare a studiului

a. Capacitatea de eliberare a citokinelor sub stimul endotoxinic (Exprimata de

delatTNF, Delta IL6, Delta IL10) la pacientii cu splenectomie toala si subtotala

Analiza intregului lot introdus in studiu a aratat o crestere a nivelului de TNF la pacientii

cu splenectomie subtotala comparativ cu pacientii cu splenectomie totala.

30

In cadrul lotului de pacienti la care s-a practicat splenectomie totala avand ca indicatie

purpura trombocitopenica idiopatica s-a observat o crestere a nivelelor plasmatice de TNF si

IL10 la 7 zile postoperator si o scadere a nivelelor de IL6.

Analiza lotului de pacienti la care s-a practicat splenectomie subtotala avand ca indicatie

microsferocitoza eredidara a aratat o scadere a nivelelor plasmatice de TNF si IL6 la 7 zile

postoperator si o crestere a nivelelor de IL10.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1 2 3 4 5 6

Delta TNF/MO 2012 Procent

T S

0

1

2

3

4

5

D1 D2 D3 D4 D5 D6

Splenectomie - PTI

Delta TNF/MO

0

0,5

1

1,5

2

1 2 3 4 5 6

Splenectomie - PTI

Delta IL6/MO

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

1 2 3 4 5 6

Splenectomie - PTI

Delta IL10/MO

31

b. Determinari de microRNA plasmatice si celulare la pacientii cu splenectomie

totala si partiala

Recent a fost studiată implicarea microRNA în elaborarea răspunsului imun înnăscut. În

uma stimulării cu LPS a celulelor participante la elaborarea răspunsului imun înnăscut, a

monocitelor şi macrofagelor, s-a înregistrat o modificare a expresiei unor tipuri de microRNA

cum ar fi: miR-146a, miR-155, miR-125a, miR-9, miR-142 (O'Connell, 2007; Taganov, 2006;

Tili, 2007).

In studiul nostru am observat scadere a nivelelor plasmatice de miR-142 si miR-146 la 7

zile si 30 de zile postsplenectomie spre deosebile de nivelurile celulare care raman constante la

30 de zile postsplenectomie.

Confirmarea statistica a semnificatiei detreminarilor de citokine si microRNA-uri si

corelarea lor cu tipul de interventie chiurgicala si datele clinice sunt in curs de desfasurare.

0

2

4

6

8

1 2 3 4 5 6

Splenectomiemicrosferocitoza

Delta TNF/MO

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 2 3 4 5 6


Delta IL6/MO

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

1 2 3 4 5 6


Delta IL10/MO

32

Befo

re s

ple

necto

my

7 d

ays a

fter

sp

len

ecto

my

30 d

ays a

fter

sp

len

ecto

my

0

2 0

4 0

6 0

8 0

m iR -1 4 2

S p le e n p la s m a (2 5 p a t ie n ts )

Re

lati

ve

Qu

an

tifi

ca

tio

n

miR

-14

2/m

iR-3

4-m

iR-5

4 B e fo re s p le n e c to m y

7 d a y s a fte r s p le n e c to m y

3 0 d a y s a fte r s p le n e c to m y

Befo

re s

ple

necto

my

7 d

ays a

fter

sp

len

ecto

my

Day 3

0 a

fter

sp

len

ecto

my

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

m iR -1 4 2

S p le e n p la s m a

C(t

) v

alu

es

B e fo re s p le n e c to m y

7 d a y s a fte r s p le n e c to m y

D a y 3 0 a fte r s p le n e c to m y

Befo

re s

ple

necto

my

Day 3

0 a

fter

sp

len

ecto

my

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

m iR -1 4 2

S p le e n c e lls (1 7 p a t ie n ts )

C(t

) v

alu

es



m iR -1 4 6 b

S p le e n p la s m a (2 4 p a t ie n ts )

Re

lati

ve

Qu

an

tifi

ca

tio

n

miR

-14

6b

/miR

-34

-miR

-54

Befo

re s

ple

necto

my

7 d

ays a

fter

sp

len

ecto

my

Day 3

0 a

fter

sp

len

ecto

my

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0



33

ROLUL microRNA IN MODULAREA IMUNA DUPA SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA

MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic implications of RNA networks.

Expert Opinion on Biological Therapy

IMPACT FACTOR 3,653

Rezultate obtinute din analiza datelor obtinute de la pacientii introdusi in studiu

From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of

target subcellular localization.

Mathematical Biosciences

IMPACT FACTOR 1,64

Robotic Splenectomy: What is the Real Benefit?

World Journal of Surgery

IMPACT FACTOR 2,348

Cellular and viral microRNAs in sepsis: mechanisms of action and clinical applications

Cell Death and Differentiation

IMPACT FACTOR 8,385

Fractal-like kinetics of intracellular enzymatic reactions: a chemical framework of endotoxin tolerance and a possible non-

specific contribution of macromolecular crowding to cross-tolerance

Theoretical Biology and Medical Modelling

IMPACT FACTOR 1,46

Patients after splenectomy: old risks and new perspectives.

Revista Chirurgia

Cellular and Kaposi's sarcoma-associated herpes virus microRNAs in sepsis and

surgical trauma:

Cell Death & Disease

IMPACT FACTOR 5,014

Splina. De la laparoscopie la chirurgia robotica si inapoi.”

Editura Medicala, ISBN 978-973-39-0815-9

Probleme teoretice legate de fenomenului de toleranta la endotoxina ca expresie a raspunsului

imun innascut si rolul posibil al microRNA-urilor in reglarea raspunsului imun la pacientii la care s-a

efectuat splenectomie totala sau partiala

34

Bibliografie

Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pillai, S. Cellular and Molecular Immunology, Elsevier

Saunders Philadelphia 2012.

