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Progetto Alleanza contro il Cancro 2007-2009Programma 3
Sviluppo di nuove terapie nei sarcomi muscolo scheletrici:
immunoterapia e target terapia a confronto
Coordinatore: Dott. Piero Picci
Progetto Alleanza contro il Cancro 2007-2009Programma 3
Sviluppo di nuove terapie nei sarcomi muscolo scheletrici:
immunoterapia e target terapia a confronto
Coordinatore: Dott. Piero Picci
LA RETE NAZIONALE SOLIDALE E COLLABORAZIONI INTERNAZIONALI DEL PROGRAMMA STRAORDINARIO ONCOLOGIA 2006 (ISS PER ACC)
CONVEGNO DI PRESENTAZIONE DELLE ATTIVITA’ INIZIATE NELL’AMBITO DEI PROGRAMMI 1, 2, 3, 4
21 Aprile 2008 Istituto Superiore di Sanità - Roma
Unità operativeUnità operativeUnità 1
Katia Scotlandi (IOR BO)Massimo Serra (IOR BO)Mario Colombo (INT MI)Luciano Zardi (CBA GE)Laura Borsi (IST GE)Maurizio Cianfriglia (ISS Roma)Anna Maria Caccuri (Univ. Tor Vergata Roma)
Unità 2Roberto Perris (CRO Aviano - Univ. Parma)Maria Serena Benassi (IOR BO)
Unità 1Katia Scotlandi (IOR BO)Massimo Serra (IOR BO)Mario Colombo (INT MI)Luciano Zardi (CBA GE)Laura Borsi (IST GE)Maurizio Cianfriglia (ISS Roma)Anna Maria Caccuri (Univ. Tor Vergata Roma)
Unità 2Roberto Perris (CRO Aviano - Univ. Parma)Maria Serena Benassi (IOR BO)
Progetto focalizzato su 4 diversi approcci terapeutici
Progetto focalizzato su 4 diversi approcci terapeutici
1. Definizione del significato prognostico e terapeutico del proteoglicano NG2Verifica del significato prognostico e predittivo della sovraespressione di NG2 nei sarcomi delle parti molli e convalida funzionale della sua capacità di indurre un fenotipo cellulare altamente maligno.Utilizzo di anticorpi primari e anti-idiotipo in approcci immunoterapeutici bersaglio specifici (targeted) e personalizzati nei suddetti tumori.
2. Definizione dell’efficacia di anticorpi umani ricombinanti contro il dominio EDB della FibronectinaIl dominio EDB della fibronectina è espresso in molti sarcomi umani: deve essere verificata la sua espressione nei sarcomi muscoloscheletriciL’analisi dell’efficacia preclinica di schemi terapeutici basati sull’utilizzazione di anticorpi anti-EDB coniugati a TNF-alpha potrà portare alla definizione di nuovi approcci immunoterapici
1. Definizione del significato prognostico e terapeutico del proteoglicano NG2Verifica del significato prognostico e predittivo della sovraespressione di NG2 nei sarcomi delle parti molli e convalida funzionale della sua capacità di indurre un fenotipo cellulare altamente maligno.Utilizzo di anticorpi primari e anti-idiotipo in approcci immunoterapeutici bersaglio specifici (targeted) e personalizzati nei suddetti tumori.
2. Definizione dell’efficacia di anticorpi umani ricombinanti contro il dominio EDB della FibronectinaIl dominio EDB della fibronectina è espresso in molti sarcomi umani: deve essere verificata la sua espressione nei sarcomi muscoloscheletriciL’analisi dell’efficacia preclinica di schemi terapeutici basati sull’utilizzazione di anticorpi anti-EDB coniugati a TNF-alpha potrà portare alla definizione di nuovi approcci immunoterapici
3. Generazione di un anticorpo umano specifico per CD99 utilizzabile clinicamenteCD99 molecola di membrana particolarmente espressa nel sarcoma di EwingPotenziale bersaglio immunoterapico, soprattutto per il sarcoma di Ewingma anche per altre neoplasie con elevata espressione di questo antigene
4. Valutazione pre-clinica dell’efficacia di NBDHEXGli enzimi glutatione transferasi (GST) sono deputati alla detossificazioneintracellulare dei farmaci chemioterapici ed una loro sovraespressione e/o aumentata attività è stata rilevata come essere associata a scarsa risposta al trattamento e ad un prognosi avversa in diversi sarcomi muscoloscheltrici e altri tumori umani NBDHEX è un nuovo agente antitumorale sintetizzato presso l’UniversitàTor Vergata di Roma diretto contro le GST e il suo impiego potrebbe far superare o attenuare la farmacoresistenza GST-mediata
3. Generazione di un anticorpo umano specifico per CD99 utilizzabile clinicamenteCD99 molecola di membrana particolarmente espressa nel sarcoma di EwingPotenziale bersaglio immunoterapico, soprattutto per il sarcoma di Ewingma anche per altre neoplasie con elevata espressione di questo antigene
4. Valutazione pre-clinica dell’efficacia di NBDHEXGli enzimi glutatione transferasi (GST) sono deputati alla detossificazioneintracellulare dei farmaci chemioterapici ed una loro sovraespressione e/o aumentata attività è stata rilevata come essere associata a scarsa risposta al trattamento e ad un prognosi avversa in diversi sarcomi muscoloscheltrici e altri tumori umani NBDHEX è un nuovo agente antitumorale sintetizzato presso l’UniversitàTor Vergata di Roma diretto contro le GST e il suo impiego potrebbe far superare o attenuare la farmacoresistenza GST-mediata
FINANZIAMENTOFINANZIAMENTOFASI PROGETTUALIFASI PROGETTUALI
60% per i primi 24 mesi,ugualmente distribuito tra le varie U.O. e Gruppi di Ricerca
60% per i primi 24 mesi,ugualmente distribuito tra le varie U.O. e Gruppi di Ricerca
Prima Fase (mesi 0- 24)Validazione pre-clinica, in vitro ed in vivo, dei 4 diversi approcci terapeutici
Prima Fase (mesi 0- 24)Validazione pre-clinica, in vitro ed in vivo, dei 4 diversi approcci terapeutici
40% per gli ultimi 12 mesi,riservato all’approccio terapeutico che sara’risultato piu’ promettente in base ai dati ottenuti nella prima fase del progetto
40% per gli ultimi 12 mesi,riservato all’approccio terapeutico che sara’risultato piu’ promettente in base ai dati ottenuti nella prima fase del progetto
Seconda Fase (mesi 24-36)Selezione dell’approccio terapeutico con maggiori possibilita’ di trasferimento “rapido” nella pratica clinica
Seconda Fase (mesi 24-36)Selezione dell’approccio terapeutico con maggiori possibilita’ di trasferimento “rapido” nella pratica clinica
Metodologia e OrganizzazioneMetodologia e Organizzazione
Maurizio Cianfriglia:CD99 e fibronectina
Roberto Perris:NG2
Massimo Serra:NBDHEX
Maurizio Cianfriglia:CD99 e fibronectina
Roberto Perris:NG2
Massimo Serra:NBDHEX
9
Scheme of the different strategies utilized for the development of anti-
CD99 antibodies for immunotherapy of EWs
0662 hybridoma( murine)
mAb
Functional assay (apoptosis on Ews cells) of the purified 0662 mAb (IgG3) and itsFab’ and Fab’’ fragments
Epitope mapping for the identificationof the CD99 peptide/epitope
Isolation of rodent VH and VL genes andtheir expression with human Fc (IgG1) forproduction of chimeirc human/mouse mAb
Isolation and expression ofthe extracellular CD99 domain
Target antigens forin in vitro selection ofhuman scFv fromphage display antibody libraries
Anti CD99 human antibodies
IgG; scFv::IL2; scFv::TNFa+
Doxo; NHBDEX
10
Genetic engineering and transient expression of the chimerichuman/ mouse anti CD99 mAb
chimeric
Chimerization1. mRNA extraction from the hybridoma clone 0662 secreting an anti CD99 mAb2. cDNA synthesis3. VH and VL amplification with degeneratedprimers4. agarose purification of VH and VL5. VH and VL sequencing6. VH / VL murine amplification with specificprimers7. VH / VL cloning into expression vector (pVH-Express/ pVkExpress) with respective humanconstant chains (gamma-1 Heavy/kappa Light )8. transient cotransfection of vectors into recipientcells
Control
ChimericMouse
Flow-cytometry analysis of CD99 recognition on EWs sarcomacells by the transiently expressedhuman/mouse chimeric mAb.
11
-PNHPSSSGSFSDADLAD-COOHBiotine
-PNHPSSSGSFSDADLAD-COOHBSA
NH2-PNHPSSSGSFSDADLAD-COOH
Lys-βAla-Resin
Lys
LysNH2-PNHPSSSGSFSDADLADGVS-
NH2-PNHPSSSGSFSDADLADGVS-
NH2-PNHPSSSGSFSDADLADGVS-
NH2-PNHPSSSGSFSDADLADGVS-
Free
Pe
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BSA
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0
0,2
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1
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0,6
0,8
1
1,2
mAb 0662 (Super)
control m
Ab (Super)
mAb 0662 (purif)
.
Control m
Ab ( purif
).
O.D
.Different formulations of the CD99 peptide epitope ELISA
12
rCD99 extracellular domain ( 6xHis-tag fused ) was purified using metalaffinity cromatography
45 KDa -
30 KDa -
E1-4
14.3 KDa -
20.1 KDa -
niM i3h
supe
r
afte
r bin
ding
pelle
t
was
h
ELISA
0662 antiCD99 mAb
IrrelevantmAb
Recombinant CD99 + -
GO - -BSA-CD99 peptide + -CD99 free-peptide + -
MALDI-TOF confirmed protein aminoacidicsequence of CD99 extracellular domain
13
ETH-2
(semi-synthetic)
GOLD
(semi-synthetic)
Naive MIX
(immune)
Phage antibody libraries
Methods of panning
SELECTION OF RECOMBINANT ANTIBODIES ANTI CD99 FROM ANTIBODY LIBRARIES
Biotynilated antigen Immunotubes alive cells
Streptavidinated beads
Biotynilated antigen
AntigenCell
14
Eluition
Amplification
Antibody phageSCREENINGWashes
NextPANNING
Antibody phagelibrary
Selection of a binding specificity from a phage display library
scFv
rCD99
scFv monoclonal
PANNING
15
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
11,11,2
4a sel
no. selezione
OD
BSAGSTGOCD99 E1CD99-GST
O.D.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
O.D.
Selection of human specific antibody in scFv format from ETH-2 antibody phagelibrary by four cycles of panning on immunotubes - coated rCD99 protein (A) and screening of the cloned scFvs (B)
A
B
Selection
ScFvs ELISA screening
16
Antibody libraries
antigen method results FACS on ES cells
ETH-2
Peptide CD99
Recombinant CD99
Immunotube
Immunotube
Negative
Positive: scFvs specific for
recombinant CD99
_
(in progress)
ETH-2GOLD
Peptide CD99
6647 cells
Immunotube
In suspension
Negative
Negative
_
−
Naive
Peptide CD99
Peptide CD99
Streptavydinatedbeads
Immunotube
clones cross-reactive withantigens non related to CD99
−
(in progress)
Immune (mix lymphocyresfrom cancerpatients)
Peptide CD99
Peptide CD99
Streptavydinatedbeads
Immunotube
clones cross-reactive withantigens non related to CD99
(in progress)
−
Summary of the phage antibody library selection
17
Selective delivery of TNFa in tumor blood vessel by scFv anti fibronectin (EDB domain) and preclinical results of combined
immuno-chemotherapy (L. Zardi).
Genetic construction of immunoprotein Selective delivery to tumor vessel
18
WEHI-164 SCID beige mice
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20 25
survival (%)
time (d)
PBS
L19mTNFα/melph.
survival (%)
time(d)
WEHI-164 (osteosarcoma) BALB/c mice
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
PBSL19mTNFα/melph.L19mTNFαmelphalan
References:• Borsi et al. Blood,
102:13, 4384-92, 2003.• Balza et al. Clin Cancer
Res, 12:8, 2575-82, 2006.• Mortara et al. Eur. J.
Immunol, 37:12, 3381-92, 2007.
19
Ongoing studies to verify the feasibility of CD99 and EDB domain of fibronectin as target antigens for immunotherapy
of EWs
• Isolation of clones stably expressing chimeric human/mouse anti CD99 mAb
• Isolation of anti CD99 human scFvs and construction of fully humanmAb and immunproteins (scFv::IL2; scFv::TNFa)
• Functional assay of the isolated mAbs and scFvs (induction of apoptosis in EWs cells)
• Pre-clinical efficacy of the human scFv anti EDB domain in combination with antitumor agents
20
Contributors of the work presented by Prof. M. Cianfriglia
• Dr. Silvia Zamboni,ISS: Genetic engineering and chimerization of the rodent anti-Cd99 mAb
• Dr. Alessandra Mallano, ISS: Expression of rCD99 (extracellulardomain) and selection of scFv from the antibody phage libraryETH-2
• Dr. Mara Gellini,ISS: Selection of scFvs specific for CD99 peptidesand protein from different antibody phage libraries
• Dr. Alessandro Ascione, ISS: purification and functional assay of anti CD99 mAb
• Prof. L. Zardi and Dr. L. Borsi (Genova): scFv anti EDB -basedimmuno.chemotherapy of human osteosarcoma
S-S
S-S
PDGF, FGFs
Integrins, galectin-3
Chondroitin sulfate
NG2[HMW-MAA, MCSP, CSPG4 - 8 kb, 2322 aa, 550-680 kDa, 15q]
VitronectinCollagen type IVCollagen type VI
ECM
Growth factors
Cell adhesion molecules
PKCαERK1/2
FAK/cdc42/p130casSIGNALLING
GSK3α/βmTOR
MUPP1
Cofilin
Cytoskeleton
Synthenin-1
Actin filaments
PROTEOMIC SCREENING OF MOLECULAR INTERACTORSOF THE ECTODOMAIN
Overexpression of NG2 is an independent prognostic factor and stronglypredicts short-term post-surgical metastatic disease
Up to 7yrs Up to 7yrs
MULTICENTER INTERNATIONAL STUDY(US institutions)
NG2 confers a more malignant phenotype independently of other pro-oncogenicor pro-metastatic molecular traits
UNVEIL THE MOLECULAR MECHANISMSI) Tumour cell-host microenvironment interactionsII) Intracellular signalling cascades
THERAPEUTIC IMMUNOTARGETING OF NG2 – STRATEGY I
63 mAbs againstrecombinantNG2 ectodomain
Intravital microscopy
NG2+Diaphragm (2hr)
Inoculation site
Lymphatic invasion (4hr) Lymphatic invasion (4hr) Lung infiltration (12hr)
Diaphragm (0hr) NG2- NG2+
NG2+NG2+NG2-
Diaphragm (2hr)
Proliferation
Migration
IN VITRO
IN VIVO
ANTI-IDIOTYPIC ANT-NG2 VACCINATION – STRATEGY II
763.74 IgG2a
NG2 Ab-1 against NG2
Target antigen Tumour NG2
Ab-3 endogenous(against NG2)
ANTI-IDIOTYPIC VACCINE
MK2-23 IgG1
Ab-2 against A1(mimics NG2)
MK2-23-L1 MK2-23-H3
Progetto Alleanza contro il Cancro Programma 3 (2007-2009)
Valutazione pre-clinica dell’efficacia di NBDHEX
Gruppi di Ricerca:
Laboratorio di Ricerca Oncologica, Modulo di Farmacoresistenza, Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna (Resp. Dott. Massimo Serra)
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche, Università Tor Vergata, Roma (Resp. Prof.ssa Anna Maria Caccuri)
Obiettivi generali
Valutazione pre-clinica dell’efficacia di NBDHEX:
• analisi dell’efficacia in vitro di NBDHEX e delle interazioni con i chemioterapici convenzionali
• analisi del meccanismo di morte cellulare indotto dal trattamento con NBDHEX
• analisi dell’efficacia in vivo (nell’animale da esperimento) di NBDHEX, usato sia come farmaco singolo che in associazione ai chemioterapiciconvenzionali
• definizione del profilo farmacocinetico e degli effetti di tossicità collaterale di NBDHEX per una eventuale pianificazione di studi di fase I/II
Progetto Alleanza contro il Cancro Programma 3 (2007-2009)
Obiettivi per i primi 6 mesi di progetto
Valutazione pre-clinica dell’efficacia di NBDHEX:
•analisi dell’efficacia in vitro di NBDHEX e delle interazioni con i chemioterapici convenzionali
•analisi del meccanismo di morte cellulare indotto dal trattamento con NBDHEX
• analisi dell’efficacia in vivo (nell’animale da esperimento) di NBDHEX, usato sia come farmaco singolo che in associazione ai chemioterapiciconvenzionali
• definizione del profilo farmacocinetico e degli effetti di tossicità collaterale di NBDHEX per una eventuale pianificazione di studi di fase I/II
Progetto Alleanza contro il Cancro Programma 3 (2007-2009)
Meccanismi di resistenza al Meccanismi di resistenza al CisplatinoCisplatinonellnell’’OsteosarcomaOsteosarcoma
PerchPerchéé NBDHEX ?NBDHEX ?
⇑
Progetto Alleanza contro il Cancro Programma 3 (2007-2009)
Principali meccanismi Principali meccanismi intracellulariintracellulari delldell’’attivitattivitààdel CDDPdel CDDP
MeccanismoMeccanismo dd’’azioneazione del CDDPdel CDDP
CDDP produce CDDP produce dannidanni al DNA al DNA formandoformando legamilegamiintercatenaintercatena e e intracatenaintracatena con con conseguenteconseguente induzioneinduzionedelldell’’apoptosiapoptosi
Meccanismi di resistenza al CDDPMeccanismi di resistenza al CDDP
• Diminuito accumulo del farmaco• Aumento dell’efflusso del farmaco• Diminuzione dell’apoptosi CDDP-indotta• Aumento della detossificazione da parte del sistemaGSH/GSTpi
• Diminuizione della “platinazione” del DNA• Diminuita frammentazione del DNA CDDP-indotta
AumentoAumento delladella detossificazionedetossificazione mediatamediata daldalsistemasistema GSH/GSTGSH/GST
Cumulative event-freesurvival
Time (months)
Low GSTP1 expression
High GSTP1 expression
P = 0.0251,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
80706050403020100
RealReal--timetime PCR: 34 PCR: 34 primaryprimary OS (cutOS (cut--off = off = medianmedian valuevalue))
Il GSTP1 si propone come un promettente bersaglio Il GSTP1 si propone come un promettente bersaglio terapeutico per aggirare la terapeutico per aggirare la farmacoresistenzafarmacoresistenzanellnell’’osteosarcomaosteosarcoma
NellNell’’osteosarcomaosteosarcoma, GSTP1 , GSTP1 èè implicato anche implicato anche nellnell’’insorgenza di insorgenza di farmacoresistenzafarmacoresistenza a DX e, in a DX e, in misura minore, al MTXmisura minore, al MTX
77--nitronitro--2,1,32,1,3--benzoxadiazole (NBD)benzoxadiazole (NBD) derivativesderivatives
Compounds
6-(NBD-4-ylthio)hexanolNBDHEX
4-(NBD-4-ylthio)butanol
2-(NBD-4-ylthio)imidazole
3-(NBD-4-ylthio)propionic acid
6-(NBD-4-ylamino)hexanol
ON
N
S
NO2
OH
1
ON
N
S
NO2
OH
2
ON
N
S
NO2
N
N
3
ON
N
S
NO2
COOH
4
ON
N
N
NO2
OH
5
H
ON
N
S
NO2
OH
NBDHEX6-(NBD-4-ylthio)hexanol(EP 1 615 638 B1)MS: 297Abs. 432 nm (ε = 15,000 M-1cm-1)Em. 525 nm
NBDHEX [6NBDHEX [6--(7(7--NitroNitro--2,1,32,1,3--benzoxadiazolbenzoxadiazol--44--ylthio)ylthio)hexanolhexanol]]synthetizedsynthetized byby the the DepartmentDepartment of of ChemicalChemical SciencesSciences and Technologies, and Technologies,
TorTor Vergata University, Vergata University, RomeRome ((Pr.Pr. A.M. A.M. CaccuriCaccuri))
•• Nuovo farmaco antitumorale che ha come principale bersaglio il GNuovo farmaco antitumorale che ha come principale bersaglio il GSTP1STP1--1 1 •• Estremamente attivo in alcune linee cellulari tumorali umaneEstremamente attivo in alcune linee cellulari tumorali umane•• Non Non èè substrato delle pompe proteiche che sono causa della substrato delle pompe proteiche che sono causa della multifarmacoresistenzamultifarmacoresistenza ((PP--glicoproteinaglicoproteina) )
•• Effetti Effetti citotossicicitotossici in linee cellulari tumorali umane si hanno giin linee cellulari tumorali umane si hanno giàà a basse a basse concentrazioni concentrazioni
•• Bassa tossicitBassa tossicitàà in modelli animali in modelli animali murinimurini
1.1. Ricci Ricci etet al.al. MechanismMechanism of action of of action of potentialpotential anticanceranticancer drugsdrugs. . J J BiolBiol ChemChem 2005; 280:263972005; 280:26397--405405
2.2. TurellaTurella etet al.al. ProapoptoticProapoptotic ActivityActivity of New of New GlutathioneGlutathione SS--TransferaseTransferase InhibitorsInhibitors. . CancerCancer ResRes 2005;65, 37512005;65, 3751––61 61
3.3. TurellaTurella etet al.al. A strong A strong glutathioneglutathione SS--transferasetransferase inhibitorinhibitor overcomesovercomes the the PP--glycoproteinglycoprotein--mediatedmediated resistanceresistance in in tumortumor cellscells. 6. 6--(7(7--NitroNitro--2,1,32,1,3--benzoxadiazolbenzoxadiazol--44--ylthio)ylthio)hexanolhexanol (NBDHEX) (NBDHEX) triggerstriggers a a caspasecaspase--dependentdependent apoptosisapoptosis in in MDR1MDR1--expressing expressing leukemialeukemia cellscells. . J J BiolBiol ChemChem 2006;281: 237252006;281: 23725--3232
IC50 NBDHEX
mean IC50 0.49µM(range 0.08-1.98µM)
mean IC50 2.20µM(range 1.02-3.88µM)
mean IC50 1.13µM(range 0.35-3.16µM)
mean IC50 0.55µM(range 0.27-1.05µM)
}}}}
ApoptosiApoptosi NBDHEXNBDHEX--indottaindotta (dosi (dosi equitossicheequitossiche))
0
5
10
15
20
25
30
U-2
OS
U-2
OS/
CD
DP3
00
U-2
OS/
CD
DP1
µg
U-2
OS/
CD
DP4
µg
Saos
-2
Saos
-2/C
DD
P300
Saos
-2/C
DD
P1µg
Saos
-2/C
DD
P6µg
Perc
enta
ge o
f apo
ptot
ic c
ells
NBDHEX-IC502-fold NBDHEX-IC505-fold NBDHEX-IC50
Analisi delle interazioni NBDHEXAnalisi delle interazioni NBDHEX--CDDPCDDP
LowLow GSTP1 GSTP1 activityactivity
High GSTP1 High GSTP1 activityactivity
CDDPCDDP
Interazione NBDHEXInterazione NBDHEX--CDDPCDDP
Bassa attivitBassa attivitààGSTP1GSTP1--11
ALTA attivitALTA attivitààGSTP1GSTP1--11
CDDPCDDP
NBDHEXNBDHEX
in corso di completamento...in corso di completamento...
••Interazioni NBDHEX Interazioni NBDHEX –– DXDX
••Interazioni NBDHEX Interazioni NBDHEX -- MTXMTX
analisi analisi in vitroin vitro del meccanismo di morte cellulare indotto dal del meccanismo di morte cellulare indotto dal trattamento con NBDHEX in linee cellulari di sarcomi trattamento con NBDHEX in linee cellulari di sarcomi muscoloscheletricimuscoloscheletrici umaniumani (IOR + (IOR + UniRomaUniRoma))
analisi analisi proteomicaproteomica delldell’’effetto di NBDHEX sulle linee effetto di NBDHEX sulle linee cellulari picellulari piùù responsiveresponsive e analisi cristallografica e analisi cristallografica delldell’’interazione tra NBDHEX e le interazione tra NBDHEX e le glutationeglutatione trasferasitrasferasi umaneumane((UniRomaUniRoma))
analisi analisi in vivoin vivo delldell’’efficacia di NBDHEX, anche in efficacia di NBDHEX, anche in associazione ai chemioterapici convenzionali, e definizione del associazione ai chemioterapici convenzionali, e definizione del profilo farmacocinetico e degli effetti di tossicitprofilo farmacocinetico e degli effetti di tossicitàà collateralecollaterale(IOR + (IOR + UniRomaUniRoma + + NervianoNerviano MedicalMedical SciencesSciences, Milano), Milano)
Proseguimento dello studioProseguimento dello studio