Altamura, M., Caradonna, L., Amati, L., Pellegrino, N.M., Urgesi, G., and Miniello, S.

Splenectomy and sepsis: the role of the spleen in the immune-mediated bacterial

clearance, Immunopharmacol.Immunotoxicol., 2001 23(2):153-161.

Berger, D., Boelke, E., Seidelmann, M., Vasilescu, C., & Beger, H.G. 1997. Endotoxin-induced

cytokine release from whole blood - similarities between monocyte dysfunction in

septic disease and during post-operative acute phase response. J Endotox Res, 4, (1)

17-24

Cannon, J.G., Tompkins, R.G., Gelfand, J.A., Michie, H.R., Stanford, G.G., van der Meer, J.W.,

Endres, S., Lonnemann, G., Corsetti, J., Chernow, B., & . 1990. Circulating

interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin

fever. J Infect.Dis., 161, (1) 79-84 available from: PM:2295861

Crandall, M., Shapiro, M.B., & West, M.A. 2009. Does splenectomy protect against immune-

mediated complications in blunt trauma patients? Mol.Med., 15, (7-8) 263-267

available from: PM:19593410

Croce, C.M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer, Nat.Rev.Genet.,

2009 10(10):704-714.

de Porto, A.P., Lammers, A.J., Bennink, R.J., ten Berge, I.J., Speelman, P., and Hoekstra, J.B.

Assessment of splenic function, Eur.J Clin.Microbiol.Infect.Dis., 2010

29(12):1465-1473.

Du, T. and Zamore, P.D. Beginning to understand microRNA function, Cell Res., 2007

17(8):661-663.

Ertel, W., Kremer, J.P., Kenney, J., Steckholzer, U., Jarrar, D., Trentz, O., and Schildberg, F.W.

Downregulation of proinflammatory cytokine release in whole blood from septic

patients, Blood, 1995 85(5):1341-1347.

Jirillo, E., Mastronardi, M.L., Altamura, M., Munno, I., Miniello, S., Urgesi, G., and Amati, L.

The immunocompromised host: immune alterations in splenectomized patients and

clinical implications, Curr.Pharm.Des, 2003 9(24):1918-1923.

Lewis, B.P., Burge, C.B., and Bartel, D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines,

indicates that thousands of human genes are microRNA targets, Cell, 2005

120(1):15-20.

Lu, L.F. and Liston, A. MicroRNA in the immune system, microRNA as an immune system,

Immunology, 2009 127(3):291-298.

Mebius, R.E. and Kraal, G. Structure and function of the spleen, Nat.Rev.Immunol., 2005

5(8):606-616.

35

Moeniralam, H.S., Bemelman, W.A., Endert, E., Koopmans, R., Sauerwein, H.P., & Romijn,

J.A. 1997. The decrease in nonsplenic interleukin-6 (IL-6) production after

splenectomy indicates the existence of a positive feedback loop of IL-6 production

during endotoxemia in dogs. Infect.Immun., 65, (6) 2299-2305 available from:

PM:9169767

Murphy, K., Travers, P., and Walport, M. Janeways Immunology, Garland Science 2008.

O'Connell, R.M., Taganov, K.D., Boldin, M.P., Cheng, G., and Baltimore, D. MicroRNA-155 is

induced during the macrophage inflammatory response, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,

2007 104(5):1604-1609.

Okabayashi, T. and Hanazaki, K. Overwhelming postsplenectomy infection syndrome in adults -

a clinically preventable disease, World J.Gastroenterol., 2008 14(2):176-179.

Rodrick, M.L., Moss, N.M., Grbic, J.T., Revhaug, A., O'Dwyer, S.T., Michie, H.R., Gough,

D.B., Dubravec, D., Manson, J.M., Saporoschetz, I.B., & . 1992. Effects of in vivo

endotoxin infusions on in vitro cellular immune responses in humans. J

Clin.Immunol., 12, (6) 440-450 available from: PM:1287036

Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfelder, N., Fang, Z., Khanin, R., and Rajewsky, N.

Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs, Nature, 2008

455(7209):58-63.

Taganov, K.D., Boldin, M.P., Chang, K.J., and Baltimore, D. NF-kappaB-dependent induction of

microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune

responses, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2006 103(33):12481-12486.

Tili, E., Michaille, J.J., Cimino, A., Costinean, S., Dumitru, C.D., Adair, B., Fabbri, M., Alder,

H., Liu, C.G., Calin, G.A., and Croce, C.M. Modulation of miR-155 and miR-125b

levels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stimulation and their possible roles

in regulating the response to endotoxin shock, J.Immunol., 2007 179(8):5082-5089.

Timens, W. The human spleen and the immune system: not just another lymphoid organ,

Res.Immunol., 1991 142(4):316-320.

Tiron, A. and Vasilescu, C. [Role of the spleen in immunity. Immunologic consequences of

splenectomy], Chirurgia.(Bucur.), 2008 103(3):255-263.

Vasilescu, C., Stanciulea, O., Colita, A., Stoia, R., Moicean, A., and Arion, C. [Laparoscopic

subtotal splenectomy in the treatment of hereditary spherocytosis],

Chirurgia.(Bucur.), 2003 98(6):571-576.

Vasilescu, C., Stanciulea, O., Tudor, S., Stanescu, D., Colita, A., Stoia, R., Coriu, D., Colita, A.,

and Arion, C. Laparoscopic subtotal splenectomy in hereditary spherocytosis : to

preserve the upper or the lower pole of the spleen?, Surg.Endosc., 2006 20(5):748-

752.

Documents

Proiecte de Cercetare Exploratorie tip PCE PN-II-ID-PCE ...icfundeni.ro/wp-content/uploads/2016/10/raport-stiintific-proiect... · Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor